DE69807687T2

DE69807687T2 - Transgenfisch mit gewebespezifischer expression

Info

Publication number: DE69807687T2
Application number: DE69807687T
Authority: DE
Inventors: Shuo Lin
Original assignee: Medical College of Georgia Research Institute Inc
Current assignee: Augusta University Research Institute Inc
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2018-06-10
Also published as: JP2002504821A; DE69807687D1; ES2179512T3; EP1240824A1; ATE223483T1; WO1998056902A2; US6380458B1; AU7955898A; EP0986640B1; AU754993B2; CA2293722A1; US20100212038A1; US20020178461A1; EP0986640A2; PT986640E; WO1998056902A3; DK0986640T3

Description

Grundlage der Erfindung

Die offenbarte Erfindung liegt auf dem Gebiet transgener Fische und spezifischer in dem Bereich transgener Fische, die eine Gewebe-spezifische Expression eines Transgens aufweisen.
Die Transgentechnologie ist ein wichtiges Werkzeug für das Studium der Gen- und Promotorfunktion geworden (Hanahan, Science 246: 1265-75 (1989); Jaenisch, Science 240: 1468-74 (1988)). Die Fähigkeit, zu exprimieren und die Expression der Gene im Gesamttier zu studieren, kann durch die Verwendung transgener Tiere erleichtert werden. Die Transgentechnologie ist auch ein nützliches Werkzeug der Zellstammbaumlinien-Analyse und für Transplantationsexperimente. Studien an der Promotorfunktion oder Stammbaum-Analysen benötigen gewöhnlich die Expression eines fremden Reportergens, wie das bakterielle lacZ -Gen. Die Expression eines Reportergens kann die Identifikation von Geweben, die ein Transgen beherbergen, erlauben. Beispielhaft wurde die transgene Expression, an fixierten Tieren, durch in situ Hybridisierung oder durch Histochemie identifiziert. Leider schränkt die Unfähigkeit, transgene Expression im lebenden Tier leicht zu detektieren die Nutzung dieser Technologie erheblich ein, im besonderen für Stammbaum-Analysen.
Ein fesselndes Paradigma für das Verständnis der Genexpression, Entwicklung und Genetik von Tieren, namentlich des Menschen, ist das Studium weniger komplexer Organismen, wie das von Escherichia coli, Drosophila und Caenorhabditis. Die Hoffnung ist, dass das Verständnis dieser Prozesse in einfachen Organismen Relevanz besitzen wird für ähnliche Vorgänge in Säugern und Menschen. Das Problem ist, den Nachteil zu akzeptieren, dass ein experimenteller Organismus nur entfernt zum Menschen verwandt ist, für den Vorteil einfacher Manipulation, schneller Generationszeiten und eher direkter Interpretation der Resultate in dem experimentellen Organismus. Der Nachteil dieses Problems kann verringert werden durch die Nutzung eines Organismus, der so nahe verwandt wie möglich zum Menschen ist, während er so viele Vorteile der weniger komplexen Organismen beibehält. Das Problem besteht darin, geeignete Organismen für solche Studien zu finden und noch wichtiger, die nötigen Werkzeuge zu entwickeln, solche Organismen zu manipulieren.
Von einigen Beispielen von Zelldetermination in Invertebraten ist gezeigt worden, dass sie sich in progressiven Wellen ereignen, die durch sequenzielle Kaskaden von Transkriptionsfaktoren reguliert werden. Weit weniger ist über die Prozesse in Vertebraten bekannt. Ein integrieter Ansatz, der embryologische, genetische und molekulare Methoden kombiniert, wie der zum Studium der Entwicklung in Drosophila (zum Beispiel, Ghysen et al., Genes & Dev 7: 723-33 (1993)), würde die Identifikation der molekularen Mechanismen, die in die Spezifizierung des neuronalen Schicksals in Vertebraten involviert sind, fördern, aber solch ein Ansatz wurde durch das Fehlen robuster genetischer und molekularer Werkzeuge für die Nutzung in Vertebraten behindert.
Die Transgentechnologie wurde zu verschiedenen Zwecken auf den Fisch angewendet. Zum Beispiel, wurde die Transgentechnologie auf einige, kommerziell wichtige Varianten von Fisch angewendet, primär in dem Versuch, ihre Kultur zu verbessern. Die Anwendung der Transgentechnologie in Fischen wurde einer Revision durch Moav, Israel J. of Zoology 40: 441-466 (1994), Chen et al., Zoological Studies 34: 215-234 (1995), und Iyengar et al., Transgenic Res. 5: 147-166 (1996) unterzogen.
Stuart et al., Development 103: 403-412 (1988), beschreiben die Integration fremder DNA in Zebrafischen, beobachten aber keine Expression. Stuart et al, Development 109: 577-584 (1990), beschreiben die Expression eines Transgens von SV40 und Rous Sarcoma Virus Transkriptions-regulatorischen Sequenzen in Zebrafischen. Obwohl die Expression in einem Muster von Geweben gesehen wurde, war die Expression innerhalb eines Gewebes wechselvoll. Außerdem, da Stuart et al. (1990) transgene Organismen über die Expression und nicht über die Anwesenheit des Transgens auswählte, würden nicht exprimierende transgene Organismen bei ihrer Analyse übersehen worden sein. Culp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7953-7957 (1991), beschreiben die Integration und Keimbahn-Transmission von DNA in Zebrafischen. Obwohl die verwendeten Konstrukte das Rous Sarcoma Virus LTR oder den SV40 Enhancer-Promotor verbunden mit einem LacZ-Gen enthielten, war keine Expression zu beobachten. Bayer und Campos-Ortega, Development 115: 421-426 (1992), beschreiben die Integration und Expression eines lacZ-Transgens in Zebrafischen, das einen minimalen Promotor (ein Maushitzeschock-Promotor) aber keine stromaufwärts gelegenen regulatorischen Sequenzen besitzt. Die erhaltene Expression war abhängig vom Ort der Integration, andeutend dass endogene Sequenzen am Ort der Integration des Fisches für die Expression verantwortlich waren. Westerfield et al., Genes & Development 6: 591-598 (1992), beschreiben eine kurzzeitige Expression von β-Galactosidase im Zebrafisch, die von Hox-Genpromotoren aus der Maus und dem Menschen gesteuert ist. Lin et al., Dev. Biology 161: 77-83 (1994), beschreiben eine transgene Expression von lacZ in lebenden Zebrafischembryonen. Das Transgen verband den Enhancer-Promotor vom Xenopus Elongationsfaktor 1α Gen mit der lacZ kodierenden Sequenz. Verschiedene Linien transgener Fische zeigten verschiedene Muster der Expression, was darauf hindeutet, dass der Ort der Integration das Expressionsmuster beeinflussen dürfte. Amsterdam et al., Dev. Biology 171: 123-1129 (1995), und Amsterdam et al., Gene 173: 99-103 (1996), beschreiben eine transgene Expression von dem grün-fluoreszierenden Protein (GFP) im Zebrafisch. Das Transgen verband den Enhancer-Promotor vom Xenopus Elongationsfaktor 1α Gen mit der GFP kodierenden Sequenz. Wie bei Lin et al., Dev. Biology 161: 77-83 (1994), zeigten verschiedene Linien transgener Fische unterschiedliche Expressionsmuster, was darauf hindeutet, dass der Ort der Integration das Expressionsmuster beeinflussen dürfte. Obwohl einige der oben beschriebenen Systeme musterhafte Expression zeigten, erbrachte keine Übertragung eine stabile Gewebe-spezifische Expression des Transgens im Zebrafisch.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, transgene Fische bereitzustellen, die Gewebe- und Entwicklungs-spezifische Expression von Transgenen aufweisen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung transgener Fische, die Gewebe- und Entwicklungs-spezifische Expression von Transgenen aufweisen, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereitzustellen, die die Expression von Fischgenen von Interesse beeinflussen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung des Musters der Expression von Fischgenen von Interesse bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von Genen bereitzustellen, die die Expression von Fischgenen von Interesse beeinflussen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das mutierte Fischgene genetisch markiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von Fischen bereitzustellen die ein mutiertes Gen geerbt haben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von Enhancern und anderen regulatorischen Sequenzen im Fisch bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Konstrukt bereitzustellen, das Gewebe- und Entwicklungs-spezifische Expression im Fisch aufzeigt.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Offenbart sind transgene Fische und ein Verfahren zur Herstellung transgener Fische, die Transgene in stabiler und vorhersagbarer Gewebe- oder Entwicklungs-spezifischer Form exprimieren. Die transgenen Fische enthalten Konstrukte des Transgens mit homologen Expressionssequenzen. Ferner sind Verfahren der Verwendung solcher transgenen Fische offenbart. Eine solche Expression von Transgenen gestattet das Studium von Entwicklungsprozessen, der Verwandtschaft von Zellstammbäumen, die Bestimmung der Wirkung spezifischer Gene und Verbindungen auf die Entwicklung oder Erhaltung spezifischer Gewebe oder Zellstammbäume und die Erhaltung von Fischlinien, die markierte Gene tragen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A zeigt die Nukleotidsequenz an der Exon/Intron Grenze des GATA-1 Locus vom Zebrafisch. Die konservierten Splicesequenzen sind unterstrichen und die Intronsequenzen sind innerhalb der Klammem aufgeführt. Die Aminosäuren werden durch die Intron flankierenden Exonregionen kodiert und unter der Nukleotidsequenz aufgezeigt. Die stromaufwärts gelegenen Splicegrenzen-Nukleotidsequenzen sind SEQ ID Nr: 6 (IVS-1), SEQ ID Nr: 7 (IVS- 2), SEQ ID Nr: 8 (IVS-3), und SEQ ID Nr: 9 (IVS-4). Die stromabwärts gelegenen Splicegrenzen-Nukleotidsequenzen sind SEQ ID Nr: 10 (IVS-1), SEQ ID Nr: 11 (IVS-2), SEQ ID Nr: 12 (IVS-3), und SEQ ID Nr: 13 (IVS-4). Die Intron überspannenden Aminosäuresequenzen sind SEQ ID Nr: 14 (IVS-1), SEQ ID Nr: 15 (IVS-2), SEQ ID Nr: 16 (IVS-3), und SEQ ID Nr: 17 (IVS-4).
Fig. 1B ist ein Diagramm der Struktur des GATA-1 Locus vom Zebrafisch. Exonregionen sind gefüllt. Intronregionen sind nicht gefüllt. Die großen gefüllten Boxen repräsentieren die kodierenden Regionen. Der Pfeil zeigt die vermeintliche Transkriptionsstartstelle an. EcoRI- Endonukluease Schnittstellen sind mit E bezeichnet. BgIII-Endonuklease Schnittstellen sind mit G bezeichnet. BamHI-Endonukluease Schnittstellen sind mit B bezeichnet.
Fig. 2 ist ein Diagramm der Struktur dreier GATA-1/GFP Transgenkonstrukte zur Herstellung transgener Fische. Die gefüllte Region zur rechten Seite der GM2-Box in jedem Konstrukt repräsentiert die 5,4 kb oder 5,6 kb Region des GATA-1 Locus stromaufwärts gelegen von der GATA-1 kodierenden Region. Die als GM2 bezeichnete Box repräsentiert die kodierende Sequenz des modifizierten grün-fluoreszierenden Proteins. Die dünnen gewinkelten Linien in den Konstrukten (1) und (3) repräsentieren Vektor- oder verbindende Sequenzen. EcoRI-Endonukluease Schnittstellen sind mit E bezeichnet. BgIII-Endonuklease Schnittstellen sind mit G bezeichnet. BamHI-Endonukluease Schnittstellen sind mit B bezeichnet. In Konstrukt (3) ist das BamHI/EcoRI Fragment der rechten Seite das stromabwärts gelegene BamHI/EcoRI Fragment des GATA-1 Locus.
Fig. 3 ist ein Diagramm der Strukturen der GATA-2/GFP Transgenkonstrukte zur Analyse der Expressionssequenzen der GATA-2 Gene. Die Linie repräsentiert alle oder stromaufwärts gelegene deletierte Anteile der 7,3 kb Region, die stromaufwärts von der Translationsstartseite im Zebrafisch GATA-2 Gen gelegen ist. Die schraffierte Box repräsentiert ein Segment, dass das modifizierte GFP kodiert und ein SV40 Polyadenyliersungssignal einschließt. Die Häkchen bezeichnet mit P, Sa, A, C und Sc zeigen die Restriktionsschnittstellen von PstI, SacI, AatII, ClaI und ScaI in der 7,3 kb Region an.
Fig. 4 ist ein Diagramm der Strukturen der GATA-2/GFP Transgenkonstrukte zur Analyse der Expressionssequenzen des GATA-2 Gens. Die dicke offene Box repräsentiert ein 1116 Basenpaarfragment der stromaufwärts gelegenen Region des GATA-2 Gens, das für die Neuronen-spezifische Expression erforderlich ist. Die dünne offene Box repräsentiert Segmente der stromaufwärts gelegenen Region des GATA-2 Gens unmittelbar an der Transkriptionsstartstelle. Die dicke Linie repräsentiert den minimalen Promotor des Xenopus Elongationsfaktors 1α Gens. Die schraffierte Box repräsentiert ein Segment, dass das modifizierte GFP kodiert und ein SV40 Polyadenylierungssignal einschließt.
Fig. 5 ist eine Darstellung in Prozent von den Embryonen, die mit den in Fig. 4 gezeigten Transgenkonstrukten mikroinjiziert sind und GFP in den Neuronen exprimieren.
Fig. 6 ist eine Darstellung in Prozent von den Embryonen, die mit Transgenkonstrukten mikroinjiziert sind und GFP in den Neuronen exprimieren. Die Transgenkonstrukte waren nsP5-GM2 und eine verkürzte Form von nsP5-GM2.
Fig. 7 ist eine Darstellung in Prozent von den Embryonen, die mit Transgenkonstrukten mikroinjiziert sind und GFP in den Neuronen exprimieren. Die Transgenkonstrukte waren mutierte Formen der ns3831 Verkürzung von nsP5-GM2.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Offenbart werden transgene Fische und ein Verfahren zur Herstellung transgener Fische, die Transgene in stabiler und vorhersagbarer Gewebe- oder Entwicklungs-spezifischer Form exprimieren. Auch werden Verfahren zur Anwendung solcher transgenen Fische offenbart. Eine derartige Expression von Transgenen gestattet das Studium von Entwicklungsprozessen, der Verwandtschaft von Zellstammbäumen, die Bestimmung der Wirkung spezifischer Gene und Verbindungen auf die Entwicklung oder Aufrechterhaltung spezifischer Gewebe oder Zellstammbäume, und die Aufrechterhaltung von Fischlinien, die ein mutiertes Gen tragen. Die offenbarten transgenen Fische sind durch homologe Expressionssequenzen in einem exogenen Konstrukt charakterisiert, das in die Fische oder einen Vorläufer der Fische eingeführt wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich transgener Fisch auf Fisch oder Nachkommen eines Fisches, in den ein exogenes Konstrukt eingebracht worden ist. Ein Fisch, in den ein Konstrukt eingebracht wurde, schließt Fisch ein, der sich aus embryonalen Zellen, in die das Konstrukt eingebracht wurde, entwickelt hat. Wie hier verwendet, ist ein exogenes Konstrukt eine Nukleinsäure, die künstlich eingeführt oder die ursprünglich in ein Tier künstlich eingeführt wurde. Der Ausdruck künstliche Einführung bezweckt, die Einführung eines Konstrukts durch normale Reproduktion oder genetische Kreuzung auszuschließen. Das bedeutet, es ist beabsichtigt, die ursprüngliche Einführung von einem Gen oder eines Merkmals in eine Linie oder einen Stamm von einem Tier durch Kreuzzüchtung auszuschließen. Indessen werden Fische mittels normaler Züchtung durch die Übertragung eines exogenen Konstrukts (das bedeutet, ein Konstrukt, das ursprünglich künstlich eingeführt wurde) von einem Fisch, der das Konstrukt enthält, hergestellt, betrachtet ein exogenes Konstrukt zu enthalten. Solche Fische sind Nachkommen von Fischen, in welche das exogene Konstrukt eingeführt worden war. Wie hier verwendet, sind Nachkommen von einem Fisch alle Fische, welche von dem Fisch durch sexuelle Reproduktion oder Klonierung abstammen und von welchen genetisches Material vererbt worden ist. In diesem Zusammenhang bezieht sich Klonierung auf die Produktion von einem genetisch identischen Fisch aus der DNA einer Zelle, oder Zellen von dem Fisch. Der Fisch, von welchem ein anderer Fisch abstammt, ist als Vorläuferfisch zu bezeichnen. Wie hier verwendet, bezieht sich die Entwicklung von einem Fisch aus einer Zelle oder Zellen (z. B. embryonale Zellen) oder die Entwicklung von einer Zelle oder Zellen in einen Fisch auf den Entwicklungsprozess, durch welchen befruchtete Eizellen oder embryonale Zellen (oder ihre Nachkommen) wachsen, sich teilen und zu einem adulten Fisch differenzieren.
Die Beispiele illustrieren die Art und Weise, in der transgener Fisch, der Zellstammbaumlinien-spezifische Expression aufweist, hergestellt und verwendet werden kann. Der in den Beispielen beschriebene transgene Fisch und die verwendeten Transgenkonstrukte, sind insbesondere nützlich für den frühen Nachweis von Fisch, der das Transgen exprimiert, das Studium erythroider Zellentwicklung, das Studium neuronaler Entwicklung und als ein Reporter für genetisch verbundene mutierte Gene.
Die Gewebe-, Entwicklungsstadium- oder Zellstammbaumlinien-spezifische Expression eines von einem Promotor regulierten Reportergens in den offenbarten transgenen Fischen kann nützlich für die Identifizierung des Expressionsmusters von dem Gen sein, aus dem der Promotor stammt. Eine derartige Expression kann auch das Studium des Entwicklungsmusters eines Zellstammbaumes erlauben. Wie hier verwendet, bezieht sich Gewebe- spezifische Expression auf die Expression, die weitestgehend auf spezifische Gewebetypen begrenzt ist. Gewebe-spezifische Expression ist nicht notwendigerweise begrenzt auf die Expression in einem einzigen Gewebe, aber umfasst die auf ein oder mehrere spezifische Gewebe begrenzte Expression. Wie hier verwendet, bezieht sich die Entwicklungsstadium- spezifische Expression auf die Expression, die im wesentlichen auf spezifische Entwicklungsstadien begrenzt ist. Die Entwicklungsstadium-spezifische Expression ist nicht notwendigerweise begrenzt auf die Expression in einem einzigen Entwicklungsstadium, aber umfasst die Expression, die auf ein oder mehrere spezifische Entwicklungsstadien begrenzt ist. Wie hier verwendet, bezieht sich Entwicklungsstadium-spezifische Expression auf die im Wesentlichen auf spezifische Zellstammbäume begrenzte Expression. Wie hier verwendet, bezieht sich Zellstammbaum auf eine Gruppe von Zellen, die von einer besonderen Zelle oder Gruppe von Zellen abstammen. In der Entwicklung z. B. können neue spezialisierte oder differenzierte Zellen Zellstammbäume hervorbringen. Die Zellstammbaum-spezifische Expression ist nicht notwendigerweise begrenzt auf die Expression in einem einzigen Zellstammbaum, umfasst aber die auf einen oder mehrere spezifische Zellstammbäume, begrenzte Expression. All diese Typen spezifischer Expression können für dasselbe Gen gültig sein. Zum Beispiel kann ein entwicklungsmäßig reguliertes Gen in zwei spezifischen Entwicklungsstadien exprimiert und auf ein spezifisches Gewebe begrenzt sein. Wie hier verwendet, bezieht sich das Muster der Expression eines Gens auf die Gewebe, Entwicklungsstadien, Zellstammbäume oder Kombinationen von diesen in oder an denen das Gen exprimiert wird.

