DE69634851T2

DE69634851T2 - Immortalisierter Fusionspartner von Kaninchen

Info

Publication number: DE69634851T2
Application number: DE69634851T
Authority: DE
Inventors: L. Katherine KNIGHT
Original assignee: Loyola University Chicago
Current assignee: Loyola University Chicago
Priority date: 1995-02-28
Filing date: 1996-02-28
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2016-02-29
Also published as: EP0815213A4; US5675063A; ATE297982T1; EP0815213A1; AU4989296A; EP0815213B1; CA2214018C; WO1996027004A1; DE69634851D1; CA2214018A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Monoklonale Antikörper werden in den Bereichen Forschung sowie Diagnose und Behandlung zahlreicher Erkrankungen umfassend eingesetzt. Typischerweise werden monoklonale Antikörper in Mäusen, Ratten oder Hamstern produziert, da (1) mehrere Hybridomfusionspartner von diesen Spezies abgeleitet wurden und/oder (2) stabile Heterohybridome durch Fusion zwischen Zellen verschiedener Nagetierspezies erhalten werden können. Es gibt jedoch auch einen großen Bedarf an Hybridomen von anderen Spezies, die Antigene und Epitope erkennen können, die von von Mäusen, Ratten oder Hamstern abstammenden Reagenzien nicht erkannt werden. Demgemäß ist es ein Ziel dieser Erfindung, eine sich unbegrenzt vermehrende Plasmazytomzelllinie aus einer Spezies wie z.B. Kaninchen zu bilden, die als ein Hybridomfusionspartner zur Bildung monoklonaler Antikörper verwendet werden kann.
Die Verfügbarkeit von monoklonalen Kaninchen-Antikörpern (MAb) beispielsweise ist aus zahlreichen Gründen wertvoll. Erstens sind Kaninchen dafür bekannt, Antikörper gegen zahlreiche Antigene zu produzieren, die nicht besonders immunogen in Mäusen sind. Direkte Vergleiche von Kaninchen- und Maus-Antikörpern, die gegen menschliche Melanomzellen gerichtet sind, zeigten, dass Kaninchen- und Maus-Antikörper verschiedene Epitope erkennen. Zweitens weisen Kaninchen-Antikörper im Allgemeinen höhere Affinität auf als Maus-Antikörper. Drittens gibt es relativ wenig MAb, die mit Maus- oder Ratten-Immunogenen reagieren, da die meisten MAb in Mäusen und Ratten gebildet werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sie keine Anti-Selbstantikörper bilden und da Ratten und Mäuse phylogenetisch so eng verwandt sind, dass ihre Antigene zu einem sehr hohen Ausmaß ähnlich sind.
Bis heute wurde noch kein Fusionspartner entwickelt, von dem sich Kaninchen-MAb bilden konnten, da Kaninchen-Plasmazytome nicht verfügbar waren. Mehrere Labors entwickelten Maus-Kaninchen-Heterohybridome, doch diese Technologie hatte nur begrenzten Erfolg. Die frühesten Maus-Kaninchen-Heterohybridome waren instabil und/oder sekretierten nur Leichtkettenfragmente. Obwohl spätere Forscher versuch ten, diesem Problem durch die Verwendung von normalem Kaninchenserum (NRS) anstelle von fötalem Kälberserum (FCS) als eine Ergänzung zum Kulturmedium beizukommen, blieb die Methodik mangelhaft. Da die Heterohybridome hoch instabil sind, müssen sie alle vier oder sechs Wochen subkloniert werden, um Verlust an Antikörpersekretion zu vermeiden. In den Labors der Erfinder erhielten diese nicht mehr als zwei bis fünf Heterohybridome pro Fusion. Darüber hinaus sind solche Heterohybridome schwer zu klonieren, und die Klone sind im Allgemeinen instabil und sekretieren Antikörper nicht über längere Zeitspannen hinweg.
Es wäre wünschenswert, über Hybridome von ein und derselben Spezies zu verfügen, in denen sowohl der Fusionspartner als auch die zu fusionierenden Zellen von derselben Spezies abgeleitet sind, beispielsweise Kaninchen-Kaninchen-Hybridome. Solche Ein-Spezies-Hybridome wären stabiler als Heterohybridome und würden dadurch länger bestehende Zelllinien produzieren, die über eine längere Zeitspanne hinweg Antikörper sekretieren würden. Das ist darauf zurückzuführen, dass Ein-Spezies-Hybridome weniger stark als Heterohybridome dazu neigen, Chromosomen zu zerstören. Solche Ein-Spezies-Hybridome werden nicht nur zur Bildung monoklonaler Antikörper nützlich sein, sondern auch zur Untersuchung von Immunglobulingenen einschließlich des Mechanismus von V-, (D)- und J-Gen-Neuanordnungen, Allelausschluss und somatischer Diversifikation.
Hybridomtechnologie betrifft typischerweise die Fusion von Myelomzellen mit Lymphozyten aus Tieren, die mit einem bestimmten Antigen immunisiert wurden. Die resultierende Hybridomzelle bildet monoklonale Antikörper, die für eine einzelne antigene Determinante spezifisch sind.
Manche Eigenschaften, die eine ideale Hybridomzelllinie aufweist, sind (1) hohe Kloniereffizienz; (2) die Fähigkeit, rasch in einem Medium zu wachsen, das mit Serum ergänzt ist; (3) keine Sekretion von Myelom-Immunglobulin (Ig); (4) stabile Produktion großer Mengen an Ig nach der Fusion; und (5) die Fähigkeit zu wachsen, wenn sie in die ursprünglichen Spezies erneut insertiert werden.
Ein typisches Verfahren zur Herstellung von Hybridomen umfasst Folgendes: (a) Immunisieren eines Tiers (z.B. Kaninchens) mit einem bestimmten Immunogen; (b) Entfernen der Milz und/oder von Lymphknoten aus dem immunisierten Tier und Herstellung einer Zellsuspension in einem geeigneten Medium; (c) Fusion der Zellen (z.B. Milz/Lymph) mit Tier-Myelomzellen; (d) Verdünnen und Kultivieren des Gemisches von unfusionierten Milz/Lymph-Zellen, unfusionierten Myelomzellen und fusionierten Zellen in einem selektiven Medium, das das Wachstum der unfusionierten Zellen (Myelom-, Lymph- oder Milzzellen) nicht unterstützt; (e) Untersuchung des Überstandes in jedem Behälter, der Hybridom enthält, auf die Gegenwart von Antikörper gegen das Immunogen; und (f) Auswahl und Klonieren von Hybridomen, die die erwünschten Antikörper produzieren. Nachdem das erwünschte Hybridom selektiert und kloniert wurde, wird der resultierende Antikörper durch In-vitro-Kultivieren des erwünschten Hybridoms in einem geeigneten Medium hergestellt.
Alternativ dazu kann das erwünschte Hybridom direkt in einen geeigneten Wirt wie beispielsweise ein Kaninchen oder eine immungeschwächte Maus (wie z.B. eine SCID-Maus) injiziert werden, um konzentrierte Mengen an Antikörper zu ergeben [Kennett et al. (Hrsg.), Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A new dimension in biological analyses, Plenum Press, New York (1981)].
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kaninchen-Fusionspartner nach in Anspruch 1. Es wurden doppelt transgene Kaninchen gezüchtet, die zur Verwendung als Fusionspartner geeignete Lymphzellen entwickelten; die Fusionspartner wurden dann verwendet, um Kaninchen-Kaninchen-Hybridome herzustellen.
Die Erfindung betrifft weiters die Herstellung von Fusionspartnern zur Produktion von Immunglobulinen. Ein Verfahren gemäß der Erfindung bindet die Verwendung der Fusionspartner zur Herstellung von Ein-Spezies-Hybridomen ein, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren.
Schließlich betrifft die Erfindung transgene Kaninchen, die zumindest zwei Transgene, myc und abl, in sich tragen. Die transgene Nachkommenschaft entwickelte Plasmazytome, die kultiviert und als ein Fusionspartner verwendet werden konnten. Dieser Fusionspartner wurde verwendet, um stabile Kaninchen-Kaninchen-Hybridome herzustellen, die für das Immunogen spezifische Antikörper sekretierten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Insbesondere schließt die Erfindung eine sich unbegrenzt vermehrende Zelllinie ein, die hierin als ein Hybridomfusionspartner bezeichnet wird. Dieser Fusionspartner kann an einen Antikörper-sekretierenden Lymphozyten, vorzugsweise einen B-Lymphozyten, fusioniert werden, um ein Hybridom zu bilden, das in der Lage ist, homogene Antikörperpräparate zu bilden, die sich, vorzugsweise selektiv, an ein vorbestimmtes Immunogen binden.
Die Erfindung schließt weiters eine sich unbegrenzt vermehrende Lymphzelllinie ein, die verwendet wird, um den Fusionspartner zu produzieren. Diese Lymphzellen können beliebig aus zahlreichen differenzierenden oder differenzierten Lymphzellen ausgewählt sein und sind vorzugsweise Zellen, die in der Lage sind, Immunglobulin zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lymphzellen Plasmazytomzellen.
Die Erfindung schließt weiters ein Hybridom, vorzugsweise ein Ein-Spezies-Hybridom, ein, das durch Fusion des Fusionspartners an einen Antikörper-sekretierenden Lymphozyten hergestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein von Plasmazytom abgeleiteter Fusionspartner an einen B-Lymphozyten fusioniert.
Die Erfindung schließt weiters transgene Kaninchen ein, die verwendet werden, um die Lymphzelllinie zu bilden.
