DE3486469T2

DE3486469T2 - Herstellung heterodimirer menschlicher Fruchtbarkeitshormone

Info

Publication number: DE3486469T2
Application number: DE3486469T
Authority: DE
Inventors: Anton K. Ch 4148 Pfeffingen Beck; Edward G. Boston Ma 02109 Bernstine; Nancy Wellesley Ma 02181 Hsiung; Vemuri B. Framingham Ma 01701 Reddy
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1983-11-02
Filing date: 1984-10-31
Publication date: 1999-04-15
Anticipated expiration: 2004-11-01
Also published as: DE10199028I1; EP0160699A4; DK297285A; ATE190461T1; EP0957167A1; EP0160699A1; DE10199035I1; MX9203334A; EP0160699B1; DK171489B1; DE3486474T2; WO1985001959A1; ATE169334T1; DE10199028I2; DK297185A; DE3486469D1; NL300044I2; DK297285D0; EP0578328A1; LU90770I2

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken zur Herstellung heteropolymerer Proteine.
Mittels der rekombinanten DNA-Technik sind in Wirtszellen wie Bakterien, Hefe und kultivierten Säugerzellen verschiedene Polypeptidketten exprimiert worden, Fiddes, J. C. und Goodman, H. M. (1979) Nature Vol. 281, S. 351-356 und Fiddes, J. C. und Goodman, H. M. (1980) Nature Vol. 286, S. 684-687 beschreiben die Klonierung der alpha- bzw. beta-Untereinheiten von humanem Choriogonadotropin (hCG).
US-A-4383036 (Kaname) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von hCG, bei dem humane Lymphoblastoidzellen in ein Versuchstier implantiert, aus dem Tier geerntet und in vitro kultiviert werden; akkumuliertes hCG wird dann aus der Kultur geerntet.
Gemäß der Erfindung wird eine Zubereitung eines einzigen biologisch aktiven, posttranslational modifizierten, heteropolymeren, proteinartigen Hormons, das aus einer Mehrzahl von Untereinheiten zusammengesetzt ist, bereitgestellt, wobei die Zubereitung frei von jedem anderen derartigen Hormon ist.
Die posttranslationale Modifikation kann eine Glycosylierung sein. Das Hormon kann heterodimer sein und ist vorzugsweise ein humanes Fruchtbarkeitshormon wie hCG, luteinisierendes Hormon (LH) oder follikelstimulierendes Hormon (FSH); oder es kann das Hormon Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) sein.
Proteinartige Hormone der Erfindung können in einer eukaryotischen Zelle hergestellt werden, die einen ersten Expressionsvektor enthält, wobei die Zelle in der Lage ist, ein biologisch aktives, heteropolymeres Hormon der Erfindung zu produzieren, das wenigstens zum Teil durch den Vektor codiert ist. In bevorzugten Ausführungsformen codiert ein zweiter autonom replizierender Expressionsvektor einen zweiten Teil des Proteins, oder es werden wenigstens zwei Untereinheiten des Proteins durch einen einzigen Expressionsvektor codiert; das Protein ist hCG oder humanes luteinisirendes Hormon (LH); der Vektor ist ein replizierendes Virus oder ein Plasmid; die Zelle ist eine Affen- oder Mäusezelle; die Transkription der verschiedenen hCG- oder LH-Untereinheiten ist unter der Kontrolle des späten Promotors von SV40; die Transkription der alpha-Untereinheit des Proteins ist unter der Kontrolle des frühen Promotors von SV40, und die Transkription der beta-Untereinheit ist unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors, oder die Transkription beider Untereinheiten ist unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors; und der Expressionsvektor, der den Maus-Metallothionein-Promotor enthält, enthält außerdem wenigstens die 69%-transformierende Region des Genoms des Rinderpapillomavirus (BPV).
Alternativ können Hormone der Erfindung von einem autonom replizierenden Vektor exprimiert werden, der zwei Gene enthält, die zwei verschiedene heterologe Untereinheiten codieren, wobei die Gene unter der Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren sind, vorzugsweise einem Metallothionein-Promotor und einem BPV-Promotor; die Verwendung verschiedener Promotoren minimiert vorteilhafterweise die Möglichkeit fehlerhafter Rekombinationen.
Wie hier verwendet, bezeichnet "Untereinheit" einen Teil eines Hormons der Erfindung, wobei dieser Teil oder ein Homologes oder Analoges davon in der Natur durch eine gesonderte mRNA codiert wird.
Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezeichnet einen Klonierungsvektor, der (zum Vektor) heterologe DNA unter der Kontrolle von Kontrollsequenzen enthält, die eine Expression in einer Wirtszelle ermöglichen. Solche Vektoren umfassen replizierende Viren, Plasmide und Phagen.
Hormone der Erfindung können von einer einzigen Kultur transformierter Zellen produziert werden. Die Produktion beider Untereinheiten eines heteropolymeren Proteins in derselben Zelle beseitigt die Notwendigkeit der Rekombination von Untereinheiten aus getrennten Kulturen zum Zusammenbau eines aktiven heteropolymeren Moleküls. Das System ermöglicht auch die Produktion von Proteinen in einer einzigen Kultur, die in der Kultur zwecks Aktivität oder Stabilität eine posttranslationale Modifikation erfahren, z. B. eine Glycosylierung oder eine proteolytische Verarbeitung.
Die Verwendung autonom replizierender Expressionsvektoren verhindert eine unerwünschte Beeinflussung der gewünschten codierenden Regionen durch Kontrollsequenzen im Wirtschromosom.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und um zu zeigen, wie diese umgesetzt werden kann, werden nun bevorzugte Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, wobei:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p alpha SVHVP1 ist, das den alpha hCG-cDNA-Klon, Teile von SV40-Virus-DNA und Sequenzen des Plasmids pBR 322 enthält;
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p beta SVVP1 ist, das den beta hCG-cDNA-Klon, Teile von SV40-DNA und einen Teil von pBR 322 enthält, der die Region einschließt, die dem Wirt E. coli Ampicillin-Resistenz verleiht;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p beta SVVP1 ist, bei dem die alpha- und beta hCG-cDNA-Klone in SV40-DNA inseriert sind;
Fig. 4 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pRF375 und pRF398 ist;
Fig. 5 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids RF398 alpha t&sub2; ist;
Fig. 6 ein Diagramm ist, das den Ort einer 88-bp-Sonde in dem beta hCG-cDNA-Klon zeigt;
Fig. 7 die beta LH-Restriktionskarte und die bei der in Fig. 8 dargestellten Konstruktion verwendeten Teile zeigt;
Fig. 8 eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids, LH520H/B, ist, das den cDNA-Klon für vollständiges reifes beta LH enthält;
Fig. 9 eine schematische Darstellung der Konstruktion des viralen Vektors p alpha LHSVVP1 ist; und
Fig. 10 eine schematische Darstellung der Konstruktion BPV-haltigen Plasmids pCL28XhoLHBPV ist, das die beta-Untereinheit von LH codiert.

