[go: up one dir, main page]

DE69329641T2 - Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion - Google Patents

Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion

Info

Publication number
DE69329641T2
DE69329641T2 DE69329641T DE69329641T DE69329641T2 DE 69329641 T2 DE69329641 T2 DE 69329641T2 DE 69329641 T DE69329641 T DE 69329641T DE 69329641 T DE69329641 T DE 69329641T DE 69329641 T2 DE69329641 T2 DE 69329641T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
probe
probes
nucleic acid
reorganized
primary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69329641T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69329641D1 (de
Inventor
R. Bouma
Julian Gordon
Joannel Hoijer
Cynthia Jou
James Rhoads
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of DE69329641D1 publication Critical patent/DE69329641D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69329641T2 publication Critical patent/DE69329641T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

    Hintergrund:
  • Diese Anmeldung handelt von der Amplifikation von DNA und insbesondere von der simultanen Amplifikation vielfacher Targetsequenzen unter Verwendung der Ligase- Kettenreaktion (im weiteren Text als "LCR" bezeichnet).
  • Dieser Anmeldung steht im Zusammenhang mit einigen anderen Patentanmeldungen, die von LCR handeln, darunter EP 320 308 und EP 439 182.
  • LCR ist ein Verfahren zur exponentiellen Amplifikation der Anzahl der nachweisbaren Targetmoleküle. Sie beinhaltet die Verwendung von zwei Sondenpaaren. Ein erstes oder primäres Paar hybridisiert mit einem Strang einer Targetsequenz an nah-benachbarten Positionen, so dass sie zusammen ligiert werden können in Matrizen-abhängiger Form, um ein reorganisiertes Primärmolekül zu bilden. Das sekundäre Paar ist in der Lage, mit dem reorganisierten Primärmolekül zu hybridisieren. LCR wurde zuerst von Backman, et al. in EP- A-320 308 beschrieben. Seitdem wurde viel darüber geschrieben. Siehe zum Beispiel Wallace, EP-A-336 731; Orgel, WO 89/09835; Richards, WO 89/12696; Segev, WO 90101069 und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 189-193 (1991). Eine Abwandlung von LCR, die als "Gap"-LCR bekannt ist, ist in EP-A-439 182 und in Segev, WO 90/01069 beschrieben.
  • Anstatt der Verwendung von zwei Sondenpaaren, die glattendige Doppelstränge bilden können, enthält mindestens eine Sonde der Sondenpaare anfangs ein "modifiziertes" Ende, das den resultierenden Doppelstrang "nichtglatt" macht, und/oder kein geeignetes Substrat für die Ligase-katalysierte Fusion der beiden Sondendoppelstränge. Ein "modifiziertes Ende" hat entweder (1) einen Blockierungsanteil (oder zusätzliche Basenreste) an einer Gruppe (z. B. dem 5'-Phosphat oder dem 3'-Hydroxyl), die unter normalen LCR-Bedingungen obligatorisch an der Ligase-katalysierten Fusion beteiligt ist, oder (2) fehlende Basen zur Bildung einer "Lücke" (englisch Gap) zwischen einem Sondenterminus und dem nächsten Sondenterminus.
  • In der "Gap"-Ausführung werden modifizierte Enden erzeugt, indem von einer oder mehreren Sonden eine kurze Basensequenz eliminiert wird, wobei eine Aussparung oder Lücke zwischen dem 5'-Ende einer Sonde und dem 3'-Ende der anderen Sonde zurückbleibt, wenn beide Sonden an den Target (oder das Targetkomplement oder das daraus erzeugte Polynucleotid) hybridisiert werden. Damit die LCR die Targetsequenz amplifiziert, müssen die Lücken zwischen den Sonden ausgefüllt werden (d. h. die Modifikation muss "korrigiert" werden). In einer ersten Version kann dies erfolgen unter Verwendung einer Polymerase oder einer reversen Transkriptase und einem Überschuss an Desoxynucleotidtriphosphaten, die komplementär zu dem Targetstrang sind, der der Lücke gegenüber liegt. Alternativ kann dies erfolgen, indem eine fünfte Sonde bereitgestellt wird, die komplementär zur Targetsequenz ist, und eine sechste Sonde, die komplementär zur fünften Sonde ist.
  • PCR oder Polymerase-Kettenreaktion ist ein anderes Verfahren für die Amplifikation von DNA. Bei ihr werden zwei Primer eingesetzt, die an gegenüberliegenden Strängen einer doppelsträngigen Targetsequenz hybridisieren. Eine Polymerase initiiert die Verlängerung des Primers, wobei die Targetsequenz als Matrize verwendet wird, indem geeignete komplementäre Nucleotide nacheinander hinzugefügt werden. PCR ist in den U. S.-Patenten 4.883.195 und 4.883.202 beschrieben.
  • PCR wurde in einer Multiplex-Art und Weise verwendet, um das Vorhandensein vielfältiger Targetsequenzen in einer einzelnen Reaktion nachzuweisen. EP-A-364 255 beschreibt die Verwendung mehrerer Primer-Sätze für die simultane Amplifikation mehrerer Targetsequenzen durch PCR. Eine ähnliche Offenbarung findet sich in Chamberlan, et al., Nucl. Acids Res., 16: 1141-56 (1988).
  • Desweiteren schlagen Nickerson, et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8923-8927 (1990) einen Oligonucleotidligationsassay ("OLA") für vielfache Targetsequenzen vor, bis zur Entwicklung "mehrerer nichtisotoper Reportergruppen". OLA arbeitet mit zwei aneinandergrenzenden Sonden, die miteinander ligiert sind, und das ligierte Produkt wird als Maß für das Vorhandensein einer Targetsequenz nachgewiesen.
  • Trotz der Existenz dieser Veröffentlichungen ist die Multiplex-LCR nicht allgemein verfügbar. Die Fachkenntnis auf diesem Gebiet bietet derzeit nicht genügend Anleitung, um das Konzept der Multiplex-LCR zu ermöglichen. Das liegt weitgehend an der Nichtanwendbarkeit von PCR-Bedingungen auf LCR.
    • Zusammenfassung der Erfindung:
  • Folglich haben wir jetzt die Durchführbarkeit von Multiplex-LCR mit nicht weniger als sieben verschiedenen Sondensätzen demonstriert. Unter einem Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren für die Durchführung der LCR-Amplifikation simultan an zwei oder mehr Targetsequenzen. Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten:
  • a. Eine Reaktionslösung bereitstellen, die die Nukleinsäure einer Probe als einzelsträngige Nukleinsäure enthält, wobei die Probe vermutlich eine oder einige einer Vielzahl von Targetnukleinsäuresequenzen enthält;
  • b. Für jede vermutliche Targetsequenz in der Reaktionslösung mindestens vier Nukleinsäuresonden (ein Sondensatz) bereitstellen, worin i) die erste und zweite Sonde Primärsonden sind, und die dritte und vierte Sonde sekundäre Nukleinsäuresonden sind;
  • ii) die erste Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, an ein erstes Segment eines Primärstrangs der Targetnukleinsäure zu hybridisieren; iii) die zweite Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, an ein zweites Segment des Primärstrangs der Targetnukleinsäure zu hybridisieren; (iv) das 5'-Ende des ersten Segments des Primärstrangs des Targets bezüglich des 3'-Endes des zweiten Segments des Primärstrangs des Targets positioniert ist, um die Verbindung der ersten Sonde mit der zweiten Sonde zu ermöglichen, wenn die Sonden an den Primärstrang der Targetnukleinsäure hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Primärmolekül gebildet wird, das aus einem ersten Abschnitt und einen zweiten Abschnitt besteht; v) die dritte Sonde in der Lage ist, an einen ersten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls zu hybridisieren; und vi) die vierte Sonde in der Lage ist, an einen zweiten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls zu hybridisieren, wobei der erste Abschnitt des reorganisierten Moleküls bezüglich des zweiten Abschnitts des reorganisierten Primärmoleküls positioniert ist, um die Verbindung der dritten Sonde mit der vierten Sonde zu ermöglichen, wenn die dritte und vierte Sonde an das reorganisierte Primärmolekül hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Sekundärmolekül gebildet wird; und
  • worin für jede vermutliche Targetsequenz der Sondensatz bereitgestellt wird bei einer Konzentration, die die Verbindung in Gegenwart aller anderen Sondensätze ermöglicht; und
  • c. Den folgenden Zyklus wiederholen:
  • i) Sonden mit der Nukleinsäure in der Probe hybridisieren;
  • ii) die Verbindung vornehmen, um reorganisierte Moleküle zu bilden, und
  • iii) Nukleinsäure in der Probe denaturieren;
  • wobei mit zunehmender Zykluszahl die Menge reorganisierter Primär- und Sekundärmoleküle für jede vermutliche Targetsequenz, die in der Reaktionslösung vorhanden ist, zunimmt.
  • Im Normalfall wird die Verbindung über ein Ligaseenzym, oder ein Ligaseenzym und ein Polymeraseenzym vorgenommen. Normalerweise wird der Zyklus in Schritt c 10 bis 100 mal wiederholt, vorzugsweise 20 bis etwa 60 mal.
  • Im allgemeinen wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen mit Hilfe eines eindeutig nachweisbaren Markers, der jedem Sondensatz zugeordnet ist, wobei die einzelnen nachweisbaren Marker jeweils von den anderen unterscheidbar sind. Marker sind vorzugsweise spezifische Bindungsglieder, z. B. Haptene oder Polynucleotide. Die Marker können entweder für den Nachweis, für die Abtrennung oder für beide Schritte verwendet werden. In einer bevorzugten Konfiguration sind alle Sondensätze mit zwei verschiedenen Markern gekennzeichnet, so dass die reorganisierten Moleküle, wenn sie miteinander hybridisiert sind, mit zwei Markern gekennzeichnet sind, von denen mindestens einer ein eindeutiger Marker und der andere Marker ein allgemeiner Marker ist, das gleiche für jeden Sondensatz.
  • In einem bevorzugten Protokoll wird der allgemeine Marker verwendet für den Nachweis, und der eindeutige Marker wird verwendet, um die reorganisierten Moleküle eines Sondensatzes von den reorganisierten Molekülen mindestens eines anderen Sondensatzes abzutrennen. Die Trennung kann über verschiedene Bindungsstellen auf einer einzelnen festen Phase erfolgen, oder durch die Verwendung einer festen Phase, die charakterisiert ist durch eine Eigenschaft, die die Unterscheidung voneinander gestattet.
  • Unter einem zweiten Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge jeder einzelnen von mehreren Targetnukleinsäuresequenzen durch eine Multiplex-Ligase-Kettenreaktion, die aus den Schritten besteht:
  • a. Eine Reaktionslösung bereitstellen, die die Nukleinsäure einer Probe als einzelsträngige Nukleinsäure enthält, wobei die Probe vermutlich eine oder einige von mehreren Targetnukleinsäuresequenzen enthält;
