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JP2005522201A - ニコチンおよびニトロソアミンを減少させたタバコ - Google Patents

ニコチンおよびニトロソアミンを減少させたタバコ Download PDF

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JP2005522201A JP2003583111A JP2003583111A JP2005522201A JP 2005522201 A JP2005522201 A JP 2005522201A JP 2003583111 A JP2003583111 A JP 2003583111A JP 2003583111 A JP2003583111 A JP 2003583111A JP 2005522201 A JP2005522201 A JP 2005522201A
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Abstract

本発明の態様は、消費者用タバコ製品を製造するために使用される低ニコチンおよび低ニトロソアミンを有するタバコ、およびこうしたタバコを生産する方法に関する。より具体的には、実施形態はタバコ作物中のニコチンおよびニトロソアミンを、こうしたタバコ作物の栽培中にオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストを施用することにより減少させる方法を含む。前記方法を用いて作り出されたタバコ、およびそれから得られた消費者用タバコ製品もまた実施形態である。

Description

本発明はニコチンおよびニトロソアミンを減少させたタバコ、およびこうしたタバコを製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、タバコの栽培中に遺伝子発現を調節する化合物を施用することにより、消費者用タバコ製品を製造するために栽培された、タバコ中のニコチンおよびニトロソアミンの減少を対象とする。
タバコの消費から生じる健康の結果はよく知られているが、多くの人々はタバコ製品を使い続けている。タバコ製品の中毒特性は、主にニコチンの存在に起因する。ニコチンは、知られている最も強い中毒性の物質の1つであることに加えて、タバコおよび体中に存在する多数の発がん性化合物の前駆体でもある。
タバコ製品の中毒特性は、部分的には、デリバーレーシステムの習慣的な使用(たとえば、タバコを喫煙するまたは噛むという行為に関連した口への固定、煙を吸い込む、および味わうこと)に起因する。多くの禁煙プログラムは、ニコチン代替療法(NRT)を含んでおり、そこでは喫煙の代替として様々な量のニコチンが個人に与えられる。現在のところ、NRTを含めたいくつかの種類の禁煙用製品が入手可能である。たとえば、ニコチンパッチ、ガム、カプセル、吸入器、点鼻薬、およびトローチ剤が従来のNRT製品である。これらの従来のNRT製品は、ニコチン禁断症状を抑制することにより喫煙者を助けるが、それらは喫煙者のデリバーレーシステムを習慣的に使用することへの渇望をほとんど満たさない。デリバーレーシステムを習慣的に使用することに伴う諸要因を、以後「中毒の第2要因」と呼ぶ。中毒のこれらの第2要因は、ニコチンへの化学的依存には関連しない心理学な諸要因を含んでいる。
従来のNRTは嗜癖の第2要因をほとんど抑えないという事実に加えて、NRTそれ自体を絶つのが困難な習慣であり得る。従来のNRTは、計画的に喫煙者が1日当たりのニコチン摂取を徐々に減少することを基にしているのに対して、中毒の第2要因への渇望を精神的に抑制するものである。しかし実際には、多くのプログラムへの参加者は、タバコへの中毒をはるかにより高価なNRT製品への中毒に置き換えたに過ぎない。時には、プログラム参加者は、中毒の第2要因の達成感の欠如を補償するために、通常の喫煙から摂取したはずよりはるかに多くのニコチンを経口摂取する。他の場合は、プログラム参加者は初めのプログラムが完了した後に長期間NRT製品の使用を継続する。
大量ニコチンの摂取およびNRTの長期の使用は、重大な健康の懸念を引き起こす。時にはニコチン過量がNRT製品の熱心すぎる使用により起こり得る。ニコチン過量の症状としては、悪心および/または嘔吐、口からのよだれの増加(重症)、腹痛または胃痛(重症)、下痢(重症)、蒼白な皮膚、冷汗、頭痛(重症)、めまい(重症)、聴覚および視覚傷害、震え、錯乱、脱力感(重症)、極度の消耗、失神、低血圧、呼吸困難(重症)、不規則な心拍、または痙攣(発作)がある。
長期間NRTを使用している個人には、ニコチンがエピネフリン、体内でストレス応答を刺激するホルモンを放出するので、心理学的なストレスも生じる。ニコチンの心理学的な作用としては、短気、不安、睡眠障害、神経質、すぐれない気分および気質、頭痛、疲労、悪心、およびタバコに対する長期の欲求がある。さらに、最近の研究により、ニコチンは炎症期間中血管の増殖を刺激し、脈管形成、アテローム性動脈硬化症および腫瘍の増殖を促進させることが立証された(Heeschen等、Nature Medicine、7巻、833頁、2001年)。ニコチンはまた、体自体の代謝系により4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)などの発がん性物質の内因的形成の前駆体になり得る(Hecht等、Proc. Nat. Acad. Sci.、97巻、12493〜12497頁、2000年)。
研究者等はタバコ製品のニコチン含量またはニコチン配送を減少させるためのいくつかの方法を開発してきた。いくつかの方法は、たとえば、タバコを収穫した後で微生物の酵素的分解、化学処理、または高圧力抽出によりタバコのニコチン含量を減少させる。(米国特許第4,557,280号、米国特許第4,561,452号、米国特許第4,848,373号、米国特許第4,183,364号、および米国特許第4,215,706号を参照されたい)。前述のものを考慮して、従来技術で例示された様々な努力にもかかわらず、ニコチンおよびニトロソアミンを減少したタバコおよびタバコ製品、およびこうした組成物を製造する方法の必要性が残されている。
Heeschen等、Nature Medicine、7巻、833頁、2001年 Hecht等、Proc. Nat. Acad. Sci.、97巻、12493〜12497頁、2000年 米国特許第4,557,280号 米国特許第4,561,452号 米国特許第4,848,373号 米国特許第4,183,364号 米国特許第4,215,706号 同時係属出願は、「Methods of Reducing the Harmful Effects of Tobacco-Use Cessation Programs」の表題が付けられている(弁理士整理番号VTOB.138PR) Maksymowicz & G. Palmer、Agriculture & Natural Resources、158巻、14頁(1995年) Fung等、Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry、13巻、330〜31頁(1973年) Bandurski、Plant Hormones、P. J. Davies(編)Kluwer Academic Publishers、オランダ、39〜65頁(1995年) MaksymowiczおよびPalmer、オンライン出版物、AGR 158(4/26/01) Tso、Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants、233〜34頁、Dowden、Hutchinson & Ross、Stroudsburg、ペンシルバニア州、(1972年) Feth等、Planta、168巻、402〜07頁(1986年) Wagner等、Physiol. Plant.、68巻、667〜72頁(1986年) WagnerおよびWagner、Planta、165巻、532頁(1985年) Saunder およびBush (Plant Physiol.、64巻、236頁(1979年)) Saunders、Drug Info. Jour.、32巻、609頁(1998年) Bonnerの米国特許第4,519,163号 Hendersonの米国特許第4,274,861号 MacMurrayの米国特許第3,967,953号 Sitbon等、Physiol. Plant、98巻、677頁(1996年) Sitbon等、Plant Physiol、99巻、1062頁(1992年) WolbangおよびRoss、Planta、214巻、13頁(2001年) Nesmith、「Actigard-A New Blue Mold Control Tool」、KY Pest Newsからのタバコの病気記事 (オンライン出版物) Kahl等、Planta、210巻:336頁(2000年) Uknes, S.等、Plant Cell、4巻、645〜656頁(1992年) Schaller、J. Exp. Bot.、52巻、11頁(2001年) Kolomiets等、Plant Cell、13巻、613頁(2001年) Creelman、Plant Physiol.、99巻、1258頁(1992年) Sircar、Prostglandins、25巻、393頁(1983年) Schweizer等、Plant Physiol.、114巻、79頁(1997年) Staswick、「Jasmonate Activity in Plants」、Plant Hormones、P.J.Davies(編)、KluwerAcademic Publishers、179〜187頁(1995年) Walling, J. Plant Growth Regul.、19巻、195頁(2000年) Engelberth等、Plant Physiol.、125巻、369頁(2001年) Winz等、Plant Physiol.、125巻、2189頁(2001年) Preston等、Planta、209巻、87頁(1999年) Thornberg等、Plant Physiol.、96巻、802頁(1991年) 国際公開第98/56923号 国際公開第00/67558号 PCT/US01/26788
ニコチンおよび/またはニトロソアミンの量を減少した、タバコおよびタバコ製品を製造するいくつかの方法を見い出した。
あるアプローチにより、圃場で生育されたタバコ(たとえば、タバコ作物)を従来の技法により栽培し、かつニコチンおよび/またはニトロソアミン、具体的にはタバコ特異的ニトロソアミン類(TSNA)の産生を抑制するように、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネート(jasmonate)アンタゴニストを前記のタバコに指定された時間および/または植物の年齢に施用する。ある実施形態では、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを、前記タバコを摘心する約21日前から前記タバコを摘心した後約21日までに施用する。望ましい実施形態では、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを摘心日に施用し、収穫(たとえば摘心された21日後)する前に任意選択で第2または第3のまたは第4のオーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの施用を実施する。好ましくは、化合物の利用能または保持性を改善するために、担体または物質と共にまたはそれなしに、植物の摘心された(傷ついた)部分に直接オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを施用するが、上記の例は、本発明により包含される多くの実施形態の一例にしかすぎないことを理解されたい。
ある文脈中で「タバコ」という用語は、タバコ作物、(たとえば、圃場で生育された複数のタバコ植物、すなわち水耕法で生育されたタバコでない)これに限定されることなく、本明細書に記載されたように調製されたおよび/または得られた根、茎、葉、花および種子を含めたタバコ植物およびその一部を示すために総合的な意味で使用される。開示された方法により処理することができるタバコの品種としては、これに限定されることなくdark種(たとえば、バーレー(Burley))、暗色種（Flue or Bright varieties）(たとえば、バージニア種(Virginia flue))、オリエントまたはトルコ種、および遺伝子改変種(たとえば、Vector21〜41)がある。ある文脈中で「タバコ製品」という用語は、これに限定されることなく喫煙材料(たとえば、タバコ、葉巻、パイプタバコ)、嗅ぎたばこ、噛みタバコ、ガム、およびトローチを含めた消費者用タバコ製品を意味する。好ましくは、これらのタバコ製品は、上記のように処理されたタバコから集め、タバコ調製の従来の技法に従って裁断し、乾燥し、熟成し、および/または発酵された葉及び茎から製造される。