1. Transgene Konstrukte

Transgene Konstrukte sind das genetische Material, das in die Fische eingeführt wird, um transgene Fische herzustellen. Solche Konstrukte werden künstlich in Fische eingeführt. Die Art und Weise der Einführung und oft die Struktur des Transgenkonstrukts machen solch ein Transgenkonstrukt zu einem exogenen Konstrukt. Obwohl ein Transgenkonstrukt aus jeder Nukleinsäuresequenz hergestellt werden kann, wird für seine Verwendung in den offenbarten transgenen Fischen bevorzugt, dass die Transgenkonstrukte Expressionsequenzen verbinden, die operativ mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz verbunden sind. Das Transgenkonstrukt wird auch vorzugsweise andere Komponenten beinhalten, die die Expression, Stabilität oder Integration von dem Konstrukt in dem Genom von einem Fisch unterstützen. Wie hier verwendet, beziehen sich die Bestandteile eines Transgenkonstrukts auf als operativ verbunden zu sein oder wirksam verbunden, auf Bestandteile, die so verbunden sind, dass sie zu ihrem beabsichtigten Zweck zusammenarbeiten können. Zum Beispiel sind ein Promotor und eine kodierende Region operativ verbunden, wenn der Promotor so arbeiten kann, dass er zur Transkription der kodierenden Region führt.

A. Expressionsequenzen

Die Expressionssequenzen werden in den offenbarten Transgenkonstrukten verwendet, um die Expression eines Expressionsprodukts, kodiert durch das Konstrukt, zu vermitteln. Wie hier verwendet, umfassen Expressionssequenzen Promotoren, stromaufwärts gelegene Elemente, Enhancer- und Response-Element. Es wird bevorzugt, dass die in den offenbarten Konstrukten verwendeten Expressionssequenzen homologe Expressionssequenzen sind. Wie hier hinsichtlich der Komponenten der verwendeten transgenen Konstrukte in den transgenen Fischen verwendet, bezeichnet homolog, dass die Komponente entweder angeboren oder abgeleitet ist von der Spezies oder dem Typ des in Frage stehenden Fisches. Umgekehrt bezeichnet heterolog, dass der Bestandteil weder natürlich noch von den Arten oder dem Typ des in Frage kommenden Fisches abgeleitet ist.
Zwei in großem Maßstab durchgeführte chemische Mutagenese-Suchtests erzeugten kürzlich tausende die Entwicklung beeinflussende Zebrafisch-Mutanten (Driever et al., Development 123: 37-46 (1996); Haffter et al., Development 123: 1-36 (1996)). Derartige Gene und ihre Expressionsmuster sind von signifikantem Interesse für das Verständnis der Entwicklungsprozesse. Deswegen werden Expressionssequenzen von diesen Genen für die Verwendung als Expressionssequenzen in den offenbarten Konstrukten verwendet.
Wie hier verwendet, werden Expressionssequenzen in zwei Hauptklassen, Promotoren und Enhancer, aufgeteilt. Ein Promotor ist im allgemeinen eine Sequenz oder Sequenzen von DNA, die, wenn sie sich in verhältnismäßig festgelegter Lage hinsichtlich des Transkriptionsstartortes befindet, funktioniert. Ein Promotor umfasst Kernelemente, die für die grundlegende Interaktion der RNA Polymerase und der Transkriptionsfaktoren nötig sind und kann stromaufwärts gelegene Elemente und Response-Elemente umfassen. Enhancer im allgemeinen beziehen sich auf eine DNA Sequenz, die in keiner festgelegten Entfernung von der Transkriptionsstartstelle funktioniert und in beide Orientierungen gerichtet sein kann. Enhancer dienen dazu die Transkription von nahegelegenen Promotoren zu erhöhen. Enhancer umfassen häufig auch Response-Elemente, die die Regulation der Transkription vermitteln. Promotoren können auch Response-Elemente umfassen, die die Regulation der Transkription vermitteln.
Die Enhancer bestimmen oft die Regulation der Expression eines Genes. Diese Wirkung war in sogenannten Enhancerfallenkonstrukten zu sehen, wo die Einführung eines Konstrukts, das ein Reportergen enthält, das operativ mit einem Promotor verbunden ist, nur exprimiert wird, wenn sich das Konstrukt in die Domäne eines Enhancers einfügt (O'Kane and Gehring, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9123-9127 (1987), Allen et al., Nature 33: 852-855 (1988), Kothary et al., Nature 355: 435-437 (1988), Gossler et al., Science 244: 463-465 (1989)). In solchen Fällen wird die Expression des Konstruktes gemäß dem Muster des neuartig assoziierten Enhancers reguliert. Transgene Konstrukte, die nur einen minimalen Promotor besitzen, können in den offenbarten transgenen Fischen zur Identifizierung von Enhancern verwendet werden.
Bevorzugte Enhancer für die Verwendung in den offenbarten transgenen Fischen sind solche, die Gewebe- oder Zellstammbaum-spezifische Expression vermitteln. Besonders bevorzugt sind homologe Enhancer, die Gewebe- oder Zellstammbaum- spezifische Expression vermitteln. Noch bevorzugter sind Enhancer von Fisch GATA- 1 und GATA-2 Genen. Am meisten bevorzugt sind Enhancer von Zebrafisch GATA-1 und GATA-2 Genen.
Für die Expression kodierter Peptide oder Proteine benötigt ein Transgenkonstrukt auch Sequenzen, die, wenn sie in RNA transkribiert sind, die Translation der kodierten Expressionsprodukte vermitteln. Derartige Sequenzen sind im allgemeinen in der 5' nicht-translatierten Region der transkribierten RNA zu finden. Diese Region stimmt mit der Region auf dem Konstrukt zwischen der Transkriptionsinitiationsstelle und der Translationsinitiationsstelle (das ist das Initiationskodon) überein. Die 5'-nicht- translatierte Region eines Konstrukts kann erhalten werden von der 5'-nicht- translatierten Region, die normalerweise mit dem im Konstrukt verwendeten Promotor verbunden ist, der 5'-nicht-translatierten Region, die normalerweise mit der das Expressionsprodukt kodierenden Sequenz verbunden ist, der 5'-nicht-translatierten Region eines Gens, das nicht mit dem Promotor oder der Sequenz, die das Expressionsprodukt kodiert, verwandt oder ein Hybrid dieser 5'-nicht-translatierten Region ist. Bevorzugterweise ist die 5'-nicht-translatierte Region homolog zu dem Fisch, in dem das Konstrukt eingeführt wird. Bevorzugte 5'-nicht-translatierte Regionen sind normalerweise verbunden mit dem verwendeten Promotor.

B. Transgenkonstrukte

Die Transgenkonstrukte für die Verwendung in den offenbarten transgenen Fischen können jedes gewünschte Expressionsprodukt, umfassend Peptide, Proteine und RNA kodieren. Expressionsprodukte können Reporterproteine (zur Detektion und Quantifizierung von Expression) und Produkte, die eine biologische Wirkung auf Zellen haben, in denen sie exprimiert sind (z. B. durch Hinzufügen einer neuen enzymatischen Aktivität zu der Zelle oder Verhinderung der Expression von einem Gen), umfassen. Viele solcher Expressionsprodukte sind bekannt oder können identifiziert werden.

Reporterproteine

Wie hier verwendet, ist ein Reportergen jedes Protein, das, wenn es exprimiert wird, spezifisch nachgewiesen werden kann. Reporterproteine sind nützlich zum Nachweisen oder Quantifizieren der Expression von Expressionssequenzen. Zum Beispiel gestattet einem das wirksame Verbinden einer, ein Reportergen kodierende Nukleotidsequenz mit einer Gewebe-spezifischen Expressionssequenz, sorgfältig die Stammbaumentwicklung zu studieren. In derartigen Studien dient das Reporterprotein als ein Marker zur Verfolgung von Entwicklungsprozessen, wie etwa Zellmigration. Viele Reporterproteine sind bekannt und sind zu ähnlichen Zwecken in anderen Organismen verwendet worden. Diese umfassen Enzyme wie etwa die β- Galactosidase, die Luciferase und die alkalische Phosphatase, die spezifisch nachweisbare Produkte darstellen und Proteine, die direkt nachgewiesen werden können. Im Grunde genommen kann jedes Protein direkt nachgewiesen werden durch z. B. Verwendung spezifischer Antikörper zu dem Protein. Ein bevorzugtes Reporterprotein, das direkt nachgewiesen werden kann, ist das grün-fluoreszierende Protein (GFP). GFP aus der Qualle Aequorea victoria erzeugt Fluoreszenz auf Anregung mit ultraviolettem Licht ohne Zugabe eines Substrats (Chalfie et al., Science 263: 802.805 (1994)). Kürzlich wurde eine Anzahl modifizierter GFPs erzeugt, die bis zu 50 mal mehr Fluoreszenz bilden als wildtyp GFP unter Standardbedingungen (Carmack et al., Gene 173: 33-38 (1996); Zolotukhin et al., J. Virol 70: 4646-54 (1996)). Dieser Grad der Fluoreszenz erlaubt den Nachweis niedriger Grade Gewebe- spezifischer Expression in lebenden transgenen Tieren.
Die Verwendung von Reporterproteinen, die, wie GFP direkt nachweisbar sind ohne die Zugabe exogener Faktoren zu fordern, werden zum Nachweis oder Bewerten der Genexpression während der Zebrafisch-Embryonalentwicklung bevorzugt. Ein transgener Zebrafischembryo, der ein Konstrukt trägt, das für ein Reporterprotein und eine Gewebe-spezifische Expressionssequenz kodiert, kann ein schnelles Echtzeiten in- vivo System zur Analyse räumlicher und zeitlicher Expressionsmuster entwicklungsabhängig regulierter Gene liefern.

C. Andere Konstruktsequenzen

Die offenbarten Transgenkonstrukte umfassen bevorzugter Weise andere Sequenzen, die die Expression oder die Stabilität von dem Konstrukt verbessern. Zum Beispiel gewährleistet der Einbau eines Polyadenylierungssignals in die Konstrukte, die für ein Protein kodieren, dass die Transkripte des Transgens prozessiert und als mRNA transportiert werden. Die Identifikation und Nutzung von Polyadenylierungssignalen ist in Expressionskonstrukten wohl bekannt. Es wird bevorzugt, dass homologe Polyadenylierungssignale in den Transgenkonstrukten verwendet werden.
Es ist auch bekannt, dass die Gegenwart von Introns in primären Transkripten die Expression erhöhen kann, möglicherweise, das Transkript veranlassend in das Prozessierungs- und Transportsystem für die mRNA einzutreten. Es wird bevorzugt, dass wenn ein Intron verwendet wird, es in die 5'-nicht-translatierte Region oder die 3'-nicht-translatierte Region des Transgentranskripts eingeschlossen ist. Es ist auch bevorzugt, dass das Intron homolog zu dem verwendeten Fisch und bevorzugt homolog zu den verwendeten Expressionssequenzen ist (d. h., dass das Intron von den gleichen Genen stammt, von denen einige oder alle Expressionssequenzen stammen). Die Verwendung und Bedeutung von diesen und anderen Bestandteilen, die nützlich für die Transgenkonstrukte sind, wird in Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Seppel et al., "The Regulatory Domain Organization of Eukaryotic Genomes: Implications For Stable Gene Transfer" in Transgenic Animals (Grosveld and Kollias, eds., Academic Press, 1992), Seiten 1-26; Kollias and Grosveld, "The Study of Gene Regulation in Transgenic Mice" in Transgenic Animals (Grosveld and Kollias, eds, Academic Press, 1992), Seiten 79-98; und Clark et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 339: 225-232 (1993) diskutiert.
Die offenbarten Konstrukte sind bevorzugt in das Genom von Fischen integriert. Indessen kann das offenbarte Transgenkonstrukt auch als ein künstliches Chromosom konstruiert sein. Derartige künstliche mehr als 200 kb umfassende Chromosomen sind in verschiedenen Organismen verwendet worden. Künstliche Chromosomen können verwendet werden, um sehr lange Transgenkonstrukte in Fische zu integrieren. Diese Technologie ist nützlich, da sie eine zuverlässige Zusammenfassung des Expressionsmusters von Genen gestatten kann, die regulatorische Elemente besitzen, die viele Kilobasen von den kodierenden Sequenzen entfernt liegen.

2. Fische

Die offenbarten Konstrukte und Verfahren können in jedem Typ von Fisch verwendet werden. Wie hier verwendet, bezieht sich Fisch auf jedes Mitglied der Klassen, die gemeinsam den Pisces zugeordnet werden. Es wird bevorzugt, dass Fisch, der zu den Arten und Varietäten von Fisch kommerziellen oder wissenschaftlichen Interesses gehört, verwendet wird. Derartiger Fisch umfasst Lachs, Forellen, Thunfisch, Heilbutt, Wels, Zebrafisch, Medaka, Karpfen, Tilapia, Goldfisch und Schmerle.
Der am meisten bevorzugte Fisch für die Verwendung der offenbarten Konstrukte und Methoden ist Zebrafisch, Danio rerio. Zebrafische sind zunehmend populäre experimentelle Tiere, da sie viele der Vorteile der populären Invertebraten als experimentelle Organismen haben und schließen den zusätzlichen Vorteil ein, Vertebraten zu sein. Ein anderer wichtiger Vorteil von Zebrafischen für das Studium der Entwicklung von Zellstammbäumen ist, wie bei Caenorhabditis, dass sie größtenteils transparent sind (Kimmel, Trends Genet 5: 283-288 (1989)). Die Erzeugung von Tausenden von Zebrafischmutanten (Driever et al., Development 123: 37-46 (1996); Haffter et al., Development 123: 1-36 (1996)) liefert reichlich Rohmaterial für transgene Studien an diesen Tieren. Die allgemeine Zebrafischpflege und Haltung wird bei Streisinger, Natl. Cancer Inst. Monogr. 65: 53-58 (1984) beschrieben.
Zebrafischembryonen sind leicht zugänglich und fast durchsichtig. Mit diesen Eigenschaften kann ein transgener Zebrafischembryo, der ein Konstrukt trägt, das ein Reporterprotein und Gewebe-spezifische Expressionssequenzen kodiert, ein schnelles Echtzeit in vivo-System zur Analyse räumlicher und zeitlicher Expressionsmuster entwicklungsabhängig regulierter Gene liefern. Zusätzlich ist die Embryonalentwicklung von dem Zebrafisch extrem schnell. In 24 Stunden entwickelt ein Embryo Rudimente aller Hauptorgane, einschließlich eines funktionellen Herzens und zirkulierender Blutzellen (Kimmel, Trends Genet 5: 283-288 (1989)). Andere Fische mit einigen oder allen der gleichen wünschenswerten Eigenschaften werden auch bevorzugt.