  • b. Für jede vermutliche Targetsequenz in der Reaktionslösung einen Satz von mindestens zwei und wahlweise vier Nukleinsäuresonden (ein Sondensatz) bereitstellen, worin i) die erste und zweite Sonde Primärsonden sind, und die wahlweise dritte und vierte Sonde sekundäre Nukleinsäuresonden sind; ii) die erste Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, an ein erstes Segment eines Primärstrangs der Targetnukleinsäure zu hybridisieren; iii) die zweite Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, an ein zweites Segment des Primärstrangs der Targetnukleinsäure zu hybridisieren; iv) das 5-Ende des ersten Segments des Primärstrangs des Targets bezüglich des 3'-Endes des zweiten Segments des Primärstrangs des Targets positioniert ist, um die Verbindung der ersten Sonde mit der zweiten Sonde zu ermöglichen, wenn die Sonden an den Primärstrang der Targetnukleinsäure hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Primärmolekül gebildet wird, das aus einem ersten Abschnitt und einen zweiten Abschnitt besteht; v) die dritte Sonde in der Lage ist, an einen ersten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls zu hybridisieren; und vi) die vierte Sonde in der Lage ist, an einen zweiten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls zu hybridisieren, wobei der erste Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls bezüglich des zweiten Abschnitts des reorganisierten Primärmoleküls positioniert ist, um die Verbindung der dritten Sonde mit der vierten Sonde zu ermöglichen, wenn die dritte und vierte Sonde an das reorganisierte Primärmolekül hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Sekundärmolekül gebildet wird;
  • worin mindestens eine Sonde jedes Sondensatzes einen nachweisbaren Marker enthält, und der nachweisbare Marker, der jedem Sondensatz zugeordnet ist, unterscheidbar ist von den nachweisbaren Markern, die den anderen Sondensätzen zugeordnet sind, wodurch das Vorhandensein, das Fehlen oder die Menge jeder vermutlichen Targetsequenz bestimmt werden kann; und
  • worin für jede vermutliche Targetsequenz der Sondensatz bereitgestellt wird bei einer Konzentration, die die Verbindung in Gegenwart aller anderen Sondensätze ermöglicht; und
  • c. Den folgenden Zyklus durchführen:
  • i) Sonden mit der Nukleinsäure in der Probe hybridisieren;
  • ii) die Verbindung vornehmen, um die reorganisierten Moleküle zu bilden, und
  • iii) Nukleinsäure in der Probe denaturieren;
  • wobei mit jedem Zyklus die Menge reorganisierter Primär- und, wahlweise, Sekundärmoleküle für jede vermutliche Targetsequenz, die in der Reaktionslösung vorhanden ist, zunimmt; und
  • d. Den nachweisbaren Marker messen, der jedem Sondensatz zugeordnet ist, als Maß für das Vorhandensein von oder der Menge an Targetnukleinsäure in der Reaktionslösung.
  • Die gleichen Variationen von Markierung, Trennung und Nachweis, die weiter oben erwähnt wurden, sind für diesen Aspekt der Erfindung nützlich.
  • Zuletzt handelt die Erfindung von einem immunochromatographischen Gerät und Verfahren für die Multiplexdetektion vielfacher Analyte. Das Gerät enthält einen Streifen aus porösem Material, das Flüssigkeiten durch Kapillarwirkung transportieren kann, wobei der Streifen mindestens ein erstes und ein zweites eindeutiges Einfangreagenz aufweist, die auf ihm in einem ersten und einem zweiten getrennten Fleck immobilisiert sind, die sich in einem gewissen Abstand zu einem Ende befinden, das mit dem Transportfluid in Kontakt gebracht wird, wobei das erste und zweite eindeutige Einfangreagenz spezifisch für unterschiedliche erste bzw. zweite Analyte ist, worin der zweite getrennte Fleck vom ersten getrennten Fleck sowohl einen vertikalen als auch einen horizontalen Abstand hat, wobei vertikal die Richtung des Flüssigkeitsflusses ist. Vorzugsweise enthält das Gerät drei und mehr getrennte Flecken, und die Flecken sind alle voneinander getrennt, sowohl in vertikaler als auch in horizontaler Richtung, und bilden ein im wesentlichen lineares, diagonales Fleckenraster. Das Verfahren für die Verwendung des Geräts enthält den Schritt, das Kontaktende mit einer Testlösung in Kontakt zu bringen, von der angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, unter Bedingungen, die den Transport dieser Lösung durch Kapillarwirkung mindestens bis zum entferntesten Einfangflecken ermöglichen; und für jeden Einfangflecken bestimmen, ob Analyt an diesen Einfangfleck gebunden wurde.
  • Das Verfahren und das Gerät sind nützlich für konventionelle spezifische Bindungsanalyte wie Antigene und Antikörper sowie für Polynucleotidanalyte.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
  • Abb. 1 ist eine Darstellung des immunchromatographischen Streifens, der beim Multiplex-LCR-Nachweis verwendet wird.
  • Abb. 2a und 2b sind Fotografien, die die immunchromatographischen Streifenergebnisse von Multiplex-LCR zeigen, die an Patientenproben aus Beispiel 7 durchgeführt wurde.
  • Abb. 3 ist eine Fotografie, die die immunchromatographischen Streifenergebnisse von Multiplex-LCR zeigt, die an Patientenproben aus Beispiel 10 durchgeführt wurde.
    • Ausführliche Beschreibung:
  • Wie in dieser Anmeldung verwendet, bezeichnet ein "multiplex" Prozess die Durchführung eines Verfahrens oder eines Prozesses simultan und in dem gleichen Reaktionsgefäß an zwei oder mehreren, typischerweise drei oder mehreren unterschiedlichen Targetsequenzen. Daher ist Multiplex-LCR die Durchführung von LCR an einer Vielzahl von Targetsequenzen unter Verwendung von mindestens einem Satz mit vier Sonden für jede vermutliche Targetsequenz. Ähnlich bezeichnet "N-plex" LCR, wobei N eine Zahl ist, eine LCR, die durchgeführt wird, um eine oder mehrere von N Targetsequenzen zu amplifizieren oder nachzuweisen.
  • Eine "Targetsequenz" oder "Targetnukleinsäure" ist ein Segment einer Nukleinsäure (DNA oder RNA). Das Segment kann eine Länge von etwa 10 oder 15 bis mehrere hundert Nucleotide haben. Für LCR besteht ein Targetsegment normalerweise aus etwa 30 bis etwa 60 Nucleotiden, und die Sequenz ist bekannt. Ein Target ist "vermutlich", wenn sein Vorhandensein erwartet oder vorausgesehen wird, oder wenn es selbst oder eine Abwandlung davon erwartet oder vorausgesehen wird. Um zum Beispiel in einem Multiplex- LCR eines Homozygoten zu bestimmen, welches der beiden sich gegenseitig ausschließenden Allele vorhanden ist, sind die Sequenzen um beide Allele herum vermutliche Targetsequenzen, auch wenn bekannt ist, dass nur von einem Allel erwartet wird, dass es vorhanden ist. Die möglichen Alternativen für jedes Allel sind alles vermutliche Targets.
  • Der Schritt "Verbinden", wie er oben aufgeführt wird, umfasst mehrere bekannte Verfahren für die Verbindung von zwei Sonden miteinander. Das bevorzugte Verfahren ist unter Verwendung einer thermostabilen Ligase, auch wenn andere Ligasen und andere Ligierungsmittel nicht ausgeschlossen sind. Ligasen sind in den eingeschlossenen Patentanmeldungen, EP-A-320 308 und EP-A-373 962, beschrieben.
  • Ein Verbinden ist auch durch chemische Mittel oder durch Photoligation möglich. Verbinden umfasst auch den möglichen Zwischenschritt der "Korrektur" eines modifizierten Endes, wie in EP-A-439 182 beschrieben. Die Korrektur beinhaltet das Füllen der Lücke mit einem Füllreagenz (z. B. Polymerase) sowie die Abspaltung der Blockierungsgruppe (z. B. mit Endonuclease IV).
  • Eine Reaktionslösung wird typischerweise hergestellt, indem Probe von einem Patienten genommen und die Zellen zerstört werden, um die DNA oder RNA freizusetzen. Detergenzien können verwendet werden, aber andere bekannte Verfahren für die Probenaufbereitung sind ebenfalls eingeschlossen. Spezifische Pufferzusammensetzungen sind in der Literatur oder in den Beispielen zu finden. Die DNA oder RNA wird einzeisträngig gemacht, indem die Stringenz-Bedingungen geändert werden, was normalerweise durch Erhitzen erfolgt.
  • Die Sonden für Multiplex-LCR unterscheiden sich normalerweise nicht von den Sonden für konventionelle LCR. Jedoch sollte zum Erleichtern des Nachweises mindestens eine Sonde jedes Sondensatzes einen nachweisbaren Marker tragen. Darüber hinaus müssen alle nachweisbaren Marker von jedem Sondensatz voneinander unterscheidbar sein, entweder durch Signaldifferenzierung oder durch räumliche Differenzierung. Wie weiter unten ausführlicher beschrieben, versteht man unter Signaldifferenzierung die Fähigkeit, Targets am im wesentlichen gleichen Ort (d. h. homogener Assay) aufgrund von Differenzen im Signal (z. B. unterschiedliche Fluoreszenzemissionswellenlängen oder unterschiedliche Farben) zu unterscheiden. Dagegen versteht man unter räumlicher Differenzierung die Fähigkeit, Targets auf der Basis der Position oder des Orts des Signals zu unterscheiden. Räumliche Differenzierung ist auch als Trennung bekannt und kann nach Größe, Molekulargewicht, Ladungsdichte, oder magnetischen oder spezifischen Bindungseigenschaften erfolgen. Selbstverständlich ist es möglich und oftmals wünschenswert, beide Differenzierungsarten innerhalb des gleichen Systems zu verwenden.
  • Wo die Trennung für die Interpretation der Ergebnisse bevorzugt wird, verwendet eine bevorzugte Ausführung zwei Marker: mindestens einer davon ist ein eindeutiger oder unterscheidbarer Marker. Der andere Marker kann ein allgemeiner Marker sein und von allen Sondensätzen gemeinsam genutzt werden, oder er kann ebenfalls eindeutig sein. Je nach verwendetem einzelnen Protokoll (siehe unten) kann entweder der allgemeine Marker oder der eindeutige Marker für den Nachweis verwendet werden, und der andere Marker kann für die Trennung verwendet werden.
  • Der Ausdruck "Marker" bezeichnet ein Molekül oder eine Komponente mit einer Eigenschaft oder Charakteristik, die nachgewiesen werden kann. Ein Marker kann direkt nachweisbar sein, z. B. mit Radioisotopen, Fluorophoren oder Chemilumiphoren; oder ein Marker kann indirekt nachweisbar sein, z. B. mit Haptenen oder Polynucleotid-Enden. Wenn indirekte Marker für den Nachweis oder Signalzwecke verwendet werden, werden sie zusammen mit einem Signalgebildekomplex verwendet. Ein "Signalgebilde" ist ein Molekül oder eine Komponente, die die nachweisbare Eigenschaft oder Charakteristik liefert. Das Signalgebilde kann direkt sein, z. B. mit einem kolloidalen Partikel (z. B. kolloidales Gold oder Selen), oder es kann indirekt sein, z. B. mit einem Enzym (z. B. alkalische Phosphatase, β- Galactosidase oder Merrettichperoxidase). Indirekte Signalgebilde können weitere Komponenten benötigen, z. B. Substrat, wie auf diesem Gebiet bestens bekannt ist. Der "Signalgebildekomplex" enthält ein Signalgebilde, das an spezifische Bindungspartner, z. B. einen Antikörper oder ein Polynucleotid, konjugiert ist. Solche Konjugate können nach allen bekannten Konjugationsverfahren hergestellt werden.
  • Nützliche Marker schließen Radioisotope ein, insbesondere als allgemeinen Marker. Möglicherweise kann ein Radioisotop jedoch als eindeutiger Marker verwendet werden, wenn die Strahlung unterschieden werden kann. Ebenso werden Fluorophore und Chemilumiphore am besten als allgemeine Marker verwendet, obwohl es auch möglich ist, diese als eindeutige Marker zu verwenden, wenn ihr Signal unterschieden werden kann (z. B. auf Wellenlängenbasis). Ein Hapten, Polynucleotid oder ein anderes spezifisches Bindungsglied kann ebenfalls als allgemeiner Marker dienen, auch wenn sie durch die Fähigkeit, ein spezifisches Bindungsglied einfach von einem anderen zu unterscheiden, ideal als eindeutige Marker geeignet sind. Wenn verschiedene spezifische Bindungsglieder eingesetzt werden, werden Konjugate, die verschiedene spezifische Bindungspartner tragen, gemäß einem der Protokolle verwendet, die weiter unten beschrieben sind.
