DE69231947T2

DE69231947T2 - Genherstellung zur produktion von transgenfisch

Info

Publication number: DE69231947T2
Application number: DE69231947T
Authority: DE
Inventors: L. Fletcher; L. Hew
Original assignee: Seabright Corp Ltd; HSC Research and Development LP
Current assignee: Seabright Corp Ltd; HSC Research and Development LP
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-12
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2012-03-13
Also published as: EP0578653A1; JP3293622B2; JPH06505870A; CA2106315A1; NO933276L; ATE203269T1; NO321650B1; US5545808A; CA2106315C; NO933276D0; AU1370392A; CA2367129A1; EP0578653B1; AU669844B2; DE69231947D1; ES2163398T3; WO1992016618A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Transgenfisch und eine Promotorsequenz "für alle Fische", die bei der Entwicklung von Transgenfisch geeignet ist.

Hintergrund der Erfindung

In der gesamten Beschreibung wird auf mehrere Aufsätze verwiesen, um ergänzende Information bezüglich der Erfindung zu geben. Die vollständigen Zitate für diese Bezugnahmen sind nachfolgend aufgeführt:
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Bei der Entwicklung von Transgenfisch und anderen Tieren sind verschiedene Versuche gemacht und Erfolge erreicht worden. Wachstumshormon ist von besonderem Interesse in früheren Untersuchungen gewesen. Wachstumshormon ist ein Einketten-Polypeptidhormon, das eine Hauptrolle bei der Regulation von somatischem Wachstum und somatischer Entwicklung bei Tieren spielt.
Viele Versuche sind durchgeführt worden, um das Fischwachstum durch Wachstumshormon zu erhöhen. Diese schließen das Füttern von Extrakten der Hypophyse (Tuckmann 1936, Cantilo und Regalado 1940), Injektion oder Implantation von gereinigtem, rekombinant gewonnenem Wachstumshormon (Gill et al. 1985, Sekine et al. 1985, Kawauchi et al. 1986, Agellon et al. 1988) ein. Alle diese Ergebnisse zeigten klar, daß allein Wachstumshormon bei der Stimulierung des Fischwachstums wirksam ist. Jedoch weisen alle diese Untersuchungen beschränkte Anwendung bei der Fischzucht im Meer auf, und ein Hauptnachteil besteht darin, daß der Phenotyp nicht ererbt werden kann.
Gentransferverfahren ist eine neue und leistungsfähige Möglichkeit geworden, die genetische und phenotypische Eigenschaft sowohl von Tieren als auch von Pflanzen zu manipulieren. Verschiedene Berichte sind bei der Produktion von Transgenfisch erstellt worden. Von der ersten Transgenuntersuchung an Fisch wurde von Vielkind et al. (1982) berichtet. Diese Forscher injizierten Schwertschwanz-Tumorgene in den Platyfisch (Platyfish), und fanden, daß die injizierten Schwertschwanz-Tu-Gene T-melanophore Induktion in Tu-freiem Platyfisch induzieren konnten. 1985 und 1986 berichteten Zhu et al. über die Produktion von Transgenfisch durch Wachstumshormon-Gentransfer. Unter Verwendung eines Maus-Metallothionein-Promotors, der an ein GH-Strukturgen des Menschen ligiert war, produzierten sie erfolgreich Transgenschlammpeitzger (loach), -goldfisch und -silberkarpfen. Im Durchschnitt war der Transgenfisch ein- bis dreimal größer als das Kontrolltier. Seitdem sind mehrere Berichte veröffentlicht worden, die ähnliche Genkonstrukte verwenden (Rokkones et al. 1989, Guyomard et al. 1989, Chen et al. 1990). Von weiteren Arbeiten ist auch von Maclean et al 1987, Hew 1989, Maclean und Penman 1990 und Fletcher und Davies 1991 berichtet worden. Die früheren GH-Gentransfer-Untersuchungen an Fisch wurden unter Verwendung von Säugetier-Metallothionein-Promotoren oder Virus-Promotoren und GH-Genen des Menschen und der Ratte durchgeführt (Zhu et al. 1986, Rokkones et al. 1989, Guyomard et al. 1989 und Chen et al. 1990). Es gibt zwei Probleme, die mit der Verwendung dieser heterologen Genkonstrukte verbunden sind. Erstens kann der unter Verwendung von Säugetier-GH-Genen produzierte Transgenfisch für den Verzehr durch den Menschen nicht geeignet oder annehmbar sein. Zweitens ist von Friedenreich und Schartl (1990) berichtet worden, daß das Säugetier-GH-Gen in vitro nicht ausreichend in einer Fischzelllinie gespleißt werden konnte, und sie die Expression des GH-Gens in Fischzellen nicht nachweisen konnten. Dies kann erlklären, warum Rokkones et al. (1989) und Guyomard et al (1989) in ihrem Transgenfisch unter Verwendung von Säugetier-Metallothionein-Säugetier-GH- Fusions- oder Viruspromotor-Säugetier-GH-Genen kein schnelleres Wachstum beobachten konnten. Zhang et al. (1990) und Chen et al. (1990) setzten unter Verwendung des Retroviruspromotors das Regenbogenforellen-GH-Gen für den Gentransfer in Karpfen und Schlammpeitzger ein. Jedoch waren die Transgenfische in diesen Untersuchungen nur 20% größer als die Kontrolltiere, und dem verwendeten Forellen-GH-Gen fehlte die Signalsequenz, die für die geeignete Sekretion und Wirkung des GH erforderlich ist.
Die meisten, wenn nicht alle dieser Untersuchungen wurden entweder unter Verwendung von Säugetier-GH- oder Säugetier-Gen und Virus-Promotoren durchgeführt. Um in der Fischzucht im Meer einsetzbar zu sein, sollten der/die Piromotor(en) und das/die Gen(e), die im Transgenfisch verwendet werden, vorzugsweise von Fischprotein-Genen abstammen, um die Möglichkeit jeder potentiellen Gesundheitsrisikos zu vermeiden. Außerdem ist die Produktion eines Stammes von schneller wachsendem Fisch in einer wirtschaftlich bedeutenden Spezies, wie den Salmoniden, mit einem Genkonstrukt "für alle Fische" vorteilhaft für die Fischzucht.
Vor kurzem ist ein Expressionsvektor "für alle Fische", der den β-Actin-Promotor des Karpfen verwendet, veröffentlicht worden (Liu et al., 1990b). Ein ernsthaftes Problem mit diesem Vektor besteht darin, daß der Vektor das Polyadenylierungssignal von der Königslachs-GH-cDNA (Hew et al., 1989) als Transkriptionsterminationssignal verwendet. Jedoch erfordert Transkriptionstermination sowohl ein funktionelles Polyadenylierungssignal als auch ein strangabwärts gelegenes GT-reiches Element (Connelly und Manely, 1988; Proudfoot, 1989). Deshalb ist das Polyadenylierungssignal der GH-cDNA höchst wahrscheinlich unzureichend, um als Transkriptionsterminationssignal zu wirken. Zweitens wird der β-Actin-Promotor in den meisten, wenn nicht allen Geweben exprimiert, oder ihm fehlt Gewebe-Spezifität.

