DE69205277T2 - Verfahren für die Bestimmung von Mutationen in der DNA eines genetisch manipuliertien Säugetiers oder einer genetisch manipulierten Säugetierzelle. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung Von Mutationen in der DNA eines transgenen Säugetiers oder einer transgenen Säugetierzelle, wobei die DNA eine oder mehrere Kopien eines Markergens enthält, die in einem bakteriellen Klonvektor angeordnet sind, mit den Schritten, Isolieren der DNA aus den Zellen des transgenen Säugetieres oder den transgenen Säugetierzellen, Wiedergewinnen des Vektors aus der isolierten DNA, Umwandeln eines geeigneten bakteriellen Wirt es mit dem wiedergewonnenen Vektor und Bestimmen der im Markergen aufgetretenen Mutationen auf der Grundlage der Reaktion des Markergens im Wirt.
• Die Erfindung betrifft insbesondere ein transgenes Tiermodell, das mit einem Markergen versehen ist, welches im Genom eingebaut ist und nach dem Isolieren der chromosomalen DNA rationell wiedergewonnen werden kann. Nach der Übertragung des Markergens auf ein Bakterium, welches unfähig zur Wirtsrestrikticn ist, wird bei Vorhandensein eines mutierten Markergens eine Selektion durchgeführt, um die Mutationshäufigkeit zu bestimmen.
• Ein derartiges Tiermodell ist unter anderem für das Testen von Stoffen auf krebserregende Eigenschaften wichtig. Alle neugewonnenen Verbindungen sind im Prinzip krebsverdächtig. Entsprechend dem heutigen Verständnis könnten sie die Struktur des in jedem Zellkern vorhandenen Erbmaterials verändern. Derartige Veränderungen des Erbmaterizals (Mutationen) können unter anderem zu Krebs führen. Mutagene Stoffe (Stoffe, welche in der DNA Mutationen verursachen) sind, soweit bekannt, auch krebserregend und können ebenso in Keimzellen Mutationen verursachen, was zu erbgenetischen Abweichungen führen kann. Die mutagene Wirkung eines Stoffes wird als das wichtigste Kriterium zur Bestimmung des Risikos für die Entwicklung von Krebs oder Erbabweichungen betrachtet. Es ist deshalb besonders wichtig, in einem frühen Stadium die mutagene Wirkung eines Stoffes bestimmen zu können.
• Das bislang am besten bekannte Verfahren zum Testen potentiell mutagener Stoffe ist der Ames-Test (Ames, 1973), mit dem Mutationen in Bakterien ermittelt werden. Dieser Test kann zwar wegen der kurzen Generationszeit von Bakterien schnell durchgeführt werden, jedoch haben ausgedehnte Forschungen gezeigt, daß der Voraussagewert des Ames-Testes nicht 100 % beträgt (Hay, 1988; Ashby und Tennant, 1988) Im allgemeinen wird deshalb eine Kombination von Tests bevorzugt, einschließlich Tests mit kultivierten (in vitro) Säugetierzellen.
• Momentan gibt es nur einige wenige Möglichkeiten zur Ermittlung von Mutationen in lebenden Zellen höherer Tiere. Ein Beispiel ist der HPRT-Test, bei dem Mutationen im Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferasegen (HPRT) auf der Basis der 6-Thioguanine-Resistenz der mutierten Zellen detektiert werden (Albertine, 1982). Dieses Verfahren ist jedoch arbeitsaufwendig und erlaubt nur Messungen an Zellen, die sich noch teilen können und einfach zu kultivieren sind. Außerdem ist die künstliche Natur des in-vitro-Zustandes ein Nachteil dieses Verfahrens, wodurch es schwierig ist, Schlußfolgerungen betreffs der in Organen und Geweben induzierten Mutationen und der möglichen Unterschiede zwischen ihnen zu ziehen. Eine Alternative dazu ist die Verwendung von Labortieren (insbesondere von Nagetieren) in Langzeitstudien. Die Tiere werden einem verdächtigen Stoff ausgesetzt, und man muß abwarten, ob sich Tumore zeigen oder nicht. Das ist jedoch ein zeitaufwendiges Verfahren, welches einige Jahre dauern kann und viele Tiere erfordert, insbesondere dann, wenn niedrige Konzentrationen eines verdächtigen Stoffes getestet werden sollen. Das macht den Test sehr teuer, weshalb Stoffe, die im Ames-Test positiv waren, häufig nicht weiter getestet und deshalb nicht kommerziell verfügbar werden.
• Eine gute Alternative ist die Verwendung von transgenen Tieren, wie von Vijg und Uitterlinden (1987), Lohman u.a. (1987) und Gossen u.a. (1989) sowie in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 353 812 beschrieben. Das hier beschriebene transgene Mausmodell enthält in jeder Körperzelle, einschließlich der Keimzellen, einen bakteriophagen Lambda-Vektor, in welchem das bakterielle lacZ-Gen geklont wird, welches als Zielgen der Mutation dient. Der Vektor kann mit Milfe von in-vitro-Verpackungen des Vektors in "leere" Phagenpartikel auf rationelle Weise aus der chromosomalen DNA wiedergewonnen werden. Die Phagen, in denen Vektoren eingelagert sind, werden anschließend mit E. Coli C Wirtszellen beschichtet (welche wirtsrestriktions-negativ sind), in denen die Selektion zwischen den mutierten lacZ- Vektoren (farblos) und den nichtmutirten lacZ-Vektoren (blau) stattfindet. Das Verhältnis zwischen der Anzahl der farblosen Belege und der Anzahl der blauen Beläge zeigt dann die Mutationsfequenz an. Das Rückgewinnen von Markergenen aus einer vollständigen chromosomalen Säugetier-DNA in dieser rationellen Weise wurde zuerst von Gossen und Vijg beschrieben (1988; siehe auch die Europäische Patentanmeldung EP-A0 353 812).