ある実施形態では、本明細書に説明したタバコおよびタバコ製品は、減少した量のニコチンおよび/または、これに限定されるものではないがN'-ニトロソノルニコチン(NNN)、N'-ニトロソアナタビン(NAT)、およびN'-ニトロソアナバシン(NAB)、4-(N-ニトロソメチルアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、4-(N-ニトロソメチルアミノ)-4-(3-ピリジル)-1-ブタノール(NNA)、4-N-ニトロソメチルアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノール(NNAL)、4-N-ニトロソメチルアミノ)-4-(3-ピリジル)-1-ブタノール(イソ-NNAL)および4-(N-ニトロソメチルアミノ)-4-(3-ピリジル)-ブタン酸(イソ-NNAC)を含めた少なくとも1種の減少した量のニトロソアミンを有する。望ましくは、本発明のタバコおよびタバコ製品は、同じ種でかつ従来の技法により栽培されたタバコ、または従来のタバコから調製されたタバコ製品に比較して、NNN、NNK、NATおよびNABからなる群から選択される少なくとも1種のTSNAの減少した量を有する。
本発明の他の態様は、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを施用することにより、タバコ中のニコチンおよび/またはニトロソアミンの量を実質上妨げる、排除する、または減少させる方法に関する。好ましい実施形態では、成熟したタバコ植物に収穫の1ヵ月前まで、またはタバコ植物を摘心した後に、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを施用することにより、タバコおよびまたはタバコ製品中の、これに限定されることなくNNN、NNK、NATおよびNABを含めたTSNA類が減少する。前記処理されたタバコ植物から調製された、喫煙材料(たとえば、タバコ、葉巻、パイプタバコ)、嗅ぎたばこ、噛みタバコ、ガム、およびトローチを含めたタバコ製品（これに限定されない）もまた実施形態である。
他の実施形態は、タバコ、葉巻、噛みタバコ、嗅ぎたばこおよびタバコを含んだガムおよびトローチを含めた、タバコ製品の発がんの可能性を低下させるための方法に関する。いくつかの方法は、たとえば、上記のように前記タバコをオーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストで処理することにより、ニトロソアミンおよび/またはニコチンの減少した量を有するタバコの調製物、および前記タバコを含んだタバコ製品の製造を含む。このように処理されたタバコ植物は、収穫し、熟成し、およびタバコ製品に加工され、これは低下された発がんの可能性を示す。
本発明の他の態様は、ニトロソアミン、好ましくはTSNA類、より好ましくはNNNおよびNNK、タバコを喫煙する、消費するまたはさもなければ経口摂取する人の中での代謝産物の量の減少に関する。この方法は、本明細書に説明したアプローチの1つに従って調製された、タバコ特異的ニトロソアミン類の量が減少したタバコ製品を前記ヒトに提供し、それによりこうした製品の前記ヒトの中の発がんの可能性を低下させることにより実行される。このタバコ製品は、タバコ、葉巻、噛みタバコ、嗅ぎたばこ、またはタバコを含んだガムまたはトローチでもよい。
本発明の他の態様は一連の禁煙製品およびこれらの使用方法に関する。これらの新規の禁煙製品は、タバコ、葉巻、パイプタバコ、噛みタバコ、嗅ぎたばこ、またはタバコを含んだガムまたはトローチを含めた、タバコ消費者がすでになじみの品種のタバコ製品であり得る。新規の禁煙製品は、上記の方法に作り出され、かつ標準的タバコ製品に比較して減少されたニコチンおよび/またはニトロソアミン含量を有するタバコを特徴とする。さらに、これらの禁煙製品はニコチンおよび/またはニトロソアミンのいくつかの異なるレベルを利用可能にすることができ、各人が徐々に段階的により低いニコチンおよび/またはニトロソアミン含量を有するタバコ製品に切り換えることを可能にする。
ニコチンおよび/またはニトロソアミンの量が減少したタバコおよびタバコ製品を作り出すいくつかのアプローチを発見した。あるアプローチにより、ニコチンおよびニトロソアミンレベルが減少したタバコを作り出すために、タバコ植物、好ましくは圃場のタバコ植物(タバコ作物)を1回または複数回の特定な時期に、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストで処理する。前記処理をしたタバコ植物から収穫したタバコは、次いで種々のタバコ製品を調製するために使用される。したがって、本発明のいくつかの態様は、化学処理によりタバコ植物中のニコチン含量を減少させることによる、タバコ中のニトロソアミン含量の減少に関する。同時係属出願は、「Methods of Reducing the Harmful Effects of Tobacco-Use Cessation Programs」の表題が付けられている(attorney docket no. VTOB.138PR)。
一般に2,4-Dとして知られている、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸は除草剤および植物成長調整剤である。これは広葉雑草、イネ科植物およびその他の単子葉植物、木本植物、水生雑草、および隠花植物を抑制するために使用される。タバコ作物の近傍で2,4-Dを使用することは、特にタバコに有害であることが知られているので大いに反対される。「わずかなトリアジンまたは成長調整剤型(2,4-D)除草剤はタバコに害を与える可能性が大きい。」B. Maksymowicz & G. Palmer、Agriculture & Natural Resources、158巻、14頁(1995年)。2,4-Dは、たとえば開花段階の初期の間がタバコ植物には最も有害であることが観察されている。(Fung等、Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry、13巻、330〜31頁(1973年)を参照されたい)。しかし、ニコチンおよびニトロソアミンは、収穫する前(たとえば、収穫する1ヵ月前までに、またはタバコ植物を摘心した後に、好ましくは摘心の約21日前から摘心の約21日後に)、成熟したタバコ植物にオーキシン、オーキシン類似体、および/またはジャスモネートアンタゴニストを施用することにより、タバコ中で減少させることができることが発見された。
オーキシンは、頂芽優勢、屈性、根元の成長、および芽の伸長などのいくつかの植物の生理学的応答に関係している。(総説としては、Bandurski、Plant Hormones、P. J. Davies(編)Kluwer Academic Publishers、オランダ、39〜65頁(1995年)を参照されたい)。植物内の主要なオーキシンはインドール酢酸(IAA)である。2種の合成オーキシン類似体、2,4-D、およびナフタレン-1-酢酸(NAA)は、現在のところ発根を誘発させ、かつ果実発生を助長させるために使用される。2,4-Dはまた、作物用地および非農耕地の両方で広葉雑草、イネ科植物およびその他の単子葉植物、木本植物、水生雑草、および隠花植物を抑制するために使用される。2,4-Dは植物の年齢に応じて、タバコに対して有毒であり得る(Fung等、Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry、13巻、328頁(1973年)およびMaksymowiczおよびPalmer、オンライン出版物、AGR 158(4/26/01))が、予想外に、2,4-Dに接触した圃場で成熟したタバコ植物は、未処理のタバコ植物に比較してニコチンおよびTSNA類の減少したレベルを示す。
ニコチンおよびニトロソアミンはまた、タバコ植物をジャスモン酸アンタゴニストと接触させることによりタバコ中で減少させることができる。ジャスモン酸は急性の傷をつけること(たとえば葉を押しつぶす)に応答して、植物により産生されるホルモンである。ジャスモン酸は、またジャスモネートと呼ばれ、タバコ中の遺伝子発現を起こしてニコチンの産生がもたらされる。サリチル酸またはテトシクラシス(tetcyclacis)、などのジャスモネートアンタゴニストを接触させた圃場のタバコ植物はまた、未処理のタバコ植物に比較してニコチンおよびTSNA類の減少された量を示す。さらに、植物をリポキシゲナーゼ阻害剤などの、ジャスモン酸の産生をもたらすオクタデカノイド経路をブロックする分子と接触させると、ニコチンレベルが減少し、かつ同時にニトロソアミンの量が減少したタバコを生産することができる。以下の節では、タバコ中のニコチンおよびニトロソアミンを減少させるいくつかのアプローチを記述する。
タバコ中のニコチンおよびニトロソアミン量の低減
ニコチンは主としてタバコ植物の根内で形成され、続いて葉に移動され、蓄えられる(Tso、Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants、233〜34頁、Dowden、Hutchinson & Ross、Stroudsburg、ペンシルバニア州、(1972年))。伝統的な作物育種技法は、野生型のタバコに認められるニコチンの量が8%と低い種を含めて、ニコチンのレベルがより低いタバコを生産してきた。本明細書に記載された多くの方法はいずれのタバコの種にも使用することができるが、低ニコチンの栽培品種が好ましい。
ニコチンは、ニコチン酸および4-メチルアミノブタナールの縮合によりタバコ植物内に産生される。2種の調節遺伝子座(Nic 1およびNic 2)が、ニコチン産生の共優性制御因子として働く。単一および二重Nic突然変異体の根の酵素の分析により、2種の酵素、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ(「QPTase」)およびプトレッセンスメチルトランスフェラーゼ(putrescence methyl transferase (PMTase))の活性は、ニコチンの生合成のレベルに直接比例することが示される。ニコチン生合成の必須のステップは、キノリン酸からニコチン酸の形成である。QPTaseはタバコ内のニコチン合成のためのニコチン酸を供給する経路の律速酵素ように見える。(たとえば、Feth等、Planta、168巻、402〜07頁(1986年)、およびWagner等、Physiol. Plant.、68巻、667〜72頁(1986年)を参照されたい)。ニコチン合成の異なる機能を有するタバコ組織(根およびカルス)中の酵素活性を比較すると、QPTase活性がニコチン含量に直接相関する(WagnerおよびWagner、Planta、165巻、532頁(1985年))。実際に、Saunder およびBush (Plant Physiol.、64巻、236頁(1979年))は、ニコチン突然変異体の根中のQPTaseは、葉中のニコチンのレベルに比例することを示した。
上述のようにニトロソアミン、特にTSNA類、およびニコチンは、タバコおよびタバコ製品の発がんの可能性および中毒特性に有意に寄与する。したがって、ニトロソアミン、特にTSNA類、およびニコチンの量が減少したタバコおよびタバコ製品は、はなはだしい有用性を有する。特定の理論に縛られることは望まないが、ニコチン量が減少したタバコ植物、タバコ、およびタバコ製品の生産は、ニトロソアミン量も減少していることが企図される。すなわち、タバコ植物、タバコ、およびタバコ製品からニコチンを除去することにより、ニトロソアミン形成用のアルカロイド基質、特にTSNA形成用の基質も除去される。予想外に、本明細書に説明した方法は、中毒をもたらす可能性が減少したタバコの製造のみならず、癌をもたらす可能性を低減したタバコを製造することができる。
用語「減少した」または句「減少した量」とは、ニコチンおよび/またはニトロソアミンを減少させるための処理がされていない、同じ方法で加工した同じ種のタバコからのタバコ植物、タバコ、またはタバコ製品中に認められるものより少ない、処理されたタバコ植物、タバコ、およびタバコ製品中のニコチンおよびまたはニトロソアミンの量を意味することが強調される。したがって、ある文脈では、同じ方法で処理された同じ種の野生型タバコを、本明細書に説明した本発明の方法によりニコチンおよび/またはニトロソアミンの減少が達成されたかどうかをそれによって測定する対照として使用する。