Kurzdarstellung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Transgenfisch bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß in seinem Genom ein chimeres Genkonstrukt eingebaut ist, wobei das chimere Genkonstrukt
einen Typ III AFP-Promotor und
eine Gensequenz für ein Fischwachstumshormon
umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine PromotorsequenzlTranskriptionsterminalsequenz zur Verwendung bei der Konstruktion eines chimeren Genkonstrukts zum Einbau in das Genom eines erfindungsgemäßen Transgenfischs bereitgestellt, wobei die kombinierte Sequenz eine nichttranslatierte 5'-Sequenz zwischen dem Promotor und den Terminalsequenzen einschließt, wobei die kombinierten Sequenzen die Sequenz der Tabelle V mit einzigartigen Restriktionsstellen von BgIII bei Basenpaarposition 2116 und von Hpal bei Basenpaarposition 2188 aufweisen.
Ferner wird mit vorliegender Erfindung ein chimeres Genkonstrukt zum Einbau in Fischgenom bereitgestellt, um einen erfindungsgemäßen Transgenfisch zu produzieren, bei dem das chimere Genkonstrukt einen Promotor umfaßt, der die DNA-Sequenz der Tabelle V vom 5'-Ende bei Basenpaarposition 1 bis zur Basenpaarposition 2115 aufweist.
Außerdem wird mit vorliegender Erfindung ein chimeres Genkonstrukt zum Einbau in Fischgenom bereitgestellt, um einen erfindungsgemäßen Transgenfisch zu produzieren, bei dem das chimere Genkonstrukt eine Transkriptionsterminalsequenz umfaßt, wobei die Sequenz die DNA-Sequenz der Tabelle V von Basenpaarposition 2188 bis zum 3'-Ende bei Basenpaarposition 3350 aufweist.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung auch einen Fischwirt bereit, der mit einem erfindungsgemäßen chimeren Gen transformiert ist.
Die Erfindung betrifft spezifische Ausführungsformen, wie die Analyse transienter Expression der OP-AFP-Gen-Promotor-Aktivitäten in einer Zelllinie der Salmoniden und der Embryonen des Japanischen Medaka (Japanese medaka), die Konstruktion eines AFP-GH-Fusionsgens und dessen Gentransfer durch Mikroinjektion, Screenen des Transgenlachses durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und Messung der Größen- und Wachstumsrate.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: (A). Konstruktion von pOP-CAT für transienten CAT-Assay in Zelllinien der Salmoniden und Embryonen des Japanischen Medaka. Das Plasmid wird als pOP5B bezeichnet. (B). Konstruktion des chimeren Gens für alle Fische (pOP-GHe) für Gentransfer;
Fig. 2: Strategie der PCR-Analyse. Drei Primersätze wurden verwendet, um die Anwesenheit des Transgens nachzuweisen. Der Abstand zwischen den Primern beträgt 813 bp für die Primer A und B, 335 bp für die Primer A und D, 119 bp für die Primer C und D (Sequenzieruntersuchungen lieferten verfeinerte Daten für den Abstand zwischen den Primern; d. h. 855 bp für die Primer A und B; 333 bp für die Primer A und D; 199 bp für die Primer C und D);
Fig. 3: Analyse der OP-AFP-Promotor-Aktivität in Hepatomzellen der Regenbogenforelle durch CAT-Assay. Das CAT-Plasmid der Amerikanischen Aalmutter ist pOPSB;
Fig. 4: Analyse des Zeitverlaufs von CAT-Expression in Embryonen, denen OP-CAT (pOP%B) injiziert wurde. Ein Pool von fünf Embryonen wurde für den CAT-Assay von einen Tag, zwei Tage, vier Tage, sechs Tage, acht Tage und elf Tage alten Embryonen verwendet. Eine Einzellarve wurde für den CAT-Assay von ausgebrütetem Medaka (einen Tag nach dem Schlüpfen) verwendet. Embryonen, denen pBLCAT3 injiziert wurde, wurden als Negativkontrolle verwendet;
Fig. 5: Screenen von Transgenlachs durch PCR unter Verwendung der Primer A/B. (A). Analyse von PCR-Amplifikationsprodukten durch Agarosegel-Elektrophorese. (B). Southernblot-Analyse des PCR-Produkts unter Verwendung der GH-spezifischen Sonde E;
Fig. 6: (A). Bestätigen des Transgenlachses durch PCR unter Verwendung der Primer C/D. (B). Untersuchung der Integrität des Transgens durch PCR unter Verwendung der Primer A/B;
Fig. 7: Größenverteilung von Transgenlachs und Nicht-Transgenlachs;
Fig. 8: Transgenlachs versus Nicht-Transgenlachs;
Fig. 9: Analyse der opAFP-Gen-Promotor-Aktivität durch CAT-Assay in zwei Zelltinien der Salmoniden, die die Hepatomzelllinie der Regenbogenforelle RTH-149 und die Embryonenzelllinie des Königslachses CHSE-214 einschließen. Die acetylierten und nichtacetylierten Chloramphenicole, wie durch AC und C auf der rechten Seite angezeigt, wurden durch Dünnschicht-Chromatographie, gefolgt von Autoradiographie, getrennt;
Fig. 10: CAT-Expression in verschiedenen Stadien von Embryonen, denen opAFP-CAT injiziert wurde. Ein einzelner Embryo wurde für jeden CAT-Assay verwendet. Die acetylierten und nichtacetylierten Chloramphenicole werden durch AC und C auf der rechten Seite angezeigt. Die analysierten Zeitpunkte waren Tag 1, Tag 2, Tag 6, Tag 9 und Tag 11;
Fig. 11: ist ein Diagramm von opAFP-V. 3'-flankierende Sequenzen des AFP-Gen-Promoters und Gens der Amerikanischen Aalmutter; 5'-nichttranslatierte Sequenz des AFP-Gens der Amerikanischen Aalmutter; 3'-nichttranslatierte Sequenz des AFP-Gens der Amerikanischen Aalmutter; _ pUC-Plasmid- DNA-Sequenz und Ampicillin-Resistenzgen. Die TATA-Box, das Poly(A)-Signal (AATAAA) und das vorhergesagte Transkriptionsterminationssignal (TTTTTCT) sind angezeigt. Die Restriktionsstellen sind: A, Aatll; Ba, BamHI; Bg, BgIII; E, EcoRI; H, HindIII; Hp, Hpal; K, KpnI; Sac, SacI; Sal, SaII und Sm, SmaI;
Fig. 12: Transgenlachs (#34, 33 g) und Nicht-Transgengeschwister (mittleres Gewicht 5-7 g); und
Fig. 13: Größenhäufigkeitsverteilung von Lachs. (A) Fische (200) wurden im Oktober 1990 gewogen, 50 wurden markiert; von ihnen wurden Blutproben für eine DNA-Analyse genommen (gefüllte Balken). Die Anwesenheit von Einzeltransgenfisch wird durch T identifiziert. (T) zeigt einen Transgenfisch an, von dem nur durch Scale-DNA-Analyse gefunden wurde, daß er positiv ist. (B) Alle Fische (484) im Aquarium wurden im Januar 1991 gewogen, und von ihnen wurden Blutproben für eine DNA-Analyse genommen. T zeigt das Vorhandensein eines Transgenlachses an. (T) zeigt einen Transgenfisch an, von dem nur durch Scale-DNA-Analyse gefunden wurde, daß er positiv ist.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung betrifft die erfolgreiche Produktion von Transgenfisch mit dramatischer Expression des gewünschten Genmerkmals. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde ein chimeres Gen, pOP-GHe, unter Verwendung des Antigefrier-Promotors, der mit dem Königslachs-GH-cDNA- Klon verbunden war, konstruiert. Dieses Gen-Konstrukt pOP-GHe wurde in befruchtete nicht-aktivierte Eier des Atlantischen Lachses über die Mikropyles mikroinjiziert. Das Transgen tragende Atlantische Transgenlachse wurden mit einer Einbauhäufigkeit von wenigstens 2% gezeugt. Die Anwesenheit des Transgens wurde durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer nachgewiesen. Diese Transgenfische zeigten eine dramatische Zunahme ihres Gewichts und ihrer Wachstumsrate. Im Alter von acht Monaten war die mittlere Zunahme des Transgenfischs vierfach, und der größte Transgenfisch war achtmal größer als die Nicht-Transgenkontrolltiere. Diese Untersuchungen zeigten, daß der AFP-Promotor bei der Produktion von großem Transgenlachs wirksam war und auf viele verschiedene Fischspezies anwendbar wäre. Die Verwendung von Fischwachstumshormon mit dem erfindungsgemäßen Promotor führt zu bis zu achtmal größerem Transgenfisch als die Kontrolltiere. Dies ist die größte Zunahme, von der bis heute für einen Transgenfisch berichtet worden ist. Verglichen mit der zweifachen Zunahme bei Transgenmäusen (Palmiter et al. 1982) und Transgenschweinen (Vize et al. 1988), zeigen diese Untersuchungen, daß das Wachstum von Transgenlachs ausgeprägter ist.
Die weiter unten in dieser Beschreibung angegebenen Daten stellen ferner die erfolgreiche Produktion von Transgenlachs unter Verwendung eines aus Fischgenen stammenden DNA-Konstrukts dar. Gemäß einem Aspekt unserer Erfindung wurden der Antigefrier-Gen-Promotor und das Transkriptionsterminationssignal der Amerikanischen Aalmutter mit dem Königslachs-GH-Gen ligiert, die beide aus Fischgenen stammen. Dadurch werden die mit der Verwendung von Säugetier- oder Virusgenen für den Gentransfer in kommerziell bedeutendem Fisch verbundenen Probleme vermieden.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
opAFP: Antigefrier-Proteine der Amerikanischen Aalmutter
opAFP-CAT: Ein chimeres Plasmid, das aus dem mit der Bakterienchloramphenicolacetyltransferase verbundenen Anti-
gefrier-Protein-Promotor der Amerikanischen Aalmutter besteht. (Ursprünglich wurde dieses Produkt als "pOP- CAT" bezeichnet. Während der weiteren Entwicklung beschlossen wir, es mit "opAFP-CAT" anzugeben).
opAFP-GHc: Ein chimeres Gen "für alle Fische", das aus dem Antigefrier-Protein-Promotor der Amerikanischen Aalmutter und mit dem Fischwachstumshormon-cDNA-Gen verbundenen nichttranslatierten 3'-Sequenzen besteht. (Ursprünglich wurde dieses Produkt als "pOP-GHc" bezeichnet. Während der weiteren Entwicklung beschlossen wir, es mit "opAFP-GHc" anzugeben).
opAFP-V: Eine auf der Verwendung der Antigefrier-Promotoren der Amerikanischen Aalmutter und der nichttranslatierten 3'- Sequenzen beruhende Genkassette "für alle Fische".
Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, daß das 2kb BamHI-BgIII-Fragment des OP-AFP-Merkmals des Promotors eine Länge von 2,1 kb hat. Es zeigte sich, daß das 3'-Sequenz-HpaI-HindIII-Fragment eine Länge von 1, 1 kb hat. Ger AFP der Amerikanischen Aalmutter ist ein Mitglied der Typ III AFP (Davies und Hew 1990). Er weist ungefähr 150 Genkopien auf (Hew et al. 1988, Davies et al. 1989). Die Protein- und Genomstruktur dieses AFP wurde von uns gut charakterisiert (Hew et al. 1984, 1988, Li et al. 1985, 1989). Kürzlich sind dessen Promotorsequenzen sowohl in Zelilinien der Salmoniden als auch der Embryonen des Japanischen Medaka untersucht worden (Gong und Hew, unveröffentlicht, Gong et al. 1991, siehe Tabelle II). Das AFP-Gen der Amerikanischen Aalmutter wird hauptsächlich in Leberzellen exprimiert (Gong et al. 1991), wobei alle diese Dokumente hier durch Inbezugnahme eingeführt werden.
Anders als der alaninreiche Typ I AFP aus der Amerikanischen Scholle (winter flounder), der nur im Winter synthetisiert wird, ist der AFP der Amerikanischen Aalmutter das ganze Jahr über gegenwärtig, allerdings in einer höheren Konzentration während der Wintermonate (Fletcher et al. 1989). Die folgenden Daten zeigen anschaulich, daß der OP-AFP-Promotor ein sehr wirksamer Promotor für die Induzierung von CAT und GH-Gen oder einer anderen gewünschten verträglichen Genexpression in Fisch, wie in Atlantischem Lachs, ist. Obwohl kein Antigefrier- (AFP-) Gen in Genomen der Salmoniden oder des Medaka vorhanden ist, ist es im Hinblick auf die erfolgreiche Implementation der Erfindung wahrscheinlich, daß die die OP-AFP-Genexpression kontrollierenden Transkriptionsfaktoren in Lachs und in aüen anderen Fischen existieren. Dies stimmt mit unserer früheren Untersuchung bei der Produktion des Atlantischen Transgenlachses unter Verwendung des Typ I Antigefrier-Protein-Gens aus der Amerikanischen Scholle (winter flounder) überein (Fletcher et al. 1988). In jener Untersuchung wurden eine die Genomsequenz des AFP-Gens kodierende DNA und deren 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen verwendet. Transgen-Flundertiere und umlaufenden AFP im Serum produzierende F1-Generationen wurden zustande gebracht (Shears et al. 1991). Unsere Untersuchungen des Promotors der Amerikanischen Aalmutter in den Zeillinien der Salmoniden, der Embryonen des Japanischen Medaka und die positiven Ergebnisse vom Atlantischen Transgenlachs zeigen an, daß der Promotor für verschiedene Fischspezies geeignet ist. Das vorliegende AFP-Gen-Konstrukt kann ferner zu einer Genkassette entwickelt werden, in der viele andere Fischgene von Interesse insertiert werden können.
Der AFP-Gen-Promotor der Amerikanischen Aalmutter ist in mehrfacher Hinsicht attraktiv. Zuallererst wird er hauptsächlich in der Leber exprimiert, einem Gewebe, das große synthetische und sekretorische Fähigkeiten hat. Die Expression eines Transgens in Leber ist einer der häufigsten Versuche in Gentransfer-Untersuchungen. Zweitens ist das AFP-Gen nur in einer kleinen Anzahl von Fischspezies vorhanden. Dessen Expression wird durch das Wirtsgenom nicht beeinflußt, weil keine homologen endogenen Gene vorliegen. Außerdem macht das Fehlen des AFP-Gens in den meisten Fischgenomen den Nachweis dieses AFP-abgestammten Genkonstrukts einfach ohne irgendeinen von der Wirts-DNA beigesteuerten Hintergrund. Dieses wurde in unseren Untersuchungen des Atlantischen Transgenlachses (Du et al., 1992) klar veranschaulicht. Schließlich wurde gezeigt, daß es mehrere positive und negative cis-tätige Elemente im opAFP-Gen-Promotor gibt (Gong et al. 1991). Dies stellt eine Möglichkeit dar, diesen Vektor zu modifizieren, um den verschiedenen Erfordernissen der Transgenexpression zu entsprechen.
Wir haben auch bestimmt, daß eine ausreichende Expression des ausgewählten Gens durch Einbringen der 1,2 kb der 3'-Sequenz des opAFP-Gens in unseren Vektor opAFP-V erreicht werden kann. Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß es ein typisches Polyadenylierungssignal AATAAA enthält. Außerdem wurde ein 7 bp Sequenzmotiv (TTTTTCT) 26 bp strangabwärts zum Poly(A)- Signal gefunden. Dieses 7 bp Motiv stellt wie im Virus ein geeignetes Transkriptionsterminationssignal (TTTTTNT) dar (Zhou et al., 1991). Die 1,2 kb Sequenz kann deshalb als allgemeines Transkriptionsterminationssignal bei der Genexpression wirken.
Düe Entwicklung der opAFP-Genkassette; d. h. opAFP-V, hat die Insertion anderer Gene für den Gentransfer außerordentlich vereinfacht. Transgenlachs und andere Transgenfisch-Spezies können mit anderen Hypophyse-Hormonen und vielen anderen Proteinen und Polypeptiden unter Verwendung dieses Expressionsvektors produziert werden.