  • Viele verschiedene Haptene sind bekannt, und nahezu jedes Hapten kann mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für die Erfindung ist es lediglich erforderlich, dass ein spezifischer Bindungspartner bekannt ist oder hergestellt werden kann (eine Eigenschaft von "Hapten" per Definition), und dass das Hapten so an die Sonde gekoppelt werden kann, dass es die Hybridisierung nicht beeinträchtigt. Viele Verfahren für die Anlagerung von Haptenen an Sonden sind in der Literatur bekannt. Sowohl Enzo Biochemical (New York) als auch Clontech (Palo Alto) haben Sondenmarkeriungstechniken beschrieben und vermarktet. Zum Beispiel kann ein primäres Amin an ein 3'-Oligoende unter Verwendung von 3'-Amine-ON CPGTM (Clontech, Palo Alto, CA) angelagert werden. Ähnlich kann ein primäres Amin an ein 5'-Oligoende unter Verwendung von Aminomodifier II® (Clontech) angelagert werden. Die Amine können unter Verwendung konventioneller chemischer Aktivierungs- und Bindungstechniken zu verschiedenen Haptenen umgesetzt werden.
  • Desweiteren geben WO92/10505 und U. S. 5.290.925 Verfahren für die Markierung von Sonden an deren 5'- bzw. 3'-Enden bekannt. Alle beide zuvor genannten ebenfalls anhängigen Anmeldungen sind durch Referenz in diesem Antrag enthalten. Zu den illustrativen Haptenen gehören viele Wirkstoffe (z. B. Digoxin, Theophyllin, Phencyclidin (PCP), Salicylate, usw.), T3, Biotin, Fluorescein (FTTC), Dansyl, 2,4-Dinitrophenol (DNP); und modifizierte Nucleotide wie Bromuracil und Basen, die durch Einlagerung einer N- Acetyl-7-iodo-2-fluorenylamino-(AI F)-Gruppe modifiziert sind, sowie viele andere Haptene. Einige der hier genannten Haptene sind beschrieben in U. S. 5.424.414 (Adamantanessigsäuren), U. S. 5.464.746 (Carbazole und Dibenzofurane), WO93/20074 (Acridine) und WO93/20094 (Quinoline) (in diesem Dokument allesamt als "Haptenanmeldungen" bezeichnet).
  • Es versteht sich von selbst, dass die Zahl der Sonden, die für die mehrfache Amplifikation oder den mehrfachen Nachweis notwendig sind, im allgemeinen vier mal so groß ist wie die Zahl der vermutlichen Sequenzen. Im Fall eines Assays für "N" verschiedene bakterielle Organismen beträgt die Anzahl der benötigten Sonden 4 · N. Im Fall von genetischen Mutationstests ist die Regel 4 · T Sonden, mit T gleich der Anzahl der vermutlichen Targetsequenzen, immer noch der allgemeine oder gewöhnliche Fall. Jedoch werden weiter unten bestimmte Ausnahmen beschrieben. Es sollte im Hinterkopf behalten werden, dass es abhängig von der Art und der Komplexität der Mutation mehrere vermutliche Targetsequenzen für jede Mutation geben kann. Angenommen, es handelt sich um eine einfache, einzelne Basensubstitution. Wenn bekannt ist, dass die Substitution jeweils ein einziger Basentyp ist, gibt es zwei mögliche Targetsequenzen: den Wildtypus und die Mutationssubstitution. Wenn jedoch bekannt ist, dass jede der vier Basen am Genort substituiert werden kann, dann liegt die Zahl der vermutlichen Targetsequenzen bei vier. Die allgemeine Regel fordert acht (4 · T, T = 2) Sonden im ersten Fall und 16 (4 · T, T = 4) Sonden im zweiten Fall.
  • Die allgemeine Regel von vier Sonden für jede vermutliche Targetsequenz ist gültig, unabhängig von der Art und der Komplexität der Mutation. In einigen einfachen Mutationen jedoch dienen zwei Sonden eines Satzes (willkürlich angenommen seien es die beiden rechten) auch als die beiden (rechten) Sonden der anderen Sätze, und es werden weniger als 4 · T Sonden benötigt. Zu diesen einfachen Mutationen gehören alle kleinen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen, deren Enden sicher bekannt sind. So lange die Enden bekannt sind, beeinträchtigt die Größe der Deletion, Insertion oder Änderung nicht deren Charakterisierung als "einfach". Für diese "einfachen" Mutationen liegt die Anzahl der benötigten Sonden bei (2T+2). Der Term +2 ist der allgemeine Sondensatz auf einer Seite der Mutation, während der Term 2T alle möglichen Permutationen der Mutation darstellt, d. h. alle möglichen vermutlichen Targetsequenzen. Selbstverständlich hängt die Zahl der möglichen Permutationen von der Natur der Mutation ab.
  • Ein weiterer "Spezialfall", bei dem weniger als 4T Sonden benötigt werden, ist möglich, wo die Mutationskonfiguration des Gens so ist, dass zwei Mutationen nahe genug beieinander liegen, dass eine allgemeine Sonde zwischen den beiden Mutationen verwendet werden kann, mit spezialisierten Sonden an den äußeren Enden. "Nahe genug" bedeutet in diesem Zusammenhang innerhalb einer Distanz, die durch eine LCR-Sonde überspannt werden kann. Typischerweise beträgt diese Distanz etwa 20 bis 40 Basen.
  • Die Interpretation von LCR-Ergebnissen kann die Betrachtung der Anzahl der Zyklen beinhalten, die notwendig sind, um Ziel- und Hintergrundkurven zu produzieren, die voneinander unterscheidbar sind. Für eine gegebene Konzentration an Sonden sei das Hintergrundsignal nach n Zyklen herausgebildet, während sich das Targetsignal nach nur t Zyklen herausbildet. Damit LCR als Diagnosewerkzeug nützlich ist, ist es wünschenswert, dass n viel größer als t ist, d. h. dass es ein so großes "Zyklusfenster" wie möglich zwischen Ziel und Hintergrund gibt, siehe z. B. EP-A-320 308. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Zykluszahl, bei der das Signal "hochkommt", mit der Sondenkonzentration variiert: Je höher die Sondenkonzentration, desto früher bildet sich das Signal heraus, und umgekehrt. Als Konsequenz wurde festgestellt, dass es vorzuziehen ist, die Sondenkonzentration in der Multiplex-LCR sorgfältig abzustimmen. Da alle Reaktionen für die gleiche Zykluszahl durchgeführt werden, müssen alle Zielsignale zu etwa der gleichen Zeit "hochkommen". Das kann sichergestellt werden, indem die Konzentration für jeden Sondensatz sorgfältig abgeglichen wird, so dass jede Reaktion ihren Peak oder zumindest einen nachweisbaren Signalpegel ungefähr bei der gleichen Zykluszahl erreicht. Es ist unmöglich, genau vorherzusagen, wie die Sondenkonzentration für einen gegebenen Sondensatz einzustellen ist, aber das lässt sich durch einfache Experimente schnell empirisch bestimmen.
  • Es ist allgemein bekannt, dass die Schmelztemperatur des Sondensatzes für LCR ungefähr gleich sein sollte. Es wurde jedoch für Multiplex-LCR festgestellt, dass die Schmelztemperaturen so viel wie 8 bis 10ºC von einer zur anderen Seite variieren können.
  • Weitere Reaktionsbedingungen für die Multiplex-LCR sind ähnlich jenen, die in der fundamentaleren LCR verwendet werden. Die gleichen Puffer-, pH- und Salzbedingungen sind im allgemeinen zulässig. Es ist jedoch wünschenswert, eine etwas höhere Konzentration von Ligase zuzusetzen, wie in den Beispielen gezeigt wird. Des weiteren kann auch zusätzliche Polymerase erwünscht sein, wenn lückenfüllende LCR angewendet wird.
  • Wie weiter oben erwähnt, arbeiten die bevorzugten Protokolle mit zwei Markern, einem allgemeinen Marker und einem eindeutigen Marker. Einer der beiden Marker dient als Nachweismarker. Zur Vereinfachung werden die Ausführungen unter Verwendung von Haptenen als allgemeinem sowie eindeutigem Marker beschrieben. Es versteht sich natürlich von selbst, dass ein anderer Marker leicht für mindestens eines der Haptene, insbesondere das allgemeine Hapten, verwendet werden kann.
  • Gemäß eines bevorzugten Standard-LCR-Protokolls wird ein erstes Hapten verwendet, um die reorganisierten Moleküle einzufangen und zu trennen. Ein zweites Hapten wird verwendet, um den reorganisierten Komplex mit dem Signalgebilde zu koppeln. Dieses Verfahren ist ausführlicher in EP-A-439182 beschrieben. Zum Beispiel wird eine Fluoresceinkomponente an das 5'-Ende der ersten Primärsonde und das 3-Ende der ersten Sekundärsonde angelagert. Des weiteren wird ein anderes Hapten, z. B. Biotin, an das 3'- Ende der zweiten Primärsonde und das 5'-Ende der zweiten Sekundärsonde angelagert. Daher sind, wenn die reorganisierten Moleküle dupliziert werden, zwei Biotine an einem Ende des Doppelstranges und zwei Fluoresceine am anderen Ende zu finden. Eine feste Phase mit einer Beschichtung aus Anti-Fluorescein wird verwendet, um reorganisierte Moleküle von unligierten Sonden mit Biotinen zu trennen. (Unligierte Sonden mit Fluorecein werden ebenfalls eingefangen). Die abgetrennten Komplexe werden nachgewiesen unter Verwendung von Avidin oder Anti-Biotin, die mit einem nachweisbaren Signalgebilde, z. B. einem Enzym, markiert sind.
  • Für Multiplex-LCR braucht dieses System von Trennung und Nachweis nur wenig geändert zu werden. Es ist immer noch möglich, nur ein Hapten gemeinsam für alle Sondensätze an einem Ende (Nachweis oder Einfang) der reorganisierten Moleküle zu verwenden. Nur das andere Ende der Moleküle muss unterscheidbar sein, z. B. über ein eindeutiges Hapten. Zwei verschiedene Protokolle sind möglich.
  • Zunächst kann das gemeinsame Hapten (z. B. Biotin) verwendet werden, um alle reorganisierten Moleküle einzufangen. Dann können die unterschiedlichen Komplexe unter Verwendung spezifischer Haptene und Anti-Hapten-Konjugate mit unterscheidbaren Signalgebilden differenziert werden. Zum Beispiel (bei Berücksichtigung der Betrachtungen zu Orientierung und richtigem Sondenende, wie weiter oben erwähnt) werden Sonden für Targetsequenz A mit Biotin und Fluorescein markiert; Sonden für Targetsequenz B werden mit Biotin und Dansyl markiert; und Sonden für Targetsequenz C werden mit Biotin und Digoxin markiert. Alle reorganisierten Moleküle (und mit Biotin versehenen Sonden) werden auf einer festen Phase eingefangen. Anti-Fluorescein, gekoppelt an kolloidales Gold, bildet eine rotbraune Farbe, wenn Targetsequenz A vorhanden ist; Anti-Dansyl, gekoppelt an kolloidales Selen, bildet eine lila Farbe, wenn Targetsequenz B vorhanden ist, und Anti- Digoxin, gekoppelt an Polypyrrollatex bildet eine schwarze Farbe, wenn Targetsequenz C vorhanden ist. Als Alternative können die Antikörper an verschiedene Enzyme (z. B. alkalische Phosphatase, Peroxidase, β-Galactosidase) gekoppelt werden, deren Substrate oder Produkte unterschiedliche Farben bilden.
  • Da das Erkennen verschiedener Farben auf einer festen Phase schwierig sein kann, beinhaltet ein zweites und besseres Protokoll die Verwendung des allgemeinen Haptens/Markers als Nachweisfunktion und die Verwendung des eindeutigen Haptens, um die Targetsequenzen voneinander über eine oder mehrere feste Phasen zu trennen. Zum Beispiel können Kügelchen oder Mikropartikel, die physikalisch getrennt werden können (z. B. durch Manipulation, Filtration, Chromatographie, Sedimentation, Zentrifugation, Magnetfeld), als feste Phase verwendet werden. Trennbare Gruppen dieser festen Phasen werden jeweils mit einem Antikörper gegen eines der eindeutigen Haptene beschichtet. Nach Multiplex-LCR und Inkubation mit der festen Phase werden die Gruppen getrennt und ein allgemeiner Signalgebildekomplex wird mit dem allgemeinen Hapten umgesetzt. Unterschiedliche Sequenzen werden nachgewiesen, indem ein Signal auf einer oder mehreren der unterschiedlichen Festphasengruppen erscheint.