3. Herstellung von transgenen Fischen

Die offenbarten transgenen Fische werden durch Einführung eines Transgenkonstruktes in Zellen eines Fisches, vorzugsweise embryonale Zellen und am meisten bevorzugt in einen einzelligen Embryo, hergestellt. Dort wo das Transgenkonstrukt in embryonale Zellen eingeführt wird, erhält man den transgenen Fisch, indem man der embryonalen Zelle oder Zellen gestattet, sich in einen Fisch zu entwickeln. Die Einführung von Konstrukten in embryonale Zellen des Fischs und anschließende Entwicklung des Fisches werden durch die Tatsache vereinfacht, dass sich Embryonen in den meisten Fischarten außerhalb der Elternfische entwickeln.
Die offenbarten Transgenkonstrukte können mittels jeder geeigneten Technik, in embryonale Fischzellen eingeführt werden. Viele Techniken für eine derartige Einführung exogenen genetischen Materials sind in Fischen und anderen Tieren aufgezeigt worden. Diese schließen Mikroinjektion (beschrieben von z. B. Culp et al. (1991)), Elektroporation (beschrieben von z. B. Inoue et al., Cell. Differ Develop. 29: 123-128 (1990); Müller et al., FEBS Lett. 324: 27-32 (1993); Murakami et al., J. Biotechnolt 34: 35-42 (1994); Müller et al., Mol. Mar. Biolt Biotechnol. 1: 276-281 (1992); und Symonds et al., Aquaculture 119: 313-327 (1994)), Beschießung mit dem Partikelgewehr (Zelenin et al., FEBS Lett. 287: 118-120 (1991) und die Verwendung von Liposomen (Szelei et al., Transgenic Res. 3: 116-119 (1994)) ein. Die Mikorinjektion wird bevorzugt. Die bevorzugte Methode zur Einführung von Transgenkonstrukten in embryonale Zellen des Fischs durch Mikroinjektion wird in den Beispielen beschrieben.
Embryonen oder embryonale Zellen können im allgemeinen durch Sammeln von Eiern sofort nach ihrer Ablage erhalten werden. Abhängig von dem Typ Fisch ist es allgemein bevorzugt, dass die Eier vor oder zu dem Zeitpunkt der Sammlung befruchtet sind. Dies wird vorzugsweise durch Zusammensetzen eines männlichen und eines weiblichen Fisches in einem Aquarium erreicht, was die Eisammlung unter Bedingungen stimulierter Paarung erlaubt. Nach dem Sammeln der Eier wird bevorzugt, den Embryo der Einführung des genetischen Materials durch Entfernung des Chorions auszusetzen. Dies kann manuell oder vorzugsweise durch Verwendung einer Protease wie Pronase durchgeführt werden. Eine bevorzugte Technik für das Sammeln von Zebrafischeiern und ihrer Vorbereitung für die Mikroinjektion wird in den Beispielen beschrieben. Eine befruchtete Eizelle vor der ersten Zellteilung wird als Einzell-Embryo betrachtet, und die befruchtete Eizelle wird demzufolge als embryonale Zelle angesehen.
Nach der Einführung des Transgenkonstrukts wird dem Embryo gestattet sich zu einem Fisch zu entwickeln. Dies braucht im allgemeinen nicht mehr als die Embryonen unter den gleichen Bedingungen, wie zum Ausbrüten von Eiern nötig, auszubrüten. Jedoch können die embryonalen Zellen auch kurz in einem isotonischen Puffer inkubiert werden. Falls geeignet, kann die Expression eines eingeführten Transgenkonstrukts während der Entwicklung des Embryos beobachtet werden.
Die Fische, die ein Transgen beherbergen können durch jedes geeignete Mittel identifiziert werden. Zum Beispiel kann das Genom eines möglichen transgenen Fisches auf die Anwesenheit von Konstruktsequenzen getestet werden. Um transgenen Fisch tatsächlich als das Transgen exprimierend zu identifizieren, kann die Anwesenheit eines Expressionsproduktes analysiert werden. Einige Techniken für derartige Nachweise sind bekannt und werden für transgene Tiere gebraucht und die meisten können auf transgene Fische angewendet werden. Das Testen möglicher oder tatsächlicher transgener Fische auf Nukleinsäuresequenzen, die anwesend in oder charakteristisch für Transgenkonstrukte sind, wird bevorzugt durch Southern oder Nothern Blotting ausgeführt. Auch bevorzugt wird der Nachweis mit der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) oder anderen Sequenz-spezifischen Nukleinsäure Amplifikationstechniken. Bevorzugte Techniken zum Identifizieren transgener Zebrafische werden in den Beispielen beschrieben.

4. Identifizierung des Expressionsmusters von Fischgenen

Identifizieren des Musters der Expression in den offenbarten transgenen Fischen kann durch Messen oder Identifizieren der Expression des Transgens in verschiedenen Geweben (Gewebe-spezifische Expression), zu verschiedenen Zeiten während der Entwicklung (entwicklungsabhängige regulierte Expression oder Entwicklungsstadien-spezifische Expression) und in verschiedenen Zellstammbäumen (Zellstammbaum-spezifische Expression) durchgeführt werden. Diese Bewertungen können auch kombiniert werden durch z. B. Messung der Expression (und Beobachtung von Änderungen, wenn überhaupt welche) in einem Zellstammbaum während der Entwicklung. Die Beschaffenheit des nachzuweisenden Expressionsproduktes kann sich auf die Brauchbarkeit von einigen dieser Analysen auswirken. Auf der einen Ebene können verschiedene Gewebe von einem Fisch seziert werden und die Expression kann in separaten Gewebeproben getestet werden. Eine solche Beurteilung kann mit fast jedem Expressionsprodukt durchgeführt werden. Diese Technik wird gewöhnlich in transgenen Tieren verwendet und ist zum Feststellen Gewebe- spezifischer Expression nützlich.
Diese Technik kann auch verwendet werden, um die Expression während des Verlaufs der Entwicklung, durch Testen auf das Expressionsprodukt zu verschiedenen Entwicklungsstadien, zu bestimmen. Wo der Nachweis des Expressionsprodukts Fixieren der Probe benötigt oder andere Behandlungen, die den sich entwickelnden Embryo oder Fisch zerstören oder töten, müssen multiple Embryonen verwendet werden. Dies ist nur durchführbar, wo das Expressionsmuster in verschiedenen Embryonen gleich oder ähnlich zu sein erwartet wird. Dies wird der Fall sein, wenn die offenbarten transgenen Fische, die stabile und vorhersagbare Expression besitzen, verwendet werden.
Eine besonders bevorzugte Weise des Bestimmens des Musters der Expression eines Transgens während der Entwicklung ist ein Expressionsprodukt zu verwenden, das in lebenden Embryonen und Tieren nachgewiesen werden kann. Ein bevorzugtes Expressionsprodukt für diesen Zweck ist das grün-fluoreszierende Protein. Eine bevorzugte Form vom GFP und eine bevorzugte Technik für das Messen der Gegenwart von GFP in lebenden Fischen wird in den Beispielen beschrieben.
Die Expressionsprodukte der offenbarten Transgenkonstrukte können mit jeglicher geeigneten Methoden nachgewiesen werden. Einige Mittel zum Nachweisen der Expressionsprodukte sind bekannt und können für den Nachweis von Expressionsprodukten in transgenen Fischen verwendet werden. Beispielsweise kann RNA unter Verwendung jeder der zahlreichen Nukleinsäure-Nachweistechniken nachgewiesen werden. Einige dieser auf transgene Fische angewandte Nachweismethoden werden in den Beispielen beschrieben. Die Verwendung eines Reporterproteins als Expressionsprodukt wird bevorzugt, da solche Proteine basierend auf ihrer Nachweisbarkeit ausgewählt werden. Der Nachweis einiger nützlicher Reporterproteine wird bei Iyengar et al. (1996) beschrieben.
Im Zebrafisch erscheinen das Nervensystem und andere Organrudimente innerhalb von 24 Stunden nach der Fertilisation. Da sich der nahezu transparente Zebrafisch Embryo außerhalb seiner Mutter entwickelt, kann der Ursprung und die Wanderung von Stammbaum-Vorläuferzellen durch Verfolgen der Expression eines Expressionsproduktes in transgenen Fischen überwacht werden. Zusätzlich kann die Regulation eines spezifischen Gens in diesen Fischen studiert werden.
Unter Verwendung von Zebrafischpromotoren, die die Expression in spezifischen Geweben antreiben, kann eine Anzahl transgener Zebrafischlinien hergestellt werden, die ein Reportergen in jedem Hauptgewebe, einschließlich der Chorda dorsalis, dem Nervensystem, dem Gehirn, dem Thymus und in anderen Geweben exprimieren (siehe Tabelle 1). Andere wichtige Stammbäume, für die spezifische Expression erhalten werden kann, umfassen die Neuralleiste, die Keimzellen, die Leber, den Darm. Zusätzliche Gewebe-spezifische transgene Fische können hergestellt werden, durch Verwendung von "Enhancerfallen"-Konstrukten, um Expressionssequenzen im Fisch zu identifizieren.

Tabelle 1

Quelle der Expressionssequenzen Gewebe/Zellstammbäume

GATA-1 Erythrozytenvorläufer
GATA-2 Hämatopoetische Stammzellen/ZNS
Tinman Herz
Rag-1 T- und B-Zellen
Globin Reife rote Blutzellen
MEF Muskelvorläufer
Goosecoid Rückenorganisator
SCL-1 Hämatopoetische Stammzellen
Rbtn-2 Hämatopoetische Stammzellen
No-tail Chorda dorsalis
Flk-1 Vaskuläres Endothel
Eve-1 Ventrale/posteriore Zellen
Ikaros Frühe lymphoide Vorläuferzellen
Pdx-1 Pankreas
Islet-1 Motoneuron
Shh Multiple Gewebeinduktion/Links-Rechts-Symmetrie
Twist Axiales Mesoderm/Links-Rechts-Symmetrie
Krox20 Gehirn
BMP4 Ventrale Mesoderminduktion

5. Identifizieren von Verbindungen die die Expression von Fischgenen beeinflussen

Für viele Gene, insbesondere für Gene die in Entwicklungsprozesse einbezogen sind, wäre es vorteilhaft Verbindungen die, die Expression dieser Gene beeinflussen, zu identifizieren. Der offenbarte transgene Fisch kann den Verbindungen ausgesetzt werden, um die Wirkung dieser Verbindung auf die Expression eines Gens von Interesse festzustellen. Zum Beispiel können Testverbindungen transgenen Fischen verabreicht werden, die ein exogenes Konstrukt beherbergen, das die Expressionssequenzen eines Fischgens von Interesse, operativ verbunden mit einer Sequenz, die ein Reporterprotein kodiert, enthält. Durch den Vergleich der Expression des Reporterproteins in Fischen, die einer Testverbindung ausgesetzt sind, mit denen die dieser nicht ausgesetzt sind, kann die Wirkung der Verbindung auf die Expression des Gens von dem die Expressionssequenzen abstammen, bewertet werden.

6. Identifizieren von Genen die die Expression von Fischgenen beeinflussen

Zahlreiche Mutanten des Zebrafisches sind erzeugt und charakterisiert worden, die gemeinsam die meisten Entwicklungsprozesse beeinflussen. Die offenbarten transgenen Fische können in Kombination mit diesen und anderen Mutationen verwendet werden, um die Wirkung eines mutierten Gens auf die Expression eines Gens von Interesse, festzustellen. Zum Beispiel können Mutationen in Stämme transgener Fische eingeführt werden, die ein exogenes Konstrukt beherbergen, dass die Expressionssequenzen eines Fischgens von Interesse enthält, das operativ verbunden zu einer ein Reporterprotein kodierenden Sequenz ist. Durch Vergleich der Expression des Reporterproteins in Fischen mit einer Mutation, zu solchen ohne Mutation, kann die Wirkung der Mutation auf die Expression des Gens, aus dem die Expressionssequenzen stammen, bestimmen werden.
Die Wirkung solcher Mutationen auf spezifische Entwicklungsprozesse und auf das Wachstum und die Entwicklung spezifischer Zellstammbäume kann auch bestimmt werden unter Verwendung der offenbarten transgenen Fische, die ein Reporterprotein in spezifischen Zellstammbäumen oder zu spezifischen Entwicklungsstadien exprimieren.

7. Genetisches Markieren mutierter Fischgene

Die offenbarten Transgenkonstrukte können verwendet werden, um mutierte Gene oder Chromosomregionen genetisch zu markieren. Zum Beispiel haben chemische Mutagenese Suchtests im Zebrafisch mehr als Tausend verschiedene Mutanten mit Defekten in den meisten Entwicklungsprozessen erzeugt. Wenn Fische, die eine in diesen Suchtests erzeugte Mutation tragen, einfacher identifiziert werden könnten, würde viel Zeit und Arbeit gespart werden. Ein Weg die rasche Identifikation von Fischen, die Mutationen tragen, zu fördern, wäre die Etablierung von Balancierchromosomen, die einfach zu identifizierende Marker im lebenden Fisch tragen. Diese Technologie hat die Aufgabe der Identifikation und der Erhaltung mutanter Stämme in Drosophila stark gefördert (Aschburner, Drosophila, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989); Lindsey and Zimm, The Genome of Drosophila melanogaster (Academic Press, San Diego, CA, 1995)). Wie hier verwendet, bezieht sich genetisches Markieren eines Gens oder einer Chromosomenregion auf das genetische Verbinden eines Reportergens mit dem Gen oder der Chromosomenregion. Genetische Kopplung zwischen zwei genetischen Elementen (z. B. Genen) bezieht sich auf die Elemente, die in hinreichender Nähe auf einem Chromosom liegen, so dass sie sich nicht zufällig voneinander während der genetischen Kreuzung trennen. Je enger die genetische Kopplung um so wahrscheinlicher ist es, dass die zwei Elemente zusammen aufspalten. Für das genetische Markieren ist es bevorzugt, dass das Transgenkonstrukt sich mit dem Gen oder der chromosomalen Region von Interesse in mehr als 60% der Fälle aufspaltet, es ist mehr bevorzugt, dass das Transgenkonstrukt sich mit dem Gen oder der chromosomalen Region von Interesse in mehr als 70% der Fälle aufspaltet, es ist noch mehr bevorzugt, dass das Transgenkonstrukt sich mit dem Gen oder der chromosomalen Region von Interesse in mehr als 80% der Fälle aufspaltet, es ist noch mehr bevorzugt, dass das Transgenkonstrukt sich mit dem Gen oder der chromosomalen Region von Interesse in mehr als 90% der Fälle aufspaltet, und es ist besonders bevorzugt, dass das Transgenkonstrukt sich mit dem Gen oder der chromosomalen Region von Interesse in mehr als 95% der Fälle aufspaltet.
Das Beispiel 1 zeigt, dass lebende transgene Fische, die Insertionen eines Transgens tragen, in das der Zebrafisch-GATA-1-Promotor an das grün-fluoreszierende Protein (GFP) Reportergen ligiert wurde, durch einfache Beobachtung der GFP- Expression in Blutzellen identifiziert werden können. Wie in Drosophila, ereignet sich die chromosomale Rekombination mit signifikant niedrigerer Rate während der Spermatogenese als während der Oogenese. Daher kann eine transgene Insertion, die nahe zu einer chemisch induzierten Genmutante zu liegen kommt, in das mutierte Chromosom während der Oogenese eingekreuzt werden, und wird dann mit der Mutation im männlichen Fisch durch viele Generationen verbunden bleiben. Diese Arbeitsweise wird die Identifikation von Nachkommen, die das mutierte Gen beherbergen, durch einfache Beobachtung von GFP in Blutzellen erlauben.
Im Falle von Zebrafisch tragen 200 Linien das GATA-1/GFP-Transgen (oder ein anderes Reporterkonstrukt), zufallsweise im Zebrafischgenom inseriert, was im Durchschnitt in 8 Insertionen in jedem der 25 Zebrafischchromosomen resultieren sollte. Dies ist dadurch möglich, dass die Expression der offenbarten Konstrukte nicht auf die Wirkung des Ortes der Insertion und nicht auf die Stelle der Integration begrenzt ist. Die Insertionsstellen können kartiert und dann während der Oogenese in Zebrafischlinien eingekreuzt werden, die eine nahegelegene Mutation tragen. Einmal hergestellt können die mutierten Stämme, die das Balancierchromosom tragen, in männlichem Fisch aufrecht erhalten werden.
Obwohl es bevorzugt wird, dass mutierte Gene genetisch markiert sind, kann jedes Gen von Interesse oder jede Chromosomenregion markiert sein, und die Aufrechterhaltung und Vererbung des Gens kann in ähnlicher Weise überwacht werden. Wie hier verwendet ist ein identifiziertes mutiertes Gen ein mutiertes Gen, das bekannt ist oder das identifiziert wurde, im Gegensatz zu einem mutierten Gen, das in einem Organismus anwesend sein könnte aber das noch nicht erkannt wurde.
Genetisches Kartieren mutierter Gene oder Transgene im Fisch kann durch Verwendung eingeführter Techniken und den Prinzipien genetischen Kreuzens ausgeführt werden. Allgemein bezieht Kartieren das Bestimmen der Kopplungsverhältnisse zwischen genetischen Elementen ein, durch Bestimmen ob und in welchem Ausmaß zwei oder mehr genetische Elemente dazu tendieren in genetischen Kreuzungen zu kosegregieren.