Versuche - erste Serie von erfindungsgemäßen Ausführungsformen

A-1 Sammeln von Eiern des Atlantischen Lachses

Reifer Atlantischer Lachs (Salmo salar) wurde 2-3 Wochen vor dem Laichen aufs den Exploits and Colinet Flußsystemen, Neufundland, gefangen und lebend zum Ocean Sciences Centre, Memorial University of Newfoundland, transportiert. Der Fisch wurde bei einer der Saison entsprechenden Umgebungsphotoperiode in 2 · 2 · 0,5 m großen Aquarien gehalten, die mit Frischwasser und Luft versorgt wurden.
Eier und Spermien wurden aus dem Lachs entnommen, der in einer verdünnten Lösung von t-Amylalkohol anästhetisiert wurde. Die Eier wurden bei 4ºC aufbewahrt, bis zu 2 h vor der Mikroinjektion befruchtet und mit mehreren Wechseln eiskalter Lachs-Ringer-Lösung gewaschen. Aktivierung fand statt, wenn die Eier nach der Mikroinjektion in Frischwasser eingebracht wurden (Fletcher et al. 1988).

A-2 Sammeln von Medaka-Ei

Japanische Medaka (Oryzias latipes) wurden in Dr. J. Vielkinds Laboratorium, Cancer Research Centre, Vancouver, gehalten. Die Reproduktionsaktivität der ausgewachsenen Tiere wurde mit einer künstlichen Photoperiode von 10 Stunden Dunkelheit und 14 Stunden Licht induziert. An Weibchen haftende, befruchtete Eier wurden 1-2 h nach dem Beginn des Lichts gesammelt und vor der Injektion bei 12ºC in Ringer-Lösung (0,75% NaCl, 0,02% KCl, 0,02% CaCl&sub2;, pH 7,3) aufbewahrt. Injizierte Medaka-Embryonen wurden in Medium gezüchtet, das 0,1% NaCl, 0,003% KCl, 0,004% CaCl&sub2; · 20, 0,016% MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,0001% Methylenblau enthielt, und sofort nach dem Ausbrüten in Aquariumwasser überführt (Chong und Vielkind 1989).

A-3 Plasmid-Konstruktion

a. Antigefrier-Promotor-CAT-Fusionsgen (pOP-CAT) der Amerikanischen Aalmutter.

Das den OP-AFP-Promotor enthaltende 2 kb BamHI-BglLI-Fragment wurde in das Plasmid pBLCAT3 (Luckow und Schutz 1987) an den BamHI-, BgIII-Stellen subkioniert, um das OP-CAT-Fusionsgen zu erzeugen (Fig. 1A). Supergeknäulte Plasmide für die Transfektion wurden durch Ethidiumbromid-CsCI- Gradientenzentrifugation präpariert. Das 2 kb BamHI-BglII-Fragment wurde aus der Gensequenz des AFP-Gens der Amerikanischen Aalmutter, wie bei Hew et al. (1988) beschrieben, isoliert. Die Restriktionskarte von Plasmid Op5 ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Konstruktion und die Promotor-Aktivitäten anderer Antigefrier-Promotoren aus anderen Fischen sind ebenfalls in Tabelle II enthalten.

b. Fusionsgen aus Antigefrier-Promotor der Amerikanischen Aalmutter und Wachstumshormon des Lachses (pOP-GHe).

Das 217 bp-HindIII-Sau3A-Fragment aus den OP-AFP Promotor (Hew et al. 1988) von Tabelle I enthaltendem Plasmid OP5 wurde in das Plasmid pBLCAT3 in pUC18 (Luckow und Schutz 1987) an den Hindlil-, BamHI-Stellen subkloniert, wie in Fig. 1 B veranschaulicht. Das Plasmid wurde mit Bglfl verdaut und dann mit einem synthetischen 73 bp-BgIII-PstI-Linker ligiert, der die nichttranslatierte 5'-Sequenz des GH-Gens des Königslachses enthält (Du und Hew, unveröffentlicht). Das GH-Gen ist bei Hew et al. (1989) charakterisiert worden und ist in den Wachstumshormon-Sequenzen des Lachses von Tabelle III genauer dargestellt. Die ligierte DNA wurde mit PstI und EcoRI verdaut, und das größere Fragment, das den OP-AFP-Promotor, die nichttranslatierten 5'- GH-Sequenzen des Königslachses und die pUC18-Sequenz enthielt, wurde durch Gelelution gereinigt. Dieses größere Fragment wurde dann mit einem 709 bp-PstI-EcoRI-Fragment, das die GH-kodierende Sequenz des Königslachses und einen Teil der nichttranslatierten 5'- und 3'-Region (Hew et al. 1989) enthielt, ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde mit Hindlil geschnitten und in ein Plasmid kloniert, das die 2kb BamHI-HindIII flankierende Sequenz aus dem Antigefrier-Gen-Promotor der Amerikanischen Aalmutter (Hew et al. 1988) enthielt. Dieses Plasmid wurde dann mit StuI und AatII verdaut, und das größere den OP-AFP-Promotor und die GH-kodierende Region sowie einen Teil der nichttranslatierten 3'-GH-Sequenz enthaltende Fragment wurde dann mit einem 1 kb HpaI-AatII-Fragment aus dem die OP-AFP-Gen-Polyadenylierung und die Transkriptionsterminationssignale enthaltenden OP5-Plasmid ligiert (Hew et al. 1988). Nachfolgende DNA-Sequenzbestimmung zeigte, daß das 1 kb HpaI-AatII-Fragment 1,6 kb groß ist. Es enthält das 1, 1 kb HpaI- HindIII-Fragment aus dem OP5-Plasmid und das 0,5 kb HindIII-AaI-Fragment aus dem pUC-Plasmid. Das End-Konstrukt wurde mit pOP-GHe bezeichnet (Fig. 1 B).