野生型タバコでは種、および生育、収穫、および熟成する方法に応じてニトロソアミンおよびニコチンの量が変わる。たとえば、典型的な熟成したバーレー種のタバコの葉は、約30,000ppmのニコチンおよび約8,000ppbのニトロソアミンを有する。典型的な燻製(Flue Cured)バーレー種の葉は、約20,000ppmのニコチンおよび約300ppbのニトロソアミンを有する。および、典型的なオリエント種の熟成した葉は、約10,000ppmのニコチンおよび約100ppbのニトロソアミンを有する。ニコチンおよび/またはニトロソアミンの量が本発明により減少したタバコ植物またはその一部は、検出不可能なニコチンおよび/またはニトロソアミンを有することができ、またはニコチンおよび/またはニトロソアミンの量が、同じ種の対照中に認められる量未満である限り、1種または複数のニトロソアミンおよび/またはニコチンのいくらかの検出可能な量を含んでいてもよい。すなわち、本明細書に説明した本発明の方法により処理されたバーレー種のタバコの葉は、約0〜約30,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約8,000ppbのニトロソアミン、望ましくは約0〜約20,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約6,000ppbのニトロソアミン、より望ましくは約0〜約10,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約5,000ppbのニトロソアミン、好ましくは約0〜約5,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約4,000ppbのニトロソアミン、より好ましくは約0〜約2,500ppmの間のニコチンおよび約0〜約2,000ppbのニトロソアミン、最も好ましくは約0〜約1,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約1,000ppbのニトロソアミンの減少した量を有する。本明細書に説明した方法により調製したバーレー種の葉の実施形態はまた、約0〜約500ppmの間のニコチンおよび約0〜約500ppbニトロソアミンを有することができ、本明細書に説明した方法により調製したバーレー種の葉のある実施形態では、ニコチンまたはニトロソアミンの実質上検出可能な量は含まれない。
同様に、本明細書に説明した方法により処理された燻製バーレー種のタバコの葉は、約0〜約20,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約300ppbのニトロソアミン、望ましくは約0〜約15,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約250ppbのニトロソアミン、より望ましくは約0〜約10,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約200ppbのニトロソアミン、好ましくは約0〜約5,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約150ppbのニトロソアミン、より好ましくは約0〜約2,500ppmの間のニコチンおよび約0〜約100ppbのニトロソアミン、最も好ましくは約0〜約1,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約50ppbのニトロソアミンの減少した量のニコチンを持ち得る。本明細書に説明した方法により調製した燻製バーレー種の葉の実施形態はまた、約0〜約500ppmの間のニコチンおよび約0〜約25ppbニトロソアミンを有することができ、本明細書に説明した方法により調製した煙道熟成バーレー種の葉のある実施形態では、ニコチンまたはニトロソアミンの実質上検出可能な量は含まれない。
さらに、本明細書に説明した方法により処理された煙道熟成オリエンタル種の熟成したタバコの葉は、約0〜約10,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約100ppbのニトロソアミン、望ましくは約0〜約7,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約75ppbのニトロソアミン、より望ましくは約O〜約5,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約50ppbのニトロソアミン、好ましくは約0〜約3,000ppmの間のニコチンおよび約0〜約25ppbのニトロソアミン、より好ましくは約0〜約1,500ppmの間のニコチンおよび約0〜約10ppbのニトロソアミン、最も好ましくは約0〜約500ppmの間のニコチンおよびニトロソアミンがない、ニコチンの減少した量を有する。本明細書に説明した方法により調製した燻製バーレー種の葉の実施形態はまた、約0〜約250ppmの間のニコチンを有し、かつニトロソアミンを有しないことができ、本明細書に説明した方法により調製した燻製バーレー種の葉のある実施形態では、ニコチンまたはニトロソアミンの実質上検出可能な量は含まれない。
ある文脈では、句「ニコチンおよび/またはニトロソアミンの減少した量」とは、同じ方法で生育し、収穫し、および熟成した同じ種のタバコより少ない重量のニコチンおよび/またはニトロソアミンを有する、タバコ植物、タバコ、およびタバコ製品を意味する。たとえば、野生型タバコは、それを生育し、収穫し、および熟成する方法に応じて、ほぼ1〜4%の乾燥重量のニコチンおよびほぼ0.2%〜0.8%の乾燥重量のニトロソアミンを有する。典型的なタバコは、11mgのニコチンおよび2.2mgのニトロソアミンを有する。したがって、本発明のタバコ植物、タバコおよびタバコ製品は乾燥重量で、たとえば0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.075%、0.08%、0.085%、0.09%、0.095%、0.1%、0.15%、0.175%、0.2%、0.225%、0.25%、0.275%、0.3%、0.325%、0.35%、0.375%、0.4%、0.425%、0.45%、0.475%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、および1.0%未満のニコチン、および0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.075%、および0.08%未満のニトロソアミンを有することができる。
さらに、本発明のタバコは、たとえば、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg、1.0mg、1.1mg、1.15mg、1.2mg、1.25mg、1.3mg、1.35mg、1.4mg、1.45mg、1.5mg、1.55mg、1.6mg、1.65mg、1.7mg、1.75mg、1.8mg、1.85mg、1.9mg、1.95mg、2.0mg、2.lmg、2.15mg、2.2mg、2.25mg、2.3mg、2.35mg、2.4mg、2.45mg、2.5mg、2.55mg、2.6mg、2.65mg、2.7mg、2.75mg、2.8mg、2.85mg、2.9mg、2.95mg、3.0mg、3.1mg、3.15mg、3.2mg、3.25mg、3.3mg、3.35mg、3.4mg、3.45mg、3.5mg、3.55mg、3.6mg、3.65mg、3.7mg、3.75mg、3.8mg、3.85mg、3.9mg、3.95mg、4.0mg、4.lmg、4.15mg、4.2mg、4.25mg、4.3mg、4.35mg、4.4mg、4.45mg、4.4mg、4.45mg、4.5mg、4.55mg、4.6mg、4.65mg、4.7mg、4.75mg、4.8mg、4.85mg、4.9mg、4.95mg、5.0mg、5.5mg、5.7mg、6.0mg、6.5mg、6.7mg、7.Omg、7.5mg、7.7mg、8.Omg、8.5mg、8.7mg、9.Omg、9.5mg、9.7mg、l0.Omg、10.5mg、10.7mg、および11.0mg未満のニコチン、ならびに0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg、1.Omg、1.1mg、1.15mg、1.2mg、1.25mg、1.3mg、1.35mg、1.4mg、1.45mg、1.5mg、1.55mg、1.6mg、1.65mg、1.7mg、1.75mg、1.8mg、1.85mg、
1.9mg、1.95mg、2.0mg、2.1mg、2.15mg、2.2mg未満のニトロソアミンを有することができる。
植物中のニコチンレベルを減少させるいかなる方法も、ニコチンおよびニトロソアミン、特にTSNA類の量が減少したタバコを製造するのに適している。より具体的には、植物中のニコチンの内生的レベルを減少させるいかなる方法も、実質上ニトロソアミン、特にTSNA類を含まないタバコを製造するのに適している。ノルニチコチン(norniticotine)を含めた他のアルカロイドレベルを減少させるいかなる方法も、同様に実質上ニトロソアミン、特にTSNA類を含まないタバコを製造するのに適していよう。ニコチンおよびニトロソアミン、特にTSNA類を減少したタバコを製造する好ましい方法には、少なくとも1種のタバコ植物をオーキシン、オーキシン類似体またはジャスモネートアンタゴニストで処理することを含む。以下の節では、オーキシンまたはオーキシン類似体で処理されていない、同様の生育条件下で栽培された同年代のタバコに比較して、低レベルのニコチンおよびTSNAを有するタバコおよびタバコ製品を生産するために、オーキシンおよび/またはオーキシン類似体の使用を説明する。
オーキシン
オーキシンは天然に存在する植物の調節分子である。オーキシンなどのホルモンの添加は、植物組織の培養方法における培養媒体の成分として使用されてきた。タバコカルスの成長の研究により、組織培養媒体にオーキシンまたはこれらの類似体を添加すると、ニコチン含量の調節が起こるように見えることが示された(Saunders、Drug Info. Jour.、32巻、609頁(1998年))。最も一般的な内発性のオーキシンはインドール-3-酢酸(IAA)である。IAAに加えて、様々な種の中に内生的に存在する多くのオーキシン誘導体があると思われる。これらのオーキシン誘導体の中で、様々な糖およびアミノ酸へのAA結合物がある。オーキシンはまたポリペプチドに結合し得る。
単離されているオーキシン分子は、
a)メチルインドール-3-酢酸、エチルインドール-3-酢酸、インドール-3-アセトアミド、2-O-(インドール-3-アセチル)ミオイニシトール、5-O-β-L-アラビノピラノシル-2-O-インドール-3-アセチル-ミオイニシトール、5-O-β-D-ガラクトピラノシル-2-O-インドール-3-アセチル-ミオイニシトール、2-O-(インドール-3-アセチル)-D-グルコピラノース、4-O-(インドール-3-アセチル)-D-グルコピラノース、6-O-(インドール-3-アセチル)-D-グルコピラノース、ジ-O-(インドール-3-アセチル)-ミオイニシトール、およびトリ-O-(インドール-3-アセチル)- ミオイニシトールなどのインドール-3-アセチル誘導体類;
b)4-クロロインドール-3-酢酸、4-クロロインドール-3-酢酸メチル、4-クロロインドール-3-アセチル-L-アスパラギン酸モノメチル、α-N-カルボメトキシアセチル-D-4-クロロトリプトファン、およびα-N-カルボエトキシアセチル-D-4-クロロトリプトファンなどのクロロインドール類;
c)インドール-3-アセトニトリル、4-メトキシインドール-3-アセトニトリル、および1-メトキシインドール-3-アセトニトリルなどのインドール-3-アセトニトリル類;
d)インドール誘導体類、インドール-3-エタノール、インドール-3-アセトアルデヒド、インドール-3-アセトオキシム、トリプタミン、α-N-マロニル-D-トリプトファン、インドール-3-カルボキサルデヒド、およびインドール-3-カルボン酸;
e)インドール-3-メチルグルコシノレート、1-メトキシインドール-3-メチルグルコシノレート、および1-スルホインドール-3-メチルグルコシノレートなどのその他のインドールコンプレックス(indole complexe)である。