Struktur

Klonierungsvektoren, die bei der Herstellung von Proteinen der Erfindung verwendbar sind, besitzen die oben angeführte allgemeine Struktur.
Bevorzugte Vektoren besitzen die in den Figuren dargestellten Strukturen und sind nachstehend genauer beschrieben.

Konstruktion von Klonierungsvektoren

Isolation von cDNA-Klonen, welche die Alpha- und Beta-Untereinheiten von hCG codieren

Sämtliche hier verwendeten Techniken sind im Detail in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory), beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme eingeführt wird.
RNA wird durch das folgende Verfahren aus Plazenta-Gewebe extrahiert. Die Homogenisierung des Gewebes wird in einem 1 : 1-Gemisch von Phenol : 100 mM Na-Acetat (pH 5, 5) durchgeführt, das 1 mM EDTA enthält und das 20 Minuten auf 60ºC erwärmt worden ist. Nach 10-minütigem Abkühlen auf Eis werden die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die Extraktion mit heißem Phenol wird noch zweimal wiederholt, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform.
RNA wird aus der zuletzt erhaltenen wässerigen Phase durch Zusatz von 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt.
Um poly(A)+-mRNA anzureichern, läßt man die plazentare RNA in 0,5 M NaCl, gepuffert mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, über Oligo(dT)-Cellulose laufen und wäscht mit der gleichen Lösung. Poly(A)&spplus;-mRNA wird mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% SDS eluiert und zweimal mit Ethanol ausgefällt. Typische Anfangsausbeuten sind 1,5-2,0 mg Gesamt-RNA pro g Gewebe, wovon etwa 2% poly(A)&spplus;-mRNA sind.
Plazenta-cDNA-Bibliotheken werden durch Umkehrtranskription plazentarer mRNA, Synthese des zweiten Stranges mittels E. coli-DNA-Polymerase I (großes Fragment), Behandlung mit SI-Nuclease und Homopolymer-Tailing (dC) mit terminaler Desoxyribonucleotidyltransferase konstruiert; wobei alle diese Verfahren mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt werden.
Bei einer typischen Präparation werden 20-30% Umwandlung von mRNA in einzelsträngige (ss) cDNA, 70% Widerstandsfähigkeit gegenüber Verdauung mit Nuclease S 1 nach Synthese des zweiten Stranges und dC-"Schwänze" von zehn bis fünfundzwanzig Basen Länge erhalten. Diese cDNA-Moleküle werden dann durch Annealing mit DNA-Fragmenten des Plasmids pBR 322 verbunden, das mit PstI verdaut worden ist und an das dG-"Schwänze" angehängt worden sind. Diese rekombinanten Plasmide werden dann zur Transformation von E. coli-Zellen verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu schaffen (transformierte Zellen werden auf der Basis von Tetracyclin-Resistenz selektiert).
Um den menschlichen alpha hCG-Klon zu identifizieren, wird ein 219-bp-Fragment eines alpha-Klons von Thyreoidea-stimulierendem Hormon (TSH) aus Mäusen als Hybridisierungssonde verwendet. Diese Sonde weist 77% Sequenzhomologie mit dem menschlichen Klon auf. Sie wird durch Nick-Translation radioaktiv markiert und unter Bedingungen, die das Ausmaß an Homologie berücksichtigen, an die cDNA-Bibliothek hybridisiert. Stark hybridisierende Klone werden durch Restriktionskartierung analysiert, und Klone, welche die vollständige codierende Sequenz von alpha hCG enthalten, werden durch DNA-Sequenzierung nachgewiesen.