A-4 Transienter CAT-Assay in Lachszelllinien

RTH-149, eine Hepatomzelllinie der Regenbogenforelle wurde freundlicherweise von Dr. L. Gedamu zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden bei 18ºC in minimalem essentiellem Medium (minimum essential medium), ergänzt mit 25 mM HEPES-Puffer, (Gibco) aufbewahrt. Die Fischzellen wurden mit DNA durch Calciumphosphat-Copräzipitation mit Glycerin-Schock transfiziert, und der CAT-Assay wurde im wesentlichen gemäß Davies et al. (1986) und für Fischzellen modifiziert von Zafarullah et al. (1988) durchgeführt.

A-5 Transienter CAT-Assay in Japanischem Medaka

Die supergeknäulte pOP-CAT-Plasmid-DNA (ungefähr 500 pl, 106 Kopien) wurde in das Zytoplasma der befruchteten Medaka-Eier vor oder sofort nach der Spaltung mikroinjiziert. Phenolrot wurde in einer Endkonzentration von 0,25 % zur DNA zugegeben, um das Sichtbarmachen der Injektion zu unterstützen. Die CAT-Assays wurden gemäß Chong und Vielkind (1989) durchgeführt. Für den CAT-Assay wurden Chargen von fünf 5 Tage alten Embryonen verwendet.
Für ausgebrütete Fische wurde für den CAT-Assay ein einzelner junger Fisch verwendet.

A-6 Gentransfer in Atlantischem Lachs durch Mikroinjektion.

Das 4 kb Insert in pOP-GHe wurde durch EcoRI-Verdau herausgeschnitten und in Kochsalzpuffer bei einer Konzentration von 3 ug/ml gelöst. Ungefähr 2-3 nl, 106 Kopien des DNA-Inserts wurden nach dem Verfahren der vorstehend erwähnten US-Patentanmeldung Ser. No. 278,463 durch das Mikropyle in das Zytoplasma eines befruchteten, nichtaktivierten Lachs-Eis injiziert (Fletcher et al. 1988). Ungefähr 500 Eier wurden injiziert. Die Überlebensrate betrug 80%, im Vergleich zur nichtinjizierten Kontrolle.

A-7 Synthese von Oligonukleotid-Primern für PCR

Für die PCR-Analyse wurden vier Primer vom Biotech Service Centre, Hospital for Sick Children, Toronto, Canada, synthetisiert. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, stammt Primer A, der sich bei Position +27 bis +47 relativ zur TATA-Box befindet, vom sense-Strang des OP-AFP-Gen-Promotors; Primer B, der sich bei Position +861 bis +881 relativ zur TATA-Box befindet, stammt vom antisense- Strang der 3'-flankierenden Region des OP-AFP-Gens. Primer C, der sich bei Position +161 bis +181 befindet, stammt vom sense-Strang der GH-kodierenden Sequenz; während Primer D, der sich bei Position +339 bis +359 befindet, vom antisense-Strang des GH-Gens stammt.
Primer A +27 5'-GTCAGAAGTCTCAGCTACAGC-3' +47 sense-Strang
Primer B +861 5'-ATCTCAACAGTCTCCACAGGT-3' +881 antisense-Strang
Primer C +161 5'-TCTGCTGATGCCAGTCTTACT-3' +181 sense-Strang
Primer D +339 5'-ACAGAAGTCCAGCAGGAATAT-3' +359 antisense-Strang
A-8 DNA-Isolierung aus Blutzellen für PCR
30 ul Blut wurden aus ein Jahr alten Fischen gesammelt. 1 ul Blut wurde in 50 ul 10 mM NaOH lysiert, 3 Minuten lang in einem Wasserbad gekocht, dann 3 min lang zentrifugiert. 2 ul des Überstands wurden direkt für die PCR verwendet.

A-9 PCR-Amplifikation

Die PCR wurde in 70 ul Reaktionsiösung durchgeführt, die 50 mM KCl, 10 mM Tris, 2,5 mM MgCl&sub2;, 1 uM jeden Primers, vier Desoxyribonukleotidtriphosphate müt jeweils 200 uM und 2,5 Units Taq-DNA-Polymerase (Promega) enthielt, und 100 ul Mineralöl wurde zugegeben, um Kondensation zu verhindern. Die Amplifikation wurde durch 3 min langes Denaturieren der DNA bei 92ºC gestartet, gefolgt von 30 PCR-Zyklen. Jeder Zyklus schloß eine 1 min lange Denaturierung bei 92ºC, ein 1 min langes Annealing bei 60ºC und eine 2 min lange Verlängerung bei 72ºC ein. Nach dem letzten Zyklus wurde die Reaktion weitere 10 min lang bei 72ºC gehalten, um die gesamte Reaktion zu vervollständigen. Die PCR wurde unter Verwendung des PTC-100 programmierbaren Wärmeregulierers (PTC-100 Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc. Ocala, FL) durchgeführt.

A-10 Analyse des PCR-Produkts durch Agarosegel-Elektrophorese und Southernblot

20 ul des amplifizierten Produkts wurden der Elektrophorese in einem 0,8% Adarosegel unterzogen, und die DNA-Produkte wurden durch Ethidiumbromid- Färbung sichtbar gemacht. Die DNA wurde auf eine Nylon-Membran (Amersham) für Southern-Analyse übertragen. Eine 17 bp-GH-spezifische Oligonukleotid-Sonde E, 5'-GAAAATGTTCAATGACT-3', von der Sequenz des GH-cDNA-sense-Strangs (+277 bis +294) des Königslachses (Fig. 2) wurde am Ende durch T4-Kinase mit 32P markiert und als Sonde für den Southernblot verwendet.

Versuchsprotokoll - zweite Serie von erfindungsgemäßen Ausführungsformen

B-1 Alternative Ausführungsform zur Konstruktion des Antigefrier-Promotor- CAT-Fusionsgens (opAFP-CAT) der Amerikanischen Aalmutter Das den opAFP-Gen-Promotor enthaltende 2,1 kb BamHl-BgIII-Fragment wurde aus dem Plasmid opAFP-GHc2 herausgeschnitten (Du et al., unveröffentlicht). Es wurde dann an den BamHI- und BgIII-Stellen in das Plasmid pBLCAT3 kloniert (Luckow und Schutz, 1987), um das opAFP-CAT-Fusionsgen zu erzeugen.

B-2 Alternative Konstruktion einer Expressionskassette "für alle Fische" opAPP- V.

Das Plasmid opAFP-GHc2, das aus opAFP-GHc durch Ersetzen der 73 bp nichttranslatierten 5'-Sequenz des GH-Gens durch eine 72 bp nichttranslatierte 5'-Sequenz des opAFP-Gens (Du et al., unveröffentlicht) gewonnen wurde, wurde mit PstI verdaut, dann mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit Alkalischer Phosphatase des Kälberdarms dephosphoryliert. Es wurde dann mit einem phosphorylierten 8 bp-Hpal-Linker (5'-CGTTAACG-3') ligiert. Das so erhaltene Plasmid, das den 2,1 kb opAFP-Gen-Promotor, die 63 bp nichttranslatierte 5'-Sequenz des opAFP-Gens und das Plasmid pUC enthielt, wurde mit HpaI und SaII verdaut, und dann mit dem 1, 2 kb HpaI-SaII- Fragment aus OP-5 ligiert (Hew et al., 1988). Dieses enthielt die 3'-Sequenz des opAFP-Gens. Das Endkonstrukt wurde als Vektor opAFP-V bezeichnet. Die DNA-Sequenz, die mit Ba startet und sich zur zweiten HindIII-Stelle H in Fig. 11 erstreckt, enthält 3350 bp, wie in Tabelle V gezeigt ist.

B-3 Transienter CAT-Assay in Lachszelllinien

RTH-149, eine Hepatomzelllinie der Regenbogenforelle und CHSE-214, eine Embryonenzelllinie des Königslachses wurden feundlicherweise von Dr. L. Gedamu, University of Calgary, Canada, zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden bei 18ºC in minimalem essentiellem Medium, ergänzt mit 25 mM HiEPES-Puffer (Gibco), aufbewahrt. Die Fischzellen wurden mit DNA durch Calciumphosphat-Copräzipitation mit Glycerin-Schock transfiziert. Die CAT-Assays wurden im wesentlichen gemäß Davies et al. (1986), für Fischzellen von Zafarullah et al. (1988) modifiziert, durchgeführt.

