DE69623122T2

DE69623122T2 - Methode zur expression in und isolation von biologisch aktiven molekülen aus urin

Info

Publication number: DE69623122T2
Application number: DE69623122T
Authority: DE
Inventors: Tung-Tien Sun
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2016-06-01
Also published as: US5824543A; CA2221453A1; US6001646A; WO1996039494A1; EP0837931A4; EP0837931B1; ATE222601T1; AU5961596A; EP0837931A1; DE69623122D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Urothel, auch bekannt als Übergangsepithel, ist ein mehrschichtiges Epithel, das fast die ganze Oberfläche des Urogenitaltrakts, einschließlich des Nierenbeckens, des Harnleiters, der gesamten Blase und eines Teils der Harnröhre, bedeckt. Die Apikaloberfläche des Urothels, die im direkten Kontakt mit dem Urin steht, ist mit einer Vielzahl an fest aussehenden Plaques bedeckt. Diese Plaques bedecken einen großen Teil der Apikaloberfläche des Säugetierurothels. Hicks, R. M. J. Cell Biol. 1965, 26, 25-48; Koss, L. G. Lab. Invest. 1969, 21, 154-168; Staehelin, L. A. J. Cell Biol. 1972, 53, 73-91. Es wird davon ausgegangen, daß sie eine wichtige Rolle als Permeabilitätsbarriere (Hicks, R. M. Biol. Rev. 1975, 50, 215-246) und/oder als physikalischer Stabilisator der Urothelzellenoberfläche spielen (Staehelin, L. A. J. Cell Biol. 1972, 53, 73-91). Beim Betrachten im Querschnitt ist das äußere Plättchen des Plaques fast zweimal so dick wie das Innere, weshalb der Begriff "asymmetrische Einheitsmembran" oder "AUM (asymmetrical unit membrane)" verwendet wurde, um diese Plaques zu beschreiben.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß AUM 4 wichtige integrale Membranproteine enthält, welche Uroplakin Ia (UPIa; 28 kDa), Uroplakin Ib (UPIb; ~ 27 kDa), Uroplakin II (UPII; 15 kDa) und Uroplakin III (UPIII; 47 kDa) genannt werden. EM- Immunlokalisationsuntersuchungen zeigten, daß diese Uroplakine in situ AUM- gebunden sind, wodurch gezeigt wurde, daß sie Hauptproteinuntereinheiten der Urothelplaques sind. Yu et al. J. Cell Biol. 1990, 111, 1207-1216; Wu et al. J. Biol. Chem. 1990, 265, 19170-19179. Die immunhistochemische Begutachtung verschiedener Rindergewebe zeigte, daß diese UPs urothelspezifisch sind und in den oberen Zellschichten des Urothels vorliegen, die den Urogenitaltrakt, einschließlich des Nierenbeckens, des Harnleiters, der Blase und Teilen der Harnröhre, bedecken. Diese Daten zeigten, daß Uroplakine hervorragende Marker für ein fortgeschrittenes Stadium der Urotheldifferenzierung sind. Yu et al. J. Cell Biol. 1990, 111, 1207-1216; Wu et al. J. Biol. Chem. 1990, 265, 19170-19179. Weiterhin scheinen die Uroplakine Ia, Ib, II und III die hauptsächlichen Proteinkomponenten aller Urothelplaques von Säugetieren zu sein. Sie wurden in acht anderen Säugetierspezies (Mensch, Affe, Schaf, Schwein, Hund, Kaninchen, Ratte und Maus) gefunden, und die AUMs dieser Spezies scheinen morphologisch ähnlich zu sein, wobei sie kristalline Bereiche von Proteinpartikeln von 12 nm enthalten, mit einem Mitte-Mitte-Abstand von 16,5 nm. Wu et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 13716-13724.
Die primären Strukturen der UPs wurden kürzlich durch cDNA-Klonen aufgeklärt. Die Ergebnisse zeigten die Existenz von zwei nahe verwandten UPI-Isoformen, dem 27-kDa-UPIa und dem 28-kDa-UPIb. Yu, J. J. Cell Biol. 1994, 125, 171-182. Es wurde kürzlich gezeigt, daß die mRNAs aller vier bekannten UPs urothelspezifisch sind, was zeigt, daß die Expression der UP-Gene durch Transkription reguliert wird. Yu, J. J. Cell Biol. 1994, 125, 171-182; Lin et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 1775- 1784; Wu, X.-R. und Sun, T.-T. J. Cell Sci. 1993, 106, 31-43; Lin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 679-683.