Wie hierin verwendet ist ein "Transgen" eine DNA-Sequenz, die durch menschliches Zutun wie beispielsweise durch die zuvor beschriebenen Verfahren in die Keimlinie eines nicht-menschlichen Tiers eingeführt wurde. Die Transgene der Erfindung umfassen DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, zugehörige endogene Allele zu unterdrücken. Weiters sind solche Transgene in der Lage, das Reifen eines lymphatischen Zelltyps zu unterstützen oder zu hemmen. Solche Transgene umfassen DNA-Sequenzen, die entweder für ein lymphatisches Polypeptid oder eine lymphatische Polypeptidvariante kodieren, das/die in einem transgenen Tier exprimiert werden kann.
Transgene sind beispielsweise von DNA-Sequenzen abgeleitet, die für zumindest eine vom Gen abstammende Polypeptidkette oder eine Polypeptidkette eines Immunglobulin- (Ig-) Moleküls kodieren.
Im Fall von B-Zellen wird ein Derivat der schweren Kette des Ig-Moleküls bevorzugt, um die Bildung von Antikörper-produzierenden Plasmazellen, die von B-Zellen abgeleitet sind, zu hemmen. Im Allgemeinen werden solche Transgene durch gänzliches oder teilweises Zerstören der für die variable Region solcher Moleküle kodierende DNA-Sequenz aus der DNA-Sequenz, die für eine funktionell neu angeordnetes β-Ketten-, γ-Ketten- oder Schwerkettenpolypeptid kodiert, abgeleitet. Vorzugsweise wird die gesamte variable Region zerstört, obwohl kleine Segmente von 5'-Sequenzen, die für einen N-terminalen Abschnitt des V-Abschnitts kodieren, und 3'-Sequenzen, die für den C-terminalen Abschnitt des J-Segments kodieren, im Transgen erbehalten werden können. Zumindest sollte das variable Segment vollständig oder teilweise zerstört werden. Somit umfassen Transgene im Allgemeinen C-Regionen der β-Ketten-, γ-Ketten- oder Schwerkettenpolypeptide von TCR- bzw. Ig-Molekülen, können jedoch auch zusätzliche Sequenzen einbinden, die für die gesamten oder für Teile von J- und D-Segmente(n) der variablen Region kodieren.
Weiters wird von transgenen Tieren, die Immunglobulinschwerkette enthalten, worin die gesamte variable Region oder ein Teil davon zerstört ist, angenommen, dass sie nicht in der Lage sind, Plasmazellen zu produzieren, die Immunglobuline sekretieren. Dies ist darauf zurückzuführen, dass während der Entwicklungsphase von B-Zellen die B-Zellen ihre Ig-Schwerkettengene als erstes neu anordnen. Nachdem ein funktionell neu angeordnetes Ig-Schwerkettengen gebildet wurde, beginnt die Leichtkettenneuanordnung. Diese resultiert schließlich in der Produktion von vollständigen IgM-Molekülen, die zwei schwere und zwei leichte Ketten enthalten. Solche IgMs werden nicht sekretiert, da ihre C-Regionen eine membranverankernde Domäne enthält. Während der weiteren Entwicklung übertragen die B-Zellen die Verwendung der konstanten Region auf andere konstante Regionen, die nicht für eine Transmembrandomäne kodieren, z.B. IgG. Tritt diese Übertragung ein, so werden sie zu Plasmazellen, die große Mengen an spezifischem Immunglobulin sekretieren. Um sich zu Plasmazellen. zu entwickeln, müssen die IgM-produzierenden B-Zellen mit anderen Zellen des Immunsystems über das IgM, das an der B-Zelloberfläche angeordnet ist, wechselwirken. Da die Schwerkette der IgM-Variante die Deletion der gesamten variablen Region oder eines Teils davon enthält, sollten transgene, nicht-menschliche Tiere, die ein Transgen aufweisen, das für solch eine deletierte Schwerkette kodiert, nicht in der Lage sein, B-Zellen zu produzieren, die zur Bildung des reifen Plasmazelltyps mit dem Immunsystem wechselwirken.
Wie hierin verwendet ist ein Immunogen ein Antigen oder eine andere Substanz, das/die in einem Wirbeltierwirt die Bildung eines Antikörpers, eines spezifischen Antikörpers oder die Entstehung einer spezifischen Population von Lymphozyten, die sich an die Substanz binden oder mit ihr wechselwirken, hervorruft.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung Expressionskassette auf eine DNA-Sequenz mit zumindest einem Gen und den für das Gen erforderlichen Sequenzen, um in einer ausgewählten Wirtszelle exprimiert zu werden. Beispielsweise kann das Gen ein Onkogen, z.B. myc und/oder abl, sein. Die für Expression erforderlichen Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Transkriptionsstartregion (einschließlich der Wildtyp-Sequenzen für Replikation), einen oder mehrere Promotoren, einen oder mehrere Induktoren, einen oder mehrere Enhancer, eine oder mehrere Restriktionsstellen (z.B. Polylinker) und ein Poly(A)- Additionssignat. Die Expressionskassette kann auch einen oder mehrere selektierbare Marker einbinden, wie beispielsweise ein Wirkstoffresistenzgen, oder einen Screening-Marker, wie beispielsweise ein HGPRT-Gen.
Die DNA-Sequenzen, von denen das Transgen abgeleitet ist, werden vorzugsweise aus dem funktionell neu angeordneten Genom derselben Tierspezies erhalten, in die das Transgen eingeführt werden soll (d.h. Kaninchen). Die Erfindung beschränkt sich jedoch nicht auf Transgene, die von derselben Tierspezies abgeleitet sind, die auch verwendet wird, um transgene Tiere zu bilden. Andere Beispiele für heterologe transgene Expression umfassen die heterologen Regulations- und Struktursequenzen, die in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0.247.494 und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO88/00239 offenbart sind. Somit können die DNA-Sequenzen aus einer Spezies, die nicht die Spezies des transgenen Tiers ist ("heterologe DNA"), verwendet werden, um die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung zu bilden. Solche heterologen Sequenzen umfassen Regulations- und Sekretionssequenzen sowie DNA-Struktursequenzen, die, wenn sie modifiziert werden, für heterologe lymphatische Polypeptidvarianten kodieren, die in der Lage sind, die Bildung eines reifen Lymphozyten-Zelltyps zu hemmen. Die einzige Einschränkung für die Verwendung solcher heterologen Sequenzen ist eine funktionelle Einschränkung. Die heterologen Regulationssequenzen müssen vom transgenen Tier verwendet werden, damit sie ausreichende Mengen der lymphatischen Polypeptidvariante exprimieren, sodass diese in der Lage ist, die Bildung eines reifen Lymphozyten-Zelltyps zu hemmen. Weiters muss die heterologe lymphatische Polypeptidvariante, wenn sie ordnungsgemäß im transgenen Tier exprimiert wird, in der Lage sein, zur erwünschten Erschöpfung eines Lymphozyten-Zelltyps zu führen. Darüber hinaus sollte es möglich sein, homologe und heterologe DNA-Sequenzen (z.B. homologe Regulatoren mit heterologen Strukturgenen und umgekehrt) zu mischen, um funktionelle Transgene zu produzieren, die zur Umsetzung der Erfindung verwendet werden können. Alternativ dazu müssen heterologe DNA-Sequenzen, die für die lymphatische Polypeptidvariante kodieren, in der Lage sein, die Expression von funktionellem lymphatischem Polypeptid, für das Reifen eines Lymphozyten-Zelltyps erforderlich, durch Unterbrechung der Expression von zugehörigen endogenen Allelen zu hemmen.
Wie hierin verwendet bezieht sich Kulturmedium oder Gewebekultur auf ein Medium, das das Wachstum von Zellen unterstützt. Die Art der Herstellung von Kulturmedien ist Fachleuten bekannt. Typische Bestandteile umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Kohlenstoffquelle, eine Quelle für anorganisches Ammoniak (oder Ammoniumion), eine Phosphatquelle, einen) oder mehrere Hormone oder Wachstumsregulatoren, ein oder mehrere Vitamine, ein oder mehrere Salze, eine oder mehrere Aminosäuren und gegebenenfalls andere Nährstoffquellen (z.B. Glucose oder ganzes Serum). Spezifische Beispiele für Kulturmedien gemäß der Erfindung sind nachstehend noch genauer beschrieben. Der pH des Kulturmediums liegt zwischen 4,5 und 8,5, und die Zellen werden bei etwa 37°C inkubiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Fusionspartner von Zellen abstammen, die von zumindest einem transgenen Kaninchen, das myc- und abl-Transgene in sich trägt, erhalten wurden. Die Nachkommenschaft dieser Kaninchen entwickelt Lymphtumoren, z.B. Plasmazytome, die geerntet und zu einem guten Fusionspartner entwickelt werden können. Das Fusionieren dieser von Plasmazytom abstammenden Fusionspartner mit Milzzellen immunisierter Kaninchen führt zu stabilen Hybridomen, die für das Immunogen spezifische Antikörper sekretieren. Die Hybridome können kloniert, in Kultur oder in immungeschwächten Mäusen wie z.B. Nacktmäusen vermehrt und ohne ihre Fähigkeit zu ändern, spezifische monoklonale Antikörper zu sekretieren, eingefroren werden.
Im Allgemeinen umfasst ein Antikörper zwei verschiedene Polypeptide. Das kürzere Polypeptid wirkt als die Leichtketten des Antikörpers, und das längere Polypetpid wirkt als die Schwerketten des Antikörpers. Wie hierin verwendet wird einem Antikörper eine funktionelle Definition verliehen, d.h. er kann jedes beliebige Molekül sein, ob natürlich vorkommend, künstlich induziert oder rekombinant, das spezifische immunoreaktive Aktivität aufweist. Normalerweise bindet ein Antikörper, wie hierin verwendet, zumindest eine variable Region aus einer schweren oder leichten Kette ein.
Demgemäß ist ein natürlich vorkommendes oder ein rekombinantes Antikörpermolekül in der Definition von "Antikörper" eingebunden. Wie hierin verwendet schließt ein Antikörper ein Fab-Protein, ein F(ab')₂-Protein oder ein F_v- oder H_v-Protein ein, das immunoreaktive Aktivität aufweist.