B-4 Transiente CAT-Assays in Japanischem Medaka

Japanische Medaka (Oryzias latipes) wurden in Dr. J. Vielkinds Laboratorium, Cancer Research Centre, Vancouver, gehalten. Die Reproduktionsaktivität der ausgewachsenen Tiere wurde mit künstlicher Photoperiode gemäß dem von Chong und Vielkind (1989) berichteten Verfahren induziert. An Weibchen haftende befruchtete Eier wurden 1-2 h nach dem Beginn des Lichts gesammelt und vor der Injektion bei 12ºC in Ringer-Lösung (0,75% NaCl, 0,02% KCl, 0,02% CaCl&sub2;, pH 7,3) aufbewahrt. Injizierte Medaka-Embryonen wurden in Medium gezüchtet, das 0,1% NaCl, 0,003% KCl, 0,004% CaCl&sub2;·2 H&sub2;O, 0,016 % MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,0001% Methylenblau enthielt, und sofort nach dem Ausbrüten in Aquariumwasser überführt.
Die supergeknäulte opAFP-CAT-Plasmid-DNA (ungefähr 500 pl, 106 Kopien) wurde in das Zytoplasma der befruchteten Medaka-Eier in Zellstadium 1 oder 2 mikroinjiziert. Phenolrot wurde in einer Endkonzentration von 0,25% zur DNA zugegeben, um das Sichtbarmachen während der Injektion zu unterstützen. Die CAT-Assays wurden gemäß Chong und Vielkind (1989) durchgeführt. Einzelne Embryonen wurden für jeden CAT-Assay verwendet.

B-5 DNA-Sequenzierung

Das Didesoxykettenabbruch-Sequenzierverfahren wurde eingesetzt, um opAFP-V zu sequenzieren. Eine Reihe von DNA-Fragmente verschiedener Längen enthaltenden Klonen wurden durch EXO-3-Nucleasedeletion (Promega Erase-a-Base Deletionskit) erzeugt. Aus diesen Klonen gereinigte Doppelstrang-DNA wurde als Matrize für die DNA-Sequenzierung (Pharmacia Sequenzierkit) verwendet.

Testergebnisse der vorstehenden Verfahren - ciemäß der ersten Serie von Ausführungsformen

1. Der AFP-Promotor der Amerikanischen Aalmutter kann in Zellen der Salmoniden in vitro funktionieren.

Um die Wirksamkeit des OP-AFP-Promotors zu testen, wurde das OP-CAT- Konstrukt für den CAT-Assay in die RTH-149-Zelllinie transfiziert. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, wurde CAT-Aktivität klar nachgewiesen. Das Niveau der sich aus OP-CAT ergebenden CAT-Aktivität war mit der aus pBLCAT2 vergleichbar, das den Thymidinkinase-Promotor aus dem Herpes simplex Virus hat. Wenn diese Zellen jedoch mit pBLCAT3, einem promotorlosen CAT-Konstrukt, transfiziert wurden, wurde geringe oder keine CAT-Aktivität nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Embryonenzellen des Königslachses (CHSE-124) und Herzzellen des Ketalachses (CHH-1) erhalten. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der OP-AFP-Promotor verwendet werden kann, um die GH-Genexpression in Salmoniden zielgerichtet einzusetzen. Obwohl den Salmoniden, einschließlich der Regenbogenforelle, das AFP-Gen fehlt, enthalten diese Zellen alle die Transkriptionsfaktoren, die für die Expression des AFP-Gens erforderlich sind.

2. Der AFP-Promotor der Amerikanischen Aalmutter kann in Japanischem Medaka in vivo funktionieren.

Um die Eignung des OP-AFP-Promotors beim Gentransfer weiter zu untersuchen, wurde das OP-CAT-Konstrukt in Medaka-Eier mikroinjiziert. Die CAT-Aktivität von Embryonen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung bestimmt. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, wurde CAT-Aktivität zuerst 48 Stunden nach der Injektion nachgewiesen, wobei die Aktivität das Maximum nach 6-7 Tagen erreichte und dann abzunehmen begann. Jedoch war die CAT-Aktivität selbst in ausgebrüteten Fischen (11-12 Tage) noch immer nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde die CAT-Aktivität nicht im nicht-injizierten Embryo oder im pBLCAT3-injizierten Embryo nachgewiesen. Dieses Ergebnis bestätigt, daß der OP-AFP-Promotor in verschiedenen Fischspezies aktiv ist.

3. Die Screening-Strategie auf PCR-Basis.

Um auf das Vorhandensein von Transgenlachs zu screenen, wurden drei verschiedene Primersätze verwendet, Primer AID, Primer CID und Primer A/B (Fig. 2). Die Grundlage zur Verwendung der Primer AIB ist, daß die Sequenzen von Primer A und Primer B spezifisch für das OP-AFP-Gen sind, das in Atlantischem Lachs fehlt. Daher kann die DNA vom Nicht-Transgenlachs bei Verwendung der Primer AIB für die PCR nicht amplifiziert werden. Nur die DNA vom Transgenfisch kann bei Verwendung der Primer AIB amplifiziert werden, und wird ein 855 bp-DNA-Fragment durch PCR erzeugen.
Die Grundlage zur Verwendung der Primer AID ist ähnlich wie die Verwendung von Primer AIB. Obwohl Primer D von der GH-cDNA des Königslachses stammt und mit dem endogenen GH-Gen des Atlantischen Lachses hybridisieren könnte, ist Primer A für das OP-AFP-Gen spezifisch. Folglich kann die DNA von Nicht-Transgenfisch bei Verwendung der Primer A/D nicht ampüfiziert werden. Nur die DNA von Transgenfisch kann amplifiziert werden und ein 333 bp- DNA-Fragment erzeugen.
Die Grundlage zur Verwendung der Primer C/D ist von der der anderen beiden Sätze verschieden. Die Sequenzen für die beiden Primer C und D stammen von der GH-cDNA des Königslachses, die mit dem GH-Gen des Atlantischen Lachses hybridisieren könnte. Deshalb kann die DNA vom Atlantischen Lachs bei Verwendung der Primer CID amplifiziert werden. Jedoch gibt es ein Intron (Intron 2) zwischen Primer C und Primer D, wobei der Abstand zwischen Primer C und Primer D 344 bp beträgt (Du und Hew, unveröffentlicht). Die Primer C/D erzeugen ein 344 bp-Fragment in allen DNA-Proben. Das Transgen pOP-GHe wurde unter Verwendung der GH-eDNA des Königslachses konstruiert, der das Intron fehlt. Der Abstand zwischen Primer C und Primer D beträgt 199 bp. Die Primer C/D erzeugen zwei Fragmente im Transgenlachs, ein 344 bp-Fragment vom endogenen GH-Gen und ein 199 bp-Fragment vom GH-cDNA-Insert.

4. Die Identifizierung von Transgenlachs durch PCR.

Eine Voranalyse der DNA, die aus 100 einen Monat alten Lachsembryonen extrahiert wurde, offenbarte, daß zwei von ihnen (2%) die injizierte Sequenz (pOP-GHe) enthielten.
Acht Monate nach dem Ausbrüten waren die Lachse groß genug, um sie zur Identifizierung zu markieren. Zu diesem Zeitpunkt wurden 50 der ungefähr 500 Lachse in einem Aquarium gewogen und Blutproben für die PCR-Analysen entnommen. Diese 50 schlossen die 14 größten Lachse in den Aquarien (> 8 g Körpergewicht) und 36 zusätzliche Fische mit Körpergewichten im Bereich von 5-14 g ein.
Düe PCR-Analyse wurde durchgeführt, ohne daß der Untersucher die Größe jedes Fisches kannte. Mit anderen Worten, die Analyse wurde "blind" ausgeführt, um sicherzugehen, jegliches Vorurteil durch den Untersucher zu vermeiden.
Acht Monate alten Atlantischen Lachsen, die sich aus den Eiern entwickelten, denen im November 1989 pOP-GHe injiziert worden war, wurde im Oktober 1990 Blut entnommen. Die DNA aus den kernhaltigen Blutzellen wurde direkt für die PCR-Analyse unter Verwendung von Primer A/D eingesetzt, um das Vorhandensein des pOP-GHe-Transgens zu bestimmen. Von 50 analysierten Fischen waren acht positiv. Wie in Fig. 5A gezeigt ist, wurde ein 333 bp- Fragment von den Lachsen #14, #20, #28, #31, #34, #42, #11, #25 und der Positivkontrolle (pOP-GHe) erzeugt. Im Gegensatz dazu fehlte dieses 333 bp- Fragment in den nicht-injizierten Lachsen. Die Größe des Amplifikationsfragments (333 bp) entspricht der aus der Transgen-Sequenz vorhergesagten Größe.
Urn zu bestätigen, daß das amplifizierte 333 bp-DNA-Fragment vom Transgen pOP-GHe stammte, wurde die DNA auf eine Nylonmembran für Southernblot überführt, die mit einer GH-spezifischen Sonde E (Fig. 2) hybridisiert wurde, welche von der Sequenz zwischen dem Primer A und Primer D stammte. Das Ergebnis zeigt, daß alle 333 bp-Fragmente mit der Sonde E hybridisierten ( Fig. 5B). Dies bestätigte, daß das 333 bp-DNA-Fragment in der Tat vom Transgen pOP-GHe stammte.
Urn weiter zu bestätigen, daß das Transgen pOP-GHe in den positiven Fischen vorhanden war, wurde die DNA unter Verwendung der Primer C/D amplifiziert. Wie in der Screening-Strategie diskutiert ist, wurde das erwartete, vom endogenen GH-Gen des Atlantischen Lachses stammende 344 bp-DNA-Fragment in allen analysierten Lachsen gefunden. Ein zusätzliches kleineres DNA-Fragment (199 bp) wurde von den Fischen #14, #20, #28, #31, #34 und #42, #11 und #25 gefunden (Fig. 6A). Dieses 119 bp-Fragment stammte vom GH- Transgen des Königslachses. Diese positiven Fische waren dieselben, wie die, die bei Verwendung der Primer A/D erhalten wurden. Dies bestätigt folglich, daß die Fische #14, #20, #28, #31, #34, #42, #11 und #25 Transgenlachse waren.

