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Gebiet der
Erfindung
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Das
Gebiet dieser Erfindung sind im wesentlichen menschliche polyklonale
Antiseren für
die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Menschen.
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Hintergrund
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Die
Therapie infektiöser
Erkrankungen, die durch Bakterien, Pilze, Viren und Parasiten ausgelöst werden,
basiert hauptsächlich
auf der Chemotherapie. Das Auftreten arzneimittelresistenter Organismen
macht jedoch die kontinuierliche Entwicklung neuer Antibiotika notwendig.
Gleichzeitig wird die Kontrolle von Infektionen durch das Auftreten
neuer Pathogene bedroht. Die ansteigende Zahl von immunkomprimittierten
Individuen aufgrund einer schlechten Ernährung, AIDS, medizinischer
Krebstherapie, Autoimmunerkrankungen und Organtransplantationen
vermindert die Effizienz einer Antibiotikatherapie und erhöht die Schwierigkeiten
bei der Kontrolle von Infektionen.
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Therapien
von Patienten mit malignen Störungen
und Krebs basieren ebenfalls auf einer Chemotherapie. Viele dieser
Therapien sind jedoch ineffektiv und die Mortalität der erkrankten
Patienten ist hoch. Fortschritte in der monoklonalen Antikörper-Technologie
haben wenig Verbesserungen bereitgestellt, und zwar aufgrund der
Immunogenizität der
monoklonalen Antikörper
und ihrer geringen Potenz. Antiidiotypische Antikörperreaktionen
bei Patienten, die eine monoklonale Antikörpertherapie mitmachen, können die
Antikörpertherapie
ineffektiv machen.
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Die
Therapie einer steroidresistenten Abstoßung von transplantierten Organen
macht die Verwendung biologischer Reagenzien (monoklonale oder polyklonale
Antikörperpräparationen)
notwendig, die die laufende Alloimmunreaktion im Transplantatempfänger umkehren.
Die Immunogenizität der
Antikörperpräparationen
kann jedoch eine solche Therapie ineffektiv machen und die Umkehr
der Abstoßung
verhindern. In der Konsequenz kann das transplantierte Organ abgestoßen werden.
In ähnlicher
Weise sind die Antikörpertherapien
von autoimmun erkrankten Patienten häufig von begrenztem Erfolg
und zwar aufgrund der Immunogenizität der Antikörperpräparationen. Während eine
Humanisierung der Antikörper
die Immunogenizität
vermindert, ist die Effek tivität
solcher Antikörper
durch antiidiotypische Antikörperreaktionen
und eine geringe Potenz der monoklonalen Antikörper begrenzt. Nichtimmunogene
starke Reagenzien für
die Modulation der Immunreaktionen sollten entwickelt werden.
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Eine
polyklonale Antikörpertherapie
für die Behandlung
von infektiösen
Erkrankungen wurde Ende des letzten Jahrhunderts eingeführt. Um
1930 herum wurde eine Serumtherapie für die Behandlung von bakteriellen
und viralen Infektionen einschließlich einer Pneumonie, Meningitis,
Scharlach, Keuchhusten, Milzbrand, Botulismus, Gangrän, Tetanus, Brucellose,
Dysenterie, Tularämie,
Diphtherie, Masern, Poliomyelitis, Mumps und Windpocken verwendet.
Die systemische Verabreichung von Tierseren führte jedoch zu Fieber, Frieren
und allergischen Reaktionen. Eine Serumerkrankung trat in 10 bis
50% der behandelten Individuen auf.
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Das
Potenzial einer Verwendung von Antikörpern bei der Behandlung einer
Vielzahl von Indikationen ist sehr hoch. Die Fähigkeit, spezifisch an eine
Zieleinheit zu binden, stellt vielfältige Möglichkeiten bereit, diese Einheit
einzufangen und zu zerstören.
Wie oben demonstriert, gab es jedoch viele Hindernisse, heterologe
und humanisierte Antikörper zu
verwenden. Die Begrenzungen monoklonaler Antikörper fügen das zusätzliche Hindernis einer reduzierten
Affinität
hinzu. Daher gibt es einen dringenden Bedarf, alternative Modalitäten zu finden,
die einen Schutz gegen infektiöse
Erkrankungen und maligne Formen bereitstellen oder für die Immunmodulation
von Transplantatempfängern
und autoimmun erkrankten Patienten.
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Relevante Literatur
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Auf
Antikörper
basierende Therapien bei infektiösen
Erkrankungen wurden kürzlich
von A. Casadevall und M. D. Scharff, Clinical Infectious Diseases
1995; 150–161
dargestellt.
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Die
Verwendung von Antikörpern
für die
Behandlung von Krebs und malignen Erkrankungsformen wurden kürzlich von
C. Botti, A. Marinetti, S. Nerini-Molteni, und L. Ferrari, Int J
Biol Markers 1997; 12 (4): 141–147;
D. R. Anderson, A. Grillo-Lopez, C. Varns, und K. S. Chambers, Biochem
Soc Trans 1997; 25 (2): 705–708;
C. Renner, L. Trumper und M. Pfreundschuh, Leukemia 1997; 11 Suppl
2: 555–59; B.