さらに、オーキシン活性を有することができるその他の化合物、インドール-3-アセチルアスパルテート、インドール-3-アセチル-1-b-グルコース、フェニル酢酸、フェニルアセトニトリルなどが存在する。これらの化合物はしばしばオーキシン類似体と呼ばれる。
さらにいくつかの合成オーキシンの商品名:2,4-D、2,4-D(アミンまたはLVエステル)、2,4-DB、クロピラリド、ジカンバ(3,6-ジクロロアニス酸)、バンベル(ジカンバ-DMA塩)、クラリティ(Clarity)(ジカンバDGA塩)、2-メチル-4-クロロフェノキシ酢酸(MCPA)、ピクロラム(4-アミノ-3,5,6-トリクロロピコリン酸)、トリクロピル、およびフルメツラム。上記の任意のまたはすべてのオーキシンまたはオーキシン類似体は、タバコおよびタバコ製品中のニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを低下または減少させるために、単独でまたは組み合わせて使用することができることが企図される。以下の節に、タバコ中ニコチンおよびTSNAのレベルを減少させるための、オーキシンおよびオーキシン類似体の使用法をより詳細に説明する。
オーキシンおよびオーキシン類似体の使用
ニコチンの減少を必要とするものとして識別されたタバコ植物、好ましくは作物または摘心されたタバコの領域と、オーキシンおよび/またはオーキシン類似体とを接触させるために、いくつかの方法が使用し得る。オーキシン類似体2,4-Dの成長刺激薬としての施用例が、Bonnerの米国特許第4,519,163号、Hendersonの米国特許第4,274,861号、およびMacMurrayの米国特許第3,967,953号に見られる。好ましくは、植物にオーキシンまたはオーキシン類似体の水溶液を、特に植物の傷ついた部分(たとえば、摘心された部分)を覆ってスプレーする。界面活性剤または付着剤などの不活性成分を、化合物の植物への利用能または保持性を変更するために溶液に加えることができる。オーキシンまたはオーキシン類似体はまた、植物周囲の土壌に、溶液あるいは乾燥散剤で直接加えることができる。他の実施形態では、オーキシンおよび/またはオーキシン類似体を含んだ組成物を、土壌中または上に置かれた材料の徐々に溶解するケークの一部として加える。
オーキシンまたはオーキシン類似体を施用する範囲は、施用する時期およびタバコ植物の種により決まる。適当な量はまた、生育の諸条件(たとえば、土壌中の窒素)より決まり得る。適した量は、いくつかの立地の試験圃で生育する様々な年齢の作物に、2,4-Dの様々な量を施用することにより実験的に決定することができる。多くの実施形態では、オーキシンまたはオーキシン類似体を施用する範囲は、たとえば約0.005ppm〜約200ppmの間である。すなわち、オーキシンまたはオーキシン類似体の量は約、0.005ppm、0,007ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.05ppm、0.07ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、0.7ppm、1ppm、2ppm、5ppm、7ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm、100ppm、125ppm、150ppm、175ppm、または200ppm以上である。組成物を施用する範囲はまた、土壌タイプ、塩分、干ばつ、温度、および養分レベルなどの環境条件により決まることを理解されたい。多くの実施形態では、オーキシン類似体の塩を含めた任意のオーキシン類似体を使用することができる。さらに、オーキシンおよび/またはオーキシン類似体とアルコールの組合せを使用することができる。上記のように、この組成物はまた不活性成分、界面活性剤、または付着剤を含むことができ、かつこれらの実施形態では、たとえばTween 20ならびに任意の多くのよく知られている付着剤を使用することができる。
いくつかの実施形態では、ニコチンの減少を必要とするものと識別されたタバコ植物、たとえば摘心されたタバコ植物と接触させるオーキシンおよび/またはオーキシン類似体の量は、前記摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンの濃度を、摘心されていない同様の条件下で生育された同じ種のタバコ植物の濃度とほぼ等価のレベルに調整するのに十分な量である。場合により、処理され、摘心されたタバコ植物中のオーキシンのレベルは、未処理の、摘心されていないタバコ植物のレベルよりわずかに低い、またその他の場合は、処理され、摘心されたタバコ植物中のオーキシンのレベルは、未処理の、摘心されていないタバコ植物のレベルよりわずかに高い。したがって、同じ種でかつ摘心されていない同じ条件下で成育されたタバコ植物の量とほぼ同等のオーキシン(結合および非結合)の量を含んだ摘心されたタバコ植物は、本発明の実施形態である。摘心されたタバコ植物から作り出されたタバコおよびタバコ製品もまた、本発明の実施形態である。関連した実施形態では、摘心されていない同じ種でかつ同じ条件下で生育されたタバコ植物の量とほぼ同等の結合または非結合オーキシンの量を含んだタバコ植物(およびそれから作り出されたタバコ生製品)が含まれる。
処理され、摘心されたタバコ植物中のオーキシンまたはオーキシン類似体のレベルを未処理の、摘心されていないタバコ植物と比較して決定する場合、好ましくは同じ年齢でかつ同様の生育条件で栽培された植物と比較する。オーキシンのレベルの分析はまた、好ましくは実質上同じ植物組織で行う。すなわち、タバコ植物中のオーキシンのレベルは頂部からの距離が増すにつれて減少するので、未処理の、摘心されていないタバコ植物および処理され、摘心されたタバコ植物の両方の、好ましくは頂部から数えて同じ葉または節間を分析する(たとえば、Sitbon等、Physiol. Plant、98巻、677頁(1996年)、およびSitbon等、Plant Physiol.、99巻、1062頁(1992年)を参照されたい)。
一例として、ある実施形態では、オーキシンまたはオーキシン類似体で処理された、摘心されたタバコ植物から得られそれから作り出されたタバコおよびタバコ製品であって、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンまたはオーキシン類似体(結合および非結合)の量が、約5〜約40ng/g生体重(FW)または乾燥重量(DW)であるタバコおよびタバコ製品を含んでいる。すなわち、ある実施形態では、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンまたはオーキシン類似体の量は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40ng/gFWまたはDWである。
摘心され、処理されたタバコ植物の特定の実施形態では、たとえば、前記植物からの(頂部から数えて)2または3枚目の葉中のオーキシン(結合および非結合)の量は約21ng/g FW、7枚目の葉中では約6ng/g FW、第1〜3の節間では約31ng/g FW、および第7〜8の節間では約25ng/g FWである。摘心され、処理されたタバコ植物の他の実施形態では、頂部での遊離IAAの量は約52ng/g FWでありかつ結合IAAは約25ng/g FW、1〜3枚目の葉では約30ng/g FWの遊離IAAおよび16ng/g FWの結合IAA、7枚目の葉では約20ng/g FWの遊離IAAおよび26ng/g FWの結合IAA、第1〜3の節間では約60ng/g FWの遊離IAAおよび30ng/g FWの結合IAA、ならびに第5の節間では約53ng/g FWの遊離IAAおよび15ng/g FW結合IAAである。
他の実施形態では、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンの量は、未処理の、摘心されていないタバコまたはその一部より多い。すなわち、たとえば実施形態は、オーキシンまたはオーキシン類似体で処理された、摘心されたタバコ植物から得られ、それから作り出されたタバコおよびタバコ製品を含み、ただし前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンまたはオーキシン類似体(結合および非結合)の量が、40ng/g生体重(FW)または乾燥重量(DW)を超える。すなわち、ある実施形態では、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンまたはオーキシン類似体の量は、約41、42、43、44、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または100ng/g FWまたはDWである。
摘心され、処理されたタバコ植物のある実施形態では、たとえば前記植物からの(頂部から数えて)2または3枚目の葉中のオーキシン(結合および非結合)の量は、21〜100ng/g FWの間、7枚目の葉中では6〜100ng/g FWの間、第1〜3の節間では31〜100ng/g FWの間、第7〜8の節間では25〜100ng/g FWの間であり得る。摘心され、処理されたタバコ植物の他の実施形態では、頂部の遊離IAAの量は52〜100ng/g FWの間でありかつ結合IAAは25〜100ng/g FWの間、1〜3枚目の葉では30〜100ng/g FWの間の遊離IAAおよび16〜100ng/g FWの間の結合IAA、7枚目の葉では20〜100ng/g FWの間の遊離IAAおよび26〜100ng/g FWの間の結合IAA、第1〜3の節間では60〜100ng/g FWの間の遊離IAAおよび30〜100ng/g FWの間の結合IAA、ならびに第5節間では53〜100ng/g FWの間の遊離IAAおよび15〜100ng/g FWの間の結合IAAである。
摘心または頂部除去は、摘心または頂部除去の前に存在したオーキシンのほぼ50%を有するタバコ植物およびその一部をもたらす。(たとえば、WolbangおよびRoss、Planta、214巻、13頁(2001年)を参照されたい)。したがって、ある本発明の実施形態は、摘心されたタバコ植物、その一部、およびそれから作り出されたタバコ製品を含み、ただしオーキシンおよび/またはオーキシン類似体で処理された、前記植物またはその一部中のオーキシンのレベルは、摘心の前の植物またはその一部中のオーキシンの量の約51%〜100%であり、あるいはオーキシンまたはオーキシン類似体で処理されず、かつ摘心されていないが、処理され、摘心されたタバコ植物の条件と同様の生育条件下で栽培された同じ年齢のタバコ植物またはその一部中に存在するオーキシンの量の約51%〜100%である。すなわち、オーキシンおよび/またはオーキシン類似体で処理された、前記摘心されたタバコ植物またはその一部中のオーキシンのレベルは、オーキシンまたはオーキシン類似体で処理されず、かつ摘心されていないが、処理され、摘心されたタバコ植物の条件と同様の生育条件下で栽培された同じ年齢のタバコ植物またはその一部の中に存在するオーキシンの量の51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%の間であり得る。以下の節に、タバコ植物、ならびにジャスモネートアンタゴニストで処理されたタバコ植物から作製されたタバコおよびタバコ製品中のニコチンおよびTSNAのレベルを減少させるための、ジャスモネートアンタゴニストの使用を説明する。
ジャスモネートアンタゴニスト
「ジャスモネートアンタゴニスト」とは、ジャスモネートが植物中で合成されないか、または植物に利用が不可能なように、合成ステップを妨害する分子であると説明し得る。「ジャスモネートアンタゴニスト」とはまた、ジャスモン酸の受容体をブロックし、それによりジャスモン酸の活性を低下させる化合物であり得る。したがって、「ジャスモネートアンタゴニスト」とは、植物中のジャスモネート、ジャスモン酸、またはメチルジャスモネートのレベルまたは利用能を低下させるために機能するものとして特徴づけられる。「ジャスモネートアンタゴニスト」とはまた、しばしば傷をつけることまたはその他のストレス応答に伴って生じる、ジャスモン酸レベルの増加を防止するまたは阻害する分子類、およびリポキシゲナーゼ（ジャスモン酸合成をもたらす経路中の酵素）の活性に阻害作用を有する分子類を含む。ジャスモン酸アンタゴニストはまた、ジャスモン酸レベルが減少するように、オクタデカノイド経路中のいずれかのステップの阻害剤であり得る。
