DE3852582T2 - Verfahren zur Präparation von stabilen Zellinien aus transgenen Tieren zur Herstellung bestimmter Proteine, Tumorzellinien und daraus erhaltene Proteine. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft die Entwicklung von neuen Zellinien für die Herstellung von komplexen Proteinen.
• Seit mehreren Jahren wird unter Anwendung von rekombinanten DNA-Verfahren eine mehr und mehr steigende Anzahl von Proteinen (Hormonen, Lymphokinen . . . ) in unterschiedlichen Wirts-, Bakterien- oder Hefezellen hergestellt (gebildet). In zahlreichen Fällen stellen diese Mikroorganismen Mittel zur wirksamen und rentablen Produktion dar, da ihre Genetik und ihre Physiologie allgemein bekannt sind und die Fermentationsverfahren in industriellem Maßstab gut beherrscht werden.
• Bei komplexen Proteinen, die erst aktiv sind, nachdem sie einer post-translatorischen Modifizierung unterworfen worden sind, wurde jedoch festgestellt, daß die Expression in den Bakterien und den Hefen derartige Modifikationen nicht immer erlaubt. In diesen Fällen erhält man keine biologisch aktiven Proteine. Es ist beispielsweise bekannt, daß therapeutisch wichtige Moleküle, wie die Faktoren VIII und IX der Blutgerinnung in Säugetierzellen und sogar in spezifischen Zelltypen gebildet werden müssen.
• In zahlreichen Untersuchungen wurde versucht, leistungsfähige Systeme zu entwickeln, welche die Expression von klonierten Fremdgenen in höheren Eukaryonten-Zellen erlauben.
• Bei den durchgeführten verschiedenen Arbeiten ist man auf eine bestimmte Anzahl von Schwierigkeiten gestoßen, beispielsweise eine nicht immer zufriedenstellende Ausbeute, eine geringe Anzahl von leistungsfähigen Systemen, die Instabilität der transfektierten Fremdgene oder auch die Notwendigkeit, für die Herstellung von Proteinen, wie den Faktor IX, die komplizierten post-translatorischen Modifikationen unterworfen werden müssen, einen sehr spezifischen Zell-Typ zu verwenden.
• Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue experimentelle Verfahren zu entwickeln für die Herstellung von komplexen rekombinanten Proteinen durch Zellinien, die mindestens zum Teil die obengenannten Nachteile nicht aufweisen.
• Um dieses Ziel zu erreichen, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, Verfahren anzuwenden, welche die Erzeugung (Erschaffung) von transgenen (transgenetischen) Tieren erlauben.
• Verfahren, welche die Erzeugung von transgenetischen Mäusen erlauben, sind bereits beschrieben (vgl. die Übersicht von Palmiter und Brinster, 1986). Dabei wird, kurz zusammengefaßt, ein DNA-Präparat, das ein Fremdgen enthält, das von geeigneten Kontrollsignalen umgeben ist, die seine Expression in höheren Zellen erlauben, in vitro in den Pronucleus eines befruchteten Eis mikroinjiziert.
• Die so behandelten Eier werden in weibliche Träger transplantiert. Bei den Mäusejungen, die daraus entstehen, ist das Fremdgen oder "Transgen" in das Chromosomenmaterial in einer Häufigkeit von 10 bis 15% integriert. In der Mehrzahl der Fälle ist das Gen in die Keimzellen integriert und wird auf diese Weise übertragbar auf die folgenden Generationen von Mäusejungen.
• Ähnliche Verfahren sind auch bereits für andere Tierarten (Schweine, Schafe, Rinder) beschrieben.
• Man stellt allgemein fest, daß die transgenen (transgenetischen) Mäuse das "Transgen" spezifisch in bestimmten Gewebe exprimieren, welche die natürliche Umgebung wiedergeben, in welcher das Gen exprimiert wird, in seinem Ursprungs-Wirt. So synthetisieren beispielsweise die transgenen Mäuse, die ein Gen der Elastase der Ratte tragen, die Ratten-Elastase in ihrem Pakreas (Swift et al., 1984); das Gen des Human-α-Antitrypsins wird in einem hohen Mengenanteil in der Leber der Mäuse exprimiert (Sifers et al., 1987). Diese Gewebespezifität wird häufig vorbestimmt durch die Promotor-Sequenzen (oder die dazu benachbarten Sequenzen) des Fremdgens. Dies zeigen beispielsweise die Fusionsversuche zwischen heterologenen Genen und Promotoren. So bringt beispielsweise die Fusion des Gens CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase) eines Bakteriums mit dem Promotor des Gens für das Protein αA der Maus-Augenlinse die Synthese von CAT in der Augenlinse von transgenen Mäusen und eine Regulierung seiner Expression im Verlaufe der Entwicklung der Maus mit sich (Overbeek et al., 1985).
• Es ist somit möglich, die Expression der Gene in bestimmte Gewebe oder Gewebekategorien in transgenen Tieren zu lenken durch Verwendung von geeigneten Promotor-Sequenzen. In mehreren Arbeiten wird die Expression von zellulären oder viralen Onkogenen in transgenen Mäusen beschrieben, beispielsweise von c-myc, c-ras, c-fos und des Antigens T von SV40 (Adams et al., 1985; Quaife et al., 1987; Rütner et al., 1987; Palmiter et al, 1987).
• Die Expression dieser Onkogene kann zur Entwicklung von Tumoren führen in den Geweben, die sie exprimieren. So induzieren beispielsweise DNA-Konstruktionen, die das Onkogen c-myc und eine "Verstärker"-Sequenz proximal zur schweren Kette der Immunglobuline (Ig) tragen, in transgenen Mäusen Lymphoid-Tumore der Zellinien B, deren Spezifität auf die Wirkung des "Verstärkers" von Ig zurückzuführen ist (Adams et al., 1985).
• Diese Versuche zeigen, daß es möglich ist, das Auftreten eines Tumors in einem Gewebe oder in einem ausgewählten Zelltyp hervorzurufen durch Verwendung eines geeigneten Onkogens und eines Promotors und/oder eines für ein Gewebe spezifischen "Verstärkers".
• Die durch diese DNA-Konstruktionen künstlich induzierten Tumore können in vitro kultiviert werden und man kann daraus bestimmte Zellinien ableiten. Adams et al., (1986) beschreiben die Selektion von permanenten Linien von Zellen B aus Tumoren, die durch konstitutive Expression von c-myc induziert worden sind.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren, das die Herstellung eines vorgegebenen (bestimmten) Proteins erlaubt, wobei bei diesem Verfahren die Technik der Erzeugung von transgenen (transgenetischen) Tieren angewendet wird.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Zellinie, die ein vorgegebenes Protein bildet, das dadurch gekennzeichnet, daß man
• a) einen Vektor herstellt, der umfaßt
• eine onkogene Sequenz sowie die Elemente, die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten-Zelle gewährleisten,
• einen Expressions-Block, der mindestens die für das genannte Protein codierende Sequenz sowie die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten-Tumorzelle gewährleistenden Elementen umfaßt, wobei das genannte Protein von demjenigen verschieden ist, das durch die genannte onkogene Sequenz exprimiert wird,
• b) diesen Vektor in ein oder mehrere Eier eines Tieres einführt und das (die) erhaltene(n) Ei(Eier) wieder implantiert;
• c) die Deszendenten (Nachkommen), die das Onkogen integriert haben und Tumore entwickeln, selektioniert; und
• d) die so erhaltenen Tumorzellen, die das vorgegebene Protein bilden, entnimmt und auf einem geeigneten Medium kultiviert (züchtet) zur Bildung einer Zellinie.
• Gemäß einem der Aspekte der vorliegenden Erfindung kann man vor dem Kultivieren die Tumorzellen aufeinanderfolgend mehrmals in andere Tiere reimplantieren.
• Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man das vorgegebene Protein herstellen, indem man:
• a) einen Vektor herstellt, der umfaßt einen Expression-Block, der mindestens die für das genannte Protein codierende Sequenz sowie die Elemente, die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten-Zelle gewährleisten, umfaßt;
• b) diesen Vektor in ein oder mehrere Eier eines Tieres einführt und das (die) erhaltene(n) Ei(Eier) wieder implantiert;
• c) die Deszendenten (Nachkommen), welche die für das genannte Protein codierende Sequenz integriert haben, selektioniert; und
• d) die Lymphozyten der Milz dieser Tiere mit Myelom-Zellen fusioniert und Hybridom-Klone, die das Protein bilden, selektioniert.
• Die Erfindung schlägt insbesondere Mittel vor, um der Expression des Onkogens, des vorgegebenen Proteins oder beiden eine Gewebespezifität zu verleihen.