Bodey, S. E. Siegel und H. E. Kaiser, Anticancer Res 1996; 16 (2):
661–674
dargestellt.
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Die
Verwendung von polyklonalen Antikörperpräparationen für die Behandlung
einer Transplantatabstoßung
wurde kürzlich
von N. Bonnefoy-Berard und J. P. Revillard, J Heart Lung Transplant
1996; 15 (5): 435–442;
C. Colby, C. A. Stoukides und T. R. Spitzer, Ann Pharmacother 1996;
30 (10): 1164–1174;
M. J. Dugan, T. E. DeFor, M. Steinbuch, und A. H. Filipovich, Ann
Hematol 1997; 75 (1–2):
41–46
dargestellt.
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Die
Verwendung polyklonaler Antikörpertherapien
für Autoimmunerkrankungen
wurden von W. Cendrowski, Boll Ist Sieroter Milan 1997; 58 (4): 339–343; L.
K. Kastrukoff, D. R. McLean und T. A. McPherson, Can J Neurol Sci
1978; 5 (2): 175–178; J.
E. Walker, M. M Hoehn und N. Kashiwagi, J Neurol Sci 1976; 29 (2–4): 303–309 beschrieben.
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Die
Verminderung von Fettzellen unter Verwendung von Antikörperpräparationen
wurde von L. De Clercq, J. Mourot, C. Genart, V. Davidts und C. Boone,
J Anim Sci 1997; 75 (7): 1791–1797;
J. T. Wright und G. J. Hausman, Obes Res 1995; 3 (3): 265–272 beschrieben.
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Die
Klonierung von Tieren aus Zellen wurde von T. Wakayama, A. C. F.
Perry, M. Zuccotti, K. R. Johnson und R. Yanagachi, Nature 1998;
394: 369–374;
J. B. Cibelli, S. L. Stice, P. J. Golueke, J. J. Kane, J. Jerry,
C. Blackwell, A. Ponce de Leon, und J. M. Robl, Science 1998; 280:
1256–1258;
J. B. Cibelli, S. L. Stice, P. J. Golueke, J. K. Kane, J. Jerry,
C. Blackwell, F. Abel de Leon, und J. Robl, Nature Biotechnology
1998; 16: 642–646;
A. E. Schnieke, A. J. Kind, W. A. Ritchie, K. Mycock, A. A. Scott,
M. Ritchie, I. Wilmut, A. Colman A, und K. H. Campbell, Science
1997; 278 (5346): 2130–2133;
K. H. Campbell, J. McWhir, W. A. Ritchie, und I. Wilmut, Nature 1996;
380 (6569): 64–66
beschrieben.
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Die
Produktion von Antikörpern
von transgenen Tieren wird in den US-Patenten Nrn. 5,814,318; 5,545,807 und
5,570,429 beschrieben. Eine homologe Rekombination für chimäre Säugerwirte
wird beispielhaft im US-Patent Nr. 5,416,260 dargestellt. Ein Verfahren
zur Einführung
von DNA in einen Embryo wird im US-Patent Nr. 5,567,607 beschrieben.
Der Erhalt und die Expansion von embryonalen Stammzellen wird im
US-Patent Nr. 5,453,357 beschrieben.
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Weiterhin
betreffen die EP A 1288229 wie auch die WO A 00/26373 vorrangig
die Produktion von Antiseren durch Verwendung eines menschlichen
oder humanisierten Immunglobulintranslokus in nicht-genkonvertierenden
Tieren. Die menschlichen Immunglobulinloki, die in diesen Referenzen
beschrieben werden, enthalten keine multiplen menschlichen Ig-kodierenden
Sequenzen, flankiert/abgetrennt durch multiple, nicht kodierende,
von Tieren abgeleitete Sequenzen. Die in diesen Referenzen beschriebenen
menschlichen oder humanisierten Immunglobulinloki unterstützen auch
keine Genkonversion und führen
daher zu einer Expression von Antikörpern, enthaltend eine variable
Region, kodiert durch ein einzelnes V-Gen-Segment, selbst in Gen
konvertierenden Tieren. Die WO A 00/31141 betrifft humanisierte
Antikörper, die
für das
HPV-Oberflächenantigen
pre-S1 spezifisch sind, die eine Bindungsaffinität ähnlich dem Maus-monoklonalen
Antikörper
zeigen und die Immunogenizitäten
reduzieren, da sie weniger von Mäusen
abgeleitete Aminosäurereste
aufweisen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Polyklonale
Antiseren gegen ein spezifisches Antigen und ein transgenes, nichtmenschliches
Tier, umfassend genetisch veränderte
leichte und schwere Ketten-Immunglobulinloki oder mindestens einen
Teil von menschlichen leichten und schweren Ketten Immunglobulinloki
werden bereitgestellt. Ein Verfahren unter Verwendung einer schrittweisen
Modifikation eines Haustieres, worin das Antikörperreportoire im wesentlichen
durch Genkonversion diversifiziert ist (z.B. Kaninchen, Schafe, Schweine,
Kühe) wird
verwendet. Das Verfahren involviert den Ersatz endogener Elemente
der Immunglobulinloki durch homologe Rekombination durch die korrespondierenden
menschlichen Gegenstücke, insbesondere
den Ersatz von ein oder etlichen Exons, kodierend konstante Regionen
von schweren und leichten Ketten und ein oder mehreren variablen Regionelementen,
einschließlich
demjenigen, der proximal zum D-Region-Lokus liegt. Bei Tieren, bei denen
eine Antikörperdiversität im wesentlichen durch
Genkonversion erzeugt wird, führt
der Ersatz der V-Region, die zur D-Region besonders proximal ist,
durch ein menschliches V-Region-Element zu einer Expression des
menschlichen V-Elements in der Mehrzahl der Immunglobuline. Auf
diese gentechnologische Bearbeitung folgt ein Züchten von Wirten derselben
Art und eine Selektion eines Wirts, der auf eine Immunisierung reagieren
kann, unter Produktion von im wesentlichen menschlichen Antiseren
mit Wirts-Glykosylierung, wobei das Immunglobulin mindestens einen
funktionellen Teil der menschlichen schweren Kette aufweist. Tiere,
die die im wesentlichen menschliche Proteinsequenz Immglobuline
exprimieren, werden für
die Erzeugung von polyklonalen Antikörperpräparationen verwendet, durch
Immunisierung mit interessierenden Immunogenen, insbesondere Immunogenen,
die eine Antikörperproduktion
initiieren, die eine therapeutische Aktivität aufweist. Nach Reinigen der
Antiseren können
solche Antiseren selbst oder in Kombination mit anderen Reagenzien
für die
Verminderung infektiöser
Reagenzien, maligner Zellen, Krebs, unerwünschter Zielzellen oder eine
Immunmodulation verwendet werden.
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BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
werden Verfahren zur Erzeugung von im wesentlichen menschlichen
Antiseren in einem heterologen Wirt durch Immunisierung des Wirts
mit einem Immunogen bereitgestellt. Insbesondere wird eine polyklonale
Antiserenzu sammensetzung eines transgenen, nichtmenschlichen Tieres
bereitgestellt, die spezifisch ein Immunogen erkennt, wobei die
Antiserenzusammensetzung im wesentlichen aus Immunglobulinproteinmolekülen besteht,
umfassend mindestens einen Teil einer menschlichen schweren Ketten
konstanten Region- und variablen Region-Aminosäuresequenzen, codiert durch
Fragmente von mehr als einem variablen (V)-Region-Gen, worin (i)
die Immunglobulinproteinmoleküle
spezifisch an das Immunogen binden und (ii) wobei das transgene nichtmenschliche
Tier eine Antikörperdiversität im wesentlichen
durch Genkonversion erzeugt. Der Wirt ist durch das Folgende gekennzeichnet:
er ist mindestens im wesentlichen unfähig, endogene Antiseren zu
erzeugen und fähig,
vorrangig im wesentlichen menschliche Polypeptidantiseren bei Aussetzen
gegenüber
einer immunogenen Substanz zu erzeugen; und durch Erhalt seiner
Fähigkeit,
den Immunglobulinlokus umzuordnen und die V-, (DH)-,
J- und C-Regionen zu rekombinieren, um im wesentlichen menschliche
Proteinantiseren zu erzeugen, die mindestens eine menschliche Immunglobulin-konstante Region
und/oder mindestens ein menschliches variables (V)-Regionelement
beinhalten. Von besonderem Interesse sind konstante Regionen der
Subklassen Cα oder
Cγ, einschließlich aller
Cγ-Subklassen 1,
2, 3 und 4.
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DNA-Fragmente,
die menschliche konstante Regionen und variable Elemente kodieren
werden in das Genom durch homologe Rekombination integriert und
ersetzen die korrespondierenden endogenen Elemente.
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Verschiedene
Tiere, insbesondere Haustiere, die vernünftige Volumina von Antiseren
bereitstellen können,
können
verwendet werden. Die Tiere wiegen im allgemeinen mindestens 1 kg,
vorzugsweise 2 kg und können
5 kg oder mehr wiegen, wenn sie erwachsen sind, obwohl kleinere
Tiere verwendet werden können,
wenn dies geeignet ist. Die Gestationsperiode sollte auch weniger
als 12 Monate betragen, im allgemeinen im Bereich von 1 bis 4 Monate liegen.
Beispielhafte Tiere beinhalten Lagomorpha, z.B. Kaninchen, Schafe,
Rinder, Hasen, Katzen, Pferde und ähnliche, ausschließlich mausartige.
Die Tiere sind diejenigen, bei denen die Diversifikation des Antikörperrepertoirs
im wesentlichen durch Genkonversion bewirkt wird (d.h. Kaninchen,
Schweine, Schafe, Rinder). Bei diesen Tieren wird der Ersatz des
V-Regionelements, benachbart zur D-Region durch ein menschliches
V-Regionelement zu der Expression des menschlichen V-Regionelements
bei der Hauptzahl der Immunglobuline führen. Der beschriebene gentechnologische
Ansatz der vorliegenden Erfindung ist deutlich einfacher als andere
Ansätze,
die bei Mäusen
durchgeführt
wurden. Bei Mäusen wird
die Diversifikation des Antikörper repertoires
jedoch im wesentlichen durch Gen-Umanordnung (rearrangement) bewirkt.
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Wirtszellen,
z.B. Fibroblasten, Keratinozyten, Myozyten, Hepatozyten, Epithelzellen
oder andere Zellen, die in Kultur gezüchtet und expandiert werden
können
und kein umangeordnetes Genom aufweisen, werden durch die Einführung von DNA-Fragmenten
in die Zellen transformiert (genetisch modifiziert), wo die Fragmente
in das Wirtsgenom integriert werden. Die Einführung kann durch eine Vielzahl
von Verfahren geschehen, einschließlich Nackt-DNA (bare-DNA),
Transfektion mit einem viralen Vektor, Fusion, Biolistik, Liposome
usw. Das besondere Verfahren wird gemäß dem Zweck der Einführung der
DNA und der Effizienz der Integration gewählt werden. Funktionelle Immunglobulin
leichte und schwere Kettenloki werden durch homologe Rekombinationen
modifiziert, durch Ersatz von mindestens einem Teil der Wirts- schweren
Ketten konstanten Region durch mindestens einen funktionellen Teil der
menschlichen schweren Ketten konstanten Region und falls gewünscht in
analoger Weise, der Wirts- leichten Ketten konstanten Region durch
eine menschliche leichte Ketten konstante Region. Von besonderem
Interesse ist auch der Ersatz der V-Region, die besonders proximal
zur D-Region ist, durch ein menschliches V-Region-Element. Auf diese
Weise ist es nicht wahrscheinlich, obwohl einige Teile des Immunglobulins
Wirtssequenzen sind, dass eine starke Immunreaktion im Hinblick
auf die große
Vielzahl variabler Regionen in den Antiseren erzeugt wird. Bei Tieren,
bei denen die Antikörperdiversität im wesentlichen
durch Genkonversion erzeugt wird, führt der Ersatz der V-Region,
die zur D-Region besonders proximal ist, durch ein menschliches
V-Regionelement zu einer Expression des menschlichen V-Elements
in der Hauptzahl der Immunglobuline. Für den Ersatz konstanter Regionen
ist es von besonderem Interesse, mindestens ungefähr 2 der
3 Domänen
CH1, CH2 und CH3 der konstanten Region, insbesondere CH3, einzuschließen. In dem Ausmaß, in dem
solche Antiseren in einem Wirt funktionieren können, insbesondere einem immunkompromittierten
Wirt, ist die reduzierte Anzahl von Stufen, um Wirte zu erhalten,
die solche Antiseren erzeugen, attraktiv.
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Für die Integration
an einer vorherbestimmten Stelle werden Konstrukte hergestellt,
die in dieser Sequenz folgendes beinhalten: das DNA-Fragment für die Integration
und ein erstes Markergen, in Nachbarschaft zu homologen Sequenzen
von mindestens ungefähr
30nt und ein zweites Markergen, wodurch eine homologe Integration
in dem Verlust des zweiten Markergens mündet. Indem das zweite Markergen eine
negative Selektion bereitstellt – Zellen mit dem zweiten Markergen
werden gegenselektiert und aus der Zellmischung entfernt; indem
das erste Markergen eine positive Selektion bereitstellt – Zellen
mit dem ersten Markergen werden zurückgehalten – indem ein Medium verwendet
wird, gegen das das zweite Markergen empfindlich ist. Auf diese
Weise werden diejenigen Zellen, in denen das Konstrukt zufällig integriert
ist, vermindert. Durch weitere Verwendung eines Mediums, das für das erste
Markergen selektiv ist, werden die Zellen, die das erste Markergen
nicht enthalten, vermindert. Auf diese Weise sollten die verbleibenden
Zellen diejenigen sein, die eine homologe Rekombination aufweisen.
Wünschenswerterweise
befinden sich die Zellen im sich schnell vermehrenden Zustand, anstatt
in einem nicht-proliferierenden Zustand. Durch Verwendung eines Wachstumsmediums,
wie z.B. RPMI1640 oder DMEM, supplementiert mit FCS und Wachstumsfaktoren,
kann ein Wachstumszyklus induziert werden.
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Nachdem
die Zellen transformiert oder transfiziert wurden, werden die Zellen
in ein Selektivmedium gemäß dem verwendeten
Marker gegeben, in der Regel einer Antibiotikaresistenz oder dem
tk-Gen. Die Zellen werden in Kultur expandiert und dann kloniert.
Individuelle Zellen in Klonen können
dann im Hinblick auf die gewünschte
genetische Modifikation gescreent werden. Geeigneterweise kann eine
PCR verwendet werden um sicherzustellen, dass die gewünschte Modifikation,
Deletion oder Integration stattgefunden hat.
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Die
genetischen Modifikationen können
eine einzelne Modifikation sein oder, falls dies gewünscht wird,
können
die Zellen nach Expansion der Zellen mit der ersten Modifikation
einer zweiten Modifikation unterzogen werden. Zum Beispiel könnte man
nach Ersatz der schweren Ketten konstanten Regionen die leichten
Ketten konstanten Regionen ersetzen.