ある実施形態では、ジャスモネートシグナル伝達経路、または草食および虫の摂食に対する一般的な植物応答を妨害する分子類が、タバコ中のニコチンおよび/またはニトロソアミンレベルを減少させるために使用される。このジャスモン酸経路は、たとえばイブプロフェン、ナプロキセン、およびサリチル酸などの非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)でブロックすることができる。さらに、ジャスモン酸経路は、ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸(Syngenta社から市販されている)を含んだ化合物を施用することにより遮断することができる。ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を含んだ化合物としては、アシベンゾラルSメチル、アシベンゾラルSメチルフェノプロピジン(fenopropidin)またはアクチガード(actigard) 50 wpまたはビオン(bion)がある。Actigard 50 wpはアオカビを抑制するためにバーレー種タバコに施用されてきた。(Nesmith、「Actigard-A New Blue Mold Control Tool」、KY Pest Newsからのタバコの病気記事 (オンライン出版物)を参照されたい)。
ジャスモネートアンタゴニストを施用する量は、施用時期およびタバコ植物の種により決まる。適当な量はまた、生育条件より決まる(たとえば、土壌中の窒素)。好ましくは、ジャスモネートアンタゴニストを施用する量は、摘心され、処理されたタバコ植物またはその一部中のジャスモン酸のレベルを、同じ年齢でかつ同じ生育条件下で栽培された、未処理の、摘心していないタバコ植物またはその一部とほぼ等しいレベルに減少させるのに十分な量である。
処理され、摘心されたタバコ植物中のジャスモン酸のレベルは、未処理の、摘心されていないタバコ植物中の量よりわずかに高いことがあり、その他の場合は、処理され、摘心されたタバコ植物中のジャスモン酸のレベルは、未処理の、摘心されていないタバコ植物中の量よりわずかに低いことがある。したがって、本発明の実施形態は、同じ種でかつ同じ条件下で生育された、摘心されていないタバコ植物の量とほぼ同じジャスモン酸の量を含んだ摘心されたタバコ植物である。前記摘心されたタバコ植物から作り出されたタバコ作物およびタバコ製品もまた、本発明の実施形態である。関連した実施形態は、同じ種でかつ同じ条件下で生育された摘心されていないタバコ植物の量とほぼ同じである、ジャスモン酸の量を含んだタバコ作物および植物(およびそれから作り出されたタバコ製品)を含む。
上記のように、処理され、摘心されたタバコ植物中のジャスモン酸のレベルを、未処理の、摘心されていないタバコ植物と比較して決定する際、好ましくは同じ年齢でかつ同じ生育条件で栽培された植物が比較される。さらに、ほぼ同じ植物組織中のジャスモン酸のレベルを分析する。典型的には、タバコ植物を傷つけた後90分以内では、ジャスモン酸の量が5〜500ng/gに増加する。(たとえば、Kahl等、Planta、210巻:336頁(2000年)を参照されたい)。したがって、本発明のある実施形態は、ジャスモン酸アンタゴニストで処理された、摘心されたタバコ植物から得られたタバコ作物、タバコ植物、およびタバコ製品であって、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のジャスモン酸の量が約0〜約500ng/g生体重(FW)または乾燥重量(DW)であるタバコ作物、タバコ植物、およびタバコ製品を含む。すなわち、ある実施形態では、前記処理され、摘心されたタバコ植物またはその一部中のジャスモン酸の量は、前記量が摘心されずかつ同じ生育条件を用いて栽培された同じ年齢のタバコ植物中に存在するジャスモン酸の量未満である限り、約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、および500ng/g FWまたはDWである。
ジャスモネートアンタゴニストの適した量の施用は、いくつかの立地の試験圃で生育する様々な年齢の作物に、様々な量を施用することにより実験的に決定することができる。多くの実施形態では、ジャスモネートアンタゴニストの範囲は、約0.005ppm〜約200ppmの間である。すなわち、ジャスモネートアンタゴニストの量は、約0.005ppm、0.007ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.05ppm、0.07ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、0.7ppm、1ppm、2ppm、5ppm、7ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm、100ppm、125ppm、150ppm、175ppm、または200ppm以上であり得る。組成物を施用する範囲は、土壌タイプ、塩分、干ばつ、温度、養分レベルなどの環境条件により決まることを理解されたい。多くの実施形態では、任意のジャスモネートアンタゴニストを使用することができる。さらに、ジャスモネートアンタゴニストとアルコール類の組合せを使用することができる。組成物は、不活性成分、界面活性剤、または付着剤を含むことができる。たとえばTween 20などの任意の界面活性剤、ならびに任意の多くのよく知られている付着剤を使用することができる。ジャスモネートアンタゴニストは、水溶液中、乳濁液中または乾燥散剤として存在することができる。
ジャスモネートアンタゴニストとして作用するその他の分子類
本発明の他の実施形態では、植物病原性防御応答を誘発する任意の分子はサリチル酸を誘発することが可能であり、これがジャスモネートを誘発する応答を妨害し得る。植物を、ジャスモン酸応答を改善させそれによってニコチンレベルを減少させるために、摘心手順を開始する前にサリチル酸で数時間前処理することができる。サリチル酸は、全身的シグナルおよびウイルスに感染したタバコにおける病原に関連したタンパク質の誘発物質、ならびに獲得性抵抗の誘発物質である(Uknes, S.等、Plant Cell、4巻、645〜656頁(1992年))。サリチル酸は、防御応答をもたらす経路中でシグナル機能を果たすように見える。さらに、サリチル酸の内生レベルは誘導因子を与えると増加する。
本明細書では、「サリチル酸化合物」という用語は、サリチル酸およびその安息香酸類似体を包含することを意味する。この用語は、これらに限定されるものではないが、2-ヒドロキシ安息香酸(サリチル酸);(アセチルサリチル酸)(アスピリン);サリチル酸メチル;2,6-ジヒドロキシ安息香酸;3-ヒドロキシ安息香酸;4-ヒドロキシ安息香酸;2,3-ジヒドロキシ安息香酸;2,4-ジヒドロキシ安息香酸および2,5-ジヒドロキシ安息香酸などの化合物を含んでいる。その他のサリチル酸誘導体としては、ブロモサリゲニン(bromosaligenin)、フェンドサル(fendosal)、グリコールサリチレート、メサラミン、サリチル酸1-ナフチル(1-napthyl salicylate)、オルサラジン(olsalazine)、およびスルファサラジンがある。
上記のように、植物中のSAレベルを増加させる1つの方法には、植物を病原体と接触させることがある。しかし、このことは商業的には有用な方策ではない。なぜなら、植物の病原体を接触させることによりSAなどの植物防御シグナルを誘発させることは、植物を衰弱または死滅させることがあるからである。しかし、植物中に病気を起こさせることなく、内生的SAのレベルを増加させ、かつ後続のジャスモネート拮抗作用をもたらす応答を発生させる誘発物質を使用することができる。このことは、1)植物を細菌またはウイルスから誘導された化合物と接触させること、2)植物をSAレベルの増加をもたらす量の未処理の細菌またはウイルスと接触させること、3)植物を粗製細菌のまたはウイルスの抽出物または上澄み液と接触させることを含めて、いくつかの方法で実現することができる。一実施形態では、好ましくは植物に損害を与えないように処理された、ウイルス性物質の細菌の調製物を、サリチル酸の内生的産生を誘発させて、次いでこれがジャスモン酸の合成およびその対応する経路を阻害するために、葉または植物の周囲の土壌に施用することができる。
傷をつけることまたは虫の咀嚼による攻撃は、オクタデカン酸シグナル伝達経路を誘発し、これは植物調節分子ジャスモン酸を合成させる。植物内のオクタデカノイドシグナル伝達経路中に関与する酵素が、Schaller、J. Exp. Bot.、52巻、11頁(2001年)中に概説されている。このジャスモン酸への経路をブロックする機能を果たす分子類を加えることにより、ジャスモン酸をもたらす経路をブロックすることが可能である。ジャスモン酸をもたらす経路をブロックすることにより、ニコチンおよび/またはニトロソアミンレベルを減少させる機能を果たす化合物としては、サリチル酸およびその誘導体に加えて、エスクレンチン(Esculentin)、サリチルヒドロキサム酸、5,8,11-エイコサトリイン酸、5,8,11,14-エイコサトリイン酸、ケトコナゾール、バイカレイン、カフェー酸、α-ペンチル-3-(2-キノリニルメトキシ)ベンゼンメタノール、クルクミン、イブプロフェン、およびナプロキセンがある。これらの分子の多くは哺乳類の研究でリポキシゲナーゼ活性の阻害剤としてよく知られており、植物中のジャスモン酸の蓄積の阻害にも有効であり得る。非ステロイド性の抗炎症薬(たとえば、イブプロフェン、ナプロキセンおよびフルルビプロフェン)は、傷害応答に拮抗することに使用することができる。ナプロキセンはジャガイモ中で(Kolomiets等、Plant Cell、13巻、613頁(2001年))、およびダイズ中でリポキシゲナーゼ活性を阻害するために使用されてきた(Creelman、Plant Physiol.、99巻、1258頁(1992年))。いくつかのその他のリポキシゲナーゼ阻害剤が植物中で有効であることが分かってきた(Sircar、Prostglandins、25巻、393頁(1983年))。さらに、テトサイクラシス(tetcyclacis)(またはテトサイクラシス)などのその他の分子が、植物中でジャスモン酸のレベルを抑制することが分かってきた。Schweizer等、Plant Physiol.、114巻、79頁(1997年)。
リポキシゲナーゼ阻害剤を施用する範囲は、施用の時期およびタバコ植物の種に応じて決まる。適当な量はまた生育条件(たとえば、土壌中の窒素)により決まる。適した量は、いくつかの立地の検定圃で生育する様々な年齢の作物に、リポキシゲナーゼ阻害剤(たとえばナプロキセン)の様々な量を施用することにより実験的に決定することができる。多くの実施形態では、リポキシゲナーゼ阻害剤の範囲は約0.005ppm〜約200ppmの間である。すなわち、リポキシゲナーゼ阻害剤の量は、約0.005ppm、0.007ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.05ppm、0.07ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、0.7pprn、1ppm、2ppm、5ppm、7ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm、100ppm、125ppm、150ppm、175ppm、または200ppm以上であり得る。組成物を施用する範囲はまた、土壌タイプ、塩分、干ばつ、温度、および養分レベルなど環境条件により決まることを理解されたい。多くの実施形態では、任意のリポキシゲナーゼ阻害剤を使用することができる。さらに、リポキシゲナーゼとアルコールの組合せを使用することができる。組成物は不活性成分、界面活性剤、または付着剤を含むことができる。たとえばTween 20などの任意の界面活性剤、ならびに多くのよく知られている任意の付着剤を使用することができる。リポキシゲナーゼ阻害剤は、水溶液中、乳濁液中、または乾燥散剤として存在することができる。