Die Expression des UPII-Gens der Maus ist, wie dessen Gegenstück beim Rind, urothelspezifisch und spezifisch für die Differenzierung in einer späteren Stufe. Unter Verwendung von transgenen Techniken bei der Maus wurde jetzt eine 3,6- kb-5'-Seitenregion als Promotor identifiziert, die cis-Elemente umfaßt, um die Expression eines heterologen Reportergens in gleicher Weise wie beim endogenen UPII-Gen spezifisch und wirksam auf die Suprabasalzellschichten des Urothels zu leiten. Unter Verwendung dieses Promotors wurde jetzt festgestellt, daß Fremdproteine zu den oberen Zelischichten des Blasenurothels zu Expression und Ausscheidung in den Urin geleitet werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Expression biologisch aktiver Moleküle in der Blasenhöhle von nicht-menschlichen transgenen Tieren zur nachfolgenden Ausscheidung und Gewinnung aus dem Urin zur Verfügung zu stellen, wobei die Expression des Gens, das das biologisch aktive Molekül kodiert, das Ziel einer Klasse von urothelspezifischen Promotoren ist und davon gesteuert wird, die beispielsweise Uroplakin-verwandte Gene steuern, damit sie in den oberen Zellschichten des Urothel exprimieren. Die Sequenz der Promotorregion von 3,6 kb in Flußaufwärtsrichtung eines Uroplakin-II-Gens der Maus wird zur Verfügung gestellt.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von nicht-menschlichen, transgenen Tieren zur Verfügung zu stellen, die Urothelpromotor-gesteuerte heterologe Gene enthalten, welche biologisch aktive Moleküle kodieren.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven Moleküls zur Verfügung zu stellen, welches die Gewinnung eines nicht-menschlichen, transgenen Tiers, das ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül in Blasenepithelzellen exprimiert, die durch urothelspezifische Promotoren gesteuert werden, und die Gewinnung des biologisch aktiven Moleküls aus dem Urin, der vom transgenen Tier produziert wird, umfaßt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein nicht- menschliches, transgenes Tier zur Verfügung gestellt, das eine urothelspezifische Promotorsequenz und ein Gen, das ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül kodiert, umfaßt, gekennzeichnet durch die Expression des biologisch aktiven Moleküls im Urin des Tieres.
Vorzugsweise ist das Tier eine Mäuse- oder Rinderspezies.
Üblicherweise ist die urothelspezifische Promotorsequenz eine Uroplakin II- Promotorsequenz.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das biologisch aktive Molekül ausgewählt aus mindestens einer der folgenden Verbindungen:
Adipokinin, Aldosteron, Adrenocorticotropin, Blutgerinnungsfaktoren, Choriongonadotropin, Corticoliberin, Corticotropin, Transmembranleitungsregulatoren bei zystischer Fibrose, Erythropoietin, Folliberin, Follitropin, Glucagongonadoliberin, Gonadotropin, hypophysiotropes Hormon, Insulin, Lipotropin, luteinisierendes Hormon- Releasing-Hormon, Luteotropin, Melanotropin, Parathormon, Parotin, Prolactin, Prolactoliberin, Prolactorstatin, Somatoliberin, Somatotropin, Thyrotropin, gewebespezifischer Plasminogenaktivator und Vasopressin.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven Moleküls zur Verfügung gestellt, welches umfaßt:
Zusammenführen von Blasenepithelzellen in einem Tier mit einem Vektor, der eine urothelspezifische Promotorsequenz und ein Gen, das ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül kodiert, umfaßt, so daß das Gen, welches das ausgewählte biologisch aktive Molekül kodiert, exprimiert wird; und
Gewinnung des biologisch aktiven Moleküls aus dem vom Tier produzierten Urin.
