JP3708543B2 - ブチロベタイン／クロトノベタイン−ｌ−カルニチン代謝のための遺伝子およびそのｌ−カルニチンの微生物学的生産への使用 - Google Patents

Description

本発明は、ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチンの遺伝子の発現のための組換え遺伝子物質、この組換え遺伝子物質を有する微生物、およびそのような微生物をＬ−カルニチン生産の微生物学的プロセスに使用することに関する。
Ｌ−カルニチンは天然のビタミン類似物質であって、人間の代謝にきわめて重要である。脂肪酸の利用において、Ｌ−カルニチンはミトコンドリア膜を通過させる物質として、またそれによって代謝エネルギーを輸送するものとして、不可欠である。Ｌ−カルニチンが生体内で適切な量生産されなければ、その欠乏症を避けるために、食品中に添加しなければならない。とくに幼児の食品には、幼児は未だ自身でＬ−カルニチンを生合成することができないので、Ｌ−カルニチンは不可欠な栄養素である。
Ｌ−カルニチン製剤は、医薬製品においても活性成分として使用される。Ｌ−カルニチンの補給は、カルニチン欠乏の場合、およびその他の治療上の指示に従って、とくに心臓の不調などの場合に処方される。
高等な生物体内でのＬ−カルニチンの生合成は知られていて、代謝のさらなる機能および重要性が、積極的な研究活動の対象になっている。微生物とくにシュードモナス層に関して記述されている代謝経路（γ−ブチロベタインヒドロキシラーゼ触媒作用、リンデシュテットほか、Biochemistry １６，2181-2188，１９７７）に加えて、Ｌ−カルニチンは、ある種の微生物たとえばアグロバテリウム／リゾビウムＳＰ．の代謝中間生産物として形成される。
ＥＰ−Ａ−０１５８１９４は、Ｌ−カルニチンの微生物学的生産であって、たとえばγ−ブチロベタインから出発して、伝統的な微生物学的選択方法によってＬ−カルニチルデヒドロゲナーゼ陰性の生産変異種を得、それを使用して、相対的によいＬ−カルニチン収量が２０〜３０時間の反応時間内に得られる方法を開示している。容積／時間収率に関してこの方法をさらに最適化することは、しかし、この古典的な微生物学的方法による限り不可能である。
それゆえ、本発明の目的は、Ｌ−カルニチン生産のより経済的なバイオ技術的方法であって、Ｌ−カルニチンが顕著に短い反応時間で、かつ、むしろよりよい収率をもって得られる方法を提供することにある。
γ−ブチルロベタイン／クロトノベタイン代謝に関する研究の結果、５種の遺伝子が同定されるに至った。すなわちｂｃｏＡ，ｂｃｏＣ，ｂｃｏＤ，ｂｃｏＥおよびｂｃｏＴであって、これらγ−ブチロベタイン／クロトノベタイン代謝経路の酵素類をコードし、とくに、いわゆるブチロベタイン−Ｌ−カルニチンオペロン（ｂｃｏ）と呼ばれるオペロン中に含まれている。この関連において、略号は下記の意味を有する。
ｂｃｏＡ／Ｂ：γ−ブチロベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼ（ｂｏｃＡ）／クロトノベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼ（ｂｃｏＢ）、すなわち、γ−ブチロベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼ活性およびクロトノベタイン−ＣｏＡ−シセンターゼ活性の両方を有する酵素生産物をコードする唯一の遺伝子、
ｂｃｏＣ：γ−クロトノベタイン−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、
ｂｃｏＤ：クロトノベタイン−ＣｏＡヒドラーゼ遺伝子、
ｂｃｏＥ：Ｌ−カルニチルデヒドロゲナーゼ遺伝子、そして
ｂｃｏＴ：輸送システムのポテンシャル遺伝子。
遺伝子ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣおよびｂｃｏＤの遺伝子生産物はＬ−カルニチンの生合成に関連するが、一方、ｂｃｏＥは、代謝中間生成物Ｌ−カルニチル−ＣｏＡのベタインへの分解をひきおこすカルニチンデヒドロゲナーゼをコードし、ｂｃｏＴは、ブチロベタイン代謝に割り当てられた輸送システムの輸送タンパク質をコードすると推測されている。この遺伝子は、Ｌ−カルニチン生合成に不可欠なものではない。