オーキシンおよびその類似体に加えて、その他の植物調節分子をタバコ中のニコチンおよび/またはニトロソアミンレベルを減少させるために使用することができる。ニコチンおよびその他のタバコアルカロイドの合成および蓄積は、様々な発生的、環境的、および化学的信号により誘発されるシグナル伝達経路により制御されることが知られている。機械的な傷、虫による草食、または動物による草食は、しばしばジャスモン酸のシグナル分子に関与する植物中の傷害応答を誘発する。ジャスモン酸の全般的な概説が、Staswick、「Jasmonate Activity in Plants」、Plant Hormones、P.J.Davies(編)、KluwerAcademic Publishers、179〜187頁(1995年)中に見られる。これらのシグナル伝達経路に関与する植物調節分子は、他のシグナル伝達経路と影響を及ぼしあいながら、複雑な応答を引き起こす。(傷害応答およびジャスモン酸の蓄積に関与する様々な相互作用をするシグナル伝達経路の概説としてはWalling, J. Plant Growth Regul.、19巻、195頁(2000年)を参照されたい。)たとえば、ジャスモネート経路とサリチル酸経路の間で影響を及ぼしあうことがライマビーン(lima bean)において認められている(Engelberth等、Plant Physiol.、125巻、369頁(2001年))。さらに、植物調節分子のエチレンは、ジャスモネートと相互作用してニコチニアアテナータ(Nicotiana attenuata)中のニコチンレベルを変えることがわかっている(Winz等、Plant Physiol.、125巻、2189頁(2001年))。タバコモザイクウイルス(TMV)をタバコに接種すると、正常な傷害応答を有することが不可能な植物を作り出すことも見出された。この発見は、病原体誘発サリチル酸経路および傷害誘発ジャスモン酸経路の間で影響を及ぼしあうことを関与するものと考えられる。(Preston等、Planta、209巻、87頁(1999年))。
オーキシン、オーキシン類似体、および/またはジャスモネートアンタゴニストの混液
オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストを使用することに加えて、ニコチンおよび/またはニトロソアミンを減少させる複数の薬剤の混合物または「混液」を使用することができる。こうした混液では、オーキシン、オーキシン類似体、および/またはジャスモネートアンタゴニストを、植物に1回または複数回施用して使用される単一混合物として一緒に使用することができる。あるいは、処理の経過にわたり異なる組成物がタバコ植物に施用されるように、混合物の含量を変えることができる。多くの実施形態では、混液中のオーキシン、オーキシン類似体、および/またはジャスモネートアンタゴニストの範囲は、約0.005ppm〜約200ppmの間であり得る。すなわち、様々な組合せ中のオーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの量は、混液の各々オーキシン、オーキシン類似体、および/またはジャスモネートアンタゴニスト成分に対して、約0.005ppm、0.007ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.05ppm、0.07ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.5ppm、0.7ppm、1ppm、2ppm、5ppm、7ppm、10ppm、20ppm、50ppm、75ppm、100ppm、125ppm、150ppm、175ppm、または200ppm以上であり得る。以下の節では、摘心、およびオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を施用するタイミングを詳細に説明する。
摘心および処理のタイミング
タバコにおいて、収穫する前にタバコ植物を摘心する農業工程は、ニコチンレベルの調節において重要な役割を果たす。摘心によるタバコ植物の機械的な傷は、ジャスモン酸の産生を誘発し、次にこれがニコチン、ニトロソアミンの基質の産生を刺激する。さらに、タバコの摘心は、ニコチンの産生をダウンレギュレーションするオーキシンを産生する植物の細胞を除去する。その結果、摘心工程は植物中のニコチンレベルを急上昇させる。しかし、摘心はその他の理由で有利である。摘心は、作物の収率を増加させる植物性成長を促進させ、かつ植物の結実を防止する。すなわち、本明細書に説明した方法を実行することにより、オーキシン源の除去およびジャスモン酸の産生の結果起こるニコチンの急上昇を起こすことなくタバコ植物を摘心することができる。すなわち、タバコ作物を圃場で摘心し、かつオーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニスト、好ましくは1種または複数のオーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの混液で処理し、このことによりニコチンおよび/またはニトロソアミンが減少したタバコ製品をそれからを作製することができる収穫可能なタバコを生産することができる。
多くの実施形態では、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を、植物が生育の成熟した段階にある、すなわち収穫の少し前および/またはその後に植物に施用する。望ましくは、タバコ植物による傷害応答を防止するように、植物に傷をつける(たとえば、摘心または頂部除去)丁度前およびその後に、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニストを加える。タバコ植物に傷をつけた後の最初の6時間以内ではオーキシンレベルがかなり低下するので、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト処理を圃場での摘心と同時に行うことが好ましい。(たとえば、Thornberg等、Plant Physiol.、96巻、802頁(1991年)を参照されたい)。しかし、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニストでの処理は、摘心の前約21日から1ヶ月、摘心日、摘心後約21日かつ収穫日までに実施することができることを理解されたい。ある実施形態では、処理を収穫後に実施してもよい。
すなわち、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を収穫の約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、および/または約31日前に、または摘心日に、ならびに収穫の約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、1日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、および/または31日前に加えることができる。同様に、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を収穫の約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、および/または約31日前に、または摘心日に、ならびに摘心の約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日、および/または31日後に加えることができる。オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液はまた、より早期に、また場合により収穫後に施用してもよい。オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液に必要な濃度は、植物の年齢、種、感受性、および環境ストレスなどの要因が応答に影響する可能性があるので、経験的に決定される。
オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を、収穫前に1回、収穫前に毎日、またはその間の任意の頻度で施用することができる。またオーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、または混液の施用を、植物の摘心後に、典型的には摘心後31日までに、好ましくは摘心日に実施することができる。また、オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を、摘心後に1回、摘心後に毎日、またはその間の任意の頻度で施用することができる。
オーキシン、オーキシン類似体、ジャスモネートアンタゴニスト、またはその混液を、すでに比較的ニコチンレベルが低いタバコ植物と接触させてもよい。ニコチンレベルの低いタバコの種を使用することができる。さらに、遺伝子工学によりニコチンの生合成経路に関与する酵素のレベルを減少させるのに使用され、本発明の実施形態で使用することができる低ニコチンタバコ植物を生じさせることができる。好ましい実施形態は、遺伝子改変のタバコベクター21〜41であり、これらはQPTase遺伝子のアンチセンス破壊を用いて作製した。たとえば、国際公開第98/56923号、国際公開第00/67558号、およびPCT/US01/26788を参照されたい。以下の節に、処理されたタバコの収穫およびそれからのタバコ製品の調製を説明する。
収穫および製品の調製
本明細書に説明したタバコ処理は、従来の生育および収穫技法(たとえば摘心または非摘心、花の袋かけまたは花の非袋かけ、肥料に富むまたは肥料のない土壌中での栽培)と共に使用するのに適し、収穫した葉および茎は、切断、乾燥、熟成、発酵を含めた従来の調製、および、葉タバコ、粉砕したタバコ、または切断したタバコ、またはタバコを含んだガムまたはトローチを含めた任意の形態の、これに限定されることなくパイプ、葉巻およびタバコ、噛みタバコを含めた、販売用の従来のタバコ製品の製造に使用するのに適している。また、ニコチンおよび/またはニトロソアミンの様々な量を有する広範囲のタバコ製品を作り出だすために、本明細書に説明した低ニコチンおよび/またはニトロソアミンタバコを加工し従来のタバコと混合することができることも企図される。これらの混合したタバコ製品は、消費者が高ニコチンおよびニトロソアミン製品から低ニコチンおよびニトロソアミン製品に徐々に移行するために、禁煙プログラム中に使用することができる。
たとえば、喫煙者は1Omgのニコチンおよび1.5mgのニトロソアミンを有する混合タバコを喫煙するプログラムを開始し、徐々に7mgのニコチンおよびlmgのニトロソアミンを有する喫煙タバコに移り、5.Omgのニコチンおよび0.5mgのニトロソアミンを有するタバコが続き、2.Omgのニコチンおよび0.25mgのニトロソアミンを有するタバコが続き、消費者が実質上ニコチンおよびニトロソアミンを有しないタバコのみを喫煙するか、あるいはまったく禁煙することを決意するまで、1.Omgのニコチンを有しニトロソアミンを有しないタバコを続けることができる。したがって、本明細書に説明した混合したタバコは、ヒトの発がんの可能性を段階的に低下させるアプローチの基礎を提供する。
本明細書では、作物は、圃場で一緒に作付けされた、本発明のおよび同じ遺伝子の複数の植物からなる。「圃場」とは、一般的な土壌の画地または温室を意味する。したがって、本発明は、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストで処理され、それによって、同じ種の未処理の植物の類似した作物に比較して、ニコチンおよび/またはニトロソアミンレベルが減少した植物の作物を生産する方法を提供する。以下の実施例は、本発明を例示するために示しており、これに限定するものと解釈されるものではない。
（実施例１）2,4-Dを用いたタバコ中のニコチンおよびニトロソアミンレベルの低減
栽培された作物またはタバコの圃場中のニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを減少させるために、湿潤剤「Agral 60」(たとえば0.0006%体積/体積の混和可能オイル乳濁液)を含んだ、2,4-Dの濃厚水溶液(たとえば10%溶液)を調製する。2,4-Dはなく湿潤剤を含んだ対照溶液を調製する。これらの溶液を、最終スプレー溶液中の2,4-Dが0.1、1、10、または100ppmになるように希釈する。様々な年齢の成熟度(その一部は摘心されている)のタバコの対照および試験タバコ(たとえば、個々の種に対し分離した試験区で従来技法により栽培されたバーレー種、バージニア種、およびオリエント種)に、希釈物又は湿潤剤単独をスプレーする。次いで植物に上記溶液をしずくが滴り落ちる点までスプレーする。植物を14日間正常に成長し続けさせる。次いで植物を収穫し、試料の葉(同じ年齢の植物上の同じ位置からの)を液体窒素を用いて急速凍結する。これらの試料の葉について標準技法を用いてニコチンレベルを測定する。
熟成した葉(非緑色の葉または黄色に乾燥した葉)を得るために、試験する種に特定の迅速乾燥熟成技法か、または従来の熟成技法を使用する。次いで、熟成した葉および茎および/またはその部分(たとえば、葉の葉身および中骨)について従来のTSNA分析を行う。このアプローチに従って、圃場中の特定の年齢の植物(摘心されたまたは摘心されていない)に対して低ニコチンおよび/または低ニトロソアミンレベルを達成するための、特定のタバコの種に施用される2,4-Dの量は容易に決定される。以下の実施例では、タバコ中のジャスモネートで誘発されるニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを減少させるために、エテホンなどのエチレン前駆体が使用される。