• Bei Anwendung dieses Verfahrens kann die Mutationsauslösung im Prinzip an einem beliebigen Gewebe oder Organ der oben beschriebenen transgenen Tiere untersucht werden. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß das Wiedergewinnen der bakteriophagen Lambda-Vektoren mit Hilfe einer in-vitro-Verpackung verhältnismäßig teuer und arbeitsaufwendig ist. Das liegt an der Natur der Vektoren, welche wiedergewonnen werden müssen, sowie an dem Prinzip, das die Grundlage für die Ermittlung der Mutationsfrequenz bildet, nämlich dem Verhältnis zwischen der Anzahl der mutierten farblosen Beläge und der Anzahl der nichtmutierten blauen Beläge. Hinsichtlich der Natur des wiederzugewinnenden bakteriophagen Lambda-Vektors haben Experimente gezeigt, daß zwischen unterschiedlichen Chargen von Verpakkungsextrakten ein hohes Maß an Variabilität besteht; das bedeutet, daß vor Verwendung jeder einzelnen Partie zuerst die Effizienz bestimmt werden muß. Im Hinblick auf die Bestimmung der Mutationsfrequenz auf Grundlage des Verhältnisses zwischen der Anzahl der farblosen mutierten Beläge und der Anzahl der blauen nichtmutierten Beläge kann festgestellt werden, daß ein umgekehrtes System, bei dem die mutierten Vektoren gefärbt und die nichtmutierten Vektoren farblos sind, empfehlenswert ist. Die spontane Mutationsfrequenz bei verschiedenen Geweben und Organen liegt auf jeden Fall in der Größenordnung von 1 : 100 000. Um zuverlässige Mutationsfrequenzen bei verschiedenen Geweben und Organen zu erhalten, müssen mit dem vorliegenden System mindestens 1 bis 1,5 Millionen Beläge pro Organ oder Gewebe analysiert werden. Die Analyse solcher Mengen von Belägen ist außerordentlich laboraufwendig und erfordert große Mengen von Verpackungsextrakten, von X-gal-Substrat und Petrischalen für die Analyse.
• Die Erfindung liefert jetzt ein Verfahren und ein Tiermodell, das diese Nachteile umgeht.
• Die vorliegende Erfindung stellt in erster Linie ein Verfahren zur Ermittlung von Mutationen in der DNA eines transgenen Säugetiers oder einer transgenen Säugetierzelle bereit, wobei die DNA eine oder menrere Kopien eines linearisierten Plasmids mit einem lacZ-Gen enthält, das eine lacZ-Operatorsequenz als Markergen besitzt, mit den Schritten: Isolieren der DNA aus den Zellen des transgenen Säugetiers oder den transgenen Säugetierzellen, Fragmentieren der isolierten DNA durch Behandeln mit einem Restriktionsenzym, welches das Plasmid aus der DNA herausschneiden kann, Inkontaktbringen der fragmentierten DNA mit festen Partikeln, an welche ein lacZ-Operator-Bindemittel gebunden ist, Abtrennen der festen Partikel mit der daran durch die Wechselwirkung zwischen dem lacZ-Operator-Bindemittel und dem lacZ-Operator gebundenen Plasmid-DNA von der nichtgebundenen DNA, Freisetzen der Plasmid-DNA von den festen Partikeln, Zirkularisieren der freigesetzten Plasmid-DNA, Umwandeln des wirtsrestriktions-negativen, lacZ-negativen und galE-negativen bakteriellen Wirtes mit dem gewonnenen Plasmid, und Kultivieren der umgewandelten Bakterien auf einem lactosehaltigen oder einem lactoseähnlichen Medium, auf dem nur die Bakterien wachsen können, welche aufgrund einer Mutation im lacZ-Gen keine β-Galactosidase besitzen.
• Unter Ermittlung der Mutationen soll hier der Nachweis verstanden werden, ob und mit welcher Frequenz Mutationen aufgetreten sind. Im Falle eines transgenen Labortieres kann sich die Mutationsfrequenz auf das Labortier in seiner Gesamtheit beziehen oder auf eine bestimmte Ansammlung von Zellen des Labortieres, wie etwa die Zellen eines einzelnen Organs oder die Zellen eines speziellen Körperteiles.
• Entsprechend der Erfindung wird insbesondere empfohlen, daß das Plasmia ein solches ist, das zum Transformieren von Escherichia-Coli-Bakterien geeignet ist, und daß als bakterieller Wirt ein wirts-restriktions-negatlver, lacZ-negativer und gale-negativer Escherichia-Coli-Stamm verwendet wird. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von E.-Coli-Bakterien beschränkt. Andere Bakterienarten kommen ebenfalls als geeigneter bakterieller Wirt in Betracht, vorausgesetzt, daß sie geeignete Vektorplasmide aufweisen und wirtsrestriktions-negative Stämme verfügbar sind.
• Um das Abtrennen der umgewandelten und nichtumgewandelten Bakterien zu ermöglichen, muß das Plasmid ein Selektionsmarkergen enthalten. Dafür sind dem Fachmann viele Möglichkeiten bekannt. Gewöhnlich werden dazu antibiotika-resistente Gene verwendet, welche den umgewandelten Bakterien Resistenz gegenüber bestimmten Antibiotika verleihen. Es wird empfohlen, daß das zum Klonen in Escherichia-Coli-Bakterien geeignete Plasmid ein ampicillinresistentes Gen als Selektionsmarkergen enthält, und daß als bakterieller Wirt ein ampicillin-empfindlicher, wirtsrestriktions-negativer, lacZ-negativer und galE-negativer Escherichia-Coli-Stamm verwendet wird.
• Obwohl das Plasmid in einer linearisierten Form direkt in die Säugetier-DNA eingebaut werden kann, wird entsprechend der Erfindung das Plasmid vorzugsweise als Komponente eines bakteriophagen Vektors, in den es nach dem Linearisieren mit Hilfe eines Restriktionsenzyms eingefügt wurde, in die Säugetier-DNA eingebaut. Es wird empfohlen, das Plasmid durch Einfügen in einen bakteriophagen Lambda-Vektor einzubauen. Ein derartiger Aufbau ermöglicht es, die vorliegende Erfindung direkt mit der gegenwärtig verwendeten "Mutamaus", d.h. einer transgenen Maus auf der Grundlage des von den Erfindern in ihrem Europäischen Patent EP-A-0 353 812 beschriebenen Systems, zu vergleichen. Das letztgenannte System arbeitet nach dem Prinzip des Wiedergewinnens der integrierten bakteriophagen (Lambda)-Vektoren aus der chromosomalen DNA, unter Nutzung kommerziell verfügbarer Verpackungsextrakte. Bei Verwendung des beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung lassen sich Mutationen im selben lacZ-Gen sowohl durch Plasmidrückgewlnnung als auch durch bakteriophage Lambda-Rückgewinnung bestimmen. Man kann hiervon Gebrauch machen, um die gewonnenen Ergebnisse zu bekräftigen.
• Ein konkretes bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung besteht darin, daß das Plasmid pUR288 an der einzigartigen EcoRI-Stelle des bakteriophagen Lambda.-Vektors gt10 geklont wird, und daß das Restriktionsenzym EcoRI zum Fragmentieren der isolierten DNA verwendet wird.
• Die Säugetier-DNA kann sowohl DNA von in vitro kultivierten Säugetierzellen als auch DNA von transgenen Säugetieren sein. Im letztgenannten Fall betrifft dies gewöhnlich (kleine) Nagetiere, wie Ratten und Mäuse. Vorzugsweise wird das Plasmid in die DNA einer transgenen Maus oder Ratte eingebracht.
• Bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel werden als feste Partikel magnetische Partikel verwendet. Durch die Benutzung magnetischer Partikel läßt sich die Trennung zwischen der DNA, die an den Partikeln haftet, und der nichtgebundenen DNA auf eine sehr einfache und rationelle Weise herbeiführen. Die magnetischen Partikel können unter Verwendung eines Magneten auf einfache Weise aus der Mischung entnommen werden. Nichtmagnetische Partikel lassen sich jedoch ebenfalls verwenden. In diesem Fall kann das Trennen der Mischung durch Filtern und/oder Zirkulierenlassen und Waschen bewirkt werden.
• Um elne selektive Entnahme der Plasmid-DNA zu ermoglichen, werden die festen Partikel mit einem lacZ-Operator-Bindematerial beschichtet. Was hier als "Material" bezeichnet wird, ist im wesentlichen proteinhaltiges oder Proteinmaterial. Ein derartiges lacZ-Operator-Bindematerial könnte zum Beispiel ein (polyklonaler oder monoklonaler) Antikörper mit einer speziellen Affinität zum lacZ-Operator sein. Bei einem konkreten bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht das lacZ-Operator-Bindematerial aus Proteinmaterial, das einen LacI-Repressor enthält, z.B. ein LacI-Repressor-Protein oder ein LacI-Repressor-Fusionsprotein. Dieses Material kann direkt an die festen Partikel gebunden sein, ist jedoch vorzugsweise indirekt an die festen Partikel gebunden. Zum Isolieren der Plasmid-DNA werden bevorzugt feste Partikel verwendet, an welche nacheinander Anti-β-Galactosidase und LacI-Repressor/β-Galactosidase-Fusionsprotein gebunden sind.
• Nachdem die festen Partikel mit den daran gebundenen Plasmid-DNA von den ungebundenen DNA separiert wurden, muß die an die Partikel gebundene Plasmid-DNA wieder von den Partikeln abgelöst werden. Wenn zum Beispiel ein Protein-Material mit LacI-Repressor als lacZ-Operator-Bindematerial an die festen Partikel gebunden ist, können zu diesem Zweck Stoffe verwendet werden, die eine größere Affinität zum LacI-Repressor oder zum lacZ-Operator besitzen als der LacI-Repressor und der lacZ-Operator zueinander. Es wird empfohlen, zum Ablösen der Plasmid-DNA von den festen Partikeln Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG) zu verwenden, welches die Bindung zwischen dem LacI-Repressor und dem lacZ-Operator aufhebt.
• Bei dem Verfahren entsprechend der Erfindung wird ein transgenes Säugetier verwendet, das in der Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien eines Plasmids aufweist, welches ein lacZ-Gen mit einer lacZ-Operatorsequenz enthält. Das Plasmid ist vorzugsweise ein Plasmid, das zum Klonen in Eschericha-Coli-Bakterien geeignet ist, vorzugsweise ein ampicillinresistentes Gen als Selektionsmarkergen enthält und vorzugsweise als Komponente eines bakteriophagen Vektors, insbesondere eines bakteriophagen Lambda-Vektors, durch Einsetzen in die Säugetier-DNA eingebaut wird, nachdem es unter Verwendung eines Restriktionsenzyms linearisiert wurde. Ein konkretes Ausführungsbeispiel entsprechend der Erfindung ist ein transgenes Säugetier, bei dem das Plasmid pUR288 an der einzigartigen EcoRI-Stelle des bakteriellen Lambda-Vektors gtlo geklont wird. Das transgene Säugetier ist vorzugsweise ein transgenes Nagetier, vorzugsweise eine transgene Maus oder Ratte.
• Alternativ kann die Erfindung von einer transgenen Säugetierzelle Gebrauch machen, welche in der Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien eines Plasmids aufweist, das ein lacZ- Gen mit lacZ-Operatorsequenz enthält. Das Plasmid ist vorzugsweise ein Plasmid, das zum Klonen in Eschericha-Coli- Bakterien geeignet ist. Dieses Plasmid enthält vorzugsweise ein ampicillinresistentes Gen als Selektionsmarkergen. Das Plasmid wird vorzugsweise als Komponente eines bakteriophagen Vektors insbesondere eines bakteriophagen-Lambda-Vektors, durch Einsetzen in die Säugetier-DNA eingebaut, nachdem es unter Verwendung eines Restriktionsenzyms linearisiert wurde. Bei einer konkreten transgenen Säugetierzelle ist es das Plasmid pUR288, das an der einzigartigen EcoRI- Stelle des bakteriophagen Lambda-Vektors gt10 geklont wird. Die transgene Säugetierzelle ist vorzugsweise eine transgene Nagetierzelle, vorzugsweise eine transgene Maus- oder Rattenzelle.
• Die Erfindung stellt ein in-vivo-Verfahren zum Testen von Stoffen oder Bedingungen auf mutagene Eigenschaften bereit, bei dem eine oder mehrere transgene Säugetiere mit Ausnahme von Menschen einem Stoff oder einer Bedingung zum Testen ausgesetzt werden, wobei die Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien des Plasmids aufweist, das ein lacZ-Gen mit lacZ-Operatorsequenz enthält, und bei dem anschließend in der oben beschriebenen Weise die Mutationen in dem als Markergen fungierenden lacZ-Gen festgestellt werden. Weiterhin ist es hierbei möglich, zell- oder organspezifisch zu arbeiten und die Unterschiede in der mutagenen Wirkung des getesteten Stoffes oder der getesteten Bedingung auf verschiedene Zellen oder Organe festzustellen.
• Die Erfindung stellt gleichermaßen ein in-vitro-Verfahren zum Testen von Stoffen oder Bedingungen auf mutagene Eigenschaften bereit, bei dem transgene Säugetierzellen, welche in der Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien eines Plasmids aufweisen, das ein lacZ-Gen mit einer lacZ-Operatorsequenz enthält, dem Stoff oder der Bedingung zum Testen ausgesetzt werden und nachfolgend in der oben beschriebenen Weise die Mutationen in dem als Markergen fungierenden lacZ-Gen festgestellt werden.
• Die Erfindung soll im folgenden an Hand eines konkreten bevorzugten Ausführungsbeispiels mit einer transgenen Maus erläutert werden.