• Es handelt sich dabei beispielsweise darum, starke Kontroll-Signale der Expression in den Lymphoid-Zellen zu verwenden, um die Bildung von Fremdproteinen in den Transhybridomen zu optimieren.
• Die spezifische Induktion von Tumoren in transgenen Mäusen kann durch verschiedene Onkogene ausgelöst werden und diese können unter die Kontrolle unterschiedlicher Promotoren gestellt werden, um die Gewebespezifität der Antwort zu beeinflussen.
• Unter einem "Onkogen" versteht man hier das Gen, das die Fähigkeit hat, bei einem Tier eine Zellenvermehrung eines solchen Typs zu induzieren, die zur Tumorbildung führt.
• Unter den verwendbaren Onkogenen können insbesondere genannt werden die Onkogene viralen Ursprungs, unabhängig davon, woher sie stammen. Unter den Onkogenen können beispielsweise genannt werden c-myc, c-ras, c-fos oder das Antigen T von SV40, es können aber auch andere Onkogene in Betracht gezogen werden, beispielsweise die Onkogene src, erb, myb und onc.
• Allgemein umfaßt der Vektor als Expressionselemente das Onkogen sowie die für das Produkt codierende Sequenz, einen Promotor und auch einen Transkriptions-Aktivator ("Verstärker").
• So können beispielsweise der Promotor und der Transkriptions-Aktivator ("Verstärker") der schweren Kette der Ig dafür verwendet werden, die Expression in die Lymphoid- Zellen zu lenken; durch Einführung von c-myc oder des Antigens T von SV40 in die gleiche Konstruktion wird die Entwicklung von invasiven Lymphomen induziert.
• Nach dem gleichen Prinzip verwendet man zur Induktion von Leber-Tumoren spezifische Promotoren der Leberzellen, um die Expression des Onkogens zu lenken. Man verwendet beispielsweise den Promotor von α-Antitrypsin, des Faktors VIII oder des Faktors IX oder von Albumin.
• Theoretisch kann man einen Tumor in einem beliebigen Zell-Typ induzieren, so lange man den geeigneten Promotor, den geeigneten "Verstärker" und das geeignete Onkogen miteinander kombiniert.
• Um Tumore zu erzeugen, die ein Fremdgen bilden, was Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, stellt man insbesondere das Fremdgen unter die Kontrolle eines wirksamen Promotors in den Tumorzellen.
• Auf diese Weise hat man im Falle der Lymphoid-Zellen festgestellt, daß die Regulatorelemente des Immunglobulins besonders wirksam waren.
• Im Falle der Lymphom-Zellen, die durch c-myc unter der Kontrolle des Promotors und des "Verstärkers" der schweren Kette der Ig induziert worden sind, können insbesondere die Fremdgene unter die Kontrolle des Promotors der leichten Kette der Ig und auch unter den Einfluß des gleichen "Verstärker"-Elements der schweren Kette gestellt werden (man kann die beiden Promotoren beliebig vertauschen und das Fremdgen unter die Kontrolle des Promotors der schweren Kette und das Onkogen unter die Kontrolle des Promotors der leichten Kette stellen).
• Dieser Konstruktions-Typ führt zu einer wirksamen Sekretion des Fremdgens durch die Tumorzelle sowohl in vivo (in diesem Falle befindet sich das Protein in dem Blutkreislauf der transgenen Maus) als auch in vitro nach dem Kultivieren von Zellinien, die aus Tumoren stammen.
• In gleicher Weise können im Falle von Lebertumor-Zellen die Fremdgene unter die Kontrolle von starken Promotoren in den Leberzellen, beispielsweise den Promotor von α- Antitrypsin, von Albumin, gestellt werden, dem gegebenenfalls das "Verstärker-Element des Hepatitis-B-Virus zugesetzt wird (Babinet et al., 1985).
• Es ist auch möglich, weniger spezifische Promotoren zu verwenden, um auf diese Weise mehrere Typen von Tumoren zu erzeugen (Palmiter, 1986). Unter den üblicherweise verwendeten Elementen können genannt werden der "Verstärkungs"-Promotor von SV40, der Hauptverzögerungs-Promotor des Adenovirus, der Metallothionein-Promotor der Maus und der H-2-Promotor der Maus.
• Die Promotor-Elemente der Ig können auch zur Verstärkung der Expression der Fremdgene in den Hybridomen verwendet werden, die aus der Fusion der Milzzellen von transgenen Mäusen mit Myelom-Zellen stammen.
• Die Isolierung von Transhybridomen, welche das Human- Wachstumshormon exprimieren, wurde bereits beschrieben (Babinet et al., 1986); das Gen wird unter die Kontrolle des Promotors H-2K der Maus gestellt, bei dem es sich um einen ziemlich schwachen Promotor handelt, der jedoch ein breites Wirtszellen-Spektrum hat.
• Verfahren, welche die Einführung des Vektors in Eier erlauben, sind bereits bekannt; insbesondere dann, wenn es nützlich ist, zur Konstruktion des Vektors Plasmide als Synthese-Zwischenprodukt zu verwenden, ist es dagegen bevorzugt, den Vektor in Form der linearen oder so weit wie möglich von Bakteriensequenzen befreiten DNA einzuführen.
• Die Reimplantations-, Selektions- und Kultivierungs- Verfahren sind ebenfalls bereits bekannt und bestimmte Vertreter derselben werden in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben.
• Man kann auch den Grad der Expression der Fremdgene in den Tumorzellen oder in den Transhybridomen erhöhen (verbessern), indem man diese Gene mit einem Gen ligiert, das die Beständigkeit gegen einen Inhibitor amplifizieren kann (beispielsweise die Gene der Dihydrofolat-Reduktase oder der Adenin-Deaminase). Nach der Behandlung der Zellen in vitro mit dem entsprechenden Inhibitor (Methotrexat oder 2'-Deoxycoformycin) kann man Klone selektionieren, die eine Coamplifikation des zu exprimierenden Gens und des Selektions-Markers und somit einer Erhöhung (Verbesserung) der Expression des Fremdgens aufweisen.
• Die vorliegende Erfindung erlaubt die Entwicklung von neuen Systemen zur Herstellung von therapeutisch vorteilhaften (interessanten) Proteinen:
• - der Inhibitor der neutrophilen Human-Elastase, das α- Antitrypsin, und seine Varianten an der aktiven Stelle αAT (Leu³&sup5;&sup8;), αAT (Arg³&sup5;&sup8;) und αAT (Ala³&sup5;&sup7;, Arg³&sup5;&sup8;), die bestimmt sind für die Behandlung des Lungenemphysems und von thrombotischen Störungen und des Bluthochdrucks, können erfindungsgemäß unter Verwendung von neuen Zellinien gebildet werden;
• - neue Zellinien, die aus in der Leber induzierten Tumoren stammen, erlauben die Bildung von Proteinen, die eine bedeutende post-translatorische "Behandlung" erfordern, wie der Faktor IX, das Protein C und der Faktor VIII der Blutgerinnung, der Gewebeaktivator des Plasminogens (TPA), die Pro-Urokinase und dgl., sowie virale Antigene (beispielsweise verschiedene Antigene des HIV-Virus);
• - allgemein kann die vorliegende Erfindung angewendet werden zur Expression und Bildung aller Proteine, die in höheren Eukaryontenzellen synthetisiert werden müssen;
• - das Verfahren ist nicht auf die Species Maus beschränkt, sondern kann auch auf die Ratte, das Hühnchen, das Kaninchen, das Schwein, das Rind, auf Bakterien und Fische angewendet werden.
• Die Erfindung betrifft außerdem die transgenen (transgenetischen) Tiere, die im Verlaufe der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, sowie die dabei erhaltenen Zellen und Zellinien.
• Gegenstand der Erfindung sind schließlich die Proteine, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, und insbesondere Proteine aus der Leber, wie u-Antitrypsin und seine Varianten, oder die Faktoren VIII und IX der Blutkoagulation und ihre Analoga, die im wesentlichen die gleiche therapeutische Aktivität aufweisen.
• Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 11 hervor. Es zeigen:
• Fig. 1 die Struktur des Gens der leichten Kette K des Immunglobulins der Maus, das von der Myelom-Linie MPC11 abgeleitet ist;
• Fig. 2 die Struktur von pTG1999
• HCE = "Verstärker der schweren Kette"
• SS = Signal-Sequenz;
• Fig. 3 die Konstruktion des Vektors pTG1993, der die Elemente zur Kontrolle der Transkription und Translation des Immunglobulins umfaßt Abkürzungen:
• HCE = "Verstärker der schweren Kette";
• VLR = Promotor der leichten Kette;
• Restriktions-Stellen:
• B BamHI E EcoRI
• P PstI H HpaI
• St StuI X XhoI
• N NsiI Ha HpaI
• Hc HincII C ClaI
• Sm SmaI
• Fig. 4 die Einführung des Oligonucleotids TG616/617 in die Stelle (Sequenz) NsiI von pTG1958;