Die Produktion des Lymphtumors beginnt mit der Auswahl des erwünschten exogenen Moleküls und der für die Expression des Gens erforderlichen Sequenzen. Fachleuten ist bekannt, dass kanzeröses Wachstum oder Tumoren, die von bestimmten Onkogenen produziert werden, die Produktion einer Klasse von Lymphzellen, wie z.B. Zellen der B-Familien, stimulieren, die verschiedene Zwischenprodukte und reife Phänotypen haben. Jede beliebige Lymphzelle, die in der Lage ist, Immunglobulin zu produzieren, kann gemäß der Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind Lymphzellen terminal differenzierte B-Lymphozyten. Diese Lymphzellen sind Plasmazytome, Zellen, die typischerweise durch ein charakteristisches Färbungsmuster mit Wright-Giemsa-Farbstoff und durch chromosomale Neuanordnungen von Immunglobulin identifiziert werden. V-(D)- und J-Gen-Neuanrodnungen sind unter Verwendung einer Southern-Blot-Analyse nachweisbar.
Gemäß der Erfindung entwickeln sich die Plasmazytome als Reaktion auf die Expression von Onkogenen. Mehr als 20 Onkogene wurden bis heute isoliert. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Onkogene sind myc und abl.
Es ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, wie ein Onkogen zu isolieren und/oder zu gewinnen ist, und es ist ebenfalls bekannt, wie ein Expressionsvektor oder eine Expressionskassette mit einem Onkogen, das zur Expression in einem geeigneten Zelltyp in der Lage ist, zu konstruieren ist. Beispielsweise ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, wie ein myc-Gen unter Verwendung eines Immunglobulin-Schwerkettenenhancers, wie z.B. des Maus-Systems, beschrieben in Adams et al., Nature 318, 533–538 (1985), hierin durch Verweis aufgenommen, exprimiert werden kann. Solch ein System resultiert in der frühen und starken Expression des myc-Gens.
Gemäß der Erfindung, wie nachstehend noch erklärt wird, kann es wünschenswert sein, Expression eines Onkogens langsamer und/oder mit weniger Stärke zu induzieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das myc-Gen unter der Steuerung eines Immunglobulin-Leichtkettenenhancers (EK) exprimiert werden; und das abl-Gen kann unter der Steuerung eines Immunglobulin-Schwerkettenenhancers (Eμ) exprimiert werden. Werden diese Transgene in die Keimlinie eines Kaninchens eingeführt, so kann Expression des Transgens zu Tumorwachstum führen. Eine aktivierte Onkogensequenz, im Sinne der Verwendung hierin, bezeichnet ein Onkogen, das, wenn es in das Genom des Tiers inkorporiert ist, die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Neoplasmen (insbesondere von malignen Tumoren) im Tier erhöht. Wie zuvor angemerkt bilden sich Plasmazytome infolge des Tumorwachstums, und gemäß einem Aspekt dieser Erfindung können dieses Plasmazytomen aus transgenen Kaninchen isoliert werden.
Im Allgemeinen bringt die Erfindung ein transgenes Kaninchen zur Herstellung der Lymphzellen hervor. Jedes Verfahren zur Herstellung der transgenen Zellen und/oder des transgenen Kaninchens kann verwendet werden. Beispielsweise offenbart das US-Patent Nr. 5.087.571 ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen Tiers, das ein aktiviertes Onkogen aufweist. Im Allgemeinen weist das transgene Tier Keimzellen und Somazellen auf, die zumindest zwei Gensequenzen, vorzugsweise Onkogensequenzen, enthalten, die in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers eingeführt wurden. Typischerweise wird die Onkogen-Expressionskassette in das Tier in der Embryonalphase eingeführt, vorzugsweise im Einzellstadium oder dem Stadium der befruchteten Eizelle, und im Allgemeinen nicht später als etwa dem Achtzellstadium.
DNA kann in die Keimlinie des Tiers unter Verwendung verschiedener Verfahren eingeführt werden, z.B. durch Einführen des genetischen Materials in die embryonalen Stamm- (ES) Zellen durch Transfektion, retrovirale Infektion oder Elektroporation. Der wichtigste Vorteil von Gentransfer in Tiere ist, dass Zellen, die das Transgen tragen, selektiert werden können, bevor sie in eine Blastozyste injiziert werden. Beispielsweise wurden ES-Zellen mit retroviralen Vektoren infiziert oder mit Plasmiden transfiziert, die das neo-Gen trugen. Dieses Gen verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum G418. Nur ES-Zellen, die das neo-Gen aufgenommen haben, wachsen in Medium, das G418 enthält, und diese G418-resistenten Zellen wurden in Maus-Blastozysten eingeführt. Nicht nur hatten die resultierenden Tiere neo in ihre Genome eingebaut, wie durch Southern-Blotting gezeigt wurde, das Gen wurde auch der Nachkommenschaft übertragen, und Zelllinien aus der F2-Generation waren G418-resistent. Da ES-Zellen in vitro manipuliert werden können, bevor sie in den Embryo injiziert werden, können Genetiker homologe Rekombination verwenden, um transgene Tiere mit Mutationen, spezifischen Genen herzustellen oder um ein mutiertes Gen mit der normalen Entsprechung zu ersetzen.
Die "transgenen Kaninchen" der Erfindung können durch Einführen von "Transgenen" in die Keimlinie des Tiers hergestellt werden. Embryonale Targetzellen in verschiedenen Entwicklungsstadien können verwendet werden, um Transgene einzuführen. Verschiedene Verfahren werden je nach Entwicklungsstadium der embryonalen Targetzelle verwendet. Die Zygote ist das beste Target für Mikroinjektion. Im Kaninchen erreicht der männliche Vorkern die Größe von etwa 10–20 μm im Durchmesser, was reproduzierbare Injektion von 1–2 pI DNA-Lösung erlaubt. Die Verwendung von Zygoten als ein Target für Gentransfer hat einen großen Vorteil darin, dass in den meisten Fällen die injizierte DNA vor der ersten Spaltung in das Wirtsgen eingebunden wird (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438–4442 (1985)). Als Folge daraus tragen alle Zellen des transgenen Tiers das eingebaute Transgen. Dies spiegelt sich im Allgemeinen auch in der effizienten Übertragung des Transgens auf die Nachkommenschaft des Ursprungstiers wider, da theoretisch 50% der Keimzellen das Transgen in sich tragen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Übertragung eines klonierten Gens in einen Embryo bindet die Mikroinjektion der klonierten Gene in befruchtete Eizellen ein, die zwei Vorkerne enthalten, einen aus dem Sperma (männlich) und einen aus dem Ei (weiblich). Diese Zellen bilden schließlich etwa 2 pI Lösung, die direkt in einen der zwei Vorkerne mirkoinjiziert werden kann; die injizierten Embryonen werden dann in den Eileiter einer Ammenmutter übertragen und können sich bei darauf folgender Einnis tung im Uterus zu Ende entwickeln. Der Prozentsatz an Zellen, die die Manipulation überleben und sich bis zu Ende entwickeln, variiert, doch liegt er üblicherweise zwischen 10 und 30%. Bezüglich der Überlebenden liegt die Anzahl jener, die die fremde DNA in ihre Chromosomen eingebaut haben, zwischen einigen wenigen Prozent und 40%. Die eingeführte DNA scheint sich zufällig ohne Präferenz für eine bestimmte Chromosomenstelle, üblicherweise in einer Tandemanordnung mehrerer Kopien an einem einzelnen Ort, zu integrieren. Tiere, die das fremde Gen tragen, werden als transgen bezeichnet, und die fremde DNA wird als ein Transgen bezeichnet.
Es gibt mehrere Arbeitsvorschriften für das Einführen eines Onkogens in einen Tierembryo, um also chromosomal in einem aktivierten Zustand eingebunden zu sein. Bei einem Verfahren wird der Embryo mit dem Gen, wie es natürlich vorkommt, transfiziert, dann werden die transgenen Tiere, in denen sich das Gen in das Chromosom an einem Ort integriert hat, was zur Aktivierung führte, selektiert.
Andere Aktivierungsverfahren binden die Modifikation des Onkogens oder seiner Kontrollsequenzen vor der Einführung in den Embryo ein. Ein solches Verfahren besteht darin, den Embryo mit einem bereits translozierten Onkogen zu mikroinjizieren. Andere Verfahren umfassen die Verwendung eines Onkogens, dessen Transkription unter der Steuerung eines synthetischen Wirts oder eines viralen aktivierenden Promotors oder Enhancers steht, oder die Verwendung eines Onkogens, das durch eine oder mehrere Basenpaarsubstitutionen, -deletionen oder -additionen aktiviert ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bindet die Quelle des von Lymphzellen abgeleiteten Fusionspartners die Bildung eines transgenen Tiers, das nur ein erstes Transgen aufweist, die Gewinnung befruchteter Eizellen vom transgenen Tier und das anschließende Mikroinjizieren (oder sonstiges Insertieren) der Eizellen mit einem zweiten Gen ein. Die Nachkommenschaft dieses Verwandten kann dann darauf gescreent werden, ob sie beide Gene im Genom eingebunden hat.
Ein anderes typisches Verfahren bindet ein transgenes Tier, das ein erstes Transgen aufweist, und ein anderes transgenes Tier, das ein zweites Transgen aufweist, ein. Das Paaren des ersten transgenen Tiers mit dem zweiten wird eine Nachkommenschaft hervorbringen, die doppelt transgen ist, d.h. sowohl das erste Transgen als auch das zweite Transgen in das Genom eingebunden hat.
Wiederum ein anderes typisches Verfahren bindet das Mikroinjizieren (oder sonstiges Insertieren) eines ersten Gens und eines zweiten Gens in die befruchteten Eizellen eines Tiers und das Selektieren der Nachkommenschaft, die für beide Gene transgen sind, ein.