• Die Erfindung, welche zum Beispiel eine transgene Maus benutzt, bei der das Markergen in einem Plasmid innerhalb des bakeriophagen Lambda-Vektors eingebracht ist, der in eine Anzahl von Kopien in einem der Chromosomen intregriert ist, weist nicht die oben genannten Einschränkungen der bekannten Verfahren zum Bestimmen von Mutationen in DNA auf. Bei diesem Tiermodell erfolgt das Wiedergewinnen des Markergens besonders rationell, da es als bakteriellen Klonvektor ein Plasmid sowie als Markergen ein lacZ-Gen mit einer lacZ- Operatosequenz benutzt, wobei die kräftige und spezifische Bindung des LacI-Repressorproteins an die Operatorsequenz, die dem bakteriellen lacZ-Gen im Plasmid vorangeht, zum Wiedergewinnen des Vektors verwendet werden kann. Benutzt man desweiteren magnetische Körner, an die ein gegen β-Galactosidase gerichteter Antikörper gebundenen ist, welcher anschließend an das β-Galactosidase-LacI-Repressorfusionsprotein (LacI/Z) gekoppelt wird, dann läßt sich das lacZ- Markergen, nachdem es an das LacI-Repressorprotein gebunden ist, unter Verwendung eines Magneten leicht aus der chromosomalen DNA isolieren. Die Bindung zwischen der Operatorsequenz des Markergens und dem Repressorprotein kann durch Hinzufügen von IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactisid) aufgehoben werden. Infolge der viel größeren Affinität des IPTG zum LacI-Repressor wird die in dem Markergen enthaltende Plasmid-DNA in der Lösung aufgespalten. Die gewonnenen Plasmide werden dann zirkularisiert und auf einen bakterieilen Wirt übertragen, welcher (auf einem lactosehaltigen oder lactoseähnlichen Medium) nur wachsen kann, wenn ein mutiertes Markergen eingebaut ist (E.-Coli, amp-negativ, wirtsrestriktions-negativ, lacZ-negativ, galE-negativ). Indem die Anzahl der Kolonien auf die Anzahl der isolierten Markergene bezogen wird, läßt sich die Häufigkeit der spontanen oder induzierten Mutationen in allen Geweben und Organen der transgenen Maus somit auf einfache Weise genau und schnell bestimmen. Damit entfällt die aufwendige und zeitraubende Messung von Hunderten und Tausenden von Belägen.
• Das oben beschriebene Verfahren zum Isolieren von Markergenmolekülen aus der vollständigen chromosomalen DNA, bei dem von der starken Bindung zwischen dem LacI-Repressorprotein und der Operatorsequenz Gebrauch gemacht wird, ist bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. Es ist jedoch ein ähnliches Verfahren zum Isolieren von DNA-Bindeproteinen (Levens und Howly, 1985) beschrieben worden, welches ebenfalls auf der großen Affinität des LacI-Repressorproteins zur Operatorsequenz beruht. Die Verwendung der LacI-Repressor-Operatorbindung für ein scnnelles Reinigen des Markergens lacZ aus der chromosomalen DNA zum Zwecke der Mutationsanalyse wurde jedoch, wie bereits festgestellt, bisher nicht vorgeschlagen. Die Nutzung der Magnetkörnertechnologie und der bekannten Bindung zwischen dem LacI-Repressorprotein und der lacZ-Operatorsequenz zur Vorbereitung für das Reinigen der speziellen DNA-Sequenz direkt aus der chromosomalen DNA berührt ein klar umrissenes Anwendungsgebiet, nämlich das der Mutationsanalyse. Auf diesem technologischen Gebiet ist die Direktselektion üblich, während entsprechend der Erfindung zuerst möglichst viele Kopien von Markergenen isoliert werden.
• Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Effizienz, mit welcher die in die Genome der höheren Organismen integrierten Plasmide wiedergewonnen werden können. Frühere Forschungsarbeiten unter anderem von den Erfindern (Gossen und Vijg, 1988, Europäische Patentanmeldung EP-A-0 353 812), zur Bestimmung der Wiedergewinnungseffizienz der bakteriophagen Lambda-Vektoren aus der vollständigen chromosomalen DNA von transgenen Mäusen unter Verwendung verschiedener E.-Coli-Wirtsstämme haben gezeigt, daß nur E.- Coli-Stämme verwendet werden konnten, die nicht zur Wirtsrestriktion fähig sind. E.-Coli-Stämme, die nicht zur Wirtrestriktion fähig sind, sind deshalb notwendig, weil bakteriophage Lambda-Vektoren nach dem Einbau in das Genom eines Tieres modifiziert werden. Die modifizierte DNA wird nach dem Einbau in die Bakterienzelle als solche erkannt und unverzüglich von den Wirtsrestriktionssystemen aufgespalten. Dasselbe trifft für das Wiedergewinnen der Plasmidvektoren zu.
• Ein Mutationsmodell, das auf Integrierten Plasmiden basiert, ist nicht per se selbstverständlich, da bekannt ist, daß das Wiedergewinnen bakteriophager Lambda-Vektoren aus der Genom-DNA effektiver ist als das Wiedergewinnen von Plasmiden. Die Plasmidrückgewlnnung aus der Genom-DNA ist deswegen unökonomisch, weil das Zirkularisieren des linearisierten Plasmids bei sehr geringer Konzentration, das heißt mit großen Volumina erfolgen muß. Das stand bis jetzt einer erfolgreichen Anwendung eines Mutationsmodells, das auf integrierten Plasmiden beruht, im Wege.
• Die vorliegende Erfindung weist auf Grund der Verwendung eines schnellen Reinigungsschrittes, nämlich dem rationellen Separieren des das Markergen enthaltenden Plasmids aus der chromosomalen DNA durch Binden des an Magnetkörper gekoppekten LacI-Repressorproteins an die dem lacZ-Gen vorgelagerte Operatorsequenz, keine der obengenannten Beschränkungen auf. Durch diesen Reinigungsschritt wird im Prinzip die gesamte überschüssige chromosomale DNA entfernt, und das Zirkularisieren kann danach effektiver mit einem kleinen Volumen durchgeführt werden.
• Unter Verwendung des oben beschriebenen Prinzips benutzt die vorliegende Erfindung ein transgenes Tiermodell, welches in jeder Körperzelle (einschließlich der Keimzellen) ein Markergen besitzt, das sich leicht wiedergewinnnen läßt und bei Vorhandensein von Mutationen analysiert werden kann, wodurch es sich hervorragend zum Testen von auf mutagene Wirkungen verdächtige Stoffe eignet. Nach dem Binden an den LacI-Repressor-Komplex kann das integrierte Plasmid mit großer Effizienz wiedergewonnen werden und zum Bestimmen der Mutationsfrequenz auf eine E.-Coli-Wirtszellle (wirtsrestriktions-negativ) übertragen werden.