Vorzugsweise ist die urothelspezifische Promotorsequenz eine Uroplakin II- Promotorsequenz.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven Moleküls zur Verfügung gestellt, welches umfaßt:
Züchtung eines nicht-menschlichen, transgenen Tiers, welches in den Blasenepithelzellen ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül exprimiert; und
Gewinnung des biologisch aktiven Moleküls aus dem vom nicht-menschlichen, transgenen Tier produzierten Urin.
Üblicherweise umfaßt das aktive Molekül, das aus dem Urin gewonnen wird, mindestens eines aus Adipokinin, Aldosteron, Adrenocorticotropin, Blutgerinnungsfaktoren, Choriongonadotropin, Corticoliberin, Corticotropin, Transmembranleitungsregulatoren bei zystischer Fibrose, Erythropoietin, Folliberin, Follitropin, Glucagon- Gonadoliberin, Gonadotropin, hypophysiotropem Hormon, Insulin, Lipotropin, luteinisierendem Hormon-Releasing-Hormon, Luteotropin, Melanotropin, Parathormon, Parotin, Prolactin, Prolactoliberin, Prolactorstatin, Somatoliberin, Somatotropin, Thyrotropin, gewebespezifischem Plasminogenaktivator und Vasopressin.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die Organisation und Nukleotidsequenz der Uroplakin II (UPII)- Genom-DNA der Maus. Fig. 1a stellt die Exon/Intron-Organisation des UPII-Gens der Maus zur Verfügung. Die offenen und gefüllten dicken Kästchen zeigen die fünf kodierenden Sequenzen (Exons) bzw. die nicht kodierenden Sequenzen (Introns) des Gens. Die offenen und gefüllten dünnen Kästchen zeigen eine (CA)n- Dinukleotid-Wiederholungsregion bzw. eine Alu-ähnliche B1-Wiederholung bei der Maus. G1 und G2 kennzeichnen zwei unabhängige und partiell überlappende Genomklone. Die Restriktionsstellen sind SacI (S), NcoI (N), BamHI (B), SalI (Sal), und XhoI (X). Fig. 1b stellt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO (Sequenzidentifikations- Nr.): 1) eines 4-kb-SacI-Fragments des UPII-Gens der Maus zur Verfügung. Eine reverse B1-repetitive Sequenz (in der 5'-Region flußaufwärts) und eine potentielle Polyadenylierungsstelle (AATAAA; in der 3'-Region ohne Translation) sind einfach bzw. doppelt unterstrichen. Der gewellte Pfeil zeigt die Transkriptionsstarterstelle. Gebogene Pfeile, die mit 1 bis 4 markiert sind, zeigen die Intron/Exon- Verbindungsstellen der vier Introns. Der vorherbestimmte erste Aminosäurerest der gereiften UPII-Proteinsequenz ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die vorhergehende Domäne enthält eine Prä- und eine Prosequenz aus 25 bzw. 59 Aminosäuren.
Fig. 2 zeigt die Gewebeverteilung der UPII-mRNA, die mittels RT-PCR untersucht wurde. Poly(A) + mRNAs (0,3 - 0,4 mg) aus der Blase der Maus (Reihen 1 und 13), Haut (2), Vormagen (3), glandulärem Magen (4), Niere (ohne Nierenbecken) (5), Leber (6), Milz (7), Hoden (8) und Thalamus/Hypothalamus (9), Großhirnrinde (10) und Kleinhirn (11)-Regionen des Gehirns wurden revers transkribiert und entweder mit UPII-spezifischen Primern (oberhalb; 266 bp) oder mit Glyerinaldehyd- 3-phosphatdehydrogenase (GDH)-spezifischen Krimern (unterhalb, als interne Kontrolle zum Vergleich; 130 bp) verstärkt. Die PCR-Produkte wurden dann auf 1,3%- igem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Reihe 12 ist eine negative Kontrolle (kein cDNA-Templat). Das 266-bp-UPII-Produkt wurde im Überfluß in der Blase nachgewiesen, aber nicht in irgendeinem anderen getesteten Gewebe, einschließlich dem Hypothalamus.