Retrovirale Infektion kann auch verwendet werden, um ein Transgen in ein Kaninchen einzuführen. Der sich entwickelnde Embryo kann in vitro bis zum Blastozystenstadium kultiviert werden. Während dieser Zeit können die Blastomere Targets für retrovirale Infektion sein. Wirksame Infektion der Blastomere wird durch enzymatische Behandlung zur Entfernung der Zona pellucida erreicht. Das zur Einführung des Transgens verwendete Virusvektorsystem ist typischerweise ein Replikationsdefektes Retrovirus, das das Transgen trägt. Transfektion wird durch Kultivieren der Blastomere auf einem Monolayer von virusproduzierenden Zellen leicht und effizient erreicht. Alternativ dazu kann Infektion auch in einem späteren Stadium erfolgen. Virus oder virusproduzierende Zellen können in das Blastozöl injiziert werden: Die meisten der Stämme sind Mosaik für das Transgen, da die Einbindung nur in einem Teil der Zellen erfolgt, die von transgenen Tieren gebildet werden. Weiters kann die Stammzelle auch verschiedene retrovirale Insertionen des Transgens an verschiedenen Positionen im Genom enthalten, das sich im Allgemeinen in der Nachkommenschaft segregieren wird. Darüber hinaus ist es auch möglich, Transgene durch intrauterine retrovirale Infektion des Embryos zur Halbzeit des Reifeprozesses in die Keimlinie einzuführen, wenn auch mit geringer Effizienz.
Ein anderer Typ von Targetzelle für transgene Einführung ist die embryonale Stammzelle (ES-Zelle). ES-Zellen werden aus in vitro kultivierten Embryonen vor deren Implantation gewonnen und mit Embryonen fusioniert. Transgene können in die ES-Zellen durch DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion effizient eingeführt werden. Solche transformierten ES-Zellen können hiernach mit Blastozysten aus einem Kaninchen kombiniert werden. Die ES-Zellen kolonisieren hiernach den Embryo und tragen zur Keimlinie des resultierenden chimären Tiers bei. Für einen Überblick hierzu siehe R. Jaenisch, Science 240, 1468–1474 (1988).
Es wird erkannt werden, dass das Gen von Interesse in Kombination mit anderen Zellen eingeführt werden kann. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, blutbildende Stammzellen, die das Transgen tragen, in Verbindung mit embryonalem Dottersack-, fötalem Leber-, Thymus-, Milz- oder Lymphknotengewebe, fötalem oder erwachsenem Knochenmarkgewebe, Pankreasgewebe, Appendixgewebe, Mandelgewebe und dergleichen einzuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Chromosom des transgenen Kaninchens eine endogene Codiersequenz (für das c-myc-Gen, hiernach als myc-Gen bezeichnet, und das v-abl-Gen, hiernach abl-Gen bezeichnet), die im Wesentlichen dieselbe ist wie die Onkogensequenz, und Transkription der Onkogensequenz erfolgt unter der Steuerung einer Promotor/Enhancer-Sequenz, die sich von der Promotor/Enhancer-Sequenz, die die Transkription der endogenen Codiersequenz steuert, unterscheidet. Die Onkogensequenz kann auch unter der Steuerung einer synthetischen Promotor/Enhancer-Sequenz stehen. In manchen Fällen kann die Promotorsequenz, die die Transkription der Onkogensequenz steuert, induzierbar sein.
Fachleute werden erkennen, dass Nachkommenschaft, die das Transgen in sich trägt, durch Southern-Blot-Analyse, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder durch Northern-Blot-Analyse identifiziert werden kann.
Nachdem die transgenen Tiere produziert und identifiziert wurden, können die Tiere oder ihre Nachkommenschaft wachsen gelassen werden, bis Tumoren als Resultat der Expression des/der Onkogens/Onkogene produziert werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass abnormales Fressverhalten, Appetitverlust, Lethargie, abnormale Wachstumsmuster und Gewichtsverlust äußere Indikatoren dafür sind, dass sich Tumoren im transgenen Tier entwickeln.
Tiere mit Tumorwachstum können dann verwendet werden, um ihnen verschiedene differenzierte Zellen, wie beispielsweise Lymphzellen, Monozyten, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, Neutrophile, Erythrozyten, Eosinophile, Blutplättchen und dergleichen, zu entnehmen. Beispielsweise kann das Tier getötet werden, und differenzierte Zellen, die die peripheren Blutorgane, Milz, Pankreas, Lymphknoten, Mandeln usw., Blut, Knochenmark und andere Gewebe bevölkern, können kultiviert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Zellen Lymphzellen, typischerweise Plasmazytomzellen.
Diese Lymphzellen können gefroren und gelagert werden, oder sie können als Quelle für den Fusionspartner verwendet werden. Wie hierin verwendet bezieht sich Fusionspartner auf Zellen, typischerweise auf sich unbegrenzt vermehrende Zellen, die so geändert wurden, dass sie ein selektierbares Charakteristikum aufweisen, nachdem der Fusionspartner verwendet wurde, um ein Hybridom zu bilden. Fachleute werden eines von mehreren selektierbaren Charakteristika erkennen und werden in der Lage sein, eines auszuwählen. Wie noch ausführlicher in den Beispielen gezeigt wird, bindet eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung das Bestrahlen der gesammelten Plasmazytomzellen und das Kultivieren der bestrahlten Zellen in Gegenwart von 3-Azaguanin ein, eine Arbeitsvorschrift, mittels derer bekannterweise HGPRT-Mutanten (Hypoxanthin-Guanosin-Phosphoribosyl-Transferase) produziert und selektiert werden. Diese mutierten Zellen sterben, sofern sie nicht zu einem Hybridom fusioniert werden, wenn sie in HAT-Medium kultiviert werden, d.h. diese Zellen weisen eine selektierbare Eigenschaft auf. Wie hierin verwendet bezeichnet Fusionspartner eine von Lymphzellen abgeleitete Zelle, die eine selektierbare Eigenschaft aufweist und zur Fusion mit einer anderen geeigneten Zelle geeignet ist, was zu einem Hybridom führt. Eine HGPRT^–-Plasmazytomzelle ist der bevorzugte Fusionspartner.
Gemäß der Erfindung kann ein geeigneter Fusionspartner an einen Lymphozyten, vorzugsweise einen B-Lymphozyten, fusioniert werden, um ein Hybridom zu bilden. Typischerweise werden Milzzellen aus hyperimmunisierten Kaninchen mit dem Fusionspartner unter Bedingungen kultiviert, die Fusion zwischen den Zellen ermöglichen. Wird HAT zum Kulturmedium zugesetzt, so sterben nicht-fusionierte Fusionspartnerzellen, was das Isolieren von Hybridomen ermöglicht. Mehr Details zu dieser Vorgehensweise sind in den Beispielen gegeben.
Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, resultiert Hyperimmunisierung des Tiers mit einem vorher ausgewählten Immunogen letztendlich in einem Hybridom, das monoklonale Antikörper produziert, die sich spezifisch an das Immunogen (oder Antigen) binden. Um bestimmte Teilmengen von T- und/oder B-Zellen zu fördern, kann der Wirt mit einem Antigen von Interesse immunisiert werden, um die Population von T-Zellen und B-Zellen, die sich spezifisch an das bestimmte Antigen binden, vermehren. Der Wirt kann zusätzlichen Immunisierungen unterzogen werden, um die erwünschte Population noch weiter zu fördern. Auf diese Weise können B-Zellen produziert werden, die für das Antigen spezifisch sind, und können als Splenozyten, Lymphknotenlymphozyten oder andere periphere Blutlymphozyten oder Lymphozyten von anderem Gewebe zur Fusion mit einem Fusionspartner gemäß der Erfindung verwendet werden. Nähere Details zu einer beispielhaften Arbeitsvorschrift sind in den Beispielen gegeben.
VERFAHREN ZUR CHARAKTERISIERUNG VON ANTIKÖRPERN
Um Hybridome zu selektieren, die mit dem Immunogen reaktive Antikörper sekretieren, müssen Kulturüberstände aus den Hybridomen evaluiert werden. Vor dem Screenen von Hybridomüberständen kann ein natürliches Immunogen (500 ng/ml) auf 96-Well-Mikrotiterplatten zur Inkubation über Nacht bei 37°C verteilt werden. Nach Inkubation über Nacht wurden die Platten gewaschen, und die ungebundenen Stellen auf den Platten wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert.
Um Hybride zu selektieren, die Antikörper mit der erwünschten Reaktivität sekretieren, wurden Tausende an Kulturflüssigkeiten getestet. Hierzu wurden 50 μl Überstandsflüssigkeit zu den Wells zugesetzt, die das Immunogen enthielten. Die Überstände wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Überstand entfernt, und die Wells wurden mit BSA gewaschen. Jeder Well erhielt dann 50 μl mit 10 ng eines an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten Anti-Antikörpers, verdünnt in BSA-phosphatgepufterter Salzlösung (PBS). Die Wells wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die HRP wurde nach Inkubation entfernt, und die Wells wurden dreimal mit dem BSA-PBS-Gemisch gewaschen. Die Gegenwart von gebundenem HRP wurde durch Zusetzen von 50 μl von Substrat θ-Phenylendiamin (OPD) in Phosphatpuffer, 0,15% Wasserstoffperoxid enthaltend, bestimmt. HRP in Kombination mit seinem Substrat (OPD) resultiert in einem gelb gefärbten Produkt. Die Entwicklung des gelben Produkts wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang zugelassen. Die enzymatische Reaktion wurde durch den Zusatz von 50 μl von 4,5 M H₂SO₄ beendet. Die Messung des resultierenden Reaktionsprodukts erfolgte durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 488 nm. Die Gegenwart von gelber Farbe in den Wells wies darauf hin, dass der Maus-Antikörper im Hybridomüberstand vorhanden war. Wie zuvor beschrieben wurden diese Hybride kloniert, Ascites wurden produziert, und gereinigter Antikörper wurde zur zusätzlichen Charakterisierung hergestellt.
