DE69230135T2

DE69230135T2 - Dna-sequenz, die für rinder-g(a)-lactalbumin kodiert, und nutzungsmethoden

Info

Publication number: DE69230135T2
Application number: DE69230135T
Authority: DE
Inventors: Gregory Bleck; Robert Bremel
Original assignee: Wisconsin Milk Marketing Board Inc
Current assignee: Wisconsin Milk Marketing Board Inc
Priority date: 1991-08-13
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 2000-06-21
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: AU663101B2; DK0555435T3; EP0555435A4; CA2093659C; AU2411992A; WO1993004165A1; ATE185596T1; EP0555435A1; NZ243930A; US5530177A; US5850000A; JP3698369B2; IL102783A0; DE69230135D1; JPH06502550A; EP0555435B1; CA2093659A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen eine DNS-Sequenz, die für bovines α-Lactalbumin kodiert, und Verfahren zur Herstellung von Proteinen, darunter rekombinante Proteine, in der Milch von laktierenden, genetisch veränderten oder transgenen Säugetieren. Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf einen genetischen Marker, der zur Identifizierung von Tieren mit überlegenen Milcherzeugungs-Eigenschaften geeignet ist.
Vollständige bibliographische Zitate des in dieser Beschreibung genannten Standes der Technik finden sich in dem Abschnitt vor den ANSPRÜCHEN.
α-Lactalbumin ist ein wichtiges Molke-Protein, das in Kuhmilch gefunden wird (Eigel et al., 1984). Der Ausdruck "Molke-Protein" umfaßt eine Gruppe von Milchproteinen, die in "Milch-Serum" oder Molke nach Präzipitation des Caseins, einem weiteren Milchprotein, bei pH 4,6 und 20ºC, löslich bleibt. α-Lactalbumin weist diese Eigenschaften auf.
α-Lactalbumin ist ein sekretorisches Protein, das normalerweise etwa 2,5% des Gesamtproteins der Milch ausmacht. α-Lactalbumin wurde als Index der Milchdrüsenfunktion in Abhängigkeit der hormonellen Regulation in boviner Explantat-Kultur verwendet (Akers et al., 1981; Goodman et al., 1983), sowie als Index für Euter-Entwicklung (McFadden et al., 1986). α-Lactalbumin interagiert mit Galactosyltransferase und spielt daher für die Biosynthese des Milchzuckers Lactose eine wesentliche Rolle (Brew, K. und R. L. Hill, 1975). Lactose ist ein wichtiger Bestandteil der Milch und trägt zur Osmolalität der Milch bei. Es ist der konstanteste Bestandteil in Kuhmilch (Larson, 1985). α-Lactalbumin ist ein nützlicher Index der Lactogenese für Milchdrüsengewebe in Zellkultur (McFadden et al., 1987). Es wird daher davon ausgegangen, daß α-Lactalbumin ein für die Kontrolle der Milch- Ausbeute wichtiges Protein ist und als Indikator der Milchdrüsenfunktion verwendet werden kann.
Die Expression des bovinen α-Lactalbumin kann potentiell ein beschränkender Faktor in Milchvieh sein. Wenn eine gesteigerte Expression des α-Lactalbumin-Gens erreicht werden könnte, könnte mehr Milch und mehr Milchprotein erzeugt werden. Mit anderen Worten, α-Lactalbumin ist möglicherweise ein Merkmal für einen quantitativen Genort ("Quantitative Trait Locus", QTL).
Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, genetische Unterschiede in der Expression des α-Lactalbumin beim Rind nachzuweisen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine DNS-Sequenz zur Verfügung zu stellen, die für ein Milchdrüsen-spezifisches bovines α-Lactalbumin-Protein mit einer spezifizierten Nukleotidsequenz kodiert. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur genetischen Veränderung durch Aufnahme von einer oder mehreren Kopien eines Konstruktes, das einen α-Lactalbumin-Kontrollbereich umfaßt, zur Verfügung zu stellen, wobei das Konstrukt in Milchdrüsengewebe spezifisch aktiviert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird somit eine isolierte DNS-Sequenz zur Verfügung gestellt, die eine Milchdrüsen-spezifische Expression einer m-RNS in Milchdrüsenzellen eines laktierenden Tieres antreibt, welche einen α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereich vom Rind umfaßt, der ein Adenin an der Position -13 ausgehend vom Beginn des das Signalpeptid kodierenden Bereiches aufweist.
Vorzugsweise umfaßt die DNS-Sequenz ferner eine DNS, die hierin als SEQ. ID. NO: 19 bezeichnet wird. Besonders bevorzugt ist eine DNS-Sequenz, die als SEQ. ID. NO: 3 identifiziert wird.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionssystem zur Verfügung gestellt, welches ein Milchdrüsen-spezifischen α-Lactalbumin-Kontrollbereich umfassend SEQ. ID. NO: 19 aufweist, der operativ mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die ein Signalpeptid kodiert, wobei, wenn das Expressionssystem genetisch in ein nicht-humanes Säugetier eingeführt wird, dieses weiblichen Tieren dieses Säugetiers ermöglicht, ein gewünschtes rekombinantes Peptid in deren Milch zu erzeugen.
Vorzugsweise umfaßt das Konstrukt ein 5'-α-Lactalbumin-flankierenden Bereich, welcher an eine β-Casein-DNS-Sequenz vom Rind angehängt ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält es die Polyadenylierungsstellen des β-Casein flankierenden Bereichs. Vorzugsweise enthält das Konstrukt den proximalen Promotor eines ersten Milchproteins und den distalen Kontrollbereich eines zweiten Milchproteins. Das erste und zweite Milchprotein werden vorzugsweise aus α-Lactalbumin, β-Lactalbumin, as&sub1;-Casein, as&sub2;-Casein und K-Casein ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines exogenen rekombinanten Proteins und zur Sekretion desselben in nicht-humane Säugetiermilch zur Verfügung gestellt, bei dem man
a) Milch in einem genetisch veränderten, nicht-menschlichen Säugetier erzeugt, das ein Expressionssystem enthält, welches einen Milchdrüsen-spezifischen α-Lactalbumin Kontrollbereich umfassend SEQ. ID. NO: 19 umfaßt, der operativ mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion und Reifung des exogenen rekombinanten Proteins im Milchdrüsengewebe bewirken kann;
b) die Milch sammelt; und
c) das exogene rekombinante Protein aus der Milch isoliert.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Auswahlcharakteristikum zur Identifizierung von Säugetieren, die im Vergleich zu Säugetieren, denen das Auswahlcharakteristikum fehlt, eine erhöhte Milcherzeugung aufweisen, welches eine DNS- Sequenz umfaßt, die für Rinder α-Lactalbumin kodiert, und welches im Kontrollbereich des Rinder-α-Lactalbumin die DNS-Sequenz aufweist, die in SEQ. ID. NO: 3 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Auswahlcharakteristikum zum Identifizieren von Säugetieren, die im Vergleich zu Säugetieren, denen das Auswahlcharakteristikum fehlt, eine erhöhte Milcherzeugung aufweisen, welches ererbtes genetisches Material umfaßt, das ein α-Lactalbumin 5'-flankierender Kontrollbereich ist, der ein Adenin an der Position -13 ausgehend vom Beginn des das Signalpeptid kodierenden Bereiches aufweist. Das genetische Material kodiert für einen gewünschten dominanten selektierbaren Marker für α-Lactalbumin vom Rind.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zur Voraussage von erhöhter Milch- und Milchprotein-Erzeugung in Säugetieren, bei dem man Säugetiere identifiziert, die Adenin an der Position -13 ihres α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereichs aufweisen, wobei diejenigen Säugetiere, die ein Adenin an der Position -13 aufweisen, im Vergleich zu Säugetieren, die kein Adenin an der Position -13 aufweisen, eine erhöhte Milch- und Milchprotein-Erzeugung zeigen.
Die DNS-Sequenz und die verschiedenen Verfahren ihrer Verwendung haben potentielle Vorteile für Milchvieh-Landwirte, künstliche Besamungsorganisationen, sowie Firmen, die sich mit genetischen Markierungen, Embryonentransfer und Klonierung beschäftigen, um nur einige zu nennen.
Die Verwendungen für diesen genetischen Marker umfassen die Identifizierung von bevorzugten Kerntransfer-Embryonen und die Identifizierung von bevorzugten, zu klonierenden Embryonen.
Die vorliegende Erfindung wird ferner die Überprüfung der Nachkommen von Vatertieren erleichtern. Die spezifische DNS-Sequenz kann als genetischer Marker verwendet werden, um mögliche Spit zen-Vatertiere im Hinblick auf Milch-Erzeugung und Milchprotein- Erzeugung zu identifizieren. Dadurch wird die Verläßlichkeit des Erwerbs verbesserten Milchviehs gesteigert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Hilfe für Entscheidungen des landwirtschaftlichen Betriebsmanagement zur Verfügung, wie beispielsweise Auswahl des Vatertiers und selektive Ausmerzung. Die physiologischen Marker unterstützen zusätzlich zu der Abstammung einer Kuh bei der Bestimmung der zukünftigen Produktionsleistung. Ausgehend von dieser Information könnte man eine Färse mit einer DNS-Sequenz, die für das erfindungsgemäße α-Lactalbumin kodiert, erwerben oder behalten und die Ausmerzung einer Färse ohne die geeignete Sequenz erwägen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer partiellen Restriktionskarte des erfindungsgemäßen α-Lactalbumin vom Rind. Die Sequenz enthält 2,0 Kilobasen eines 5'-flankierenden Bereichs, 1,7 Kilobasen eines kodierenden Bereichs und 8, 8 Kilobasen eines 3'-flankierenden Bereichs. Verdau mit HpaI erzeugt ein Fragment von 2,8 Kilobasen, welches den gesamten 5'-flankierenden Bereich enthält.
Fig. 2 stellt eine schematische Übersicht einer Karte des Plasmids A-lac Pro/pIC 20R dar. Ein Hpa I-Fragment des genomischen Klons wurde in die EcoRV-Stelle von pIC 20R eingesetzt. Das Hpa I-Fragment enthält 2,1 Kilobasen der 5'-flankierenden DNS des für das Signalpeptid kodierenden Bereichs von α-Lactalbumin und 8 Basen, die für das reife α-Lactalbumin-Protein kodieren. Sechs einzigartige Enzymschnittstellen stehen zur Verfügung, um verschiedene Gene mit dieser Sequenz zu verknüpfen.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung einer detaillierten Karte des α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereichs, der in die EcoRV-Stelle des Plasmids pIC 20R kloniert wurde (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2).
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung einer detaillierten Karte des 8,0 Kilobasen BglII-Fragmentes.
Fig. 5 stellt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 3) des Kontroll- /Enhancer-Bereichs des α-Lactalbumin-Proteins vom Rind dar.
Fig. 6 zeigt in schematischer Darstellung eine Karte eines Plasmids, das ein bovines α-Lactalbumin- bovines β-Casein-Genkonstrukt enthält.
Fig. 7 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen humanen und bovinen Genen im 5'-flankierenden Bereich des bovinen α-Lactalbumin- Proteins zwischen der erfindungsgemäßen Sequenz des U.S.-Rindes (SEQ ID NO: 4), einer humanen Sequenz (SEQ ID NO: 5) und eines französischen Rindes (SEQ ID NO: 6) für das mögliche Steroid- Kontrollelement und zwischen der erfindungsgemäßen Sequenz vom U.S.-Rind (SEQ ID NO: 7), einer humanen Sequenz (SEQ ID NO: 8) und der Sequenz von einem französischen Rind (SEQ ID NO: 9) für den Bereich der RNS-Polymerasebindung in der Umgebung von drei der vier variierenden Nukleotidsequenz-Mutationen.
Fig. 8 ist eine DOTPLOTTM Darstellung, welche den 5'-flankierenden Bereich der α-Lactalbumin-Sequenz vom Rind mit dem Bereich der humanen α-Lactalbumin-Sequenz vergleicht.
Fig. 9 ist eine wiederum DOTPLOTTM Darstellung, welche den 5'- flankierenden Bereich der bovinen α-Lactalbumin-Sequenz mit dem entsprechenden Bereich der Meerschweinchen α-Lactalbumin-Sequenz vergleicht.
Fig. 10 ist eine DOTPLOTTM Darstellung, welche den 5'-flankierenden Bereich der α-Lactalbumin-Sequenz vom Rind mit dem entsprechenden Bereich der Ratten α-Lactalbumin-Sequenz vergleicht.
Fig. 11 ist eine Darstellung, die die Expressionsmengen in jeder der 3 α-Lactalbumin transgenen Mauslinien zeigt.
Fig. 12 zeigt ein 4% NuSieve autoradiographisches Gel von MnII verdauten PCR-Produkten.
Fig. 13 ist eine Darstellung, welche einen Scatter-Plot von jedem Datenpunkt aus Fig. 12, sowie die Durchschnittswerte für jeden der drei Genotypen zeigt.

Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Im Rahmen der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:
Genetisches Engineering, Manipulation oder Veränderung: Die Erzeugung neuer Kombinationen von Materialien durch Insertion von Nukleinsäure-Molekülen, welche außerhalb der Zelle erzeugt wurden, in irgendein virales, bakterielles Plasmid oder anderes Vektorsystem, um dessen Einbau in einen Wirtsorganismus zu ermöglichen, in welchem diese natürlicherweise nicht vorkommen, aber in welchem eine kontinuierliche Vermehrung wenigstens für die Lebensdauer des Wirtsorganismus möglich ist. Obwohl der Begriff transgene Veränderung umfaßt, muß die Veränderung der genomischen Sequenz nicht dauerhaft erfolgen, d. h. die genetische Veränderung kann lediglich das manipulierte Tier betreffen.
Transgene Tiere: Dauerhaft genetisch veränderte Tiere, die durch Einführung neuer DNS-Sequenzen in die Keimbahn über eine Zugabe zu der Eizelle erzeugt wurden.
Die vorliegende Anmeldung umfaßt die Verwendung irgendeines Säugetieres für die Erfindung. Beispiele von Säugetieren umfassen Kühe, Schafe, Ziegen, Mäuse, Ochsen, Kamele, Wasserbüffel, Lamas und Schweine. Die bevorzugten Säugetiere umfassen solche, die große Mengen an Milch produzieren und ausgedehnte laktierende Phasen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, welches für α-Lactalbumin vom Rind kodiert. Dieses Gen wurde isoliert und charakterisiert. Der 5'-flankierende Bereich des Gens wurde in sechs Vektoren zur Verwendung als Milchdrüsen-spezifischer Kontrollbereich bei der Erzeugung von genetisch veränderten Säugetieren kloniert. Um die Regulation dieses Kontrollbereichs besser zu verstehen, wurden 2,0 Kilobasen der Sequenz des 5'-flankierenden Bereichs sequenziert. Die 5'-flankierende Sequenz des α-Lactalbumin dient als nützlicher Milchdrüsen-spezifischer "Kontroll- /Enhancer-Komplex" zur Erzeugung genetischer Konstrukte, die in der Lage sein könnten, die Expression neuer und nützlicher Proteine in der Milch von genetisch veränderten oder transgenen Säugetieren anzutreiben. Dies ermöglicht eine Steigerung der Milcherzeugung und der Protein-Zusammensetzung in der Milch, eine Veränderung in der Milch und/oder der Protein-Zusammensetzung in der Milch und die Erzeugung wertvoller Proteine in der Milch von genetisch veränderten oder transgenen Säugetieren. Solche Proteine umfassen Insulin, Wachstumshormone, Faktoren, die Wachstumshormone freisetzen, Somatostatin, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Tumor-Nekrose-Faktor, Lipocortin, Gerinnungsfaktoren VIII und IX, die Interferone, Kolonie-stimulierender Faktor, die Interleukine, Urokinase, industrielle Enzyme, wie beispielsweise Cellulasen, Hemicellulasen, Peroxidasen und hitzestabile Enzyme.
Die Verwendung des α-Lactalbumin-Gens in dem Verfahren ist bevorzugt, da es einen 5'-Kontrollbereich eines Milchdrüsen-spezifischen Proteins aufweist. Ferner übt es die strengste Lactations-spezifische Kontrolle aller Milchproteine aus. Es wird auch unabhängig von anderen Milch-Proteinen reguliert und von laktierenden Tieren in großer Menge erzeugt.