  • Eine Dot-Blot-Verfahren ist ebenfalls nützlich, um reorganisierte Moleküle zu trennen. An getrennten Stellen auf einer blattförmigen festen Phase befinden sich Antikörper zu den verschiedenen eindeutigen Haptenen. Inkubation dieses Blatts mit der Reaktionslösung ermöglicht es, die reorganisierten Moleküle basierend auf der Spezifität der Antikörper für die eindeutigen Haptene zu trennen. Wiederum wird das allgemeine Hapten mit einem Signalgebildekonjugat eingesetzt, um an allen Stellen, die ein reorganisiertes Molekül enthalten, ein Signal zu erzeugen. Die feste Phase wird basierend auf der Stelle (und wahlweise der Intensität) des Signals interpretiert.
  • Eine Variation dieser Technik setzt die Immunchromatographie ein, um die reorganisierten Moleküle auf Basis des eindeutigen Haptens zu trennen. Statt Inkubation der festen Phase mit einer Reaktionslösung, handelt es sich hier bei der festen Phase um ein poröses chromatographisches Material, und die Reaktionslösung steigt gezogen durch Kapillarwirkung hindurch. Ein bevorzugtes poröses Material ist Nitrocellulose. Wie bei der Dot-Blot-Verfahren ist Antikörper zu jedem einzelnen eindeutigen Hapten an verschiedenen Stellen auf dem Streifen immobilisiert, vorzugsweise entlang einer Diagonalen. Wenn die Reaktionslösung, die alle reorganisierten Moleküle enthält, auf einen immobilisierten Antikörperfleck trifft, werden die reorganisierten Moleküle, die das komplementäre Hapten tragen, "eingefangen" und an dieser Stelle immobilisiert. Diese Technik ist eine Variation des Technik, die in EP-A-357 011 beschrieben ist.
  • Es wurde herausgefunden, dass das immunchromatographische Verfahren am besten funktioniert, wenn die Einfangflecken für verschiedene Polynucleotidtargets (und selbst für reguläre Analyte) auf einer Diagonalen angeordnet sind, wie in Abb. 1 dargestellt ist. Aus mehreren Gründen ist es wünschenswert, Einfangflecken in beiden Dimensionen räumlich zu trennen. Zunächst ist die vertikale Trennung nützlich, um Signale von benachbarten Flecken besser differenzieren zu können. Wenn jedoch die Flecken nur in dieser Richtung räumlich getrennt sind, besteht die Tendenz für Marker, sich an dem ersten positiven Einfangfleck zu akkumulieren. Flecken hinter diesem Fleck werden "überschattet" und entwickeln im allgemeinen nicht so schnell ein Signal. Daher wird es bevorzugt, die Flecken auch in horizontaler Richtung zu trennen. Flecken, die nur in horizontaler Richtung räumlich getrennt sind, machen einen viel breiteren Streifen notwendig, damit die Auflösung erreicht wird, die zum Ablesen des Streifens notwendig ist.
  • In einer nochmals anderen Variation beider Protokolle können die reorganisierten Moleküle durch sequenzspezifische Sondenhybridisierung statt über Haptene getrennt und/oder nachgewiesen werden. Diese Variation ist möglich mit den trennbaren Gruppen von festen Phasen, mit der blattförmigen festen Phase und mit dem chromatographischen Medium. Der einzige Unterschied ist der, dass anstatt eines spezifischen Antikörpers für das eindeutige Hapten eine Hybridisierungssonde auf der festen Phase immobilisiert wird, wobei die Sonde spezifisch ist für Sequenzen, die in der ersten Primär- und/oder ersten Sekundärsonde (d. h. den gleichen Sonden, die das eindeutige Hapten in der vorherigen Variation tragen) zu finden sind. Das Verfahren der chromatographischen mediumspezifischen Hybridisierung ist ausführlich in EP-A-387 696 beschrieben.
  • Für das Multiplex-LCR-Verfahren der vorliegenden Erfindung gibt es zahlreiche Anwendungen, je nach Art des eingesetzten Targets. Zunächst ist sie nützlich beim Genscreening oder bei der genetischen Untersuchung. Oftmals manifestiert sich eine bestimmte genetische Erkrankung oder ein bestimmtes genetisches Merkmal als Mutation oder Änderung des genetischen Codes an einer einzigen oder einer endlichen Anzahl Stellen im Genom. Einige Krankheiten oder Zustände (z. B. Sichelzellenanämie, Phenylketonurie, Tay-Sachs-Krankheit, Medium-Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenasedefizienz, Mukoviszidose) manifestieren sich als Punktmutation einer einzigen Base in der DNA. Andere (z. B. Mukoviszidose, Duchenne-Muskeldystrophie (DMD)) können sich manifestieren durch kurze Veränderungen oder Deletionen an einer einzigen oder einer relativkleinen Zahl von Exon-Lokationen. Die Möglichkeit zur Durchführung Multiplex-LCR erlaubt die simultane Analyse der DNA eines Individuums an jedem Exon, für das Deletionen/Veränderungen, die eine bestimmte Krankheit verursachen können, bekannt sind.
  • Eine andere Verwendung der Multiplex-LCR besteht in der Diagnose bestimmter bakterieller oder viraler Erkrankungen, die typischerweise durch viele verschiedene Sorten eines infizierenden Organismus oder Virus hervorgerufen werden. Zum Beispiel ist die Existenz der Human-Papillom-Virus(HPV)-Typen 6, 8, 11, 16, 18, 31 und 33 bekannt. Universelle oder Consensus-Sonden und Primer amplifizieren alle HP-Viren, unabhängig vom Typ. Jedoch sind nur die Typen 16, 18 und möglicherweise 33 von signifikantem klinischen Interesse aufgrund ihrer Assoziation mit krankhaften kanzerogenen Veränderungen. So ermöglicht ein Multiplex-LCR-Assay die simultane Typ-spezifische Amplifikation jeder Variante. Daraus erhält man eine weitere klinische Information, die durch einfache universelle Amplifikation oder durch einfache Typ-spezifische Amplifikation eines Typs nicht verfügbar wäre. Dieser Ansatz ist auch nützlich für den HIV-Virus, für den es mindestens zwei bekannte Typen gibt; und für Chlamydia trachomatis, das mindestens 15 Serovare hat.
  • Es kann ebenfalls nützlich sein, Multiplex-LCR durchzuführen, wenn nur ein einzelner Organismus von Interesse ist. Zum Beispiel können mehrere Targetsequenzen zur Bestätigung oder besseren Spezifität ausgewählt werden. Zum Beispiel seien Sequenzen sowohl des MOMP-Gens als auch des kryptischen Plasmids ausgewählt, um die C. trachomatis-DNA zu bestimmen. Alternativ können interne Kontrollen durchgeführt werden, indem Sonden aufgenommen werden, die die β-Globinsequenzen amplifizieren, sowie Sonden, die die gewünschte Targetsequenz amplifizieren.
  • Eine andere Anwendung der Multiplex-LCR ist die Identitätsprüfung. Eine Palette von vielleicht 10 oder mehr Sequenzen kann ausgewählt werden, deren generelle Population sehr unterschiedlich ist. Durch Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens jeder dieser Sequenzen kann ein Individuum durch ein eindeutiges Muster aus Vorhandensein und Fehlen jeder einzelnen Exon-Sequenz "typisiert" werden. In einer Binärform sei Individuum "A" als "0111001001" identifiziert, während Individuum "B" als "0000111011" identifiziert ist, wobei "0" das Fehlen und "1" das Vorhandensein einer bestimmten Exon-Sequenz anzeigt.
  • Andere Anwendungen werden dem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres offensichtlich werden.
    • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird umfassender verständlich unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich illustrativen Charakter haben sollen und die Erfindung nicht einschränken. Innerhalb der Beispiele haben die folgenden Abkürzungen diese Bedeutung:
  • - BSA steht für Bovines Serum Albumin, d. h. Rinderserumalbumin.
  • - EPPS steht für einen Puffer aus N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(3-propansulfonsäure).
  • - NAD steht für Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, eine Energiequelle für bestimmte biologische Reaktionen.
  • - PCR steht für Polymerase Chain Reaction, d. h. Polymerase-Kettenreaktion.
  • - TRIS steht für tris-(Hydroxymethyl)aminomethan-Puffer.
  • - TTP steht für Thymidintriphosphat, eines der Substrate für Polymerase.
  • - Abbott TestPack PIusTM ist ein Warenzeichen von Abbott Laboratories und bezeichnet einen chromatographischen oder auf Dochtwirkung beruhenden Immunoassaytyp. Dieses Assayformat ist ausführlich in EP-A-421 294 und EP-A-357 011 sowie in anderer Literatur beschrieben.
    • Beispiel 1: Oligosynthese und Haptenierung Teil A - Sequenz und Synthese:
  • Die folgenden Oligonucleotide (siehe Tabelle 1) wurden entsprechend eingeführter Verfahren unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoramiditen auf einem Syntheziser 380A DNA (Applied Biosystems, Foster City CA) synthetisiert, wobei x = Primäres Amin abgeleitet von 3'-Amine-ON CPGTM (Clontech, Palo Alto, CA) ist, y = Primäres Amin abgeleitet von Aminomodifier II® (Clontech) ist, p = Phosphat abgeleitet von Phosphate- ON® (Clontech) ist, und A, C, G und T ihre normale Bedeutung haben. Die Sonden sind in 5'-3'-Richtung von links nach rechts geschrieben. Die Schmelztemperaturen sind für Sondenpaare wie folgt angegeben: erste und zweite hybridisieren, und dritte und vierte hybridisieren. Tabelle 1
  • Die Oligos 1-4 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 4 des Duchenne- Muskeldystrophie(DMD)-Gens, entsprechend dem Nummerierungsschema, das von Koenig M., Monaco A. P. und Kunkel L. M. in The complete sequence of dystrophin predicts a rod shaped cytoskleletal protein. Cell 53, 219-228 (1988) beschrieben wurde. Gemäß dem gleichen Nummerierungsschema sind die Oligos 5-8 spezifisch für einen Abschnitt von Exon 8 des Duchenne-Muskeldystrophie-Gens; die Oligos 9-12 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 12 des DMD-Gens; die Oligos 13-16 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 17 des DMD-Gens; die Oligos 17-20 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 19 des DMD-Gens; die Oligos 21-24 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 44 des DMD- Gens; die Oligos 25-28 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 45 des DMD-Gens; die Oligos 29-32 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 48 des DMD-Gens; und die Oligos 33-36 sind spezifisch für einen Abschnitt von Exon 51 des DMD-Gens. Die Oligos 37-40 sind spezifisch für einen Abschnitt des Human-β-Giobin-Gens und werden als Kontrolle verwendet.
    • Teil B - Haptenierung
  • Das 3'-Ende einiger Oligonucleotide wurde mit Haptenen konjugiert, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Konjugation dieser Haptene folgte der Standard-KB- Cyanoethylphosphoramiditchemie und ist in den bereits genannten Haptenanmeldungen beschrieben. Ein ähnliches Verfahren ist für Fluoreszenzmarkerkonjugate beschrieben in der veröffentlichten U. S.-Anmeldung NTIS ORDER No. PAT-APPL-7-246.688 (Cohen et al., 1989). Die Strukturen der verwendeten Haptene sind in Tabelle 2 unten dargestellt: Tabelle 2