8. Identifizieren von Fisch der ein mutiertes Gen geerbt hat

Mutierter Fisch, in dem das mutierte Gen mit einem ein Reportergen exprimierenden exogenen Konstrukt markiert ist vereinfacht die Identifikation von Fischnachkommen, die das mutierte Gen tragen. Zum Beispiel können nach einer Kreuzung Fischnachkommen auf die Expression des Reporterproteins getestet werden. Die, die das Reportergen exprimieren sind sehr wahrscheinlich diese, die das markierte Gen, das genetisch verbunden ist, geerbt haben. Die Fischnachkommen, die das Reporterprotein nicht exprimieren, können von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
Obwohl die Rekombination während der Gametogenese in der Aufteilung der exogenen Konstrukte von den mutierten Genen resultieren sollte, wird dies nur selten geschehen. Anfängliche Suchtests für den Reporterprotein exprimierenden Fisch wird dennoch sicherstellen, dass die Mehrheit solcher Fischnachkommen dieses mutierte Gen tragen werden. Die Bestätigung der Mutante kann durch anschließendes direktes Testen auf das mutierte Gen hergestellt werden.

9. Identifizieren und Klonieren regulatorischer Sequenzen von Fisch

Die offenbarten Konstrukte können auch als "Enhancerfallen" verwendet werden, um transgenen Fisch zu erzeugen, der gewebespezifische Expression eines Expressionsproduktes zeigt. Die transgenen Tiere, die Enhancerfallenkonstrukte tragen zeigen oft Gewebe-spezifische Expressionsmuster aufgrund der Wirkung endogener Enhancerelemente, die nahe an der Position der Integration liegen.
Ist einmal bestimmt, dass das exogene Konstrukt operativ mit einem Enhancer oder einer anderen regulatorischen Sequenz in einem Fisch verbunden ist, kann das regulatorische Element durch Reklonieren des Transgenkonstruktes isoliert werden. Viele übliche Klonierungstechniken können für diesen Zweck verwendet werden. Eine bevorzugte Methode des Klonierens regulatorischer Sequenzen, die mit einem Transgenkonstrukt verbunden wurden, ist es die genomische DNA eines Fisches zu isolieren und mit einem Restriktionsenzym zu schneiden, das nicht das exogene Konstrukt schneidet. Die sich ergebenden Fragmente können in vitro kloniert und auf die Gegenwart charakteristischer transgener Sequenzen abgesucht werden. Eine Suche nach Enhancern im Zebrafisch, die ein Transgenkonstrukt, das nur einen Promotor operativ verbunden mit einer ein Reporterprotein kodierenden Sequenz besitzt, hat eine transgene Linie erzeugt, die das GFP ausschließlich in Drüsenzellen exprimiert.
Ein ähnliches Verfahren kann zum Identifizieren von Promotoren verfolgt werden. In diesem Fall wird ein "Promotorsonden"-Konstrukt, dem jegliche Expressionssequenzen fehlen, verwendet. Nur wenn das Konstrukt in das Genom stromabwärts der Expressionssequenzen inseriert wird, wird das Expressionsprodukt kodiert durch das Konstrukt, exprimiert werden.

10. Identifizieren von Promotoren und Enhancern in klonierten Expressionssequenzen

Die verbundenen genomischen Sequenzen der identifizierten Klone, die Expressionssequenzen enthalten oder jedes andere Nukleinsäuresegment, das Expressionssequenzen enthält, kann dann charakterisiert werden, um mögliche und tatsächliche regulatorische Sequenzen zu identifizieren. Zum Beispiel kann ein positiver Klon in einer Deletionsreihe auf die Expression im transgenen Fisch getestet werden. Die wesentlichen Sequenzen für die Expression oder für ein Expressionsmuster sind als solche identifiziert, die, wenn sie vom Konstrukt deletiert sind, die Expression oder das Expressionsmuster nicht länger unterstützen. Die Fähigkeit das Expressionsmuster eines Transgens im Fisch zu bestimmen, machen es durch Anwendung des offenbarten transgenen Fisches und der Methoden möglich, die Elemente in den regulatorischen Sequenzen eines Fischgens zu identifizieren, die für das Muster der Expression verantwortlich sind. Die offenbarten transgenen Fische gestatten, da sie routinemäßig und beständig erzeugt werden können, einen sinnvollen Vergleich der Expression der unterschiedlichen Deletionskonstrukte in den verschiedenen Fischen.
Ein Beispiel der Leistungsfähigkeit dieser Möglichkeit ist in Beispiel 2 beschrieben. Die Anwendung dieses Systems auf das Studium des GATA-2-Promotors hat zur Identifikation von Enhancerregionen geführt, die die Expression spezifisch in hämatopoetischen Vorläufern der umhüllenden Zellschicht (EVL) und dem Zentralnervensystem (ZNS) fördern. Durch ortsgerichtete Mutagenese ist entdeckt worden, dass die DNA-Sequenz CCCTCCT wesentlich für die neuronenspezifische Aktivität des GATA-2-Promotors ist. Dies wird in Beispiel 2 beschrieben.

11. Isolation von Zellen die ein Expressionsprodukt exprimieren

Unter Verwendung des Zellsortierens können, basierend auf der Gegenwart eines Expressionsproduktes, reine Populationen der Zellen, die ein Transgenkonstrukt exprimieren, von anderen Zellen isoliert werden. Wo das Transgenkonstrukt exprimiert wird, besonders in Zellstammbäumen oder Geweben, kann dies die Reinigung dieser Zellen von diesem besonderen Stammbaum ermöglichen. Diese Zellen können in einer Vielzahl von in vitro-Studien verwendet werden. Zum Beispiel können diese reinen Zellpopulationen mRNA für differentielles Display oder subtrahierende Suchtests zur Identifizierung exprimierter Gene in diesem Zellstammbaum liefern. Vorläuferzellen spezifischer Gewebe könnten auch isoliert werden. Die Etablierung solcher Zellen in Gewebekultur würde es gestatten die Wachstumsfaktorbedürfnisse dieser Zellen zu bestimmen. Solches Wissen könnte dazu verwendet werden nicht transgene Formen der gleichen Zellen oder verwandte Zellen in anderen Organismen zu kultivieren.
Das Zellsortieren wird besonders erleichtert durch Verwendung eines Konstruktes, das ein fluoreszierendes Protein oder ein, ein fluoreszierendes Produkt erzeugendes Enzym, exprimiert. Dies gestattet fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS). Ein zu diesem Zweck bevorzugtes fluoreszierendes Protein ist das grün-fluoreszierende Protein. Die Fähigkeit GFP exprimierenden transgenen Fisch in Gewebe und Zellstammbaum spezifischer Weise für verschiedene Zelltypen zu erzeugen, zeigt an, dass transgener Fisch, der GFP in anderen Gewebetypen exprimiert in einer einfachen Weise erzeugt werden kann. Der offenbarte FACS-Ansatz kann daher als eine generelle Methode zur Isolierung reiner Zellpopulationen aus sich entwickelnden Embryonen, einzig basierend auf dem Genexpressionsmuster, verwendet werden. Diese Methode zur Isolation spezifischer Zellstammbäume wird bevorzugt ausgeführt unter Verwendung von Konstrukten, die GFP mit den Expressionssequenzen von Genen, die als in die Entwicklung involviert und identifiziert wurden, verbinden. Zahlreiche solcher Gene sind oder können als Mutanten, die die Entwicklung beeinflussen, identifiziert werden. Auf diese Weise isolierte Zellen sollten in Transplantationsexperimenten nützlich sein.

Beispiele

Beispiel 1: Gewebespezifische Expression und Keimbahntransmission eines Transgens im Zebrafisch

In diesem Beispiel wurden DNA-Konstrukte, die mögliche Zebrafischexpressionssequenzen von GATA-1, der ein Erythrozyten-spezifischer Transkriptionsfaktor ist, enthalten, operativ mit einer das grün-fluoreszierende Protein (GFP) kodierenden Sequenz verbunden, und in Einzelzellzebrafischembryonen mikroinjiziert.
GATA-1, ein früher Marker des Erythrozytenstammbaumes, war anfänglich durch seine Wirkung auf die Globingenexpression identifiziert worden (Evans and Felsenfeld, Cell 58: 877- 85 (1989); Tsai et al., Nature 339: 446-51 (1989)). Seither ist gezeigt worden, dass GATA-1 ein Mitglied einer Multigenfamilie ist. Die Mitglieder dieser Genfamilie kodieren Transkriptionsfaktoren, die die DNA-Kernconsensussequenz WGATAR erkennen (SEQ ID NO: 18). Die GATA-Faktoren sind Schlüsselregulatoren vieler wichtiger Entwicklungsprozesse in Vertebraten, besonders der Hämatopoese (Orkin, Blood 80: 575-81 (1992)). Die Bedeutung von GATA-1 für die Hämatopoese war definitiv in Nullmutationen der Maus dargestellt worden (Pevny et al., Nature 349: 257-60 (1991)). Chimäre Mäuse, deren embryonale Stammzellen eine Nullmutation von GATA-1, hergestellt via homologer Rekombination tragen, trugen zu allen getesteten nicht hämatopoetischen Geweben und zu einer Fraktion weißer Blutzellen bei, versagten aber reife rote Blutzellen hervorzubringen.
Im Zebrafisch ist die GATA-1-Expression auf Erythrozyten Vorläuferzellen beschränkt, die ursprünglich eine ventral extraembryonale Position besetzen, ähnlich der Situation, die in anderen Vertebraten gefunden wird (Detrich et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 10713-7 (1995)). Da sich die Entwicklung fortsetzt dringen diese Zellen in den Zebrafischembryo ein und bilden eine distinkte Struktur, die als die hämatopoetische intermediäre Zellmasse (ICM) bekannt ist.
Die Vertebraten-Hämatopoese ist ein komplexer Vorgang, der in distinkten Phasen und an verschiedenen Orten während der Entwicklung abläuft (Zon, Blood 86: 2876-91 (1995)). Obwohl Studien an in vitro-Modellsystemen einen gewissen Einblick in die hämatopoetische Entwicklung gebracht hat (Cumano et al., Cell 86: 907-16 (1996); Kennedy et al., Nature 386: 488-493 (1997); Medvinsky and Dzierzak, Cell 86: 897-906 (1996); Nakano et al., Science 272: 7224 (1996)), ist der Ursprung hämatopoetischer Vorläuferzellen während der Vertebratenembryogenese immer noch strittig. Deshalb sollte ein in vivo-Modell zur genauen Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen, die in die hämatopoetische Entwicklung einbezogen sind, nützlich sein. Ein solches Modell könnte auch verwendet werden, um Verbindungen und Gene, die die Hämatopoese beeinflussen, zu identifizieren. In Säugern ist es schwer hämatopoetische Prozesse sorgfältig zu beobachten, da die Embryogenese intern abläuft.
Die Zebrafische haben eine Anzahl von Eigenschaften, die das Studium der Vertebraten- Hämatopoese erleichtern. Da die Entwicklung extern ist und Embryonen nahezu transparent sind, kann die Wanderung markierter hämatopoetischer Zellen einfach überwacht werden. Zusätzlich sind viele Mutanten, die fehlerhaft in der hämatopoetischen Entwicklung sind, erzeugt worden (Ransom et al., Development 123: 311-319 (1996); Weinstein et al., Development 123: 303-309 (1996)). Zebrafischembryonen, die einen signifikanten Mangel an zirkulierendem Blut haben, können für einige Tage überleben, so dass die Stromabwärtswirkungen der Mutationen, auf die, für die embryonale hämatopoetische Entwicklung schädliche Genexpression, charakterisiert werden kann. Da die zellulären Prozesse und die molekulare Regulation der Hämatopoese im Allgemeinen über die Vertebratenevolution konserviert sind, können die Ergebnisse der Studien an Zebrafischembryonen auch Einblick in die, in die Säugerhämatopoese einbezogenen Mechanismen, liefern.

Klonieren und Sequenzieren von GATA-1 genomischer DNA

Eine genomische Phagenbibliothek des Zebrafischs wurde mit einer ³²P-radioaktiv markierten Sonde, die eine Region der Zebrafisch GATA-2-cDNA enthält, die einen konservierten Zinkfinger kodiert, getestet. Es wurde eine Anzahl positiver Klone isoliert. Die Inserts in diesen Klonen wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Die sich ergebenden Fragmente wurden in pBluescript II KS(-) subkloniert und sequenziert. Basierend auf der DNA-Sequenzanalyse wurde gezeigt, dass zwei Phagenklone Zebrafisch GATA-1- Sequenzen enthielten. Die cDNA-Sequenz des Zebrafisch GATA-1 wird von Detrich et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 10713 (1995) beschrieben. Die Nukleotidsequenz der GATA-1- Promotorregion ist in der SEQ ID Nr: 26 dargestellt.

Plasmidkonstrukte

Das Konstrukt G1-(BgI)-GM2 wurde durch Ligieren eines modifizierten GFP-Reportergens (GM2) an ein 5,4 kb EcoRI/BgIII-Fragment hergestellt, das mögliche Zebrafisch-GATA-1- Expressionssequenzen enthält, d. h. die 5'-flankierenden Sequenzen stromaufwärts der Haupt-GATA-1-Transkriptionsstartstelle. GM2 enthält 5' ein wildtyp-GFP und 3 ein NcoI/EcoRI-Fragment, das abgeleitet von einer GFP-Variante, m2, ist, die annäherungsweise eine 30-fach größere Fluoreszenz abstrahlt als das wildtyp-GFP unter Standard-FITC- Bedingungen (Cormack et al., Gene 173: 33-8 (1996)). Dieses Konstrukt wird als Konstrukt (1) in Darstellung 2 erläutert.
Um die Expressionssequenzen in der 5'-nicht-translatierten Region von GATA-1 zu isolieren, wurde ein 5,6 kb DNA-Fragment mittels der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR), aus einem GATA-1-genomischen Subklon mittels eines T7-Primers, der komplementär zu der Vektorsequenz ist und einem spezifischen Primer, Oligo (1), der komplementär zu der cDNA-Sequenz gerade 5' des GATA-1-Translationsstarts ist, amplifiziert. Der GATA-1- spezifische Primer enthielt eine BamHI-Stelle um die anschließende Klonierung zu erleichtern. Die PCR-Reaktion wurde mit dem ExpandTM Long Template PCR-System (Boehringer Mannheim) für 30 Zyklen (94ºC, 30 Sekunden; 60ºC, 30 Sekunden; 68ºC, 5 Minuten) ausgeführt. Nach Verdau mit BamHI und XhoI wurde das 5,6 kb DNA-Fragment gel-gereinigt, und mit einer, das modifizierte GFP kodierenden DNA ligiert, was in dem Konstrukt G1-GM2 resultierte (Konstrukt (2) in Fig. 2). Das Konstrukt G1-(5/3)-GM2 wurde hergestellt, durch Ligieren einer zusätzlichen 4 kb GATA-1-genomischen Sequenz, die GATA-1 Intron- und Exonsequenzen enthält, an das 3'-Ende (folgend dem Polyadenylierungssignal) des Reportergens in Konstrukt G1-GM2. Dieses Konstrukt ist als Konstrukt (3) in Fig. 2 dargestellt.