STANDARD-ELISA-BEDINGUNGEN: Wells können mit Protein (500 ng/ml) als Einfangreagens beschichtet werden; 0,1 bis 1.000 ng des Antikörpers oder Antikörperfragments in 50 μl pro Well phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die Rinderserumalbumin (BSA) enthält, als eine Testprobe; Übernacht-Inkubation bei 37°C, gefolgt von BSA-PBS-Waschen; 10 ng von Ziege-Anti-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase, in 50 μl BSA-PBS als Detektionsmittel; 60 Minuten Inkubation bei 37°C, gefolgt von BSA-PBS-Waschen; 50 μl von o-Phenylendiamin in PBS, 0,15% Wasserstoffperoxid enthaltend, als Substrat; 15 Minuten Entwicklung, 50 μl von 4,5 M Schwefelsäure als Stoppmittel; und Bestimmung von optischer Dichte (OD) bei 488 nm.
Transgene Kaninchen, die funktionell neu angeordnete Immunglobulingene enthalten, können zur Untersuchung mehrerer Aspekte von Immunglobulin-Genexpression, z.B. von Gewebe-spezifischer Expression, des Mechanismus von Segmentneuanordnung, Allelausschluss und Repertoireentwicklung eingesetzt werden.
Monomere Immunglobuline setzen sich aus vier Ketten zusammen. Die hochmolekularen Ketten werden als schwere (H-) Ketten bezeichnet, und die niedermolekularen Ketten als leichte (L-) Ketten. Verdau eines Immunglobulins mit proteolytischen Enzymen wie Pepsin produziert ein F(ab)₂-Molekül und kleine Peptide. Der F(ab)₂-Abschnitt wird häufig als ein immunoreaktives Fragment bezeichnet. Ein immunoreaktives Fragment behält die biologische Aktivität und Spezifität des verwandten Immunglobulins bei. Immunoreaktive Fragmente werden ähnlich den verwandten Immunglobulinmolekülen verwendet. Der Vorteil liegt darin, dass sie nicht spezifische Hintergrundreaktivität reduzieren. Werden sie in vivo verwendet, so sind sie typischerweise weniger immunogen als das gesamte Immunglobulin und sind äußerst nützlich für Immuntherapie. (Handbook of Experimental Immunology, Bd. 1, 3. Auflage; hrsg. von M. M. Weir, Immunochemistry, Blackwell Scientific Publications).
Die Tiere der Erfindung können auch als eine Quelle von Zellen für Zellkultur verwendet werden. Ein Vorteil ist, dass Zellen aus den Tieren wünschenswerte Eigenschaften von sowohl normalen als auch transferierten kultivierten Zellen aufweisen können; d.h. sie sind morphologisch und physiologisch normal oder beinahe normal, können jedoch, wie Zellen wie z.B. NIH-3T3-Zellen, über lange Zeitspannen hinweg, möglicherweise unbegrenzt, kultiviert werden. Ist die Promotorsequenz, die Transkriptionen der onkogenen Sequenz steuert, weiters induzierbar, so verstärkt sich Zellwachstum, und andere Kultureigenschaften können durch Zusetzen oder Entfernen des Induktionsfaktors gesteuert werden.
Gewebe von transgenen Kaninchen können auf die Gegenwart der aktivierten Onkogene analysiert werden, entweder durch direkte Analyse von DNA oder RNA oder durch Testen des Gewebes auf das durch das Gen exprimierte Protein. Zellen von Geweben, die das Gen in sich tragen, können unter Verwendung von Standard-Gewebekulturverfahren kultiviert werden.
BEISPIEL 1
Erstellen einer sich unbegrenzt vermehrenden Plasmazytomzelllinie aus transgenen Kaninchen
Die Erfinder verwendeten die Transgen- (Tg-) Methodik, um Kaninchen mit Plasmazytomen zu bilden, aus denen eine Plasmazytomzelllinie entwickelt werden konnte. Zwei Kaninchen, die für zwei unterschiedliche Onkogene, c-myc und v-abl, transgen waren, wurden gepaart und ergaben eine Nachkommenschaft, die Plasmazytome entwickelte. Eine Familie von Tg-Kaninchen trug das myc-Onkogen gebunden an den Leichtketten-Enhancer (EK-myc), und eine zweite Familie von Tg-Kaninchen trug v-abl gebunden an den Schwerketten-Enhancer (Eμ-abl). Die Erfinder paarten EK-myc-Tg-Kaninchen mit den Eμ-abl-Tg-Kaninchen und screenten die Nachkommenschaft mittels Southern-Blot-Analyse auf die Gegenwart von beiden Transgenen. Mehrere Nachkommen, die sowohl EK-myc- als auch Eμ-abl-Transgene in sich trugen, wurden im Alter zwischen 8 und 19 Monaten krank. Als diese Kaninchen getötet wurden, hatten sich Tumoren an verschiedenen Orten entwickelt. Histologische Analyse dieser Tumoren zeigte, dass die Kaninchen immunoblastische Lymphome oder frühe Plasmazytome entwickelt hatten.
Die Erfinder verwendeten auch die Tg-Methodik, um Kaninchen mit Plasmazytomen durch Mikroinjektion von Zygoten aus EK-myc-Kaninchen mit dem Eμ-abl-Tg zu bilden. Die injizierten Embryonen wurden dann in den Eileiter des Kaninchens implantiert, und lebende Nachkommenschaft wurde so erhalten. Ein Nachkomme, 240E1-1, trug sowohl das Eμ-myc- als auch das Eμ-abl-Tg in sich und wurde mit etwa zehn Monaten krank. Als dieses Kaninchen getötet wurde, hatten sich Tumoren an verschiedenen Stellen entwickelt. Histologische Analyse dieser Tumoren zeigte, dass das Kaninchen immunoblastisches Lymphom oder frühes Plasmazytom entwickelt hatte.
Um Kaninchen-Plasmazytomzelllinien zu gewinnen, wurden Zellen aus den kanzerösen Geweben entnommen und in Kultur in Medium mit 15% FCS gegeben. Stabile Zelllinien wurden aus fünf der sechs Kaninchen mit Plasmazytom (300F1-2, 0022-3, 20337-7, 20337-8, 240E1-1) gewonnen. Alle diese Zelllinien synthetisierten und sekretierten Immunglobuline.
BEISPIEL 2
Kaninchen-C-myc-Gen
Das Kaninchen-c-myc-Gen wurde aus dem rekombinanten Kaninchen-Phagenbibliothek X314-6 wie zuvor beschrieben (Knight et al., J. Immunol. 134, 1245–1250) unter Verwendung eines 5,5 kb großen EcoRI-Fragments als Sonde, das das v-myc-Gen enthielt, kloniert (Vennstrom et al., J. Virol. 39, 625–631 (1981)). Positive Klone wurden Plaque-gereinigt, und einer, Klon 14, wurde restriktionskartiert. Die 5'-3'-Ausrichtung des Klons wurde unter Verwendung geeigneter v-myc-Sonden und eines synthetischen DNA-Oligomers, das für 33 Basenpaare aus einer relativ konservierten DNA-Sequenz rund um die menschliche und Maus-c-myc-TATAAT-Box kodiert, bestimmt (Bernard et al., EMBO J. 2, 2375–2383 (1983)).
BEISPIEL 3
Kaninchen-κ-Kettenenhancer- (EK-myc-) DNA-Konstrukt
Die EK-Region von Kaninchen-DNA wurde aus der J-Ckl-Region des b4-k-Kettenlocus kloniert: Das EK1-Fragment, ein 1,1 kb großes PstI-Fragment, und das vorgeschlagene EK2-Fragment, ein 0,4 kb großes BgI-II-Fragment (Emorine et al., Nature 304, 447 (1983)), wurden 5' von c-myc in pUC18 kloniert. Das EK-myc-Konstrukt wurde aus der Plasmid-DNA als ein 7,5 kb großes Bam-HI/Hind-III-Fragment gespaltet.
BEISPIEL 4
Transgene Kaninchen
Erwachsene weibliche Kaninchen wurden von Scientific Small Animals (Chicago, IL) erhalten. Kaninchenzygoten-Donoren wurden subkutan 50 IU "Pregnant-Mare"-Gonadotropin (aus dem Serum trächtiger Stuten) (Sigma, St. Louis, MO) am Tag 4 und unmittelbar nach dem Paaren injiziert, und intravenös wurden ihnen 150 IU Chorion-Gonadotropin (HCG) (Sigma) injiziert. Einzelzellzygoten wurden 19 Stunden später aus den Eileitern gespült. In manchen Versuchen wurden den Vorkernen gemäß Hammer et al., Nature 315, 680–683 (1985), 7,5 kb großes Bam-HI/Hind-III-DNA-Fragment (1 μg/ml) injiziert, das sowohl Kaninchen-c-myc- als auch κ-Kettenenhancer-DNA-Segmente enthielt, die davor in pUC18 kloniert worden waren. In anderen Versuchen wurden den Vorkernen 5 kb großes Eco-RI-Fragment injiziert, das das Eμ-abl-Konstrukt enthielt (siehe Rosenbaum et al., The EMBO Journal 9, 897–905 (1990)). Die injizierten Zygoten wurden an Tag 1 durch das Fimbrienende in den Eileiter eines Akzeptorkaninchens implantiert, das an Tag 1 durch intravenöse Injektion von 150 IU Chorion-Gonadotropin (HCG) oder durch Paaren mit einem sterilen Männchen scheinschwanger gemacht wurde.