• Fig. 5 die Erzeugung einer Stelle (Sequenz) ClaI in dem Intron, welches die Signal-Sequenz der leichten Kette Ig trägt, in M13TG1930;
• Fig. 6 die Konstruktion des Plasmids pTG1990, das die Einführung der cDNA von α&sub1;AT in ein Plasmid erlaubt, das die Elemente zur Kontrolle der Transkription und Translation des Immunglobulins trägt (Abkürzungen: vgl. Fig. 3-M = Methionin; A = Arginin);
• Fig. 7 die Einführung einer Stelle (Sequenz) SmaI in den nicht-übersetzten 3'-Bereich der cDNA von α&sub1;AT (gleiche Abkürzungen wie in Fig. 3);
• Fig. 8 die Konstruktion von pTG1999, ausgehend von den Plasmiden pTG1993 und pTG1990;
• Fig. 9 Einzelheiten der Struktur von pTG1999, ausgehend von dem "Start" des Exons (2);
• Fig. 10 die Einführung des Gens des großen Antigens T von SV40 unter der Kontrolle des Promotors der schweren Kette von Ig in das pTG1999 (gleiche Abkürzungen wie in der Fig. 3); und
• Fig. 11 die Einführung des Gens c-myc unter der Kontrolle des Promotors der schweren Kette Ig in das pTG1999 (gleiche Abkürzungen wie in der Fig. 3).
Verfahren 1) Manipulationen der DNA
• Allgemein wendet man klassische Verfahren an, wie sie von
• R. Maniatis, E.F. Fritsch und J.B. Sambrook, in "Molecular cloning, a laboratory manual" (1982), Cold Spring Harbor Press, beschrieben sind.
Konstruktion von neuen DNA-Molekülen a.1. Herstellung von Vektoren und Fragmenten
• Die Restriktionsenzyme werden entsprechend den Instruktionen des Lieferanten (New England Biolabs et Promega Biotech) verwendet.
• Man inkubiert 1 bis 2 ug DNA in 100 ul mit der erforderlichen Enzymmenge, um eine vollständige Digestion innerhalb von 2 h bei 37ºC zu erzielen (die Digestion wird überprüft durch elektrophoretische Agarose-Gel-Analyse). Um das Hintergrundrauschen zu vermindern und die Religation der Vektoren zu verhindern, werden sie mit alkalischer Bakterien-Phosphatase oder mit Kalbsintestinal-Phosphatase behandelt, wodurch die 5'-Phosphat-Enden eliminiert werden (man verwendet 20 Einheiten Phosphatase in einem 0,1 M Tris pH 8,0-Puffer 2 h lang bei 37ºC). Die DNA wird durch Extraktion mit Phenol-Chloroform gereinigt, dann mit Ethanol ausgefällt und in dem Puffer 10 mM Tris pH 7,5 1 mM EDTA in einer Konzentration von etwa 100 ng/ul wieder aufgelöst.
• Die Vektoren mit freien Enden werden hergestellt durch Digestion mit der Nuclease S&sub1; von Aspergillus oryzae. Man inkubiert 5 ug DNA, die durch ein Restriktionsenzym geschnitten worden ist, mit 10 Einheiten Nuclease S&sub1; in einem Volumen von 100 ul einer Lösung von 0,3 M NaCl, 0,03 M CH&sub3;COONa, pH 4,8, und 0,003 M ZnCl&sub2;. Die Reaktion wird 20 min lang bei 37ºC fortgesetzt, dann wird sie durch Zugabe von 10 mM EDTA abgestoppt. Die DNA wird wie weiter oben angegeben gereinigt. Die DNA-Fragmente, die in die Vektoren inseriert werden sollen, werden wie folgt hergestellt: 5 bis 10 ug DNA werden durch geeignete Restriktionsenzyme digeriert und die Fragmente werden durch Elektrophorese an einem Agarose-Gel voneinander getrennt, dann wird das ausgewählte Fragment aus dem Gel zurückgewonnen (nach dem klassischen Verfahren von H.O. Smith "Methods in Enzymology" (1980), 65, 371-380, ED. Grossmann und Moldave).
• Die nach der Mutagenese in den Vektoren M13 erhaltenen Fragmente werden vor ihrer Insertion in den Vektor nicht erneut gereinigt, da kein Hintergrundrauschen vorliegt, das auf M13 nach der Selektion mit Ampicillin zurückzuführen ist.
• Die synthetischen Oligonucleotide werden vor ihrer Verwendung mit Kinase behandelt (man inkubiert 30 min lang bei 37ºC 200 ng Oligonucleotid, 20 ul Reaktionsmischung: 50 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA und 10 Einheiten T&sub4;-Polynucleotid-Kinase).
• Die für gerichtete Mutagenesen bestimmten Oligonucleotide werden in diesem Zustand gewonnen durch Ausfällung mit Ethanol in Gegenwart von 10 ug t-RNA-Träger.
• Die als "Linker" oder "Adapter" dienenden Oligonucleotide werden wie folgt behandelt:
• wenn die beiden Stränge nicht identisch sind, werden sie einer Gesamt-Kination unterworfen; die Paarung der beiden Stränge (sowie die Paarung der komplementären Stränge) erfolgt durch 10-minütiges Erwärmen auf 65ºC, gefolgt von einem langsamen Abkühlen auf 30ºC und dann mindestens 4 h lang auf 4ºC.
a.2. Gerichtete Mutagenese von DNA-Fragmenten
• Die zu mutierenden DNA-Fragmente werden in eines der Einzelstrang-Derivate des Phagen M13 inseriert und mit Synthese-Oligonucleotiden, welche die gewünschte Sequenz tragen, gepaart.
a.3. Ligation der DNA-Fragmente
• Die Ligations-Mischungen umfassen im allgemeinen 100 ng DNA des Vektors und 50 bis 200 ng DNA des zu inserierenden Fragments oder 100 bis 200 pmol Oligonucleotid in 200 ul des Puffers 10 mM Tris pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2- Mercaptoethanol und 2 mM ATP. Die Inkubation wird 16 h bei 14ºC oder 2 h lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
a.4. Transformation der kompetenten Zellen
• Kompetente Zellen der Stämme E. coli 5 K (für die Plasmide) und JM103 (für die M13) werden nach klassischen Verfahren transformiert.
b. Überprüfung der Konstruktionen
• DNA-Präparate werden in kleinem Maßstab hergestellt, wobei man von gegen Ampicillin resistenten Kolonien oder M13-Zonen ausgeht, und die DNA wird mit Restriktionsenzymen oder durch Sequenzierung analysiert.
• Die Sequenzierung der DNA wird durchgeführt nach dem Verfahren von Sanger et al., "Proc. Natl. Acad. Sci." 1977, 74, 5463).
c. Herstellung von DNA-Fragmenten in einem Saccharose- Gradienten
• Saccharose-Gradienten (15-25%) werden hergestellt in einem Puffer 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA; die ausgeschnittene DNA wird in einer Menge von 10 ug in einem Maximalvolumen von 300 ul dem Maximalwert des Gradienten zugesetzt und 16 h lang bei 20ºC mit 30 K zentrifugiert.
• Aufeinanderfolgende Fraktionen von 400 ul werden mit dem Maximum des Gradienten gesammelt und durch Elektrophorese auf einem Agarose-Gel eines Aliquots von 15 ul analysiert. In den gewählten Fraktionen wird die DNA mit Ethanol ausgefällt und durch Extraktion mit Phenol-Chloroform gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in dem Puffer TE wieder aufgelöst. Die Reinheit des Präparats wird durch Elektrophorese auf einem Gel bestätigt. Die geeigneten Verdünnungen werden durch Injektion erzeugt (in der Größenordnung von 5 bis 10 ng/ml).
2. Verfahren zur Herstellung von transgenen (transgenetischen) Mäusen durch Infektion von DNA in das Ei einer Maus
• Man verwendet:
• - Mäuse, die in der Lage sind, viele kleine Eier zu produzieren und bereit sind für die Befruchtung durch männliche Mäuse. Man verwendet zu diesem Zweck Mäuse des Stammes C57xSJL, die man mit Sexualhormonen behandelt;
• - Mäuse, die in der Lage sind, eine Schwangerschaft auszutragen; dafür verwendet man weiße "Swiss"-Mäuse, die bereits eine vollständige Schwangerschaft hinter sich haben.
• Man verwendet befruchtete Mäuse C57xSJL, um aus ihren Ovarien die befruchteten kleinen Eier zu extrahieren.
• In die Kerne der befruchteten kleinen Eier, hier als "Eier" bezeichnet, injiziert man die Fremd-DNA, dann reimplantiert man die Eier in die Ovarien der tragenden "Swiss"-Mäuse, in denen sie sich entwickeln.
a) Behandlung der Mäuse C57xSJL
• Der Maus werden zwei Hormone injiziert, bevor sie mit einem Männchen zusammengebracht wird:
• - 48 h vorher erhalten die Mäuse eine Injektion von PMSG (ein Schwangerschafts-Mark-Serum Gonadotrophin (FSH) in einer Menge von 10 U/Maus) in einer Dosis von 0,2 ml pro Maus. Diese Behandlung erlaubt die Erzielung von Mäusen, die deutlich mehr kleine Eier produzieren als normale Mäuse;
• - unmittelbar vor dem Zusammenbringen der weiblichen Mäuse mit den männlichen Mäusen injiziert man ihnen 0,2 ml HCG (Human-Chorion-Gonadotrophin (LH) in einer Menge von 5 U/Maus), damit das Weibchen die Paarung mit dem Männchen akzeptiert.
• Die Mäuse bleiben dann eine Nacht lang mit den Männchen zusammen, mit denen sie sich paaren (90% der Weibchen werden befruchtet).