Konstruktion von Plasmid p alpha SVHVP1

Es wird nun auf Fig. 1 Bezug genommen. Für die Konstruktion des Plasmids alpha 970 H/B wird ein cDNA-Klon, der das alpha hCG-Fragment enthält, mit NcoI verdaut. Der NcoI-Ort, unmittelbar 5' zum ATG-Codon, das den Translationsbeginn signalisiert, wird aufgefüllt und mit einem synthetischen HindIII-Linker ligiert. Entsprechend wird der natürliche HindIII-Ort in der nichttranslatierten 3'-Region des Klons geschnitten, mit E. coli-DNA-Polymerase Klenow aufgefüllt und dann an einen synthetischen BamHI-Linker ligiert. Dieses Fragment wird in das Plasmid pBR 322 zwischen dessen HindIII- und BamHI-Orte kloniert, um das Plasmid alpha 574 H/B zu schaffen. Dieses Plasmid wird mit BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und an das 396-bp-Sau3A-Fragment von SV40-DNA (von Karteneinheit 0,07 bis 0,14) ligiert, das aus einem Polyacrylamidgel isoliert worden ist. Das Ligationsgemisch wird verwendet, um E. coli zur Ampicillin-Resistenz zu transformieren, und das gewünschte Plasmid, alpha 970 H/B, wird unter den Transformanten identifiziert.
Das Plasmid Q&sub2;7 wird durch Schneiden von SV40 an seinem HpaII-Ort, das Herstellen glatter Enden durch Verdauung mit Nuclease 51, Ligation an EcoRI-Linker, Verdauen mit EcoRI und Klonieren des resultierenden 1436-bp-Fragmentes in den EcoRI-Ort von pBR 322 konstruiert.
Wie in Fig. 1 dargestellt, wird Q27 vollständig mit EcoRI und teilweise mit HindIII verdaut; das Fragment von Karteneinheit 0,72 bis 0,94 wird isoliert und in alpha 970 H/B kloniert, das mit EcoRI und Hindill verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden ist. Das Ligationsgemisch wird verwendet, um E. coli zu transformieren, und das gewünschte Plasmid alpha p SVL wird unter den Transformanten durch Restriktionskartierung identifiziert.
p alpha SVL wird mit EcoRI verdaut, und das SV40-Fragment mit EcoRI-Enden, das sich von Karteneinheit 0 bis 0,72 erstreckt und den Replikationsstartpunkt und die intakte frühe Region von S V40 enthält, wird an dieses ligiert, um das Plasmid p alpha SHVP1 zu schaffen, das aus E. coli-Transformanten isoliert wird.

Konstruktion von Plasmid p beta SVVPI

Ein 579-bp-Klon, der für beta hCG codiert, wurde von John C. Fiddes bei Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Fiddes et al. (1980) Nature Vol. 286, Seite 684-687) erhalten. Dieses Fragment wird an jedem Ende an synthetische BamHI-Linker ligiert. Nach Verdauung mit dem Restriktionsenzym HgaI werden die Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt, und es werden synthetische EcoRI-Linker so anligiert, daß sich etwa 10 bp 5' zum ATG-Codon der signalpeptid-codierenden Sequenz ein EcoRI-Ort befindet. Ein BamHI-Ort befindet sich etwa 60 bp 3' zum Terminationscodon, welches das Ende der codierenden Sequenz kennzeichnet. Wie in Fig. 2 dargestellt, wird dieses 556-bp-EcoRI-BamHI-Fragment isoliert und in pBR 322 zwischen den EcoRI- und den BamHI-Ort kloniert, um das Plasmid p beta 556 R/B zu ergeben.
Um das Plasmid pSVHR (Fig. 2) zu konstruieren, wird SV40-DNA zur Gewinnung linearer Moleküle teilweise mit HindIII verdaut, mit Nuclease S1 verdaut, um glatte Enden herzustellen, an synthetische EcoRI-Linker ligiert und mit EcoRI und BamHI verdaut. Das Fragment von Karteneinheit 0,94 bis 0,14, das den Replikationsstartpunkt und die frühe Region von SV40 enthält, wird als ein EcoRI-BamHI-Stück in pBR 322 kloniert.
Wie außerdem in Fig. 2 dargestellt, wird der EcoRI-Ort des Plasmids p beta556 R/B in einer durch EcoRI-Methylase katalysierten Reaktion methyliert, wonach das Plasmid mit NdeI geschnitten wird. Es werden EcoRI-Linker an die SI-behandelten glatten NdeI-Enden ligiert und durch Verdauung mit EcoRI aktiviert, gefolgt von einer Verdauung mit BamHI.
Das SV40-Fragment von pSVHR vom EcoRI-Ort zum BamHI-Ort wird isoliert und in einem Reaktionsgemisch, das die Verdauungsfragmente von p beta 556 R/B enthält, ligiert. Nach der Ligation wird das Gemisch mit SaII verdaut, um Plasmide zu entfernen, in die das EcoRI (NdeI)-bis-BamHI-Stück von pBR 322 wieder inseriert ist. E. coli wird mit dem verdauten Ligationsgemisch transformiert, und p beta SVVP1 wird identifiziert und isoliert.

