NO319058B1 - Gener for butyrobetain/krotonobetain-L-carnitinstoffskiftet og deres anvendelse for mikrobiologisk fremstilling av L-carnitin. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant genetisk materiale for ekspresjon av genene for butyrobetain/- krotonobetain-L-carnitin-stoffskiftet, mikroorganismer som inneholder dette rekombinante genetiske materialet og anvendelsen av slike mikroorganismer i en bioteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin. L-carnitin er en naturlig, vitaminaktig substans av stor betydning for det humane stoffskiftet. L-carnitin er essensielt ved utnyttelsen av fettsyrer som transmitter-substans for mitokondriemembranen og dermed som transportør av metabolsk energi. Syntetiseres L-carnitin i utilstrekkelig mengde for organismen, må det for å unngå mangelsymptomer, nødvendigvis tilføres med næringen. Spesielt ved ernæring av småbarn som enda ikke er i stand til egen L-carnitin-biosyntese, utgjør L-carnitin et essensielt næringsstoff. L-carnitinpreparater inngår som virksomme deler av farma-søytiske produkter. Supplement av L-carnitin ved carnitin-mangel og ved andre terapeutiske indikasjoner, spesielt ved hjertesykdommer etc., er indisert.

Biosyntesen av L-carnitin i høyere organismer er kjent, mens ytterligere funksjoner i, og betydningen for stoffskiftet, er gjenstand for intens forskningsinnsats. Ved siden av en stoffskiftevei som beskrives for mikroorganismer, spesielt av slekten Pseudomonas (y-butyrobetain-hydroksylase-katalyse, Lindstedt et al., Biochemistry 16, 2181-2188, 1977), dannes L-carnitin som stoffskifte-mellomprodukt av visse mikroorganismer, f.eks. av Aqrobacterium/ Rhizobium sp.

Fra EP-A-0 158 194 er det kjent en fremgangsmåte for mikrobiologisk fremstilling av L-carnitin ved å gå ut fra f.eks. y-butyrobetain, hvor det via tradisjonelle mikrobiologiske seleksjonsmetoder oppnås en L-carnityl-dehydrogenase-negativ produksjonsmutant som det allerede i løpet av en omsetningstid på 20 til 30 timer, oppnås relativt gode utbytter av L-carnitin med. En videre optimalisering av denne fremgangsmåte med hensyn til volum-/tidsutbyttet er imidlertid ikke mulig med denne klassiske mikrobiologiske metode.

EP-A 0 122 794 Bl beskriver en satsvis mikrobiologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin hvori crotonobetain overføres av mikroorganismer som er i stand til å metabolisere crotonobetain, slik som sådanne tilhørende slektene Escherichia eller Pseudomonas, til L-carnitin. På begynnelsen av fremgangsmåten må alle utgangsmaterialer være tilstede i dyrkningsmediet. L-carnitinkonsentrasjonen som kan oppnås i dyrkningsmediet er lavere enn 1% og er således ikke tilfredsstillende.

En annen mikrobiologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin fra crotonobetain og/eller y-butyrobetain er beskrevet i EP-A 0410 430. I denne fremgangsmåten blir crotonobetain og/eller y~butyrobetain( betain og en supplerende karbonkilde kontinuerlig fordelt til et dyrkningsmedium inneholdende en mikroorganisme av slekten Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, E. coli eller en gjær av slekten Saccharomyces. Etter dyrking kan en L-carnitin-konsentrasjon på mer enn 6% oppnås i dyrkningsmediet. Imidlertid er en videre optimalisering av denne fremgangsmåten med hensyn til utbytte ikke mulig.

Det har derfor vært en oppgave ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en mer økonomisk bioteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin, hvor L-carnitin oppnås med enda bedre utbytte i løpet av vesentlig kortere omsetningstid.

Undersøkelser av Y~butyrobetain/krotonobetain-stoffskiftet førte til identifisering av fem gener, bcoA/B, bcoC. bcoD, bcoE og bcoT, som koder for enzymer på y-kutyrobetain/- krotonobetain-stoffskifteveien og bla.a. inngår i et operon, det såkalte butyrobetain-L-carnitin-operon (bco). Her betyr bcoA/B: et y-butyrobetain-CoA-syntetase(bcoA)/krotonobetain-CoA-syntetase(bcoB)-gen, dvs. et enkelt gen som koder for et enzymprodukt som har både ybutyrobetain-CoA-syntetase-aktivitet og krotonobetain-CoA-syntetase-aktivitet.

bcoC:et y-butyrobetain-CoA-dehydrogenase-gen

bcoD:et krotonobetain-CoA-hydrolase-gen

bcoEiet L-carnityl-dehydrogenase-gen; og

bcoT:et potensielt gen i transportsystemet.

Det har nå vist seg at genproduktene av genene bcoA/B. bcoC og bcoD er ansvarlig for biosyntesen av L-carnitinet, mens bcoE koder for en carnitin-dehydrogenase som bevirker nedbrytningen av stoffskifte-mellomproduktet L-carnityl-CoA til betain. Ved bcoT er det formodentlig tale om et gen som koder for et transportprotein tilordnet ett av transport-systemene for butyrobetain-stoffskiftet. Dette gen er ikke essensielt for L-carnitin-biosyntesen.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er således DNA-fragmenter og vektorer som omfatter ett eller flere av de genene bcoC. bcoA/B og bcoD som i y-butyrobetain/krotonobetain-stoffskiftet koder for biosyntese-enzymene for L-carnitin og dessuten eventuelt omfatter det potensielle transportgen bcoT.