Fische und Mikroinjektion

Wildtyp-Zebrafischembryonen wurden für alle Mikroinjektionen verwendet. Die Zebrafische wurden ursprünglich von einer Tierhandlung erhalten (Culp et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 7953-7 (1991)). Die Fische wurden in durch Umkehrosmose gereinigtem Wasser gehalten, dem Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH.) zugegeben wurde (50 mg/l). Die Plasmid DNA G1-GM2 wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms AatII (das Vektorrückgrat schneidet) linearisiert, während die Plasmid DNA G1-(5/3)-GM2 aus dem Vektor durch Verdau mit dem Restriktionsenzym SacI herausgeschnitten und mittels eines Gels, aus niedrigschmelzender Agarose, aufgetrennt wurde. Die DNA-Fragmente wurden durch Verwendung des GENECLEAN II Kits (Bio101 Inc.) gereinigt und in 5 mM Tris, 0,5 mM ED- TA, 0,1 M KCl zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml, vor der Mikroinjektion resuspendiert. Einzelzellembryonen wurden vorbereitet und wie bei Culp et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 7953-7 (1991) beschrieben injiziert, mit der Ausnahme, dass Tetramethyl- Rhodamindextran als Injektionskontrolle miteinbezogen wurde. Dies schloss das Sammeln neu befruchteter Eier, das Entfernen des Chorions der Eier mit Pronase (verwendet zu 0,5 mg/ml), und Injizieren der DNA, ein. Die Injektion mit jedem Konstrukt wurde unabhängig voneinander 5- bis 10-mal ausgeführt, und die erhaltenen Messwerte wurden vereinigt.

Fluoreszenzmikroskopische Beobachtungen und Bildgebung

Die Embryonen und adulteen Fische wurden mit Tricain (Sigma A-5040) wie vorhergehend beschrieben (Westerfield, The Zebrafish Book (University of Oregon Press, 1995)) betäubt und unter einem FITC-Filter, auf einem, mit einer Video-Kamera ausgestatteten Zeiss- Mikroskop, untersucht. Die Bilder zirkulierender Blutzellen wurden durch Ausdrucken individueller Raster aufgezeichneter Videos hergestellt. Andere Bilder fluoreszierender Embryonen wurden durch Übereinanderschichten eines Hellfeldbildes mit einem Fluoreszenzbild, unter Verwendung der Adobe Photoshop-Software, hergestellt. Ein Monat alte Fische wurden betäubt und dann rasch in OCT eingebettet. Schnitte von 60 um wurden unter Verwendung eines Kryostats geschnitten und sofort mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

Identifikation von Keimbahn transgenem Fisch durch PCR

Die DNA-Isolation, die internen Kontrollprimer und PCR-Bedingungen waren die gleichen wie bei Lin et al., Dev Biol 161: 77-83 (1994)) beschrieben. In Kürze, DNA wurde extrahiert aus Pools von 40 bis einigen Hundert vom Chorion befreiter Embryonen (erhalten aus der Paarung eines einzelnen Fischpaars) nach 16 bis 24 Stunden der Entwicklung, durch Schütteln für 1 Minute in einem Puffer, der 4 M Guanidiumisothiocyanat, 0,25 mM Natriumcitrat (pH 7,0), 0,5% Sarkosyl und 0,1 M β-Mercaptoethanol enthält. Die Probe wurde einmal mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und die Gesamtnukleinsäure wurde durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 5,5) gefällt. Das Sediment wurde einmal in 70%igem Ethanol und in 1X TE (pH 8,0) gelöst.
Ungefähr 0,5 ug der DNA wurde in einer RCR-Reaktion verwendet, die 20 mM Tris (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 25 mM KCl, 100 ug/ml Gelatine, 20 pmole jeden PCR-Primers, 50 uM jeden dNTPs, 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Pharmacia) enthält. Die Reaktion wurde ausgeführt bei 94ºC für 2,5 Minuten für 30 Zyklen mit einer 5-minütigen anfänglichen 94ºC Denaturierungsphase und mit einem 7-minütigem finalen 72ºC Elongationsschritt. Die spezifischen Primer, Oligos (2) und (3), die verwendet wurden um GFP nachzuweisen, erzeugten ein 267 bp-Produkt. Ein Paar interner Kontrollprimer, die homolog zu Sequenzen des Zebrafisch-Homeobox-Gens, ZF-21 (Njolstad et al., FEBS Letters 230: 25-30 (1988)) sind, wurden in jede Reaktion einbezogen. Dieses Primerpaar sollte für alle PCR-Reaktionen, die Zebrafisch-DNA verwenden ein PCR-Produkt von 475 bp erzeugen.

Herstellung embryonaler Zellen und Durchfluss-Zytometrie

Die Embryonen wurden in Holfereter's-Lösung unter Verwendung eines Sedimentstößels (Kontes Glass, OEM749521-1590) aufgebrochen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (400 g, 5 Minuten) gesammelt. Nach Verdau mit 1X Trypsin/EDTA für 15 Minuten bei 32ºC, wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepuffertem Salz (PBS) gewaschen und durch ein 40 Mikron-Nylonnetz gefiltert. Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) wurde unter Standard-FITC-Bedingungen ausgeführt.

cDNA-Synthese und PCR

Die Gesamt-RNA wurde aus FACS-gereinigten Zellen mittels des RNA-Isolationskits, TRI- ZoL (Bio101) extrahiert. Die reverse Transkription und die PCR (RT-PCR) wurden unter Verwendung des Access RT-PCR-Systems von Promega (Katalog # A1250) ausgeführt. Die spezifischen Primer, Oligos (4) und (5), die zum Nachweis der Zebrafisch-GATA-1-cDNA verwendet wurden, erzeugten ein 410 bp-Produkt. Oligonukleotide

Ganzpräparat RNA in situ Hybridisierung

Die Sinn- und Antisinn-Digoxigenin-markierten RNA-Sonden wurden aus einem GATA-1- genomischen Subklon, der die zweite und die dritte Exon kodierende Sequenz enthält, mittels eines DIG/GeniusTM 4 RNA-Markierungskits (SP6/T7) (Boehringer Mannheim) hergestellt. Die RNA in situ Hybridisierungen wurden wie beschrieben (Westerfield, The Zebrafish Book (University of Oregon Press, 1995)) ausgeführt.

Genomische Struktur von Zebrafisch-GATA-1

Zwei Klone, die Zebrafisch-GATA-1-Sequenzen enthalten, wurden wie oben beschrieben aus einer lambda-Phagen Zebrafisch-genomischen Bibliothek, isoliert. Restriktionsenzymkartierung zeigte an, dass die zwei überlappenden Klone ungefähr 35 kb des GATA-1-Locus enthielten. Um den Promotor des Zebrafisch-GATA-1-Gens zu definieren, wurden die Transkriptionsinitiationsstellen für Zebrafisch-GATA-1 durch Primerextensionsanalyse kartiert. Wie im Huhn, der Maus, dem Menschen und anderen Arten wurden mehrfach Transkriptionsinitiationsstellen identifiziert. Eine Haupttranskriptionsinitiationsstelle wurde 187 Basen stromaufwärts des Translationsstartes gelegen, kartiert.
Ein Vergleich der GATA-1-genomischen Struktur für den Menschen, die Maus und das Huhn legten nahe, dass die Intron-Exton-Verbindungssequenzen dieses Gens, wahrscheinlich in allen Vertebraten konserviert sind. Oligonukleotidprimer wurden entworfen, die mögliche GATA-1-Introns flankieren und zum Sequenzieren der Zebrafisch-genomischen Klone verwendet. Die Sequenzanalyse ergab, dass das Zebrafisch-GATA-1-Gen aus fünf Exons und vier Introns besteht, die innerhalb einer 6,5 kb-genomischen Region liegen (Fig. 1). Obwohl die Exon-Intron-Anzahl und die Verbindungssequenzen gut zwischen dem Zebrafisch und anderen Vertebraten konserviert sind, sind die Zebrafisch-GATA-1-Introns kleiner als die anderer Arten.

Kurzzeitige GFP-Expression in Zebrafischembryonen angetrieben durch den GATA-1- Promotor

Basierend auf der Zebrafisch-GATA-1-genomischen Struktur wurden drei GFP- Reportergenkonstrukte (Fig. 2) erzeugt. Das Konstrukt G1-(BgI)-GM2 wurde durch Ligation eines modifizierten GFP-Reportergens (GM2) an ein 5,4 kb EcoRI/BgIII-Fragment erzeugt, das die 5'-flankierenden Sequenzen stromaufwärts der Haupt-GATA-1-Transkriptionsstelle gelegen, enthält. Das Konstrukt G1-GM2 enthielt eine 5,6 kb-Region, die stromaufwärts des Translationsstarts von GATA-1 gelegen ist. Das dritte Konstrukt G1-(5/3)-GM2 wurde durch Ligation einer zusätzlichen 4 kb-genomischen Sequenz von GATA-1, die Intron- und Exon- Sequenzen enthält, an das 3'-Ende des Reportergens in Konstrukt G1-GM2, erzeugt. Jedes Konstrukt wurde in das Zytoplasma von Einzelzell-Zebrafischembryonen mikroinjiziert. Die GFP-Reportergenexpression in den Embryonen wurde zu einer Anzahl unterschiedlicher Entwicklungsstadien durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
Die GFP-Expression wurde in Embryonen, die entweder mit Konstrukt G1-GM2 oder Konstrukt G1-(5/3)-GM2 injiziert wurden, bereits bei 80% vorliegender Epibolie, ungefähr 8 Stunden nach der Befruchtung (pf) beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt waren GFP-positve Zellen auf die ventrale Region der injizierten Embryonen beschränkt. Nach 16 Stunden pf war die GFP-Expression deutlich in der sich entwickelnden intermediären Zellmasse (ICM), dem frühesten hämatopoetischen Gewebe im Zebrafisch sichtbar. Nach 24 Stunden pf waren GFP-positive Zellen in dem zirkulierenden Blut zu beobachten und konnten ununterbrochen in dem zirkulierenden Blut für einige Monate beobachtet werden. Während der ersten fünf Tage pf zeigte die Untersuchung zirkulierenden Blutes zwei verschiedene Zellpopulationen mit unterschiedlichem Grad der GFP-Expression. Ein Zelltyp war größer und heller, der andere schmaler und weniger hell. Kein signifikanter Unterschied im GFP- Expressionsgrad war zwischen den entweder mit Konstrukt G1-GM2 oder G1-(5/3)-GM2 injizierten Embryonen nachweisbar. Indessen ergab die Injektion von Konstrukt G1-(BgI)- GM2 sehr schwache GFP-Expression in sich entwickelnden Embryonen. Dieses Ergebnis zeigte an, dass entweder die GATA-1-Transkriptionsinitiationsstelle durch den BgIII- Restriktionsverdau entfernt wurde, oder dass die 5' nicht-translatierte Region von Zebrafisch-GATA-1 für hochgradige gewebespezifische GFP-Expression nötig ist. Es ist nicht überraschend, dass einem Konstrukt, dem die 5' nicht-translatierte Region von GATA-1 fehlt, keine hohe GFP-Expression in mikroinjizierten Embryonen erzeugt. Diese Regionen werden häufig für die Stabilität des Transkriptes benötigt. Manchmal enthalten diese Regionen auch Stellen für Regulatoren der Genexpression.
Mindestens 75% der mit dem G1-GM2 oder G1-(5/3)-GM2 Konstrukt injizierten Embryonen zeigte einen gewissen Grad von ICM-spezifischer GFP-Expression (Tabelle 2). Die Anzahl GFP-positiver Zellen in dem ICM oder in der Zirkulation reichte von einer einzigen Zelle bis zu einigen hundert Zellen. Weniger als 7% dieser Embryonen zeigte GFP-Expression in nicht hämatopoetischen Geweben, die gewöhnlich auf weniger als zehn Zellen pro Embryo begrenzt waren. Nicht spezifische GFP-Expression wurde gewöhnlich in der Chorda dorsalis, dem Muskel und den umhüllenden Zellschichten beobachtet, und war auf nicht mehr als 10 Zellen pro Embryo begrenzt. Diese Beobachtungen zeigten an, dass ein genomisches GATA-1-Fragment, das sich ungefähr über 5,6 kb stromaufwärts von der GATA-1- Translationsstartstelle erstreckt, ligiert an GFP, ausreicht, um das Muster embryonaler GATA-1-Expression im Zebrafisch zu wiederholen. Tabelle 2
aStarke GFP-Expression heißt, dass jeder Embryo mehr als 10 grün-fluoreszierende Zellen in der ICM hat.

GFP-Expression in Keimbahn-GATA-1/GFP-transgenem Zebrafisch

Mikroinjizierte Zebrafischembryonen wurden bis zur Geschlechtsreife gezüchtet und gepaart. Die Nachkommen wurden durch PCR getestet, um die Frequenz der Keimbahntransmission des GATA-1/GFP-Trangsgens zu bestimmen. Neun von sechshundertzwei- undsiebzig Gründerfischen haben GFP auf die F1-Generation übertragen. Die Untersuchung dieser Fische mittels Fluoreszenzmikroskopie erbrachte, dass sieben von acht Linien GFP in der ICM und in zirkulierenden Blutzellen exprimieren. Die GFP-Expressionsmuster in der ICM standen im Einklang mit den vorhergehend beobachteten RNA in situ Hybridisierungsmustern für die GATA-1-mRNA Expression in Zebrafisch (Detrich et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 10713-7 (1995)). In den zwei Linien, in denen F2-transgene Fische beobachtet wurden, wurde in 50% der Nachkommen GFP-Expression in den Blutzellen beobachtet, wenn eine transgene F2 mit einem nicht transgenen Fisch gepaart wurde. Dies zeigte an, dass GFP auf die Nachkommen nach Mendel übertragen wurde. Southern Blot- Analysen zeigten, dass GFP-Transgeninsertionen in diesen zwei Linien, an verschiedenen Orten, vorkommen. In einer Linie tragen die transgenen Fische offensichtlich 4 Kopien und in der anderen Linie 7 Kopien des Transgens.
Die Blutzellen wurden von 48 Stunden altem transgenen Fisch durch Herzpunktion gesammelt und ein Blutausstrich wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie betrachtet. Zwei unterschiedliche Populationen fluoreszierender Zellen wurden in diesen Ausstrichen beobachtet. Wie in der Zirkulation der Embryonen, die vorübergehend GFP exprimieren, wurde eine Zellpopulation beobachtet die groß und hell war und eine andere die klein und weniger hell war. Obwohl, die von dem adulten transgenen Zebrafisch gesammelten Blutzellen einige Variabilität in der Fluoreszenzintensität zeigten, schienen sie die gleiche Größe zu haben. Gesammelte Blutzellen von nicht transgenem Fisch zeigten keine Fluoreszenz.
In zwei Tage altem transgenen Fisch wurde im Herzen schwache GFP-Expression beobachtet. Die GFP-Expression wurde auch in den Augen und in drei von sieben transgenen Linien in einigen Neutronen des Rückenmarks beobachtet. Die Expression in den Augen gipfelte zwischen 30 und 48 Stunden pf und wurde am Tag 4 extrem schwach. Es wird angenommen, dass die Expression von GFP in den Augen und den Neuronen das authentische GATA-1-Expressionsmuster widerspiegelt.
Die Untersuchung der GFP-Expression in Geweben von einem Monat alten Fischen zeigte, dass die Kopfniere eine große Anzahl fluoreszierender Zellen enthält. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die Niere der Ort der adulten Erythrozytenbildung im Zebrafisch ist. Es ist berichtet worden, dass GATA-1 in den Hoden von Mäusen exprimiert wird. Die Expression von GFP wurde nicht in den Hoden sezierter adulter Fische gefunden. Es ist möglich, dass dem offenbarten GATA-1-Transgenkonstrukt ein notwendiger Enhancer für die Hodenexpression von GATA-1 fehlt. Andere Gewebe einschließlich des Gehirns, des Muskels und der Leber hatten keinen nachweisbaren GFP-Expressionsgrad.