• Am folgenden Morgen werden sie von den Männchen getrennt, dann getötet. Man extrahiert die beiden Ovarien jeder Maus (6 bis 10 Mäuse pro Tag) und aus jedem Ovarium extrahiert man die kleinen Eier und die Eier, die in einer unter einem Mikroskop sichtbaren Tasche enthalten sind.
b) Vorbehandlung der Eier für die Infektion
• Um die Eier in gutem Zustand zu halten, wird das Ovarium, wenn es extrahiert worden ist, in eine Prinster-Lösung eingeführt, deren pH-Wert äquilibriert wird, indem man sie in einen Ofen bei 37ºC einführt unter einer Atmosphäre von 5 bis 6% CO&sub2;.
• Die aus dem Ovarium extrahierten Eier werden dann mit einem Folikel-Gewebe agglutiniert, das eliminiert werden soll, indem man sie 20 min lang in einer Hyaluronidase-Lösung stehen läßt. Nachdem sie auf diese Weise individualisiert worden sind, werden die Eier zweimal in der Prinster-Lösung gewaschen. Anschließend werden sie selektioniert, weil es viele abweichende und geplatzte Eier gibt.
• Im allgemeinen erhält man 50 bis 60 Eier. Um sie anschließend unter dem Mikroskop zu manipulieren, werden die Eier in einen Tropfen einer Prinster-Hepes-Lösung eingeführt, die mit Cytochalasin versetzt ist. Diese Lösung verleiht dem Ei eine bessere Beständigkeit gegen Injektion.
c) Infektion von DNA in die Eier
• Durch Betrachten im Mikroskop (Vergrößerung 100-fach und 200-fach) werden die Eier erneut selektioniert. Man trennt diejenigen, die befruchtet worden sind (sie enthalten zwei Kerne) von denjenigen, die nicht befruchtet sind. In die befruchteten Eier wird anschließend injiziert.
• Um das Ei bei der Injektion an Ort und Stelle festzuhalten, wird es mittels einer dicken Nadel mit abgerundeten Enden angesaugt; die DNA wird mit einer sehr feinen Nadel, die man in eines der Kerne einsticht, injiziert; man setzt die Injektion fort, bis man sieht, daß sich die Membran dieses Kerns (Nucleoplasma) erweitert.
• Die Nadeln werden betätigt mit Hilfe von Mikromanipulatoren, die beiderseits des Mikroskops installiert sind. Bestimmte Eier, in die zu häufig injiziert worden ist, platzen. Man eliminiert sie und behält für die Reimplantation nur die Eier zurück, in die korrekt injiziert worden ist.
d) Vorbereitung von weißen "Swiss"-Mäusen
• Am Vorabend der Behandlung werden etwa 15 "Swiss"- Mäuse mit vasektomisierten Männchen zusammengebracht, die nicht mehr in der Lage sind, die kleinen Eier der Weibchen zu befruchten. Nach einer Nacht zusammen mit dem Männchen müssen diejenigen Weibchen, die sich mit den Männchen gepaart haben, ermittelt werden. Zu diesem Zweck genügt es, an der Öffnung des Uterus der Maus einen durchscheinenden Pfropfen zu finden, der durch die Spermaflüssigkeit des Männchens gebildet worden ist. Jedes Weibchen, das diesen Pfropfen aufweist, wird als geeignet für den Beginn einer Schwangerschaft angesehen.
• Unter etwa 15 weiblichen Mäusen gibt es etwa 1 bis 5 Mäuse, die für die Reimplantation selektioniert werden.
e) Reimplantation der Eier in die tragenden Mäuse
• Nach der Anästhesie einer "Swiss"-Maus macht man einen Einschnitt in die Haut derselben in dem Bereich, in dem sich das Ovarium befindet. Dieses wird, einmal gefunden, aus dem Körper der Maus herausgezogen. Man ermittelt darauf die Tasche, welche die Eier enthält, man bringt eine Öffnung an, um die Einführung der Kapillar-Pipette zu ermöglichen, in die man die Eier angesaugt hat. Man bläst den Inhalt der Pipette in die Tasche und auf diese Weise sind die befruchteten und injizierten Eier bereit für den Beginn des Schwangerschafts-Cyclus.
• Anschließend führt man das Ovarium wieder an die richtige Stelle ein und schließt die Einschnitte, die bei der Maus vorgenommen worden sind.
3) Herstellung von Hybridomen
• Die Fusion von Milz-Zellen und Myelom-Zellen zur Herstellung (Bildung) von Hybridomen erfolgt nach dem Verfahren, wie es von G. Köhler und Milstein, 1974, in "Nature", 256, 495, beschrieben worden ist.
4) Messung von α&sub1;-Antitrypsin in dem Plasma von Mäusen durch den ELISA-Test
• Man verwendet einen sehr empfindlichen "Sandwich"- ELISA-Test (der 0,1 ng α&sub1;-AT nachweisen kann), wie er von Michalski et al. 1985, "J. Immunol. Meth." 83, 101-112, entwickelt worden ist.
• Kurz zusammengefaßt wird dabei ein Schaf-Anti-αAT-Antikörper auf den Cupula von Immunnachweis-Platten (Nunc- Immunplatte) adsorbiert.
• Reihenverdünnungen einer Standard-Lösung von α-AT und der zu analysierenden Plasmen werden hergestellt und mit den Cupula 1 h lang bei 370 in Kontakt gebracht. Nach dem Spülen wird die fixierte α-AT mittels eines zweiten Antikörpers vom Kaninchen nachgewiesen. Dabei wird ein Anti- Kaninchen-Antikörper, der mit Biotin markiert ist, fixiert, der seinerseits einen Peroxidase-Streptavidin-Komplex fixiert (Amersham). Der fixierte Komplex wird mit einer Lösung von 0,1% o-Phenylendiamin (Sigma)-1% Methanol- 0,1% Wasserstoffperoxid-H&sub2;O nachgewiesen. Die Reaktion wird nach 20 min durch Zugabe von 3 M Schwefelsäure abgestoppt. Die gefärbte Reaktionsmischung wird im Titertek- Uniscan-Spektrophotometer gemessen.
• Die gemessenen Werte werden in ein Diagramm im doppelt-logarithmischen Maßstab eingetragen und die mit der Standard-Lösung von α-AT aufgestellte Kurve erlaubt die Berechnung der Konzentrationen jeder Probe.
Beispiel 1 Expression eines Fremdgens in transgenen (transgenetischen) Mäusen unter Verwendung der Transkriptions- und Translations-Regulatoren der Immunglobuline A. Konstruktion eines Expressionsvektors für Human-α&sub1;- Antitrypsin (Variante Arg³&sup5;&sup8;): pTG1999
• Das Gen des Human-α-Antitrypsins wurde als erstes Modell gewählt. Die Ausgangs-Konstruktion ist ein Plasmid, welches die codierende Sequenz der Variante Arg³&sup5;&sup8; von α- AT trägt, pTG1951 (dieses Plasmid unterscheidet sich von pTG152 (das in dem französischen Patent 86.09608 beschrieben ist) nur durch eine Restriktionsstelle; jedes andere Plasmid, das den gleichen Expressionsblock trägt, könnte ebenfalls verwendet werden).
• Die codierende Sequenz von α-AT wird unter die Kontrolle der Regulatorelemente des Maus-Immunglobulins gestellt, die aus dem umgelagerten Gen der leichten Kette K, MPCII stammen, wie von Kelley et al. (1982) beschrieben (vgl. Fig. 1).
• Das Protein der leichten Kette wird durch drei Exonen codiert: das Exon 1 codiert für den größten Teil der Signal-Sequenz (die verantwortlich ist für die Exkretion des Protein aus den Zellen hinaus), das Exon 2 codiert für die vier letzten Aminosäuren der Signal-Sequenz und für die variable Region und das Exon 3 codiert für die konstante Region. Der Promotor ist in den 200 Basenpaaren angeordnet, die dem ersten Exon vorhergehen, und der Transkriptions-"Verstärker" ist in dem zweiten Intron angeordnet. Es ist möglich, daß auch andere Regionen für die Transkription und die Stabilität der mRNA wichtig sind.
• Um die codierende Sequenz von α-AT mit der Signal-Sequenz der leichten Kette zu fusionieren, müssen alle Sequenzen in 3'-Stellung der Signal-Sequenz einschließlich des "Verstärkers" deletiert werden. Diese Deletion kann durch die Insertion des "Verstärkers" stromaufwärts von der schweren Kette der Immunglobuline kompensiert werden.
• Andererseits fügt man stromabwärts von der Sequenz α- AT die Polyadenylierungs-Sequenz von SV40 zu.
• Die Struktur des Plasmids pTG1999 ist in der Fig. 2 schematisch dargestellt.
• Die Manipulation der Sequenzen der leichten Kette des Ig ist in der Fig. 3 schematisch dargestellt: Das Fragment PstI von 3,5 kb von pK&spplus; MPC11, das die Signal-Sequenz und die für die variable Region codierende Sequenz enthält, wurde in die Stelle (Sequenz) PstI des Plasmids pUC8 subkloniert unter Bildung von pTG1958.
• Dieses Plasmid wurde mit der Einzel-Sequenz NsiI geöffnet und die Enden wurden freigemacht durch Digestion mit Nuclease S1, wobei man pTG1967 erhielt. Ein kleines Oligonucleotid (TG616/617, dargestellt in der Fig. 4) wurde in die Stelle (Sequenz) NsiI eingeführt; dieses Oligonucleotid umfaßt die Stellen (Sequenzen) der Wiedererkennung durch die Restriktionsenzyme XhoI, HpaI, ClaI.