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Wenn
eine individuelle Modifikation auftritt, kann man einen einzelnen
Marker für
eine positive Selektion verwenden und man kann denselben Marker
wiederholt verwenden. Wenn zwei oder mehr Modifikationen in derselben
Zelle erzeugt werden, sollten unterschiedliche positive Selektionsmarker
verwendet werden, um unabhängig
auf jeder Stufe zu selektieren. Wie bereits angegeben, gibt es vielfältige Antibiotikaresistenzgene,
wobei diese Gene in Kombination verwendet werden können, um
eine Selektion auf jeder Stufe zu ermöglichen. Gene, die für die Selektion
nützlich
sind, beinhalten neo, tet, cam, tk, pen, mtx usw. Nachdem die Wirtszellen
modifiziert wurden und demonstriert wurde, dass sie die gewünschte Modifikation
aufweisen, können
die Zellen dann mit einer vom Kern befreiten nukleären Transfereinheitszelle
fusioniert werden, z.B. mit Oozyten oder embryonalen Stammzellen,
Zellen die totipotent sind und dazu in der Lage, einen funktionalen Neugeborenen
zu bilden. Die Fusion wird gemäß konventionellen
Techniken durchgeführt,
die gut etabliert sind. Siehe z.B. Cibelli et al., Science (1998)
280: 1256. Alternativ kann die Enukleierung von Oozyten und der
nukleäre
Transfer durch Mikrochirurgie unter Verwendung von Injektionspipetten
durchgeführt werden.
(Siehe z.B. Wakayama et al., Nature (1998) 394: 369). Die resultierenden
funktionellen Eizellen werden dann in einem geeigneten Medium kultiviert und
in synchronisierte Empfänger übertragen.
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Ein
anderes Verfahren zur Erzeugung nukleärer Transfereinheitszellen
ist die Einführung
von DNA-Konstrukten, umfassend menschliche Transgene in befruchtete
Eier. Die Eier können
dann expandiert werden, um embryonale Stammzellen bereitzustellen,
die im Hinblick auf die genetische Modifikation einem Screening
unterworfen werden und durch darauffolgendes Embryotransfer in Stiefmütter, in
denen die Eier fertiggestellt werden und die resultierenden Neugeborenen
im Hinblick auf den modifizierten Genotyp einem Screening unterzogen
werden.
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Die
resultierenden mutierten Wirte können dann
für eine
Züchtung
mit anderen mutierten Wirten verwendet werden. Zum Beispiel können Wirte
mit einem veränderten
schweren Ketten Immunglobulinlokus mit Wirten gezüchtet werden,
die einen veränderten
leichten Ketten Immunglobulinlokus aufweisen, um einen Wirt zu züchten, der
im wesentlichen menschliche Polypeptidimmunglobuline erzeugen kann.
Die hemizygoten Geschwister, enthaltend die zwei mutierten Gene,
werden dann gezüchtet,
um homozygote Geschwister zu erzeugen. Die Homozygozität kann einfach
durch Abwesenheit der unerwünschten
Gensequenzen bestimmt werden. Nach jeder Züchtung wird der Wirt im Hinblick
auf die Gegenwart der genetischen Modifikation in seinen Zellen
hin untersucht, insbesondere den Keimzellen und kann zu einer weiteren
Generation gezüchtet
werden, in der Regel nicht mehr als drei Generationen, um sicherzustellen,
dass die Modifikation stabil über sukzessive
Generationen erhalten bleibt. Die Genome der verschiedenen Nachkommen
können
im Hinblick auf den Erhalt der genetischen Modifikationen hin analysiert
werden oder je nach Bedarf kann die Nachkommenschaft im Hinblick
auf die biologische Veränderung
durch die erzeugte genetische Modifikation hin analysiert werden.
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Sobald
der Wirt erzeugt wurde, kann der Wirt nun verwendet werden, um Antiseren
unter einer Vielzahl von Bedingungen zu erzeugen. Abhängig von
der Verwendung der Antiseren können
Antigene, Immunogene, umfassend ein Hapten, kovalent gebunden an
ein Antigen, Organismen, z.B. Viren und einzellige Organismen, lebend,
attenuiert oder tot, Fragmente von Organismen, Organellen, Zellen,
insbesondere menschliche Zellen oder Fragmente von Zel len oder ähnliche
verwendet werden. So können die
Antiseren gegen ein Antigen, ein kleines organisches Molekül oder eine
Zelle gerichtet sein, wobei die verschiedenen Einheiten endogen
oder exogen für
den menschlichen Wirt sein können.
Die Immunisierungszusammensetzung kann auf jede übliche Weise verabreicht werden,
mit oder ohne Adjuvans und kann gemäß einem bestimmten Schema verabreicht
werden. Die Affinität
für die
Immunisierungszusammensetzung kann dann überwacht werden und die Antiseren
gesammelt werden, wenn die Antiseren eine gewünschte Spezifität und Affinität aufweisen. Die
Affinität
der Antiseren wird im allgemeinen bei mindestens 10–7,
in der Regel mindestens ungefähr 10–8,
vorzugsweise mindestens ungefähr
10–9 oder höher liegen.
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Für einige
Anwendungen kann man Wirte verwenden, worin das V-Element, proximal
zu den D-Regionen, durch verschiedene menschliche V-Regionelemente
ersetzt wurde. Auf diese Weise werden unterschiedliche Immunreaktionen
gegenüber
demselben Immunogen von unterschiedlichen Wirten erhalten, wo die
variable Regionsequenz als Ergebnis einer Genkonversion sein kann,
was unterschiedliche Allele bereitstellt. Die Antiseren von den
unterschiedlichen Wirten können
vermischt werden, um ein breiteres Repertoire von Antikörpern bereitzustellen.