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion und die quantitative Bestimmung eines repräsentativen Transgens. Fig. 3a zeigt eine Restriktionskartierung (Abkürzungen wie in Fig. 1 beschrieben) des endogenen UPII-Gens der Maus. Ein 500-bp-PCR- Fragment (dicker Balken) wurde als Probe verwendet, die ein 1,4-kb-NcoI-Fragment des endogenen UPII-Genoms, aber ein kürzeres 1,1-kb-NcoI-Fragment des Transgens bestimmt. Fig. 3b zeigt eine Restriktionskartierung des Transgens. Eine 3,6- kb-5'-Seitensequenz des UPII-Gens wurde in einen Escherichia coli placF-Vektor eingeführt, der β-Galactosidase (β-gal) kodiert. In diesem bestimmten Testexpressionsvektor wurde eine Sequenz, die einen Teil von Exon 1 und alle Introns 1 und Exons 2 des Protamin-1-Gens (mp1) der Maus enthält, an das 3'-Ende des β-gal (oder lacZ)-Gens eingeführt, um eine Exon/Intron-Spleißstelle und ein Polyadenylierungssignal zur Verfügung zu stellen. Dieses Rekombinationsgen wurde aus dem Vektor herausgeschnitten, gelgereinigt und in Eier der Maus mikroinjiziert.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zwei Hauptprobleme bei der Gewinnung von biologisch aktiven Molekülen, wie beispielsweise Proteinprodukten, aus klonierten Genen im kommerziell durchführbaren Maßstab sind: (1) daß die bakteriellen Expressionssysteme häufig nicht in der Lage sind, Proteine richtig zu modifizieren, d. h. durch Glycosylierung etc. und (2) die nachfolgende Isolierung der Genprodukte aus den Expressionssystemen. In Bakterien-, Hefe- und Baculovirensystemen werden die exprimierten Proteine meistens von unlöslichen, intrazellulären Kompartimenten gereinigt. Ausgeschiedene Proteine in Hefe benötigen spezialisierte proteasearme Stämme, die mit geeigneten Vektoren mit Sekretionssignalen gekoppelt werden. Kürzlich war die Verwendung von brustdrüsenspezifischen Promotoren erfolgreich, um die Expression von fremden Proteinen in diesen Sekretdrüsen zu steuern, was letzlich zu ihrer Ausscheidung in die erhaltene Milch führte. Dieses Verfahren wurde kommerziell genutzt, um menschliches Wachstumshormon in Kühen und Schafen zu exprimieren. WO 94/05782. Die reichlichen Volumina an Milch, die von Kühen und Schafen produziert werden, machen dieses Verfahren attraktiv. Dieses Verfahren leidet jedoch an einigen potentiellen Nachteilen: einer davon ist, daß das exprimierte Protein sogar bei relativ hohen Leveln von einer großen Menge an Milchproteinen, wie beispielsweise Kaseinen, Immunoglobinen und Lactoferrinen abgetrennt werden muß, welche das gewünschte wertvolle Produkt einschließen; ein anderer Nachteil ist, daß bestimmte Proteinprodukte in der calciumreichen Umgebung der Milchflüssigkeit unlöslich sind; und ein anderer ist der, daß dieses Verfahren die Verwendung von trächtigen Tieren erfordert, die teuer sind und zeitaufwändig gezüchtet werden müssen.
In der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zum Exprimieren von biologisch aktiven Molekülen in der Blasenhöhle von transgenen Säugetieren entwickelt. Urin in der Blase hat eine relativ hohe Osmolalität (50 bis 1000 mosmol/kg) mit niedrigen pH-Werten von 4,5, und enthält hohe Konzentrationen an Harnstoff und Ammonium. Die Blasenhöhle kann somit eine vorteilhafte Umgebung für die Herstellung von Proteinen zur Verfügung stellen, die normalerweise aufgrund ihrer Unlöslichkeit nur schwer zu exprimieren sind. Der Harnstoff und die hohe Osmolalität können als in situ-Denaturierungsmittel und chaotrope Mittel dienen. Der Urin enthält jedoch relativ wenig Proteine im Vergleich zur Milch, da die Nieren so angelegt sind, daß sie einen Proteinverlust verhindern, so daß die Urothelpromotor-gesteuerte Expression von Proteinen, die die Nieren umgeht, das gewünschte Protein in einer Lösung mit relativ wenig kontaminierenden wirtsendogenen Proteinen produziert.