• Um mutlerte lacZ-Gene auf einfache Weise erkennen zu können, ist es erforderlich, ein Selektionssystem zu verwenden, bei dem zugunsten der mutierten Kolonien die nichtmutierten Kolonien nicht überleben. Dies wird entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung realisiert, indem ein gale-negativer E.-Coli-Stamm verwendet wlrd. Wenn die lacZenthaltenden Plasmide nach der Reinigung auf einen E.-Coli- Wirt übertragen werden, der wirtsrestriktions-negativ, lacZ-negativ und gale-negativ ist, können nach einer Beschichtung mit einem lactosehaltigen oder lactoseähnlichem Medium nur solche Zellen wachsen, welche ein mutiertes Plasmid enthalten; E.-Coli-Zellen, welche ein nichtmutiertes Plasmid enthalten, werden infolge der Anwesenheit von β-Galactosidase die Lactose oder den lactoseähnlichen Stoff in Galactose wandeln. Infolge der Mutation im galE-Gen ist jedoch keine weitere Unwandlung der Galactose möglich. Dies führt zur Ansammlung des toxischen Nebenproduktes UDP- Galactose, wodurch die Zellen absterben (Malamy, 1966). Die Verwendung gale-negativer Stämme zur Mutationsanalyse in höheren Tieren ist neu. Diese Form der Selektion ist auch mit bakteriophagen Lambda-Vektoren möglich.
• Die vorliegende Erfindung hat deshalb zwei Komponenten, nämlich (1) technische Komponenten, welche die schnelle Reinigung der integrierten Plasmide von der vollständigen chromosomalen Säugetier-DNA und eine einfache Erkennung der mutierten Markergene sichert, und (2) biologische Komponenten in Form der Verwendung einer speziellen Art von transgenen Säugetieren und einer besonderen Art eines bakteriellen Wirtes zum Erkennen mutlerter Markergene, was zu einem transgenen Tiermodell führt, das bei Einsatz der obigen technischen Komponenten direkt als neues in-vivo-Mutationsmodell benutzt werden kann.
• Die entsprechend der Erfindung angewendeten Methoden, einschließlich der Magnetkörnertechnologie zum Raffinieren der Markergene aus der gesamten chromosomalen Säugetier-DNA sowie der Nutzung eines galE-, lacZ- und wirtsrestriktionsnegativen E.-Coli-Stammes zum einfachen Bestimmen der Mutationsfrequenz, machen das hier beschriebene transgene Mausmodell ganz besonders für ein in-vivo-Mutationsmodell geeignet. Ein wichtiger Aspekt des transgenen Mausmodells, das bei dem Verfahren entsprechend der Erfindung verwendet wird, sind die verhältnismäßig niedrigen Kosten, die mit dem Test von potentiell krebserregenden Stoffen verbunden sind. Vergleichsweise belaufen sich die Testkosten eines möglicherweise krebserregenden Stoffes belaufen sich vergleichsweise bei Verwendung einer Langzeitstudie an Nage- tieren auf etwa 2 Millionen Gulden (Golberg und Frazier 1989) und bei Verwendung des in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 353 812 beschriebenen transgenen Mausmodells, das auf einer Wiedergewinnung der bakteriophagen Lambda-Vektoren beruht, auf annähernd 120 000 Gulden. Die letztgenannten Kosten betreffen die Analyse von 40 Tieren, bei denen die Mutationsfrequenz in einem Organ bestimmt wurde, und werden sich deshalb vervielfachen, wenn mehrere Organe getestet werden. Im Gegensatz dazu werden sich die Kosten bei Verwendung des hier beschriebenen transgenen Mausmodells, wenn ein Organ getestet wird, auf etwa 20 000 Gulden belaufen. Die beträchtliche Kostensenkung entsteht hauptsächlich durch die kombinierte Anwendung der Magnetkörnertechnologie und eines gale-negativen, lacZ-negativen und wirtsrestriktions-negativen E.-Coli-Wirtes und bildet einen wichtigen Aspekt bei der Anwendung des transgenen Mausmodells für die in-vivo-Mutationsanalyse.
Experiment 1: Herstellung des transgenen Mausstammes Ingeny M1.
• Als Vektor wurde der bakteriophage Lambda-gt10-Vektor verwendet (Promega b.V. aus Leiden), In den das Plasmid pUR288 in der einzigartigen EcoRI-Stelle geklont wird (Fig. 1). Das pUR288-Plasmid enthält für die Reproduktion ein pBR322 Ori, das Ampicellin-Gen, die lacZ-Operatorsequenz und das gesamte lacZ-Gen (Ruther und Muller-Hill, 1986). Der Vektor wurde durch Mikroinjektion von befruchteten Eizellen (Hogan u.a., 1986) auf die Keimzellen von CD2-Mäusen (Balb/c x DBA/2) übertragen. Balb/c und DBA/2 sind zwei Mäusestämme, die aus der Rattenzucht des TNO Instituts für Alterungsund Zellforschung (TNO-IVVO) in Rijswijk stammen.
• Es ist aus der Literatur bekannt, daß nach Mikroinjektion einer linearen DNA in den Pronukleus einer befruchteten Eizelle die injlzierte DNA im Genom an einer beliebigen Stelle (Palmiter und Brinster, 1986) von vorn nach hinten eingeordnet wird. Fig. 2A zeigt eine schematische Ansicht der von-vorn-nach-hinten-Einordnung des plasmidenthaltenden bakteriophagen Lambda-Vektors im Genom einer Maus. Diese Art der Integration der Lambda-Vektoren ist für das Wiedergewinnen der chromosomalen DNA mit Hilfe der in-vitro-Verpackung entscheidend. Während des Integrationsvorganges bilden die beiden kohäsiven Enden der 12-Basen-Paare eine intakte cos-Stelle, welche durch das Terminaseenzym im invitro-Verpackungsextrakt erkannt wird. Die Lambda-DNA zwischen den beiden intakten cos-Stellen ist in ein leeres Phagenpartikel gepackt. Dies wird ausführlich in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 353 812 beschrieben. Fig. 2B zeigt, daß die plasmidenthaltenden Lambda-Vektoren tatsächlich von vorn nach hinten im Genom der Maus des Stammes Ingeny M1 (ING3) eingeordnet sind. Dies wurde durch eine Southern-Analyse der Leber-DNA nachgewisen. Die chromosomale DNA wird mit dem Restriktionsenzym Drai aufgetrennt, welches den plasmidenthaltenden Vektor in eine Anzahl von Fragmenten zerlegt, einschließlich eines Fragmentes von 1,2 kb. Dieses Fragment, welches eine intakte cos- Stelle enthält, ist nur nach ener von-vorn-nach-hinten-Integration von Lambda-Vektoren vorhanden. Das Autoradiogramm in Fig. 28 zeigt, daß das 1,2 kb-Fragment tatsächlich in der chromosomalen DNA des Mauskulturstammes Ingeny M1 vorhanden ist. Durch Kreuzungsexperlmente wurde festgestellt, daß die zugehörige Verkettung In Mendelscher Weise vererbt wird.
Experiment 2: Raffinieren der integierten Plasmide aus der chromosomaien DNA der Maus ING3.
