FI118568B - Butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiiniaineenvaihduntaan liittyviä geenejä ja niiden käyttö L-karnitiinin mikrobiologiseen valmistukseen - Google Patents

Description

118568

Butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiiniaineenvaihdun-taan liittyviä geenejä ja niiden käyttö L-karnitiinin mikrobiologiseen valmistukseen 5 Tämä keksintö koskee yhdistelmägeenimateriaalia butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiiniaineenvaihdun-tageenien ilmentämiseksi, tätä yhdistelmägeenimateriaalia sisältäviä mikro-organismeja ja mainitunlaisten mikro-organismien käyttöä bioteknisessä menetelmässä L-karnitiinin 10 valmistamiseksi.

L-karnitiini on vitamiinin kaltainen luonnonaine, jolla on suuri merkitys ihmisen aineenvaihdunnassa. L-karnitiini on välttämätön rasvahappojen hyödyntämisessä mi-tokondrion kalvon välittäjäaineena ja siten metabolisen 15 energian kuljettajana. Jos organismi syntetisoi riittämättömästi L-karnitiinia, on sitä pakko antaa ravinnon mukana puutosilmiöiden välttämiseksi. Erityisesti pienten, omaan L-karnitiinibiosynteesiin vielä kykenemättömien lasten ravitsemuksessa on L-karnitiini välttämätön ravintoaine.

20 L-karnitiinivalmisteita käytetään farmaseuttisten tuotteiden aktiivisena aineosana. L-karnitiini täydennys on tarpeen karnitiinin puutoksen ja muiden hoitoindikaatioi-den, erityisesti sydäsairauksien jne., yhteydessä.

• · : ** Kehittyneemmissä eliöissä tapahtuva L-karnitiinin ·· · • 1.· 25 biosynteesi on tunnettua; muut toiminnot aineenvaihdunnas- • # ·.· : sa ja niiden merkitys sille ovat tiiviin tutkimustyön koh- *:**: teinä. Erityisesti suvun Pseudomonas mikro-organismien yh- :teydessä kuvatun aineenvaihduntatien [gamma-butyrobetaii-• · · ni-hydroksylaasikatalyysi, Lindstedt et ai., Biochemistry 30 16 (1977) 2181 - 2188] ohella syntyy L-karnitiinia tiettyjä jen mikro-organismien, esimerkiksi Agrobacterium/Rhizoblum * 1· *... sp.:n, aineenvaihdunnan välituotteena.

• 1 **"1 Julkaisussa EP-A 0 158 194 kuvataan menetelmää • · · ! L-karnitiinin valmistamiseksi mikrobiologisesti lähtien 35 esimerkiksi gamma-butyrobetaiinista, jonka yhteydessä saa- • · · ···« · 2 118568 daan aikaan perinteisin mikrobiologisin valikointiinne-telmin L-karnityylidehydrogenaasin suhteen negatiivinen tuotantomutantti, jonka avulla saadaan jo 20 - 30 tunnin reaktioajalla suhteellisen hyviä L-karnitiinisaantoja. Tä-5 män menetelmän lisäoptimointi aika-tilavuussaantojen suhteen ei ole kuitenkaan mahdollista näillä perinteisillä mikrobiologisilla menetelmillä.

Tämän keksinnön päämääränä on siten saada aikaan taloudellisempi biotekninen menetelmä L-karnitiinin valio mistamiseksi, jonka yhteydessä saadaan L-karnitiinia olennaisesti lyhyemmällä reaktioajalla vielä paremmilla Saanoilla.

Gamma-butyrobetaiini/krotonobetaiiniaineenvaihdun-taa koskevat tutkimukset ovat johtaneet viiden geenin, 15 bcoA/B, bcoC, bcoO, bcoE ja bcoT, identifiointiin, jotka koodittavat gamma-butyrobetaiini/krotonobetaiiniaineen-vaihduntatien entsyymejä ja joita esiintyy mm. yhdessä operonissa, niin kutsutussa butyrobetaiini-L-karnitiini-operonissa (bco). Tässä yhteydessä merkinnät tarkoittavat 20 seuraavaa: bcoA/B: gamma-butyrobetaiini-CoA-syntetaasi (bcoA)/ krotonbetaiini-CoA-syntetaasi (bcoB) -geeni, ts. yksi ainoa geeni, joka koodittaa entsyymituotetta, jolla on sekä • · ! ** gamma-butyrobetaiini-CoA-syntetaasiaktiivisuus että kroto- *· · i 1.· 25 nobetaiini-CoA-syntetaasiaktiivisuus; • · ·,· · bcoC:gamma-butyrobetaiini-CoA-dehydrogenaasigeeni; *ϊ**: bcoD: krotonobetaiini-CoA-hydrolaasigeeni; : ϊ1: bcoE: L-karnityylidehydrogenaasigeeni; :1·1· bcoT: potentiaalinen kuljetusjärjestelmään liittyvä 30 geeni.

:1. On havaittu, että geenien bcoA/B, bcoC ja bcoD

• · · *···. tuotteet ovat vastuussa L-karnitiinin biosynteesistä, kun * · *!1 taas bcoE koodittaa karnitiinidehydrogenaasia, joka saa 4»· ·.· 1 aikaan aineenvaihdunnan välituotteen, L-karnityyli-CoA:n, • « · ϊ.,,ί 35 hajoamisen betaiiniksi. bcoT:n kohdalla on otaksuttavasti ·· ···· 118568 3 kyse geenistä, joka koodittaa butyrobetaiiniaineenvaihdun-taa liittyvän kuljetusjärjestelmän yhtä kuljetusproteii-nia. Tämä geeni ei ole välttämätön L-karnitiinin biosynteesille.

5 Tämä keksintö koskee siten DNA-fragmentteja ja vek toreita, jotka käsittävät yhden tai useamman geeneistä bcoC, bcoA/B ja jbcoD, jotka koodittavat gamma-butyrobe-taiini/krotonobetaiiniaineenvaihdunnassa L-karnitiinin biosynteesiin osallistuvia entsyymejä, ja mahdollisesti 10 lisäksi potentiaalisen kuljetusgeenin JbcoT.

Keksintö koskee lisäksi mikro-organismeja, jotka sisältävät näitä DNA-fragmentteja. Yhtenä lisäkohteena on biotekninen menetelmä L-karnitiinin valmistamiseksi käyttämällä keksinnön mukaisia mikro-organismeja.