FACS-Analyse von GATA-1/GFP-transgenem Fisch

Die GFP-Expression in GATA-1/GFP-transgenem Fisch gestattet die Isolation von reinen Populationen der frühesten Erythrozytenvorläuferzellen für in vitro Studien, mittels fluoreszenzaktivierten Zellsortierens. Transgene F1-Embryonen wurden zu Beginn der GFP- Expression gesammelt und Zellsuspensionen wurden hergestellt. Ungefähr 3,6% der Zellpopulationen des gesamten transgenen Fisches waren im Vergleich zu 0,12% der nicht transgenen Fische fluoreszenzpositiv. Basierend auf der Anzahl der verwendeten Embryonen legte die FACS-Analyse nahe, dass ungefähr dreihundert Erythrozytenvorläuferzellen pro Embryo, 14 Stunden nach pf vorhanden sind.
Um festzustellen, ob die FACS-gereinigten Zellen für GATA-1 angereichert sind, wurde RNA aus diesen Zellen isoliert und der GATA-1 mRNA-Spiegel wurde durch RT-PCR bestimmt. Diese Ergebnisse zeigten an, dass diese Zellen hoch angereichert waren für GATA-1 mRNA.
Die Erythrozyten-spezifische Expression wurde in lebenden Embryonen während der frühen Entwicklung beobachtet. Fluoreszierende zirkulierende Blutzellen wurden in mikroinjizierten Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung nachgewiesen und konnten noch in zwei Monate altem Fisch beobachtet werden. Die von injizierten Gründern erhaltenen Keimbahntransgenen Fische setzten in den F1- und F2-Generationen die GFP-Expression in erythroiden Zellen fort. Die GFP-Expressionsmuster im transgenen Fisch standen im Einklang mit dem erzeugten RNA in situ Hybridisierungsmuster für die GATA-1 mRNA-Expression. Diese transgenen Fische gestatteten die Isolation der frühesten Erythrozytenvorläuferzellen aus sich entwickelnden Embryonen durch FACS. Unter Verwendung von Konstrukten, die andere Zebrafisch-Promotoren und GFP enthalten, wird es möglich sein transgenen Fisch zu erzeugen, der eine andauernde Beobachtung des Ursprungs und der Migration, einer jeden Stammbaum-spezifischen Vorläuferzelle, in einem lebenden Embryo gestattet.
Die in diesem Beispiel beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass das Überwachen der GFP- Expression eine viel sensitivere Methode sein kann als der RNA in situ Nachweis, durch welchen Genexpressionsmuster bestimmt werden. In den offenbarten GATA-1/GFP- transgenen Fischen z. B. gestattet die GFP-Expression in zirkulierenden Blutzellen, zwei Typen von Zellen zu unterscheiden. Der eine Zelltyp war größer und heller, der andere kleiner und weniger hell. Dort waren weniger von dem großen und hellen Zelltyp. Von diesen Zellen wird angenommen, dass sie Erythrozytenvorläufer sind, während die zahlreicheren kleineren Zellen als vollständig differenzierte Erythrozyten angesehen werden. Vorläufige Zelltransplantationsexperimente mit embryonalen Blutzellen haben gezeigt, dass sie eine Zellpopulation enthalten, die Langzeitproliferationsfähigkeiten besitzt.
In zwei Tage alten transgenem Zebrafisch wurde GFP-Expression im Herzen beobachtet. In adultem transgenem Zebrafisch wurde GFP-Expression in der Niere beobachtet. Durch histologische Methoden ist gezeigt worden, dass die Herzinnenhaut ein Übergangsort der Hämatopoese im embryonalen Zebrafisch ist, und dass die Niere der Ort der adulten Hämatopoese ist (AI-Adhami and Kunz, Develop. Growth and Differ. 19: 171-179 (1977)). Die Ergebnisse aus GATA-1/GFP-transgenem Fisch stützen diese Beobachtungen.
Die in den Augen und Neuronen embryonaler transgener Fische beobachtete GFP- Expression könnte dem Fehlen eines transkriptionalen Abschalters, in den Transgenkonstrukten, zuzuschreiben sein. Es erscheint unwahrscheinlich, dass die GFP-Expression in den Augen einer Lagewirkung, verursacht durch den Ort der Insertion, zuzuschreiben ist, da alle sieben transgenen Linien GFP-Expression in embryonalen Fischaugen haben.
Unter Verwendung fluoreszenzaktivierten Zellsortierens wurden reine Populationen hämatopoetischer Vorläuferzellen aus der ICM transgenen Zebrafisches isoliert. Da ungefähr 10&sup7; Zellen pro Stunde sortiert werden können, können 10&sup5; bis 10&sup6; gereinigte ICM-Zellen in wenigen Stunden erhalten werden. Diese Zellen, die aus dem frühesten Ort der Hämatopoese im Zebrafisch stammen, können in einer Mannigfaltigkeit von in vitro Studien verwendet werden. Diese reinen Zellen z. B. können mRNA für differentielles Display oder subtrahierende Suchtests, zur Identifizierung neuer hämatopoetischer Gene, zur Verfügung stellen. Die aus der ICM erhaltenen Erythrozytenvorläufer sollten auch in Gewebekultur gebildet werden. Dies würde gestatten die Wachstumsfaktorbedürfnisse dieser Zellen zu bestimmen.
Der oben beschriebene Ansatz, die Transgenexpression in erythroiden Zellen zu erhalten und zu studieren, ist allgemein auf das Studium jeden entwicklungsabhängig regulierten Prozesses anwendbar. Dieser Ansatz kann auch auf die Identifikation von cis-wirkenden Promotorelementen angewendet werden, die für die Gewebe-spezifische Genexpression benötigt werden (siehe Beispiel 2). Die Analyse der Promotoraktivität in einem Gesamttier ist wünschenswert, da dynamische zeitliche und räumliche Änderungen in einem zellulären Mikromilieu nur schlecht in vitro kopiert werden können. Die Leichtigkeit eine große Anzahl transgene Zebrafischlinien herzustellen und zu versorgen, macht das Erhalten statistisch signifikanter Ergebnisse durchführbar. Transgener Zebrafisch schließlich, der GFP in spezifischen Geweben exprimiert, stellt nützliche Marker zur Identifizierung von Mutationen zur Verfügung, die diese Linien in genetischen Suchtests beeinflussen. Da die genetischen Resourcen und embryologischen Verfahren für Zebrafisch verfügbar sind, ist transgener Zebrafisch, der Gewebe-spezifische GFP-Expression zeigt, ein wertvolles Werkzeug für das Untersuchen von Entwicklungsprozessen.

Beispiel 2: Identifikation von Enhancern in GATA-2-Expressionssequenzen

Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass neuronale Zelldetermination in Invertebraten in fortschreitenden Wellen vorkommt, die durch aufeinanderfolgende Kaskaden von Transkriptionsfaktoren reguliert werden. Viel weniger ist über diesen Prozess in Vertebraten bekannt. Es wurde erkannt, dass ein ergänzender Ansatz, der die embryologischen, genetischen und molekularen Verfahren kombiniert, wie der zum Studium der Neurogenese in Drosophila (Ghysen et al., Genes & Dev 7: 723-33 (1993)), die Identifikation der molekularen Mechanismen erleichtern würde, die in die Spezifizierung des neuronalen Schicksals in Vertebraten verwickelt sind. Das Folgende ist ein Beispiel der Identifikation von cis- wirkenden Sequenzen, die die Neuronen-spezifische Genexpression in einem Vertebraten kontrollieren. Eine solche Identifikation ist ein anfänglicher Schritt hin auf das Entwirren ähnlicher Kaskaden in einem Vertebraten.
Die Transkriptionsfaktoren binden an cis-wirkende DNA-Sequenzen (die gelegentlich als Antwortsequenzen bezeichnet sind), um die Transkription zu regulieren. Oft sind diese Transkriptionsfaktoren Mitglieder einer Multigenfamilie, die überlappende aber verschiedene Expressionsmuster und Funktionen haben. Der Transkriptionsfaktor GATA-2 ist ein Mitglied einer solchen Genfamilie (Yamamoto et al., Genes Dev 4: 1650-62 (1990)). Jedes Mitglied der GATA-Genfamilie ist durch die Fähigkeit charakterisiert an cis-wirkende DNA-Elemente mit der Consensuskernsequenz WGATAR zu binden (Orkin, Blood 80: 575-81 (1992); SEQ ID Nr: 18). Alle Proteinprodukte der GATA-Familie enthalten zwei Kopien eines hoch konservierten strukturellen Motivs, das allgemein als ein Zinkfinger bekannt ist, der für die DNA- Bindung benötigt wird (Martin and Orkin, Genes Dev 4: 1886-98 (1994)). Sechs Mitglieder der GATA-Familie sind in Vertebraten identifiziert worden (Orkin, Blood 80: 575-81 (1992), Orkin, Curr Opin Cell Biol 7: 870-7 (1995)). Pannier, ein anderes Mitglied der GATA- Genfamilie, wird in neuronalen Vorläufern von Drosophila exprimiert und hemmt die Expression von achaete-scute, einen Genkomplex, der eine entscheidende Rolle in der Neurogenese von Drosophila spielt (Ramain et al., Development 119: 1277-91 (1993)).
Im Huhn und der Maus wird der Transkriptionsfaktor GATA-2 in hämatopoetischen Vorläufern, unreifen erythroiden Zellen, proliferierenden Mastzellen, dem zentralen Nervensystem (ZNS) und den sympathischen Neuronen exprimiert (Yamamoto et al., Genes & Dev 4: 1650- 62 (1990), Orkin, Blood 80: 575-81 (1992), Jippo et al., Blood 87: 993-8 (1996)). Studien in Zebrafisch (Detrich et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 10713-7 (1995)) und Xenopus (Zon et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 19642-6 (1991), Kelley et al., Dev Diol 165: 193-205 (1994)) haben auch gezeigt, dass die GATA-2-Expression auf hämatopoetisches Gewebe und das ZNS beschränkt ist. In der Maus, über homologe Rekombination, erzeugte homozygote Nullmutanten haben tiefgreifende Ausfälle in allen hämatopoetischen Stammbäumen (Tsai et al., Nature 371: 221-6 (1994)). Die von GATA-2 gespielte Rolle im neuronalen Gewebe dieser Mäuse ist nicht sorgfältig untersucht worden, vielleicht weil die Embryonen vor Tag E11,5 sterben. Die Analyse der GATA-2-Expression in embryonalem Neuronengewebe nach Entfernen der Chorda dorsalis im Huhn hat nahegelegt, dass GATA-2 eine Rolle im Spezifizieren eines Neurotransmitterphänotyps spielt (Groves et al., Development 121: 887- 901 (1995)). Zusätzlich werden GATA-Faktoren für die Aktivität des Neuronen-spezifischen Enhancers des Gonadotropin-releasing Hormon Gens benötigt (Lawson et al., Mol Cell Biol 16: 3596-605 (1996)).
Die Wirkungen verschiedener hämatopoetischer Wachstumsfaktoren auf die GATA-2- Expression ist sorgfältig in Gewebekultursystemen studiert worden (Weiss et al., Exp Hematol 23: 99-107 (1995)), und von einigen Wachstumsfaktoren ist gezeigt worden, dass sie eine dramatische Wirkung auf die frühe embryonale GATA-2-Expression haben (Walmsley et al., Development 120: 2519-29 (1994), Maeno et al., Blood 88: 1965-72 (1996)). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass ein von mütterlicher Seite zur Verfügung gestellter CCAAT- bindender Transkriptionsfaktor, für den Beginn der GATA-2-Transkription an dem Mitte- Blastula-Übergang in Xenopus, erforderlich ist (Brewer et al., Embo J 14: 757-66 (1995)). Jedoch war vorausgehend zu der offenbarten Arbeit nichts über die Mechanismen, die die Neuronen-spezifische Expression dieses Gens kontrollieren, bekannt.

Klonieren und Sequenzieren des 5'-Anteils der GATA-2-genomischen DNA

Eine Zebrafisch-genomische Phagenbibliothek wurde mit der ³²P-radioaktiv markierten konservierten Zinkfingerregion der Zebrafisch-GATA-2-cDNA abgesucht. Zwei positive Klone, λGATA-21 und λGATA-22 wurden identifiziert. Restriktionsfragmente von λGATA-21 wurden in pBluescript II KS(-) subkloniert. Eine DNA-Sequenz der sich ergebenden Klone wurde von -4807 bis +2605 relativ zum GATA-2-Translationsstart erhalten. Die Nukleotidsequenz der GATA-2-Promotorregion ist in SEQ ID Nr: 27 gezeigt. Wenn nicht anders angegeben verwenden die Positionen innerhalb der GATA-2-Klone diese Zählweise. Die 7,3 kb Region, die stromaufwärts des Translationsstarts in λGATA-21 liegt, wurde mittels der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, unter Verwendung des ExpandTM Long Template PCR-Systems (Boehringer Mannheim), für 25 Zyklen (94ºC, 30 Sekunden; 68ºC, 8 Minuten). Die verwendeten Primer waren ein T7-Primer und ein spezifischer Primer für Sequenzen 5' zu der GATA-2-Translationsstartstelle (5'- ATGGATCCTCAAGTGTCCGCGCTTAGAA-3'; SEQ ID Nr: 19). Der GATA-2-spezifische Primer enthielt eine BamHI-Stelle, um eine anschließende Klonierung zu erleichtern. Das PCR-Produkt (P1) wurde in die SmaI/BamHI-Stelle des pBluescript II KS(-) kloniert.

Plasmidkonstrukte

Das 7,3 kb DNA-Fragment, das die möglichen GATA-2-Expressionssequenzen (P1) enthält wurde an ein modifiziertes GFP-Reportergen (GM2, wie oben beschrieben) ligiert, das in dem Konstrukt P1-GM2 (Fig. 3) resultierte. Basierend auf P1-GM2 wurden Konstrukte, die aufeinanderfolgende 5'-Deletionen in der Region stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle gelegen, enthalten, unter Verwendung der Restriktionsstellen PstI, SacI, AatII, ClaI und ScaI in dieser Stromaufwärtsregion, hergestellt (Fig. 3). Die Konstrukte nsP5-GM2 und nsP6- GM2 wurden durch Ligieren des 1116 bp-Fragments, das den GATA-2-Neuronen- spezifischen Enhancer von -4807 bis -3690 enthält, an PS-GM2 bzw. P6-GM2 hergestellt (Fig. 4). Das gleiche Fragment, das den Neuronen-spezifischen Enhancer enthält wurde auch an ein 243 bp SphI/BamHI-Fragment des Xenopus-Elongationsfaktors 1α (EF 1α) minimalen Promotor ligiert, der vorher an das GM2-Gen ligiert wurde, resultierend in dem Konstrukt ns-XS-GM2 (Fig. 4). Der EF 1α minimale Promotor ist beschrieben worden in Johnson und Krieg, Gene 147: 223-6 (1994).

PCR-Kartierung Neuronen-spezifischer Enhancer

Die PCR-Technologie wurde genutzt, um Deletionsserien innerhalb des 1116 bp Neuronen- spezifischen Enhancers zu erzeugen, unter Verwendung von nsP5-GM2 als Matrize. Insgesamt wurden 10 spezifische 22 bp lange Primer synthetisiert. Diese umfassen ns4647, ns4493, ns4292, ns4092, ns3990, ns3872, ns3851, ns3831, ns3800 und ns3789, wobei die Zahlen sich auf die Position ihrer 5'-Endbasen in der GATA-2-genomischen Sequenz beziehen. Ein T7-Primer wurde auch in den PCR-Reaktionen verwendet. Die amplifizierten Fragmente enthielten alle das GM2-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal zusätzlich zu den GATA-2-Expressionssequenzen. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des ExpandTM Long Template PCR-Systems (Boehringer Mannheim) für 25 Zyklen (94ºC, 30 Sekunden; 55ºC, 30 Sekunden; 72ºC, 2 Minuten) ausgeführt. Die PCR-Produkte wurden mit dem GENECLEAN II Kit (Bio 101 Inc.) gereinigt und anschließend für die Mikroinjektion verwendet.
Nachdem ein 31 bp Neuronen-spezifischer Enhancer identifiziert war, wurden zusätzliche Primer, die jeder 2 oder 3 mutierte Basen relativ zur wildtyp-Enhancersequenz enthielten, entworfen. Diese Primer sind (die mutierten Basen sind unterstrichen):
Diese Primer wurden in Verbindung mit dem T7-Primer für die PCR-Amplifikation der Zielsequenzen, unter Verwendung des nsP5-GM2 als Matrize, verwendet. Die PCR- Bedingungen waren identisch zu den oben beschriebenen.

Mikroinjektion des Zebrafisch

Wildtyp-Zebrafisch wurde für alle Mikroinjektionen verwendet. Die Plasmid-DNA wurde mittels Einzelschnitt-Restriktionsstellen in dem Vektorrückgrat linearisiert, mittels des GENECLEAN II Kit gereinigt (Bio 101 Inc.) und in 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 0,1 M KCl zu einer Endkonzentration von 100 ug/ml resuspendiert. Die Einzelzellembryonen wurden wie oben beschrieben mikroinjiziert. Jedes Konstrukt wurde unabhängig voneinander 2- bis 5-mal injiziert und die erhaltenen Werte wurden zusammengefasst.