Konstruktion von Plasmid p Alpha Beta SVVP1

Wie aus Fig. 3 ersichtlich, wird pBR 322/Kpn aus pBR 322 gewonnen, indem ein KpnI-Linker in dessen einzigen EcoRI-Ort inseriert wird, nachdem dieser Ort durch Verdauung mit EcoRI deletiert wurde und eine anschließende Verdauung mit 51 erfolgt ist.
Wie außerdem in Fig. 3 dargestellt, wird SV40-DNA mit AvaII verdaut. Die versetzten Enden der resultierenden Fragmente werden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt, um glatte Enden zu bilden, und das Gemisch wird dann auf einem Polyacrylamidgel fraktioniert. Das 682-bp-Fragment (Karteneinheit 0,64 bis 0,77), das den Replikationsstartpunkt und den nur einmal vorhandenen NpiixI-Ort enthält, wird aus dem Gel isoliert, an synthetische HindIII-Linker ligiert und mit Hindill und KpnI verdaut.
Die resultierenden Fragmente werden an pBR 322/Kpn ligiert. p266, das das 266-bp-KpnI-HindIII-Fragment enthält, welches die Region des späten Promotors von SV40 einschließt, wird isoliert. p266 wird mit HindIII und BamHI geschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.
Wie ebenfalls in Fig. 3 dargestellt, wird p beta SVVPI/B folgendermaßen konstruiert: p beta SVVPI (Fig. 2) wird mit EcoRI geschnitten, gefolgt von einer Ligation, um pBR 322-Sequenzen zu entfernen. Anschließend wird diese DNA mit BamHI geschnitten und in den BamHI-Ort von pBR 322 kloniert.
Das resultierende Plasmid p betaSVVPI/B wird dann mit Hindill und BamHI verdaut, und das 1003-bp-HindIII-BamHI-Fragment wird in p266 ligiert, um das Plasmid p beta VP1 266 zu ergeben, in dem die beta hCG-cDNA derart stromabwärts vom späten SV40-Promotor angeordnet ist, daß sein RNA-Transkript so gespleißt werden würde, als wäre es das virale VP1-Transkript.
Die alpha hCG-cDNA wird in p beta VP1 266 als HindIII-Fragment inseriert, das an seinem HindIII-Ort geschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden ist. Aus dieser Ligation gewonnene E. coli-Transformanten werden durch Restriktionskartierung gescreent, und es werden Plasmide mit der gewünschten Struktur isoliert, in denen die alpha hCG-cDNA VP2 in der richtigen Orientierung ersetzt hat, stromabwärts gefolgt von der beta hCG-cDNA, die VP1 ersetzt hat.
Ein solches isoliertes Plasmid, p alpha beta VP1, wird verwendet, um die Konstruktion von p alpha beta SVVP1 zu vollenden. Das Plasmid wird mit KpnI geschnitten, und das vollständige SV40-Genom, geschnitten mit KpnI, wird durch Ligation in diesen Ort inseriert. Nach Transformation von E. coli wird ein Plasmid mit der gewünschten Struktur, p alpha beta SVVP1, isoliert. Dieses Plasmid enthält DNA, die sowohl die alpha- als auch die beta-Untereinheit von hCG codiert, und somit in der Lage ist, in Säuger-Wirtszellen die Expression beider Untereinheiten zu steuern, wodurch biologisch funktionelles, glycosyliertes heterodimeres hCG produziert wird (Glycosylierung erfolgt posttranslational).

Konstruktion der Plasmide pRF 375 und pRF 398

Wie in Fig. 4 dargestellt, wird das Plasmid CL28 (identisch mit Plasmid JYMMT(E); Hamer et al. (1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288), das den Maus-Metallothionein-Promotor, SV40-DNA und pBR 322-Sequenzen enthält, mit der Restriktionsendonuclease BglII geschnitten. An diesem Ort werden cDNA-Klone von entweder alpha hCG oder beta hCG inseriert, die nichttranslatierte Regionen von etwa 10 und 30 bp an ihren 5'-Enden und von etwa 220 und 60 bp an ihren 3'-Enden enthalten. Diese Klone sind durch Anfügen synthetischer BamHI-Linker an ihre Enden gentechnisch verändert worden.
Die resultierenden Plasmide pRF 302 (alpha) oder pRF 394 (beta) werden mit den Restriktionsenzymen BamHI und Sah verdaut, um die SV40-DNA-Sequenzen freizusetzen.
Plasmid pB2-2, das das gesamte BPV-Genom und einige pBR 322-Sequenzen enthält, wird mit BamHI und Sah verdaut, um das BPV-Genom mit BamHI/SaU-Enden zu ergeben; dieses Fragment wird in pRF 302 (alpha) und pRF 394 (beta) ligiert, welche die Metallothionein-hCG-Sequenzen enthalten.
Nach Transformation von E. coli werden die Plasmide pRF 375 und pRF 398 identifiziert und isoliert. Sie codieren alpha hCG bzw. beta hCG unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors.

Konstruktion des Plasmids RF 398 alpha t&sub2;

Wie in Fig. 5 dargestellt, wird das Plasmid p alpha t&sub2; durch Klonieren des alpha hCG-574-HindIII-Fragmentes in Plasmid pVBt2 gewonnen (V. B. Reddy et aL, PNAS 79, 2064-2067, 1082). p alpha t&sub2;, das die alpha hCG-cDNA unter der Kontrolle des frühen Promotors von SV40 enthält, wird mit EcoRI verdaut. Die überstehenden 5'-Enden werden vor dem Anfügen synthetischer BamHI-Linker durch Ligation stumpfer Enden durch Verdauung mit S1-Nuclease entfernt.
Plasmid RF 398 (Fig. 4) wird mit BamHI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das 1735-bp-BamHI-Fragment von p alpha t&sub2; wird in RF 398 inseriert. Das resultierende Plasmid RF 398 alpha t&sub2; wird aus E. coli-Transformanten isoliert. Dieses Plasmid besitzt somit die beta hCG-cDNA in einer Transkriptionseinheit unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors und die alpha hCG-cDNA in einer von dem frühen SV40-Promotor kontrollierten Transkriptionseinheit.

Expression von cDNA-Klonen des luteinisierenden Hormons (LH)