15 Merkinnät bcoA/B, bcoC, bcoD ja bcoT, joita käyte tään tässä kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa, kattavat määritelmänsä mukaisesti sekä villiä tyyppiä olevien organismien geenit, jotka koodittavat gamma-butyrobetaiini/ krotonobetaiini-L-karnitiiniaineenvaihdunnan entsyymejä, 20 joilla on edellä mainitut entsyymiaktiivisuudet, erityisesti butyrobetaiini-L-karnitiini (bco) -operonin geenit, että niiden toiminnallisesti vastaavat geenivariantit ja -mutantit, ts. geenit, jotka ovat villin tyypin organis-: *** mien geenien johdoksia ja joiden geeni tuotteiden biologi- Φ · · • *.· 25 nen toiminta on olennaisesti muuttumaton. Toiminnallises- t * ·,· j ti vastaavat geenivariantit ja -mutantit käsittävät siten ·;**: esimerkiksi geneettisen koodin tunnetun degeneraation : puitteissa tapahtuneet emästen vaihtumiset, jollaisia voi- «*· daan aikaansaada esimerkiksi keinotekoisesti geenisekvens-30 sin tekemiseksi sopivaksi sen määrätyn mikro-organismin suosiman kodonien käytön kannalta, jossa ilmentymisen on

Φ M

määrä tapahtua. Varianttien ja mutanttien piiriin kuuluvat *;* lisäksi emästen tai kodonien deleetiot, insertiot ja subs- φ φ # V· tituoinnit, kunhan ne jättävät siten muutettujen geenien 35 tuotteiden biologisen toiminnan olennaisesti muuttumatto- φ φ φ«· • • φφφ φ φ 4 118568 maksi. Mukaan luetaan täten esimerkiksi geenisekvenssit, joiden homologisuusaste villin tyypin sekvessien kanssa on korkea, esimerkiksi yli 70 %, ja jotka kykenevät hybridi-soitumaan villin tyypin sekvenssin komplementin kanssa 5 ankarissa hybridisaatio-olosuhteissa, esimerkiksi lämpötilassa 50 - 70 °C ja suolapitoisuuden ollassa 0,5 - 1,5 mol/1.

Tässä käytetyllä ilmauksella transkriptioyksikkö tarkoitetaan DNA-sekvenssejä, joissa geeni on sijoittunee-10 na transkriptiosuuntaan ja tulee transkription yhteisen ohjauksen alaisena kopioiduksi yhtenäiseksi transkriptik-si, jolloin DNA-sekvenssien käytettävissä on geenien lisäksi geenien ilmentymiseen tarvittavia geneettisiä kont-rollielementtejä, kuten promoottoreja ja ribosomisitoutu-15 miskohtia.

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin kuvioin.

Kuvio 1 esittää gamma-butyrobetaiini/krotonobetaii-ni-L-karnitiiniaineenvaihduntatien entsyymejä.

Kuvio 2 esittää bco-operonin sisältävästä Rhizo-20 biim/Agrobacterium-organismista peräisin olevan 10,6 kilo- emäksen (ke) DNA-fragmentin restriktiokarttaa.

Kuviot 3 ja 4 esittävät plasmidia pVKlOll ja plas-midia pAZIOI; nuolet osoittavat bco-geenien ja beu-geenien ·» : *** sijainnin ja orientaation (betaiininhyödyntämisgeenit; ·· · • 25 EP-A 0 543 344). Plasmidien inserttiosa on merkitty pak- • · : : : sunnoksella.

*·· · *:**: Kuvio 5 esittää plasmidia pCC49 mahdollisena lähtö- • ·*· materiaalina recA'-isäntäkannan valmistamiseksi.

• · ·

Kuvio 6 esittää plasmidien pVHlOll, pAZIOI, pVKIOOq 30 ja pAZ7 konstruointikaaviota.

.. Kuvio 7 esittää recA‘-isäntäkannan konstruointikaa- • · *... viota.

• · '·;·* Lähtömateriaalina gamma-butyrobetaiini/krotonobe- :**: : taiini-L-karnitiiniaineenvaihduntatien geenien bcoA/B, 35 bcoC, bcoO ja bcoT eristämiseksi voivat toimia kaikki mik- • « ·

Itt * • « · · * • · 5 118568 ro-organismit, jotka metaboloivat butyrobetaiinia ja kro-tonobetaiinia kuvion 1 mukaisesti. Esimerkkejä sopivista kannoista ovat sukujen Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobixm ja Agrobacterixm/Rhizoblxm mikro-orga-5 nismit, joista edullisia ovat viimeksi mainitut. Yksi esimerkki edullisesta suvun Agrobacterixm/Rhizoblxm mikro-organismista on lajin Agrobacterixm/Rhizoblxm sp. HK4 (dsm 2938) mikro-organismi, jota on kuvattu aiemmin julkaisussa EP-A 0 158 194. Erityisen edullista on käyttää mikro-orga-10 nismeja, jotka ovat valmiiksi karnitiinidehydrogenaasine-gatiivisia, ts. joissa ei ole bcoE-geeniä tai joissa tämä geeni on virheellinen (jäljempänä käytetään myös merkintää bcoE')· Esimerkkejä edullisista karnitiinidehydrogenaasi-negatiivisista mikro-organismeista ovat lajien Agrobacte-15 rixm/Rhizobixm sp. HK13 (DSM 2903) ja HK1331b (DSM 3225) mikro-organismit, joita on kuvattu aiemmin julkaisussa EP-A 0 158 194, tai lajin Agrobacterixm/Rhizobixm sp. HK1349 (DSM 3944) mikro-organismit, joita on kuvattu julkaisussa EP-A 0 543 344.

20 Gamma-butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiini- aineenvaihduntatien geenit bcoA/B, bcoC, bcoD ja bcoT voidaan sijoittaa mikro-organismin kromosomiin tekemällä mikro-organismeille esimerkiksi transposoni-lnsertiomutage-: “ neesi ja varustamalla siten gamma-butyrobetalini/krotono- • t · : 1.1 25 betaiini-L-karnitiiniaineenvaihduntatien geenit sopivalla * 1 ;,· · markkerilla, esimerkiksi kanamysiini (Km) -resistenssillä.

*:1: Sen jälkeen voidaan eristää siten merkityt mutantit, jotka : eivät enää pysty hyödyntämään butyrobetaiiniaineenvaihdun- ··· j1·1· nan välituotteita. Tällä tavalla voidaan indentifioida 30 gamma-butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiiniaineen- ··. vaihduntatien geenit ja todeta niiden toiminnot. Markke- • · 1 \...t rilla varustetut geenit voidaan sitten kloonata ja karak- • 1 "1 terisoida tarkemmin sopivilla restriktioentsyymeillä. In- ··· V ! taktin geenin tai keksinnön mukaisten DNA-fragmenttien 35 eristys voi sitten tapahtua lähtien vastaavan mutaatiotto- a ··· ···♦ t 118568 6 man mikro-organismin geenipankista, josta bco-geenit tai niiden fragmentit voidaan eristää ja tunnistaa tekemällä hybridisaatio edellä kuvatulla tavalla saatujen mutageni-soidun kannan kloonattujen geenien kanssa. Saadut geenit 5 voidaan sitten kloonata haluttuihin vektoreihin ja kartoittaa restriktioentsyymien avulla.

L-karnitiinin biosynteesistä ovat vastuussa vain geenit JbcoA/B, bcoC ja bcoD. Vastaavasti vain näiden geenien läsnäolo on välttämätöntä L-karnitiinituotannolle.