Bis zu 10 oder mehr unterschiedliche Wirte können verwendet werden, abhängig vom
interessierenden Antigen.
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Antikörperpräparationen
werden erhalten, indem Blut von gentechnologisch vorbereiteten Tieren, die
menschliche Sequenzimmunglobuline exprimieren, fraktioniert wird.
Eine konzentrierte Immunglobulinfraktion kann durch Chromatografie
(Affinität,
Ionenaustausch, Gelfiltration usw.), selektive Präzipitation
mit Salzen wie z.B. Ammoniumsulfat, organischen Lösungsmitteln,
wie z.B. Ethanol oder Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, hergestellt
werden.
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Die
fraktionierten Antikörper
können
in nicht-toxischen, nicht-pyrogenen Medien, die für eine intravenöse Verabreichung
an den Menschen geeignet sind, gelöst oder verdünnt werden,
z.B. steriler gepufferter Salzlösung.
Bei einigen Anwendungen können
die Antikörperpräparationen
direkt auf das Epithel angewendet werden. Für solche Anwendungen können die
fraktionierten Antikörper
in einem wasserlöslichen
Gel, wie z.B. KY-Gel oder ähnlichem gelöst werden.
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Die
für die
Verabreichung verwendeten Antikörperpräparationen
sind allgemein dadurch gekennzeichnet, dass sie eine polyklonale
Antikörperpopulation
enthalten, mit Immunglobulinkonzentrationen von 0,1 bis 100 mg/ml,
noch üblicher
1 bis 10 mg/ml. Die Antikörperpräparation
kann Immunglobuline verschiedener Isotypen enthalten. Alternativ
kann die Antikörperpräparation
Antikörper
mit nur einem Isotyp enthalten oder eine Anzahl von selektierten
Isotypen.
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In
den meisten Fällen
wird die Antikörperpräparation
aus nicht-modifizierten Immunglobulinen bestehen. Alternativ kann
die Immunglobulinfraktion einer Behandlung, wie z.B. einem enzymatischen
Verdau (z.B. mit Pepsin, Papain, Plasmin, Glykosidasen, Nukleasen
usw.), einer Erwärmung
usw. unterzogen werden und/oder weiter fraktioniert werden.
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Die
Antikörperpräparationen
werden allgemein in das vaskuläre
System verabreicht, in geeigneter Weise intravenös durch Injektion oder Infusion über einen
Katheter, der in eine geeignete Vene implantiert ist. Die Antikörperpräparation
wird in einer geeigneten Rate verabreicht, im allgemeinen im Bereich
von ungefähr
10 Minuten bis ungefähr
24 Stunden, üblicherweise
von ungefähr
30 Minuten bis ungefähr
6 Stunden, gemäß der Rate,
mit der die Flüssigkeit
vom Patienten akzeptiert werden kann. Die Verabreichung der effektiven
Dosierung kann als einzelne Infusion oder als Reihe von Infusionen
auftreten. Wiederholte Infusionen können einmal täglich, einmal
pro Woche, einmal pro Monat oder einmal alle drei Monate verabreicht
werden, abhängig
von der Halbwertszeit der Antikörperpräparation
und der klinischen Indikation. Für
Anwendungen auf Epitheloberflächen
werden die Antikörperpräparationen
auf die Oberfläche
aufgebracht, die einer Behandlung bedarf und zwar in ausreichender
Menge, um das beabsichtigte Endergebnis bereitzustellen und diese können, falls
nötig,
wiederholt werden.
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Die
Antikörperpräparationen
finden ihre Verwendung in ihrer Fähigkeit, antigene Einheiten,
die eine Erkrankung oder die unerwünschte oder abnormale Immunreaktionen
auslösen,
in menschlichen Körpergeweben
zu binden und zu neutralisieren. Eine "antigene Einheit" ist hier definiert als alle löslichen
oder zelloberflächengebundenen
Moleküle,
einschließlich
Proteinen wie auch Zellen oder infektiöse Erkrankung auslösende Organismen
oder Mittel, die mindestens zu einer Bindung an einen Antikörper in der
Lage sind und vorzugsweise auch zu einer Stimulation einer Immunreaktion
in der Lage sind.
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Die
Verabreichung einer Antikörperpräparation
gegen ein infektiöses
Mittel als Monotherapie oder in Kombination mit einer Chemotherapie
führt zu
einer Eliminierung infektiöser
Teilchen. Eine einzelne Verabreichung von Antikörpern vermindert die Zahl der
infektiösen
Teilchen allgemein um das 10- bis 100fache, noch üblicher
um mehr als das 1.000fache. Auf ähnliche
Weise reduziert eine Antikörpertherapie
bei Patienten mit malignen Erkran kungen als Monotherapie oder in
Kombination mit einer Chemotherapie die Anzahl maligner Zellen im
allgemeinen um das 10- bis 100fache oder um mehr als das 1.000fache.