• Nach der Insertion des Oligonucleotids in der gewünschten Orientierung wird die Stelle (Sequenz) NsiI auf einer Seite regeneriert. Diese Manipulation erlaubt die Rückgewinnung (Regenerierung) des Fragments NsiI-HindIII von pTG1958 in Form des Fragments HpaI-HindIII für die Einführung in einen Vektoren M13, um verschiedene Manipulationen und die Wiedereinführung in pTG1958 oder eines seiner Derivate in Form des Fragments NsiI-HindIII zu ermöglichen. Unter den verschiedenen Klonen, die das Oligonucleotid integriert haben, behält man das pTG1967 zurück, dessen Sequenzierung zeigt, daß darin eine einzige Kopie und in der richtigen Orientierung integriert worden ist (Fig. 4).
• Das Fragment HpaI-HindIII von 2 kb wird anschließend in das durch SmaI und HindIII geöffnete M13mp8 eingeführt unter Bildung von M13TG1930. Durch gerichtete Mutagenese wird eine einzelne Stelle (Sequenz) ClaI an der Verbindung zwischen der Signal-Sequenz und der codierenden Sequenz der leichten Kette geschaffen, um die Einführung eines Fremdgens zu ermöglichen. Die Sequenz (Stelle) ClaI wird erzeugt durch Änderung von 2 Nucleotiden (vgl. Fig. 5) im Innern des Introns, was keine Konsequenz im Bereich der Sequenz aus Aminosäuren nach sich ziehen muß; darüber hinaus ist diese Mutation von der normalen "Spleißungs"- Aufnahmestelle ausreichend entfernt. In der Fig. 5 ist die verfolgte Strategie im Detail dargestellt.
• Es wurde ein Klon selektioniert: M13TG1932.
• Das Fragment NsiI-HindIII von 2 kb von M13TG1932 wurde zurückgewonnen (regeneriert) und in pTG1991, ein Derivat von pTG1958, wieder eingeführt.
• Das pTG1991 ist ein Derivat von pTG1958, in das ein Fragment von 0,9 kb, das den "Verstärker" der schweren Kette des Immunglobulins enthält, in die einzelne Stelle (Sequenz) StuI eingeführt worden ist, etwa 0,6 kb stromaufwärts von dem Initiator-ATG der leichten Kette. Das Fragment, welches den "Verstärker" der schweren Kette des Ig enthält, ist das Fragment XbaI-XbaI, das von Church et al. (1985) beschrieben worden ist.
• Dieses Fragment wurde in die Stelle XbaI von pUC18 kloniert unter Bildung von pTG1962; es wurde anschließend in Form eines Fragments SmaI-HindII zurückgewonnen, um in die Stelle StuI von pTG1958 eingeführt zu werden. Ein Klon, pTG1991, wurde zurückgehalten, der den "Verstärker" in der gewünschten Orientierung aufweist, wie in der Fig. 3 gezeigt.
• Das pTG1991 wurde durch NsiI und HindIII geöffnet und mit Phosphatase behandelt, um die Insertion des Fragment NsiI-HindIII von M13TG1932 (wie weiter oben beschrieben), das nicht-phosphatiert ist, zu ermöglichen. Nach der Ligation und Transformation werden die Rekombinanten analysiert und selektioniert auf die Anwesenheit der Stelle (Sequenz) ClaI. Einer der Kandidaten wurde zurückbehalten: pTG1993. Dieses Plasmid ist bereit für die Aufnahme der Insertion eines zu exprimierenden Fremdgens, insbesondere des Gens von α&sub1;-Antitrypsin.
• Das Plasmid pTG1951 (französisches Patent 86.09608) trägt ein Insert BglII-PstI von 1,3 kb, welches die cDNA der Signal-Sequenz und des reifen Proteins des Human-α&sub1;- Antitrypsins, Variante Arg, enthält.
• Zur Einführung des Polyadenylierungssignals von SV40 stromabwärts von dem Stoppcodon des Gens α-AT ist es erforderlich, durch ein Restriktionsenzym eine Schnittstelle zu erzeugen. Um dies zu bewirken, führt man eine gerichtete Mutagenese in einem Vektor M13 durch (die angewendete Strategie ist in der Fig. 7 schematisch dargestellt): das Fragment BamHI-PstI von 1,1 kg von pTG1951 wird zwischen den Stellen (Sequenzen) BamHI und PstI von M13mp701 eingeführt unter Bildung von M13TG1920. Mit einem Synthesenucleotid erzeugt man eine Stelle /Sequenz) SmaI am 3'- Ende von M13TG1920. Man behält einen Kandidaten, M13TG1923, zurück, dessen Struktur durch Sequenzierung bestimmt wird.
• Ein Fragment EcoRV-PstI von 0,45 kb wird aus dieser Konstruktion zurückgewonnen und zwischen den Stellen (Sequenzen) EcoRV und PstI von pTG1950 wieder eingeführt unter Bildung von pTG1957 (vgl. Fig. 3).
• Das Polyadenylierungssignal von SV40 kann aus einem Plasmid pTG1986 zurückgewonnen werden, das aus pUC8 stammt durch Addition eines Fragments SalI-BglII von 0,12 kb (dieses Fragment enthält die Nucleotide 2533 bis 2666 des Virus SV40), das die Polyadenylierungsstelle von SV40 trägt, die so orientiert ist, daß sie, bezogen auf die Stelle (Sequenz) SmaI in der Richtung 5'→3' aktiv ist.
• Man gewinnt ein Fragment StuI-SmaI von 1,1 kb aus pTG1957 zurück für die Einführung in die Stelle (Sequenz) SmaI von pTG1986 in der Weise, daß die Stelle (Sequenz) BamHI des Inserts distal in bezug auf die Stelle ( Sequenz) polyA ist. Diese Konstruktion wird als pTG1990 bezeichnet.
• Die letzte Stufe der Konstruktion ist der Ersatz des Fragments ClaI-HindIII von pTG1993 durch das Fragment BamHI-HindIII von pTG1990. Um ein Ende ClaI mit BamHI wieder zu verbinden-, verwendet man einen Syntheseadapter (vgl. Fig. 8 und 9); dieser umfaßt auch die beiden ersten Codons, die dem reifen α&sub1;-Antitrypsin entsprechen, die durch die Digestion mit BamHI deletiert worden waren.
• Eine Rekombinante, deren Struktur durch Sequenzierung bestimmt wurde, wurde zurückgehalten: pTG1999.
B. Mikroinjektion von pTG1999 in Maus-Eier
• Man weiß, daß die Anwesenheit von Sequenzen des Vektors (pBR322, pUC8, pUC18) eine Inhibierungswirkung auf die Expression eines Transgens in dem Tier haben kann. Um die Konstruktion Ig-αAT von pTG1999 von den Vektor-Sequenzen zu befreien, digeriert man das Plasmid mit SalI und XmnI (Fig. 8). Das gesuchte Fragment von 4,0 kb wird von zwei weiteren Fragmenten (von 0,8 und 1,8 kb) durch Zentrifugieren in einem Saccharosegradienten abgetrennt. Der Pool der Fraktionen, der 4,0 kb enthält, wird anschließend mit Ethanol ausgefällt, in 200 ul des Puffers TE wieder aufgelöst, mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol wieder ausgefällt und in 10 ul des Puffers TE wieder aufgelöst. Die fertige DNA-Lösung wird durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert, um das Fehlen von Spuren von verunreinigenden Vektorfragmenten zu bestätigen.
• Dieses DNA-Präparat von 40 ng/ml wird in die befruchteten Eier von Mäusen injiziert. Man injiziert etwa 500 Kopien pro Ei. Insgesamt wurde in 1014 Eier injiziert, die in 72 weibliche Mäuse reimplantiert wurden. Man erhielt so 158 Mäusejunge.
• Man analysiert die DNA jedes Mäusejungen anhand eines DNA-Präparats, das aus den Schwänzen der Mäusejungen extrahiert wurde, durch Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde, die aus pTG1990 stammt, durch "Nick-Translation". Ein einziges Mäusejunges ergibt ein positives Signal, das die Anwesenheit des Gens anzeigt, es wird als S.TG1999/1 bezeichnet.
• Ein zweiter Versuch wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt; es wurde in 706 Eier injiziert; sie wurden in 32 weibliche Mäuse reimplantiert; man erhielt 87 lebende Mäusejunge. Unter diesen haben 7 das Transgen integriert: S.TG1999/2 bis 8.
• Die Maus S.TG1999/1 ist ein Weibchen. Es wurde mit einem Männchen gepaart und die Nachkommen wurden untersucht, um festzustellen, ob das Transgen von einer Generation zur anderen stabil war. Unter 19 Mäusejungen, die in drei Würfen erhalten wurden, trugen fünf das Transgen. Es ist somit wahrscheinlicher, daß die Maus S.TG1999/1 eher ein "Mosaik" als eine homogene Maus war, in der jede Zelle das Gen integriert hatte.
C. Bestimmung von α-Trypsin in dem Blut der transgenen (transgenetischen) Maus S.TG1999/1
• Die in dem Plasma der transgenen Maus vorhandene Menge an α-Antitrypsin wurde durch einen Elisa-Test (beschrieben in dem Abschnitt "Verfahren") bestimmt.
• Die Ergebnisse sind in der Tabelle I g 19 dargestellt.
• Man stelle eine signifikante Menge an α-AT fest: 2 bis 8 ug/ml. Das eingesetzte Modell des Fremdgens in Abhängigkeit von den Transkriptions- und Translationselementen der Immunglobuline ist somit bei der Maus funktionsfähig.
D. Herstellung von α&sub1;-Antitrypsin durch Hybridome die aus der Maus S.TG1999/1 stammen
• Die Maus S.TG1999/1 wurde mit dem Freund-Adjuvans stimuliert und eine Woche später getötet. In diesem Augenblick wurden 15 ug/ml α-AT in dem Blut nachgewiesen.