10 Valittujen lähtöolosuhteiden, esimerkiksi valitun lähtömateriaalin tai valitun tuotantokannan, mukaan voivat L-kar-nitiinituotannossa käytettävät DNA-fragmentit ja vektorit sisältää yhden tai useamman L-karnitiinin biosynteesiin liittyvän geenin.

15 Geenien JbcoA/B, bcoC ja bcoD ohella voivat keksin nön mukaiset DNA-fragmentit ja vektorit haluttaessa sisältää myös potentiaalisen kuljetusgeenin bcoT.

L-karnityylidehydrogenaasigeenin, siis bcoE-geenin, läsnäolo on epätoivottavaa, sillä sen ollessa läsnä tapah- 20 tuu L-karnitiinin hajoaminen. Virheellisen bcoE-geenin (jbcoE':n) läsnäolosta ei kuitenkaan ole haittaa.

On tarkoituksenmukaista, että L-karnitiinin biosynteesiin liittyvät geenit, nimittäin bcoC, bcoA/B ja bcoD, • · • ** sijaitsevat L-karnitiinin tuotannossa käyttämisen ollessa mm m : V 25 kyseessä kaikki yhdessä DNA-fragmentissa tai vektorimole- • · : kyylissä ja edullisesti tavanomaisessa 5'-3' -suunnassa ··**: geenien säätelyelementtien jälkeen järjestyksessä bcoC, : bcoA/B ja bcoD tai bcoC, bcoh/B, bcoD ja bcoT ja yhdessä, ·*·*· edellä määritellyn kaltaisessa transkriptioyksikössä jär- * 30 jestyneinä vastaavalla tavalla kuin luonnossa esiintyväs- ··, sä butyrobetaiini-L-karnitiinioperonissa. Mainitunlaisen • ··

transkriptioyksikön geenejä bcoC, bcoA/B, bcoD ja bcoT

• · *1* voidaan karakterisoida esimerkiksi kuvion 2 mukaisen rest- mmm ϊ.ϊ · riktiokartan vastaavien osien kautta.

··· m m m m mmm m m mmm m mmmm m m m 7 118568

Jbco-geenien transkriptio ja ilmentyminen tapahtuu tarkoituksenmukaisesti sopivan, edullisesti voimakkaan promoottorin ohjauksessa. Promoottorin valinta riippuu halutuista ilmentymisolosuhteista, esimerkiksi siitä, halu-5 taanko konstitutiivista vain indusoitua ilmentymistä, tai mikro-organismista, jossa ilmentymisen on määrä tapahtua. Yksi sopiva promoottori on esimerkiksi luonnollisen bu-tyrobetaiini-L-karnitiinioperonin promoottori Pbco. Jos L-karnitiinln biosynteesistä vastuussa olevien jbco-geenien 10 eristys tapahtuu esimerkiksi mikro-organismista, jossa on virheellinen bcoE-geeni (JbcoE'), voidaan edullisesti eristää j a kloonata esimerkiksi koko bcoE'-geenin sisältävä bco-operoni ja siihen liittyvät geeninsäätelyelementit tästä mikro-organismista ja käyttää niitä sitten L-karni-15 tiinin tuotantoon sopivissa mikro-organismeissa. Mainitunlaista transkriptioyksikköä, jossa on JbcoE-geenimutantti ja jollainen voidaan eristää esimerkiksi Rhizobium/Agroba-cterlum HK1349:stä, voidaan mahdollisesti karakterisoida myös kuvion 2 esittämän restriktiokartan avulla, jos 20 bcoE:ssä oleva virhe on vain pistemutaation aiheuttama eikä koske mitään restriktiopilkkoutumiskohtaa. Muita ilmentämiseen soveltuvia promoottoreja ovat esimerkiksi promoottorit P^, Pel [M. Labes et ai., Gene 89 (1990) 37 - ϊ ** 46], trp-promoottori [Amann et ai., Gene 25 (1983) 167 - ·· · : 25 178], lac-promoottori [Amann et ai., Gene 25 (1983) 167 - • · · 178] ja tac-promoottori, mainittujen trp- ja lac-promoot- torien hybridi, jota voidaan käyttää konstitutiivisena tai i indusoitavana promoottorina [Russell ja Bennett, Gene 20 .•ϊ*. (1982) 231 - 243].

30 Sopivassa tuotantokannassa tapahtuvaa L-karnitiinin ··, tuotantoa varten on tarkoituksenmukaista sisällyttää kek- • «· sinnön mukaiset DNA-fragmentit, jotka käsittävät mainitut • · "* bco-geenit, edullisesti yhdessä samassa transkriptioyksi- 999 V : kössä, tunnetuin menetelmin sopiviin tunnettuihin vekto- z[ma} 35 reihin, erityisesti ilmentymisvektoreihin, esimerkiksi a m • 99 9 9999 9 9 9 _ 118568 o faageihin tai plasmideihin. Vektoreina voidaan käyttää autonomisesti ja itsestään replikoivia vektoreita tai myös niin kutsuttuja integraatiovektoreita. Integraatiovekto-rilla tarkoitetaan tässä yhteydessä vektoria, esimerkiksi 5 plasmidia, jossa on ainakin yksi vastaanottajakannan geno-misekvenssin kanssa homologinen sekvenssi ja joka mahdollistaa tämän sekvenssin kanssa tapahtuvan homologisen re-kombinaation kautta vieraiden geenien viennin vastaanottajakannan genomiin. On edullista käyttää autonomisesti ja 10 itsestään replikoivia vektoreita.

Valittujen vektoreiden lajin mukaan voidaan L-kar-nitiinin biosynteesiin liittyvien entsyymien geenejä saattaa ilmentymään erilaisissa organismeissa. Vektoreiksi soveltuvat sekä isäntien suhteen spesifiset että isäntäkir-15 joltaan laajat ("broad host range") vektorit ja edellä kuvatut integraatiovektorit.

"Broad host range" -vektoreina voidaan käyttää kaikkia vektoreita, jotka soveltuvat gramnegatiivisille bakteereille. Esimerkkejä mainitunlaisista "broad host 20 range" -vektoreista ovat pVKIOO [Knauf ja Nester, Plasmid 8 (1982) 45 - 54], pME285 [Haas ja Itoh, Gene 36 (1985) 27 - 36] ja pKT240 (Bagdasarian et ai., Gene 26 (1983) 273 - 282] tai niiden johdokset. pVKIOO-johdoksena voidaan i ** käyttää esimerkiksi pVK1001:ä, pME285-johdoksena esimer- ·· · j V 25 kiksi pAZ10:aa ja pKT240-johdoksena esimerkiksi pL032:a • a ·,; · (kuten on kuvattu julkaisussa EP-A 0 543 344).

"**: Integraatiovektoreina voidaan Rhizobium/Agrobacte- : riimin ollessa kyseessä käyttää pACYC184- ja pBR322-poh- »1· .1·1· jäisiä vektoreita [Comai et ai.. Plasmid 10 (1983) 21 - 30 30].