Konstruktion einer menschlichen Hypophysen-cDNA-Bibliothek

Aus menschlichen Hypophysen wird durch Homogenisieren von 5 bis 10 g der gefrorenen Drüsen in 20 ml einer Lösung, die 4 M Guanidinthiocyanat, 1 M 2-Mercaptoethanol, 0,05 M Na-Acetat (pH 5,0) und 0,001 M EDTA enthält, RNA präpariert. Es wird 1 g CsCI pro ml Homogenat zugesetzt, und die Suspension wird 15 min bei 2.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig über ein 15-ml-Kissen aus CsCl-Lösung (die 1,25 ml 1 M Na-Acetat (pH 5), 62,5 Mikroliter 0,4 M EDTA und 39,8 g CsCl in einem Endvolumen von 35 ml enthält) geschichtet und 18-24 h bei 20ºC bei 45.000 Upm in dem Ti 70-Rotor einer Beckmann-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Die als Häutchen in dem Gradienten sichtbare RNA wird mit einer Spritze entfernt, verdünnt und durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach drei Zyklen Verdünnung und erneuter Ausfällung wird das RNA-Pellet in H&sub2;O verdünnt und durch Zugabe konzentrierter Stammlösungen auf 0,01 M Tris-HCl (pH 7,5) und 0,5 M NaCl gebracht. Die Präparation wird dann, wie oben im Falle der Plazenta-RNA beschrieben, durch zweimaliges Laufenlassen über Oligo(dT)-Cellulose mit poly(A)&spplus;-mRNA angereichert.
Von der poly(A)&spplus;-mRNA wird eine menschliche Hypophysen-cDNA-Bibliothek hergestellt, wie dies oben für Plazenta-poly(A)&spplus;-mRNA beschrieben ist, mit Ausnahme, daß sowohl das große Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I als auch die reverse Transkriptase des aviären Myeloblastenleukämie-Virus (AMV) aufeinanderfolgend zur Synthese des zweiten cDNA-Stranges verwendet werden. Das Klenow-Fragment wird zuerst verwendet. Die Reaktion wird durch Phenolextraktion gestoppt.
Die wässerige Phase des zentrifugierten Extraktes wird auf eine 5-ml-Säule von BioGel A-5m aufgebracht. Fraktionen, die Material von hohem Molekulargewicht enthalten, werden gesammelt, aufkonzentriert, mit zwei Volumen Ethanol ausgefällt, getrocknet und für die Umkehrtranskription in 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl&sub2;, 140 mM KCl, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM jeder der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate gelöst. Reverse Transkriptase wird bis etwa 20 Einheiten pro Mikrogramm cDNA zugesetzt. Doppelsträngige cDNA wird dann mit Nuclease S1 behandelt, mit Schwänzen versehen und, wie oben beschrieben, kloniert.

Isolation von Beta LH-cDNA-Klonen

Kolonien, die auf Nähragarplatten mit 25 Mikrogramm Tetracyclin pro ml gewachsen sind, werden auf Nitrocellulose-Filter transferiert. Die Kolonien werden durch Behandlung mit 0,5 M NaOH in situ lysiert und mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), das 1,5 M NaCl enthält, neutralisiert. Die freigesetzte DNA wird durch 2-stündiges Backen bei 80ºC in einem Vakuumofen an dem Filter fixiert. Die Filter werden durch Hybridisierung an ein 32P-markiertes 88-bp-Fragment des beta hCG-Klons gescreent, das den Aminosäuren 16 bis 45 der reifen hCG-beta-Kette entspricht und 29 von 30 Aminosäuren mit dieser Region des LH-Polypeptids gemeinsam hat (Fig. 6). Die Hybridisierung wird über Nacht bei 32º in 50% Formamid, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-Citrat (pH 7,0), 2,5% Dextransulfat, 0,1% Polyvinylpyrollidon, 0,1 mg pro ml Rinderserumalbumin und wenigstens 105 cpm ³²P-markiertem 88-bp beta hCG-Fragment pro Filter durchgeführt. Die Filter werden vor der Autoradiographie mehrere Male in 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat bei 37ºC gewaschen. Einer der positiven isolierten Klone LH12 (Fig. 7) wird weiterverwendet. LH12 ist 365 bp lang und enthält Sequenzen, die für 15 Aminosäuren der Prä-beta-Signalsequenz plus 105 Aminosäuren des reifen LH-Polypeptids codieren. Seine Nucleotidsequenz wird bestimmt. Da das vollständige reife LH nicht von LH12 codiert wird, erfolgt ein weiteres Screening der menschlichen Hypophysen-cDNA-Bibliothek mittels eines 240-bp-NcoI-PvuII-Fragmentes von LH12 (Fig. 7) als ³&sup7;P-markierter Hybridisierungssonde. Anhand dieses Screenings wird der Klon LH6 (Fig. 7) isoliert. LH6 enthält das vollständige 3'-Ende von beta LH, einschließlich der Region, die dem nichttranslatierten Teil der mRNA durch 27 A-Reste des Poly(A)-"Schwanzes" der mRNA entspricht. Es werden keine Klone gefunden, die sich weiter als LH12 in die 5'-Richtung erstrecken. Die DNA-Sequenzierung der vollständigen, vereinigten, für reifes LH codierenden Regionen offenbart zwei Abweichungen in der LH-Aminosäuresequenz von den veröffentlichten Proteinsequenzdaten: Position 42 ist ein Methionin und Position 55 ist ein Valin. Auch enthält das reife LH laut der cDNA-Sequenz 121 Aminosäuren.
Mittels des in Fig. 7 dargestellten Restriktionsfragmentes wird, wie in Fig. 8 gezeigt, ein Klon konstruiert, der eine intakte signalpeptid-codierende Sequenz und die vollständige Sequenz für reifes LH enthält. Aus dem Plasmid beta 579 H wird ein 104-bg-EcoRI-DdeI-Fragment isoliert und an ein isoliertes und anschließend mit Pstl verdautes 181-bp-DdeI-Fragment aus dem LHIZ-Plasmid ligiert. Nach der Ligation über Nacht bei 15ºC wird das Ligationsgemisch mit EcoRI und PstI verdaut und auf einem 7%igen Polyacrylamidgel fraktioniert, aus dem das gewünschte 256-bp-Fragment isoliert wird. Dieses Fragment vereinigt die beta hCG-Signalsequenz mit der von Prä beta-LH derart, daß es eine codierende Sequenz für ein 20-Aminosäuren-Signalpeptid liefert.
Das 256-bp-EcoRI-PstI-Fragment wird in pBR 322 kloniert, das mit EcoRI und PstI verdaut worden ist, um das Plasmid LH beta 260 zu ergeben. Das in Fig. 8 angegebene 146-bp-EcoRI-NcoI-Fragment wird aus einem Polyacrylamidgel isoliert und später bei der unten beschriebenen Konstruktion verwendet.
Das LH6-Plasmid (Fig. 8) wird mit Sau3a verdaut, und das 390-bp-Fragment wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wird dann mit HincII verdaut, an BamHI-Linker ligiert, mit BamHI verdaut und am BamHI-Ort in das Plasmid pAPP kloniert. pAPP wird aus pBR 322 durch Verdauung mit Aval, Auffüllen der überstehenden 5'-Enden mit den dNTPs und dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli, Verdauung mit PvuII und Ligation zum Schließen des Plasmids zwecks Entfernung des PvuII-Ortes gewonnen. Das Plasmid LH6B, das aus der Ligation des 340-bp-BamHI-Fragmentes in den BamHI-Ort von pAPP isoliert worden ist, wird mit EcoRI und PvuII verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die Fragmente werden an ein Gemisch des oben beschriebenen 145-bp-EcoRI-NcoI-Fragmentes von beta LH 260 und des isolierten 241-bp-NcoI-PvuII-Fragmentes aus dem in Fig. 8 dargestellten Plasmid LH12 ligiert. Das Ligationsgemisch wird verwendet, um E. coli zur Ampicillin-Resistenz S zu transformieren. Unter den Transformanten befindet sich das Plasmid LH 520 H/B. LH 520 H/B enthält eine vollständige beta LH-codierende Sequenz einschließlich einer Hybrid-Signalpeptidsequenz.