• Die Milz-Lymphozyten wurden hergestellt und fusioniert mit den Myelom-Zellen P3.X63Ag8.653. Man erhielt 48 Klone und die Kulturüberstände wurden durch Elisa analysiert.
• Die zwei besten Produktions-Klone A2 und A5 produzieren (bilden) 3 ng/ml. Nach der Subklonierung wurden nach 5-tägiger Kultivierung eine Produktion (Bildung) von 10 bis 15 ng/ml erhalten.
Beispiel 2 Induktion von Tumoren in transgenen (transgenetischen) Mäusen mit Vektoren, die das große Antigen T von SV40 und den Expressionblock von Human-α&sub1;-Antitrypsin tragen A. Konstruktion des Vektors
• Man gewinnt die Elemente von SV40, die Gesamtmenge des Gens des großen Antigens T und das Polyadenylierungs- Signal, aus einem Plasmid, das konstruiert wurde, um das Tollwut-Glycoprotein pTG173 (französisches Patent 83.15716) zu exprimieren, es kann aber auch jedes andere Plasmid, das die gleichen Sequenzen trägt, verwendet werden.
• Das Plasmid pTG173 (Fig. 10) enthält zwischen den Nucleotiden 2533 und 346 die Gesamtheit des großen Antigens T von SV40 mit seinem Polyadenylierungs-Signal. Es kann in Form eines Fragments StuI-BamHI von 2,65 kb zurückgewonnen (regeneriert) werden, durch das Schneiden mit StuI wird jedoch die frühreife Promotor-Region bis zu dem Initiator- ATG deletiert.
• Um einen Immunglobulin-Promotor stromaufwärts von dem Gen T von SV40 einzuführen, wurde das Plasmid pTG173 mit StuI digeriert, welches das Plasmid ein zweites Mal schneidet in dem Gen des Tollwut-Proteins (Fig. 10).
• Um den Promotor der schweren Kette des Maus-Immunglobulins zurückzugewinnen, verwendet man ein Plasmid pCLSvp, das von pUC18 stammt, das zwei Polylinker und ein Insert von 400 pb enthält, das aus dem Hybridom NP-186-2 stammt, das von Bothwell et al. (1981) beschrieben worden ist.
• Für die Einführung in das große Fragment StuI-StuI von pTG173 (Fig. 10) durch Ligation der freien Enden wählt man ein Fragment SmaI-SmaI. Die erhaltenen Transformanden werden analysiert zur Bestimmung der Orientierung des Inserts Tg und ein Kandidat wird zurückbehalten: pTG2914.
• Die letzte Stufe dieser Konstruktion ist die Insertion der Promotor-Sequenzen Ig-Gen T von SV40 in Form eines Fragments BamHI in die Stelle (Sequenz) BglII von pTG1999 (wie in Beispiel 1 beschrieben).
• Der Promotor der schweren Kette von Ig findet sich somit wieder in Form der "Verstärker"-Sequenz des gleichen Ig und die Transkription, die er kontrolliert, erfolgt in einer Richtung entgegengesetzt zu derjenigen des Gens α-AT (Fig. 10).
• Diese Stufe erfordert eine partielle Digestion durch BamHI unter gut kontrollierten Bedingungen, weil auch eine Stelle (Sequenz) BamHI zwischen dem Antigen T und dem Promotor Ig existiert. Das durch BamHI partiell digerierte DNA-Fragment wird anschließend in pTG1999 inseriert, das durch BglII geöffnet worden ist, und mit Phosphatase behandelt.
• Die Transformanden werden analysiert zur Bestimmung der jeweiligen Orientierung ihrer Inserts und um festzustellen, ob während der Klonierung keine Umlagerung in dem Insert von 3,5 kb stattgefunden hat. Ein Kandidat wird zurückgehalten: pTG2917.
• Wie in dem vorhergehenden Beispiel wurde diese Konstruktion von Vektor-Sequenzen befreit durch Digestion diesmal mit dem Enzym FnuDII, das mehrmals in den Vektor schneidet, nicht jedoch in den Expressionsblock. Das Fragment FnuDII von 2,7 kb wurde in einem Saccharose-Gradienten gereinigt und für die Mikroinjektion präpariert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
B. Injektion des Fragments FnuDII von 7,2 kb von PTG2917 in die Eier von Mäusen
• Man injiziert etwa 500 Kopien pro Ei; es wurden Injektionen in 1166 Eier vorgenommen und diese wurden in 104 weibliche Tiere reimplantiert; man erhielt 78 lebende Mäusejunge; unter ihnen hatten 11 das Transgen integriert.
C. Bestimmung des Gehaltes an α-Antitrypsin in dem Plasma der transgenen (transgenetischen) Mäuse S.TG.2917
• Die Gehalte an α-AT, gemessen in den Plasmen der transgenen (transgenetischen) Mäuse, sind in der Tabelle I angegeben (9 Mäuse - zwei starben während der Manipulationen).
• Die Mäuse, die lange genug überlebt hatten, wurden ein zweites Mal untersucht. Die anderen starben entweder im Verlaufe der Blutentnahmen durch Herzpunktion oder wegen des Wachstums ihrer Tumoren.
• Bei den Mäusen S.TG2917/2, 4, 7 und 9 ist die Zunahme der Gehaltes an α-AT, gemessen bei der zweiten Blutentnahme, wahrscheinlich zurückzuführen auf die Entwicklung von Tumoren.
D. Pathologie der transgenen (transgenetischen) Mäuse und Bildung von Tumoren
• Bis zum Augenblick der Entwicklung der Tumore unterscheiden sich die transgenen (transgenetischen) Mäuse nicht stark von normalen Mäusen des gleichen Wurfs. Bestimmte Tiere weisen jedoch eine spezielle Morphologie des Kopfes auf, der kleiner ist und runder ist, und diese Charakteristik ist auf die Nachkommenschaft übertragbar. Außerdem weisen bestimmte Tiere neurologische und motorische Störungen auf. Die genaue Ursache für diese Störungen ist nicht bekannt.
• Die Entwicklung der Tumore erfolgt zwischen der 10. und der 18. Woche nach der Geburt. In der Mehrzahl der Fälle stellt man eine Hypertrophie der Lymphoid-Knoten und des Thymus fest. Man beobachtet gelegentlich große Tumormassen, die aus Mesenterial- oder Brachial-Lymphoid- Knoten stammen. Man kann Hyper- oder Hypotrophien der Milz und gelegentlich eine Vergrößerung der Speicheldrüsen feststellen. Man findet keine Tumore in dem Gehirn, während solche beschrieben sind für Tumore, die durch das Antigen T von SV40 unter der Kontrolle des frühreifen Promotors von SV40 induziert worden sind. Tabelle I Bestimmung des Gehaltes an α&sub1;-AT in dem Plasma von transdenen (transgenetischen) Mäusen, die das Fragment SalI von pTG2917 trafen Maus Alter im Augenblick des Todes ug/ml α-AT in dem Plasma Entnahme Todessache Bemerkungen Herzversagen während der Blutentnahme Nachkommen getötet zahlreiche Lymkphoid-Tumore Intestinal-Verschluß, hervorgerufen durch Tumore der Mesenterial-Knoten falsch-transgen (wie weiter unten gezeigt) abgerundeter Kopf; motorische Schwierigkeiten; Nachkommen
E. Vermehrung der Tumorzellen in vivo
• Die Vermehrung der ausgewählten Tumorzellen der transgenen (transgenetischen) Mäuse kann bewirkt werden durch subkutane oder intraperitoneale Injektion von 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen, die aus einer Tumormasse (durch leichten Druck auf die Zellmasse) gewonnen worden sind, in einem Eagle-Medium + 10% FC-Serum. Die Empfänger-Mäuse sind Hybride C57xSJL.
• Es wurde die Vermehrung der Tumorzellen der Mäuse S.TG2917/1, 2917/4, 2917/7 und 2917/8 untersucht. Nur die aus STG2917/8 extrahierten Zellen induzierten die Entwicklung von neuen Tumoren.
• Die Untersuchung dieser Mäuse nach ihrem Tod zeigt eine Hypertrophie der Milz, des Thymus, des Uterus. Die histologische Untersuchung dieser Gewebe zeigt eine Invasion durch eine große Anzahl von Lymphoid-Zellen. Diese Zellen sind kleiner als diejenigen, die man in den Tumoren der transgenen (transgenetischen) Mäuse S.TG2926 (folgendes Beispiel) beobachtet, was ein späteres Entwicklungsstadium anzeigt.
• Es wurde das Plasma dieser Mäuse, die Tumore der zweiten Generation trugen, untersucht; man fand darin 0,5 bis 1 ug/ml α-AT je nach Maus.
F. Vermehrung der Tumorzellen in vitro
• Nach dem Tod der Maus entnimmt man ein Tumorgewebe- Fragment und bringt es in 5 ml Kulturmedium Eagle + 10% FC-Serum + 50 uM Mercaptoethanol + 100 uM Asparagin ein und injiziert das Medium vorsichtig in die Tumormasse, um die Zellen zu verteilen. Man gewinnt die Zellen zurück und inokuliert 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen pro Petrischale mit einem Durchmesser von 2,5 cm. Man inkubiert die Kulturen 2 Tage lang bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2;.
• Der Kulturüberstand wird anschließend in einem Elisa- Test untersucht, um die Menge an sekretierter α-AT zu bestimmen. Man erhält 3 ng/ml.