  • Alle Oligonucleotide wurden durch Reversed-Phase-HPLC gereinigt, um fehlerhafte Sequenzen zu entfernen, und im Fall von haptenierten Oligos alle unhaptenierten Spezies zu entfernen.
    • Beispiel 2: Biotinylierung
  • Die aminierten Enden von Oligos 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35, 36, 39 und 40 aus Beispiel 1 wurden mit Biotin markiert, im wesentlichen nach dem Protokoll von Urdea, et al., NucL Acids Res., 16(11): 4937-4956 (1988). Kurz gesagt, es wurden bis zu 1 mg Oligo in 100 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst und mit 2 mg Biotin-(aminocaproyl)2-N-hydroxysuccinimidester in 100 ul Dimethylformamid (DMF) 16 Stunden bei Raumtemperatur behandelt.
  • Oligo 22 (3'-Ende) und 33 (5'-Ende) wurden nach der Synthese mit Fluorescein verknüpft, indem bis zu 1 mg Oligo in 100 u1 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 9,0, gelöst wurden und mit 2 mg Fluoresceinisothiocyanat (FITC) 15 Stunden bei Raumtemperatur behandelt wurden.
  • Alternativ könnte das aminierte 3'-Ende von Oligo 34 mit FTIC umgesetzt werden statt der Haptenierung von Oligo 33.
  • Alle Biotin- und Fluorescein-markierten Oligonucleotide wurden gereinigt durch Säulenchromatographie über Sephadex® G-25 (Pharmacia, Piscataway NJ), präparative Gelelektrophorese und Ethanolfällung.
  • Für Qualitätskontrollzwecke wurde die Integrität der reorganisierten Moleküle nach der Durchführung von LCR auf dem IMx®-Gerät (Abbott Labs) überwacht unter Verwendung des typischen BiotinlFluorescein-bihaptenierten Komplexes, der in EP-A-439182 beschrieben wurde. Aus diesem Grund wurden Oligo 1, 9, 13, 17, 21, 25 und 29 mit einem primären 5'-Amin synthetisiert. Abschnitte dieser Oligos wurden wie weiter oben beschrieben mit Fluorescein umgesetzt, um den Biotin/Fluorescein-Komplex zu liefern, der für die IMx- Analyse notwendig ist. Bei der Multiplex-LCR wurden jedoch die sicht haptenierten aminierten Oligos verwendet.
    • Beispiel 3: Reaktionsbedingungen für LCR
  • Die markierten Oligos von Beispiel 2 wurden, in unterschiedlichen Kombinationen, in "lückenfüllender" modifizierter LCR verwendet, die im wesentlichen in EP-A-439182 beschrieben ist. Im allgemeinen wurden die folgenden Reagenzien in einem 0,5 ml Polypropylenröhrchen gemischt:
  • Reagenz Endkonzentration
  • Wasser (bis zu einem Endvolumen von 45 ul)
  • Reaktionspuffer 15 mM EPPS, pH 7, 8
  • 20 mM KCl
  • 30 mM MgCl&sub2;
  • Oligonucleotide siehe Tabelle 3
  • NAD 0,1 mM
  • TTP 1 uM
  • Probe 250 ng DNA
  • Mineralöl 2 Tropfen/Röhrchen
  • Das Gemisch wurde 3 Minuten auf 100ºC erhitzt, abgekühlt, und das Folgende wurde mit einem Volumen von 5 ul hinzugegeben, für ein Endreaktionsvolumen von 50 ul:
  • Reagenz Endkonzentration
  • DNA-Ligase 3400 UI50 ul
  • von Thermus thermophilus
  • DNA-Polymerase 1,2 U/50 ul
  • von Thermus (MBR Inc., Milwaukee WI)
  • Das Gemisch wurde dann 37 Zyklen einer programmierten Temperaturänderung unterworfen, wobei der Zyklus 30 Sekunden bei 85ºC und 20 Sekunden bei 45ºC war. Die thermische Zyklenführung wurde in einem TempCyclerTM (Coy Laboratory Products, Ann Arbor MI) durchgeführt. Tabelle 3
    • Beispiel 4: Antikörper und feste Phase
  • Antiserum wurde in Kaninchen gegen Immunogene gebildet, die mit Konjugaten von Hapten und entweder Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH, das Hämocyanin der marinen Schlüssellochschnecke) hergestellt wurden. Die Herstellung und Beschreibung dieser Seren ist in den bereits erwähnten Haptenanmeldungen beschrieben, auch wenn alle bekannten Verfahren für die Aufzucht von Antikörpern genügen würden. Diese Seren wurden durch Passage durch Protein A Sepharose® (Phamacia) gereinigt. Das Antiserum gegen Dansyl war ein Maus-monoklonales Antiserum und wurde von der Universität Pennsylvania erhalten (Fan, S.-T. und Karush, F. Molecular Immunology 21: 1023-1029 (1984)).
  • Diese Antiseren wurden in 0,1 M TRIS, pH 7, 8, 0,9% NaCl, 0,1% BSA, 1% Saccharose und einer Spur Phenolrot verdünnt. Teile (0,2 ul) dieser verdünnten Antiseren wurden in einem regelmäßigen Muster (siehe Abb. 1) auf Streifen aus Nitrocellulose (Schleicher und Schuell AE 98,5 um) mit den Abmessungen ca. 4 · 50 mm getüpfelt. Die Konzentrationen der Antiseren waren wie in Tabelle 4 angegeben.
    • Tabelle 4
  • Antiserum Konzentration
  • gegen (mg/ml)
  • Acridin 2,55
  • Dansyl 0,5
  • Dibenzofuran 3,4
  • Fluorescein 0,5
  • Chinolin 0,75
  • Thiophencarbazol 0,25
    • Beispiel 5: Markerkonjugat
  • Kolloidales Selen wurde entsprechend des Verfahrens von Yost, D. A. et al. (U. S.-Patent 4.954.452 (1990)) hergestellt. Das Kolloid wurde in Wasser verdünnt, um eine optische Dichte von 16 bei 545 nm zu erhalten. Zu 1 ml dieser Suspension wurden 1 ul Antibiotin (Abbott Laboratories) mit einer Konzentration von 1 mg/ml und 60 ul BSA mit 100 mg/ml hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde auf einem Vortexmischer 1 Minute gemischt.
    • Beispiel6: Multiplex-Immunchromatographie
  • Die LCR-Reaktionsgemische von Beispiel 3 wurden durch Abbott TestPack PlusTM lmmunchromatographie analysiert, im wesentlichen nach dem Protokoll von EP-A-357 011. Kurz gesagt, die kolloidale Suspension von Beispiel 5 (15 ul) wurde mit Puffer (14 ul, 0,1 M TRIS pH7,8, 0,9% NaCl, 3% Alkali-behandeltes Casein) verdünnt und mit dem Produkt der LCR-Reaktion (1 ul) gemischt. Ein Nitrocellulosestreifen von Beispiel 4 wurde in die Suspension eingelassen. Nach 5 Minuten war der Chromatographieprozess abgeschlossen, und der Nitrocellulosestreifen wurde aus der Reaktionslösung/Kolloidsuspension entfernt und trocknen gelassen. Das Vorhandensein eines farbigen Flecks an der Stelle, an der Antikörper aufgebracht war, zeigte das Vorhandensein eines spezifischen LCR-Produkts an.
    • Beispiel 7: Analyse von Patientenproben auf DMD
  • Proben von Human-DNA, die von Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie erhalten wurden, wurden auf das Vorhandensein von Exon 4, 12, 17, 19, 44, 45, 48 und 51 unter Verwendung von Oligos 1-4 und 9-36 analysiert. Die Oligos 37-49 wurden in das Reaktionsgemisch als Prozesskontrolle aufgenommen, um das Vorhandensein von Human- DNA nachzuweisen. Die Analyse jeder Probe wurde in zwei Teilen durchgeführt: in einem Reaktionsröhrchen war das Gemisch, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, mit Oligo 13-28 und 33-40 (zum Amplifizieren von Exon 17, 19, 45, 48 und 51; zusammen mit Human-β- Globin); und in einem anderen Röhrchen war das LCR-Reaktionsgemisch mit Oligo 1-4, 9- 12, 29-32 und 37-40 (zum Amplifizieren von Exon 4, 12 und 44; zusammen mit Human-β- Globin). Diese Analysen wurden durchgeführt, indem die Proben-DNA einer LCR unterworfen wurde nach Beispiel 3, und anschließend das resultierende Gemisch nach Beispiel 6 immunchromatographisch behandelt wurde.
  • Abb. 2 zeigt die Fotografien der Nitrocellufosestreifen nach der lmmunchromatographie. Die Fotografie in Abb. 2a zeigt 7 Nitrocellulosestreifen. Diese zeigen das Vorhandensein von Amplifikationsprodukten, die spezifisch sind für (Flecken von unten nach oben) Human-β-Globin und DMD-Exon 17, 45, 48, 51 und 19. Die Proben enthielten 250 ng DNA von (von links nach rechts): Lachssamenzellen-DNA; 5 verschiedenen Patienten, die an Duchenne-Muskeldystrophie leiden (Patientennummern in der Fotografie angegeben), und Normal-Human-DNA. Ebenso zeigt die Fotografie in Abb. 2b 5 Nitrocellulosestreifen. Diese zeigen das Vorhandensein von Amplifikationsprodukten für (Flecken von unten nach oben) Human-β-Globin und DMD-Exon 12, 4 und 44. Die Proben enthielten 250 ng DNA von (von links nach rechts): Lachssamenzellen-DNA; 3 verschiedenen Patienten, die an Duchenne-Muskeldystrophie leiden (Patientennummern nicht in der Fotografie angegeben - diese sind (von links nach rechts) Patient 5294, 4036 und 638), und Normal-Human-DNA.
  • Die fehlenden Exons für jeden Patienten sind aus der PCR bekannt (siehe Tabelle 5)
    • Tabelle 5
  • Patient Nr. Exon deletiert (durch PCR) alle anderen werden amplifiziert
  • 4722 17, 19, 45, 48 und 51 (44 nicht getestet)
  • 5294 4, 12, 17 und 19
  • 5303 45
  • 5396 51
  • 638 4, 12, 17, 19, 44 und 45
  • 4036 12 und 44 (17, 19, 45, 48 und 51 nicht getestet)
    • Beispiel 8: Oligosynthese für Mukoviszidose
  • Die folgenden Oligonucleotide (siehe Tabelle 6) wurden entsprechend eingeführter Verfahren unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoramidit auf einem Syntheziser 380A DNA (Applied Biosystems, Forster City CA) synthetisiert, wobei p = Phosphat abgeleitet von Phosphate-ON® (Clontech) ist, Biotin eingeführt wird unter Verwendung von Biotin-ON® (Clontech), und A, C, G und T ihre normale Bedeutung haben. Sonden sind in 5-3'-Richtung von links nach rechts geschrieben. Die angegebene Haptenierung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Tabelle 6
    • Beispiel 9: Reaktionsbedingungen für LCR
  • Die markierten Oligos von Beispiel 8 wurden für glattendige LCR verwendet, im wesentlichen wie in EP-A-320-308 beschrieben, wobei die folgenden Konzentrationen für die Reagenzien verwendet wurden:
  • Reagenz Endkonzentration
  • Wasser (bis zu einem Endvolumen von 45 ul)
  • Reaktionspuffer 50 mM EPPS, pH 7,8 150 mM KCl 10 mM MgCl&sub2;
  • Oligonucleotide 41, 42, 43 und 44 je 3,3 · 10¹¹ Kopien
  • Oligonucleotide 45, 46, 47 und 48 je 4,2 · 10¹¹ Kopien
  • Oligonucleotide 49, 50, 51 und 52 je 2,7 · 10¹¹ Kopien
  • NAD 0,1 mM
  • BSA 5 uM
  • Probe 250 ng DNA
  • Mineralöl 2 Tropfen/Röhrchen
  • Das Gemisch wurde 3 Minuten auf 100ºC erhitzt, abgekühlt auf Raumtemperatur, und die folgende Substanz wurde mit einem Volumen von 5 ul hinzugegeben:
  • Reacienz Endkonzentration
  • DNA-Ligase 3400 U/50 ul
  • von Thermus thermophilus
  • Das Gemisch wurde dann 45 Zyklen einer programmierten Temperaturänderung unterworfen, wobei der Zyklus 30 Sekunden bei 85ºC und 20 Sekunden bei 57ºC war. Die thermische Zyklusführung wurde in einem TempCyclerTM (Coy Laboratory Products, Ann Arbor MI) durchgeführt.
    • Beispiel 10: Analyse von Patientenproben auf Mukoviszidose-Mutationen
  • Proben von Human-DNA, die von Patienten mit Mukoviszidose erhalten wurden, wurden auf das Vorhandensein der Mutationen G551 D, W1282X und ΔF508 unter Verwendung von Oligo 41-52 analysiert. Diese Analysen wurden durchgeführt, indem die Proben-DNA einer LCR nach Beispiel 9 und anschließend das resultierende Gemisch einer Immunchromatographie nach Beispiel 6 unterworfen wurde. Die Reagenzien wurden wie zuvor hergestellt (siehe Beispiel 4-6).