Gesamtsequenz

Ein Gen, das für das Milchprotein α-Lactalbumin vom Rind kodiert, wurde aus einer genomischen Bank vom Rind isoliert (Woychik, 1982). Die Charon 28 Lambda-Bank wurde unter Verwendung einer bovinen α-Lactalbumin cDNS (Hurley, 1987) und eines 770 Basenpaar α-Lactalbumin Polymerasekettenreaktions-Produktes untersucht. Der positive λ-Klon umfaßt 12,5 Kilobasen an inserierter boviner Sequenz, bestehend aus 2,0 Kilobasen eines 5'- flankierenden (Kontroll-/Enhancer-)Bereichs, eines 1,7 Kilobasen kodierenden Bereichs und 8,8 Kilobasen eines 3'-flankierenden Bereichs. Eine partielle Restriktionskarte des Klons wird in Fig. 1 dargestellt.
Ein 2,8 Kilobasen Hpa I-Fragment, umfassend den 2,0 Kilobasen- Kontrollbereich mit dem für das Signalpeptid kodierenden Bereich wurde in die EcoRV-Stelle des Plasmides pIC 20R kloniert. Das Plasmid wird als schematische Übersichtsdarstellung in Fig. 2 gezeigt.
Ein 8,0 Kilobasen Bgl II-Fragment, enthaltend einen 2,0 Kilobasen 5'-flankierenden Kontrollbereich, einen 1,7 Kilobasen kodierenden Bereich, 3,0 Kilobasen eines 3'-flankierenden Bereichs, sowie 1,2 Kilobasen an Lambda-DNS wurde ebenfalls isoliert. Es wird auf Fig. 4 für eine Karte des 8,0 Kilobasen- Fragmentes verwiesen. Unter Verwendung des Bgl II-Fragmentes wurden transgene Mäuse erzeugt.

Kontroll-/Enhancer-Bereich

Der 2,0 Kilobasen 5'-flankierende Bereich wurde in die Vektoren Pic 20R und Bluescript KS+ kloniert. Eine schematische Darstellung der in die EcoRV-Stelle des pIC 20R klonierten 5'-flankierenden Kontrollbereichs des α-Lactalbumins ist in Figs. 2 und 3 dargestellt (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2).
Die multiple Klonierungsstelle des Konstruktes, welche stromabwärts von dem Bereich liegt, der für das Signalpeptid kodiert, ermöglicht die Verknüpfung verschiedener Gene mit dem α-Lactalbumin Kontrollbereich. Dieser Vektor erlaubt somit die einfache Anbindung spezifischer Kodierungssequenzen von Genen. Er enthält alle Elemente, die für eine Expression des Proteins in Milch notwendig sind, d. h. einen Milchdrüsen-spezifischen Kontrollbereich, einen Bereich, der für ein Milchdrüsen-spezifisches Signalpeptid kodiert, und eine Spleiß-Stelle zwischen dem reifen Protein und dem Signalpeptid, die in der Lage ist, in der Milchdrüse gespalten zu werden. Zur Vereinfachung der Klonierung enthält der Vektor ferner viele einzigartige Restriktionsenzym- Schnittstellen. Die Verbindung von Genen mit diesem Kontroll- Bereich ermöglicht Milchdrüsen-spezifische Expression der Gene, wenn entsprechende Konstrukte in Säugetiere plaziert werden. Diese Vektoren enthalten ferner die für das α-Lactalbumin Signalpeptid kodierende Sequenz, welche den richtigen Transport des exprimierten Proteins in die Milch des laktierenden Säugetiers ermöglicht.
Das Kontroll-Bereich-Konstrukt war in der Lage, Milchdrüsen- spezifische Expression eines gewünschten Proteins in transgenen Mäusen anzutreiben. Mengen von bovinem α-Lactalbumin von mehr als 1 mg/ml wurden in der Milch von transgenen Maus-Linien beobachtet, wie in Beispiel 2 beschrieben (infra). Konstrukte, in denen der 2,0 Kilobasen-Bereich an das bovine β-Casein-Gen (Bonsing, J., et al., 1988) sowie das bakterielle Reportergen Chloramphenicol-Acetyltransferase gebunden wurde, wurden in unserem Labor erzeugt. Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung eines Plasmides, das das bovine α-Lactalbumin, bovine β-Casein-Ggenkonstrukt aufweist. Die genomische DNS-Sequenz, die das bovine β-Casein-Gen enthält, wurde mit der 5'-flankierenden Sequenz des bovinen α-Lactalbumin verknüpft. Der Vektor enthält die Polyadenylierungsstelle des β-Casein zusammen mit etwa 100 Basenpaaren der 5'-flankierenden DNS. Die 100 Basenpaare der 5'-flankierenden DNS werden an den 5'-flankierenden Bereich des α-Lactalbumin in der Position -100 gebunden. Das Konstrukt verwendet die proximalen Promotorelemente des β-Casein und distalen Elemente des Kontrollbereichs von α-Lactalbumin. Das β-Caseinkonstrukt wurde verwendet um transgene Mäuse zu erzeugen, wie in den Beispielen dargestellt.
Um den Einfluß des Kontroll-/Enhancer-Bereichs zu verstehen, wurden die 2,0 Kilobasen des 5'-flankierenden Bereichs sequenziert. Eine Einzelstrangkopie der Sequenz wird in Fig. 5 (SEQ ID NO: 3) dargestellt.