··. Tällä tavalla on saatu esimerkiksi plasmidit pVHlOOq, pVKIOll (kuvio 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOI (kuvio *·;·1 4) ja pL041. Plasmidi pVKIOOq on talletettu 16.11.1993 «·· V 1 kokoelmaan Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zell- 35 kulturen GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, « ·»· · 118568 9

Rhizobium/Agrobacterium HK1349:ssä talletusnumerolla DSM 8726.

Fermentointiin tarkoitettujen tuotantokantojen, ts. L-karnitiinituotantokantojen, valmistamiseksi täytyy kek-5 sinnön mukaiset DNA-fragmentit tai vektorit viedä haluttuihin ja ilmentämiseen soveltuviin isäntäkantoihin. Tämän tekemiseksi on tarkoituksenmukaista transformoida mikro-organismit tavanomaisella ja sinänsä tunnetulla tavalla keksinnön mukaisilla DNA-fragmenteilla. Mikro-organismit 10 voivat sisältää keksinnön mukaisen DNA-fragmentin joko vektorimolekyylissä tai kromosomiinsa integroituneena.

Tuotantokannoiksi soveltuvat kaikki mikro-organismit, joilla on kyky tuottaa L-karnitiinia krotonobetaii-nista ja/tai gamma-butyrobetaiinista ja joiden kyky hajot-15 taa (kataboloida) L-karnitiinia on estetty kokonaan tai osittain. Mikro-organismeja, joiden L-karnitiinikatabolia on estynyt, ovat esimerkiksi kannat, jotka ovat karnitii-nidehydrogenaasinegatiivisia, ts. kannat, joissa karnitii-nidehydrogenaasigeeni bcoE on tehty toimimattomaksi esi-20 merkiksi mutaation tai deleetion kautta, ja/tai kannat, jotka ovat L,D-karnitiinirasemaasinegatiivisia ja L-karni-tiinidehydrataasinegatiivisia.

Soveltuvia isäntäkantoja, edullisesti kantoja, : **· joilla on korkea substraatti- ja lähtöainetoleranssi, ovat ·· · • V 25 esimerkiksi sukujen Escherichia, Pseudomonas, Agrobacte- j rlum, Rhizobium, Comamonas ja Rhizobium/Agrobacterium mik- ·:·*: ro-organismit, joista viimeksi mainitut ovat edullisia.

• ·*· Edellä jo mainittujen lajien Rhizobium/Agrobacterium sp.

HKI3, HK1331b ja HK1349, samoin kuin lajin HK1349.3 (jota 30 kuvataan julkaisussa EP-A 0 543 344) mikro-organismit ovat ..e erityisen edullisia.

• ··

Lisäksi on havaittu, että L-karnitiinisaantoa voi- • ♦ *··** daan parantaa vielä edelleen, jos isäntäkannan rekombinaa- :|ί ! tiokyky, ts. sen rekonbinaatiotaipumus ja rekombinaatio- 35 taajuus, on heikentynyt. Siten rajoitetaan rekombinaatiota ··· 1 2 2 118568 10 vektorin kanssa kromosomaalisen homologlan perusteella. Isäntäkannan rekombinaatiokykyä voidaan heikentää esimerkiksi tunnetulla tavalla sen recA-geenin tarkoituksellisella mutaatiolla (recA-mutaatio). Erityisen edullisia, 5 rekombinaatiokyvyltään heikennettyjä mikro-organismeja ovat lajin Rhizobium/Rgrobacterium sp. mikro-organismit, esimerkiksi keksinnön mukaisesti, jäljempänä kuvattavalla tavalla, aikaansaatu lajin Rhizobium/Rgrobacterium HK1349.49 kanta.

10 Soveltuvia tuotantokantoja ovat siten esimerkiksi lajien Rhizobium/Rgrobacterium HK1349, HK1349.4 ja HK1349.49 mikro-organismit, jotka sisältävät kussakin tapauksessa plasmidin pVHlOOg, pVKIOll, pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOI tai pL041.

15 Transformoitujen isäntäkantojen (tuotantokantojen) eristys voi tapahtua selektiivisestä kasvualustasta, johon lisätään antibioottia, jolle kanta on resistentti vektorissa tai DNA-fragmentissa olevan markkerigeenin ansiosta. Jos tuotantokantoina käytetään julkaisun EP-A 0 543 344 20 mukaisia mikro-organismeja, ts. mikro-organismeja, joiden kromosomissa olevassa betaiinin hyödyntämistä koodittavas-sa geenissä on mutaatio ja jotka on transformoitu plasmi-dilla, joka sisältää betaiinin hyödyntämistä koodittavan

M

: 1·· geenin, voidaan valikointi tehdä myös betaiinin hyödyntä- t· · • 1.i 25 misen mukaan. Esimerkkejä betaiinin hyödyntämisen mukaan i valikoitavissa olevista mikro-organismeista ovat edellä ··1·· mainitut HK1349.4 ja HK1349.49, jotka sisältävät esimer- . kiksi plasmidin pL041, pAZIOI, pAZ7::beu tai pVHlOll.

a 1 · L-karnitiinin biotekninen valmistus tapahtuu käyt- • · ♦ 30 tämällä mikro-organismeja, jotka sisältävät keksinnön mu-..^ kaisla DNA-fragmentteja tai vektoreita. Prosessi L-karni- tiinin valmistamiseksi toteutetaan sisänsä tunnetuin mene- • · *·;·1 telmin, esimerkiksi julkaisussa EP-A 0 158 194 kuvatulla :T: tavalla, käyttämällä lähtöaineena esimerkiksi gamma-buty- ·**'· 35 robetaiinia sopivan hiili- ja typpilähteen läsnä ollessa.

IM

• M «

MM

118568 11

Hiili- ja typpilähteinä voidaan käyttää esimerkiksi gluta-maattia, asetaattia ja betaiinia tai glyserolia ja betaii-nia. Jos biotekninen valmistus toteutetaan käyttämällä be-taiinin hyödyntämisen mukaan valikoitavissa olevia mikro-5 organismeja, käytetään ainoana typpilähteenä betaiinia.

Fermentointi ja sitä seuraava L-karnitiinin eristys voi tapahtua julkaisussa EF-A 0 158 194 kuvatulla menetelmällä.

Vaihtelemalla alustassa olevia ravintoaineita ja 10 tekemällä fermentointiolosuhteet kulloinkin kyseessä olevalle mikro-organismille sopiviksi tavanomaisella tavalla voidaan L-karnitiinisaantoa parantaa edelleen.

Esimerkki 1

Transposoni-insertiomutanttien (Tn5) aikaansaanti 15 ja niiden fenotyyppi-indentifiointi

Villiä tyyppiä oleva kanta Rhizobium/Agrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B 0 158 194) saatettiin valikoitumispai-neen kautta kehittämään spontaani resistenssi streptomysiinille (Sm, 1 000 pg/ml). Tämä resistenssi oli stabii-20 listi osoitettavissa yli 50 valikoimattoman sukupolven ajan ja sitä käytettiin valikointimarkkerina.