Die Promotorregion des Uroplakin II-Gens wurde nun aufgeklärt. Unter Verwendung einer Rinder-UPII-cDNA als Probe wurde ein 16-kb-Genomklon (G1) der Maus isoliert, welches eine ~ 2,5-kb-transkribierte Region enthält, die durch ~ 3,5-kb bzw. ~ 10 kb von 5'- bzw. 3'-Sequenzen flankiert ist (siehe Fig. 1a). Abgleichen der kodierenden Sequenz mit den UPII-cDNA-Sequenzen von Rindern (Lin et al. J Biol. Chem. 1994, 269, 1775-1784), welche hochgradig homolog sind, definierte die Exon/Intron-Verbindungsstellen von vier Introns (Fig. 1b). 5'-RACE-Experimente (Frohman et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1988, 85, 8998-9002) unter Verwendung von mRNA der Blasenschleimhaut der Maus als Templat zeigten, daß die Transkriptionsstelle des UPII-Gens an der flußaufwärtsgerichteten 60-bp-5'-Stelle des Translationsstarterkodons und der flußabwärtsgerichteten 27-bp-Stelle einer vermuteten TATA-Box lokalisiert ist. Die flußaufwärtsgerichtete 5'-Region enthält eine Aluähnliche B1-Wiederholungssequenz (-830 bp) und einen (CA)n - Abschnitt (~ -2,1 kb). Schließlich befindet sich ein Polyadenylierungssignal bei ~ 230 bp flußabwärts des Translationsstoppkodons (siehe Fig. 1b).
Das UPII-Gen der Maus ist urothelspezifisch wie das UPII-Gen des Rindes. Die mRNAs wurden aus verschiedenen Mäusegeweben präpariert und durch einen reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)-Assay auf das Vorliegen von UPII-Sequenzen untersucht. Eine große Menge an UPII-Produkt der erwarteten Größe (266-bp) wurde von der Blase erzeugt, aber nicht von der Haut, dem Vormagen, dem glandulären Magen, Niere, Leber, Milz, Hoden oder dem Hypothalamus/Thalamus-Cortex und dem Kleinhirn des Gehirns (siehe Fig. 2).
Ein Kaninchen-Antiserum, das vorher gegen ein synthetisches Peptid präpariert wurde, das der N-endständigen Aminosäuresequenz ELVSWDSGSG (1-11) (Sequenzidentifizierungsnummer: 2) von UPII ausgewachsener Rinder (Lin et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 1775-1784) entspricht, färbt immunhistochemisch das 15- kDa-UPII des Rinds und lokalisiert es an den Oberflächenzellschichten von Rinderurothel. Dieses Antiserum ergab eine gute Kreuzreaktion mit dem UPII der Maus, welches ein identisches Epitop enthält, aber wandert etwas langsam bei einer scheinbaren Masse von 17 kDa. Immunfluoreszierende Färbung von gefrorenen Abschnitten der Mäuseblasen zeigte, daß das UPII mit allen suprabasalen Zellschichten verbunden ist, was zur Annahme führt, daß der Beginn der UPII-Genexpression in der Maus früher war als der im Rind.
Um die cis-Promotorelemente für urothelspezifische Expression zu definieren, und um zu zeigen, daß heterologe Gene von suprabasalen Urothelzellen als endogenes UPII aufgenommen werden können, wurde eine transgene Maus gezüchtet, die ein Rekombinationsgen enthielt, in dem ein lacZ-Reportergen von einer 3,6-kb- 5'-Seitensequenz des UPII-Gens der Maus (Fig. 3b) reguliert wurde. Die DNA- Konstruktion wurde zur Erzeugung einer transgenen Maus in befruchtete Eier der Maus injiziert. Southern-Blot-Analysen der endständigen DNAs zeigten, daß das Transgen in die Genome von 4 der 25 Mäuse eingebaut wurde. Drei dieser Tiere übertrugen das Reportergen auf ihre Nachkömmlinge. Southern-Blot-Analysen zeigten, daß die genomischen DNAs dieser drei transgenen Linien TG1, TG2 und TG3 ungefähr 40, 6 bzw. 30 Kopien des Reportergens pro diploidem Genom enthielten. Eine Untersuchung des gleichen Southern-Blot-Tests mit der lacZ-Sequenz zeigte, daß die Transgene aller drei Linien in Tandern-Wiederholungen vorlagen und in unabhängige Stellen integriert waren.