Die Therapie kann über
eine verlängerte
Zeitspanne wiederholt werden, um eine vollständige Eliminierung infektiöser Teilchen,
maligner Zellen usw. sicherzustellen. In einigen Fällen wird eine
Therapie mit Antikörperpräparationen
für verlängerte Zeitspannen
in Abwesenheit nachweisbarer Mengen infektiöser Teilchen oder unerwünschter
Zellen fortgesetzt werden. Auf ähnliche
Weise kann die Verwendung der Antikörpertherapie für die Modulation
von Immunreaktionen aus einzelnen oder multiplen Verabreichungen
der therapeutischen Antikörper bestehen.
Die Therapie kann für
verlängerte
Zeitspannen in Abwesenheit irgendwelcher Erkrankungssymptome fortgesetzt
werden.
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Die
vorliegende Behandlung kann zusammen mit einer Chemotherapie in
ausreichenden Dosierungen verwendet werden, um eine infektiöse Erkrankung
oder maligne Vorkommnisse zu inhibieren. Bei an Autoimmunerkrankungen
leidenden Patienten oder Transplantatempfängern kann die Antikörpertherapie
zusammen mit immunsupprimierenden Therapien in ausreichenden Dosierungen
verwendet werden, um Immunreaktionen zu inhibieren.
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Die
folgenden Beispiele werden illustrativ angeboten und sollen nicht
begrenzend sein.
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EXPERIMENTELLER TEIL
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Erzeugung von transgenen
Kaninchen, die im wesentlichen menschliches Immunglobulin exprimieren
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Exons,
die menschliche konstante Regionelemente und variable Regionelemente
kodieren, werden in das Genom von Kaninchen-Fibroblasten durch homologe
Rekombination integriert. Kaninchen-Fibroblasten werden mit verschiedenen
linearisierten DNA-Konstrukten transfiziert, enthaltend menschliche
Immunglobulin-Lokuselemente. Erfolgreich transfizierte Zellen werden
selektiert und für
die Klonierung von Kaninchen verwendet.
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Klonierung
von Kaninchen
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Reife
holländische
Belton-Kaninchen werden durch subkutane Injektion von follikelstimulierendem
Hormon (FSH) alle 12 Stunden (0,3 mg × 2 und 0,4 mg × 4) superovuliert.
Die Ovulation wird durch intravenöse Verabreichung von 0,5 mg
luteinisierendem Hormon (LH) 12 Stunden nach der letzten FSH-Injektion
induziert. Die Oozyten werden durch Ovidualflush 17 Stunden nach
der LH-Injektion gewonnen. Die Oozyten werden mechanisch 16 bis
19 Stunden nach ihrer Reifung vom Kern befreit. Eine Chromosomenentfernung wird
durch BisBENZIMID (HOECHST 33342, Sigma, St. Louis, MO) -Farbstoff unter
ultraviolettem Licht überprüft.
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Die
enukleierten Oozyten werden mit sich aktiv teilenden Fibroblasten
unter Verwendung von einem elektrischen Puls von 180 V/cm für 15 μs (Electrocell
Manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA) fusioniert. Nach 3
bis 5 Stunden werden die Oozyten chemisch mit Calciumionophor (6 μM) für 4 Minuten
(# 407952, Calbiochem, San Diego, CA) und 2 mM 6-Dimethylaminopurin
(DMAP, Sigma) in CR2-Medium (Specialty Media, Lavalett, NJ) mit
3 mg/ml bovinem Serumalbumin (fettsäurefrei, Sigma) für 3 Stunden
aktiviert. Folgend auf die Aktivierung werden die Embryos in Hamsterembryo-Kulturmedium (HECM)-Hepes
fünfmal
gewaschen und darauffolgend in CR2-Medium, enthaltend 3 mg/ml fettsäurefreies
BSA für
7 Tage bei 37,8°C
und 5% CO2 an Luft kultiviert. Die Embryos
werden dann in synchronisierte Empfänger übertragen. Die Nachkommen werden
durch PCR im Hinblick auf ein Segment des Transgens analysiert.
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Bindung menschlicher Antikörper, exprimiert
in Kaninchen, an das Hepatitis B-Oberflächenantigen
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Gentechnologisch
vorbereitete Kaninchen (wie oben beschrieben) werden intramuskulär mit gereinigtem
Hepatitis B-Oberflächenantigen
(HBsAg) (10 μg
in inkomplettem Freunds Adjuvans) am Tag 0 und Tag 14 immunisiert.