Fluoreszenzmikroskopische Beobachtung

Die Embryonen wurden mittels Tricain wie oben beschrieben betäubt und unter einem FITC- Filter eines Zeiss-Mikroskops, das mit einer Video-Kamera ausgestattet ist, untersucht. Bilder die GFP-positive Zellen in lebenden Embryonen zeigen, wurden durch Übereinanderlegen eines Hellfeldbildes auf ein Fluoreszenzbild, mittels der Adobe Photoshop-Software, hergestellt.

Ganzpräparat RNA in situ Hybridisierung

Sinn und Antisinn Digoxigenin-markierte RNA-Sonden wurden aus einem GATA-2-cDNA- Subklon, der ein 1 kb-Fragment der 5'-kodierenden Sequenz enthielt, mittels DIG/GeniusTM 4 RNA Markierungskit (SP6/T7) (Boehringer Mannheim) hergestellt. Die RNA in situ Hybridisierungen wurden wie bei Westerfield beschrieben ausgeführt (The Zebrafish Book (University of Oregon Press, 1995)).

Isolation GATA-2-genomischer DNA

Zwei GATA-2-positive Phagenklone, λGATA-21 und λGATA-22 wurden wie beschrieben identifiziert. Vorläufige Restriktionsanalysen legten nahe, dass λGATA-21 eine große Region, die stromaufwärts des Translationsstartcodons liegt, enthielt. Es wurden 7412 bp dieses Klons ausgehend von -4807 bis +2605 relativ zur Translationsstartstelle sequenziert. Die vermuteten GATA-2-Expressionssequenzen (P1), die ungefähr 7,3 kb umfassen und stromaufwärts von der Translationsstartstelle des λGATA-21 liegen, wurden in einen Plasmidvektor für Expressionsstudien subkloniert.

Expressionsmuster eines modifizierten GFP-Gens, das durch den möglichen GATA-2- Promoter in Zebrafischembryonen angetrieben wird

Das Konstrukt P1-GM2 wurde durch Ligation eines modifizierten GFP-Reportergens (GM2) an P1 (Fig. 3) hergestellt. Dieses Konstrukt wurde in das Zytoplasma von Einzelzell- Zebrafischembryonen injiziert, und die GFP-Expression in den mikroinjizierten Embryonen wurde zu einer Anzahl verschiedener Entwicklungsstadien durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
Die GFP-Expression wurde anfänglich durch Fluoreszenzmikroskopie zum 4000 Zellstadium, ungefähr 4 Stunden nach Injektion (pi) beobachtet. Zum Dorsalrückenschildstadium (6 Stunden pi) wurde die GFP-Expression überall in dem angehenden ventralen Mesoderm und Ektoderm beobachtet, aber die Expression im Rückenschild war äußerst selten. Nach 16 Stunden pi wurde die GFP-Expression, in der sich entwickelnden intermediären Zellmasse (ICM), dem frühen hämatopoetischen Gewebe des Zebrafisches, beobachtet. Zusätzlich konnte die GFP-Expression in den oberflächlich gelegenen EVL-Zellen, nach 4 Stunden pi, gesehen werden. Die Expression in der EVL gipfelte zwischen 24 und 48 Stunden pi und wurde zu Tag 7 äußerst schwach. Die GFP-Expression in Neuronen, einschließlich gestreckter Axone, wurde erst nach 30 Stunden pi beobachtet und wurde auf hohem Niveau bis einschließlich Tag 8 aufrecht erhalten.
Die Embryonen, die mit dem P1-GM2-Konstrukt injiziert waren, exprimierten GFP in einer auf hämatopoetische Zellen, EVL-Zellen und das ZNS beschränkten Weise. Die GFP- Expressionsmuster in gastrulierenden Embryonen, in den Blutvorläuferzellen und in Neuronen standen im Einklang mit den RNA in situ Hybridisierungsmustern, die früher für die GATA-2-mRNA-Expression im Zebrafisch hergestellt wurden (Detrich et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 10713-7 (1995)). Indessen ist die GATA-2-Expression in der EVL nicht durch RNA in situ Hybridisierung nachgewiesen worden.
Mehr als 95% der mit P1-GM2 injizierten Embryonen hatten Gewebe-spezifische GFP- Expression (Tabelle 3). Ungefähr 5% dieser Embryonen hatten nicht spezifische GFP- Expression, die auf weniger als fünf Zellen pro Embryo begrenzt war.
Diese Beobachtungen zeigten an, dass das DNA-Fragment, das sich ungefähr über 7,3 kb stromaufwärts von der GATA-2-Translationsstartstelle erstreckt, ausreicht um das embryonale Gewebe-spezifische Muster der GATA-2-Genexpression genau zu erzeugen. Tabelle 3

Grobkartierung Gewebe-spezifischer Enhancer

Um die Anteile der GATA-2-Expressionssequenzen zu identifizieren, die für das Regulieren Gewebe-spezifischer Genexpression verantwortlich sind, wurden Konstrukte, die Deletionen in dem Promotor enthalten, hergestellt (Fig. 3). Natürlich vorkommende Restriktionsstellen wurden verwendet, um eine Serie von Bruttodeletionen in der Expressionssequenzregion zu erzeugen. Jedes Konstrukt wurde getrennt in Einzelzell-Embryonen mikroinjiziert. Die sich entwickelnden Embryonen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie in regelmäßigen Abständen an verschiedenen Tagen beobachtet.
Mit mit P2-GM2 injizierte Embryonen, die GATA-2-Sequenzen von -4807 bis +1 enthalten, exprimierten GFP in einer ähnlichen Weise wie Embryonen, die mit dem Originalkonstrukt P1-GM2 (Tabelle 3) injiziert wurden. Nach 48 Stunden pi wurde die GFP-Expression in zirkulierenden Blutzellen, dem ZNS und dem EVL beobachtet. Indessen offenbarte die sorgfältige Beobachtung injizierter Embryonen nach 16 Stunden pi, dass die Expression in dem Hinterende der ICM nahezu aufgehoben war. Dies legte nahe, dass ein Enhancer für die GATA-2-Expression in frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen, in der deletierten Region liegen dürfte. Die Expression von GFP in zirkulierenden Blutzellen stieg von ungefähr 2% auf 16% an, nahelegend, dass ein möglicher Repressor für die GATA-2-Expression in Erythrozyten auch in dieser deletierten Region liegen könnte.
Mit P3-GM2 injizierte Embryonen, die GATA-2-Sequenzen von -3691 bis +1 enthalten, exprimierten GFP in zirkulierenden Blutzellen und in der EVL, aber nicht im ZNS. Mit anderen Konstrukten injizierte Embryonen, denen die deletierte 1116 bp-Region fehlte, die sich von -4807 bis -3692 erstreckt, hatten auch keine GFP-Expression im ZNS (Tabelle 3). Es wurde geschlossen, dass die 1116 bp-Region, die sich von -4807 bis -3692 erstreckt ein Neuronen-spezifisches Enhancerelement enthielt.
Mit P4-GM2 injizierte Embryonen, die GATA-2-Sequenzen von -2468 bis +1 enthalten, zeigten ein ähnliches GFP-Expressionsmuster zu denen mit P3-GM2 injizierten. Injektion mit PS-GM2, das GATA-2-Sequenzen von -1031 bis +1 enthält, ergab einen scharten Rückgang hinsichtlich des Prozentsatzes GFP-exprimierender Embryonen in der EVL, wohingegen die GFP-Expression in zirkulierenden Blutzellen nicht beeinflusst war. Dies zeigte an, dass die 1437 bp-Region, die sich von -2468 bis -1032 erstreckt einen EVL-spezifischen Enhancer enthält. Das 1031 bp-Segment, das in PS-GM2 gegenwärtig ist, könnte die minimale Expressionssequenz verkörpern, die für die Aufrechterhaltung Gewebe-spezifischer Expression von GATA-2 erforderlich sind.

Neuronen-spezifische Enhanceraktivität

Um die Neuronen-spezifische Enhanceraktivität der 1116 bp Region zu bestätigen, die sich von -4807 bis -3692 des GATA-2 erstreckt, wurde das nsP5-GM2 durch Ligieren des 1116 bp Fragments an PS-GM2, das die 1031 bp Region enthält, die stromaufwärts vom Translationsstart des GATA-2-Gens liegt, welche operativ an eine GM2-kodierende Sequenz gebunden ist, konstruiert (Fig. 4). Ungefähr 70% der mit nsP5-GM2 injizierten Embryonen zeigten GFP-Expression im ZNS (Fig. 5), während mit P5-GM2 injizierte Embryonen keine GFP-Expression im ZNS, wie in Tabelle 3 gezeigt, hatten. Dies zeigt an, dass die 1116 bp- Region die Neuronen-spezifische Expression wirksam steuern kann.
Um zu bestimmen, ob die 1116 bp Neuronen-spezifische Enhanceraktivität milieuabhängig war, wurde das Konstrukt ns-Xs-GM2 (Fig. 4) durch Ligieren des Enhancers an den Xenopus-Elongationsfaktor 1α minimalen Promoter (Johnson und Krieg, Gene 147: 223-6 (1994)) erzeugt, der operativ verbunden ist mit der GM2-kodierenden Sequenz (Xs-GM2; Fig. 4). Wenn Embryonen mit Xs-GM2 injiziert sind, exprimierten sie GFP in verschiedenen Geweben einschließlich dem Muskel, der Chorda dorsalis, den Blutzellen und den Melanozyten. Indessen wurde keine GFP-Expression im ZNS beobachtet (Fig. 5). Die Injektion mit ns- XS-GM2 ergab, dass 8,5% der Embryonen GFP-Expression im ZNS hatten, weit weniger als man durch Injektion mit nsP5-GM2 erhält (Fig. 5). Ein anderes Konstrukt, nsP6-GM2 (Fig. 4), hatte eine zusätzliche 653 bp Deletion in der GATA-2-minimalen Expressionssequenz, die sich von -1031 bis -378 erstreckt. Injektion von nsP6-GM2 ergab, dass 6,2% der Embryonen GFP im ZNS exprimieren (Fig. 5). Injektion mit P6-GM2 ergab keine GFP- Expression im ZNS (Tabelle 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der 1116 bp-Enhancer eine gewisse Fähigkeit besitzt, um Neuronenspezifität auf einen heterogenen Promoter zu übertragen, erfordert aber zur Mitte hin gelegene Elemente innerhalb seines eigenen Promoters, um seine volle Aktivität zu entfalten.

Genaues Kartieren eines Neuronen-spezifischen cis-wirkenden regulatorischen Elements

Um den möglichen Neuronen-spezifischen Enhancer genau zu kartieren, wurde eine Serie von Konstrukten, die fortschreitende Deletionen in dem 1116 bp-DNA-Fragment enthalten, durch PCR erzeugt, unter Verwendung des nsP5-GM2 als Matrize. Die erhaltenen PCR- Produkte wurden direkt für die Mikroinjektion verwendet. Die erste Deletionsserie umfasste ns4647, ns4493, ns4292, ns4092 und ns3900 (wobei die Zahl den stromaufwärts gelegenen Endpunkt des deletierten Fragments anzeigt). Die Mikroinjektion aller 5 Mutanten ergab einen ähnlichen Prozentsatz von Embryonen, die GFP-Expression im ZNS (Fig. 6) besitzen.
Dies zeigte an, dass ein Neuronen-spezifischer Enhancer innerhalb der 298 bp-Sequenz (von -3990 bis -3692) liegt, die in ns3990 enthalten ist.
Als nächstes wurden zwei zusätzliche Deletionskonstrukte, ns3872 und ns3789, erzeugt. Wie in Fig. 6 gezeigt, hatten mehr als 60%, der mit ns3872 injizierten Embryonen GFP- Expression im ZNS, während den mit ns3789 injizierten Embryonen die GFP-Expression im ZNS fehlte. Das zeigte an, dass das Neuronen-spezifische Enhancerelement innerhalb einer 83 bp-Sequenz von -3872 bis -3790 lokalisiert war.
Die Injektion von Embryonen mit drei zusätzlichen Deletionskonstrukten, ns3851, ns3831 und ns3800 gestattete die Lokalisierung des Neuronen-spezifischen Enhancerelements auf eine 31 bp-pyrimidinreiche Sequenz. Dieses Element hat die Sequenz 5'-TCTGCGCCGCTTTCTGCCCCCTCCTGCCCTC-3' (Nukleotide 1 bis 31 der SEQ ID Nr: 20), die sich von -3831 bis -3801 innerhalb der GATA-2-genomischen DNA erstreckt.