Regulatorische Sequenzen

Mögliche regulatorische Sequenzen innerhalb des 5'-flankierenden Bereichs des bovinen α-Lactalbumins wurden identifiziert. Es gibt mögliche regulatorische Bereiche in den Introns sowie in den 3'-flankierenden Bereichen. Teile der erwarteten Kontroll- Bereiche wurden auf mögliche Sequenzunterschiede in der Population hin untersucht, welche in Relation zu Milch- und Milchprotein-Erzeugung einzelner Kühle stehen könnten. Es ist davon auszugehen, daß Unterschiede in den regulatorischen Bereichen des α-Lactalbumin zu Unterschieden in Expression an α-Lactalbumin mRNS führt. Der gesteigerte zelluläre Anteil an mRNS wird die Expression des α-Lactalbumin-Proteins erhöhen, wodurch gleichzeitig ein Anstieg an Lactose-Synthase erfolgt, was schließlich zu einer Steigerung in Milch- und Milchprotein-Erzeugung führt. Diese Art von Mechanismus würde als ein wesentlicher Gen-Effekt auf Milch- und Milchprotein-Erzeugung über α- Lactalbumin zu bewerten sein. Die Veränderungen werden mit den Veränderungen in der Milch- und Milchprotein-Erzeugung kausal und nicht korrelationsabhängig zu erkennen sein. Korrelationsabhängige Merkmale sind solche, die nahe mit einem unbekannten Genort assoziiert sind, welcher unmittelbaren Einfluß auf das quantitative Merkmal hat.
Sequenzunterschiede zwischen der U.S.-Holstein und der Französischen Kuh (Vilotte, et al., 1987) unbekannter Herkunft wurden innerhalb von vier Positionen in dem 5'-flankierenden Bereich gefunden. Eine der identifizierten Sequenzen weist eine Sequenz auf, die darauf hindeutet, daß es sich um ein Steroidhormon- Kontroll-Element handelt. Zwei weitere Unterschiede wurden im Bereich der RNS-Polymerase-Bindungsstelle und ein vierter im dem Bereich des Gens, welches für das Signalpeptid kodiert, gefunden. Aufgrund des Verhältnisses zwischen diesen Sequenzen und bekannten Kontroll-Sequenzen von Säugetiergenen würde man davon ausgehen, daß alle Abweichungen in Bereichen vorliegen, die in der Regulation der Menge der erzeugten mRNS involviert sind. Ferner, ist auch davon auszugehen, daß genetische Unterschiede, welche in Faktoren auftreten, die an diesen Bereich binden, ebenfalls Veränderungen hervorrufen.
Fig. 7 zeigt die Sequenzunterschiede, die im 5'-flankierenden Bereich zwischen der vorliegenden Erfindung am U.S. bovinen, humanen (Hall et al., 1987) und dem Französisch bovinen (Vilotte, 1987) im Hinblick auf das mögliche Steroid-Kontroll-Element (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6, respektive) und für die RNS-Polymerasebindungsstelle (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9, respektive) beobachtet wurden. Alle Unterschiede tauchen in hochkonservierten Teilen des Gens auf, wie durch Vergleich dieser Bereiche zu entsprechenden Bereichen des humanen α-Lactalbumin-Gens deutlich wird. Fig. 7 zeigt ferner, daß die Positionen, in denen die bovinen Gene sich unterscheiden, dieselben Positionen sind, in denen sich die humanen Gene von den bovinen unterscheiden. Diese Daten weisen darauf hin, daß die Basen Teil eines möglicherweise wichtigen Kontrollbereichs sind.
Es wurde ein Verfahren entwickelt, um eine eindeutige Differenzierung zwischen den zwei Varianten bei einer Position von - 13 Basen vom Start der Transkription, d. h. 13 Basenpositionen vor dem für das Signalpeptid kodierenden Bereich. Die zwei Varianten wurden (α-Lac (-13) A) und (α-Lac (-13) B) bezeichnet. Der α-lac (-13) A-Genotyp weist die Base Adenin in der Position -13 auf, während der α-lac (-13) B-Genotyp entweder ein Guanin, Thymin oder Cytosin als Base bei -13 aufweist. Diese können mittels eines einfachen Restriktionsenzymverdaus von amplifiziertem Polymerasekettenreations-Produkt unter Verwendung eines spezifischen Restriktionsenzyms (MnlI) voneinander unterschieden werden. Aufgrund der Spezifität des Restriktionsenzyms MnlI ist die Restriktionsanalyse nicht in der Lage, zwischen diesen verschiedenen Möglichkeiten zu unterscheiden. Das α-Lac (-13) A- Allel enthält eine weitere MnlI-Stelle bei Position -13, wodurch eine kleinere Bande auf dem Gel beobachtet werden kann.
Um den geeigneten Bereich an DNS zu amplifizieren, werden Oligonukleotide synthetisiert, die die interessierende Sequenz umschließen. Diese Oligonukleotide werden aufgrund ihrer spezifischen chemischen Charakteristika gewählt. Diese Oligonukleotide werden anschließend in einer Polymerasekettenreaktion verwendet, um den eingerahmten Teil des α-Lactalbumin-Gens zu amplifizieren. Die Oligonukleotide weisen die folgende Sequenz auf:
α-lac Seq. 1 (SEQ ID NO: 10)
5'ACGCTTGTAAAACGACGGCCAGTTGATTCTCAGTCTCTGTGGT 3'
α-lac Seq. 1 (SEQ ID NO: 11)
5'AGCATCAGGAAACAGCTATGACCTGGGTGGCATGGAATAGGAT 3'
Restriktionsfragmentanalyse (Sambrook, J. et al., 1989) wurde verwendet, um Tiere verschiedener Abstammung zu untersuchen. In den meisten Linien, nämlich Jersey, Guernsey, Brown Swiss, Simmental und Brahman, wird lediglich einer von zwei Genotypen gefunden. Dabei handelt es sich um den α-lac (-13) B Genotyp. In der populärsten und am meisten Milch produzierenden Zucht von Rindvieh, der Holstein-Zucht, treten jedoch beide Genotypen in dieser Position auf. Die Frequenz des A Genotyp betrug 27% in zufällig gewählten Proben, während die Frequenz des H Genotyp 73% betrug. Holsteiner enthalten die beiden Genotypen, die auch in anderen Zuchtlinien gefunden wurden, und ferner ein weiterer, verschiedener Genotyp, welcher offensichtlich in den letzten 30 Jahren in der U.S.-Holstein-Population entstanden ist, wie durch Untersuchung der Abstammung von derzeit verwendeten Vater tieren ermittelt wurde. Es hat den Anschein, daß unerkannterweise auf diesen Genotyp hin mittels traditioneller Tierauswahl selektiert wurde. Homozygote und heterozygote Tiere wurden innerhalb der Holstein-Population gefunden.
Der Genotyp (α-lac (-13)) wurde im Hinblick auf eine Korrelation mit der Milch- und Milchprotein-Erzeugung untersucht. Die drei weiteren Variationen werden analysiert, um die Frequenz dieser Unterschiede in der Rinderpopulation und ihre Korrelation zur Milch- und Milchprotein-Erzeugung zu bestimmen. Die mögliche Verknüpfung dieser Genotypen wird ferner unter Verwendung von DNS-Sequenzierung untersucht. Das Ziel dieser Technologie besteht darin, den optimalen regulatorischen Genotyp für α-Lactalbumin zu identifizieren und Tiere mit diesen besonderen Eigenschaften auszuwählen.

Nachweis und Auswahl der vier genetischen Varianten

Der Bereich der Sequenz, in dem die α-lac (-13) Variation auftritt, kann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) (Sambrook et al., 1989) bei Verwendung der folgenden, speziell entwickelten Primer, amplifiziert werden. Jeder Primer ermöglicht die Amplifikation eines spezifischen Teils des α-Lactalbumin-Gens. Kombinationen der genannten Primer können zwischen irgendeinem der unten genannten Primerorte verwendet werden:
Nach Amplifikation des spezifischen Bereichs wird die DNS entweder sequenziert oder mit Restriktionsenzymen verdaut, um die Sequenzunterschiede nachzuweisen. Im Fall der α-lac (-13) Variation kann der Sequenzunterschied unter Verwendung des Restriktionsenzyms MnlI erkannt werden (5'CTCC 3' Erkennungsstelle). Das PCR-DNS-Produkt wird mit MnlI verdaut und anschließend auf einem 4% NuSieve Agarosegel laufen gelassen, um den Polymorphismus zu erkennen.
Eine 650 Basenpaarsequenz, die alle vier der Variationen enthält wird mittels einer einzigartigen Sequenzierungstechnik untersucht. PCR wird zunächst zur Amplifikation eines 770 Basenpaarteils des 5'-flankierenden Bereichs des α-Lactalbumin verwendet. Eine weitere PCR-Reaktion wird anschließend durchgeführt unter Verwendung eines Teils der ursprünglichen Reaktion und der folgenden Primer (SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11, respektive):
α-lac seq. 1 5'ACGCTTGTAAAACGACGGCCAGTTGATTCTCAGTCTCTGTGGT 3'
α-lac seq. 2 5'AGCATCAGGAAACAGCTATGACCTGGGTCGCATGGAATAGGAT 3'
Die oben genannten Primer enthalten einen Teil des α-Lactalbumin-Gens, sowie beide M13 DNS-Sequenzierungsprimer. Die Primer wurden entworfen, um eine DNS-Sequenzierung des PCR-DNS-Produktes in beide Richtungen zu ermöglichen. Das letzte PCR-Produkt wird den Bereich des α-Lactalbumin enthalten, welcher die vier genetischen Varianten aufweist, die zwei M13-Sequenzierungs- Primer-Bereiche und 5 "Dummybasen" am Ende, um die M13-Primerbindung zu erleichtern.