  • Abb. 3 zeigt eine Fotografie der Nitrocellulosestreifen nach der Immunchromatographie. Sie zeigt das Vorhandensein von Amplifikationsprodukten, die spezifisch sind für (Flecken von unten links nach oben rechts) Mukoviszidose-Mutation W1282X, ΔF508 und G551D. Die Proben waren: 1) Wasser (keine DNA), 2) Patient heterozygotisch für Mutation G542X, 3) Patient heterozygotisch für Mutation W1282X, 4) Patient heterozygotisch für Mutation AF508, und 5) Patient heterozygotisch für Mutation G551 D. Keine Flecken erscheinen nach der Amplifikation von Wasser oder DNA G542X (Streifen 1 und 2). Nur ein Fleck erscheint auf Streifen 3, und der befindet sich nahe der linken Kante des Streifens (Ort der Anti-Thiophencarbazol-Immobilisierung) und zeigt eine positive Amplifikation nur von DNA W1282X an. Nur ein Fleck erscheint auf Streifen 4, und der befindet sich fast in der Mitte des Streifens (Ort der Anti-Fluorescein-lmmobilisierung) und zeigt eine positive Amplifikation nur von DNA AF508 an. Nur ein Fleck erscheint auf Streifen 5, und der befindet sich nahe der rechten Kante des Streifens (Ort der Anti-Dansyl- Immobilisierung) und zeigt eine positive Amplifikation nur von DNA G551 D an.
  • Obwohl alle 12 Oligos in allen Reaktionsröhrchen vorhanden waren und die Amplifikation der DNA von allen drei Mutationen ermöglichten, wurde tatsächlich nur die spezifische DNA amplifiziert, die in jeder Probe vorhanden ist. Jeder Patient war heterozygotisch für seine eigene Mutation, d. h. jeder trägt auch ein normales Gen. In keinem Fall zeigte sich für das normale Gen, dass es durch irgendein Oligonucleotid amplifiziert wurde.
    • SEQUENZLISTE
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
  • (1) ANTRAGSTELLER: ABBOTT LABORATORIES und:
  • Bouma, Stanley R.
  • Gordon, Julian
  • Hoijer, Joannel
  • Jou, Cynthia
  • Rhoads, James
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN DER MULTIPLEX LIGASEKETTENREAKTION
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 52
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) EMPFÄNGER: Abbott Laboratories
  • (B) STRASSE: One Abbott Park Road
  • (C) STADT: Abbott Park
  • (D) STAAT: Illinois
  • (E) LAND: U. S.
  • (F) PLZ: 60064-3500
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM
  • (A) MEDIUMTYP: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentln Rel. Nr. 1.0, Version Nr. 1.25/WordPerfect
  • (vii) VORHERIGE APPLIKATIONSDATEN:
  • (A) DOKUMENTNUMMER: 07/860.702
  • (B) LAND: U. S.
  • (C) DATUM DER EINREICHUNG: 31. März 1992
  • (viii) ANWALT-/AGENTENINFORMATIONEN
  • (A) NAME: Brainard, Thomas D.
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32.459
  • (C) REFERENZ-/LISTENNUMMER: 5155.PC.01
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
  • (A) TELEFON: (708) 937-4884
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 1:
  • CACTGCGGGT TTTGCAGAAC AATAA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 2:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 2:
  • ATTGTTCTGC AAAACCCGCA GT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 3:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 3:
  • GTAAGTAGTA CCCTGGACAA GGT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 4:
  • GACCTTGTCC AGGGTACTAC TTACA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 5:
  • CAAGTTTTGC CTCAACAAGT GAGCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 6:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 6:
  • GCTCACTTGT TGAGGCAAAA CTT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 7:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 7:
  • GAAGCCATCC AGGAAGTGGA AA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 8:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 8:
  • ATTTCCACTT CCTGGATGGC TTCAA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 9:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 9:
  • TACATCCTTC TCAATGTCCA ATAGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 10:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 10:
  • CTATTGGACA TTGAGAAGGA TGT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE:23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 11:
  • GCCCCGAAAT GCGAACATTC CAT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 12:
  • TATGGAATGT TCGCATTTGG GGGCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 13:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHRELBUNG: SEQ ID-NR. 13:
  • ACAGGCTGTC ACCACCACTC AGCCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • I (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAMEISCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 14:
  • GGCTGAGTGG TGGTGACAGC CTA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 15:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 15:
  • GACTAACACA GACAACTGTA ATG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 16:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 16:
  • CCATTACAGT TGTCTGTGTT AGTGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 17:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (0) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 17:
  • CGTGATAAGC TGACAGAGTG AAACA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 18:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 24
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 18:
  • GTTTCACTCT GTCAGCTTAT CACG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 19:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 24
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 19:
  • GTTAAGGCTT GAAAGGGCAA GTAG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 20:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 20:
  • CTACTTGCCC TTTCAAGCCT TAACA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 21:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • I (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 21:
  • TTTTACCTGC AGGCGATTTG ACAGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 22:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 22:
  • CTGTCAAATC GCCTGCAGGT AAA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 23:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 23:
  • CTGTTGAGAA ATGGCGGCGT TTT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 24:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare ·
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 24:
  • GAAAACGCCG CCATTTCTCA ACAGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 25:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 25:
  • TTGAATGCAA CTGGGGAAGA AATAA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 26:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 26:
  • ATTTCTTCCC CAGTTGCATT CA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 27:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (8) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANG FORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 27:
  • CAGCAATCCT CAAAAACAGA TGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 28:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 28:
  • GCATCTGTTT TTGAGGATTG CTGAA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 29:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 29:
  • AAGACCTTGA AGAGCAGTTA AATCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 30
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 30:
  • GATTTAACTG CTCTTCAAGG TCT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 31:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 31:
  • CTGCTGCTGT GGTTATCTCC TAT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 32:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 32:
  • AATAGGAGAT AACCACAGCA GCAGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 33:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 33:
  • CAAGTTATAA AATCACAGAG GGTGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 34:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 34:
  • CACCCTCTGT GATTTTATAA CTT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 35:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 35:
  • GGTGGGTGAC CTTGAGGATA TCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 36:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 36:
  • TTGATATCCT CAAGGTCACC CACCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 37:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 37:
  • CCTGTGGGGC AAGGTGAACG TGGA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 38:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 38:
  • CCACGTTCAC CTTGCCCCAC AG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 39:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 39:
  • GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 40:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 40:
  • CCCAGGGCCT CACCACCAAC TTCA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 41:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 41:
  • GTGGAATCAC ACTGAGTGGA GA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 42:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGLE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 42
  • TCTCCACTCA GTGTGATTCC AC
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 43:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 21
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 43:
  • TCAACGAGCA AGAATTTCTT T
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 44:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 44:
  • AAAGAAATTC TTGCTCGTTG A
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 45:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTfKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 45:
  • ATTCAATAAC TTTGCAACAG TG
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 46:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 22
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 46:
  • CACTGTTGCA AAGTTATTGA AT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 47:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 47:
  • AAGGAAAGCC TTTGGAGT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 48:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
  • (8) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 48:
  • ACTCCAAAGG CTTTCCTT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 49:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCMREIBUNG: SEQ ID-NR. 49:
  • GGCACCATTA AAGAAAATAT CAT
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 50:
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 50:
  • ATGATATTTT CTTTAATGGT GCC
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 51:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 23
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 51:
  • TGGTGTTTCC TATGATGAAT ATA
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID-NR. 52
  • (1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP; DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
  • (B) STELLE: 1
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID-NR. 52
  • TATATTCATC ATAGGAAACA CCA