5. Die GH-kodierenden Regionen der Transgene sind im Transgenlachs intakt.

Um die Integrität der GH-kodierenden Sequenz des Transgens zu bestimmen, wurden die Primer AIB für die PCR-Analyse verwendet. Der Primer A und der Primer B stammten aus den 5'- und 3'-Sequenzen des OP-AFP-Gens, die sich außerhalb von 5' und 3' der GH-kodierenden Sequenz im Transgen befinden (Fig. 2). Daher sollte bei Verwendung der Primer AIB ein 855 bp-DNA-Fragment erzeugt werden, um die DNA des Transgenfisches zu amplifizieren, wenn die GH-kodierende Sequenz im Transgen im Transgenfisch intakt war. Wie in Fig. 6B gezeigt ist, wurde ein 855 bp-Fragment in allen acht positiven Fischen gefunden. Dies zeigte, daß das GH-Transgen im Transgenlachs intakt war.

6. Die Wachstumsleistung der Transgenfische.

a. Gewicht der Transgenfische

Die PCR-Analyse zeigte, daß acht Fische transgen waren. Zwei Fische (#11, #25) starben im Juli 1990. Deshalb wurden nur die sechs verbliebenen Transgenfische analysiert.
Unter den sechs Lachsen, von denen festgestellt würde, daß sie für das Wachstumshormon-Genkonstrukt transgen waren, waren fünf, die zu den sechs größten Fischen im Aquarium gehörten. Die Chancen, dies zufällig zu beobachten, sind äußerst gering. Das mittlere Gewicht der sechs Transgenfische betrug 29,2 ± 0,3 g. Das mittlere Gewicht aller 459 Fische im Aquarium betrug 5,06 ± 1,0 g. Folglich waren die Transgenfische im Mittel viermal größer als die Nicht-Transgenkontrolltiere und ungefähr sechsmal so groß wie die mittlere Größe der Lachse im Aquarium. Der größte Transgenfisch im Aquarium war achtmal größer als die Nicht-Transgenkontrolltiere.

b. Die Wachstumsrate der Transgenfische

Um die Wachstumsraten abzuschätzen, wurden die 50 Fische, denen Blutproben entnommen und die markiert worden waren, 100 Tage später erneut gewogen. Die mittlere Wachstumsrate der sechs Transgenlachse während dieses Zeitraums betrug 0,766 ± 0,18% pro Tag, während die 24 Nicht-Transgenfisehe mit 0,224 ± 0,03% pro Tag wuchsen. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant.

c. Gewichte der Transgenfische

Die Körpergewichte der beiden Transgenlachse, die im Juli 1990 gestorben waren, die Nummern 11 und 25, betrugen 8,07 g bzw. 12,1 g. Diese Lachse waren beträchtlich größer als alle anderen Lachse im Aquarium zu der Zeit. Das mittlere Körpergewicht von 10 zufällig aus den ungefähr 500 Fischen im Aquarium ausgewählten Fischen betrug 1,4 ± 0,17 g.
Die Größenhäufigkeitsverteilung aller 200 Lachse, die im Oktober 1990 gewogen wurden, einschließlich der 50, denen Blut abgenommen wurde und die markiert wurden, ist in Fig. 13A dargestellt. Von den sieben Transgenlachsen, die unter den 50 Fischen, von denen Proben genommen worden waren, gefunden wurden, waren sechs die größten Fische im Aquarium (Fig. 13A). Das mittlere Körpergewicht der 200 Fische betrug 5,91 ± 0,43 g. Die Körpergewichte der drei größten Transgenlachse waren größer als dieses Mittel, zuzüglich von zwei Standardabweichungen. Das mittlere Körpergewicht der sieben Transgenfische betrug 27,3 ± 7,8 g, während die 43 Nicht-Transgengeschwister 7,4 ± 0,26 g wogen. Folglich waren die Transgenfische im Mittel 3,7mal größer als ihre Nicht-Transgengeschwister. Der größte Transgenlachs (#28, 65,8 g) wies das 8,9fache des mittleren Gewichts der Kontrolltiere auf. Die drei größten Transgenlachse hatten alle Eigenschaften der Musterungen von Salmlingen (bevor sie das Frischwasser verlassen) verloren und hatten die silbrige Erscheinung von Junglachsen (wenn sie das Frischwasser verlassen) angenommen (Fig. 12). Das Wachstumshormon ist in diesen Prozeß verwickelt worden.
Die Größenhäufigkeitsverteilung aller im Januar 1991 vorhandener 494 Fische und die Gewichte der einzelnen Transgenfische sind in Fig. 12B dargestellt. Der größte Transgenlachs, von dem Proben genommen wurde, starb im Oktober 1990 (#28) im Anschluß an die Blutprobennahme und ist in der Figur nicht aufgeführt.
Das mittlere Körpergewicht aller (484) Lachse im Aquarium betrug 6,36 ± 0,26 g. Das mittlere Körpergewicht der Nicht-Transgenlachse (476 Fische) betrug 5,94 ± 0,14 g, während das mittlere Gewicht der Transgenfische 37,0 ± 10,2 g betrug; es war damit ungefähr sechsmal größer als das der Nicht-Transgenfische. Fünf der acht Transgenfische in dieser Gruppe hatten Körpergewichte, die zwei Standardabweichungen des Mittelwerts für das Aquarium überstiegen. Die Körpergewichte von zwei der 476 Nicht-Transgenlachse überstiegen auch zwei Standardabweichungen des Aquariummittels. Das Gewicht des größten Transgenlachses im January 1991 (#31, 76,7 g) war ungefähr 13mal so groß wie das mittlere Gewicht der Kontrolltiere.
Die Wachstumsraten der Transgenlachse (6) und die von deren Nicht-Transgenfischgeschwistern (43) von Oktober 1990 bis Januar 1991 sind in Tabelle VI dargestellt. Daraus ist erkennbar, daß die Transgenlachse im Mittel merklich größer waren und merklich schneller an Gewicht und Länge wuchsen als die im selben Aquarium aufgezogenen Nicht-Transgenfische. Außerdem waren die Zustandsfaktoren der Transgenfische leicht, aber merklich niedriger als die der Kontrolltiere. Die Gewichtszunahmen der Transgenfische bewegten sich von 0,48 bis 1,6% pro Tag. Nur zwei der 43 Nicht-Transgenfischkontrolltiere wiesen Wachstumsraten auf, die die des am langsamsten wachsenden Transgenfisches überstiegen.
(Smolting) ist ein sehr kompliziertes Transformationsverfahren, das viele morphologische und physiologische Änderungen einschließt (siehe Übersichtsartikel von Hoar 1988). Eine der morphologischen Änderungen ist die Silberfärbung von Junglachs. In unseren Untersuchungen färbt sich der Transgenlachs früher als die Kontrolltiere. Dies legt nahe, daß Transgenlachs früher zu Junglachs wird (Fig. 8). Es ist berichtet worden, daß die Fischgröße und die Vllachstumsrate die bedeutenden Faktoren beim Regulieren der Farbänderung des Lachses vom Salmling zum Junglachs (smolting) zu sein scheint (siehe Übersichtartikel von Hoar 1988). Dies wird durch unsere Beobachtung unterstützt, daß Transgenlachs früher zu Junglachs wird als die Kontrolltiere. Deshalb scheint der Transgenlachs ein gutes Modell für die Untersuchung der Farbänderung des Lachses vom Salmling zum Junglachs (smolting) zu sein.

Testergebnisse der vorstehenden Verfahren gemäß der zweiten Serie von Ausführungsformen

1. Der AFP-Promotor der Amerikanischen Aalmutter kann in Zellen der Salmoniclen in vitro funktionieren.

CAT-Assays wurden verwendet, um die Wirksamkeit des opAFP-Promotors zu testen. Das opAFP-CAT-Konstrukt wurde in zwei Zelilinien der Salmoniden, RTH-149, einer Hepatomzelllinie der Regenbogenforelle, und CHSE-124, einer Ernbryozelllinie des Königslachses, transfiziert. Wie in Fig. 9 gezeigt ist, wurde CAT-Aktivität in beiden von ihnen klar nachgewiesen. Die Höhe der CAT-Aktivität, die sich aus opAFP-CAT ergab, war mit der aus pBLCAT2 vergleichbar, das den Thymidinkinase-Promotor aus dem Herpes simplex-Virus hat. Wenn diese Zellen mit pBLCAT3, einem promotorlosen CAT-Konstrukt, transfiziert wurden, wurde geringe oder keine GAT-Aktivität nachgewiesen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß diese Zellen die für die Grundexpression des AFP-Gens erforderlichen Transkriptionsfaktoren enthalten, was ihre Nützlichkeit in Transgenuntersuchungen anzeigt, obwohl den Zellen der Salmoniden das AFP-Gen fehlt.