• Fig. 3 zeigt das Raffinieren und das Zirkularisieren des linearen pUR288-Plasmids aus der chromosomalen DNA einer transgenen Ingeny M1-Maus (ING3). Um das lacZ-enthaltende Plasmid aus der chromosomalen DNA zu raffinieren, wurde die letztere zuvor durch das Restriktionsenzym EcoRI (Streifen a) aufgetrennt. Anschließend wur&en zu etwa 10 ug chromosomaler DNA circa 10&sup8; Magnetkörner (zum Beispiel Dyna-Körner M-450 Schaf-anti-Maus IgG, ITK Diagnostics B.V. in Uithoorn) hinzugefügt, an welche nacheinander ein Anti-β-Galactosidase-Antikörper (Promega B.V.) und ein LacI-β-Galactosidase-Fusionsprotein (Promega B.V.) angekoppelt wurden. Die Kopplung des Anti-β-Galactosidase-Antikörpers an die Magnetkörner und die Kopplung des LacI-β-Galactosidase-Fusionsproteins an die Anti-β-Galactosidase-Antikörper wurde entsprechend den Standardvorschriften (der ITK Diagnostcs B.V. beziehungsweise der Promega B.V.) durchgeführt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Magnetkörner mit dem daran gebundenen lacZ-enthaltenden Plasmid unter Verwendung eines Magneten (ITK Diagnostics B.V.) von der restlichen chromosomalen DNA abgetrennt und mindestens zweimal in 250 ul 50 mM Tris.HCL pH 8,0, 100 mM NaCl gewaschen. Die Kopplung zwischen dem LacI-Repressor-Protein und der Operatorsequenz wurde durch Hinzufügen von 10 ul 50 mM Tris.HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,2 % IPTG (Streifen b) zu den Magnetkörnern aufgehoben. Das Zirkularisieren des Plasmids wurde entsprechend den Standardvorschriften (Miniatis u.a., 1982) durchgeführt, 20 ng gereinigtes Plasmid wurden unter Verwendung von 0,02 U T4-Ligaseenz'jm (Gibco BRL) im Gesamtvolumen von 25 ul gebunden. Da das zirkularisierte Plasmid im Vergleich mit dem linearen Plasmid bei der Agar-Gel- Elektrophorese eine niedrigere Wanderungsgeschwindigkeit aufweist, läßt sich das Zirkularisieren des wiedergewonnenen pUR288-Plamids auf einfache Weise analysieren (Streifen c).
Experiment 3: Bestimmung der Wiedergewinnungseffizienz integrierter Plasmide aus der chromosomalen DNA der Maus ING3.
• Die Wiedergewinnungseffizlenz des lacZ-enthaltenden Plasmids wird ermittelt, indem ein kleiner Teil der zentrifugierten pUR288-Plasmide durch Transformation in kompetente Zellen übertragen wird. Die Transformation kann mit ampicillinempfindlichen E.-Coli-Stämmen ausgeführt werden, welche wirtsrestriktions- und lacZ-negativ sind, wie zum Beispiel E.-Coli C (Gossen und Vijg, 1988), E-Coli Sure (Stratagene, Westburg B.V. in Leusden) oder DH5αMCR (Life Technologies B.V. in Breda). Die Transformation wird mit Hilfe einer Elektroporierung durchgeführt, wie sie Dower u.a., 1988 beschrieben haben. Die pUR288-enthaltenden E.Coli-Zellen wurden anschließend auf ampicillinhaltiges (50 ug/ml) LB Agar-Medium (Gibco ERL) aufgetragen. Die Anzahl der Kolonien (A) nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37º C ist ein Maß für die Wiedergewinnungseffizienz. Bei diesem Experiment wurden annähernd 50 000 Plasmide aus etwa 5 ug chromosomaler DNA wiedergewonnen, die vorher mit dem Restriktionsenzym EcoRI aufgetrennt worden war. Die übrigen zirkularisierten Plasmide können dann auf einen E.-Coli- Wirt übertragen werden (amp-negativ, lacZ-negativ und wirtsrestriktions-negativ), welcher auf Galactose (galE-negativ) empfindlich ist. Nach der Transformation wurden die E.-Coli-Zellen auf ein MM/LB-Medium (4:1 vol/vol), welches Galactosid (0,05 %; Sigma), IPTG (20 ug/ml; Gibco ERL), und Ampicillin (50 ug/ml: Merck) enthält, aufgetragen. Auf diesem Medium können nur Zellen wachsen, die als Folge der Mutation im lacZ-Gen keine β-Galactosidase besitzen und nicht nicht in der Lage sind, Phenylgalactoside umzuwandeln. Die Anzahl der Kolonien (B) nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37º C ist ein Maß für die Anzahl der Mutanten. Die Mutationsfrequenz ist dann durch das Verhältnis B/A deziniert.
Experiment 4: Wiedergewinnen der integrierten bakteriophagen Lambda-Vektoren aus der chromosomalen DNA eines transgenen Tieres.
• Zum Vergleich wurden die lacZ-Wiedergewinnungsexperimente mittels bakteriophagen Lambdas anstelle der Plasmidrückgewinnung mit dem Ingeny-M1-Mausstamm durchgeführt. Die Rückgewinnung des plasmidenthaltenden bakteriophagen Lambda- Vektors erfolgte durch Hinzufügen von maximal 10 ug chromosomaler DNA zu einem in-vitro-Verpackungsextrakt (Stratagene, Westburg B.V. in Leusden). Nach der Inkubation des Extraktes über zwei Stunden bei 22º C wurde der Extrakt mit 500 ul 5M Puffer (100 mM NaCl, 8 mM MgSO&sub4; H&sub2;O, 50 mM Tris.HCl pH 7,5) verdünnt, und mittels Beschichten der annähernd 5ul Phagenlösung mit E.-Coli-C (lacZ-negativ und wirtsrestriktions-negativen) Wirtszellen (Maniatis u.a. 1982) wurde die Wiedergewinnungseffizienz bestimmt. Auf diese Weise konnten aus etwa 10 ug Leber-DNA einer transgenen Maus des Stammes Ingeny M1 (ING3) cirka 500 000 Vektoren wiedergewonnen werden. Die Mutationsfrequenz ist durch das Verhältnis zwischen der Anzahl der farblosen (mutierten lacZ-Gene) und blauen (nichtmutierten lacZ-Gene) Beläge definiert.
Beschreibung der Figuren
• Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des pUR288 plasmidenhaltenden bakteriophagen Lambda-Vektors 9t10, wie bei Experiment 1 beschrieben.
• Fig. 2a ist eine schematische Darstellung der von-vorn- nach-hinten-Integration des Vektors im Genom einer Maus.
• Fig. 2b ist eine Darstellung des Autoradiogramms, gemessen nach dem Southern-Blotting der Leber-DNA von verschiedenen transgenen Mäusen, die mit dem Restriktionsenzym DraI aufgespalten wurde.
• Fig. 3 zeigt die Wiedergewinnung des pUR288-Plasmids aus der vollständigen chromosomalen DNA einer transgenen Ingeny M1-Maus. Das Autoradiogramm wurde gemessen nach dem Southern-Blotting der mit dem Restriktionsenzym EcoRI aufgespaltenen Leber-DNA der transgenen Maus ING-3 (Streifen a), Reinigen des pUR288-Plasmids unter Verwendung von Magnetkörnern (Streifen b), das zirkularisierte pUR288-Plasmid (Streifen c). Als Sonde wurde das mit ³2p-markierte pUR288-Plasmid verwendet.
Referenzen:
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• Ruther, U. and Müller-Hill, B. EMBO 2, 1791-1793 (1983) Vijg, J. and Uitterlinden, A.G. Mech. Ageing Dev. 41, 47-63 (1987)