Claims (26)

1. Verfahren zur Durchführung von Multiplex-Ligase-Kettenreaktion, das folgende Schritte umfaßt:
a. die Bereitstellung einer Reaktionslösung, die die Nukleinsäure einer Probe als einzelsträngige Nukleinsäure enthält, wobei die Probe vermutlich eine oder mehrere einer Vielzahl von TargetNukleinsäuresequenzen enthält;
b. die Bereitstellung von mindestens vier Nukleinsäuresonden (ein Sondensatz) in der Reaktionslösung für jede vermutliche Targetsequenz, worin i) die erste und zweite Sonde Primärsonden sind, und die dritte und vierte Sonde sekundäre Nukleinsäuresonden sind; ii) die erste Sonde ein Einzelstrang ist, der an ein erstes Segment eines Primärstrangs der Targetnukleinsäure hybridisiert; iii) die zweite Sonde ein Einzelstrang ist, der an ein zweites Segment des Primärstrangs der Targetnukleinsäure hybridisiert; (iv) das 5'-Ende des ersten Segments des Target-Primärstrangs bezüglich des 3'-Endes des zweiten Segments des Target- Primärstrangs positioniert ist, um die Verbindung der ersten Sonde mit der zweiten Sonde zu ermöglichen, wenn die Sonden an den Primärstrang der Targetnukleinsäure hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Primärmolekül gebildet wird, das aus einem ersten Abschnitt und einen zweiten Abschnitt besteht; v) die dritte Sonde an einen ersten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls hybridisiert; und vi) die vierte Sonde an einen zweiten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls hybridisiert, wobei der erste Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls bezüglich des zweiten Abschnitts des reorganisierten Primärmoleküls positioniert ist, um die Verbindung der dritten Sonde mit der vierten Sonde zu ermöglichen, wenn die dritte und vierte Sonde an das reorganisierte Primärmolekül hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Sekundärmolekül gebildet wird; und
worin für jede vermutliche Targetsequenz der Sondensatz so abgeglichen ist, dass jeder Sondensatz bei einer Konzentration bereitgestellt wird, die die Verbindung in Gegenwart aller anderen Sondensätze ermöglicht; und
worin jeder Sondensatz ein nachweisbares Produkt nach der gleichen Zahl von Amplifikationszyklen produziert; und
c. die Wiederholung des folgenden Zyklus:
i) die Hybridisierung der Sonden mit der Nukleinsäure in der Probe;
ii) die Vornahme der Verbindung, um reorganisierte Moleküle zu bilden, und
iii) das Denaturieren von Nukleinsäure in der Probe;
wobei mit zunehmender Zykluszahl die Menge reorganisierter Primär- und Sekundärmoleküle für jede vermutliche Targetsequenz, die in der Reaktionslösung vorhanden ist, zunimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung über ein Ligaseenzym, oder über ein Ligaseenzym und ein Polymeraseenzym vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Zyklus von Schritt c 20 bis etwa 60 mal wiederholt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens eine Sonde jedes Sondensatzes einen nachweisbaren Marker trägt und jeder nachweisbare Marker jeweils von den anderen unterscheidbar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die nachweisbaren Marker Haptene enthalten, die auf der Basis der Spezifität verschiedener spezifischer Bindungsglieder unterscheidbar sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder Sondensatz mit zwei unterschiedlichen Markern gekennzeichnet ist, so dass die reorganisierten Moleküle, wenn sie zusammen hybridisiert sind, mit zwei Markern gekennzeichnet sind, von denen mindestens einer ein eindeutiger Marker ist, der für jeden Sondensatz verschieden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der andere Marker ein allgemeiner Marker ist, der gleiche für jeden Sondensatz.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der allgemeine Marker für den Nachweis verwendet wird und gewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Chemilumiphoren und Haptenen besteht.
9. Verfahren nach Anspruch 6, worin die eindeutigen Marker eindeutige spezifische Bindungsglieder enthalten, so dass jedes spezifische Bindungsglied von jedem anderen spezifischen Bindungsglied unterscheidbar ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die eindeutigen Marker spezifische Haptene enthalten.
11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die eindeutigen Marker spezifische Hybridisierungssonden enthalten.
12. Verfahren nach Anspruch 9, worin das eindeutige spezifische Bindungsglied verwendet wird, um die reorganisierten Moleküle eines Sondensatzes von den reorganisierten Molekülen mindestens eines anderen Sondensatzes zu trennen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Trennung erreicht wird, indem ein spezifischer Bindungspartner für jedes spezifische Bindungsglied an einer unterschiedlichen Stelle auf einer festen Phase immobilisiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Trennung erreicht wird, indem ein spezifischer Bindungspartner für jedes spezifische Bindungsglied auf einer festen Phase immobilisiert wird, und die feste Phase durch eine Eigenschaft charakterisiert ist, die die Unterscheidung voneinander gestattet.
15. Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge jeder einzelnen einer Vielzahl von Targetnukleinsäuresequenzen durch eine Multiplex-Ligase-Kettenreaktion, das die folgenden Schritte umfaßt:
a. die Bereitstellung einer Reaktionslösung, die die Nukleinsäure einer Probe als einzelsträngige Nukleinsäure enthält, wobei die Probe vermutlich eine oder mehrere einer Vielzahl von Targetnukleinsäuresequenzen enthält;
b. die Bereitstellung in der Reaktionslösung eines Satzes von mindestens zwei und wahlweise vier Nukleinsäuresonden (ein Sondensatz) für jede vermutliche Targetsequenz, worin 1) die erste und zweite der Sonden Primärsonden sind, und die wahlweise dritte und vierte Sonde sekundäre Nukleinsäuresonden sind; ii) die erste Sonde ein Einzelstrang ist, der an ein erstes Segment eines Primärstrangs der Targetnukleinsäure hybridisiert; iii) die zweite Sonde ein Einzelstrang ist, der an ein zweites Segment des Primärstrangs der Targetnukleinsäure hybridisiert; (iv) das 5'-Ende des ersten Segments des Target-Primärstrangs bezüglich des 3'- Endes des zweiten Segments des Target-Primärstrangs positioniert ist, um die Verbindung der ersten Sonde mit der zweiten Sonde zu ermöglichen, wenn die Sonden an den Primärstrang der Targetnukleinsäure hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Primärmolekül gebildet wird, das aus einem ersten Abschnitt und einem zweiten Abschnitt besteht; v) die dritte Sonde an einen ersten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls hybridisiert; und vi) die vierte Sonde an einen zweiten Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls hybridisiert, wobei der erste Abschnitt des reorganisierten Primärmoleküls bezüglich des zweiten Abschnitts des reorganisierten Primärmoleküls positioniert ist, um die Verbindung der dritten Sonde mit der vierten Sonde zu ermöglichen, wenn die dritte und vierte Sonde an das reorganisierte Primärmolekül hybridisiert sind, wodurch ein reorganisiertes Sekundärmolekül gebildet wird;
worin mindestens eine Sonde jedes Sondensatzes einen nachweisbaren Marker enthält, und der nachweisbare Marker, der jedem Sondensatz zugeordnet ist, unterscheidbar ist von den nachweisbaren Markern, die den anderen Sondensätzen zugeordnet sind, wobei das Vorhandensein, das Fehlen oder die Menge jeder vermutlichen Targetsequenz bestimmt werden kann; und
worin für jede vermutliche Targetsequenz der Sondensatz so abgeglichen ist, dass jeder Sondensatz bei einer Konzentration bereitgestellt wird, die die Verbindung in Gegenwart aller anderen Sondensätze ermöglicht; und
worin jeder Sondensatz ein nachweisbares Produkt nach der gleichen Zahl von Amplifikationszyklen produziert; und
c. die Durchführung des folgenden Zyklus:
i) das Hybridisieren der Sonden mit der Nukleinsäure in der Probe als
ii) das Vornehmen der Verbindung, um die reorganisierten Moleküle zu bilden, und
iii) das Denaturieren von Nukleinsäure in der Probe;
wobei mit jedem Zyklus die Menge reorganisierter Primär- und, wahlweise, Sekundärmoleküle für jede vermutliche Targetsequenz, die in der Reaktionslösung vorhanden ist, vergrößert wird; und
d. das Messen des nachweisbaren Markers, der jedem Sondensatz zugeordnet ist, als Maß für das Vorhandensein oder die Menge an Targetnukleinsäure in der Reaktionslösung.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin dis Verbindung über ein Ligaseenzym, oder über ein Ligaseenzym und ein Polymeraseenzym vorgenommen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15, worin die dritte und vierte Sonde bereitgestellt werden und der Zyklus von Schritt c 10 bis etwa 100 mal wiederholt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Zyklus von Schritt c 20 bis etwa 60 mal wiederholt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Sonden mit zwei Markern gekennzeichnet sind, so dass die reorganisierten Moleküle mit zwei Markern gekennzeichnet sind, von denen mindestens einer ein eindeutiger Marker ist, der für jeden Sondensatz verschieden ist.
20. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Sonden mit zwei Markern gekennzeichnet sind, so dass die reorganisierten Moleküle mit zwei Markern gekennzeichnet sind, von denen mindestens einer ein eindeutiger Marker ist, der für jeden Sondensatz verschieden ist, und der andere ein allgemeiner Marker ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, worin der allgemeine Marker für den Nachweis verwendet wird und gewählt ist aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Chemilumiphoren und Haptenen besteht.
22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die eindeutigen Marker Haptene beinhalten und worin jedes eindeutige Hapten sich von jedem anderen eindeutigen Hapten unterscheidet.
23. Verfahren nach Anspruch 20, worin die eindeutigen Marker spezifische Hybridisierungssonden enthalten.
24. Verfahren nach Anspruch 22, worin das eindeutige Hapten verwendet wird, um die verschiedenen reorganisierten Moleküle zu trennen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Trennung erreicht wird, indem ein spezifischer Bindungspartner für jedes eindeutige Hapten an einer unterschiedlichen Stelle auf einer festen Phase immobilisiert wird.
26. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Trennung erreicht wird, indem ein spezifischer Bindungspartner für jedes eindeutige Hapten auf einer festen Phase immobilisiert wird, und die feste Phase charakterisiert ist durch eine Eigenschaft, die die Unterscheidung voneinander gestattet.
DE69329641T 1992-03-31 1993-03-31 Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion Expired - Fee Related DE69329641T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86070292A 1992-03-31 1992-03-31
PCT/US1993/003034 WO1993020227A1 (en) 1992-03-31 1993-03-31 Method of multiplex ligase chain reaction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69329641D1 DE69329641D1 (de) 2000-12-14
DE69329641T2 true DE69329641T2 (de) 2001-06-21