Vergleich von hochkonservierten Teilen des 5'-flankierenden Bereichs des α-Lactalbumins verschiedener Arten

Es wird auf die DOTPLOTTM Darstellungen der Figs. 8 bis 10 verwiesen, welche die Sequenz des α-Lactalbumin vom Rind zu dem entsprechenden Bereichen des Menschen (Fig. 8), Meerschweinchen (Fig. 9), und der Ratte (Fig. 10) vergleichen. Der Bereich in Fig. 8 (Mensch) umfaßt 819 Basenpaare. Die Sequenzen sind hochkonserviert bis etwa 700 Basenpaare. Der Bereich in Fig. 9 (Meerschweinchen) umfaßt 1381 Basenpaare. Die Sequenzen sind bis etwa 700 Basenpaare hochkonserviert, divergieren jedoch anschließend. Der Bereich in Fig. 10 (Ratte) umfaßt 1337 Basenpaare. Die Sequenzen sind bis etwa 700 Basenpaare hochkonserviert, divergieren jedoch danach. Es ist davon auszugehen, daß Artenspezifische Unterschiede in Kontrollbereichen in den nichtkonservierten Bereichen der Sequenz auftreten.

Vergleich des 5'-flankierenden Bereichs des bovinen α-Lactalbumin mit anderen bovinen Milchprotein-Genen

Teile des 5'-flankierenden Bereichs anderer boviner Milchprotein-Gene (αs1 und αs2 Casein, β-Casein, K-Casein und β-Lactoglobulin), die im Vergleich zu dem 5'-flankierenden Bereich des α-Lactalbumin hochkonserviert sind, wurden identifiziert. Es ist wahrscheinlich, daß Sequenzunterschiede innerhalb dieser Bereiche auch die mRNS-Produktion sowie schließlich die Proteinproduktion beeinflußen. Zwei Beispiele dieser hoch-homologen Bereiche werden nachfolgend dargestellt.
Die bovine α-Lactalbumin-Sequenz von (-161) - (-115) (SEQ ID NO: 17) im Vergleich zur bovinen β-Casein-Sequenz (SEQ ID NO: 18), die dem identischen Bereich des Gens entspricht. Die prozentuale Ähnlichkeit beträgt 69% über 46 Basen.
Die bovine α-Lactalbumin-Sequenz (SEQ ID NO: 19) von (-1420) - (-1351) wird mit der bovinen β-Casein-Sequenz (SEQ ID NO: 20) verglichen, die dem identischen Bereich des Gens entspricht. Die prozentuale Ähnlichkeit beträgt 75% über 69 Basen.
Die hierin aufgenommenen Daten zeigen, daß das bovine α-Lactalbumin-Gen als Werkzeug für die Auswahl in der Milchvieh-Industrie nützlich sein wird, sowie einen wertvollen Kontroll-/Enhancer-Bereich und das entsprechende Gen zur Verwendung im Bereich von genetisch veränderten Säugetieren zur Verfügung stellt. Der Kontroll-Bereich, der kloniert wurde, enthält die notwendigen regulatorischen Elemente, um Gene in der Milch von genetisch veränderten Säugetieren zu exprimieren, sowie den "hochexprimierenden Genotyp", wie mittels der Milch- und Milchprotein-Erzeugung und Sequenzvariationsdaten gezeigt wurde. Diese Tatsachen bestätigen, daß es sich um ein sowohl für industrielle als auch Forschungs-Zwecke nützliches Gen handelt. Die Anwendung dieser Verfahren auf andere Milchproteine wird die Auswahl wertvoller Genotypen ermöglichen, die den β-Casein (αs&sub1;- und αs&sub2;-Casein und κ-Casein-Genen sowie den β-Lactoglobulingenen entsprechen.

Kodierender Bereich

Der kodierende Bereich des α-Lactalbumin-Proteins umfaßt eine 1,7 Kilobasensequenz.

3'-flankierende Bereich

Der 3'-flankierende Bereich ist ein 8,8 Kilobasen flankierender Bereich stromabwärts der DNS-Sequenz, die für das gewünschte rekombinante Protein kodiert. Dieser Bereich stabilisiert offenbart das RNS-Transkript des Expressionssystems und steigert somit die Ausbeute an gewünschtem Protein durch das Expressionssystem.

Vorgehensweise

Die oben beschriebenen Expressionssysteme können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele umfassen verschiedene Ligationsverfahren, bei denen konventionelle Linker verwendet werden, Restriktions-Schnittstellen, etc. Vorzugsweise sind die Expressionssysteme Teil eines größeren Plasmids.
Nach Isolation und Reinigung wird das Expressionssystem oder Konstrukt zu dem Genpool zugegeben, der genetisch verändert werden soll.
Verfahren zur genetischen Veränderung von Säugetieren sind im Stand der Technik bekannt. In diesem Zusammenhang wird auf Alberts, B. et al., 1989 und Lewin, B. 1990 als Handbuchbeschreibungen zur genetischen Veränderung und transgenen Änderung von Tieren verwiesen. In Kurzform umfaßt die genetische Veränderung die Konstruktion eines Expressionsvektors, indem ein cDNS-Klon oder eine genomische Struktur unmittelbar an eine DNS-Sequenz gebunden wird, die als starker Promotor für die DNS-Transkription agiert. Mittels genetischer Veränderung können Säugetierzellen, beispielsweise Milchdrüsengewebe induziert werden, so daß große Mengen nützlicher Proteine erzeugt werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "genetische Veränderung" wie in der obigen Liste von Definitionen definiert verwendet und umfaßt Veränderung einzelner Linien, d. h. genetische Änderungen lediglich während der Lebenszeit des betroffenen Tiers ohne Keimbahnbeeinflussung. Das Konstrukt kann in Säugetierdrüsen, wie beispielsweise die Milchdrüse- und Säugetierstammzellen genetisch eingebaut werden.
Genetische Veränderung umfaßt ferner transgene Veränderungen, d. h. die dauerhafte Insertion der Gensequenz in die genomische Struktur des betroffenen Tiers und jedes seiner Nachkommen. Transgene Veränderungen eines Säugetiers umfassen Mikroinjektion eines DNS-Konstrukts in Pronuclei einer befruchteten Säugetier- Eizelle, wodurch eine oder mehrere Kopien des Konstrukts in den Zellen des sich entwickelnden Säugetiers erhalten werden. In einem transgenen Tier sind die veränderten Gene dauerhaft in der Keimbahn des Tieres inseriert.
Das genetisch veränderte Säugetier ist anschließend durch ein Expressionssystem gekennzeichnet, das den Kontroll-Bereich des α-Lactalbumin umfaßt, welcher operativ über eine DNS-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, welches die Sekretion und Reifung des rekombinanten Proteins in Geweben der Milchdrüse bewirkt, mit einer exogenen DNS-Sequenz verknüpft ist, die für das rekombinante Protein kodiert. Um rekombinantes Protein zu erzeugen und in die Säugetiermilch zu sekretieren, muß es dem transgenen Säugetier ermöglicht werden, Milch zu produzieren, wonach die Milch gesammelt wird. Die Milch kann anschließend in Standard-Behandlungsverfahren verwendet werden. Das exogene, rekombinante Protein kann auch nach im Stand der Technik bekannten Verfahren aus der Milch isoliert werden.