Claims (13)

1. Verfahren zum Detektieren von Mutationen in der DNA eines transgenen Säugetiers oder einer transgenen Säugetierzelle, wobei die DNA eine oder mehrere Kopien eines linearisierten Plasmids, enthaltend ein lacZ-Gen mit einer lacZ-Operatorsequenz als Markergen, enthält, mit den Schritten: Isolieren von DNA aus Zellen des transgenen Säugetiers oder aus den transgenen Säugetierzellen, Fragmentieren der isolierten DNA durch Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das das Plasmid aus der DNA herausschneiden kann, Bringen der fragmentierten DNA in Kontakt mit Feststoffteilchen, an die ein lacZ-Operator-Bindemittel gebunden ist, Separieren der Feststoffteilchen mit der daran durch die Wechselwirkung zwischen dem lacZ-Operator- Bindemittel und dem lacZ-Operator gebundenen Plasmid-DNA von der nichtgebundenen DNA, Freisetzen der Plasmid-DNA von den Feststoffteilchen, Zirkularisieren der freigesetzten Plasmid-DNA, Transformieren eines wirt-restriktions-negativen, lacZ-negativen und galE-negativen bakteriellen Wirtes mit dem erhaltenen Plasmid, und Ansiedeln der transformierten Bakterien au einem Lactose enthaltenden Medium, auf dem nur diejenigen Bakterien wachsen können, die aufgrund einer Mutation in den lacZ-Gen keine β-Galactosidase bes ltzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1,