Gjenstand for oppfinnelsen er dessuten mikroorganismer som inneholder disse DNA-fragmentene resp. vektorene. En ytterligere oppfinnelsesgjenstand er en bioteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin under anvendelse av mikroorganismene i henhold til oppfinnelsen.

Betegnelsene bcoA/B, bcoC, bcoD og bcoT, som her benyttes i beskrivelsen og kravene, omfatter definisjonsmessig de gener av villtypeorganismer som koder for y-butyrobetain/krotonobetain-L-carnitin-stoffskifte-enzymer med ovennevnte enzym-aktiviteter, særlig genene for butyrobetain-L-carnitin (bco)-operonene, så vel som deres funksjonelt ekvivalente genetiske-varianter og mutanter, dvs. gener som avledes av genene av villtypeorganismer og deres genprodukter og som i deres biologiske funksjon i det vesentlige er uendret. De funksjonelt ekvivalente genetiske varianter og mutanter omfatter således for eksempel baseutskiftning innenfor rammen av den kjente degenerering av den genetiske kode, slik som de f.eks. kan frembringes kunstig for å tilpasse gensekvensen til den foretrukne kodonanvendelse av en bestemt mikroorganisme, hvor det skal foregå en ekspresjon. Variantene og mutantene omfatter dessuten delesjoner, insersjoner og substitusjoner av baser eller kodoner i den utstrekning de lar genproduktene av slike endrede gener i det vesentlige forbli uendret med hensyn til deres biologiske funksjon. Herunder omfattes eksempelvis gensekvenser som oppviser høy grad av homologi med villtype-sekvensene, eksempelvis mer enn 70%, og som under stringente hybridiseringsbetingelser, f.eks. ved temperaturer mellom 50 og 70°C, og ved 0,5 til 1,5 M saltandel, er i stand til hybridisering med komplementet av villtypesekvensen.

Med begrepet transkripsjonsenhet slik som det her benyttes, forstås DNA-sekvenser, hvori gener er anordnet i én transkripsjonsretning og transkriberes under felles transkripsjonskontroll i et gjennomgående transkript, idet DNA-sekvensene ved siden av genene, dessuten har nødvendige genetiske kontrollelementer for genekspresjon, så som promotere og ribosom-bindingsteder.

Oppfinnelsen belyses ytterligere gjennom de etterfølgende figurer. Fig. 1 viser enzymene for y-butyrobetain-, resp. krotonobetain-L-carnitin-stoffskifteveien. Fig. 2 viser restriksjonskartet av et 10,6 kb-DNA-fragment fra Rhizobium/Agrobacterium med bco-operon. Fig. 3 og Fig. 4 viser plasmidet pVK 1011, resp. pAZlOl; piler angir posisjonen og orienteringen av bco-genene og beu-genene (betain-utnyttende gen; EP-A-0 543 344) . Innskudds-andelen av plasmidene er angitt med bred strek. Fig. 5 viser plasmid pCC49 som mulig utgangsmateriale for fremstilling av en recA"-vertsstamme. Fig. 6 viser konstruksjonsskjemaet for plasmidet pVKlOll, pAZlOl; pVKlOOq Og pAZ7. Fig. 7 viser et konstruksjonsskjerna for en recA'-vertsstamme.

Som utgangsmateriale for isoleringen av genene bcoA/B, bcoC, bcoD og bcoT av ybutyrobetain/krotonobetain-L-carnitin-stoffskifteveien kan alle mikroorganismer benyttes som meta-boliserer butyrobetainene og/eller krotonobetainene ifølge Fig. 1. Eksempler på egnede stammer er mikroorganismer av slektene Escherichia, Pseudomonas, A<g>robacterium, Rhizobium og Agrobacterium/ Rhizobium, hvorav sistnevnte foretrekkes. Et eksempel på en foretrukket mikroorganisme av slekten Agrobacterium/ Rhizobium er en mikroorganisme av arten Aqrobacterium/ Rhizobium sp. HK4 (DSM 2938), slik som den allerede er- beskrevet i EP-A-0 158 194. Særlig foretrekkes anvendelse av mikroorganismer som allerede er carnitin-dehydrogenase-negative, og altså for eksempel ikke inneholder noe eller kun et defekt bcoE-gen (i det følgende også betegnet bcpE'). Eksempler på foretrukne carnitin-dehydrogenase-negative mikroorganismer er mikroorganismene av artene Aarobacterium/ Rhizobium sp. HK13 (DSM 2903) og HK1331b

(DSM 3225) som allerede er beskrevet i EP-A-0 158 194 eller artene Agrobacterium/ Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944) som er beskrevet i EP-A 0 543 344.