Sekoitettiin 0,2 ml E. coli S17-l/pSUP2021 -luovut- tajaviljelmää [R. Simon et ai., Biotechnology 1 (1983) ϊ 1·1 784 - 790] 2 ml:n kanssa HK-vastaanottajaviljelmää ja »· · •V 25 sentrifugoitiin. Solut pestiin 0,9-%:isella keittosuolani | liuoksella (NaCl-liuoksella) ja suspendoitiin uudelleen ·:··: 100 pl:aan 0,9-%:ista keittosuolaliuosta. Vastaanottaja- • ·1· kantaa konjugoitiin luovuttajakannan kanssa yön yli lämpö-

Ml ,1Γ. tilassa 30 °C kuivalla ravintoagarilla. Talteen otetut so- 30 lut siirrostettiin laimennoksiksi vastaanottajalle (SmR) .. ja transposonille [neomysiiniresistenssi (NmR)] tarkoite- • · tulle valikointialustalle.

• s *·;** Tn5-mutant te ja saatiin ravintoagarilla, joka sisäl- :T: si Sra:ä (1 000 pg/ml) ja Nm:ä (100 pg/ml). Mutanttien fe- ·***; 35 notyyppi-identifiointi onnistui osoittamalla kuvion 1 mu- • •a • •f • ••a · 118568 12 kaisten butyrobetaiiniaineenvaihduntavälituotteiden hyö- dyntämättömyys hiili (C) -lähteenä minimialustassa. Esimerkki 2

Tn5-markkerilla varustettujen DNA-fragmenttien 5 kloonaus HK4-genomista

Tn5-mutaation sisältävän HK4:n eristetty genomi-DNA (5 pg) pilkottiin täydellisesti EcoRIillä (4 yksikköä/pg). pBR325 (2,5 pg) [Gene 2 (1977) 95 - 113] käsiteltiin täydellisen EcoRI-pilkonnan jälkeen alkalisella fosfataasil-10 la. Yhdistelmähybridiplasmideja saatiin sekoittamalla genomi-DNA ja pBR523 T4-DNA-ligaasin kanssa (0,2 yksikköä/ pg DNA:ta) 200 pl:ssa ligaatiopuskuria [20 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,2, 10 mmol/1 DTT:a (ditiotreitolia), 10 mmol/1 MgCl2:a, 0,6 mmol/1 ATP:tä] ja inkuboimalla yön yli lämpö-15 tilassa 12 °C.

Ligaatioseosannoksia käytettiin E. colt ED 8654:n [Barek et ai., Mol. Gen. Genet. 146 (1976) 199 - 297] transformointiin [Cohen et ai., PNAS 69 (1972) 2110 - 2114]. Transformantit valikoitiin ravintoagarilla ampisil-20 liiniresistenssinsä [Ap, 100 pg/ml) ja kanamysiiniresis-tenssinsä (Km, 25 pg/ml) perusteella. Kaikissa valikoiduissa hybridiplasmideissa oli HK4-insertti, joka oli varustettu Tm-markkerilla. Insertit kartoitettin erilaisten ·*·.. restriktioentsyymien suhteen kuvion 2 esittämän restrik- a 25 tiokartan mukaisesti. Restriktiokarttojen vertaaminen a · : .·, osoitti transposoni-insert in olevan samassa genomi f ragmen- a · * ‘".5 tissa joukossa fenotyypiltään erilaisia Tn5-mutantteja.

• · . Tämä havainto voitiin vahvistaa tekemällä ldentti- • · « *"** sesti pilkotun plasmidi-DNA:n Southern Blot -hybridissä- • · · *·* * 30 tio (S. Bertram ja H. G. Gassen, Gentechnische Methoden,

Fischer Verlag 1991, s. 219) ja sen jälkeen elektroforeet- ·· •*·· tinen erotus. Koettimina toimivat tämän transposonimutan- • · · teista peräisin olevan kloonatun DNA:n alafragmentit.

··· • # · • · · ··· • · • · ··· ··· * *·· ·«·· 0 118568 13

Esimerkki 3

Genomi-HK4-geenipankin muodostaminen lambda-faagei- hin

Jotta pystytään pakkaamaan DNA lambda-faageihin, on 5 vaatimuksena koko 40 - 52 ke ja "cos-kohta". Genomi-HK4-geenipankin aikaansaamiseksi lamda-faageihin käytettiin kosmidivektoria pVKIOO [Knauf ja Nester, Plasmid 8 (1982) 45 - 54], jonka koko on 23 ke ja mahdollistaa siten sellaisten DNA-fragmenttien kloonauksen, joiden koko on 17 -10 29 ke.

pVKIOO pilkottiin EcoRIrllä, defosforyloitiin ja ligatoitiin HK4-DNA:n kanssa, joka oli pilkottu osittain EcoRI:llä. HK4-DNA:n osittaisen pilkonnan kannalta optimaaliseksi EcoRl-pitoisuudeksi määritettiin koepilkonnan 15 avulla 0,58 yksikköä/pg DNA:ta eli 0,02 yksikköä/μΐ reak-tioseosta, kun reaktioseoksessa käytettiin 8,5 pg HK4-DNA:ta. Eristettiin agaroosielektroforeesigeeleiltä DNA-fragmentit, jotka olivat kooltaan yli 17 ke. Ligaatio tapahtui 10 pl:n tilavuuksissa, jotka sisälsivät 100 mg kos-20 midivektoria ja 400 ng siirrettävää DNA:ta. Sitten seurasi "in vitro -pakkaus" valmistajan ohjeen mukaisesti Promega Biotec.:n seoksessa 2 tunnin ajan lämpötilassa 25 °C. Kun oli transfektoitu E. coll S17-1, tehtiin valikointi kosmi-·1·,, divektorin Km-resistenssin perusteella. Yhdestä erästä 25 saatiin noin 5 000 pesäkettä (yksittäistä kloonia). Geeni-: .·. pankkipesäkkeet säilytettiin viitenä noin 1 000 kloonin • · i "eränä" pakastusväliaineessa (Nutrient Yeast Broth, NYB, • · . Oxoid ja 50 % glyserolia) lämpötilassa -70 ®C. Geenipankin • · · 'lii monistus tehtiin viljelemällä kerralla 10 pl tätä erää yön • 1 · *·1 1 30 yli 10 ml:ssa NYB-alustaa ja jakamalla annoksiksi.

·· » · * · · • 1 • · • · · • · · * · · » · 1 ♦ ·· • ♦ • · ··· ·♦·1 · 118568 14

Esimerkki 4 KH4-kosmldlgeenipankin tutkiminen, jbco-geenin sisältävän kosmidikloonin identifiointi pesäkebybri- disäätiöila, täplähybridisaatiolla tai suoralla HK-5 mutanttikomplementaatiolla

Hybridisaatiokoettimina voitiin käyttää suoraan kloonattuja, Tn5-markkerilla varustettuja DNA-fragmentteja.