Konstruktion von p alpha LHSVVP1

Um diesen Prä alpha-LH-Klon in einem Vektor auf SV40-Basis zu exprimieren, wie es für die an früherer Stelle beschriebenen Prä-alpha- und Prä beta hCG-Klone durchgeführt wurde, ist es wünschenswert, einen EcoRI-Ort sehr nahe an dem ATG der Prä-beta-codierenden Sequenz anzuordnen. Dies wird erreicht durch Verdauung von LH520 H/B mit HgaI, Auffüllen des überhängenden 5'-Endes, Ligation an synthetische EcoRI-Linker, Verdauung mit EcoRI und BamHI und Klonieren des isolierten 496-bp-EcoRI-BamHI-Fragmentes in pBR 322, das mit EcoRI und BamHI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden ist. Das Plasmid pLH496 R/B wird aus E. coli, das mit diesem Ligationsgemisch transformiert worden ist, isoliert und wird als Quelle für das zu exprimierende 496-bp-Fragment verwendet.
Das Plasmid p alpha beta VP1, dessen Konstruktion und Verwendung bei der Expression beider hCG-Untereinheiten an früherer Stelle beschrieben wurde (Fig. 3), wird mit EcoRI und BamHI verdaut und in einem Reaktionsgemisch ligiert, welches das Plasmid pLH496 R/B enthält, das mit beiden dieser Enzyme verdaut worden ist (Fig. 9). Das Plasmid p alpha LHVPI wird unter den E. coli-Transformanten identifiziert. Wie in Fig. 9 dargestellt, wird p alpha SVHVP1 (Fig. 1) die intakte virale frühe Region von SV40 entnommen und durch Ligation als ein KpnI-SalI-Fragment in p alpha LHVP1 inseriert, das mit KpnI und SaII verdaut worden ist, um das Plasmid p alpha LHSVVP1 zu ergeben. Durch Schneiden dieses Plasmids mit BamHI und erneute Ligation wird das Virus alpha LHSVVP1 gebildet. Dieses Virus enthält klonierte cDNAs für die (LH und hCG sowie FSH und TSH) gemeinsame alpha-Untereinheit und die spezifische beta-Untereinheit von LH unter der Kontrolle des späten Promotors von SV40. Die klonierten cDNAs sind so angeordnet, daß das gemeinsame alpha-Insert die für virales VP1-Protein codierende Sequenz ersetzt und das beta LH-Insert die für virales VP2 codierende Sequenz ersetzt.

Insertion der Beta LH-cDNA (mit dem Beta hCG-5'-Ende des Signalpeptids) in ein Expressionssystem auf BPV-Basis

LH 520 H/B (Fig. 8) wird mit Hindill und BamHI verdaut, mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow) behandelt, an synthetische Sall-Linker ligiert, mit SalI verdaut und in den SalI-Ort von pBR 322 kloniert. Das resultierende Plasmid, LH 530 Sal, wird als Quelle für den LH-cDNA-Klon zur Insertion in das Maus-Metallothionein-Gen des Plasmids CL28 verwendet, wie in Fig. 10 beschrieben.
CL28 wird mit Bolil geschnitten, mit Nuclease 51 behandelt und an XhoI-Linker ligiert. Nach Verdauung mit XhoI, Ligation und Verdauung mit BgIII wird E. coli mit dem Reaktionsgemisch transformiert, um das Plasmid CL28Xho zu ergeben. Dieses Plasmid wird mit BamHI und SaII verdaut und an einen BamHI+SalI-Verdau des Plasmids pB2-2 (Fig. 4) ligiert, um das Plasmid CL28XhoßPV zu ergeben. Das letztere LH-Insert wird dann als ein SaII-Fragment in den XhoI-Ort von CL28XhoßPV ligiert, da das überstehende 5'-Ende der SaII-Verdaue komplementär zu dem der Xhol-Verdaue ist. Nach Verdauung mit XhoI zur Entfernung von Hintergrund wird E. coli transformiert, und es wird das gewünschte Plasmid pCL28XhoLHBVP isoliert, das das (hybride) Prä beta-LH-Insert in einem Plasmid auf BPV-Basis unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors enthält.