Bei allen drei Mäuselinien wurde das Transgen in die suprabasalen Zellen des Blasenepithels in einem Expressionsmuster vergleichbar dem endogenen UPII-Gen exprimiert. Das Anfärben korrelierte teilweise mit der Gendosierung, da es im TG1 intensiv war (40 Kopien), aber nur mäßig im TG2 (6 Kopien) und TG3 (30 Kopien). Die β-Galactosidaseaktivität wurde nur in der Blase und anderen Urothelia von Mäusen beobachtet, die das Mäusegen geerbt hatten, was bestätigte, daß die Aktivität transgenspezifisch ist. In allen drei transgenen Mäusen wurde keine β- Galactosidaseaktivität in irgendeinem der getesteten nicht-urothelstratifizierten Epithelia, einschließlich denen der Haut, der Zunge, der Cornea, der Speiseröhre und des Vormagens, gefunden. Das Reportergenprodukt war auch in allen anderen getesteten Epithelia nicht nachweisbar, einschließlich denen aus Leber, Lunge, glandulärem Magen, Dünn- und Dickdarm, Uterus und Hoden, oder embryonalen Bindegeweben, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Milz und verschiedenen Muskelzellen.
Es wurden auch Experimente durchgeführt, bei denen Uroplakin II-Promotor verwendet wurde, um die Expression des biologisch aktiven menschlichen Wachstumshormongens im Urothel der transgenen Mäuse zu bewirken. In diesen Experimenten zeigten mindestens zwei unabhängige Founderlinien eine Akkumulierung einer relativ hohen Konzentration von menschlichem Wachstumshormon in Mäuseurin (400-500 ng/ml). Die Blutkonzentrationen des Hormons waren kleiner als 5 ng/ml, was anzeigte, daß das synthetisierte Hormon eher in den Blasenhohlraum als in den Blutstrom vektoriell abgesondert wird.
Andere Urothelia, die eng verwandt sind mit dem Epithel der Blase, und von denen bekannt ist, daß sie andere Bereiche des Harntraktes bedecken, wie beispielsweise das Nierenbecken der Nieren, den Harnleiter und die Harnröhre, und welche auch AUM-Plaques hervorbringen, zeigen ähnliche Expression des Transgens.
Diese Daten zeigen, daß die 3,6-kb-5'-Seitensequenz des UPII-Gens der Maus sowohl ein heterologes Reportergen als auch ein Gen für ein biologisch aktives Molekül dazu veranlassen kann, in den oberen Zellschichten des Blasenepithels zu exprimieren. Das Fehlen der Expression in anderen nicht-urothelialen Geweben zeigt einen hohen Grad an Gewebespezifizität und zeigt, daß die cis-Elemente dieser Promotorregion eine sehr starke Regulationskontrolle auf die gewebespezifische und differenzierungsabhängige Expression eines Gens, das flußabwärts vom Promotor angeordnet ist, zur Verfügung stellen. Da diese Ergebnisse in unabhängigen transgenen Linien mit unterschiedlichen Stellen von transgener Integration bestätigt wurden, zeigen sie, daß die inhärente Promotoraktivität verantwortlich ist für die gewebespezifische Expression, und nicht zurückzuführen ist auf die Wirkung von benachbarten Sequenzen der transgenen Integrationsstellen. Diese strenge Regulierung ist eine sehr wünschenswerte Eigenschaft eines jeden Promotors, der für die Gewinnung fremder Proteinprodukte in transgenen Wirtstieren verwendet wird, da sie eine genaue Abgabe an die Zielproduktionsstellen und eine hohe Effizienz der Expression von transduzierenden Genen gewährleistet und den toxischen Effekt aberrierender Expressionen minimiert.
Während diese Experimente unter Verwendung des UPII-Promotors der Maus durchgeführt wurden, ist eine ausreichende Ähnlichkeit bei diesem Gen in verschiedenen Spezies vorhanden, so daß ähnliche Ergebnisse mit der UPII- Promotorsequenz in anderen Tieren zu erwarten sind. Beispielsweise sind die UP- Genorganisation (Ryan et al. Mamm. Genome 1993, 4, 656-661), die cDNA (Lin et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 1775-1784) und Proteinsequenzen, Gewebemuster der Expression und die Morphologie von AUMs auffallend ähnlich zwischen der Maus und der Kuh. Die Aminosäuresequenzen von Rinder- und Mäuse-UPII sind sehr ähnlich, da sie sich in 84 ihrer 100 Aminosäurereste gleichen. Wu et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 13716-13724. Darüberhinaus ist UPII sowohl in den Blasenepithelia der Kuh und der Maus deutlich differenzierungsverwandt, obwohl der Beginn der Expression des UPII-Gens in diesen beiden Spezies unterschiedlich ist.