Vastaavia DNA-sekvenssejä sisältävät kloonit antoi-10 vat hybridisaatiosignaaleja ja johtivat HK-mutanteissa kulloinkin olevan virheellisen geenin komplementaatioon. Eri mutanteista peräisin olevan DNA:n ristihybridisaatiot osoittivat useamman butyrobetaiiniaineenvaihdunnan geenin "kerääntymisen" yhteen DNA-fragmenttiin, jonka koko oli 15 10,6 ke (kuvio 2).

Pesäkehybridisaatio toteutettiin tavanomaisesti (S. Bertram ja H. G. Gassen, ibid. 1991, 221). Täplähybri-dlsaatio (Dot-blotting) toteutettiin samoin tavanomaisesti (S. Bertram ja H. G. Gassen, ibid. 1991, 217).

20 Esimerkki 5 HK-mutanttien komplementointi

Kun oli paikannettu tarkasti butyrobetaiiniaineenvaihdunnan yksittäiset geenit ottaen huomioon molekyyli- ·1·.. koot identifioitujen peptidiketjujen perusteella oli saa- # :1.1. 25 vutettavissa yksittäisten mutanttien komplementointi kul- • ♦ • .·. loosillakin geenifragmenteilla.

• · »

Kukin ilmentymisplasmidi pVKIOO: :HK-DNA vietiin « · konjugaation kautta E. coli S17-l:stä esimerkin 1 mukai-*;;;' siin Rhizobium/Agrobacterium sp. HK -kantoihin, joissa oli φ · · 30 aineenvaihdunnan eri vaiheisiin liittyviä mutaatioita (katso kuvio 1). Valikointi tehtiin luovuttajan proliini : 1·♦ (pro) -auksotrofian ja vektorin antibioottiresistenssin ··· S...: [KmRTc(tetrasykliini)11] perusteella.

• · · » · · ♦ ·· • · • · • · · • it lllt · 118568 15

Esimerkki 6

6.1 bco-fragmentin kloonaus kannasta HK1349 (DSM

3944) ja sen johdoksista

Geeniannosvaikutusten ja tuotantokyvyn paranemisen 5 aikaansaamiseksi tuotantokannassa kloonattiin bco-operoni kannasta HK 1349 (DSM 3944, EP-A 0 543 344). Tässä kannassa on säilynyt koko bco-opreoni; ensimmäinen, karnitiini-CoA-dehydrogenaasia vastaava geeni, bcoE sisältää kuitenkin mutaation. Tästä kannasta saatu hco-operonin sisältävä 10 DNA-fragmenttl on siten ihanteellinen tuotantokyvyn parantamiseen ilmentymisvektoreiden suurten kopiolukumäärien ansiosta.

Kloonaus tapahtui tunnetulla tavalla E. coli S17-l:een julkaisun EP-A 0 543 344 esimerkin 3 mukaisesti. 15 Tätä varten eristettiin 10,6 ke:n bco-operoni HK1349-gee-nipankista ja ligatoitiin sen pVKl00:aan. Tällöin oli tuloksena plasmidi pVKlOOg (katso kuvion 6 esittämä konstru-ointikaavio). Valikointi tehtiin E. coli S17-l:ssä Km-pi-toisella (25 pg/ml) NYB:llä. Oikean insertin indentifioin-20 ti onnistui esimerkissä 5 kuvatulla menetelmillä käyttämällä HK-mutantteja. EcoRI:llä pilkotulle HK1349-DNA:lle tehtiin elektroforeettinen erotus ja eristettiin geelistä kokoalueella 10,6 ke olevat fragmentit. Fragmentit liga- ·1·,, toitiin EcoRI:llä pilkottuun pVKl00:aan. Tällä hybridi- * 25 plasmidiseoksella transformoitiin E. coli S17-1 (proliini- • · : .·, auksotrofi) ja tehtiin valikointi Km-pitoisella (25 pg/ml) ravintoagarilla. Vektorista peräisin olevan oikean hybri-

• I

diplasmidikloonin ja bco-operonin sisältävän 10,6 ke:n *" DNA-fragmentin identifiointi toteutettiin tekemällä "palo- • · · *** 30 jen sovitus yhteen" ("patch-mating") butyrobetaiini-CoA- syntetaasinegatiivisen mutantin (HK4V4) kasvustolla mini- Φ · : 1·1 mialustalla, joka sisälsi 0,2 % (massa/tilavuus) butyrobe- • · · :...· taiinia C- ja N-lähteenä. Oikea klooni pystyi mutantteihin .1i1. tehdyn mainitunlaisen konjugatiivisen siirron jälkeen täy- ,···. 35 dentämään soluja tämän C-lähteen hyödyntämisessä. Siten • « • · Φ ··· **«· · 1 1 8568 16 identifioitu klooni pVKIOOq toimi suoraan tuotantoplasmi-dina tai bco-operonin sisältävän DNA-fragmentin varastona jatkossa tehtäviä alikloonauksia varten.

6.2 pAZl01:n, pAZ7:n, pVKIOllin, pVKIOOq:n, pL041:n 5 ja pAZ7::beun:n konstruointi pAZ101:n, pAZ7:n, pVK1011:n ja pVKIOOq:n konstruointi tapahtui kuvion 6 esittämän konstruointikaa-vion mukaisesti. pL041:n konstruointi tapahtui lähtien pL032:sta (EP-A 0 543 344) bco-geenin (10,6 ke:n EcoRI/ 10 EcoRI-fragmentti) insertion kautta ja plasmidin pAZ::beu konstruointi lähtien pAZ7:stä (kuvio 6) beu-geenin (3 ke:n Pstl/Pstl-fragmentti, EP-A 0 543 344) insertion kautta. Asianomaisia restriktioentsyymejä käytettiin 3-5 yksik-köä/pg DNA:ta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidi 15 pVKIOOq saatiin insertoimalla 2>co-geeni pVK100:aan (Knauf ja Nester, ibid). Lähtöplasmidi pVKlOOsl (kuvion 6 konst-ruointikaavio) saatiin plasmidin pVKIOOs EcoRI-deleetio-kloonausten kautta (EP-A 0 543 344).

Esimerkki 7 20 recA-mutaation vienti HK1349.4:ään 7.1 recA:ta koodittavan geenipankkikloonin identifiointi

Tutkittiin pesäkehybridisaatiomenetelmillä (S. ·**,, Bertram ja H. G. Gassen, ibid. 1991, 221) genomi-HK4-kos- 25 midigeenipankki recA:ta koodittavien kloonien suhteen.