Transfektion und Infektion von Affen-Wirtszellen

Der Einbau virushaltiger Vektoren in eukaryotische Zellen zur Produktion eines heteropolymeren Proteins wird allgemein folgendermaßen durchgeführt. Wenn die virale DNA und die homopolymeres Protein codierende DNA in ein Plasmid eingebaut sind, das beispielsweise in E. coli erhalten wird, werden zunächst die Plasmidsequenzen (z. B. die pBR 322-Sequenzen) entfernt, und die resultierende DNA wird ligiert, um zirkuläre DNA zu bilden, welche die virale Region und die heteropolymeres Protein codierende(n) Sequenz(en) enthält. Diese zirkuläre DNA enthält im allgemeinen nicht alle genetischen Informationen, die zur Produktion eines replizierenden Virus erforderlich sind, wobei die anderen erforderlichen Informationen (z. B. jene, die Hüllprotein codieren) durch die heteropolymeres Protein codierende(n) Sequenz(en) ersetzt worden sind. Die zirkuläre DNA minus der Plasmid-DNA muß der natürlich vorkommenden viralen DNA, von der sie abstammt, in der Größe ähnlich genug sein, um es der DNA zu ermöglichen, in geeignete Säuger-Wirtszellen zu gelangen und dort zu replizieren.
Die zirkuläre DNA wird zur Transfektion von Wirtszellen verwendet, um eine Virus-Stammkultur für spätere Infektionen zu produzieren. Da ein Teil der zur Virusproduktion erforderlichen DNA fehlt, muß die Transfektion in Verbindung mit Helfervirus-DNA erfolgen, die genug von der fehlenden Funktion codiert, um ein replizierendes Virus zu hervorzubringen.
Die transfektierten Wirtszellen werden kultiviert und inkubiert, bis sie durch das replizierende Virus lysiert werden. Die resultierende replizierende Virus-Stammkultur einschließlich des Helfervirus wird dann verwendet, um Wirtszellen für die Produktion des heteropolymeren Proteins zu infizieren. Die Virus-Stammkultur wird erhalten, da sie im allgemeinen zur Infektion frischer Chargen von Wirtszellen wiederverwendet werden muß, weil jede Kultur infizierter, proteinproduzierender Wirtszellen im allgemeinen schließlich durch das Virus lysiert wird.
Die oben beschriebenen spezifischen rekombinanten DNA-Sequenzen werden folgendermaßen verwendet, um Wirtszellen zu transfektieren und dann zu infizieren. Die pBR 322-Sequenzen werden aus den oben beschriebenen SV40-haltigen Plasmiden entfernt, um transfektierende virale DNA zu erzeugen. Im Falle von p alpha SVHVPI und p beta SVVPI wird dies durch Verdauung mit BamHI erreicht, gefolgt von einer Ligation unter Bedingungen, die eine Zirkularisierung der Fragmente begünstigen, um (unter anderen Produkten) alpha SVHVP1 und beta SVVPI zu ergeben. Was p betaSVVP1 betrifft, so bringt eine Verdauung mit EcoRI, gefolgt von einer erneuten Ligation, den späten Promotor von SV40 und die VP1-Spleißregion in Nebeneinanderstellung mit dem beta hCG-cDNA-Insert, wobei zugleich pBR 322-Sequenzen eliminiert werden und beta SVP1 entsteht. Gleichzeitig wird ptsA58 Bam (in den BamHI-Ort von pBR 322 klonierte virale SV40-tsA58-DNA) mit BamHI geschnitten und ligiert, um selbstligierte Ringe zu erhalten. Entsprechende Verfahren werden für die LH-Vektoren verwendet. Einzelne Virus-Stammkulturen werden, wie unten beschrieben, präpariert.
Die DNAs, die, wie oben beschrieben, geschnitten und ligiert worden sind, werden mit Ethanol ausgefällt und in sterilem Wasser gelöst. Etwa 1 ug ptsA58 Bam-DNA (Helfervirus) und 10 ug rekombinante DNA (die alpha- und/oder beta hCG oder -LH codiert) werden in einem sterilen Reagenzglas kombiniert, mit 2 ml TBS-Puffer (G. Kimura und R. Dulbecco 1972, Virogy, 4% 79-81) und 1 ml einer DEAE-Dextran-Lösung (2 mg/ml) gemischt und zu einem Monolayer konfluenter Affen-CV-1-Zellen gegeben, die vorher in einem T-75-Glaskolben zweimal mit 10 ml TBS gewaschen worden sind. Die Zellen werden 1-2 h unter gelegentlichem Schütteln bei 37ºC stehen gelassen, zweimal mit TBS gewaschen, mit 10 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum enthält, gefüttert und 10-15 Tage bei 40ºC stehen gelassen. Nach vollständiger Zellyse wird das Medium in ein Reagenzglas überführt, fünfmal eingefroren und aufgetaut und fünf Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die resultierenden Überstände dienen als Virus-Stammkulturen zus Infektion frischer CV-1-Zellen.
Zur Durchführung einer Infektion werden CV-1-Zellen bis zur Konfluenz in einem T-150-Glaskolben kultiviert. Dem Glaskolben wird 1 ml einer der Virus-Stammkulturen (hergestellt wie oben beschrieben) zugesetzt, und die Zellen werden 5 Tage bei 40ºC inkubiert.
Für Mischinfektionen werden CV-1-Zellen bis zur Konfluenz in einem T-150-Glaskolben kultiviert. Alpha SVHVP1- und beta SVP1-Viren werden in einem 1 : 1-Verhältnis gemischt, und 1 ml des Mischvirus wird zur Infektion von CV-1-Zellen bei 40ºC verwendet.