Auswahlcharakteristikum

Die α-Lactalbumin Kontroll-/Enhancer-Sequenz der Fig. 1 ist ferner als Auswahlcharkteristikum zur Identifizierung von überlegenen oder Spitzenmilch-erzeugenden Säugetieren von Bedeutung. Derzeit kann man sich im Milchviehgeschäft lediglich auf Informationen aufgrund der Abstammung verlassen, welche jedoch häufig nicht verfügbar ist, um die Milch- und Milchprotein-Erzeugung in Säugetieren, insbesondere bei Rindern vorherzusagen. Die Analyse von physiologischen Markern als Mittel zur Bestimmung der Milch- und Milchprotein-Erzeugung hat einiges Interesse erregt. Die am meisten verbreiteten physiologischen Merkmale, die bei Milchvieh analysiert werden sind Hormone, Enzyme und verschiedene Blut- Metabolite. Bestandteile des Immunsystems wurden ferner ebenfalls untersucht. Als Merkmale, die als möglicher Marker für Milchertrag genannt wurden, wurden Thyroxin, Blut Harnstoff Stickstoff, Wachstumshormone, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren und Insulin, sowie Glucose und freie Fettsäuren genannt. Obwohl diese Verfahren einen gewissen Fortschritt bei der Voraussage der Milch- und Milchprotein-Erzeugung in Milchvieh ermöglicht haben, existiert derzeit kein weiteres verläßliches Mittel zur Vorhersage dieser Eigenschaften.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Auswahlcharakteristikum zur Identifizierung von überlegenen Milch- und Milchprotein-erzeugenden Säugetieren zur Verfügung, welches geerbtes genetisches Material umfaßt, das eine innerhalb der genetischen Struktur des Säugetiers auftretende DNS ist, wobei das genetische Material einen dominanten selektierbaren Marker für bovines α-Lactalbumin kodiert.
Die hierin offenbarte DNS-Sequenz dient als charakteristischer Marker für Milch-erzeugende Spitzensäugetiere.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die hierin offenbarte Erfindung, obwohl die Erfindung in keiner Weise als auf die Ausdrücke und den Umfang der Beispiele beschränkt zu verstehen ist.

BEISPIELE

Beispiel 1: α-lac (-13) Variationsstudie.

Zweiundvierzig Säugetiere wurden in mehrschichtiger, zufälliger Weise ausgewählt, um Säugetiere mit einem großen Bereich an Milch- und Milchprotein-Erzeugungseigenschaften innerhalb der UW-Herde zur Verfügung zu stellen.
Nach im Stand der Technik bekannten Verfahren wurde DNS aus zufälligen Proben von 42 Holstein-Milchviehkühen in der Universität von Wisconsin-Madison Herde isoliert. Jedes Säugetier wurde, wie oben dargestellt, unter Verwendung eines 4%igen NuSieve-Gels mit MnlI verdauten PCR-Produkten bezüglich der α- Lactalbumin (-13) Variation genotypisiert.
Die Genfrequenz in dieser Population für das α-lac (-13) A betrug 28% und für das α-lac (-13) B betrug 72%. Jeder der verschiedenen Genotypen werden auf dem in Fig. 12 gezeigten Gel dargestellt. Die Legende für das Gel der Fig. 12 ist wie folgt:
Bahn 1 Molekulargewichtsstandard
Bahn 2-3 heterozygot α-lac (-13) AB
Bahn 4 homozygot α-lac (-13) BB
Bahn 5 heterozygot α-lac (-13) AB
Bahn 6 homozygot α-lac (-13) BB
Bahn 7 homozygot α-lac (-13) AA
Bahn 8 heterozygot α-lac (-13) AB
Analyse der genetischen Eigenschaften der 42 Säugetiere wies darauf hin, daß möglicherweise ein wesentlicher Geneffekt durch das α-lac (-13) Allel erzeugt wird oder mit dem α-lac (-13) Allel verknüpft ist. Ein Scatter-Plot eines jeden Datenpunktes sowie der Durchschnittswerte für jeden der drei Genotypen wird in Fig. 13 gezeigt. Holstein-Kühe wurden miteinander bezüglich der vorhersagbaren Übertragungsfähigkeit für Milch verglichen.
Die Daten weisen darauf hin, daß der α-lac (-13) A Genotyp der bevorzugte Genotyp für Milch- und Milchprotein-Erzeugung ist. Die unten gezeigte Tabelle 1 weist die statistische Assoziation der Unterschiede zwischen Milch- und Milchprotein-Erzeugungsfähigkeit nach, die zwischen jedem der Genotypen für die unten genannten Merkmale beobachtet wurde. Analyse der Varianz und T- Tests (LSD) wurde mittels der Daten durchgeführt. Alle Merkmale der Produktionsausbeute waren positiv mit dem α-lac (-13) A Allel korreliert. Der Milchproteinprozentsatz korrelierte negativ mit dem α-lac (-13) A Allel. Tabelle 1

Beispiel 2: Erzeugung von transgenen Mäusen zur Analyse der Regulation in der α-Lactalbumin-Genexpression beim Rind:

Screenen einer genomischen Bank:

Das für das Milchprotein α-Lactalbumin vom Rind kodierende Gen wurde aus einer genomischen Bank vom Rind (Woychik, 1982) isoliert. Die genomische Bank wurde mittels dem folgenden Verfahren gescreent. Etwa 1,5 Millionen Lambda-Plaques wurden auf Nylonmembranen entsprechend den in Maniatis et al. (1989) beschriebenen Verfahren übertragen. Die α-Lactalbumin cDNS (Hurley, 1987) oder ein 770 Basenpaar PCR-Produkt wurde translatiert (BRL) mit einem-P32 markierten dCTP. Die Blots wurden über Nacht vorhybridisiert (65ºC) und anschließend für 16 Stunden bei 65ºC hybridisiert. Die Blots wurden bei 65ºC gewaschen (zweimal in 2X SSC, 1% SDS, einmal in 0,1X SSC, 0,1% SDS) und auf ein Kodak X-OMAT Film zur Autoradiographie plaziert. Ein 8,0 Kilobasenfragment, das das α-Lactalbumin-Gen enthielt, wurde wie in Fig. 4 dargestellt gereinigt. Das 8,0 Kilobasenfragment enthielt 2,1 Kilobasen eines 5'-flankierenden Bereichs, 1,7 Kilobasen kodierenden Bereichs und 2,6 Kilobasen eines 3'-flankierenden Bereichs.

Erzeugung der transgenen Mäuse:

Reife C57B6 · DBA2J F1 (B6D2) weibliche Tiere wurden superovuliert (PMSG und hCG) und mit ICR oder B6D2 männlichen Tieren gepaart, um befruchtete Eizellen für eine pronukleare Mikroinjektion zu erhalten. Die Eizellen wurden unter Verwendung eines Leitz Mikromanipulators und eines Nikon invertierten Mikroskops mikroinjiziert. 40 normal aussehende Zweizellembryonen wurden in jeden pseudoträchtigen Empfänger übertragen (University of Wisconsin-Madison Biotechnology Center Transgenic Mouse Facility, Dr. Jan Heideman).