（実施例２）エテホンを用いたタバコ中のニコチンおよびニトロソアミンレベルの低減
様々な年齢の成熟度(その一部は摘心されている)の対照および試験タバコ(たとえば、個々の種に対し分離した試験区で従来技法により栽培されたバーレー種、バージニア種、およびオリエント種)を生育する。摘心されていない植物の一部をジャスモン酸メチル(MeJA)単独、またはMeJAおよびエテホンで処理し、摘心された植物をエテホンで処理する。MeJAおよびエテホンの様々な量を施用し、実施例1と同様に調製された「Agral 60」を試験区の一部に使用する。植物を処理の1、2、3、4、および5日後に収穫する。試料の葉を液体窒素を用いて急速凍結し、試料の葉についてニコチン濃度(μg/mg乾燥重量)を求める。熟成した葉(非緑色の葉または黄色に乾燥した葉)を得るために、試験する種に特定の迅速乾燥熟成技法か、または従来の熟成技法を使用する。次いで、熟成した葉および茎および/またはその部分(たとえば、葉の葉身および中骨)について従来のTSNA分析を行う。上記のアプローチに従って、圃場中の特定の年齢の植物(摘心されたまたは摘心されていない)に対して低ニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを達成するための、特定のタバコの種に施用するエテホンの量は容易に決定される。以下の実施例では、タバコ中のジャスモネートで誘発されるニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを減少させるために、ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を含んだ化合物が使用される。
（実施例３）ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を用いたタバコ中のニコチンおよびニトロソアミンレベルの低減
様々な年齢の成熟度(その一部は摘心されている)の対照および試験タバコ (たとえば、個々の種に対し分離した試験区で従来技法により栽培されたバーレー種、バージニア種、およびオリエント種)を生育する。様々な希釈のベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を含んだ化合物Actigardを、製造者の説明書に従ってタバコ圃場に施用する。処理の5、10、14、および21日後、タバコを収穫し、試料の葉を液体窒素中で急速凍結する。試料の葉を従来の試験法を用いてニコチンレベルを分析する。熟成した葉(非緑色の葉または黄色に乾燥した葉)を得るために、収穫した茎および葉を試験される種に特定の熟成法を用いて、迅速乾燥熟成技法か、または従来の熟成技法を用いて熟成する。次いで、熟成した葉および茎および/またはその部分(たとえば、葉の葉身および中骨)について従来のTSNA分析を行う。上記のアプローチに従って、圃場中の特定の年齢の植物(摘心されたまたは摘心されていない)に対して低ニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを達成するための、特定のタバコの種に施用するベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸の量は容易に決定される。以下の実施例では、タバコ中のジャスモネートで誘発されるニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを減少させるために、2,4-Dおよびベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を含んだ化合物の混液が使用される。
（実施例４）2,4-Dおよびベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を用いたタバコ中のニコチンおよびニトロソアミンレベルの低減
様々な年齢の成熟度(その一部は摘心されている)の対照および試験タバコ (たとえば、個々の種に対し分離した試験区で従来技法により栽培されたバーレー種、バージニア種、およびオリエント種)を生育する。実施例1に記載のように、Agral 60と共におよびなしで2,4-Dの溶液(様々の希釈度の)を調製する。ベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸を含んだ化合物Actigardを、製造者の説明書に従って調製する。試験区(摘心されたおよび摘心されてない)に2,4-Dを用いて噴霧し、続いてActigardを用いて噴霧する。処理の5、10、14、および21日後、タバコを収穫し、試料の葉を液体窒素中で急速凍結する。試料の葉を従来の試験法を用いてニコチンレベルを分析する。熟成した葉(非緑色の葉または黄色に乾燥した葉)を得るために、収穫した茎および葉を試験する種に特定の熟成法を用いて、迅速乾燥熟成技法か、または従来の熟成技法を用いて熟成する。次いで、熟成した葉および茎および/またはその部分(たとえば、葉の葉身および中骨)について従来のTSNA分析を行う。上記のアプローチに従って、圃場中の特定の年齢の植物(摘心されたまたは摘心されていない)に対して低ニコチンおよび/またはニトロソアミンのレベルを達成するための、特定のタバコの種に施用するベンゾ[1,2,3]チアジアゾール-7-カルボチオ酸と組み合わせた2,4-Dの量は容易に決定される。以下の実施例では、低ニコチンおよび低ニトロソアミンタバコ混合物の製造を説明する。
（実施例５）低ニコチンおよびニトロソアミン混合タバコ
以下の実施例は、特定な量のニコチンおよび/またはTSNA類を有するタバコ製品を、混合により作り出すためのいくつかの方法を説明する。いくつかの混合アプローチは、きわめて低い量のニコチンおよび/またはTSNA類を有する種から調製されたタバコで開始する。低ニコチン/TSNA種から調製されたタバコ(たとえば、ニコチンおよび/またはTSNA類が検出不可能なレベルの)と従来のタバコ(たとえば、30,000ppmのニコチンおよび8,000ppb（10億分の1)のTSNAを有するバーレー種、20,000ppmのニコチンおよび300ppbのTSNAを有する煙道熟成品、および10,000ppmのニコチンおよび100ppbのTSNAを有するオリエント種)とを混合することにより、実質上任意のニコチンおよび/またはTSNA類の量を有するタバコ製品を製造することができる。様々な量のニコチンおよび/またはTSNA類を有するタバコ製品は、喫煙者がそのニコチン依存を低下させるまたは除く、および発がんの可能性を低下させることを助けるための、禁煙キットおよびプログラムに組み込むことができる。
たとえば、第1ステップのタバコ製品は、ほぼ25%の低ニコチン/TSNAタバコおよび75%の従来のタバコからなることができる;第2ステップのタバコ製品は、ほぼ50%の低ニコチン/TSNAタバコおよび50%の従来のタバコからなることができる;第3ステップのタバコ製品は、ほぼ75%の低ニコチン/TSNAタバコおよび25%の従来のタバコからなることができる;および第4ステップのタバコ製品は、ほぼ100%の低ニコチン/TSNAタバコおよび0%の従来のタバコからなることができる。禁煙キットは、上記それぞれの混合物からのタバコ製品の、消費者が1月用プログラムを満たすための量で構成することができる。すなわち、消費者が1日に1箱の喫煙者の場合は、たとえば1月キットは各ステップから7箱、合計28箱を提供することになる。各禁煙キットは、消費者に段階的な方法により具体的に指示する1組の説明書を含むことになる。もちろん、ニコチンおよび/またはTSNA類の特定の量を有するタバコ製品は、消費者が個々に所望するニコチンおよび/またはTSNAの量を選択できるように、便利なサイズの量で(たとえば、葉巻の箱、タバコの箱、嗅ぎたばこの缶、および噛みタバコの袋またはひねりタバコ)入手可能にすることになる。本明細書に説明した教示を用いて様々な低ニコチン/低TSNAタバコ混合物を得る多くの方法があり、以下のものは単に当業者を1つの可能なアプローチに導くことを意図している。
25%の低ニコチン/TSNA混合物である第1ステップのタバコ製品を得るために、ほぼ0ppmのニコチン/TSNAタバコから調製されたタバコを、従来のバーレー種、煙道熟成品、またはオリエント種とそれぞれ25%/75%の比率で混合し、22,500ppmのニコチンおよび6,000ppbのTSNAを有するバーレー種タバコ製品、15,000ppmのニコチンおよび225ppbのTSNAを有する煙道熟成品の製品、および7,500ppmのニコチンおよび75ppbのTSNAを有するオリエント種製品を得ることができる。同様に、50%の低ニコチン/TSNA混合物である第2ステップの製品を得るために、ほぼ0ppmのニコチン/TSNAタバコから調製されたタバコを、従来のバーレー種、煙道熟成品、またはオリエント種とそれぞれ50%/50%の比率で混合し、15,000ppmのニコチンおよび4,000ppbのTSNAを有するバーレー種タバコ製品、10,000ppmのニコチンおよび150ppbのTSNAを有する煙道熟成品の製品、および5000ppmのニコチンおよび50ppbのTSNAを有するオリエント種製品を得ることができる。さらに、75%/25%の低ニコチン/TSNA混合物である第3ステップの製品を得るために、ほぼ0ppmのニコチン/TSNAタバコから調製されたタバコを、従来のバーレー種、煙道熟成品、またはオリエント種とそれぞれ75%/25%の比率で混合し、7,500ppmのニコチンおよび2,000ppbのTSNAを有するバーレー種タバコ製品、5,000ppmのニコチンおよび75ppbのTSNAを有する煙道熟成品の製品、および2,500ppmのニコチンおよび25ppbのTSNAを有するオリエント種製品を得ることができる。
タバコ製品はしばしば、世界の多くの異なる地域で様々な生育条件下で生育された、多くの異なる種類のタバコの混合物であることを理解されたい。その結果、ニコチンおよびTSNA類の量は作物ごとに異なる。それにもかかわらず、所望の混合物を作り出すために使用した作物当たりのニコチンおよびTSNA平均量は、従来の技法を用いて容易に決定する事ができる。混合物を構成するタバコの各タイプの量を調整することにより、当業者ならニコチンおよび/またはTSNAの量と外観、風味、および吸いやすさなどのその他の要件とバランスをとることができる。このようにして、様々なレベルのニコチンおよび/またはニトロソアミン、ならびに外観、風味および吸いやすさを有する種々の種類のタバコ製品を作り出すことができる。
（実施例６）低ニコチンおよびニトロソアミンレベルを含んだ禁煙製品
以下の実施例は、本発明の低ニコチン、低TSNAタバコ製品を利用した禁煙製品を説明する。タバコ当たりのニコチンの特定の段階的レベルを作り出すために、非常に低レベルのTSNA類および本質的に無ニコチンを含んだ処理されたタバコを、合成で調製したニコチンと混合する。たとえば、タバコが5mg、4、3、2、1、0.5、0.1、または0mgのニコチンをタバコ当たりに含み得る。段階的タバコの箱には、そのニコチン含量を表示し、かつ段階的ニコチン低減プログラムの段階を包装上に明確に表示する。ユーザは毎週、次に低いレベルのニコチンを有するタバコを含んだ箱を購入するが、以前消費した1日当たりのタバコの本数以下に自身を制限する。ユーザは、a)1日当たりに喫煙するタバコの本数、b)出発ニコチンレベル、c)各週のタバコ当たりのニコチンレベルの変化、およびd)1日当たりに喫煙するニコチンの最終レベルを選択することにより、各人のニーズに応じた自分の禁煙速度を画定し得る。ニコチン低減プログラムのより効果的な経過を維持するために、各人は毎日合計ニコチン摂取量、ならびに1日当たり喫煙したタバコの本数を記録しておく。最終的には、各人は本質的にニコチンを含まないタバコ製品を喫煙することになる。最終ステップのニコチンを含まないタバコ製品は非中毒性であるので、したがってタバコ製品の使用をまったくやめることがより容易になる。
（実施例７）低TSNAレベルおよび段階的にニコチンレベルが減少するタバコの箱を含んだ禁煙キット