2. Der AFP-Gen-Promotor der Amerikanischen Aalmutter kann in Embryonen des Japanischen Medaka in vivo funktionieren.

Um die Eignung des opAFP-Gen-Promotors beim Gentransfer weiter zu untersuchen, wurde das opAFP-CAT-Konstrukt in Medaka-Embryonen in Zellstadium 1 oder 2 mikroinjiziert. Die CAT-Aktivität wurde von einzelnen Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten während der embryonalen Entwicklung bestimmt. Wie in Fig. 10 gezeigt ist, wurde CAT-Aktivität zuerst zwei Tage nach der Injektion nachgewiesen. Die Aktivität erreichte ein Maximum nach 6-8 Tagen. Dann begann die CAT-Aktivität abzunehmen. Jedoch war die CAT-Aktivität selbst in ausgebrüteten Fischen (11 Tage) noch immer nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde geringe oder keine CAT-Aktivität in nicht-injizierten Embryonen oder Embryonen, denen pBLCAT3 injiziert wurde (Daten nicht gezeigt), nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß der opAFP-Gen- Promotor in vivo in verschiedenen Fischspezies aktiv war, denen die AFP-Gene fehlen.
3. Design und Konstruktion einer universalen Gentransferkassette, opAFP-V. Die vorstehenden Ergebnisse aus dem CAT-Assay in Zeillinien der Salmoniden und Medaka-Embryonen legen nahe, daß der opAFP-Promotor in Fischen aktiv ist, die AFP normalerweise nicht exprimieren. Dies wird ferner durch unsere jüngsten GH-Gen-Transferuntersuchungen in Atlantischem Lachs unterstützt. Wenn der opAFP-Gen-Promotor mit der GH-cDNA des Lachses ligiert und das Fusionsgen in Ätlantischen Lachs mikroinjiziert wurde, zeigte der Transgenlachs eine dramatische Steigerung der Wachstumsraten (Du et al. 1992). Insgesamt zeigen diese Versuche an, daß der opAFP-Promotor in verschiedenen Fischspezies aktiv ist.
Um die Verwendung des opAFP-Gen-Promotors als nützliches Vehikel für Gentransferuntersuchungen zu erleichtern, und um die Konstruktion anderer Fusionsgene unter Verwendung dieses Promotors zu vereinfachen, wurde ein Expressionsvektor, opAFP-V, unter Verwendung des opAFP-Gen-Promotors, der nichttranslatierten 5'-Sequenz und der 3'-Sequenz des opAFP-Gens in pUC kloniert. Der 2,1 kb-Promotor ist für aktive Transkription erforderlich, und die 1,2 kb-3'-Sequenz ist für die Polyadenylierung und die Transkriptionstermination bevorzugt. Wie in Fig. 11 gezeigt ist, wurde der 2,1 kb-opAFP-Gen-Promotor mit der 63 bp nichttranslatierten 5'-Sequenz des opAFP-Gens durch eine einzigartige BgIII-Stelle verbunden, und die nichttranslatierte 5'-Sequenz wurde mit ihrer 3'-Sequenz durch eine einzigartige HpaI-Stelle verbunden. Wo und wie ein Gen in diesen Vektor zu insertieren ist, hängt vom Wesen des zu insertierenden Gens ab, d. h. eine cDNA oder eine genomische DNA, mit oder ohne ihre/r eigeneln nichttranslatierte/n 5'-Sequenz.
Um eine cDNA-Sequenz, die eine kurze oder keine nichttranslatierte 5'-Region enthält, in opAFP-V zu insertieren, sollte die Insertion an der HpaI-Stelle sein, die sich gleich nach der nichttranslatierten 5'-Sequenz des opAFP-Gens befindet. Die HpaI-Stelle ist die einzige HpaI-Stelle im Vektor. Folglich kann er durch Einzel-HpaI-Verdau gespalten werden, und cDNA-Klone von Interesse ohne die nichttranslatierte 5'-Sequenz können direkt in diese einzigartige HpaI-Stelle kloniert werden. Die nichttranslatierte 5'-Region vom opAFP-Gen kann als Leitsequenz für Ribosomenscanning für Translationsinitiation dienen.
Urn eine cDNA-Sequenz mit einer relativ langen nichttranslatierten 5'-Region zu insertieren, könnte die Insertion gezielt auf die einzigartige BgIII-Stelle gerichtet werden, die sich vor der nichttranslatierten 5'-Sequenz des opAFP-Gens befindet. Um die Anwesenheit der zusätzlichen, nichttranslatierten 5'-Sequenz des opAFP-Gens zu verhindern, kann die nichttranslatierte 5'-Sequenz des opAFP- Gens durch BgIII/HpaI-Verdau entfernt werden. Die Insertion könnte sich auch an der HpaI-Stelle befinden und eine mRNA mit einer langen nichttranslatierten 5'-Fusionssequenz erzeugen.
Weil genomische Gene ihre eigenen 3'-Sequenzen enthalten, die als Transkriptionsterminator wirken, ist die 3'-Sequenz des opAFP-Gens für das Klonieren genomischer Gene nicht erforderlich. Die 3'-Sequenz des opAFP-Gens kann je nach der Länge der nichttranslatierten 5'-Sequenz im insertierten genomischen Gen durch BgIII/SaII- oder HpaI/SaII-Verdau aus dem Vektor entfernt werden. Wie in Fig. 11 gezeigt ist, sind mehrere zusätzliche einzigartige Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden im Vektor vorhanden, wie EcoRI-, KpnI-, SmaI- und BamHI-Stellen am 5'-Ende, und PstI, SaII, BamHI, SmaI und EcoRI am 3'-Ende. Diese ermöglichen das Ausschneiden des intakten Fusionsgens aus dem Vektor.