Genene bcoA/B. bcoC. bcoD og bcoT av y-butyrobetain/- krotonobetain-L-carnitin-stoffskiftet kan lokaliseres i kromosomet til en mikroorganisme, ved at mikroorganismen eksempelvis underkastes en transposon-insersjonsmutagenese og genene av y-butyrobetain/krotonobetain-L-carnitin-stoffskiftet derved markeres med en egnet markør, eksempelvis en kanamycin (Km-)resistens. Deretter kan slike markerte mutanter som ikke lenger kan utnytte mellomproduktene av butyrobetain-stoffskiftet, isoleres. På denne måte kan genene for y-butyrobetain/krotonobetain-L-carnitin-stoffskiftet identifiseres og tilordnes deres funksjon. De markerte genene kan så klones og nærmere karakteriseres med egnede restriksjonsenzymer. Isoleringen av de intakte gener, resp. DNA-fragmentene ifølge oppfinnelsen, kan deretter skje ved å gå ut fra en genbank av en tilsvarende ikke-mutert mikroorganisme, hvorfra bco-genene eller fragmentene av disse på kjent måte kan isoleres og identifiseres gjennom hybridisering med de ovenfor oppnådde klonede gener av den mutageniserte stamme. De oppnådde gener kan deretter klones i de ønskede vektorer og kartlegges ved hjelp av restriksjonsenzymer.

For biosyntesen av L-carnitin er kun genene bcoA/B. bcoC og bcoD ansvarlig. Følgelig fordres kun nærvær av disse gener for fremstillingen av L-carnitin. Avhengig av de valgte utgangsbetingelser, eksempelvis det valgte utgangsmateriale eller den valgte produksjonsstamme, kan DNA-fragmentene og de vektorer som er benyttet ved L-carnitin-produksjonen, inne-holde ett eller flere av genene for L-carnitin-biosyntesen.

Ved siden av genene bcoA/B, bcoC og bcoD. kan DNA-fragmentene og vektorene i henhold til oppfinnelsen om ønskes også omfatte det potensielle transportgen bcoT.

Nærværet av et L-carnityl-dehydrogenase-gen, altså et bcoE-gen, er uønsket idet det ved nærvær av dette inntrer en nedbrytning av L-carnitin. Nærværet av et defekt bcoE-gen ( bcoE') medfører imidlertid ingen skade.

Hensiktsmessig foreligger genene for L-carnitin-biosyntesen, nemlig bcoC. bcoA/B og bcoD, og eventuelt det potensielle transport-gen bcoT, for anvendelse ved fremstillingen av L-carnitin, sammen på et DNA-fragment eller vektormolekyl, og da fortrinnsvis i konvensjonell 5'-3'-retning nedstrøms fra de genregulatoriske elementene i rekke-følgen bcoC, bcoA/B og bcoD, resp, bcoC, bcoA/B, bcoD og bcoT og i én enkelt, som ovenfor definert, transkripsjonsenhet ■ tilsvarende anordningen i det naturlig forekommende butyrobetain-L-carnitin-operon. Genene bcoC, bcoA/B, bcoD og bcoT i en slik transkripsjonsenhet kan eksempelvis karakteriseres gjennom de tilsvarende avsnitt av restriksjonskartet i Fig. 2.

Transkripsjonen, resp. ekspresjonen av bco-genene skjer hensiktsmessig under kontroll av en fortrinnsvis sterk, egnet promoter. Valget av promoter avhenger av de ønskede ekspresjonsbetingelsene, for eksempel av hvorvidt det ønskes en konstitutiv eller indusert ekspresjon, eller av den mikroorganisme som ekspresjonen skal skje i. En egnet promoter er eksempelvis promoteren av det naturlige butyrobetain-L-carnitin-operon. Skjer isoleringen av de bco-gener som er ansvarlig for L-carnitin-biosyntesen eksempelvis fra en mikroorganisme med et defekt bcoE-gen ( bcoE'), kan hele bco-operonen med bcoE'-genet og de tilhørende genregulatoriske elementer med fordel isoleres og klones fra disse mikroorganismene og deretter benyttes til produksjon av L-carnitin i egnede mikroorganismer. En slik transkripsjonsenhet med et mutert bcoE-gen som eksempelvis kan isoleres fra Rhizobium/- A<g>robacterium HK1349, lar seg eventuelt likeledes karakterisere gjennom restriksjonskartet gjengitt i Fig. 2 når defekten i bcoE for eksempel kun kan tilbakeføres til en punktmutasjon og ikke gjelder noe restriksjons-kutte-sted. Andre promotorer egnet for ekspresjon er eksempelvis promotorene P,,., PS1 (M. Labes et al., Gene, 89, 37-46, 1990), trp-promotoren (Amann et al., Gene, 25., 167-178, 1983), lac-promoteren (Amann et al. Gene, 25., 167-178, 1983) og tac-promoteren, et hybrid av de nevnte tro- og lac-promotorer som kan benyttes som konstitutiv eller induserbar promoter (Russell & Bennett, Gene, 20, 231-243, 1982).

For anvendelse ved produksjonen av L-carnitin i en egnet produksjonsstamme, bygges DNA-fragmentene ifølge oppfinnelsen og som omfatter de nevnte bco-genene, fortrinnsvis sammen, inn i én enkelt transkripsjonsenhet, hensiktsmessig ved hjelp av kjent teknikk, i kjente, egnede vektorer, spesielt ekspresjonsvektorer, eksempelvis makrofager eller plasmider. Som vektorer kan det benyttes autonome og selvrepliserende vektorer eller også såkalte integrasjonsvektorer. Med en integrasjonsvektor menes her en vektor, eksempelvis et plasmid, som oppviser i det minste én sekvens som er homolog med resipientstammens genomiske sekvens og som ved homolog rekombinasjon med denne sekvens, tillater en innføring av fremmede gener i resipientstammens genom. Fortrinnsvis benyttes autonome og selvreplikerende vektorer.