• · : .·. Hybridisaatiokoettimena toimi Rhizobium leguminosarumista "„· peräisin oleva kloonattu recA-geeni [W. Selbitschka et ' ai., Mol. Gen. Genet. 299 (1991) 86 - 95]. Eristettiin • · · markkerilla varustettu kosmidiklooni ja EcoRI-pilkonnan • · · '·' 30 jälkeen saaduista EcoRI-DNA-inserttifragmenteista tutkit tiin recA-homologiset sekvenssit Southern Blot -hybridi- ·1 ! 1·1 säätiöllä käyttämällä recA-koettimia (S. Bertram ja H. G.

·,,,· Gassen, ibid. 1991, 219. Tällaisen markkerin sisältävä

EcoRI-fragmentti ligatoitiin samalla tavalla pilkottuun i i · .···. 35 vektoriin pVKIOO. Tuloksena olevalla hybridiplasmidilla • ♦ ··· ··· ···· ♦ 118568 17 pVKIOOrl transformoitiin E. coli S17-1 -solut DNA:n lisäämiseksi .

7.2 Kanamysiinresistenssigeenin vienti HKl349.4:ään kromosomaalisen recA-geenin inaktivoimiseksi 5 Kloonattiin 11,0 ke:n EcoRI-fragmenttipVK100rl:stä pACYC184:ään [C. C. Y. Chang ja S. N. Cohen, J. Bacteriol. 134 (1978) 1141 - 1156), joka oli pilkottu EcoRIjllä.

Määritettyä restriktiokarttaa vastaavalla tavalla kloonattiin BglII-Nrul-pilkottu 3,1 ke:n alafragmentti, 10 joka merkittiin Southern Blot -hybridisaatiossa recA-koet-timen kanssa reagoivaksi, BamHI-Hindlll-pilkottuun vektoriin pWS233. pWS233 on "geeninvaihtovektori" ("gene replacement"), ja sitä kuvaavat W. Selbitschka et ai. julkaisussa Appi. Microbiol. Biotechnol. 38 (1993) 615 - 618. 15 Kloonattiin tuloksena olevan plasmidin pCC45 XhoI- pilkkoutumiskohtaan Tn5:stä [pSUP2021, R. Simon et ai., Biotechnology 1 (1983) ibid] peräisin oleva XhoI-DNA-fragmentti, joka koodittaa Km-resistenssiä. Tuloksena oli pCC49. Noudattamalla W. Selbitschkan et ai. menettelyä 20 (1993, Ibid) tehtiin "geeninvaihto" seuraavasti:

Yhdistettiin 3 ml eksponentiaalisessa vaiheessa olevaa HK1349.4-viljelmää 1 ml:n kanssa eksponentiaaliessa vaiheessa olevaa luovuttajaviljelmää (S17-l/pCC49), sent-rifugoitiin ja pestiin 0,9-%:isella NaCl-liuoksella. Solu- * ·*·*. 25 ja inkuboitiin 50 pl:ssa NYB:tä ravintoagarilla yli yön • i : lämpötilassa 30 eC. Sen jälkeen 0,9-%:iseen NaCl-liuokseen • SS · uudelleen suspendoidut solut siirrostettiin sopivana lai- • * . mennoksena selektiiviselle alustalle. Sm-resistentin vas- • i « • t · taanottajan HK1349.4 transkonjugaatteja saatiin Sm:ä * 30 (1 000 pg/ml) ja Nm:ä (150 pg/ml) sisältävällä ravintoaga rilla, ja ne olivat "korvausvektorissa" olevaa geeniä ! ** sacRB vastaavalla tavalla herkkiä sakkaroosipitoisuudelle • · · \.,· 5 % kompleksisessa alustassa.

m

Kaksoisrekombinaatioita saatiin viljelemällä vali- .···, 35 koituja transkonjugaatteja ilman valikoitumispainetta ra- * · ··· s· * t • · 118568 18 vintoagarilla pienenä tiheytenä (10"e): noin 1 viikon kuluttua voitiin eristää soluja, jotka sietivät alustan sak-karoosipitoisuutta 5 % ja olivat säilyneet Nm-resistent-teinä, mutta joista oli tullut uudelleen herkkiä gentamy-5 siinille (Gm) (vektorimarkkeri).

Tämä fenotyyppi vahvistaa alleellisen markkerin-vaihdon ja merkitsee recA-mutaatiota HK1349.4:ssä. recA-mutanttien tyypillinen fenotyyppi (esimerkiksi UV-herkkyys jne.) on havaittavissa.

10 Tällä tavalla saadussa kannassa HK1349.49 on taipu mus plasmidien kromosomaaliseen intergoitumiseen homologisten sekvenssien kanssa (homologinen rekombinaatio) heikentynyt selvästi. Tämä kanta on siten hyvin sopiva isäntä esimerkissä 6.2 esitetyille hybridiplasmideille.

15 Esimerkki 8

Biotransformaatio

Biotransformaatio tehtiin ravistuspulloissa (100 ml) käyttämällä typetöntä minimialustaa [MM; Kulia et ai,, Arch. Microbiol. 135 (1983) 1-7], joka sisälsi 0,2 % 20 (massa/tilavuus) gamma-butyrobetaiinia (lähtöaine) ja C-lähteenä 0,4 % (massa/tilavuus) glyserolia. N- ja lisä-C-lähteeksi lisättiin 0,2 % (massa/tilavuus) L-glutamaat-tia (betaiinin hyödyntämisen suhteen negatiivisten kanto- j\ jen ollessa kyseessä) tai 0,2 % (massa/tilavuus) betaii- 25 nia.

• · \ I Tuotantokantoina käytettiin keksinnön mukaisia kan- • · · !*J i to ja HKl349.4/pL041, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7: :beu, ‘ .* HK1349.4/pAZ101, HK1349/pVK100q ja HK1349/pAZ27.

• * · *···’ Taulukkoon 1 on koottu tulokset verrattuina julkai- : 30 sussa EP-A 0 543 344 kuvattuihin HK13-peräisiin HK1349:ään (DSM 3944) ja HKl349.4:ään.

·· • *·· L-karnitiinin muodostus gamma-butyrobetaiinista määritettiin Bergmeyerin kuvaamalla DTNB [5, 51-ditiobis(2- .···. nitrobentsoaatti)] -menetelmällä (H. K. Bergmeyer, Metho- * · · 35 den der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim ’*:·* 1974, s. 1810f).