4. Die vollständige DNA-Sequenz von opAFP-V.

Urn die Analyse des Einbaus und der Expression des Transgens mit diesem Vektor zu fördern, wurde die vollständige DNA-Sequenz von opAFP-V bestimmt. Die vollständige Länge von opAFP-V beträgt 6027 bp, wobei 2677 bp aus der pUC-Sequenz (Yanisch-Perron et al., 1985) und 3350 bp aus der opAFP-DNA-Sequenz abstammten. Die vollständige opAFP-DNA-Sequenz ist in Tabelle V gezeigt. Der opAFP-Gen-Promotor umspannt 2,1 kb, es befinden sich eine "CAAT"-Box und eine "TATA"-Box bei den Positionen 2006 bzw. 2049. Im Anschluß an die Promotor-Sequenz befindet sich die nichttranslatierte 5'-Sequenz des opAFP-Gens, die mit dem Promotor durch einen synthetischen BglII-Linker verbunden ist (bei Position 2116). Die genaue Größe der nichttranslatierten 5'-Sequenz ist nicht bekannt, weil die Amerikanische Aalmutter (ocean pout) 150 Kopien des AFP-Gens aufweist (Hew et al., 1988), die sehr ähnliche, aber nicht identische Genstrukturen aufweist. Deshalb ist es schwierig, die CAP-Stelle für dieses bestimmte AFP-Gen zu bestimmen. In Eukaryotengenen befindet sich gewöhnlich eine CAP-Stelle 25-30 bp strangabwärts von der "TATA"-Box. Deshalb ist die nichttranslatierte 5'-Sequenz des opAFP-Gens etwa 90 bp lang. Die im opAFP-V vorhandene nichttranslatierte 5'-Sequenz ist 63 bp lang und befindet sich zwischen den BgIII und HpaI-Stellen. Die 3'-Sequenz des opAFP-Gens ist mit dem Promotor und der nichttranslatierten 5'-Sequenz durch eine einzigartige HpaI-Stelle verbunden (bei Position 2188). Die 3'-Sequenz umspannt 1, 2 kb und enthält eine 80-90 bp nichttranslatierte 3'-Sequenz und eine 1, 1 kb flankierende 3'-Sequenz. Ein Poly(A)Signal "AATAAA" und ein mögliches Transkriptionsterminationssignal "CT" befinden sich bei Position 2253 bzw. 2285.
Die DNA-Sequenz des opAFP-Gens wurde auf das Vorhandensein irgendwelcher leber-spezifischer Sequenzen analysiert. Zwei 17 bp-Fragmente mit 70% Identität zum leber-spezifischen Promotor-Element HPI des Xenopus albumin- Gens (Schorpp et al., 1988) wurden bei den Positionen 1004 bis 1020 und 1944 bis 1960 nachgewiesen (Tabelle V). Diese beiden Fragmente befanden sich bei ungefähr -1 kb bzw. -100 bp strangaufwärts von der CAP-Stelle. Die Xenopus aibumin-HPI-Sequenz wird als die Bindungsstelle für einen leber-spezifischen Transkriptionsfaktor LF-B1 (De Simone und Cortese, 1988) nahegelegt. Jedoch bleibt die Funktion dieser beiden mutmaßlichen leber-spezifischen Sequenzen zu untersuchen.
In jüngerer Zeit ist die PCR ein nützliches Werkzeug zur DNA-Analyse geworden, wenn die DNA-Quelle begrenzt ist. Die PCR ist beim Screenen der Transgenmaus verwendet worden (Chen und Evans 1990). Die Blutzellen wurden durch SDS lysiert, und die DNA wurde direkt für die PCR verwendet. Jüngst berichteten Hanley und Merile (1991) vom Transgennachweis in der Maus durch PCR unter Verwendung ungereinigter Schwanz-DNA. Unsere Daten zeigten, daß 1 ul Blut zum Screenen von Transgenfisch direkt durch PCR ausreichend ist. Dieses Protokoll ist für die Routine-Analyse im Laboratorium zum Nachweis mehrerer tausend Proben übernommen worden.
Es ist anerkannt, daß es andere Promotorsysteme gibt, die erfindungsgemäß in einem Transgenfisch-Genkonstrukt gleichermaßen funktionieren. Diese schließen Promotor-Sequenzen ein, die aus Seewolf (wolffish), Amerikanischer Scholle (winter flounder) und Seehase (sea raven) sowie aus anderen AFP- oder AFGP-haltigen Fischen isoliert wurden.
Aus der vorstehenden Diskussion verschiedener Ausführungsformen der Erfindung wird deutlich, daß es natürlich viele funktionelle Äquivalente zu den angegebenen Sequenzen gibt, nicht nur bezüglich der bestimmten Sequenz von Tabelle V, sondern ebenso gezeigt für die Promotor-Sequenzen, die aus anderen Spezies als der Amerikanischen Aalmutter, nämlich dem Seewolf, isoliert wurden, wie in Tabelle IV beschrieben ist, soweit sich diese Ausführungsformen auf den Promotor, die fakultative nichttranslatierte 5'-Sequenz als Genvorstufe und die 3'-Terminalsequenz beziehen. Die erfindungsgemäße Promotor-Sequenz ist auf verschiedene Gen-Produkte anwendbar, weil sie aus Fischgenen abstammt und deshalb mit verschiedenen Fischarten verträglich ist. Folglich wird die Promotor-Sequenz als Genkonstrukt "für alle Fische" bezeichnet. Im Hinblick auf den Vorteil der Promotor-Sequenz, leber-spezifisch oder leber-vorherrschend für die Expression zu sein, das ein für die Synthese und Selkretion von Transgenprodukten gut geeignetes Gewebe ist, gibt es vielfältige AFP/AFGP-Promotoren, die zum Herstellen des Genkonstrukts "für alle Fische" nützlich sind (Gong et al., 1992).
Hinsichtlich der in den meisten Fischspezies fehlenden AFP-Promotor-Sequenz wird der Nachweis von Transgenspezies leicht durch PCR oder andere Formen von Gensequenz-Amplifikationsverfahren, wie Ligase-Kettenreaktion, ermöglicht. Weil außerdem die meisten Fische diese AFP-Gene nicht enthalten, ist es leichter, das Transgen unter Verwendung des AFP-Promotors zu modifizieren, ohne die Leistung endogener Gene zu beeinflussen. Auch die AFP-Gen-Sequenz, einschließlich sowohl der 5'- als auch der 3'-Enden, enthält funktionelle DNA-Sequenzen, die wichtig für normale DNA-Transkription und -Termination und gewebespezifische Expression sind. Diese DNA-Sequenzen können ferner modifiziert werden, um ihren Erfahrungsstand nach Wunsch zu verbessern, umd auf viele Signale von außen, wie Hormone, Wachstumsfaktoren etc., ansprechen.
Olawohl bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung hier ausführlich beschrieben werden, ist es für den Fachmann selbstverständlich, daß Veränderungen dazu innerhalb des Schutzumfangs der anhängenden Ansprüche gemacht werden können. Tabelle I TABELLE 1I PROMOTOR-ANALYSE DES ANTIGEFRIER-GENS IN RTH-ZELLLINIE UND IN EMBRYONEN DES JAPANISCHEN MEDAKA (JAPANESE MEDAKA) TABELLE II (Forstsetzung) TABELLE III TABELLE III (Fortsetzung)
Die vollständige Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Königslachs-GH. ↑ zeigt die Spaltungs-Stelle zwischen der Signal-Sequenz und dsm vollentwickelten Protein. Das Polyadenylierungssignal AATAAA ist unterstrichen. TABELLE IV
TABELLE V
Die vollständige DNA-Nukleotid-Sequenz der Amerikanischen Aalmutter in opAFP-V. Die "CAAT"- und "TATA"-Sequenzen sind umrandet; das Poly(A)-Signal (AATAAA) und das vorhergesagte Transkriptionsterminationssignal (TTTTTCT) sind durch Doppellinien unterstrichen; die beiden mutmaßlichen leber-spezifischen Sequenzen sind durch Einfachlinien unterstrichen; und die einzigartigen BgIII- und HpaI-Stellen für die Gen-Insertion sind angezeigt. TABELLE V Fortsetzung) TABELLE V Fortsetzung) TABELLE V Fortsetzung) TABELLE V Fortsetzung) TABELLE V Fortsetzung) TABELLE VI
Transgenlachse und deren Geschwister wurden aus Eiern entwickelt, denen das GH-Gen-Konstrukt injiziert wurde und die im selben Aquarium kultiviert worden waren. Kontroll-Lachse wurden aus nicht-injizierten Eiern entwickelt. Der Zustandsfaktor ist ein Maß für das Gewicht pro Längeneinheit; berechnet als Gewicht/Länge³ x 1000. Alle Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben. Die Zahlen in Klammern zeigen die Anzahl der analysierten Fische oder der analysierten Proben an. Statistische Vergleiche wurden zwischen Transgenlachsen und Geschwistern oder Kontrolltieren angestellt.

Claims

1. Transgenfisch, dadurch gekennzeichnet, daß in seinem Genom ein chimeres Genkonstrukt eingebaut ist, bei dem das chimere Genkonstrukt einen Typ III AFP-Promotor; und eine Gensequenz für ein Fischwachstumshormon umfaßt.

2. Transgenfisch nach Anspruch 1, bei dem der Typ III AFP-Promotor aus einem Fisch erhalten wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Amerikanischer Aalmutter (ocean pout), Seewolf (wolffish), Kormoran (sea raven) und Amerikanischer Scholle (winter flounder).

3. Transgenfisch nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Typ III AFP-Promotor die Sequenz der Tabelle V vom 5'-Ende bei Basenposition 1 bis zur Basenposition 2115 umfaßt.

4. Transgenfisch nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem das Genkonstrukt die Transkriptionsterminalsequenz von Tabelle V von Basenpaarposition 2188 bis zum 3'-Ende bei Basenpaarposition 3350 umfaßt.

5. Transgenfisch nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem das chimere Genkonstrukt eine kombinierte Promotor- ITranskriptionsterminalsequenz umfaßt, die eine nichttranslatierte 5'-Sequenz zwischen dem Promotor und der Transkriptionsterminalsequenz einschließt und bei dem die kombinierte Sequenz die Sequenz von Tabelle V mit einzigartigen Restriktionsstellen von BgIII bei Basenpaarposition 2116 und von HpaI bei Basenpaarposition 2188 aufweist.

6. Transgenfisch nach Anspruch 5, bei dem die nichttranslatierte 5'-Sequenz zwischen den Stellen BgIII und HpaI entfernt ist.

7. Transgenfisch nach Anspruch 6, bei dem eine zu exprimierende chimere Gensequenz bei der Bglil-Stelle oder der HpaI-Stelle insertiert ist.

8. Transgenfisch nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem das Genkonstrukt vorwiegend in Fischleber exprimiert wird.

9. Transgenfisch nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Fisch Lachs, Amerikanische Aalmutter (ocean pout), Kormoran (sea raven) odier Seewolf (wolffish) ist.

10. Test zur Bestimmung eines Transgenfisches nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der die folgenden Schritte umfaßt:

I. Amplifizieren eines Teils des Fischgenoms mit einer DNA-Sequenz, die ein Teil der Promotorsequenz von Tabelle V ist, durch DNA-Sequenz-Amplifikationsverfahren; und

II. Detektieren des Vorhandenseins des amplifizierten Teils, um einen Transgenfisch anzuzeigen.

11. Test nach Anspruch 10, bei dem die im PCR-Amplifikationsverfahren verwendeten Primer aus Sequenzfragmenten von Tabelle V vom 5'-Ende bis zur BgIII-Stelle ausgewählt sind.

12. Test nach Anspruch 11, bei dem die Primer ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus

Primer A + 275'-GTCAGAAGTCTCAGCTACAGC-3' + 47 sense-Strang;

Primer B + 8615'-ATCTCAACAGTCTCCACAGGT-3' + 881 antisense-Strang;

Primer C + 1615'-TCTGCTGATGCCAGTCTTACT-3' + 181 sense-Strang; und

Primer D + 3395'-ACAGAAGTCCAGCAGGAATAT-3' + 359 antisense-Strang.

13. Eine nichttranslatierte 5'-Sequenz zwischen den Promotor- und Terminalsequenzen einschließende Promotorsequenzllrans-kriptionsterminalsequenz, wobei die kombinierten Sequenzen die Sequenz von Tabelle V mit einzigartigen Restriktionsstellen von BgIII bei Basenpaarposition 2116 und von HpaI bei Basenpaarposition 2188 aufweisen.

14. Promotor-/Terminalsequenz nach Anspruch 13, bei der die nichttranslatierte 5'-Sequenz zwischen den Stellen BgIII und HpaI entfernt ist.

15. Promotor-/Terminalsequenz nach Anspruch 13 oder 14, bei der eine zu exprimierende chimere Gensequenz an der BgIII-Stelle oder an der HpaI-Stelle insertiert ist.

16. Chimeres Genkonstrukt, das einen Promotor umfaßt, der die DNA-Sequenz von Tabelle V vom 5'-Ende bei Basenpaarposition 1 bis zur Basenposition 2115 aufweist.

17. Chimeres Genkonstrukt, das eine Transkriptionsterminalsequenz umfaßt, bei der die Sequenz die DNA-Sequenz von Tabelle V von Basenpaarposition 2188 bis zum 3'-Ende bei Basenpaarposition 3350 aufweist.

18. Fischwirt, der mit einem chimeren Gen nach Anspruch 16 oder 17 transformiert ist.

19. Wirt nach Anspruch 18, bei dem der transformierte Wirt eine Fischembryozelle ist.