Avhengig av arten av de valgte vektorer, kan genene for enzymene for L-carnitin-biosyntesen uttrykkes i forskjellige organismer. Som vektorer er så vel vektorer med spesifikt virkningsspektrum, som vektorer med bredt virkningsspektrum ("broad host range") og de ovenfor beskrevne integrasjonsvektorer egnet.

Som "broad host range"-vektorer kan alle vektorer som er egnet for gramnegative bakterier, benyttes. Eksempler på slike "broad host range"-vektorer er pVKlOO (Knauf & Nester, Plasmid, 8, 45-54, 1982), pME285 (Haas & Itoh, Gene, 36, 27-36, 1985) og pKT240 (Bagdasarian et al., Gene, 26, 273-282, 1983) eller deres derivater. Som derivat av pVKlOO kan eksempelvis pVKlOOl, som derivat av pME285 eksempelvis pAZlO og som derivat av pKT240 eksempelvis pL032 (som allerede beskrevet i EP-A-0 543 344) benyttes.

Som integrasjonsvektorer kan, når det gjelder Rhizobium/ Agrobacterium. vektorer på basis av pACYC184 eller pBR322 (Comai et al., Plasmid, 10, 21-30, 1983) anvendes.

På denne måte oppnås eksempelvis plasmidene pVKlOOq, pVKlOll (Fig. 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl (Fig. 4) og pL041. Plasmid pVKlOOq ble deponert 16.11. 1993 ved Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, i Rhizobium/ Agrobacterium HK1349 under aksesjonsnummeret DSM 8726.

For fremstilling av produksjonsstammene for fermenteringen, dvs. stammene for L-carnitin-produksjonen, må DNA-fragmentene resp. vektorene ifølge oppfinnelsen bringes inn i de ønskede vertsstammer som er egnet for ekspresjon. For dette formål transformeres hensiktsmessig mikroorganismene på vanlig og kjent måte med de vektorer som inneholder DNA-fragmentene ifølge oppfinnelsen. Mikroorganismene kan inne-holde DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen enten i et vektormolekyl eller integrert i deres kromosom.

Som produksjonsstammer er alle de mikroorganismene egnet som er i stand til å produsere L-carnitin fra krotonobetain og/eller y-butyrobetain og hvis evne til nedbrytning (katabolisme) av L-carnitin helt eller delvis er hemmet. Mikroorganismer som er hemmet i deres L-carnitin-katabolisme er eksempelvis stammer som er carnitin-dehydrogenase-negative, dvs. stammer hvor carnitin-dehydrogenase-genet bcoE, f.eks. er kuttet ut gjennom mutasjon eller delesjon, og/eller stammer som er L,D-carnitin-racemase-negative og L-carnitin-dehydratase-negative.

Egnede vertsstammer, fortrinnsvis stammer med høy substrat- og edukt-toleranse, er eksempelvis mikroorganismer av slektene Escherichia. Pseudomonas. Agrobacterium, Rhizobium. Comamonas og Rhizobium/ Agrobacterium, hvorav sistnevnte er å foretrekke. Mikroorganismer av de ovenfor allerede omtalte artene Rhizobium/ Aqrobacterium sp. HK13, HK1331b og HK1349, samt artene HK1349.4 (som beskrevet i EP-A-0 543 344) er særlig foretrukket.

Det ble dessuten fastslått at utbyttet av L-carnitin kunne forbedres ytterligere når vertsstammens evne til rekombinasjon, hvilket vil si dens rekombinasjonstendens og rekombinasjonshyppignet, er nedsatt. Derved begrenses en rekombinasjon med vektoren på grunn av kromosomal homologi. Vertsstammens rekombinasjonsevne kan eksempelvis reduseres på kjent måte ved målrettet mutasjon av dens recA-gen (recA-mutasjon). Av mikroorganismer som har svekket rekombinasjonsevne, er særlig mikroorganismer av artene Rhizobium/- A<g>robacterium sp. foretrukket, for eksempel de stammer av artene Rhizobium/ Agrobacterium HK1349.49, oppnådd ifølge oppfinnelsen som nedenfor beskrevet.

Egnede produksjonsstammer er således eksempelvis mikroorganismer innen artene Rhizobium/ Agrobacterium HK134 9, HK1349.4 og HK1349.49, som hver inneholder plasmid pVKlOOq, pVKlOOl, pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl eller pL041.

Isoleringen av de transformerte vertsstammene {produksjonsstammer) kan foretas fra et selektivt nærings-medium som er tilsatt et antibiotikum som stammene, gjennom et markør-gen som befinner seg på vektoren eller DNA-fragmentet, er resistente mot. Benyttes det som produksjonsstammer mikroorganismer ifølge EP-A-0 543 344, dvs. mikroorganismer som er mutert i deres kromosomale, for betain-utnyttelsen kodende gen, og transformert med et plasmid som inneholder genet som koder for betain-utnyttelsen, kan det også selekteres med henblikk på betain-utnyttelsen. Eksempler på mikroorganismer som lar seg selektere med henblikk på betain-utnyttelsen, er de allerede nevnte HK1349.4 og HK1349.49, som for eksempel inneholder plasmidene pL041, pAZlOl, pAZ7::beu eller pVKlOll.

Den bioteknologiske fremstilling av L-carnitin skjer ved bruk av mikroorganismer som inneholder DNA-fragmentene resp. vektorene ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåten for fremstilling av L-carnitin følger i og for seg kjente fremgangsmåter som f.eks. de beskrevet i EP-A-0 158 194, ved f.eks. å gå ut fra y-butyrobetain i nærvær av en egnet karbon- og nitrogenkilde. Som karbon- og nitrogenkilde kan det eksempelvis benyttes glutamat, acetat og betain eller glycerol og betain. Foretas den bioteknologiske fremstilling ved hjelp av mikroorganismer som lar seg selektere med henblikk på betain-utnyttelsen, benyttes betain som eneste nitrogenkilde.

Fermenteringen og den påfølgende isolering av L-carnitin kan skje analogt med fremgangsmåten beskrevet i EP-A-0 158 194.

Gjennom på vanlig måte å variere næringsstoffene i mediet og tilpasse fermenteringsbetingelsene til den respektive mikroorganisme, kan utbyttet av L-carnitin forbedres ytterligere .

EKSEMPEL 1

Fremstillin<g> av transposon- insersionsmutanter ( Tn5) og deres fenotypiske identifisering

Villtypestammen Rhizobium-Z Agrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B 0 158 194) ble gjennom seleksjonstrykk bragt til utvikling av en spontan resistens mot streptomycin (Sm,

1000 ug/ml). Resistensen som kunne påvises over 50 generasjoner, var stabil uten seleksjon og ble benyttet som seleksj onsmarkør.

0,2 ml av en Tn5-donorkultur av E. coli S17-l/pSUP2021'

(R. Simon et al., Biotechnology, 1983, 1, 784-790) ble blandet med 2 ml av resipientkulturen HK4 og sentrifugert. Cellene ble vasket i 0,9% saltvann (NaCl-løsning) og resuspendert i 100 yl 0,9% saltvann. Konjugasjonen av resipientstammen med donor-stammen skjedde i løpet av natten ved 3 0°C på tørr næringsagar. De høstede cellene ble utplatet i fortynning på seleksjonsmedium for resipient- (Sm<B>) og transposon- (neomycin-resistens (NmR)) .

Tn5-mutanter ble oppnådd på næringsagar med Sm

(1000 ug/ml) og Nm (100 ug/ml). Den fenotypiske identifisering av mutantene ble foretatt gjennom påvisning av at butyrobetain-stoffskifte-mellomproduktene ifølge Fig. 1 ikke ble utnyttet som karbon(C-)kilde i minimalmedium.

EKSEMPEL 2

Kloning av Tn5- merkede DNA- fragmenter av HK4- qenomet

Isolert genomisk DNA av Tn5-mutert HK4 (5 ug) ble oppsluttet fullstendig med EcoRI (4 U/ug). pBR325 {2,5 ug) {Gene, 1977, 2, 95-113) ble etter fullstendig oppslutning med EcoRI behandlet med alkalisk fosfatase. Rekombinante hybridplasmider ble oppnådd etter blanding av genomisk DNA og pBR325 med T4-DNA-ligase (0,2 U (enheter)/ugDNA) i 400 yl ligeringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT (ditiotreitol), 10 mM MgCl2, 0,6 mM ATP) og inkubering over natten ved 12°C.

Alikvoter av ligeringsblandingen ble benyttet til trans-formasjon (Cohen et al., 1972, PNAS, 69, 2110-2114) av E. coli ED 8654 (Barek et al., Mol. Gen. Genet., 146, 199-207, 1976). Transformanter ble selektert i næringsmediet på deres resistens mot ampicillin {Ap, 100 yg/ml) og kanamycin {Km, 25 yg/ml). Alle selekterte hybridplasmidene bar et HK4-innskudd som var markert med Tn5. Innskuddene ble kartlagt for forskjellige restriksjonsenzymer i henhold til restriksjonskartet i Fig. 2. Sammenligning av restriksjonskartene be-kreftet transposon-insersjonen i det samme genomiske' fragment i en rekke Tn5-mutanter av forskjellig fenotype.

Bekreftelse av denne observasjon ble oppnådd gjennom Southern blott-hybridisering {"Gentechnische Methoden", utgitt av S. Bertram & H.G. Gassen, G. Fischer Verlag 1991, 219f.) av identisk kuttet plasmid-DNA og påfølgende elektroforetisk separasjon. Som prober tjente subfragmenter av dette klonede DNA fra transposon-mutanter.

EKSEMPEL 3

Opprettelse av en genomisk HK4- genbank i lambda- fag

For å kunne pakke DNA i lambda-fag må det ha en størrelse på 40-52 kb og et "cos-sete". For å opprette en genomisk HK4-.genbank i lambda-fag ble cosmidvektoren pVKlOO (Knauf & Nester, 1982, Plasmid, 8., 45-54) benyttet. Denne er 23 kb stor og tillater således kloning av DNA-fragmenter mellom 17 og 29 kb.

pVKlOO ble oppsluttet med EcoRI. defosforylert og ligert med HK4-DNA som var partielt kuttet med EcoRI. Den ideelle EcoRI-konsentrasjon for partialoppslutningen av HK4-DNA ble fastslått gjennom testoppslutninger som 0,58 U/ug DNA, resp. 0,02 U/ul reaksjonsblanding, idet 8,5 ug HK4-DNA ble anvendt i reaksjonsblandingen. DNA-fragmentene i størrelsesområdet fra større enn 17 kb ble isolert fra agarose-elektroforesegel. Ligeringen skjedde i 10 yl volumer med et innhold på 100 ng cosmidvektor og 400 ng "passenger-DNA". Deretter ble det i en

blanding fra Fa. Promega Biotec. foretatt "In vitro-Packaging" i løpet av 2 timer ved 25°C i henhold til produsentens instruksjoner. Etter transfeksjon av E. coli S17-1 ble det foretatt seleksjon basert på cosmidvektorens Km-resistens. Ca. 5500 kolonier (individuelle kloner) ble oppnådd med en ansats. Genbank-koloniene ble oppbevart i 5 satser, hver på ca. 1000 kloner, i frysemedium (Nutrient Yeast Broth, NYB, Oxoid og 50% glycerol) ved -70°C. Amplifiseringen av genbanken ble foretatt med 50 yl fra hver av disse satser i 10 ml NYB-overnattkultur og porsjonering.

EKSEMPEL 4

Screening av HK4- cosmid- genbanken. identifisering av bco- gen-bærende cosmidkloner g- jennom kolonihvbridisering, Dot- blot-hvbridiserin<g> eller direkte komolementerin<g> på HK- mutanter

Som hybridiseringsprober kunne de klonede Tn5-merkede DNA-fragmentene benyttes direkte.

Kloner med tilsvarende DNA-sekvenser oppviste hybridiseringssignaler og førte til komplementering av de respektive defekte gener i HK4-mutantene. Krysshybridiseringer av DNA fra forskjellige mutanter tydet på "clustering" av flere gener av butyrobetain-stoffskiftet på et 10,6 kb DNA-fragment (Fig. 2).

Kolonihybridiseringen ble foretatt på vanlig måte (S. Bertram & H.G. Gassen, 1991, ibid, 221f.). Dot-blotting ble likeledes foretatt på kjent måte (S. Bertram & H.G Gassen, 1991, ibid. 217f.).

EKSEMPEL 5

Komplementering av HK- mutanter

Etter nøyaktig lokalisering av de enkelte gener for butyrobetain-stoffskiftet under hensyntagen til de molekylære størrelser basert på de identifiserte peptidkjeder, kunne det oppnås en komplementering av de enkelte mutanter gjennom de respektive gen-avsnitt.

Det respektive ekspresjonsplasmid pVKl00::HK-DNA ble innført via konjugering av E. coli S17-1 i Rhizobium/- A<g>robacterium sp. HK4-stammer ifølge Eksempel 1, som oppviser mutasjoner for ulike stoffskifte-trinn (se Fig. 1). Seleksjon ble foretatt mot donorens prolin ( pro)-auxotrofi og vektorens antibiotikaresistens (Km<R>Tc (Tetracyclin)H) .

EKSEMPEL 6

6. 1 Kloning av bco- fragmentet fra stamme HK13- 49 ( DSM 3944) og etterkommere

For å oppnå gendose-effekter og produktivitetsøkninger i produksjonsstammen, ble bco-operonet fra HK1349 (DSM 3944, EP-A-0 543 344) klonet. I denne stamme inngår hele det komplette bco-operon, men det første gen, bcoE, er imidlertid mutert for carnitin-CoA-dehydrogenasen. Et DNA-fragment med bco-operonet oppnådd fra denne stamme, er således ideell for produktivitetsøkning på grunn av ekspresjonsvektorens høye kopitall.

Kloningene foregikk på kjent måte i E. coli S17-1, tilsvarende Eksempel 3 i EP-A-0 543 344. For dette formål ble det 10,6 kb store bco-operon fra en HK1349-genbank isolert og ligert i pVKlOO. Dette resulterte i plasmid pVKlOOq (se konstruksjonsskjema ifølge Fig. 6). I E. coli S17-1 ble det selektert på NYB Km (25 ug/ml). Identifiseringen av det riktige innskudd lykkedes på HK-mutanter ifølge fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 5. EcoRI-kuttet DNA fra HK 1349 ble separert elektroforetisk, og fragmentene i størrelsesområdet fra 10,6 kb ble isolert fra gelen. De isolerte fragmentene ble ligert i EcoRI-kuttede pVKlOO. Med denne hybridplasmid-blandingen ble E. coli S17-1 (prolin-auxotrof) transformert og selektert på næringsagar Km (25 ug/ml). Identifiseringen av den riktige hybridplasmid-klon fra vektor og fra det bco-operon-bærende 10,6 kb DNA-fragment skjedde via "patch-mating" på en plen av en butyrobetain-CoA-syntetase-negativ mutant (HK4V4) på minimalmedium med 0,2% (vekt/vol.) butyrobetain som C- og N-kilde. Den riktige klon var etter en slik konjugativ overføring i mutantene, i stand til å komplementere utnyttelsen av denne C-kilde. Den således identifiserte klon pVKlOOq, tjente direkte som produksjonsplasmid eller som reservoar for DNA-fragmentet med bco-operonet for videre subkloninger.

6. 2 Konstruksjon av <p>AZlOl. pAZ7. pVKlOll og pVKlOOq. <p>L041 og pAZ7::beu

Konstruksjonen av pAZlOl, pAZ7, pVKlOll og pVKlOOq ble foretatt ifølge konstruksjonsskjemaet i Fig. 6. Konstruksjonen av pL041 ble foretatt ved å gå ut fra pL032 (EP-A-0 543 344) ved insersjon av bco-genene (10,6 kb stort EcoRI/ EcoRI-fragment) og konstruksjonene av plasmid pAZ7::beu ved å gå ut fra pAZ7 (Fig. 6) ved insersjon av beu-genene (3 kb stort Pstl/PstI-fragment, EP-A-0 543 344). De tilsvarende restriksjonsenzymer ble benyttet med 3-5 U/ug DNA etter produsentens anvisninger. Plasmid pVKlOOq ble oppnådd ved insersjon av bco-genene i pVKlOO (Knauf & Nester; ibid). Utgangsplasmidet pVKlOOsl (Konstruksjonsskjema Fig. 6) ble oppnådd ved EcoRI-delesjonskloning av plasmid pVKlOOs (EP-A-0 543 344).

EKSEMPEL 7

Innføring av en recA- mutasnon i HK134 9. 4

7. 1 Identifikasion av genbank- klonen som koder for recA

Ved hjelp av kolonihybridiseringsmetoden (S. Bertram & H.G. Gassen, 1991, ibid, 221f.) ble den genomiske HK4 cosmid-genbank undersøkt på recA-kodende kloner. Som probe for hybridiseringen ble det klonede recA-gen fra Rhizobium leguminosarum (W. Selbitschka et al., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95) benyttet. Den merkede cosmidklon ble isolert, og EcoRI-DNA-innskuddsfragmentene oppnådd etter EcoRI-kutting, ble undersøkt med henblikk på recA-homologe sekvenser ved hjelp av Southern blott-hybridisering mot recA-proben (S. Bertram & H.G. Gassen, 1991, ibid, 219f.). Det således merkede EcoRI-fragment ble ligert inn i den tilsvarende kuttede vektor pVKlOO. Med det resulterende hybridplasmid pVKlOOrl, ble E. coli S17-l-celler transformert for DNA-replikasjon.

7. 2. Innføring av et kanamycin- resistens- gen i HK134 9. 4 for' inaktivering av det kromosomale recA- gen

Det 11,0 kb store EcoRI-fragment ble omklonet fra pVKlOOrl i pACYC184 (A.C.Y. Chang & S.N. Cohen, J. Bacteriol. 134. 1978, 1141-1156) som var kuttet med EcoRI.

I henhold til det fastlagte restriksjonskart, ble et BgllI-Nrul-kuttet 3,1 kb stort subfragment som ved Southern blott-hybridisering var merket mot recA-proben, klonet inn i vektoren pWS233, som var kuttet med BamHI- Hindlll. pWS233 er en "gene replacement"-vektor beskrevet av W. Selbitschka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38., 1993, 615-618.

I Xhol-snittstedet for det resulterende plasmid pCC45, ble det klonet inn et Xhol-DNA-fragment fra Tn5 (pSUP2021, R. Simon et al., Biotechnology, 1, 1983, ibid) som koder for Km-resistens. Resultatet av dette var pCC49. Analogt med fremgangsmåten til W. Selbitschka et al., 1993, ibid, ble det foretatt en "gene replacement" på følgende måte:

3 ml eksponensiell HK1349.4-kultur ble slått sammen med

1 ml eksponensiell donorkultur (S17-l/pCC49), sentrifugert og vasket med 0,9% NaCl-løsning. Cellene ble inkubert over natten ved 30°C i 50 yl NYB på næringsagar. Deretter ble cellene som var resuspendert i 0,9% NaCl-løsning i hensiktsmessig fortynning overført til selektive medier. Transkonjuganter av den Sm-resistente resipient HK1349.4 ble oppnådd på næringsagar med Sm (1000 <y>g/ml) og Nm (150 yg/ml) og oppviste følsomhet overfor 5% sakkarose i kompleksmediet i overensstemmelse med genene sacRB på "replacement"-vektoren.

Det ble med lav frekvens (10"<B>) oppnådd dobbelte rekombinasjoner etter dyrkning av de selekterte transkonjuganter uten seleksjonstrykk på næringsagar. Etter ca. 1 uke kunne det isoleres celler som tålte 5% sakkarose i mediet, var blitt Nm-resistente, men som igjen var blitt gentamycin (Gm)-sensitive (vektormarkør).

Denne fenotype bekrefter den allele markør-utskiftning og tyder på en recA-mutasjon i HK1349.4..Den typiske fenotype (f.eks. UV-følsomhet, etc.) av recA-mutanter kan registreres.

I stammen HK1349.49 som er oppnådd på denne måte, er tendensen til kromosomal integrasjon av plasmider med homologe sekvenser (homolog rekombinasjon) tydelig nedsatt. Stammen er derfor en velegnet vert for hybridplasmidene fremstillet i Eksempel 6.2.

EKSEMPEL 8

Biotransformasion

Biotransformasjonen ble foretatt i ristekolber (100 ml) med N-fritt minimalmedium (MM; Kulla et al., Arch. Microbiol., 1983, 135, s. 1-7), inneholdende 0,2% (vekt/vol.) y-butyrobetain (Edukt) og som C-kilde 0,4% (vekt/vol.) glycerol. Som N- og ytterligere C-kilde ble det tilsatt 0,2% (vekt/vol.) L— glutamat (ved stammer som var negative med hensyn til betain-utnyttelse) eller 0,2% (vekt/vol.) betain.

Som produksjonsstammer ble stammene HK1349.4/pL041, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/pAZ101, HK1349/pVK100q og HK134 9/pAZ7 ifølge oppfinnelsen, benyttet.

Resultatene er sammenfattet i Tabell 1 og sammenlignet med tilsvarende fra de fra EP-A-0 543 344 kjente HK13-etterkommerne HK1349 (DSM 3 944) og HK134 9.4.

Dannelsen av L-carnitin fra y-butyrobetain ble bestemt etter DTNB- (5,5'-ditiobis{2-nitrobenzoat)metoden beskrevet av Bergmeyer (H.K. Bergmeyer, 1974, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, 1810f.).

Claims (16)

1. Isolert DNA-fragment som omfatter ett eller flere av genene bcoC, bcoA/B og bcoD for L-carnitin-biosyntesen, som koder for et y-butyrobetain-CoA-dehydrogenase (bcoC), et y-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetase ( bcoA/B), eller et krotonobetain-CoA-hydrolase ( bcoD), hvor DNA-fragmentet er valgt a) fra et 10,6 kb-EcoRI-fragment som innskutt i plasmid pVKlOOq, anbragt i Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 under aksesjonsnummer DSM 8726, eller subfragmenter derav; og b) fra fragmenter som hybridiserer med dette 10,6 kb-EcoRI-fragment eller subfragmenter derav, og koder for enzymer med virkningene av en y-butyrobetain-CoA-dehydrogenase, en y-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetase og/eller et krotonobetain-CoA-hydrolase.

2. DNA-fragment ifølge krav 1, som ytterligere omfatter genet bcoT som er tilordnet y-butyrobetain/krotonobetain-stoffskiftet og koder for et potensielt transportprotein.

3. DNA-fragment ifølge krav 1 eller 2, hvor genene bcoC, bcoA/B og bcoD og eventuelt bcoT skriver seg fra mikroorganismer av slektene Escherichia. Pseudomonas, A<g>robacterium, Rhizobium og Rhizobium/ Agrobacterium.

4. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor genene operativt er forbundet med genetiske kontrollelementer som er nødvendige for ekspresjonen.

5. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor genene for L-carnitin-biosyntesen er anordnet i rekke-følgen bcoC, bcoA/B og bcoD eller, eventuelt, bcoC. bcoA/B, bcoD og bcoT og foreligger som en enkelt transkripsjonsenhet.

6. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 4 og 5, hvor det genregulatoriske element omfatter promoteren for det naturlige bco-operon, P^.

7. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor genene bcoC. bcoA/B, bcoD og bcoT karakteriseres gjennom det følgende restriksjonskart:

8. Vektor, inneholdende et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Vektor ifølge krav 8, nemlig plasmid pVKlOOq, som anbragt i Rhizobium/ Agrobacterium HK 1349 under aksesjonsnummer DSM 8726, plasmid pVKlOll som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 3, og plasmid pAZlOl, som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 4.

10. Rekombinant mikroorganisme inneholdende et DNA-fragment eller en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9.

11. Mikroorganisme ifølge krav 10, karakterisert ved at dens evne til katabolisering av L-carnitin helt eller delvis er hemmet.

12. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst av kravene 10 ogll,karakterisert ved. at dens evne til rekombinasjon er svekket.

13. Mikroorganisme ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 12 valgt fra mikroorganismer av slektene Escherichia, Pseudomonas. A<q>robacterium. Rhizobium. Comamonas og Rhizobium/ Agrobacterium.

14. Mikroorganisme Rhizobium/ Agrobacterium HK 1349, inneholdende plasmid pVKlOOq, som deponert under aksesjonsnummer DSM 8726, plasmid pVKlOll som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 3, eller plasmid pAZlOl, som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 4, samt genetiske varianter og mutanter avledet av slike mikroorganismer og som har evne til L-carnitin-biosyntese.

15. Mikroorganisme Rhizobium/ Agrobacterium HK 1349.4, inneholdende plasmid pVKlOOq, som deponert i Rhizobium/- Agrobacterium HK 1349 under aksesjonsnummer DSM 8726, plasmid pVKlOll som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 3, eller plasmid pAZlOl, som karakterisert ved restriksjonskartet ifølge Fig. 4, samt av genetiske varianter og mutanter avledet fra slike mikroorganismer og som har evne til L-carnitin-biosyntese.

16. Bioteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin karakterisert ved at krotonobetain og/eller y-butyrobetain fermenteres i nærvær av en egnet karbon- og nitrogenkilde ved hjelp av en mikroorganisme ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 15, hvoretter L-carnitinet isoleres.