9 999 9 9999 9 9 9 118568 19

Kannat Alusta MM + Omina!sak-

glyseroli tllvlsuus mmol/l/h/OD

5 HK1349 (ei keksinnön mukainen) + betaiini 0,24 HK1349/pVKl00q + betaiini 0,36 HK1349/pAZ7 + betaiini 0,49 HK1349 (ei keksinnön mukainen) + L-glutamaatti 0,14 HK1349.4 (ei keksinnön mukainen) + L-glutamaatti 0,14 10 HK1349.4/pL041 + L-glutamaatti 0,29 HK1349.4 (ei keksinnön mukainen) + ammonium 0,12 HK1349♦4/pVK1011 + betaiini 0,54 HK1349.4/pAZ7::beu + betaiini 0,47 HK1349.4/pAZ101 + betaiini 1,08 #· s · • n • »« · s · · • a a a • a • * · ♦ * · aa» a a a a a • · · a » a »aa aaa • t · • · · m s· • ·

• M

··· • a • ♦ • •a a aa· a a a a a a a aaa a a a a aaa a a aaa a aaaa a a a

Claims (16)

20 1 1 8568

1. Eristetty DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman L-karnitiinin bio-5 synteesiin liittyvistä geeneistä bcoC, bcoA/B ja bcoD, jotka koodittavat gamma-butyrobetaiini-CoA-dehydrogenaasia (bcoC), gamma-butyrobetaiini/krotonobetaiini-CoA-syntetaa-sia (bcoA/B) ja krotonobetaiini-CoA-hydrolaasia (bcoO), jolloin tämä DNA-fragmentti valitaan seuraavien joukosta: 10 a) 10,6 ke:n EcoRI-fragmentti, jollainen on inser- toitu plasmidiin pVKlOOq, joka on talletettu Rhizobium/ Agrobacterium HK1349:ssä talletusnumerolla DSM 8726, tai sen alafragmentit; b) fragmentit, jotka hybridisoituvat tämän 10,6 15 ke:n EcoRI-fragmentin tai sen alafragmenttien kanssa ja koodittavat entsyymejä, joilla on gamma-butyrobetaiini-CoA-dehydrogenaasiaktiivisuus, gamma-butyrobetaiini/kroto-nobetaiini-CoA-syntetaasiaktiivisuus ja/tai krotonobetaii-ni-CoA-hydrolaasiaktiivisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi gamma-bu-tyr obetai ini /krotonobet ai iniaineenvaihduntaan 1 i i t ty vän, potentiaalista kuljetusproteiinia koodittavan geenin bcoT.

3. Kumman tahansa patenttivaatimuksista 1 ja 2 mu-•V. 25 kainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että gee- • f j ,1, nit bcoC, bco A/B, hcoD ja mahdollisesti bcoT ovat peräisin I f » *** I sukujen Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizo bium ja Rhizobium/Agrobacterium mikro-organismeista. • · · **··1

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukai- • · · 1 *·1 1 30 nen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että geenit on kytketty operatiivisesti ilmentymiseen tarvittavien ge- ·» j 1·· neettisten kontrollielementtien kanssa.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukai-#.j.# nen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että L-karni- t · · 35 tiinin biosynteesiin liittyvät geenit ovat järjestyksessä * · • · ··· • * M **·· 21 118568 bcoC, bcoA/B ja bcoD tai mahdollisesti bcoC, bcoA/B, bcoD ja bcoT ja esiintyvät yhtenä ainoana transkriptioelement-tinä.

6. Kumman tahansa patenttivaatimuksista 4 ja 5 mu-5 kainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että gee- ninsäätelyelementti käsittää luonnollisen Z>co-operonin promoottorin Pboo.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että geeneil- 10 le bcoC, bcoA/B, bcoD ja bcoT on tunnusmerkillistä seuraa-va restriktiokartta: XL O — σ -g - 1 e- -i s? - J ? ?Q- ä Ct 53 ^ eo- ^ 3 ö ^ " *·"Ί.·| u in'' it “L'll't Ι,Η-h — - - u — =; — o o π z: £ σ g σ g o οι o σ xl c ιλ o <λ ιλ c σ cl tn (Λ w «Λ W(DW cnx —CLcn q. α.\~ c/i m I->-i _I___I_i _Il-1— 0 Ϊ 2 3 ^5678 20 1 1-1 1 -I i ··· bcoC bcoA/B bcoD bco T !*·*· 25

• · • · • 8. Vektori, tunnettu siitä, että se sisäl-*·« « tää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen • · , DNA-fragment in. • · ·

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen vektori, t u n - • 30 n e t t u siitä, että se on plasmidi pVKIOOq, jollainen on talletettu Rhlzobiim/Agrobacterium HK1349:ssä talletus- • ** numerolla DSM 8726, plasmidi VK1011, jollaiselle on tun- »44 nusmerkillistä kuvion 3 mukainen restriktiokartta, tai plasmidi pAZIOI, jollaiselle on tunnusmerkillistä kuvion 4 *' · ,*·», 35 mukainen restriktiokartta. • I ··* *·« 4441 • * 118568 22

10. Yhdistelmämikro-organisml, tunnettu siltä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 9 mukaisen DNA-fragmentin tai vektorin.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen mikro-organis-5 mi, tunnettu siitä, että sen kyky kataboloida L-karnitiinia on estetty kokonaan tai osittain.

12. Kumman tahansa patenttivaatimuksista 10 ja 11 mukainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että sen rekombinaatiokyky on rajoittunut.

13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 10 - 12 mu kainen mikro-organismi, tunnettu siitä, että se valitaan sukujen Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizoblum, Comamonas ja Rhizobium/Agrobacterium mikro-organismien joukosta.

14. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on Rhizobium/Agrobacterium HK1349, joka sisältää plas-midin pVKIOOg, jollainen on talletettu talletusnumerolla DSM 8726, plasmidin VK1011, jollaiselle on tunnusmerkillistä kuvion 3 mukainen restriktiokartta, tai plasmidin 20 pAZIOI, jollaiselle on tunnusmerkillistä kuvion 4 mukainen restriktiokartta, tai mainitunlaisista mikro-organismeista johdettu geenivariantti tai -mutantti, jolla on kyky L-karnitlinin biosynteesiin.

·*·.. 15. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että 25 se on Rhizobium/Agrobacterium HK1349.4, joka sisältää • « ; ,·. plasmidin pVKIOOq, jollainen on talletettu Rhizoblum/Agro- • · · bacterium HK1349:ssä talletusnumerolla DSM 8726, plasmidin « « . VK1011, jollaiselle on tunnusmerkillistä kuvion 3 mukainen * · · ;;; restriktiokartta, tai plasmidin pAZIOI, jollaiselle on • * · *·* ' 30 tunnusmerkillistä kuvion 4 mukainen restriktiokartta, tai mainitunlaisista mikro-organismeista johdettu geeniva- ϊ *** riantti tai -mutantti, jolla on kyky L-karnitilnin biosyn- ··· teesiin. .•f,

16. Biotekninen menetelmä L-karnitiinin valmistami- • · · ,···, 35 seksi, tunnettu siitä, että fermentoidaan kroto- • · ·»· ·«·· 9 9 9 118568 23 nobetaiinia ja/tai gamma-butyrobetaiinia sopivan hiili- ja typpilähteen läsnä ollessa minkä tahansa patenttivaatimuksista 10 - 15 mukaisen mikro-organismin avulla ja eristetään L-karnitiini. aa : • aa ·. : ·: • a • a • a · aaa •e# · a a * • • ♦ · • · aaa • aa a a · a a * a ···.. :···. a · aaa a aaa a a a a a · a aaa : ϊ aaa a a aaa a aaaa a a a 118568 24