Beispiel 3 Induktion von Tumoren in transgenen (transgenetischen) Mäusen mittels eines Vektors, der das Maus-Gen c-myc und den Expressionsblock von Human-α&sub1;-Antitrypsin enthält A. Konstruktion des Vektors
• Es wurde eine ähnliche Konstruktion wie diejenige von pTG2917 durchgeführt; das Gen T von SV40 wurde durch ein Fragment Xba-BamHI von 4,8 kb, welches die Exonen 2 und 3 des Maus-Gens c-myc enthielt, ersetzt.
• Dieses Fragment wurde aus pSV2gpt/c-myc zurückgewonnen (vgl. Fig. 11). Dieses Plasmid (beschrieben von Bernard et al., 1983) enthält ein Fragment XbaI-BamHI von 4,8 kb, das die zweiten und dritten Exonen des Maus-Gens c-myc enthält (das erste Exon ist nicht-codierend). Der Promotor der schweren Kette der Ig wurde zurückgewonnen, in diesem Falle in Form des Fragments XbaI, aus pCSLvp und stromaufwärts von dem Gen c-myc in die Stelle (Sequenz) XbaI von pSV2gpt eingeführt. Ein Kandidat wurde zurückbehalten: pTG2903; die jeweilige Orientierung der Inserts ist in der Fig. 11 angegeben.
• Es existiert eine Stelle (Sequenz) SalI zwischen dem Promotor Ig und dem Gen c-myc. Um die End-Konstruktionen zu erleichtern und das Ganze wie ein einziges Restriktionsfragment zurückzugewinnen, ist es erforderlich, diese Stelle (Sequenz) zu supprimieren. Zu diesem Zweck wird pTG2903 durch SalI geöffnet, die Einfachstrang-Enden werden durch Nuclease S&sub1; digeriert und das Plasmid wird durch die Ligase T4 wieder geschlossen.
• Man behält den Klon pTG2910 zurück; die Analyse seiner Restriktionskarte bestätigt, daß er die Stelle (Sequenz) SalI verloren hat, daß jedoch die Stellen (Sequenzen) XbaI und SphI beibehalten worden sind, was zeigt, daß die Digestion durch S&sub1; nicht zu weit getrieben worden ist.
• Das Fragment BamHI von 5,2 kb von pTG2910, welches den Promotor der schweren Kette Ig und das Gen c-myc enthält, wird anschließend in die Stelle (die Sequenz) BglII von pTG1999 eingeführt. Man behält einen Transformanden, pTG2926, zurück, in dem die Transkription von c-myc in entgegengesetzter Richtung zu derjenigen von α-AT erfolgt.
• Zur Herstellung der in die Eier von Mäusen zu injizierenden DNA eliminiert man die Vektorsequenzen, wie weiter oben beschrieben, durch Digestion mit SalI.
B. Infektion des Fragments SalI von 8,8 kb in die Eier von Mäusen und Herstellung von transgenen (transgenetischen) Mäusen
• Man injiziert etwa 500 Kopien pro Ei; man erhielt 1102 Eier mit Injektionen, die in 50 weibliche Mäuse reimplantiert wurden; man erhielt 69 lebende Mäusejunge, von denen 11 das Transgen (S.TG2926/1 bis 11) trugen.
• Die Ergebnisse sind in der Tabelle II dargestellt. Wie in dem vorhergehenden Beispiel mißt man eine signifikante Menge an α-AT in dem Plasma.
• Zwei Mäuse (S.TG2926/3 und 8) starben, bevor sie untersucht worden waren; 5 Mäuse starben oder wurden getötet zwischen der 8. und 9. Woche nach der Geburt und wiesen zahlreiche Lymphoid-Tumore auf; 3 Mäuse sind noch am Leben.
• 4 Mäuse haben ausreichend lange überlebt, um mit einem Männchen gepaart zu werden; nur zwei hatten Nachkommen (S.TG2926/6 und 11).
C. Pathologie der transgenen (transgenetischen) Mäuse und Bildung von Tumoren
• Nahezu alle transgenen (transgenetischen) Mäuse dieser Reihe sind kleiner als die normalen Mäuse des gleichen Wurfes.
• Die Mäuse, die Tumore entwickeln, weisen gleichzeitig ein Anschwellen der Achsel- oder Brachial-Lymphoid-Knoten auf. Diese Mäuse haben auch motorische Probleme und verenden, indem sie sich nicht mehr bewegen, wobei sie jedoch konstante Pulsfrequenzen aufweisen. Tabelle II Bestimmung des Gehaltes an α&sub1;-AT in dem Plasma von transgenen (transgenetischen) Mäusen, die nach der Infektion des Fragments SalI von pTG2926 erhalten wurden Maus Alter im Augenblick des Todes Wochen ug/ml α-AT in dem Plasma Entnahme Todessache Bemerkungen noch am Leben getötet zahlreiche Lymphoid-Tumore Nachkkommen nicht untersucht gestorben aufgrund ihrer Tumore
• Der Augenblick der Entwicklung des Tumors und des Todes des Tieres variieren von einer Maus zur andern. Bei der Untersuchung nach dem Tode weisen sie alle eine Hypertrophie der Lymphoid-Knoten, des Thymus und der Milz auf und gelegentlich weisen sie große Tumore auf, die aus Mesenterial- oder Brachial-Knoten stammen.
• Die histologische Untersuchung dieser Tumore zeigt eine beträchtliche Infiltration durch die Lymphoid-Zellen B oder T.
• 3 Mäuse (S.TG2926/1, 7 und 11) sind noch am Leben 18 Wochen nach ihrer Geburt und sie scheinen durch die Anwesenheit des Transgens nicht beeinflußt zu sein.
D. Vermehrung der Tumorzellen in vivo
• Die Zellen werden zurückgewonnen aus Brachial- oder Thymus-Knoten-Tumoren, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, und auf subkutanem oder intraperitonealem Wege in einer Dosis von 10&sup6; bis 10&sup7; Zellen pro Maus (C57xSJL) injiziert.
• Alle Mäuse, denen Injektionen verabreicht worden sind, erkranken innerhalb von 2 Wochen nach der Injektion mit Symptomen ähnlich denjenigen der transgenen (transgenetischen) Mäuse der ersten Generation. Man mißt einen Gehalt an α-AT von 1 bis 2 ug/ml in dem Plasma.
• Die Tumorzellen können zurückgewonnen und in neue Mäuse erneut injiziert werden: diese entwickeln die gleichen Tumore und produzieren (bilden) 1 bis 2 ug/ml α-AT in dem Plasma.
• Die histologische Untersuchung der Mäuse, denen erneut Injektionen beigebracht wurden, zeigt, daß die Tumore die gleiche Morphologie und die gleiche Lokalisation haben wie bei den ersten transgenen (transgenetischen) Mäusen. Man stellt fest, daß die durch pTG2926 induzierten Tumore einen sehr aggressiven und invasiven Charakter haben.
• Man hat versucht, durch intraperitoneale Injektion von Tumorzellen in Mäusen, die vorher mit Pristan behandelt worden waren, Ehrlich-Ascites-Tumore zu erzeugen. Die Mäuse haben keine Ascites-Tumore entwickelt, sie wiesen jedoch eine Hypertrophie der Lymphknoten, vor allem der Mesenterial-Knoten, und die Bildung von Tumoren auf. Dieser Versuch zeigt, daß für die Vermehrung dieser transformierten Zellen eine physiologische Umgebung, die für Lymphoid-Gewebe typisch ist, erforderlich ist.
E. Vermehrung der Tumorzellen in vitro
• Die Tumorzellen wurden wie in Beispiel 2 kultiviert. Der Kulturüberstand wurde unter Anwendung des Elisa-Tests untersucht; man erhielt 50 bis 600 ng α-AT/ml.
• Es ist somit möglich, permanente Zellinien zu erhalten, die α-AT exprimieren und sekretieren.
• Die Kultivierungsbedingungen und die Produktionsbedingungen können noch optimiert werden.
F. Untersuchung der Nachkommen der transgenen (transgenetischen) Mäuse S.TG2926
• Einige Mäuse hatten Nachkommen (vgl. Tabelle II); die Maus S.TG2926/6 ergab 15 Mäusejunge, von denen 8 das Transgen trugen; die Maus S.TG2926/11 hatte 13 Mäusejungen, von denen 6 das Transgen trugen.
• Die Nachkommen der Mäuse S.TG2926/1 und 7 trugen nicht das Transgen.
Hinterlegung von repräsentativen Stämmen der Erfindung
• Die folgenden Stämme wurden bei der Collection Nationale de Culture des Microorganismes (25, Rue du Dr. Roux, Paris) am 15. Juni 1987 hinterlegt:
• 5K/pTG1999 unter der Nr. I668
• 5K/pTG2917 unter der Nr. I669
• 5K/pTG2926 unter der Nr. I670.
Literaturstellen
• 1) R.D. Palmiter & R.L. Brinster, "Ann. Rev. Genetics", 20, 465-499 (1986).
• 2) G.H. Swift, R.E. Hammer, R.J. Mac Donald & R.L. Brinster, "Cell", 38, 639-646 (1984).
• 3) J.M. Adams, A.W. Harris, C.A. Pinkert, L.M. Corcoran & W.S. Alexander, "Nature", 318, 533-538 (1985).
• 4) C.J. Quaife, C.A. Pinkert, P.M. Ornitz, R.D. Palmiter & R.L. Brinster, "Cell", 1023-1034 (1987).
• 5) U. Rüther, Ch. Garber, Komitowski, R. Müller & E.F. Wagner, "Nature", 325, 412-416 (1987)
• 6) R.D. Palmiter, H.Y. Chen, A. Messing & R.L. Brinster, "Nature", 316, 457-460 (1985).
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• 8) C. Babinet, H. Farza, D. Morello, M. Hadchouel & C. Pourcel, "Science", 230, 1160-1163 (1985)
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• 12) G. Church, A. Ephrussi, W. Gilbert & S. Tonegawa, "Science", 227, 134-140 (1985).
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• 14) O. Bernard, S. Cory, S. Gerondakis, E. Webb & J.M. Adams, "EMBO J.", 2, 2375-2383 (1983).