タバコを多く、中位に、または少し吸う人を対象とした、様々な禁煙キットを調製する。キットは、キットに応じて2週間(速い)、1ヵ月間(中位)あるいは2ヶ月間(遅い)中に喫煙をやめるのに必要なすべての材料を提供する。各キットは、タバコ当たり5mg、4、3、2、1、0.5、0.1、あるいは0mgのニコチンを含んだ、本発明により調製されたタバコの設定された箱数を含んでいる。たとえば、1日1箱の喫煙者は7箱のタバコを受け取ることになり、各々の箱は各タバコ当たり上記の量のニコチンを含んでいる。消費者にニコチンを含まないタバコの喫煙に慣れさせるために、キット中には0mgのタバコを含んだ数週間分の追加のタバコも提供することになる。キットにはさらに、毎日のニコチン摂取量の経過を残しておく日記、各人に禁煙プログラムを継続する動機付けを保持させるための意欲を起こさせる文書、禁煙の利益についての健康情報、チャットグループ、集会、ニュースレター、最近の文献、およびその他の適切なリンクなどのような更なる禁煙情報が見られるウェブサイトアドレスを含むことになる。
本発明を実施形態および実施例を参照して説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更形態を加えることができることを理解されたい。

Claims (30)

  1. タバコ植物をオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物と、前記タバコ植物を摘心する前約21日から摘心した後約21日までの間に接触させることを含み、
    前記組成物と接触させた前記摘心されたタバコ植物中のニコチンの量が、前記組成物に接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物のもの未満である、タバコ植物中のニコチン量を減少させる方法。
  2. タバコ植物をオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物と、前記タバコ植物を摘心する前約21日から摘心した後約21日までの間に接触させること、
    前記タバコ植物を収穫すること、および
    前記収穫されたタバコ植物の葉を熟成することを含み、
    前記熟成させたタバコ中のニコチンの量が、前記組成物に接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物から熟成させたタバコのもの未満である、熟成させたタバコの葉中のニコチン量を減少させる方法。
  3. タバコ植物をオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物と、前記タバコ植物を摘心する前約21日から摘心した後約21日までの間に接触させることであって、前記組成物と接触され、前記摘心されたタバコ植物中のニコチンの量が、前記組成物と接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物のニコチンの量未満であり、
    前記低ニコチン含量のタバコ植物を収穫すること、および
    前記低ニコチン含量のタバコを熟成することを含み、
    それにより、熟成させた低ニコチン含量のタバコが、前記組成物と接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物から熟成させたタバコのもの未満のTSNAレベルを有する、熟成させたタバコ中のTSNA量を減少させる方法。
  4. 摘心後のタバコ植物中に形成されたニコチンの量を、摘心後の同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分な量の、オーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させることを含む、タバコ植物のニコチン量を減少させる方法。
  5. タバコ植物中のニコチンの量を、同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分なオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させること、
    前記低ニコチン含量のタバコ植物を収穫すること、および
    前記低ニコチン含量のタバコを熟成することを含み、
    それにより、熟成させた低ニコチン含量のタバコが、前記組成物と接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物から熟成させたタバコのもの未満のTSNAレベルを有する、熟成させたタバコ中のTSNA量を減少させる方法。
  6. 摘心後のタバコ植物中に形成されるニコチンの量を、摘心後の同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分な量の、オーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させることにより生産されたタバコを含む、低ニコチンタバコを含んだタバコ製品。



  7. タバコ植物中のニコチンの量を、同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分なオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させること、
    前記低ニコチン含量のタバコ植物を収穫すること、および
    前記低ニコチン含量のタバコを熟成することにより生産されたタバコであって、
    それにより、熟成させた低ニコチン含量のタバコが、前記組成物と接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物から熟成させたタバコのもの未満のTSNAレベルを有するタバコを含む、低TSNAタバコを含んだタバコ製品。
  8. 従来のタバコ製品の喫煙をやめ、ニコチンの消費を中止しようとするヒトに、摘心後のタバコ植物中に形成されたニコチンの量を、摘心後の同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分な量の、オーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させることにより生産された低ニコチンタバコを、前記ヒトが従来のタバコ製品喫煙をやめ、ニコチンの消費を中止するのに十分な時間提供することを含んだ禁煙処置方法。
  9. タバコ消費者に請求項8に記載のタバコ製品を提供するステップを含む、ニコチンの有毒作用を低減させる方法。
  10. 摘心後のタバコ植物中に形成されるニコチンの量を、摘心後の同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分な量の、オーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させることにより生産されたタバコ製品であって、
    前記タバコ製品が少なくとも2つの組成物:(a)前記未処理のタバコ植物から生産されたタバコ中に認められるニコチンのレベル未満のニコチンの量、しかし中毒性を引き起こすニコチンレベルを超えるニコチンの量を含んだ、混合されたタバコの第1組成物;および(b)中毒性を引き起こすニコチンレベル未満のニコチンの量を含んだタバコの第2組成物;で提供されるタバコ製品をタバコ消費者に提供すること、および
    前記タバコ消費者に、従来のタバコ製品の使用を減少させるのに十分な時間、第1組成物を喫煙するように指示すること、および
    前記タバコ消費者に、前記第1組成物の使用を減少するのに十分な時間、第2組成物を
    喫煙するように指示し、それによりニコチンの有毒作用が減少されることを含む、ニコチンの有毒作用を低減させる方法。
  11. タバコ植物中のニコチンの量を、同じ種の未処理のタバコ植物のもの未満に減少させるのに十分なオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される組成物とタバコ植物を接触させること、
    前記低ニコチン含量のタバコ植物を収穫すること、および
    前記低ニコチン含量のタバコを熟成することにより生産されたタバコであって、
    それにより、熟成させた低ニコチン含量のタバコが、前記組成物と接触されていない同じ種の摘心されたタバコ植物から熟成させたタバコのもの未満のTSNAレベルを有するタバコを含む、低TSNAタバコを含んだタバコ製品をタバコ消費者に提供するステップを含む、TSNAの有毒作用へのタバコ消費者の暴露を低減する方法。
  12. 第1種のタバコ植物をオーキシン、オーキシン類似体、およびジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される薬剤を含む少なくとも1つの組成物と、前記タバコ植物を摘心する前約21日から摘心した後約21日までの間に接触させること、および
    、組成物と接触されてなく同じ生育条件下で栽培された同じ種の摘心された植物と同様の葉中のニコチンのレベルより低いニコチンのレベルを有する前記タバコ植物の葉を得ることを含む、
    ニコチンの形成を減少させるまたは排除するためにタバコ植物を処理する方法。
  13. 接触させるステップが反復される、請求項12に記載の方法。
  14. 前記タバコ植物を、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストからなる群から選択される複数の薬剤と接触させる、請求項12または13に記載の方法。
  15. 前記タバコ植物がバージニア種、オリエント種、またはバーレー種である、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記タバコ植物が遺伝子組換えタバコ植物である、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記遺伝子組換え植物がVector21から41である、請求項16に記載の方法。
  18. 摘心されたタバコ植物中の摘心後2日のオーキシン量が約5〜約40ng/g生体重である、オーキシンまたはオーキシン類似体で処理された摘心されたタバコ植物。
  19. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約10〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  20. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約15〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  21. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約20〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  22. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約25〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  23. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約30〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  24. 前記摘心されたタバコ植物の前記葉中のオーキシンの量が、約35〜約40ng/g生体重の間である、請求項18に記載の摘心されたタバコ植物。
  25. 摘心されたタバコ植物中のニコチンの量を減少させるための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
  26. 低ニコチン量を有するタバコ製品を調製するための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
  27. 熟成させたタバコ中のTSNAの量を減少させるための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
  28. 低TSNA量を有するタバコ製品を調製するための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
  29. 熟成させたタバコ中のニコチンおよびTSNAの量を減少させるための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
  30. 低ニコチン量および低TSNA量を有するタバコ製品を調製するための、オーキシン、オーキシン類似体、またはジャスモネートアンタゴニストの使用。
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