bei dem das Plasmid ein für die Klonierung in Escherichia- coli-Bakterien geeignetes Plasmid ist und ein wirt-restriktions-negativer, lacZ-negativer und galE-negativer Escherichia-coli-Stamm als bakterieller Wirt verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2,

bei dem das für Klonierung in Escherichia-coli-Bakterien geeignete Plasmid ein ampicillin-restistentes Gen als Selektionsmarkergen enthält und ein ampicillin-sensitiver, wirt -restriktions -negativer, lacZ-negativer und galE- negativer Escherichia-coli-Stamm als bakterieller Wirt verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,

bei dem das Plasmid in die Säugetier-DNA als Komponente eines Bakteriophagen-Vektors eingeführt wird, in den es nach Linearisierung mittels eines Restriktionsenzyms durch Inserierung inkorporiert wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4,

bei dem das Plasmid durch Inserierung in einen Bakteriophagen-Lambda-Vektor inkorporiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5,

bei dem das Plasmid pUR288 an der speziellen Stelle EcoRI des Bakteriophagen-Lambda-Vektors gt10 kloniert wird und dieses Restriktionsenzym EcoRI für die Fragmentierung der isolierten DNA verwendet wird.

7. Verfahren der Ansprüche 1 bis 6,

bei dem das Plasmid in die DNA einer transgenen Maus oder Ratte eingeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,

bei dem magnetische Teilchen als Feststoffteilchen verwendet werden.

9. Verfahren der Ansprüche 1 bis 8,

bei dem einen LacI-Repressor aufweisendes Proteinmaterial als das lacZ-Operator-Bindemittel verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9,

bei dem zur Isolierung von Plasmid-DNA Feststoffteilchen verwendet werden, an die nacheinander Anti-β-Galactosidase und LacI-Repressor/β-Galactosidase-Fusionsprotein gebunden werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10,

bei dem zur Freisetzung von Plasmid-DNA von den Feststoffteilchen Isopropyl-β-D-Thiogalactoside (IPTG) verwendet wird, welches die Bindung zwischen dem LacI-Repressor und dem lacZ-Operator eliminiert.

12. Verfahren zum Testen von Stoffen oder Bedingungen hinsichtlich mutagener Eigenschaften, bei dem ein oder mehrere transgene Säugetiere, mit Ausnahme von menschlichen Lebewesen, die in der Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien eines Plasmids enthalten, das ein lacZ-Gen mit einer lacZ- Operatorsequenz enthält, einem zu testenden Stoffes oder einer zu testenden Bedingung ausgesetzt werden und anschließend Mutationen in dem als Markergen wirkenden lacZ- Gen detektiert werden durch Isolierung der DNA aus Zellen des transgenen Säugetiers, Fragmentierung der isolierten DNA durch Behandlung mit einem Restriktlonsenzym, das das Plasmid aus der DNA herausschneiden kann, Bringen der fragmentierten DNA In Kontakt mit Feststoffteilchen, an die ein lacZ-Operator-Bindemittel gebunden ist, Abtrennen der Feststoffteilchen mit daran durch die Wechselwirkung zwischen dem lacZ-Operator-Eindemittel und dem lacZ-Operator gebundener Plasmid-DNA von der nichtgebundenen DNA Freisetzen der Plasmid-DNA von den Feststoffteilchen, Zirkularisieren der freigesetzten Plasmid-DNA, Transformieren eines wirtrestriktions-negativen, lacZ-negativen und gale-negativen bakteriellen Wirtes mit dem erhaltenen Plasmid, und Ansiedein der transformierten Bakterien auf einem Lactose enthaltenden Medium, auf dem nur diejenigen Bakterien wachsen können, die aufgrund einer Mutation in den lacZ-Gen keine β-Galactosidase besitzen.

13. Verfahren zum Testen von Stoffen oder Bedingungen hinsichtlich mutagener Eigenschaften, bei dem eine oder mehrere transgene Säugetierzellen, die in der Säugetier-DNA eine oder mehrere Kopien eines Plasmids enthalten, das ein lacZ-Gen mit einer lacZ-Operatorsequenz enthält, einem zu testenden Stoff oder einer zu testenden Bedingung ausgesetzt werden und anschließend Mutationen in dem Markergen detektiert werden durch Isolieren der DNA aus den transgenen Säugetierzellen, Fragmentieren der isolierten DNA durch Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das das Plasmid aus der DNA herausschneiden kann, Bringen der fragmentierten DNA in Kontakt mit Feststoffteilchen, an die ein lacZ-Operator-Bindemittel gebunden ist, Abtrennen der Feststoffteilchen mit daran durch die Wechselwirkung zwischen dem lacZ-Operator-Bindemittel und dem lacZ-Operator gebundener Plasmid-DNA von der nichtgebundenen DNA, Freisetzen der Plasmid-DNA von den Feststoffteilchen, Zirkularisieren der freigesetzten Plasmid-DNA, Transformieren eines wirt-restriktions-negativen, lacZ-negativen und galE-negativen bakteriellen Wirtes mit dem erhaltenen Plasmid, und Ansiedein der transformierten Bakterien auf einem Lactose enthaltenden Medium, auf dem nur diejenigen Bakterien wachsen können, die aufgrund einer Mutation in den lacZ-Gen keine Beta-Galactosidase besitzen.