Claims (28)

1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Zellinie, die ein vorgegebenes Protein bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Vektor herstellt, der umfaßt

- eine onkogene Sequenz sowie die Elemente, die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten- Zelle gewährleisten,

- einen Expressions-Block, der mindestens die für das genannte Protein codierende Sequenz sowie die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten-Tumorzelle gewährleistenden Elementen umfaßt, wobei das genannte Protein von demjenigen verschieden ist, das durch die genannte onkogene Sequenz exprimiert wird,

b) diesen Vektor in ein oder mehrere Eier eines Tieres einführt und das (die) erhaltene(n) Ei(Eier) wieder implantiert;

c) die Deszendenten, die das Onkogen integriert haben und Tumore entwickeln, selektioniert; und

d) die so erhaltenen Tumorzellen, die das vorgegebene Protein bilden, entnimmt und auf einem geeigneten Medium kultiviert (züchtet) zur Bildung einer Zellinie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommenen Tumorzellen vor der Kultivierung (Züchtung) in der Stufe (d) wieder in ein anderes Tier injiziert werden, um die Entwicklung von neuen Tumoren zu induzieren, deren Zellen kultiviert werden zur Bildung einer Zellinie.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommenen und kultivierten (gezüchteten) Tumorzellen Zellen eines Tieres einer Nachfolgegeneration sind, die ebenfalls Tumore entwickeln.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Onkogen so ausgewählt wird, daß es sich in dem behandelten Tier exprimieren kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Onkogen ausgewählt wird aus c-myc, c-ras, c-fos und dem Antigen T von SV40.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Vektor herstellt, der umfaßt

- einen Expression-Block, der mindestens die für das genannte Protein codierende Sequenz sowie die Elemente, die ihre Expression in einer höheren Eukaryonten-Zelle gewährleisten, umfaßt;

b) diesen Vektor in ein oder mehrere Eier eines Tieres einführt und das (die) erhaltene(n) Ei(Eier) wieder implantiert;

c) die Deszendenten, welche die für das genannte Protein codierende Sequenz integriert haben, selektioniert; und

d) die Lymphozyten der Milz dieser Tiere mit Myelom-Zellen fusioniert und Hybridom-Klone, die das Protein bilden, selektioniert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor praktisch frei von Bakterien-DNA ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein lineares DNA-Fragment ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente, welche die Expression des Onkogens gewährleisten, und diejenigen, welche die Expression des vorgegebenen Proteins gewährleisten, spezifisch sind für ein Gewebe oder für einen Zell-Typ.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente, welche die Expression gewährleisten, einen Promotor und einen Transkriptions-Aktivator umfassen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das für das genannte Protein codierende Gen mit einem Amplifikations-Gen assoziiert ist und daß man die Anzahl der Kopien des Gens, das für das genannte Protein codiert, amplifiziert durch Verwendung des Amplifikations-Gens in den erhaltenen Zellen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikations-Gen ausgewählt wird unter dem Gen der Dihydrofolat-Reduktase oder der Adenin-Deaminase.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Expression des Onkogens und des Proteins in einer Lymphoid-Zelle die Elemente, welche die Expression gewährleisten, Regulator-Elemente des Immunglobulins sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Promotoren ausgewählt werden aus:

- P.Ig (LC), das den Promotor für die leichte Kette der Immunglobuline darstellt, und

- P.Ig (LH), das den Promotor für die schwere Kette der Immunglobuline darstellt, und

- daß es sich bei dem Transkriptions-Aktivator handelt um

- (enh).Ig, das den "Verstärker" für die schwere Kette der Immunglobuline darstellt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Expression des Onkogens und des Proteins in den Leberzellen die Elemente, welche die Expression gewährleisten, Regulator-Elemente für die Synthese eines Leber-Proteins oder eines Leber-Virus sind.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ausgewählt wird unter den Promotoren von α-Antitrypsin und Albumin und daß der Transkriptions-Aktivator derjenige des Hepatitis B-Virus ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ausgewählt wird unter den Säugetieren, den Vögeln, den Reptilien und den Fischen.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das vorgegebene Protein ein Protein von therapeutischem Interesse (Vorteil) ist, das ausgewählt wird unter den Human- oder Tier-Proteinen und den Virus-Antigenen oder Antigenen eines anderen Ursprungs.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das vorgegebene Protein ein Human-Protein ist, das aus der Leber stammt, und daß die erhaltene Zellinie eine Lebertumor-Linie ist.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das vorgegebene Protein ausgewählt wird unter

- α-Antitrypsin,

- den Blut-Koagulationsfaktoren,

- ihren Varianten oder Analoga, die im wesentlichen die gleiche therapeutische Aktivität aufweisen oder nicht aufweisen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das vorgegebene Protein ausgewählt wird unter dem Faktor VIII und dem Faktor IX.

22. Nicht-humanes transgenes Tier, das erhalten wird durch Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Produktion eines Proteins mit therapeutischer Aktivität.

23. Tier nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine Maus handelt.

24. Zelle eines transgenen Tiers nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Onkogen und das vorgegebene Protein exprimiert.

25. Zelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine Lymphoid-Zelle oder um eine Leberzelle handelt.

26. Tumore, die aus der Transformation der Zelle nach einem der Ansprüche 24 oder 25 resultieren.

27. Zellinien, die nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 erhalten werden können oder aus Tumoren nach Anspruch 26 stammen.

28. Verfahren zur Herstellung eines vorgegebenen Proteins aus höheren Eukaryonten-Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellinien nach Anspruch 27 verwendet und das erhaltene Protein gewinnt (abtrennt).