Screening transgener Mäuse mittels PCR:

Schwanz DNS wurde mittels des von Constantini et al. (1986) beschriebenen Verfahrens extrahiert. Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden unter Verwendung von 10 ml 10x PCR-Reaktionspuffer (Promega Corp., Madison, WI), 200 mM je dNTP (Pharmacia Intl., Milwaukee, WI), 1,0 um je Primer (Primer stromaufwärts 25mer - 712 bis -687 (5' CAATGTGGTATCTGGCTATTTAGTG 3') (SEQ ID NO: 14), Primer stromabwärts 20mer +39 bis +59 (5' AGCCTGGGTGGCATGGAATA 3') (SEQ ID NO: 15), 1 Einheit Taq DNS-Polymerase (Promega Corp., Madison, WI) und 1 mg genomischer DNS. Das Volumen wurde auf 100 ml mit zweifach destilliertem, sterilem Wasser eingestellt und die Reaktion wurde mit schwerem Mineralöl überzogen. Die Proben wurden 30 Zyklen unterworfen (94ºC, 2 min., 50ºC, 1,5 min., 72ºC, 1,5 min.). Die Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mittels Ethidiumbromid gefärbt.

Melken der Mäuse:

Die Mäuse wurden für vier Stunden von ihren Nachkommen getrennt und anschließend anästhesiert (0,01 ml/g Körpergewicht I. P. Injektion einer 36%igen Propylenglykol, 10,5% Ethylalkohol (95%), 41,5% sterilem Wasser und 12% Natriumpentabarbitol (50 mg/ml)). Nach Anästhesie wurde den Mäusen I. M. 0,3 I. U. Oxytocin injiziert und sie wurden mittels einer kleinen Vakuummilchmaschine gemolken. Drei der einundfünfzig lebenden Nachkommen wurden als transgene Tiere mittels Polymerasekettenreaktion identifiziert. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 14 als Darstellung verwiesen, in der die gemessenen Expressionsmengen in jedem der drei α-Lactalbumin transgenen Mauslinien dargestellt wird.

ELISA:

Tiere der zweiten Generation einer Linie wurden gemolken und die Analyse wurde mittels eines ELISA ("Enzyme Linked Immunosorbent Assay") für α-Lactalbumin vom Rind gemäß dem nachfolgenden Verfahren durchgeführt:
1. Jede Vertiefung einer Nunc-Immuno Plate IF MaxiSorp. wurde mit 100 ml 1/40k bovinem α-Lactalbumin-Antiserum beschichtet (in 0,05M Carbonatpuffer, pH 9,6).
2. Es wurde 4x mit einem Waschpuffer gewaschen (0,025% Tween 20 in PBS, pH 7,2).
3. 50 ml Nachweispuffer (0,04M MOPS, 0,12M NaCl, 0,01M EDTA, 0,1% Gelatine, 0,05% Tween 20, 0,005% Chlorhexidindigluconat, Leupeptin 50 mg/ml, pH 7,4) wurde zugegeben.
4. 50 ml der Standards und der Proben (in Nachweispuffer) wurden zugegeben, wobei drei Meßreihen je Probe durchgeführt wurden.
5. 50 ml 1/100k verdünntes α-Lactalbumin-Biotin-Konjugat wurde zugegeben.
6. Über Nacht wurde bei 4ºC inkubiert.
7. Es wurde 4x mit Waschpuffer gewaschen.
8. 100 ml 1/10k Nachweispuffer, verdünnte ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma), wurde zugegeben. Es wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
9. Es wurde 4x zweimal mit Waschpuffer gewaschen.
10. 125 ml frischer Substratpuffer (200 ml Tetramethylbenzidin, 20 mg/ml) DMSO, 64 ml, 0,5M Wasserstoffperoxid, 19,74 ml Natriumacetat, pH 4,8) wurden zugegeben.
11. Es wurde für 12 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
12. 50 ml 0,5M Schwefelsäure wurden zugegeben, um die Substratreaktion zu beenden.
13. Die Absorption bei 450 nm minus 600 nm wurde in einem EIA- Autoreader abgelesen.
Bovines α-Lactalbumin war in einer Konzentration von bis zu und mehr als 1,0 mg/ml Mäusemilch vorhanden. Die Expression wurde mittels Western Blotting in den nachfolgenden Schritten bestimmt. Das 14%ige PAGE-Gel wurde auf eine Immobilon-P Membran (Millipore) übertragen, die in 0,02M Natriumphosphat, 0,12M NaCl, 0,01% Gelatine, 0,05% Tween 20; pH = 7,2 blockiert war und mit anti-bovinem α-Lactalbumin (1/2000 Verdünnung) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gel wurde zweimal (2 min.) mit einem ELISA Waschpuffer gewaschen und mit Ziege-anti-Kaninchen- IgG-HRP für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wonach dreimal mit Waschpuffer und einmal mit zweifach destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das Gel wurde in eine Substratlösung (25 mg 3,3'-Diaminobenzidin, 1 ml 1% CoCl&sub2; in H&sub2;O, 49 ml PBS pH 7,4 und 0,05 ml 30% H&sub2;O&sub2;) gelegt und auf Farbentwicklung hin überwacht. Die Membran wurde luftgetrocknet.
Es ist klar, daß die Erfindung nicht auf die bestimmte Konstruktion und Zusammenstellung, die hierin illustriert und beschrie ben wurde, beschränkt ist, sondern auch solche modifizierten Formen umfaßt, die unter den Umfang der Ansprüche fallen, welche den Literaturhinweisen folgen.

Literaturhinweise

Akers, R. M. et al., 1981, "Prolactin regulation of milk secretion and biochemical differentiation of mammary epithelial cells in periparturient cows." Endocrinology, 109 : 23.
Alberts, B. et al., 1989, Molecular Biology of The Cell (Second Edition), Garland Publishing, Inc., New York, pp. 265-271.
Bonsing, J. et al., 1988, "Complete nucleotide sequence of the bovine beta-casein gene," Aust. J. Biol. Sci., 41 : 527-537.
Brew, K. and R. L. Hill, 1975, "Lactose biosynthesis." Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 72 : 105.
Eigel, W. N. et al., 1984, "Nomenclature of proteins of cows milk: fifth revision." J. Dairy Sci., 67 : 1599.
Goodman, G. T. et al., 1983, "Hormonal regulation of alpha-lactalbumin secretion from bovine mammary tissue cultured in vitro." Endocrinology, 112 : 1324:
Hall, L., et al., 1987, "Organization and sequence of the human α-lactalbumin and the origins of lactation," Biochem. J., 242 : 735-742.
Hurley, W. L. und L. A. Schuler, 1987, "Molecular cloning and nucleotide sequence of a bovine α- lactalbumin cDNA," Gene, 61 : 119-122.
Larson, B. L., 1985, "Biosynthesis and cellular secretion of milk." In: Lactation, pp. 129-163, edited by B. L. Larson, The Iowa State University Press, Ames.
Lewin, B., 1990, GENES IV, Oxford University Press, New York, pp. 691-702.
McFadden, T. B. et al., 1987, "Alpha- lactalbumin in bovine serum: relationships with udder development and function." J. Dairy Sci., 70 : 259.
Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Second Edidon), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Vilotte, J. et al., 1987, "Complete nucleotide sequence of bovine α-lactalbumin gene: comparison with its rat counterpart. Biochimie, 69 : 609- 620.
Woychik, R., et al., Nucl. Acids Res., 10 : 7197-7210 (1982).