BEISPIEL 5
Entwicklung von EK-myc/Eμ-abl-doppeltransgenen Kaninchen
Es wurde eine Familie transgener Kaninchen, die das c-myc-Onkogen, gebunden an den κ-Kettenenhancer, in sich trug, gebildet. Die Erfinder züchteten nun eine zweite Familie transgener Kaninchen mit dem v-abl-Onkogen, gebunden an den Immunglobulin-Schwerkettenenhancer (Eμ), als ein Transgen. Eine Gesamtzahl an 665 Zygoten wurde mikroinjiziert und in 31 scheinschwangere weibliche Tiere implantiert. Von 11 trächtigen Weibchen wurden 19 Nachkommen erhalten, von denen 2 das v-abl-Transgen in sich trugen.
EK-myc/Eμ-abl-doppeltransgene Kaninchen wurden mittels zwei Verfahren entwickelt. Im ersten. Verfahren wurden Einzelzellzygoten aus dem EK-myc-transgenen Kaninchen gesammelt, und ihnen wurde das Eμ-abl-DNA-Konstrukt injiziert. Die injizierten Embryonen wurden in den Eileiter des Kaninchens implantiert, und lebende Nachkommen wurden erhalten. Southern-Blot-Analyse von DNA aus diesen Kaninchen zeigte, dass eines, 24OE, doppeltransgen war, also sowohl das E_κ-myc- als auch das E_μ-abl-Transgen in sich trug.
Im zweiten Verfahren wurden Kaninchen aus der Ek-myc-Familie, die das Ek-myc-Transgen in sich trugen, mit Kaninchen aus der Eμ-abl-Familie gepaart, die das Ek-abl-Transgen in sich trugen. Von der Nachkommenschaft trugen manche sowohl das Ek-myc- als auch das Eμ-abl-Transgen in sich, wie durch Southern-Analyse bestimmt wurde. Von vier Paarungen wurden 22 Nachkommen erhalten, und von diesen trugen 5 beide Transgene in sich. Die Plasmazytome 81E5-1 und 300F1-2 entwickelten sich in der Nachkommenschaft transgener Kaninchen, die in den Labors der Erfinder gezüchtet wurden.
Alle Nachkommen, die beide Transgene, c-myc und v-abl, in sich trugen, erkrankten im Alter zwischen 8 und 19 Monaten. Tumoren hatten sich in diesen Kaninchen an verschiedenen Stellen entwickelt. Histologische Analyse dieser Tumoren zeigte, dass die Kaninchen immunoblastisches Lymphom oder frühes Plasmazytom entwickelt hatten.
BEISPIEL 6
Gewebekultur
Einzelzellsuspensionen für Gewebekultur wurden aus Milz, Mesenteriallymphknoten und Knochenmark hergestellt. Das für alle Suspensionen verwendete Kulturmedium war angereichertes RPMI 1640: RPMI 1640 mit den folgenden Zusätzen: Aminosäuren, nicht-essentielle Aminosäuren, Pyruvat, Glutamin, Vitamine, HEPES, Gentamycin, Penicillin, Streptomycin und Fungizon. Alle Komponenten waren im Handel bei Gibco Laboratories, Grand Island NY, erhältlich und wurden in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwendet. Das Medium enthielt auch 50 μM 2-Mercaptoethanol. Nach 6–8 Wochen in Kultur bildeten sich stabile Zelllinien aus diesen Tumorgeweben.
BEISPIEL 7
Histologische Analyse
Zellen, die aus Gewebekultur der Plasmazytomzelllinien genommen werden, und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte von normalen Kaninchen und Kaninchen mit Plasmazytomen wurden mit Wright-Giemsa (Diff Quick, American Scientific Products, McGaw Park, IL) oder Hämatoxylin bzw. Eosin gefärbt.
Genomische DNA-Analyse. Genomische DNA (10 μg), hergestellt durch das Verfahren von Blin & Stafford (Nucleic Acid Research 3, 2303–2308 (1976)), wurde unter Verwendung der von Southern (J. Mol. Biol. 98, 503–517 (1975)) beschriebenen Verfahren analysiert. ³²P-markierte DNA-Sonden wurden wie zuvor beschrieben (Knight et al., (1985) s.o.) hergestellt.
ELISA und Immunfluoreszenz. Enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) erfolgte in 96-Well-Mikrotiterplatten (Falcon 3912, Fisher), die über Nacht mit gereinigtem Ziege-Anti-Kaninchen-L-Ketten-Antikörper (1 μg/ml) oder mit dem Immunogen (2 μg/ml) beschichtet waren. Die folgenden Lösungen wurden nacheinander 1–2 h lang bei Raumtemperatur zugesetzt: zuerst die zu testenden Überstände, dann biotinylierte Ziege-Anti-Kaninchen-L-Ketten- oder Ziege-Anti-Kaninchen-μ-, -γ- oder -α-Ketten-Antikörper (1 μg/ml). Diesem Schritt folgte Inkubation mit Avidin-Biotin-Meerrettichperoxidase- (HRP-) Komplex (Vectastain ABC Kit, Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA, 94010) und schließlich mit Substrat, 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzlthiazolinsulfonsäure) (ABTS), wie vom Hersteller vorgeschlagen. Farbentwicklung wurde bei 405 nm in einem ELISA-Plattenleser abgelesen.
BEISPIEL 8
Entwicklung eines Kaninchen-Fusionspartners
Um einen HAT-empfindlichen Fusionspartner zu erhalten, wurden drei Zelllinien zuerst mit 200 Rad röntgenbestrahlt und dann in Gegenwart von 8-Azaguanin kultiviert, um eine mit Hypoxanthin-Guanosin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) mutierte Zelllinie zu entwickeln, die sterben würde, wenn sie in Gegenwart von Hypoxanthanin, Aminopterin und Thymidin (HAT) kultiviert werden würde. Die Konzentration von 8-Azaguanin betrug anfänglich 0,2 μg/ml und wurde langsam über eine Zeitspanne von 10 Monaten auf 20 μg/ml gesteigert. Die Erfinder erhielten drei 8-Azaguaninresistente Klone; 20337-7 nach einem Monat und 240E1-1-1 und 240E1-1-2 nach 8 Monaten in Kultur. Zellen aus diesen drei Klonen waren gegenüber HAT-hältigem Medium empfindlich.
In vorläufigen Fusionen testeten die Erfinder, ob irgendeine der HAT-empfindlichen Plasmazytomzelllinien als ein Fusionspartner verwendet werden könnte. Sie fusionierten alle drei Zelllinien mit Milzzellen eines Kaninchens, das mit der menschlichen T-Zelllinie Jurkat immunisiert war, und sie erkannten, dass eine der drei Plasmazytomzelllinien, 240E1-1-2, Hybridome produzierte. Die Erfinder verwendeten diese Zelllinie für weitere Fusionen.
Die Erfinder bestimmten die Verdoppelungsdauer der 240E1-1-2-Zellen mit 48–72 h (wenn sie in Medium mit 15% FCS gezüchtet wurden). Durch Färben mit Wright-Giemsa (Diff-Quick, Amercian Scientific Products, Mc Gaw Park, Illinois) wurde erkannt, dass die Zellen typische Eigenschaften von Plasmazellen aufwiesen, d.h. dass sie große Zellen mit reichlich Zytoplasma waren und dass die Zellkerne häufig "klumpiges" Chromatin enthielten. Die Zellen hatten zahlreiche Vakuolen, was darauf hinweist, dass sie Proplasmozyten waren. Die Erfinder testeten auf die Gegenwart an sekretiertem und intrazellulärem Ig mittels ELISA und fanden keine Ig-Schwer- oder -Leichtkette im Überstand oder im Zelllysat des 240E1-1-2-Fusionspartners. Somit ist dieser Fusionspartner unwahrscheinlich die ursprüngliche Zelllinie 240E-1-1, da er Ig weder produziert noch sekretiert. Solch ein nicht-sekretierender Fusions partner hat den Vorteil, dass die Erfinder die Möglichkeit bekommen, Hybridome durch Testen auf sekretiertes Ig und nicht auf sekretierten Antikörper mit Spezifität für ein bestimmtes Immunogen nachzuweisen.
BEISPIEL 9
Fusion von Kaninchen-Plasmazytomzelllinie mit Kaninchen-Milzzellen
Milzzellen (1,5–3 × 10⁸) von hyperimmunisierten Kaninchen und der Fusionspartner 240E-1-1-2 wurden in einem Verhältnis von 2:1 mit 50% PEG 4000 (EM Science, Cherry Hill, NJ 08304) bei 37°C in serumfreiem Medium fusioniert. Die Zellen wurden in 48-Well-Mikrotiterplatten bei etwa 2 × 10⁵ Milzzellen pro Well in Medium mit 15% FCS ausplattiert. Nach 72 Stunden wurde HAT zugesetzt. Das Medium wurde alle 5–6 Tage gewechselt. Klone wurden üblicherweise nach 2 Wochen beobachtet. Nach 3–5 Wochen nach der Fusion wurden Überstände auf die Gegenwart von Antikörper, der für das Immunogen spezifisch war, entweder durch Immunfluoreszenz oder durch ELISA getestet. Hybridome wurden durch Grenz-Verdünnung in 48-Well-Mikrotiterplatten kloniert. Als Feeder-Zellen wurde der Fusionspartner 240E1-1-2, 5 × 10⁴ Zellen pro Well, verwendet. Diese Feeder-Zellen wurden 5–6 Tage später durch Zusatz von HAT getötet.