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Abgabesystem zur Verfügung gestellt, das speziell die Blase zu einem Bioreaktor macht, der in der Lage ist, ein transgenes Produkt zu erzeugen. Dieses Abgabesystem umfaßt ein Transgen, das eine 3,6-kb- 5'-Seitensequenz eines urothelspezifischen Gens enthält, beispielsweise des Uroplakin II-Gens der Maus, und ein Gen, das ein biologisch aktives Molekül kodiert. In einer Ausführungsform wird dieses Transgen in Keimzellen eingeführt, um ein transgenes Tier zu erzeugen, das in der Lage ist, das biologisch aktive Molekül in seiner Blase zu exprimieren. Wie hier verwendet, bezeichnet "biologisch aktives Molekül" ein Molekül, das in der Lage ist, in einem Tier, nicht unbedingt in dem Tier, das das Transgen besitzt, einen Effekt hervorzurufen. Beispiele für solche Moleküle umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Adipokinin, Aldosteron, Adrenocorticotropin, Blutgerinnungsfaktoren, Choriongonadotropin, Corticoliberin, Corticotropin, transmembrane Leitungsregulatoren bei zystischer Fibrose, Erythropoietin, Folliberin, Follitropin, Glucagon-Gonadoliberin, Gonadotropin, hypophysiotropes Hormon, Insulin, Lipotropin, luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon, Luteotropin, Melanotropin, Parathormon, Parotin, Prolactin, Prolactoliberin, Prolactostatin, Somatoliberin, Somatotropin, Thyrotropin, gewebespezifischen Plasminogenaktivator und Vasopressin. Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, daß die oben genannte Liste nicht abschließend ist. Darüberhinaus werden neue Gene für biologisch aktive Moleküle, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wirken, kontinuierlich identifiziert werden. Das biologisch aktive Molekül kann aus dem Urin dieser transgenen Tiere isoliert werden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung großer Mengen biologisch aktiver Moleküle aus dem Urin von transgenen Tieren zur Verfügung, welche zu vielen verschiedenen Zwecken verwendet werden können.
In einer anderen Ausführungsform wird das Transgen in einem Vektor transportiert, der von den Epithelzellen, die die Blasenhöhle beschichten, aufgenommen wird. Ein Beispiel für ein nützliches Vektorsystem ist das Myogenic Vektorsystem (Vector Therapeutics Inc. Houston Texas). In dieser Ausführungsform wird das vom Vektor transportierte Gen in vivo in die Blase eines Tieres eingeführt. Die Einführung des Vektors kann nach vielen verschiedenen Verfahren, die für den Fachmann auf dem Gebiet Routine sind, durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Vektor über einen intraurethralen Gummiblasenkatheter oder Foley- Katheter in direkten Kontakt mit dem Urothel gebracht werden. Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch in Liposome eingebracht werden und in dieser Form in das Tier eingeführt werden. Das Transgen wird von einer oder mehreren Epithelzellen absorbiert, die in der Lage sind, das biologisch aktive Molekül in den Urin, der sich in der Blase sammelt, zu exprimieren und abzusondern. Bei einigen biologisch aktiven Molekülen kann es bevorzugt sein, auch eine Signalsequenz in den Vektor einzubauen, um zu gewährleisten, daß das Molekül aus der Apikaloberfläche in den Hohlraum abgesondert wird. Die Verwendung von Signalsequenzen, wie beispielsweise der Glycophosphatidylinosit (GPI)-Bindung beim Verankern von Molekülen an eine ausgewählte Oberfläche ist aus dem Stand der Technik gut bekannt. Das biologisch aktive Molekül wird dann aus dem Hohlraum abgeschieden, wo es dann gesammelt und von anderen Urinkomponenten abgetrennt werden kann. Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.