Transfektion von Mauszellen

Um heterodimeres hCG mittels einer Mischtransfektion zu produzieren, werden fünf ug jedes BPV-Plasmids, d. h. pRF 375 (alpha hCG) und pRF 398 (beta hCG), gemischt und 0,5 ml einer 250 mM CaCl&sub2;-Lösung zugesetzt, die 10 ug Lachsspermien-DNA als Carrier enthält. Dieses Gemisch wird in 0,5 ml einer Lösung aus 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Natriumphosphat eingesprudelt. Man gestattet 30-40 Minuten lang bei Raumtemperatur die Bildung des Calciumphosphat-Niederschlags.
24 Stunden vor der Transfektion werden 5 · 105 Zellen von Maus-C127-Zellen (erhältlich von Dr. Dean Hamer, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD) in eine 100-mm-Schale oder einen T-75-Glaskolben gegeben. Unmittelbar vor Zugabe der exogenen DNA werden die Zellen mit frischem Medium (Dulbeccos Modifiziertes Medium, 10% fötales Kälberserum) gefüttert. Jeder Schale (10 ml) werden 1 ml Calciumphosphat-Niederschlag zugesetzt, und die Zellen werden 6-8 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Das Medium wird abgesaugt und für 2 Minuten bei Raumtemperatur durch 5 ml 20% Glycerin in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,0 (PBS) ersetzt. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit 10 ml Medium gefüttert und bei 37ºC inkubiert. Nach 20-24 Stunden wird das Medium ausgetauscht, und anschließendes erneutes Füttern der Zellen erfolgt alle 3-4 Tage. Einzelne Klone werden in T-25cm-Glaskolben kultiviert. Nach 7-21 Tagen können die Zellklone zwecks Analyse in größere Glaskolben überführt werden.
Um heterodimeres hCG mittels einer einzigen Transfektion zu produzieren, wird das Plasmid RF 398 alpha t&sub2; auf die gleiche Weise verwendet, wie die obigen zwei Plasmide zur Mischinfektion verwendet wurden.
Um heterodimeres LH zu erzeugen, werden die Plasmide pRF 375 und pCL28XhoLHBPV gemischt, wie oben im Falle von hCG beschrieben.
Eine interessante Beobachtung ist, daß die Kultivierung von Zellen, die nur beta hCG- oder beta LH-codierende Vektoren enthalten, in Abwesenheit von alpha-codierenden Zellen praktisch zu keiner Produktion von beta-Untereinheit führt, während Zellen, die alpha- und beta-codierende Sequenzen enthalten, nicht nur Heterodimer, sondern auch freie beta-Untereinheit produzieren. Dies erhärtet die Annahme, daß die Produktion beider Untereinheiten in einer einzigen Zellkultur den zusätzlichen Vorteil hat, daß die Anwesenheit der alpha-Untereinheit irgendwie die beta-Untereinheit stabilisieren kann.

Hinterlegungen

Die folgenden oben Beschriebenen sind in der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt worden:
alpha beta SVVP1, ATCC VR2077;
alpha SVHVP1, ATCC VR2075;
beta SVVP1, ATCC VR2075;
pRF 375 in C127-Zellen, ATCC CRL8401;
pRF 398 in C 127-Zellen, ATCC CRL8401;
pCL28XhoLHBPV E. coli, ATCC 39475;
pRF 398 alpha t&sub2; in C127-Zellen.

Verwendung

Die oben beschriebenen transformierten Zellinien werden zur Produktion biologisch aktiver, posttranslational modifizierter, heteropolymerer, proteinartiger Hormone der Erfindung verwendet. Erfindungsgemäßes hCG hat zum Beispiel mehrere wohlbekannte medizinische Verwendungszwecke in Verbindung mit menschlicher Fruchtbarkeit.

Weitere Ausführungsformen

Weitere Ausführungsformen liegen innerhalb des Schutzumfangs der folgenden Ansprüche. Zum Beispiel:
Es können andere heteropolymere Protein-Hormone, z. B. follikelstimulierendes Hormon oder Thyreoidea-stimulierendes Hormon, hergestellt werden.
Es können auch andere Wirtszellen, Vektoren, Promotoren, transformierende Sequenzen und Viren verwendet werden. Die verwendete Wirtszelle hängt im allgemeinen von dem verwendeten Vektor ab. Wenn zum Beispiel der Vektor ein replizierendes Virus oder nicht replizierende virale DNA ist, sind die Wirtszellen Zellen, die von diesen Vektoren infiziert bzw. transfektiert werden können; z. B. benötigen SV40-haltige Vektoren Affen-Wirtszellen, vorzugsweise CV-1-Zellen. Wo der Klonierungsvektor ein Plasmid ist, das prokaryotische Kontrollsequenzen aufweist, werden prokaryotische Wirtszellen, z. B. E. coli, verwendet. Wo der Klonierungsvektor ein Plasmid ist, das eukaryotische Kontrollsequenzen aufweist, werden geeignete eukaryotische Wirtszellen, z. B. Maus-C127-Zellen, verwendet.

Claims

1. Zubereitung eines einzigen biologisch aktiven, heteropolymeren, proteinartigen Hormons, das aus einer Mehrzahl von Untereinheiten zusammengesetzt und posttranslational modifiziert ist, wobei die Zubereitung frei von jedem anderen derartigen Hormon ist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, bei welcher die posttranslationale Modifikation eine Glycosilierung ist.

3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher das Hormon heterodimer ist.

4. Zubereitung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei welcher das Hormon ein Fruchtbarkeitshormon ist.

5. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher das Hormon ein menschliches Fruchtbarkeitshormon ist.

6. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher das Hormon hCG ist.

7. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher das Hormon LH ist.