Ortsgerichtete Mutagenese innerhalb eines Neuronen-spezifischen Enhancerelements

Um die Kernsequenz zu bestimmen, die notwendig für die Aktivität des Neuronen- spezifischen Elements ist, wurden fünf Primer, von denen jeder zwei bis drei veränderte Nukleotide innerhalb des 31 bp-Neuronen-spezifischen Elements (siehe oben) besitzt, zur Amplifikation von nsP5-GM2 verwendet. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden direkt in Einzelzell-Embryonen injiziert. Diese 31 bp-Sequenz enthält eine Ets-ähnliche Erkennungsstelle (AGGAC) in einer invertierten Orientierung, die in verschiedenen Neuronen- spezifischen Promotoren (Chang und Thompson, J. Biol Chem 271: 6467-75 (1996), Charron et al., J. Biol Chem 270: 30604-10 (1995)) anwesend ist. Daher enthalten vier der Primer, die in diesen PCR-Reaktionen verwendet wurden veränderte Nukleotide innerhalb der Ets-ähnlichen Erkennungsstelle oder in der benachbarten Sequenz. Wie erwartet zeigten die mit ns3831M1, das zwei mutierte Nukleotide enthält, die dreizehn Nukleotide stromaufwärts der Ets-ähnlichen Erkennungsstelle gelegen sind, injizierten Embryonen, wenig Veränderung in der Neuronen-spezifischen GFP-Expression (Fig. 7). Eine Mutation von 2 Nukleotiden (ns3831 M2), die drei Nukleotide stromaufwärts der Ets-ähnlichen Erkennungsstelle liegen, hatte keine Wirkung auf die Enhanceraktivität (Fig. 7). Die Mutation von zwei Nukleotiden, die gerade ein Nukleotid stromaufwärts des Ets-ähnlichen Motivs liegt, das in ns3831 M3 enthalten ist, schaltet vollständig die Neuronen-spezifische Enhanceraktivität des 31 bp-Elements (Fig. 7) ab. Die Mutation von drei Nukleotiden (ns3831 M4), von denen zwei innerhalb der Ets-ähnlichen Erkennungsstelle liegen, ergab auch eine starke Abnahme der Enhanceraktiyität (Fig. 7). Eine Mutation von zwei Nukleotiden, die innerhalb der Ets- ähnlichen Erkennungsstelle (ns3831 M5) liegen, verminderten die Neuronen-spezifische Enhanceraktivität des 31 bp-Elements um ungefähr 50% (Fig. 7). Daraus wurde geschlossen, dass ein CCCTCCT-Motiv das teilweise die Ets-ähnliche Erkennungsstelle innerhalb der 31 pb-Sequenz überlappt, absolut für die Neuronen-spezifische Enhanceraktivität erforderlich ist.
Diese genaue Untersuchung der Expressionssequenzen mittels transgenem Fisch zeigte beispielhaft, wie oben beschrieben für Zebrafisch und mit GATA-2, das er ein System zur Verfügung stellt, das schnell und wirkungsvoll die Identifikation von diesen cis-wirkenden Elementen gestattet, die eine Schlüsselrolle in der Modulation der Expression entwicklungsabhängig regulierter Gene spielen. Die Identifikation dieser cis-wirkenden Elemente ist ein nützlicher Schritt bei der Bestimmung der Gene, die früher wirken als das untersuchte Gen bei der Spezifizierung eines Entwicklungsweges (da die identifizierten distalen regulatorischen Elemente mit Transkriptionsfaktoren zusammenarbeiten, die exprimiert sein müssen um für die regulatorischen Elemente zu arbeiten).
Sorgfältige Analysen der GATA-2-Promotoraktivität in Zebrafischembryonen offenbarten drei einzelne Gewebe-spezifische Enhancerelemente. Diese drei Elemente scheinen unabhängig tätig zu sein, um die Genexpression besonders in Blutvorläufern, der EVL oder dem ZNS zu erhöhen. Die Deletion von einem oder zwei dieser Elemente wird Transgenkonstrukte erzeugen, die die Expression eines Gens von Interesse, in einem spezifischen Gewebe antreiben können. Solche Konstrukte gestatten auch das Studium der Gewebe-spezifischen Funktion exprimierter Gene in mehrfachen Geweben.
Es ist gezeigt worden, dass die entwicklungsabhängige Regulation der Säuger HOX6 und GAP-43-Promotoraktivitäten im Zebrafisch konserviert ist (Westerfield et al., Genes Dev 6: 591-8 (1992), Reinhard et al., Development 120: 1767-75 (1994)). Wenn gezeigt wird, dass das im Zebrafisch GATA-2-Promotor identifizierte Neuronen-spezifische Element für die Neuronen-spezifische Aktivität in dem Mauspromotor benötigt wird, könnte man die Expression von GATA-2 im ZNS der Maus gezielt durch dieses cis-Element ausschalten. Dies würde einem gestatten die Rolle, die GATA-2 im ZNS spielt, genau zu bestimmen.
Das Neuronen-spezifische Enhancerelement von GATA-2 ist genau kartiert worden und es wurde herausgefunden, dass es die Kern-DNA-Consensussequenz für die Bindung Ets- verwandter Transkriptionsfaktoren enthält. Obwohl Ets-verwandte Faktoren in den Zusammenhang mit der Regulation der Expression einer Anzahl Neuronen-spezifische Gene gebracht wurden (Chang und Thompson, J. Biol Chem 271: 6467-75 (1996), Charron et al., J. Biol Chem 270: 30604-10 (1995)), wurde eine andere Sequenz, CCTCCT, die in dieser Region des Zebrafisch GATA-2-Promotors gegenwärtig ist, entdeckt, für die Expression im ZNS erforderlich zu sein. Dieses Motiv überlappt teilweise eine invertierte Form der Kernsequenz der Ets-DNA-Bindungserkennungsstelle. Wie für andere Gene gezeigt wurde, basieren die Aktivitäten der Ets-Familienproteine oft mehr auf ihrer Fähigkeit mit anderen Transkriptionsfaktoren zu interagieren, als auf spezifischer Bindung an eine Erkennungs- DNA-Sequenz (Crepieux et al., Crit Rev Oncog 5: 615-38 (1994)). Es ist möglich, dass ein unabhängiger Faktor, der an das CCTCCT-Motiv bindet für die Neuronen-spezifische Aktivität des GATA-2-Promotors benötigt wird.
Eine Anzahl von Wachstumsfaktoren ist bekannt die frühe embryonale Expression von GATA-2 zu beeinflussen. Noggin und Aktivin, die beide dorsalisierende Aktivität in Xenopus- Embryonen haben, regulieren die GATA-2-Expression im rückenseitigen Mesoderm herunter (Walmsley et al., Development 120: 2519-29 (1994)). BMP-4 aktiviert die GATA-2- Expression im unterseitigen Mesoderm und ist möglicherweise für die frühe Blutvorläuferproliferation wichtig (Maeno et al., Blood 88: 1965-72 (1996)). Wachstumsfaktoren, die die Expression von GATA-2 in Neuronen beeinflussen konnten sind nicht bekannt. Indessen können beide BMP-2 und BMP-6 Neuronen-spezifische Genexpression aktivieren (Fann und Patterson, J. Neurochem 63: 2074-9 (1994)). Übereinstimmend mit den Studien über Wachstumsfaktoren, die die GATA-2-Expression herauf oder herunter regulieren, wurde die GATA-2-Promotoraktivität von dem Zebrafischrückenschild ausgeschlossen. Durch GFP- Expression ist auch entdeckt worden, dass Lithiumchloridbehandlung die injizierten Embryonen dorsalisiert und die GATA-2-Promotoraktivität dramatisch reduziert.
Obwohl die GATA-2-Expression nicht in der EVL durch die in situ Hybridisierung in Gesamtembryonen beobachtet wurde, könnte dies auf die verwendeten Bedingungen zurückzuführen sein. In der Maus sind die embryonalen Mastzellen, die in der Haut anwesend sind, nur durch an Hautgewebeschnitten ausgeführter in situ Hybridisierung nachgewiesen worden (Jippo et al., Blood 87: 993-8 (1996)). Interessanterweise geschieht die Expression von GATA-2 der Mastzellen, in der Maushaut, nur während einer kurzen Periode der Embryogenese, ähnlich zu der, die für die EVL-Zellen im Zebrafisch gefunden wurde. Es ist möglich, dass die in diesem Beispiel verwendeten Konstrukte fehlende Elemente sein könnten, die spezifisch die GATA-2-Expression in Zebrafisch-EVL abschalten würden.
Die oben beschriebene Methode ist allgemein anwendbar auf die Analyse von jedem entwicklungsabhängig regulierten Vertebratenpromotor. Gewebe-spezifische Antwortelemente und Wachstumsfaktor-Antwortelemente können rasch auf diese Weise identifiziert werden. Die Tatsache, dass Zebrafische typischerweise Hunderte befruchteter Eier pro Paarung bilden, erleichtert das Erhalten statistisch signifikanter Ergebnisse. Während Gewebekultursysteme nützlich zur Identifikation vieler wichtiger Transkriptionsfaktoren waren, kann die Transfektionsanalyse in Gewebekulturzellen, die komplexe sich schnell ändernde Mikroumgebung auf die der Promotor während der Embryogenese antworten muss, nicht simulieren. Die zeitliche und räumliche Analyse der Promotoraktivität kann nur schlecht in vitro nachgeahmt werden. Das hierin beschriebene System gestattet die vollständige Analyse der Promotoraktivität in allen Geweben eines ganzen Vertebraten.

Claims

1. Ein transgener Zebrafisch, dessen Zellen ein exogenes Konstrukt enthalten, worin das Konstrukt Zebrafisch-Expressionssequenzen operativ verbunden mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz enthält, worin die Expression von dem Expressionsprodukt Zellstammbaumlinien-spezifisch ist.

2. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 1, worin die Expressionssequenzen einen Zebrafisch-Promotor operativ verbunden mit einem Zebrafisch-Enhancer enthalten.

3. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin die Expressionssequenzen und die das Expressionsprodukt kodierende Sequenz in der Natur nicht operativ verbunden sind.

4. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin das Expressionsprodukt heterolog ist.

5. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 4, worin das Expressionsprodukt ein Reporterprotein ist.

6. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 5, worin das Reporterprotein ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus β-Galactosidase, Chloramphenicol- Acetyltransferase und grün-fluoreszierendem Protein.

7. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 6, worin das Reporterprotein grün-fluoreszierendes Protein ist.

8. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin die Expression des Expressionsproduktes stabil ist und über die Keimbahn übertragen wird.

9. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin das Expressionsprodukt nur in Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutzellen, Nervenzellen und Hautzellen, exprimiert wird.

10. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 9, worin das Expressionsprodukt nur in Blutzellen exprimiert wird.

11. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 10, worin das Expressionsprodukt nur in erythroiden Vorläuferzellen exprimiert wird.

12. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 9, worin das Expressionsprodukt nur in Neuronen exprimiert wird.

13. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin die Expressionssequenzen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus GATA-1-Expressionssequenzen und GATA-2-Expressionssequenzen.

14. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 13, worin die Expressionssequenzen GATA- 1-Expressionssequenzen enthalten.

15. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 13, worin die Expressionssequenzen GATA- 2-Expressionssequenzen enthalten.

16. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 15, worin die Expressionssequenzen den GATA-2-Promotor, operativ verbunden mit dem Neuronen-spezifischen Enhancer von GATA-2, enthalten.

17. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 15, worin die Expressionssequenzen den GATA-2-Promotor, operativ verbunden mit dem Blut-spezifischen Enhancer von GATA- 2, enthalten.

18. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 15, worin die Expressionssequenzen den GATA-2-Promotor, operativ verbunden mit dem Haut-spezifischen Enhancer von GATA- 2, enthalten.

19. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin sich der transgene Fisch entwickelt aus, oder der Nachkomme ist von einem transgenen Zebrafisch, entwickelt aus einer embryonalen Zelle, in die das Konstrukt einbracht wurde.

20. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin das Expressionsprodukt in festgelegten Zellstammbaumlinien exprimiert wird.

21. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin das exogene Konstrukt genetisch gekoppelt ist mit einem identifizierten, mutierten Gen.

22. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin die Expressionssequenzen weiter enthalten, Zebrafisch 5'-nicht-translatierte Sequenzen, operativ verbunden mit dem Promotor und der das Expressionsprodukt kodierenden Sequenz.

23. Der transgene Zebrafisch gemäß Anspruch 2, worin das Konstrukt weiter enthält (a) Intronsequenzen, operativ verbunden mit der das Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, (b) ein Polyadenylierungssignal, operativ verbunden mit der das Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, oder beide.

24. Zellen, isoliert aus dem transgenen Fisch gemäß Anspruch 2, worin die Zellen das Expressionsprodukt exprimieren.

25. Ein Verfahren zum Herstellen von transgenem Zebrafisch, wobei der Verfahren umfasst (a) Einbringen eines exogenen Konstruktes in eine embryonale Zelle von einem ersten Zebrafisch, worin das Konstrukt Zebrafisch-Expressionssequenzen, operativ verbunden mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, enthält, und (b) den Eizellen oder embryonalen Zellen ermöglicht, sich in einen zweiten Zebrafisch zu entwickeln, worin die Expression des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch Zellstammbaumlinien-spezifisch ist.

26. Das Verfahren gemäß Anspruch 25, worin die Expressionssequenzen einen Zebrafisch- Promotor, operativ verbunden mit einem Zebrafisch-Enhancer, enthalten.

27. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin das Expressionsprodukt in festgelegten Zellstammbaumlinien exprimiert wird.

28. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin das Verfahren weiter umfasst, Herstellen von Nachkommen der zweiten Zebrafische.

29. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin die Expressionssequenzen und die das Expressionsprodukt kodierende Sequenz in der Natur nicht operativ verbunden sind.

30. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin die Expressionssequenzen Expressionssequenzen von einem Zebrafischgen sind, worin das Verfahren weiterhin umfasst:

(c) Aussetzen des Zebrafisches oder der Nachkommen des zweiten Zebrafisches einer Testverbindung

(d) Nachweisen des Expressionsprodukts, in dem der Testverbindung ausgesetzten Zebrafisch und

(e) Vergleichen des Expressionsmusters des Expressionsproduktes in dem der Testverbindung ausgesetzten Zebrafisch mit dem Expressionsmuster des Expressionsproduktes des der Testverbindung nicht ausgesetzten zweiten Zebrafisches oder der Nachkommen des zweiten Zebrafisches, worin, falls das Expressionsmuster des Expressionsproduktes in dem der Testverbindung ausgesetzten Zebrafisch von dem Expressionsmuster des der Testverbindung nicht ausgesetztem Zebrafisches abweicht, die Testverbindung die Expression des Zebrafischgens beeinflusst.

31. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin die Expressionssequenzen Expressionssequenzen von einem Zebrafischgen sind, worin das Verfahren weiterhin umfasst:

(c) Nachweisen des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch oder in Nachkommen des zweiten Zebrafisches, worin das Expressionsmuster des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches das Expressionsmuster von dem Zebrafischgen identifiziert.

32. Das Verfahren gemäß Anspruch 26, worin die Expressionssequenzen Expressionssequenzen von einem Zebrafischgen sind, worin das Verfahren weiterhin umfasst:

(c) Kreuzen des zweiten Zebrafisches oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches mit einem dritten Zebrafisch, enthaltend ein identifiziertes, mutiertes Gen, um einen vierten Zebrafisch herzustellen, enthaltend beides, das exogene Konstrukt und die identifizierte Mutation,

(d) Nachweisen des Expressionsproduktes in dem vierten Zebrafisch oder Nachkommen des vierten Zebrafisches und

(e) Vergleichen des Expressionsmusters des Expressionsproduktes in dem vierten Zebrafisch oder Nachkommen des vierten Zebrafisches mit dem Expressionsmuster des Expressionsproduktes des zweiten Zebrafisches, worin, falls das Expressionsmuster des Expressionsproduktes in dem vierten Zebrafisch oder Nachkommen des vierten Zebrafisches von dem Expressionsmuster des zweiten Zebrafisches abweicht, das mutierte Gen die Expression des Zebrafischgens beeinflusst.

33. Das Verfahren gemäss Anspruch 26, worin das Verfahren weiterhin umfasst:

(c) Kreuzen des zweiten Zebrafisches oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches mit einem dritten Zebrafisch, enthaltend ein identifiziertes, mutiertes Gen, worin das exogene Konstrukt und das mutierte Gen der gleichen Region des Genoms zugeordnet werden, um einen vierten Zebrafisch herzustellen, enthaltend beides, das exogene Konstrukt und das mutierte Gen, und

(d) Kreuzen des vierten Zebrafisches mit einem fünften Zebrafisch, worin der fünfte Zebrafisch weder das exogene Konstrukt noch das mutierte Gen enthält, um einen sechsten Zebrafisch herzustellen, worin der sechste Zebrafisch beides enthält, das exogene Konstrukt und das mutierte Gen, worin das mutierte Gen gekennzeichnet ist durch das exogene Konstrukt in dem sechsten Zebrafisch.

34. Das Verfahren gemäß Anspruch 33, worin das Verfahren weiterhin umfasst:

(e) Kreuzen des sechsten Zebrafisches oder Nachkommen des sechsten Zebrafisches mit einem siebten Zebrafisch und

(f) Identifizieren von Zebrafisch-Nachkommen, die das Expressionsprodukt exprimieren, worin der das Expressionsprodukt exprimierende Zebrafisch das mutierte Gen enthält.

35. Ein Verfahren zum Identifizieren von Zebrafisch-Enhancern, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Einführen eines exogenen Konstruktes in eine embryonale Zelle eines ersten Zebrafisches, worin das Konstrukt Zebrafisch-Expressionssequenzen enthält, operativ verbunden mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, worin das Konstrukt einen Zebrafisch-Promotor, operativ verbunden mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, enthält, worin der Promotor nicht operativ mit einem Enhancer verbunden ist,

(b) Ermöglichen der Eizelle oder den embryonalen Zellen, sich in einen zweiten Zebrafisch zu entwickeln, worin die Expression des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch Zellstammbaumlinien-spezifisch ist,

(c) Nachweisen des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches, worin, falls das Expressionsprodukt nachgewiesen wird, das exogene Konstrukt mit einem Enhancer operativ verbunden ist.

36. Das Verfahren gemäß Anspruch 35 weiterhin umfassend,

(d) Isolieren des Enhancers aus dem zweiten Zebrafisch oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches.

37. Das Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei es weiterhin umfasst,

(d) Bestimmen des Expressionsmusters des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches, worin das Expressionsmuster des Expressionsproduktes in dem zweiten Zebrafisch oder Nachkommen des zweiten Zebrafisches, das Expressionsmuster des Enhancers identifiziert.

38. Ein Verfahren zum Identifizieren regulatorischer Elemente in Sequenzen stromaufwärts eines Gens von Interesse, wobei das Verfahren umfasst,

(a) Einbringen von Mitgliedern aus einer Gruppe exogener Konstrukte in getrennte embryonale Zellen, worin jedes Mitglied aus der Gruppe von Konstrukten eine ein Expressionsprodukt kodierende Sequenz operativ verbunden mit stromaufwärts gelegenen Sequenzen von einem Zebrafischgen von Interesse enthält, worin bei verschiedenen Mitgliedern aus der Gruppe verschiedene Regionen der stromaufwärts gelegenen Sequenzen deletiert sind,

(b) Ermöglichen den embryonalen Zellen sich in Zebrafische zu entwickeln,

(c) Nachweisen des Expressionsproduktes in dem Zebrafisch oder Nachkommen von Zebrafisch.

(d) Bestimmen, welche Regionen der stromaufwärts gelegenen Sequenzen für die Expression des Expressionsproduktes gebraucht werden.

39. Das Verfahren gemäß Anspruch 38, worin das Bestimmen welche Regionen der stromaufwärts gelegenen Sequenzen für die Expression gebraucht werden, durch Vergleich der Expression des Expressionsproduktes in dem Zebrafisch, in den ein exogenes Konstrukt eingeführt worden war, bewerkstelligt wird, worin, falls das Expressionsprodukt in Zellen von Interesse in einem Zebrafisch nachgewiesen wird, das in diesen Zebrafisch eingebrachte exogene Konstrukt ein regulatorisches Element für die Expression in den Zellen von Interesse umfasst, worin, falls das Expressionsprodukt in den Zellen von Interesse in einem Zebrafisch nicht nachgewiesen wird, das in diesen Zebrafisch eingebrachte exogene Konstrukt kein regulatorisches Element, für die Expression in den Zellen von Interesse umfasst.

40. Ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend Expressionssequenzen, erhalten aus Zebrafisch, operativ verbunden mit einer ein Expressionsprodukt kodierenden Sequenz, worin die Expressionssequenzen einen Promotor, operativ verbunden mit einem Enhancer, enthalten, worin die Expression des Expressionsproduktes Zellstammbaumlinien-spezifisch ist.