BEISPIELE

Beispiel 1: Charakterisierung des UPII-Gens der Maus

Eine UPII-cDNA eines Rinds (Lin et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 1775-1784) wurde als Probe zum Screening einer EMBL3-SP6A/T7-Genomdatenbank (Clontech Laboratories Inc. Palo Alto, CA) verwendet. Zwei sich überschneidende Klone (G1 und G2) wurden isoliert (Fig. 1a) und mittels der Dideoxynukleotid- Terminationsmethode sequenziert. Die Transkriptionsstarterstelle wurde durch Sequenzieren dreier Klone von 5'-RACE (rapid amplification of cDNA ends)-Produkten von Blasen-cDNA der Maus bestimmt.

Beispiel 2: Expression eines Fusion-Gens (UPII-lacZ) in transgenen Mäusen

Ein 6-kb XhoI-DNA-Fragment des G1-Genomklons (Fig. 1a) wurde in pGEM7Z subkloniert und dann durch Restriktion geschnitten, um ein 3,6-kb-DNA- Fragment des G1-Klons (verlaufend von der XhoI-Stelle bei -3,6 kb zur BamHI-Stelle bei -42 bp relativ zur Transkriptionsstartertstelle) zu erhalten, und in die SmaI-Stelle eines lacZ-Vektors, placF, (Peschon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 5316-5319; Mercer et al. Neuron 1991, 7, 703-716) eingefügt, um pUPII-LacZ zu erzeugen (Fig. 3). Das 7,1-kb-Fusionsgen wurde unter Verwendung von Kpn I und Hind III herausgeschnitten, gelgereinigt und in befruchtete Eier der Maus mikroinjiziert (aus F1-Hybriden von C57BL/6J X DBA2), welche in CD-1-Leihmütter implantiert wurden. Die lacZ-Transgene wurden durch Southern-Blot-Analyse endständiger DNA nach Verfahren, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, identifiziert. Positive Founder-Tiere wurden mit (C57BL/6J X DBA2)-F1-Hybriden rückgekreuzt, um semizygotische Tiere zu erzeugen, die für die Untersuchung der transgenen Expression verwendet wurden.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Tung-Tien Sun
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Expression und Isolierung biologisch aktiver Moleküle aus Urin
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Jane Massey Licata, Esq.
(B) STRASSE: 210 Lake Drive East, Suite 201
(C) STADT: Cherry Hill
(D) BUNDESSTAAT: NJ
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 08002
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: DISKETTE, 3,5 INCH, 1,44 Mb SPEICHERKAPAZITÄT
(B) COMPUTER: IBM 486
(C) BETRIEBSSYSTEM: WINDOWS FOR WORKGROUPS
(D) SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN:
(A) AKTENZEICHEN: noch nicht erteilt
(B) EINREICHUNGSDATUM: hiermit
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERES ANMELDUNGSDATUM:
(A) AKTENZEICHEN:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(viii) ANWALTS-VERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Jane Massey Licata
(B) EINTRAGUNGSNUMMER: 32 257
(C) BEZUGS-/REGISTRIERNUMMER: NYU-0005
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (609) 779-2400
(B) TELEFAX: (609) 779-8488
(2) INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGS-NR.: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3963
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: Linear
(iv) EMPFINDLICHKEIT GEGEN: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZIDENTIFIKATIONS-NR.: 1:
(2) INFORMATION ZUR SEQUENZIDENTIFIZIERUNGS-NR.: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 11
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQUENZIDENTIFIZIERUNGS-NR.: 2:

Claims

1. Nichtmenschliches transgenes Tier, umfassend eine urothelspezifische Promotersequenz, die ein Gen reguliert, das ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Molekül im Urin des Tieres exprimiert wird.

2. Transgenes Tier nach Anspruch 1, worin das Tier eine Maus oder eine Rinderspezies ist.

3. Transgenes Tier nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die urothelspezifische Promotersequenz eine Uroplakin II-Promotersequenz ist.

4. Transgenes Tier nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das biologisch aktive Molekül ausgewählt ist aus mindestens einer der folgenden Verbindungen:

Adipokinin, Aldosteron, Adrenocorticotropin, Blutgerinnungsfaktoren, Choriongonadotropin, Corticoliberin, Corticotropin, Transmembranleitungsregulatoren bei zystischer Fibrose, Erythropoietin, Folliberin, Follitropin, Glucagon-Gonadoliberin, Gonadotropin, hypophysiotropes Hormon, Insulin, Lipotropin, LH-releasing-Hormon, Luteotropin, Melanotropin, Parathormon, Parotin, Prolactin, Prolactoliberin, Prolactorstatin, Somatoliberin, Somatotropin, Thyrotropin, gewebespezifischer Plasminogenaktivator und Vasopressin.

5. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Moleküls, das umfaßt:

Zusammenführen von Blasenepithelzellen in einem nicht- menschlichen Tier mit einem Vektor, der eine urothelspezifische Promotersequenz und ein Gen, das ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül kodiert, umfaßt, so daß das Gen, das das ausgewählte biologisch aktive Molekül kodiert, exprimiert wird; und

Gewinnung des biologisch aktiven Moleküls aus dem vom Tier produzierten Urin.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die urothelspezifische Promotersequenz eine Uroplakin II - Promotersequenz ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Moleküls, das umfaßt:

Züchtung eines transgenen Tiers nach Anspruch 1, welches in den Blasenepithelzellen ein ausgewähltes biologisch aktives Molekül exprimiert; und

Gewinnung des biologisch aktiven Moleküls aus dem vom transgenen Tier produzierten Urin.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das biologisch aktive Molekül, das aus dem Urin gewonnen wird, mindestens eines aus Adipokinin, Aldosteron, Adrenocorticotropin, Blutgerinnungsfaktoren, Choriongonadotropin, Corticoliberin, Corticotropin, Transmembranleitungsregulatoren bei zystischer Fibrose, Erythropoietin, Folliberin, Follitropin, Glucagon-Gonadoliberin, Gonadotropin, hypophysiotropem Hormon, Insulin, Lipotropin, LH-releasing-Hormon, Luteotropin, Melanotropin, Parathormon, Parotin, Prolactin, Prolactoliberin, Prolactorstatin, Somatoliberin, Somatotropin, Thyrotropin, gewebespezifischem Plasminogenaktivator und Vasopressin umfasst.