Am Tag 28 läßt man die
Tiere aus dem Ohr bluten und das Serum wird hergestellt. ELISA-Platten
(NUNC, Dänemark)
werden mit 1 μg/ml
HBsAg in PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Darauffolgend
werden die zur Verfügung stehenden
Bindungsstellen durch Inkubation mit 1% nicht fetter Trockenmilch
(NFM) in PBS (300 μl/Vertiefung)
blockiert. Kaninchenserum wird in PBS/1% NFM verdünnt und
den beschichteten Vertiefungen zugefügt. Nach einer Inkubation für 1 Stunde
werden die Platten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und
gebundenes Ig wird unter Verwendung von Ziegen-anti-menschlichem
Ig, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Konjugierter Ziegen-Antikörper wird
unter Verwendung von o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma) mit
1 mg/ml nachgewiesen. Die Farbreaktion wird durch Zugabe von 1 M
HCl-Lösung
beendet und die Absorption bei 490 nm gemessen. Als Kontrolle wird
Serum von nicht immunisierten Kaninchen verwendet. Serum von nicht
immunisierten Kaninchen reagiert nicht mit HBsAg. Bei einer Verdünnung von
1:100 liegt die gemessene optische Dichte bei nicht beschichteten
und HBsAg-beschichteten Vertiefungen unterhalb von 0,4. Demgegenüber enthält Serum
von immunisierten Kaninchen substanziell menschliche Antikörper, die
mit HBsAg reaktiv sind. Bei einer Serumverdünnung von 1:100 beträgt die ge messene
optische Dichte 2,8. Bei weiterer Verdünnung des Serums nimmt die
gemessene optische Dichte auf 0,2 ab (bei einer Verdünnung von
25.600). Es können
keine Antikörper,
die mit einem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat reaktiv sind,
nachgewiesen werden. Dies demonstriert, dass die gentechnologisch
vorbereiteten Kaninchen im wesentlichen menschliche anti-HBsAg-Antikörper, folgend
auf die Immunisierung, erzeugen.
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Komplementvermittelte
Zytotoxizität
bei einer Virusinfektionszelllinie unter Verwendung menschlicher Antikörper
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Eine
menschliche Leber-Karziomzelllinie, die HBsAg exprimiert, wird mit
0,1 mCi 51Cr in 100 ml PBS 1 Stunde bei
37°C markiert.
Zweitausend 51Cr-markierte Zellen werden
mit Serum von gentechnologisch vorbereiteten Kaninchen, die anti-HBsAg-Immunglobulin
exprimieren, (siehe oben) inkubiert. Nach 2 Stunden bei 37°C wird die
Freisetzung von 51Cr in den Überstand
durch Messung der Radioaktivität
unter Verwendung einer Szintillationszählvorrichtung bestimmt. Für die Bestimmung
der maximalen Freisetzung wird 1% Triton X100 zugesetzt. Der Grad
der Zelllyse wird wie folgt berechnet: % Lyse
= CPM im Experiment ± CPM-#spontan/CPM#
total ± CPM
spontan.
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Die
Inkubation markierter Zellen mit Serum (verdünnt 1:30) von nicht-immunisierten Kaninchen führt nicht
zu einer Zelllyse (< 10%).
Die Inkubation von Zellen mit Serum von immunisierten Kaninchen führt jedoch
zu 80% Zelllyse. Die Inaktivierung von Komplement im Serum durch
Wärmebehandlung (56°C für 30 Minuten)
macht das Serum der immunisierten Kaninchen inaktiv. Diese Ergebnisse
demonstrieren, dass im wesentlichen menschliche Antikörper, erzeugt
durch gentechnologisch vorbereitete Kaninchen, an HBsAg-positive
Zellen binden und zu einer komplementabhängigen Lyse führen.
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Behandlung von Tieren
mit einer Infektion
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Im
wesentlichen menschliches Immunglobulin wird aus dem Serum gentechnologisch
vorbereiteter Kaninchen durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und Ionenaustauschchromatographie
gereinigt. SCID-Mäuse
werden mit einer Million menschlicher Leberkarzinomzellen, die HBsAg
exprimieren, injiziert. Darauffolgend wird 25 μg Immunglobulin peritoneal einmal
pro Tag injiziert. Tiere, die mit Antikörpern behandelt wurden, isoliert
aus nichtimmunisiertem Kaninchenserum, starben nach ungefähr 60 Tagen. Dies
entspricht ungefähr
nicht behandelten Empfängern
von Leberkarzinomzellen. Demgegenüber überleben Mäuse, behandelt mit Antikörpern, isoliert
aus dem immunisierten Kaninchenserum, mehr als 150 Tage. Dies demonstriert,
dass menschliche Antikörper,
erzeugt in genetisch vorbereiteten Kaninchen, dazu in der Lage sind,
menschliche Karzinomzellen aus SCID-Mäusen zu eliminieren.
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Aus
den obigen Ergebnissen wird deutlich, dass durch die Verwendung
gentechnologisch vorbereiteter Kaninchen, die im wesentlichen menschliche Immunglobulingene
exprimieren, polyklonale Antikörperpräparationen
gegen Antigene, infektiöse
Teilchen, Krebszellen und ähnliches
erzeugt werden können.
Solche polyklonalen Antikörperpräparationen
können
verwendet werden um Patienten zu behandeln, die an einer infektiösen Erkrankung
oder malignen Vorkommnissen leiden. Die Antiseren können auch
verwendet werden, um eine Immunreaktion durch Eliminierung von Zell-Subpopulationen,
Zytokinen oder ähnliche
zu modulieren. Die menschliche Antikörperpräparation hat im Vergleich mit
heterologen Antiseren eine deutlich reduzierte Wahrscheinlichkeit,
eine Immunreaktion bei menschlichen Patienten auszulösen, wird
weniger Nebenwirkungen aufweisen und kann sicher mit positiven Ergebnissen verwendet
werden.
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Es
wird für
den Fachmann deutlich werden, dass viele Veränderungen und Modifikationen
hier durchgeführt
werden können,
ohne sich vom Umfang der beigefügten
Ansprüche
zu entfernen.