BEISPIEL 10
Herstellung von MAb
Um weiter zu testen, ob sie stabilen Antikörper, der Hybridome produzierte, gewinnen konnten, fusionierten die Erfinder die neu erstellte Plasmazytomlinie, 240E1-1-2, mit Milzzellen aus Kaninchen, die mit drei verschiedenen Antigenen, der menschlichen T-Zelllinie, Jurkat; Ovalbumin; oder Maus-Serumproteinen, einschließlich Immunglobulinen, die mit 45% gesättigtem (NH₄)₂SO₄ gefällt worden waren, hyperimmunisiert waren. Die Erfinder wählten diese Immunogene wegen der folgenden Gründe aus: Jurkat-Zellen, da sie eine Quelle für Zelloberflächenantigene darstellen; Ovalbumin, da es ein bekanntes Immunogen für Kaninchen ist; und Maus-Ig, da mo noklonale Isotyp-spezifische Antikörper gegen Maus-Ig wertvolle Reagenzien sein würden. Aus allen drei Fusionen wurden Hybridome erhalten, die MAb sekretierten, der für das Immunogen spezifisch war (Tabelle 1). Die Erfinder verwendeten Immunfluoreszenz, um den Überstand von Hybridomen zu testen, die aus Milzzellen eines Kaninchens gewonnen wurden, das mit Jurkat-Zellen immunisiert worden war, und erkannten, dass 10 von 104 Hybridomen Antikörper sekretierten, die sich an Jurkat-Zellen banden. Sie verwendeten ELISA, um den Überstand von den Hybridomen der zwei anderen Fusionen zu testen, und erkannten, dass 9 Hybridome für Ovalbumin spezifische Antikörper sekretierten und dass 43 Hybridome Antikörper sekretierten, die Antigene der Maus-Serumproteine erkannten, welche verwendet wurden, um das Kaninchen zu immunisieren. Die Erfinder benötigten ELISA ebenfalls, um den Überstand von einigen der MAb gegen Maus-Serumproteine auf deren Fähigkeit zu testen, sich an verschiedene Maus-Ig-Isotypen zu binden. Sie fanden heraus, dass mehrere der MAb Maus-IgG erkennen. Sie verwendeten Immunfluoreszenz, um einen MAb zu testen, der das Maus-IgG2 erkennt, und zeigten, dass er sich an IgG2a-exprimierende B-Lymphomzellen, A20, bindet.
Die Fusionseffizienz der drei erfolgten Fusionen lag zwischen 0,25 und 1,2 in 10⁶ Zellen, was mit der Effizienz vergleichbar ist, die im Allgemeinen in Maus-Maus-Fusionen erreicht wird. Von den produzierten Hybridomen sekretierten zwischen 9% und 24% MAb, die für die Immunogene spezifisch waren (Tabelle 1). Dieser Prozentsatz von Hybridomen, die spezifische MAb sekretieren, ist wiederum mit jenem vergleichbar, der bei Maus-Maus-Fusionen erreicht wurde. Mittels ELISA bestimmten die Erfinder den Isotyp der Antikörper, die von den Hybridomen sekretiert wurden und spezifisch für Maus-Serumproteine waren, und erkannten, dass alle 43 von diesen vom IgG-Isotyp waren. Von diesen 43 Antikörper-sekretierenden Klonen subklonierten die Erfinder 7, von denen alle MAb sekretierten. Die Hybridome konnten eingefroren und wieder aufgetaut werden, ohne ihre Fähigkeit, MAb zu sekretieren, zu verlieren. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Hybridome stabil sind und dass häufiges Klonieren, das für die Heterohybridome erforderlich war, für die Kaninchen-Kaninchen-Hybridome nicht mehr notwendig ist.
Die Konzentration von MAb im Überstand wurde mittels ELISA bestimmt. Es wurde ein Ergebnis von etwa 10 ng/ml erhalten, eine geringe Konzentration, die zu erwarten ist, wenn der Fusionspartner ein Proplasmazyt und keine reife Plasmazelle ist. Konzentrationen an MAb von 1 μg/ml konnten in Ascites von Nacktmäusen erreicht werden. Sowohl Überstand als auch Ascites können zum Fluoreszenz-Markieren von Zelloberflächenantigenen verwendet werden. Die meisten der Kaninchen-MAb sind vom IgG-Isotyp, und da Kaninchen-IgG Protein A und Protein G sowie Komplement bindet, können diese MAb auch für Immunfällung und Zytotoxizitätstests nützlich sein.
BEISPIEL 11
Häufigkeit und Stabilität von Hybridomen, die in drei Fusionen des Kaninchen-Fusionspartners mit Milzzellen aus hyperimmunisierten Kaninchen erhalten wurden
Fusionen wurden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt: Milzzellen (1,5–3 × 10⁴) von hyperimmunisierten Kaninchen und der Fusionspartner 240E1-1-2 wurden in einem Verhältnis von 2:1 mit 50% PEG 4000 (EM Science, Cherry Hill, NJ 08304) bei 37°C in serumfreiem Medium fusioniert. Die Zellen wurden in 48-Well-Mikrotiterplatten bei etwa 2 × 10⁴ Milzzellen pro Well in Medium mit 15% FCS ausplattiert. Nach 72 h wurde HAT zugesetzt; das Medium wurde alle 5–6 Tage ausgetauscht. Klone wurden üblicherweise nach 2 Wochen beobachtet. Nach 3–5 Wochen nach der Fusion wurden Überstände auf die Gegenwart von für das Immunogen spezifischen Antikörper getestet, entweder durch Immunfluoreszenz mit Jurkat-Zellen (unter Verwendung von FITC-Ziege-Anti-Kaninchen-L-Ketten-Antikörper als sekundäres Reagens) (Fusion 1) oder durch ELISA (Fusionen 2 und 3). Hybridome wurden durch Grenz-Verdünnung in 48-Well-Mikrotiterplatten kloniert. Als Feeder-Zellen wurde der Fusionspartner, 240E1-1-2, 5 × 10⁴ Zellen pro Well, verwendet. Diese Feeder-Zellen wurden 5–6 Tage später durch den Zusatz von HAT getötet. TABELLE 1

* In manchen Wells wuchsen aneinanderhaftende Zellen, die das Wachstum der entstehenden Hybridome verhinderten. In solchen Fällen mussten die Hybridomklone von den aneinanderhaftenden Zellen entfernt werden, und dies erfolgte nur bei 38 Klonen.

Im ursprünglichen Screening-Verfahren wies der Überstand aus den meisten Wells, die Hybridome enthielten, Antikörper auf, die für das Antigen spezifisch zu sein schienen. Jedoch enthielten die meisten Wells auch aneinanderhaftende Zellen, die das Wachstum von primären Lymphozyten, die spezifischen Antikörper sekretierten, über mehrere Wochen hinweg zu unterstützen schienen. Erst nach dem Entfernen der Lymphozyten aus der Schicht aneinanderhaftender Zellen konnten die Erfinder echte Hybridome identifizieren. Diese Schwierigkeit erklärt wahrscheinlich die geringe Anzahl an positiven Wells in dieser Fusion.
In vorläufigen Fusionsversuchen erkannten die Erfinder übermäßiges Wachstum von aneinanderhaftenden Zellen in mehreren Wells, was die Hybridome daran hinderte, sich selbst dort niederzulassen. Das Ausmaß dieses Wachstums variierte zwischen den einzelnen Versuchen, und es konnte teilweise unterbunden werden, sofern fötales Kälberserum (FCS) gänzlich oder teilweise durch das normale Kaninchenserum (NRS) ersetzt wurde. Die Hybridome schienen jedoch in Abwesenheit von FCS langsamer zu wachsen. In einem Versuch gelang es den Erfindern, die aneinanderhaftenden Zellen durch 6-stündige Inkubation der Milzzellsuspension auf Kunststoffschalen bei 37°C, bevor sie fusioniert wurden, zu entfernen. Obwohl dieses Verfahren anhaftendes Zellwachstum nicht vollständig hemmte, reduzierte es die Anzahl der Wells, die aneinanderhaftende Zellen aufwiesen.
BEISPIEL 12
Immunfluoreszenz-Markieren von Maus-B-Lymphomzellen A20 mit monoklonalem Kaninchen-Anti-Maus-IgG2-Antikörper
A20-Zellen wurden mit dem Überstand eines Kaninchen-Kaninchen-Hybridoms (Fusion 3) inkubiert, für das durch ELISA gezeigt wurde, dass es Maus-IgG2a und -IgG2b, jedoch keinen der anderen Maus-Ig-Isotypen erkannte. In Kontrollproben wurden A20-Zellen mit dem Überstand von IgG-sekretierendem Kaninchen-Kaninchen-Hybridom, das ein irrelevantes Antigen, d.h. ein Oberflächenantigen von Jurkat-Zellen, erkennt, inkubiert (Fusion 1). Als sekundärer Antikörper verwendeten die Erfinder FITC-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-L-Kette.
Um die Nützlichkeit dieser MAbs in Immunfluoreszenz-Versuchen zu untersuchen, testeten die Erfinder zwei der MAbs, die IgG2a erkennen, auf Bindung an IgG2a-exprimierende B-Lymphomzellen, A20, und erkannten, dass sich beide MAbs an A20-Zellen binden, während sich ein MAb, für den durch ELISA gezeigt wurde, dass er nur IgG2b erkennt, nicht an die A20-Zellen band. Die Erfinder schließen daraus, dass die Kaninchen-MAbs wertvolle Immunfluoreszenz-Reagenzien darstellen.
Die Hybridome wurden subkloniert, dann eingefroren und wieder aufgetaut, ohne ihre Fähigkeit, MAb zu sekretieren, zu verlieren. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Hybridome stabil sind und dass häufiges Klonieren, das für die Heterohybridome erforderlich war, nun für die Kaninchen-Kaninchen-Hybridome nicht mehr notwendig ist.
BEISPIEL 13
Klonieren des HPRT-Gens
Tierzellen mit einer homozygoten Mutation für HPRT wurden in einem Medium gezüchtet, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt (HAT). Nur HPRT⁺-Zellen können in diesem Medium wachsen, sodass die Zellen, die überlebten und Kolonien entstehen ließen, HPRT⁺-Revertanten waren. In-vitro-Translation von mRNA aus solchen Zellen zeigte, dass die Zellen HPRT-mRNA überexprimierten. Diese mRNA kann verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, die mit radioaktiv markierten cDNAs, hergestellt aus mRNA von den Revertanten und HPRT-Zellen, differenziell gescreent wurde. Ein einzelner Klon, der nicht mit HPRT-Zell-cDNA hybridisierte, doch mit HPRT⁺-Revertantenzell-cDNA hybridisierte, wurde isoliert, und es wurde gezeigt, dass er durch In-vitro-Translation von Hybrid-selektierter mRNA HPRT-cDNA enthielt. Diese Tier-cDNA wurde dann verwendet, um eine DNA-Bibliothek bei niedriger Stringenz zu screenen.
BEISPIEL 14
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), gebildet aus Blastozysten
Kaninchen werden gepaart, und 3 Tage später werden Blastozysten isoliert und in Petrischalen kultiviert. Die Zellen verteilen sich über die Oberfläche der Schale, sodass der "Zellklumpen", der die innere Zellmasse bildet und dem zukünftigen Embryo entspricht, entfernt werden kann. Der Zellklumpen wird unter Verwendung von Trypsin, einem proteolytischen Enzym, in einzelne Zellen dissoziiert. Wenn ES-Zellen auf einer flachen Kulturschalenoberfläche ausplattiert werden, so differenzieren sie sich zu zahlreichen verschiedenen Gewebearten, werden sie jedoch auf einer Feeder-Schicht aus Fibroblasten gezüchtet, so vermehren sie sich kontinuierlich weiter und können wiederholt subkultiviert werden. Eine Feeder-Schicht wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Monolayer aus Zellen, der so behandelt wurde, dass die Zellen sich nicht weiter teilen können. Sie metabolisieren weiter, und dadurch "konditionieren" sie das Kulturmedium, sodass die Zellen, die auf diese Schicht überimpft werden, überleben und besser wachsen. Die Zellen können in eine Blastozyste mikroinjiziert werden, wo sie in die innere Zellmasse assimiliert werden und an der Bildung zahlreicher Gewebe des chimären Tiers teilnehmen. Üblicherweise werden ES-Zellen und Akzeptor-Blastozysten von Tieren mit unterschiedlichen Phänotypen verwendet, sodass der Beitrag der ES-Zellen zur chimären Nachkommenschaft durch einfaches Suchen nach dem Phänotyp bestimmt werden kann.
BEISPIEL 15
Herstellung von IgA-sekretierenden Hybridomen
Die meisten der Hybridome aus Milzgewebe sekretierten IgG, und keines sekretierte IgA (Tabelle 2). Da IgA-produzierende Hybridome wertvolle Reagenzien sein würden, beschlossen die Erfinder, Fusionen mit Zellen aus Peyerschen Platten (PP) und Mesenteriallymphknoten (MLN) durchzuführen, um IgA-sekretierende Hybridome zu erhalten. Aus zwei getrennten Fusionen sekretierten 34% der Hybridome von MLN und 81% der Hybridome von PP IgA (Tabelle 2). Ähnliche Resultate wurden in zwei zusätzlichen Versuchen erhalten, d.h. 35% der Hybridome von MLN und 38% der Hybridome von PP sekretierten IgA. Ein hoher Prozentsatz IgA-produzierender Hybridome von MLN, PP und anderen Schleimhautgeweben wurden von anderen Forschern für Ratten gefunden. Dahingegen ergibt Fusion mit Milzzellen jedoch im Allgemeinen weder bei Mäusen noch bei Ratten IgA-sekretierende Hybridome, wie die Erfinder nun für Kaninchen berichten.
TABELLE 2
Durch Kaninchen-Hybridome produzierte monoklonale Antikörper, erhalten aus Fusionen von 240E1-1-2 mit Mesenteriallymphknoten (MLN), Peyerschen Platten (PP) oder Milzzellen.

* Daten von Fusion 3, Tabelle 1: 25 von 43 spezifischen MAbs wurden analysiert.
** MLN-Zellen von einem immunisierten Kaninchen wurden durch Maus-CD40-Ligandentransfizierte CHO-Zellen 48 Stunden lang vor der Fusion aktiviert
*** PP-Zellen wurden wie zuvor für MLN-Zellen beschrieben behandelt und in 400 Wells ausplattiert

HINTERLEGUNGEN
Die Kaninchen-Plasmazytomzelllinie (als 240E1-1 bezeichnet), der Kaninchen-Fusionspartner (als 240E-1-2 bezeichnet) und ein Hybridom, das durch Fusionieren des Fusionspartners 240E1-1-2 mit Milzzellen eines hyperimmunisierten Kaninchens erhalten wurde, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, hinterlegt. Die Plasmazytomzelllinie (240E1-1) erhielt die ATCC-Zugriffsnummer CRL-11872; der Kaninchen-Fusionspartner (240E-1-2) erhielt die ATCC-Zugriffsnummer HB-11870; und das durch Fusionieren des Fusionspartners 240E1-1-2 mit Milzzellen gewonnene Hybridom erhielt die Zugriffsnummer HB-11871.
Obgleich die vorliegende Erfindung auch unter Bezugnahme auf besondere bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, ist sie nicht auf eben diese Ausführungsformen beschränkt. Alternative Ausführungsformen, Beispiele und Modifikationen, die im Schutzumfang der Ansprüche liegen, werden Fachleuten zugänglich sein, insbesondere vor dem Hintergrund der vorangehenden Lehren.
Angaben bezüglich eines hinterlegten Mikroorganismus INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)
Angaben bezüglich eines hinterlegten Mikroorganismus INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)
Angaben bezüglich eines hinterlegten Mikroorganismus INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)

Claims

Kaninchen-Fusionspartner, umfassend einen transformierten Kaninchen-B-Lymphozyten, der ein myc-Onkogen und ein abl-Onkogen exprimiert und in der Lage ist, mit einem aktivierten B-Lymphozyten zu fusionieren, worin die Fusion des Kaninchen-Fusionspartners und des aktivierten B-Lymphozyten in einem Hybridom resultiert, das ein Immunglobulin produziert.
Kaninchen-Fusionspartner nach Anspruch 1, der der Kaninchen-Fusionspartner der ATCC-Zugriffsnummer HB-11870 ist.
Kaninchen-Hybridomzelllinie, die aus der Fusion eines Kaninchen-Fusionspartners nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und eines aktivierten B-Lymphozyten resultiert.
Kaninchen-Hybridomzelllinie nach Anspruch 3, die die Hybridomzelllinie der ATCC-Zugriffsnummer HB-11871 ist.
Kaninchen-Plasmazytomzelllinie der ATCC-Zugriffsnummer CRL-11872.
Befruchtete Kanincheneizelle, umfassend (i) eine Expressionskassette, die ein myc-Onkogen enthält, und eine Expressionskassette, die ein abl-Onkogen enthält, oder (ii) eine Expressionskassette, die ein myc-Onkogen und ein abl-Onkogen enthält, worin ein transgenes Kaninchen, das sich aus dieser Eizelle entwickelt, Keimzellen und Somazellen umfasst, die diese zwei Onkogene enthalten, worin die Expression dieser zwei Onkogene zusammen in seinen B-Lymphozyten zur Transformation dieser B-Lymphozyten führt.
Transgenes Kaninchen, dessen Keimzellen und Somazellen ein myc-Onkogen und ein ab1-Onkogen umfassen, die jeweils operabel an eine Transkriptionsstart region gebunden sind, die für Expression in Kaninchen-B-Lymphozyten spezifisch ist, worin die Expression dieser zwei Onkogene zusammen zur Transformation dieser B-Lymphozyten führt.
Kaninchen-Fusionspartner nach Anspruch 1, befruchtete Kanincheneizelle nach Anspruch 6 oder transgenes Kaninchen nach Anspruch 7, worin jedes dieser Onkogene die Wildtyp-Transkriptionsstartregion für das Onkogen und einen Lymphozyten-spezifischen Enhancer umfasst.
Kaninchen-Fusionspartner, befruchtete Kanincheneizelle oder transgenes Kaninchen nach Anspruch 8, worin die Onkogene ein c-myc-Onkogen, das operabel an Immunglobulin-Leichtketten-Enhancer gebunden ist, und ein v-abl-Onkogen, das operabel an einen Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerketten-Enhancer gebunden ist, sind.
Kaninchen-Fusionspartner, befruchtete Kanincheneizelle oder transgenes Kaninchen nach Anspruch 9, worin die Onkogene ein E_κ myc-Onkogen und ein E_μ-abl-Onkogen sind.
Verfahren zur Herstellung eines Kaninchen-Fusionspartners, umfassend: (a) Kultivieren von transformierten B-Lymphozyten, die von einem transgenen Kaninchen nach Anspruch 7 stammen, in Gegenwart eines Selektionsmittels; und (b) Selektieren dieser transformierten B-Lymphozyten, worin die Selektion zu B-Lymphozyten führt, die ein selektierbares Merkmal umfassen und zur Verwendung als Kaninchen-Fusionspartner geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Selektion zu HGPRT^–-Zellen führt.
Verfahren zur Herstellung einer Kaninchen-Hybridomzelllinie, umfassend das Fusionieren des Kaninchen-Fusionspartners nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit einem aktivierten Kaninchen-B-Lymphozyten unter Fusionsbedingungen und selekti ven Bedingungen, um ein Hybridom zu erhalten, das in der Lage ist, Immunglobuline zu produzieren.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Kaninchen-Immunglobulinen, umfassend das Herstellen einer Kaninchen-Hybridomzelllinie durch das Verfahren nach Anspruch 13 und das Kultivieren dieses Hybridoms unter solchen Bedingungen, dass die Immunglobuline produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der aktivierte Kaninchen-B-Lymphozyt aus einem Kaninchen, dem ein Antigen injiziert wurde, isoliert wird.
Verfahren zum Kultivieren eines Kaninchen-Fusionspartners, umfassend das Züchten der Zellen eines Kaninchen-Fusionspartners nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in einem angereicherten Kulturmedium, das Aminosäuren, essentielle Aminosäuren, Pyruvat und Glutamin umfasst.