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: BLECK, Gregory T.
BREMEL, Robert D.
(ii) ANMELDETITEL: DNA-Sequenz, die für Rinder-G(A)-Lactalbumin Kodiert und Nutzungsmethoden
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
(iv) KORRESPONDENZADRESSE
(A) NAME: ANDRUS, SCEALES, STARKE & SAWALL
(B) STRASSE: 100 E. WISCONSIN AVE., SUITE 1100
(C) ORT: MILWAUKEE
(D) STAAT: WI
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 53202-4178
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #11.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDE NR:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) INFORMATIONEN ZUM ANWALT:
(A) NAME: Sara, Charles S
(B) REGISTERNUMMER: 30,492
(C) ANWALTSAKTENZEICHEN: F. 3262-1
(ix) KOMMUNIKATIONSDATEN:
(A) TELEFONNR: (608) 255-2022
(B) TELEFAXNR: (608) 255-2182
(C) TELEX: 26832 ANDSTARK

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ATGACCATGA TTACGAATTC ATCGTA 26

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 88 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GAACAGTTAT CTAGATCTCG AGCTCGCGAA AGCTTGCATG CCTGCAGGTC GACTCTAGAG 60
GATCCCCGGG TACCGAGCTC GAATTCAC 88

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2044 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Ererbter Kontroll-Bereich des α-Lactalbumin
(B) LAGE: 1966
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Mögliches Steriod Kontroll-Element
(B) LAGE: 1433..1446
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: RNS-Polymerase-Bindungsstelle
(B) LAGE: 1961..1978
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
CATATTCTAT TCTA 14

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CATATTCTAT TCCTA 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
CATATTCTAT TTCTA 15

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
TCTTGAGGGG TAACCAAA 18

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
TCTTGGGGGT AGCCAAA 17

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
TCTTGGGGGG TCACCAAA 18

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
ACGCTTGTAA AACGACGGCC AGTTGATTCT CAGTCTCTGT GGT 43

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 43 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
AGCATCAGGA AACAGCTATG ACCTGGGTGG CATGGAATAG GAT 43

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
CTCTTCCTGG ATGTAAGGCT T 21

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
TCCTGGGTGG TCATTGAAAG GACT 24

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
CAATGTGGTA TCTGGCTATT TAGTG 25

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
AGCCTGGGTG GCATGGAATA 20

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
GAAACGCGGT ACAGACCCCT 20

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
AGGAAGCTCA ATGTTTCTTT GTTGGTTTTA CTGGCCTCTC TTGTCA 46

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
AGGAGGCTAT TCTTTCCTTT TAGTCTATAC TGTCTTCGCT CTTCA 45

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) ART:. Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
TATAAGAAAT CAGGCTTTAG AGACTGATGT AGAGAGAATG AGCCCTGGCA TACCAGAAGC 60
TAACAGCTA 69

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
TCTCAGAAAT CACACTTTTT TGCCTGTGGC CTTGGCAACC AAAAGCTAAC ACATA 55

Claims

1. Isolierte DNS-Sequenz, die die Milchdrüsen-spezifische Expression einer mRNS in Milchdrüsenzellen eines laktierenden Tieres antreibt, welche einen α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereich vom Rind umfaßt, der ein Adenin an der Position -13 ausgehend vom Beginn des für das Signalpeptid kodierenden Bereiches aufweist.

2. DNS-Sequenz nach Anspruch 1, die SEQ ID NO: 19 im Bereich der 5'-flankierenden Regulationssequenz des α-Lactalbumins vom Rind an den Nukleotidpositionen 433 bis 501 umfaßt, wie in SEQ. ID. NO: 3 gezeigt.

3. DNS-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 umfassend SEQ ID NO: 3.

4. Expressionsvektor, der eine DNS-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

5. Expressionssystem, das ein Konstrukt umfaßt, welches einen Milchdrüsen-spezifischen α-Lactalbumin-Kontrollbereich umfassend SEQ ID NO: 19 aufweist, das operativ mit einer DNS- Sequenz verbunden ist, die ein Signalpeptid kodiert, wobei, wenn das Expressionssystem genetisch in ein nicht humanes Säugetier eingeführt wird, dieses weiblichen Tieren dieses Säugetiers ermöglicht, ein gewünschtes rekombinantes Peptid in deren Milch zu erzeugen.

6. Expressionssystem nach Anspruch 5, bei dem das Konstrukt einen 5'-α-Lactalbumin flankierenden Bereich umfaßt, welcher an eine β-Casein DNS-Sequenz vom Rind angehängt ist.

7. Expressionssystem nach Anspruch 6, bei dem das Konstrukt die Polyadenylierungs-Stellen des β-Casein 5'-flankierenden Bereichs enthält.

8. Expressionssystem nach Anspruch 6 oder 7, bei dem das Konstrukt den proximalen Promoter eines ersten Milchproteins und den distalen Kontrollbereich eines zweiten Milchproteins einschließt.

9. Expressionssystem nach Anspruch 8, bei dem das erste und zweite Milchprotein aus der Gruppe bestehend aus α-Lactalbumin, β-Lactglobulin, β-Casein, as&sub1;-Casein, as&sub2;-Casein und K-Casein ausgewählt werden.

10. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 5 bis 9, bei dem das Konstrukt den proximalen Promoter von β-Casein und den distalen Kontrollbereich von α-Lactalbumin umfaßt.

11. Verfahren zur Herstellung eines exogenen rekombinanten Proteins und zur Sekretion desselben in nicht-humane Säugetiermilch, bei dem man

a) Milch in einem genetisch veränderten nicht-menschlichen Säugetier herstellt, das ein Expressionssystem enthält, das einen Milchdrüsen-spezifischen α-Lactalbumin Kontrollbereich umfassend SEQ ID NO: 19 umfaßt, der operativ mit einer DNS-Sequenz verbunden ist, die für ein Signalpeptid kodiert, das bei der Sekretion und Reifung des exogenen rekombinanten Proteins im Milchdrüsengewebe wirksam ist;

b) die Milch sammelt; und

c) das exogene rekombinante Protein aus der Milch isoliert.

12. Auswahlcharakteristikum zum Identifizieren von Säugetieren, die im Vergleich zu Säugetieren, denen das Auswahlcharakteristikum fehlt, eine erhöhte Milchproduktion aufweisen, welches eine DNS-Sequenz umfaßt, die Rinder α- Lactalbumin kodiert, und welches im Kontrollbereich des Rinder-α-Lactalbumin die DNS-Sequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 3 ist.

13. Auswahlcharakteristikum zum Identifizieren von Säugetieren, die im Vergleich zu Säugetieren, denen das Auswahlcharakteristikum fehlt, eine erhöhte Milchproduktion aufweisen, welches geerbtes genetisches Material umfaßt, das ein α-Lactalbumin 5'-flankierende Kontrollbereich ist, der ein Adenin an der Position -13 ausgehend vom Beginn des für das Signalpeptid kodierenden Bereiches aufweist.

14. Auswahlcharakteristikum nach Anspruch 12 oder 13, das SEQ ID NO: 19 angeordnet in dem α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereich vom Rind umfaßt.

15. Auswahlcharakteristikum nach Anspruch 12 oder 13, das SEQ ID NO: 20 in dem α-Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereich vom Rind umfaßt.

16. Auswahlcharakteristikum nach Anspruch 13, bei dem das Auswahlcharakteristikum SEQ ID NO: 3 umfaßt.

17. Verfahren zur Voraussage von erhöhter Milch- und Milchproteinproduktion in Säugetieren, bei dem man Säugetiere identifiziert, die Adenin an der Position -13 ihres α- Lactalbumin 5'-flankierenden Kontrollbereichs aufweisen, wobei diejenigen Säugetiere, die ein Adenin an der Position -13 aufweisen, im Vergleich zu Säugetieren, die kein Adenin an der Postion -13 aufweisen, eine erhöhte Milch- und Milchproteinproduktion zeigen.