Family

ID=25333823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69329641T Expired - Fee Related DE69329641T2 (de) 1992-03-31 1993-03-31 Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion

Country Status (8)

Country Link
EP (2) EP1018649A3 (de)
JP (1) JPH07505293A (de)
AU (1) AU3942993A (de)
CA (1) CA2133220A1 (de)
DE (1) DE69329641T2 (de)
ES (1) ES2153379T3 (de)
TW (1) TW260672B (de)
WO (1) WO1993020227A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10330982A1 (de) * 2003-07-09 2005-02-17 Prisma Diagnostika Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Bestimmung von Blutgruppenantigenen
DE10330981B4 (de) * 2003-07-09 2010-04-01 Medion Diagnostics Ag Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Durchführung von Blutgruppenbestimmung, Serumgegenprobe und Antikörpersuch-Test

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995011454A1 (en) * 1993-10-21 1995-04-27 Abbott Laboratories Apparatus and method for detecting a target ligand
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
DE69427876T2 (de) * 1994-05-23 2002-04-11 Biotronics Corp., Lowell Methode zur detektion einer gezielten nukleinsäure
US5667974A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Abbott Laboratories Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
US5888731A (en) * 1995-08-30 1999-03-30 Visible Genetics Inc. Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
JP4294732B2 (ja) * 1996-02-09 2009-07-15 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド アドレス可能アレイでのリガーゼ検出反応を用いた核酸配列の相違の検出
EP2369007B1 (de) 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Erkennung von Nukleinsäuresequenz-Unterschieden mittels der gleichzeitigen Ligaseerkennungs- und Polymerasekettenreaktion
US6312892B1 (en) * 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
AU6871798A (en) * 1997-03-28 1998-10-22 Zymogenetics Inc. Human chemokine zsig-35
US6395472B1 (en) 1999-02-05 2002-05-28 Abbott Laboratories Methods of utilizing the TT virus
EP1218536A2 (de) 1999-02-12 2002-07-03 Genset Biallele marker abgeleitet von genomischen regionen, die gene enthalten, die am arachidonsäure stoffwechsel beteiligt sind
CA2405412A1 (en) 2000-04-14 2001-10-25 Cornell Research Foundation, Inc. Method of designing addressable array for detection of nucleic acid sequence differences using ligase detection reaction
WO2002053768A2 (en) * 2001-01-05 2002-07-11 Diagnosticart Llc Dna rapid immune detection methods and apparatus
JP2005511012A (ja) 2001-08-10 2005-04-28 セローノ ジェネティクス インスティテュート ソシエテ アノニム ヒトｃＤＮＡおよびタンパク質およびその使用
DK1436621T3 (da) * 2001-09-17 2011-04-04 Phadia Ab Multianalytprøveapparat med multi-punkt-detektionszone
CA3001404C (en) 2002-11-25 2020-07-28 Masafumi Matsuo Ena nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mrna precursors
TWI333977B (en) 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
JP4933258B2 (ja) 2003-09-22 2012-05-16 クイデル コーポレーション 試料中の複数分析物の検出装置
US7670771B2 (en) 2004-01-21 2010-03-02 University Of Utah Research Foundation Mutant sodium channel Nav1.7 nucleic acid methods
EP3808845A1 (de) 2004-06-28 2021-04-21 The University Of Western Australia Antisense-oligonukleotide zur induzierung von exon-skipping und verfahren zur verwendung davon
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ES2369946T3 (es) 2007-03-01 2011-12-09 Symphogen A/S Procedimiento para clonación de anticuerpos análogos.
CN102203253B (zh) 2008-10-24 2016-04-06 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
CA2780563A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
KR102258326B1 (ko) 2013-03-14 2021-06-02 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
EA201591792A1 (ru) 2013-03-15 2016-02-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Улучшенные композиции для лечения мышечной дистрофии
CN104764877A (zh) * 2014-05-14 2015-07-08 陈岩松 一种免疫层析检测方法及试纸

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4435504A (en) * 1982-07-15 1984-03-06 Syva Company Immunochromatographic assay with support having bound "MIP" and second enzyme
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
DE3887491T2 (de) * 1987-12-21 1994-07-07 Abbott Lab Chromatographische Bindungstesteinrichtungen und Verfahren.
CA1341584C (en) * 1988-04-06 2008-11-18 Bruce Wallace Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
CA1339731C (en) * 1988-10-12 1998-03-17 Charles T. Caskey Multiplex genomic dna amplification for deletion detection
AU635105B2 (en) * 1990-01-26 1993-03-11 Abbott Laboratories Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10330982A1 (de) * 2003-07-09 2005-02-17 Prisma Diagnostika Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Bestimmung von Blutgruppenantigenen
DE10330981B4 (de) * 2003-07-09 2010-04-01 Medion Diagnostics Ag Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Durchführung von Blutgruppenbestimmung, Serumgegenprobe und Antikörpersuch-Test

Also Published As

Publication number Publication date
TW260672B (de) 1995-10-21
EP0633944A4 (de) 1998-02-04
EP0633944A1 (de) 1995-01-18
EP0633944B1 (de) 2000-11-08
JPH07505293A (ja) 1995-06-15
ES2153379T3 (es) 2001-03-01
WO1993020227A1 (en) 1993-10-14
AU3942993A (en) 1993-11-08
DE69329641D1 (de) 2000-12-14
CA2133220A1 (en) 1993-10-14
EP1018649A3 (de) 2000-11-29
EP1018649A2 (de) 2000-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69329641T2 (de) Verfahren zur mehrfachen ligase-kettenreaktion
US5869252A (en) Method of multiplex ligase chain reaction
DE69429626T2 (de) Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis
US6100099A (en) Test strip having a diagonal array of capture spots
DE69231124T2 (de) Schnelle bestimmungsverfahren für amplifikationsprodukte
DE69506393T2 (de) Hybridisation-ligitation-verfahren zum nachweis von spezifischen dns sequenzen
DE69620596T2 (de) Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat-primer-reihen
DE69432419T2 (de) Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation
DE69031665T2 (de) Nachweis von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Fluoreszenz-Polarisation
DE69928747T2 (de) Verfahen und Zusammensetzungen zur Vermehrung von feststellbaren Signalen in spezifischen Bindungstests
DE69528644T2 (de) Verfahren zu Feststellung von DNA-Mulationen in einer Probe eines Patienten
DE69633941T2 (de) Nachweis von unterschieden in nukleinsäuren
DE69131233T2 (de) Verfahren und reagens zum nachweis von spezifischen nukleotid-variationen
DE69327326T2 (de) Vervielfältigungs- und detektionsprozess
DE69420454T2 (de) Interne Kontrollen für isotherme Nukleinsäure-Amplifizierungsreaktionen
DE69618460T2 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen unter verwendung von kompetitiven amplifikation
DE60033825T2 (de) Detektion von unterschieden in nukleinsäuren durch inhibierung spontaner dna verzweigungsmigration
DE69003477T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren.
EP0530794A1 (de) Verfahren zum Nachweis ähnlicher Nukleinsäuren
DE69734576T2 (de) Methode zur vervielfältigung und zum nachweis eines gewünschten nukleinsäurefragments
DE3856224T2 (de) Nachweis eines Polynukleotids durch Ersätzung einer Kette an einer Fangsonde
DE69431510T2 (de) Verfahren zur Koamplifikation zweier unterschiedlicher Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion
DE60309817T2 (de) Mehrzweck-Primer und -Sonden für verbesserte Hybridisierungsassays durch Zerstörung von Sekundärstrukturen
DE69518697T2 (de) Nachweis von Treponema Pallidum und Haemophilus Ducreyi
DE69716706T2 (de) Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäure unter Ausbildung einer Tripelhelix mit aneinander angrenzenden Sonden

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee