ES2237954T3 - Coenzima util para la sintesis de l-carnitina. - Google Patents
Coenzima util para la sintesis de l-carnitina.Info
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Abstract
Crotonobetainil-coenzima A, caracterizada por las siguientes propiedades: a) Masa molar 893, 6 b) Absorción máxima 208, 0 y 260nm c) Coeficiente de extinción molar{å260} 20, 21 mmol- 1cm-1 d) Valor de Km de la L(-)-carnitina hidratasa 8.10-6 para la crotonobetainil-coenzima A e) Estabilidad de la temperatura varias semanas a ¿20ºC una hora a 0ºC f) Estabilidad del pH buena durante una semana a pH de 2 a 10 estable durante varias semanas a pH 5 g) Solubilidad buena en agua muy pobre en disolventes orgánicos h) Otras características higroscópica
Description
Coenzima útil para la síntesis de
L-carnitina.
La invención descrita en este documento se
refiere a una coenzima útil para la síntesis de
L-carnitina, en particular a un compuesto de
coenzima A, y más en particular a la
crotonobetainil-coenzima A, a procedimientos para su
preparación y a su uso para la producción de
L(-)-carnitina a partir de crotonobetaína y
D(-)-carnitina.
Hasta la fecha no tenemos conocimiento de
coenzimas aisladas que sean útiles para la síntesis de
L-carnitina, y en particular la
crotonobetainil-coenzima A no es una sustancia
aislada.
El documento WO95/10.613 postula la
crotonobetainil-coenzima A y la
gamma-butirobetainil-coenzima A como
productos intermedios en el metabolismo de la
gamma-butirobetaína o la crotonobetaína a
L(-)-carnitina en la célula. Se muestra
esquemáticamente una síntesis metabólica de
crotonobetainil-coenzima A que parte de
gamma-butirobetaína por la
gamma-butirobetainil-coenzima A o
directamente a partir de la crotonobetaína y una síntesis metabólica
de gamma-butirobetainil-coenzima A
que parte de gamma-butirobetaína. Además en el curso
del metabolismo, la
gamma-butirobetainil-coenzima A y la
crotonobetainil-coenzima A, respectivamente, se
degradan por la
L(-)-carnitil-coenzima A dando como
resultado L(-)-carnitina o por la
L(-)-carnitil-coenzima A y
deshidrocarnitil-coenzima A dando como resultado
betaína. Sin embargo, este documento no enseña cómo obtener
crotonobetainil-coenzima A o
gamma-butirobetainil-coenzima A ya
que está dirigido a la preparación de L(-)-carnitina
usando microorganismos que tienen un gen que codifica una enzima que
degrada de nuevo tanto la crotonobetainil-coenzima A
como la
gamma-butirobetainil-coenzima A, no
siendo posible, por consiguiente, obtener
crotonobetainil-coenzima A y
gamma-butirobetainil-coenzima A como
sustancia siguiendo la enseñanza de este documento.
Si se comprueban las capacidades de estos
compuestos para usarse en el procedimiento de producción de la
L(-)-carnitina, deberían tomarse en consideración la
técnica conocida y el conocimiento relacionado con el procedimiento
de producción de la L(-)-carnitina. Se conocen
numerosos procedimientos químicos y bioquímicos o biotecnológicos
para obtener la L(-)-carnitina. La mayoría de los
procedimientos de síntesis química producen
D,L-carnitina como resultado, por reacción de la
mezcla racémica con ácidos de separación activos ópticamente, por
ejemplo con isómeros ópticos del ácido tartárico, ácido canfórico o
ácido canforsulfónico, y es posible obtener por cristalización
fraccionada posterior el enantiómero L-carnitina
(por ejemplo, las patentes concedidas DD23.217; DD93.347; y la
solicitud publicada en el documento DE2.997.672). Hasta la fecha
todos los procedimientos de síntesis presentan el inconveniente de
que la D(+)-carnitina resulta como un producto de
desecho y debería eliminarse y que sólo se obtiene un máximo del 50%
de producto sintetizado como L(-)-carnitina. El uso
terapéutico de la D, L-carnitina no es sustituible,
en el sentido de que la D(+)-carnitina no es
sustituible, ya que la D(+)-carnitina no sólo es
inefectiva con respecto a la oxidación de ácidos grasos, sino que
también es más competitiva como una sustancia que inhibe los
diversos sistemas de transporte y enzimas específicas de la
L(-)-carnitina (Life Sciences 28 [191]
2.931-2.938). Por esta razón, se han desarrollado
procedimientos en los últimos años para la síntesis
estereoespecífica de etapas aquirales iniciales (por ejemplo,
Tetrahedron, [1992], Vol. 48, 319-324).
Las alternativas a la síntesis química de la
L(-)-carnitina son los procedimientos
microbiológicos o enzimáticos. En este sentido se demuestra que es
posible aprovechar la reacción inversa de la
L(-)-carnitina deshidrogenasa (documento
EC1.1.1.108) para producir L(-)-carnitina a partir
de la 3-dihidrocarnitina (patente de EE.UU.
4.221.869). La preparación de equivalentes de reducción, siendo una
enzima NADH dependiente, debería estar garantizada. La
3-dihidrocarnitina, además, es muy inestable.
Diversas cepas de Enterobacteriaceae son capaces de
transformar la L(-)-carnitina en
gamma-butirobetaína por la crotonobetaína en
condiciones anaerobias (patentes concedidas DD221.905, JP6.167.494,
JP61.234.794, JP61.234.788). La metabolización de la
L(-)-carnitina a crotonobetaína es reversible y está
catalizada por una enzima estereoespecífica,
L(-)-carnitina deshidratasa (patentes concedidas
DD281.735, DD281.919). De esta forma, la crotonobetaína puede usarse
como el complemento final aquiral de la síntesis de la
L(-)-carnitina. Una serie de cepas de Proteus
pueden formar también L(-)-carnitina a partir de
crotonobetaína en condiciones aerobias (patente de EE.UU.
5.300.430). Para la síntesis enzimática de la
L(-)-carnitina a partir del producto de desecho
D(+)-carnitina, se ha descrito una racemasa (patente
concedida DD300.181). Una tercera posibilidad consiste en obtener
L(-)-carnitina a partir de
gamma-butirobetaína por la
gamma-butirobetaín hidroxilasa (documento
EC/1.14.11.1) (solicitud publicada DE3.123.975). En las patentes
EP158.194, EP195.944 y JP61.199.793 se describen los procedimientos
basados en la producción de L(-)-carnitina a partir
de crotonobetaína o gamma-butirobetaína cultivando
microorganismos seleccionados en una fuente suplementaria de C, por
ejemplo glicinobetaína, en presencia de crotonobetaína o
gamma-butirobetaína.
La L(-)-carnitina deshidratasa
(documento EC4.2.1.89) cataliza la transformación reversible de
crotonobetaína a L(-)-carnitina sólo en presencia de
un factor F de bajo peso molecular aislado de Escherichia
coli y todavía no identificado (patente concedida DD281.735). A
partir de la inmovilización de una L(-)-carnitina
deshidratasa aislada de la familia Enterobacteriaceae se ha
desarrollado un procedimiento para la síntesis de
L(-)-carnitina sin la formación de productos
secundarios (documento DD281.910). El anteriormente citado factor F
de bajo peso molecular es igualmente indispensable para la
racemización de D(+)- a L(-)-carnitina. La reducción
de crotonobetaína a gamma-butirobetaína también se
produce sólo en presencia de este factor.
La L(-)-carnitina
(3-hidroxi-4-trimetilaminobutirato)
es un compuesto ubicuo que se produce naturalmente. Es de
importancia fundamental como vehículo de grupos acilo para el
transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana
interna mitocondrial. Como resultado de su papel central en el
metabolismo de organismos superiores, se usa la
L(-)-carnitina en la terapia y profilaxis de
pacientes con diversas enfermedades de corazón así como en el
tratamiento de pacientes en diálisis (véase: Pathology 17, [1985],
116-169). El suplemento con
L(-)-carnitina es indispensable en la nutrición
parenteral de neonatos en el periodo postnatal y también en adultos
durante periodos más largos (Gürtler and Löster, Carnitin [1996],
21-30). La L(-)-carnitina es un
suplemento dietético de cada vez mayor importancia.
Los procedimientos microbiológicos usados para la
síntesis de L(-)-carnitina presentan el
inconveniente de que los microorganismos, debido a su número muy
limitado, pueden separarse mal de su medio de cultivo y pueden
hacerse nuevos medios de nutrientes adecuados continuamente para el
cultivo. El resultado es que debe hacerse un esfuerzo considerable
para regenerar la L(-)-carnitina evaporada que
contiene el líquido de cultivo. En la síntesis de
L(-)-carnitina a partir de crotonobetaína en
sistemas microbiológicos hay la posibilidad de transformar
crotonobetaína a gamma-butirobetaína por la
crotonobetaína reductasa como una reacción que compite con la
reacción de síntesis.
De no menos importancia es el problema de usar
microorganismos para la producción de sustancias para uso
farmacéutico. A veces, los microorganismos usados proceden de cepas
patógenas, o están muy manipuladas por ingeniería genética y
contienen genes extraños, que es un aspecto al que las Autoridades
Reguladoras dedican mucha atención.
El procedimiento para la síntesis enzimática de
L(-)-carnitina a partir de crotonobetaína presenta
el inconveniente de que una solución obtenida a partir de E.
Coli y que carece de proteínas, por inmovilizado de la
L(-)-carnitina deshidratasa, debe contener no sólo
crotonobetaína, sino también un factor F no identificado, que es
esencial para la activación de la enzima. No pueden excluirse las
influencias que perturban el factor F producidas por componentes de
la solución de proteína libre. La síntesis enzimática de la
L(-)-carnitina puede optimizarse sólo hasta un punto
límite, en particular en vista de que la cantidad de factor F usada
no puede cuantificarse exactamente. El mismo factor F es de
importancia fundamental para la racemización de D(+)- a
L(-)-carnitina descrito en E. Coli. El factor
F no puede reemplazarse por coenzimas conocidas o cofactores de
enzimas (Jung y col., Biochim. Biophys. Acta 1.003 [1989]
270-276).
La causa de los inconvenientes mencionados
consiste en nuestro escaso conocimiento de la estructura del factor
F y su papel en la activación de la apoenzima de la
L(-)-carnitina deshidratasa. No se conocen otros
compuestos que puedieran estimular la activación de la apoenzima de
la L(-)-carnitina deshidratasa de la misma
manera.
El propósito de la invención descrita en este
documento es hacer la síntesis estereoespecífica de la
L(-)-carnitina a partir de crotonobetaína en un
medio acelular posible enzimáticamente así como la racemización del
producto de desecho D(+)-carnitina a
L(-)-carnitina. Estas reacciones catalizadas
enzimáticamente representan una alternativa a la síntesis química
pura de la L(-)-carnitina o al uso de los
procedimientos microbiológicos para obtener la
L(-)-carnitina.
El propósito de la invención según el presente
documento es cómo realizar la síntesis enzimática de la
L(-)-carnitina a partir de la crotonobetaína con la
croronobetainil-coenzima A y la
L(-)-carnitina deshidratasa sin la formación de
productos secundarios. Es también posible realizar la transformación
del producto de desecho inefectivo fisiológicamente
D(+)-carnitina a L(-)-carnitina
usando el sistema de la racemización de la carnitina junto con la
crotonobetainil-coenzima A.
El objeto de la invención es un compuesto de
coenzima A, denominado en lo sucesivo
crotonobetainil-coenzima A, que es capaz de activar
la L(-)-carnitina deshidratasa como un cofactor, de
manera que tenga lugar una transformación reversible de la
crotonobetaína a L(-)-carnitina. El cofactor es
también estrictamente necesario para la racemización de D(+)- a
L(-)-carnitina así como para la transformación de la
crotonobetaína a gamma-butirobetaína. El objeto de
la invención descrita en este documento es un procedimiento para la
síntesis y el uso de crotonobetainil-coenzima A así
como la coenzima en sí.
El uso de la L(-)-carnitina
deshidratasa en combinación con
crotonobetainil-coenzima A, ofrece una nueva
posibilidad de síntesis de la L(-)-carnitina a
partir de crotonobetaína. De la inmovilización simultánea de la
L(-)-carnitina deshidratasa y la
crotonobetainil-coenzima A, se desarrolla una
alternativa a los procedimientos industriales conocidos determinados
para la producción de L(-)-carnitina. De modo
similar, el sistema de racemización se usa junto con la
crotonobetainil-coenzima A, como un procedimiento
para la síntesis de L(-)-carnitina a partir de
D(+)-carnitina.
Según la invención descrita en este documento, es
posible sintetizar L(-)-carnitina a partir de
crotonobetaína por medio de la L(-)-carnitina
deshidratasa (documento EC4.2.1.89). Para la activación de la
apoenzima de la L(-)-carnitina deshidratasa son
necesarias sólo cantidades catalíticas de
crotonobetainil-coenzima A.
La condición para la síntesis de
crotonobetainil-coenzima A es que se active la
crotonobetaína.
El clorhidrato de crotonobetaína seco se usa
preferentemente como el producto final. El clorhidrato de
crotonobetaína reacciona con tricloruro de fósforo a
15-70ºC (preferentemente a 25ºC) en una atmósfera de
oxígeno. El cloruro de crotonobetainilo formado se separa de los
demás productos y sustancias finales por burbujeo con nitrógeno.
Además, el cloruro de crotonobetainilo así
obtenido es adecuado para la síntesis de
crotonobetainil-coenzima A. La coenzima A es primero
suspendida en una mezcla helada de bicarbonato sódico 1M a pH
7,5-9,5 (preferentemente pH 8,5). A esto se le añade
una cantidad definida de cloruro de crotonobetainilo
(preferentemente superior) manteniendo los valores de pH bajo
control. La reacción se completa tras 15-30 minutos.
La formación de la crotonobetainil-coenzima A se
controla por HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución)
(columna Spherisorb C_{18}) y finalmente es sometida a una etapa
de purificación más (cromatografía de intercambio iónico en DOWEX
50). La pureza se comprueba de nuevo por HPLC (columna Spherisorb
C_{18}). Las propiedades fisicoquímicas se determinaron en el
producto lavado (véase la tabla siguiente).
Para la prueba de la activación de la
L(-)-carnitina deshidratasa según la invención se
suministra crotonobetainil-coenzima A purificada
(preferentemente 1-10 nmol) en un tampón de fosfato
potásico (10mM pH7,5), que se añade con
L(-)-carnitina deshidratasa concentrada en parte
(sin que el factor F muestre ninguna actividad) y la solución de
crotonobetaína (1M) para metabolizarse e incubarse a 37ºC.
La L(-)-carnitina formada se
probó posteriormente con una prueba óptica con la ayuda de carnitina
acetiltransferasa (según BERGMEYER (1970)). Se adoptó un
procedimiento similar en la prueba de la reacción de racemización,
en la que una solución de D(+)-carnitina (1M) se
añadió en el lugar de la crotonobetaína. La
L(-)-carnitina formada se puede determinar
exactamente por la prueba anterior del sistema con soluciones
conocidas de L(-)-carnitina.
Para probar la activación del sistema enzimático
según la invención descrita en este documento, que transforma
crotonobetaína a gamma-butirobetaína, se suministró
crotonobetainil-coenzima A purificada
(preferentemente 1-10nmol) en un tampón de fosfato
potásico templado (preferentemente 37ºC) y se burbujeó con nitrógeno
(50mM, a pH7,8), y se añadió el sistema de reducción enzimática de
crotonobetaína (sin que el factor F muestre ninguna actividad) así
como ditionito (preferentemente 50 mM) y
bencil-viologen (preferentemente 1mM). Tras la
adición de la solución de crotonobetaína (3,75M) a metabolizar la
gamma-butirobetaína formada se pudo probar usando la
prueba óptica basada en el bencil-viologen
oxidado.
Formación de L(-)-carnitina a
partir de crotonobetaína por medio de L(-)-carnitina
deshidratasa concentrada y crotonobetainil-coenzima
A (CB-CoA) tras 10 minutos de incubación a 37ºC en
un tampón de fosfato potásico (10mM, pH 7,5).
Formación de L(-)-carnitina a
partir de D(+)-carnitina por el sistema de
racemización de carnitina y crotonobetainil-coenzima
A (CB-CoA) tras 10 minutos de incubación a 37ºC en
un tampón de fosfato potásico (10mM, pH 7,5).
Claims (6)
1. Crotonobetainil-coenzima A,
caracterizada por las siguientes propiedades:
2. Procedimiento para la preparación de
crotonobetainil-coenzima A según la reivindicación 1
a partir de clorhidrato de crotonobetaína y coenzima A,
caracterizado porque el clorhidrato de crotonobetaína se hace
reaccionar con tricloruro de fósforo para dar cloruro de
crotonobetainilo, que se transforma posteriormente con coenzima
A.
3. Uso de
crotonobetainil-coenzima A según la reivindicación 1
para la activación de L(-)-carnitina deshidratasa,
caracterizado porque los dos compuestos están en contacto uno
con el otro.
4. Uso de
crotonobetainil-coenzima A según la reivindicación 1
para la preparación de L(-)-carnitina,
caracterizado porque la
crotonobetainil-coenzima A y la
L(-)-carnitina deshidratasa están en contacto una
con la otra, y después se añade crotonobetaína.
5. Uso de
crotonobetainil-coenzima A según la reivindicación 1
para la preparación de L(-)-carnitina,
caracterizado porque la
crotonobetainil-coenzima A y el sistema de
racemización de la carnitina se ponen en contacto uno con el otro, y
entonces se añade D(+)-carnitina.
6. Uso de
crotonobetainil-coenzima A según la reivindicación 1
para la preparación de gamma-butirobetaína,
caracterizado porque la
crotonobetainil-coenzima A y el sistema de reducción
de la crotonobetaína enzimático se ponen en contacto un con el otro,
y se añade crotonobetaína.
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