本発明は従って、γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン代謝におけるＬ−カルニチン生合成のための酵素類をコードする遺伝子、ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／ＢおよびｂｃｏＤの１種または２種以上からなるＤＮＡ断片およびベクターに関し、場合によっては、さらにポテンシャル輸送遺伝子ｂｃｏＴにも関する。
本発明はさらに、これらＤＮＡ断片および（または）ベクターを含有する微生物にも関する。本発明はまた、本発明の微生物を使用するＬ−カルニチン生産のバイオ技術的方法に関する。
本明細書および請求の範囲中で使用されるｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴの表示は、定義されたように、野生種の生物のもつ遺伝子であって上記した酵素活性を有するγ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝の酵素をコードするもの、とくにブチロベタイン−Ｌ−カルニチン（ｂｃｏ）オペロンと、その機能的に同様な遺伝子的変種すなわち、野生種の生物の遺伝子から誘導され、その遺伝子生産物が生物学的機能に関しては本質的に変化を受けていないものとの、両方から成る。機能的に同等な遺伝子的変種および突然変異種は、このようにして、たとえば遺伝子コードの既知のデジェネレーションとの関連における塩基変換、たとえば人工的な遺伝子配列を、発現を生じさせるべきある種の微生物の好ましいコドン使用に適合させるために、生産することができる。変種および突然変異種は、さらに、塩基またはコドンの削除、挿入および置換を、このようにして変性させられた遺伝子の遺伝子生産物を、生物学的機能に関しては本質的に変化させない程度に止めておいたものを包含する。ここで包含されるのは、たとえば、野生種の配列に対して高度の、たとえば７０％を超える均一性を有し、野生種の配列の補体とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、たとえば５０〜７０℃の温度および０．５〜１．５モルの塩濃度において、ハイブリッド形成可能な遺伝子配列である。
ここで使用される転写ユニットの語は、遺伝子がひとつの転写方向に配置され、ふつうの転写コントロール下に中断されない転写として転写されるようなＤＮＡ配列をするものと理解されるべきであり、遺伝子に加えてＤＮＡ配列とは、追加的に遺伝子発現に必要な遺伝子コントロール要素、たとえばプロモーターおよび染色体固定サイトを有するものである。
本発明は、下記の図面により、より詳細に説明される。
図１は、γ−ブチロベタインまたはクロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝径路における酵素を示す。
図２は、ｂｃｏオペロンを有するリゾビウム／アグロバクテリウムからの１０．６kbのＤＮＡ断片の制限地図を示す。
図３および図４は、プラスミドｐＶＫ１０１１およびｐＡＺ１０１を示し、矢印はｂｃｏ遺伝子およびｂｅｕ遺伝子（ベタイン利用遺伝子：ＥＰ−Ａ−０５４３３４４）の位置および方向を示す。
図５は、ｒｅｃＡ⁻宿主株の生産のための出発物質と考えられる、プラスミドｐＣＣ４９を示す。
図６は、プラスミドｐＶＫ１０１１，ｐＡＺ１０１，ｐＶＫ１００ｑおよびｐＡＺ７の構成スキームを示す。
図７は、ｒｅｃＡ⁻宿主株の構成スキームを示す。
γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝径路における遺伝子ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴを単離するために使用される出発物質としては、ブチロベタインおよび（または）クロトノベタインを図１に従って代謝するすべての微生物を使用することができる。適当な株は、エシェリチア、シュードモナス、アグロバクテリウム、リゾビウムおよびアグロバクテリウム／リゾビウム属の微生物であって、最後のものが好ましい。アグロバクテリウム／リゾビウム属の好ましい微生物の例は、アグロバクテリウム／リゾビウムｓｐ．ＨＫ４（ＤＳＭ２９３８）株であって、これに関してはＥＰ−Ａ−０１５８１９４に記述されている。これらの微生物はとくに好適に使用され、カルニチンデヒトロゲナーゼ陰性、すなわち、たとえばｂｃｏＥ遺伝子を有しないか、または欠陥のあるｂｃｏＥ遺伝子（以下、ｂｃｏＥ′とも記す）しか有しないものである。カルニチンデヒドロゲナーゼ陰性の好ましい微生物の例は、すでにＥＰ−Ａ−０１５８１９４に記述されているアグロバクテリウム／リゾビウムｓｐ．ＨＫ１３Ｃ（ＤＳＭ２９０３）種およびＨＫ１３３１ｂ（ＤＳＭ３２２５）種、またはＥＰ−Ａ−０５４３３４４に記述されているアグロバクテリウム／リゾビウムｓｐ．ＨＫ１３４９（ＤＳＭ３９４４）種である。
γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝の遺伝子ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴは、微生物の染色体中で、微生物を、トランスポゾン挿入変異処理し、それによってγ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝の遺伝子を、適宜のラベルたとえばカナマイシン（Ｋｍ）耐性ラベルを用いて標識づけすることによって、局在化させることができる。このようにしてラベルをつけられた、ブチロベタイン代謝の中間体としてはもはや使用できない突然変異種は、ついで単離することができる。このようにして、γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−Ｌ−カルニチン代謝の遺伝子をその機能に関して同定し、関連づけることができる。標識づけされた遺伝子は、ついでクローンをつくり、適当な制限酵素を使用してさらに詳細に特徴づけることができる。完全な遺伝子または本発明に従うＤＮＡ断片の単離は、ついで、対応する非変異種微生物の遺伝子バンクから出発して行なうことができ、その微生物からｂｃｏ遺伝子またはその断片を単離して、既知の方法よりクローン化して得た、上記の突然変異した株の遺伝子とハイブリダイゼーションすることにより、単離して同定することができる。得られた遺伝子は、続いて所望のベクター中にクローン化し、制限酵素の助けを借りて制限地図に描くことができる。
遺伝子ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣおよびｂｃｏＤだけが、Ｌ−カルニチンの生合成に関与する。従って、これら遺伝子の存在だけがＬ−カルニチンの生産にとって必要である。選択した出発条件たとえば選択した出発原料または選択した生産株によって、Ｌ−カルニチン生産に使用したＤＮＡ断片およびベクターは、１種または２種以上のＬ−カルニチン生合成の遺伝子を含有することができる。
遺伝子ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＣおよびｂｃｏＤに加えて、本発明に従うＤＮＡ断片およびベクターは、所望であれば、ポテンシャル輸送遺伝子ｂｃｏＴを含むことができる。
Ｌ−カルニチルデヒドロゲナーゼ遺伝子すなわちｂｃｏＥ遺伝子の存在は、望ましくない。というのは、その存在下にＬ−カルニチンの分解が生じるからである。しかし、欠陥のあるｂｃｏＥ（ｂｃｏＥ′）の存在は、無害である。
好都合なことに、Ｌ−カルニチンの生産に使用するためのＬ−カルニチン生合成の遺伝子、すなわちｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／ＢおよびｂｃｏＤ、そして場合によってはポテンシャル輸送遺伝子ｂｃｏＴは、１個のＤＮＡ断片またはベクター分子中に共に存在する。たとえば、好ましくは、遺伝子制御要素から常用の５′−３′−方向の下流において、ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／ＢおよびｂｃｏＤの配列、またはｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴの配列であって、天然に生じるブチロベタイン−Ｌ−カルニチンオペロンの配置に対応する、上記した単一転写ユニット中に存在する。このような転写ユニット中の遺伝子ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴは、たとえば、図２の制限地図の対応するセクションによって特徴づけられる。
ｂｃｏ遺伝子の転写または発現は、適宜の、好ましくは協力なプロモーターのコントロールの下で好都合に起る。プロモーターの選択は所望の発現条件に依存し、たとえば、本質的なまたは誘起された発現が望ましいか否かによって、あるいは発現を起すべき微生物の種類によって異なる。適切なプロモーターは、たとえば天然のブチロベタイン−Ｌ−カルニチンオペロンのプロモーターＰ_bcoである。Ｌ−カルニチン生合成に関与するｂｃｏ遺伝子の単離を行なう場合は、たとえば、欠陥のあるｂｃｏＥ（ｂｃｏＥ′）遺伝子を有する微生物から、有利にはたとえば全ｂｃｏオペロンを単離してｂｃｏＥ′遺伝子およびこれらの微生物からの関連する遺伝子制御要素のクローンをつくることができ、ついで、適当な微生物中でＬ−カルニチン生産に利用することができる。変異されたｂｃｏＥ遺伝子を有するこの種の転写ユニット、たとえばリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９から単離されるようなものは、場合によっては、すなわちｂｃｏＥの欠陥が、たとえばポイント変異にだけ帰せられ、制限分解サイトには関係がないのであれば、図２に示した制限地図によって特徴づけられるものであってもよい。発現に適当なプロモーターの別の例は、たとえば、プロモーターＰ_Nm′．Ｐ_S1（Ｍ．Ｌａｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，37-46，１９９０）、ｔｒｐプロモータ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５，167-178，１９８３）、ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５，167-178，１９８３）およびｔａｃプロモータ、上記ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッドであって、本質的な、または誘起されたプロモーター（ＲｕｓｓｅｌｌおよびＢｅｎｎｅｔｔ，Ｇｅｎｅ，２０，231-243，１９８２）として使用することができる。
Ｌ−カルニチン生産に使用するための適当な生産株の中で、本発明に従う、前記ｂｃｏ遺伝子を包含するＤＮＡ断片は、好ましくは単一の転写ユニットとともに、既知の技術の助けを借りて好都合に既知の適当なベクター中に、とりわけ発現ベクターたとえばファージまたはプラスミド中に組み込まれる。使用するベクターは、自律的かつ自己複製的ベクターであってもよいし、あるいはまた、いわゆるインテグレーションベクターであってもよい。インテグレーションベクターは、この関連において、たとえば、受容株のゲノム配列に相同の配列を少なくとも１個もち、この配列に相同的な組換えによって外来の遺伝子の受容株のゲノム中への挿入を許すようなプラスミドを意味するものと解すべきである。自律的かつ自己複製的ベクターが好ましく使用される。
選択されるベクターの特性によって、Ｌ−カルニチン生合成の酵素のための遺伝子を、種々の生物体内で発現させることができる。適当なベクター特定の宿主スペクトルを有するベクターと、広い宿主スペクトル（広い宿主範囲）を有するベクターのどちらでも、また前記した集積ベクターのいずれでもよい。
使用される広い宿主範囲のベクターは、グラム陰性の細菌に適するすべてのベクターであることができる。そのような広い宿主範囲のベクターの例は、ｐＶＫ１００（ＫｎａｕｆおよびＮｅｓｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ，８，45-54，１９８２）、ｐＭＥ２８５（ＨａａｓおよびＩｔｏｈ，Ｇｅｎｅ，３６，27-36，１９８５）およびｐＫＴ２４０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５，273-282，１９８３）またはこれらの誘導体である。使用されるｐＶＫ１００の誘導体は、たとえば、ｐＶＫ１００１であることができ、使用されるｐＭＥ２８５の誘導体は、たとえばｐＡＺ１０であることができ、使用されるｐＫＴ２４０の誘導体は、たとえばｐＬＯ３２（すでにＥｐ−Ａ−０５４３３４４に記述されている）であることができる。
リゾビウム／アグロバクテリウムの場合に使用される集積ベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４またはｐＢＲ３２２（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１０，21-30，１９８３）にもとづくベクターであることができる。
このようにして、たとえばプラスミドｐＶＫ１００ｑ，ｐＶＫ１０１１（図３），ｐＡＺ７，ｐＡＺ７：：ｂｅｕ，ｐＡＺ１０１（図４）およびｐＬＯ４１が得られる。プラスミドｐＶＫ１００ｑは、１９９３年１１月１６日に、ドイツチェン・ザンメルグ・フュア・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・Ｇm ｂＨ Ｄ−３８１２４ ブラウンシュヴァイク・マシェローダヴェク１ｂに、リゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９中に、寄託番号ＤＳＭ８７２６として寄託されている。
発酵のための生産株すなわちＬ−カルニチン生産株の生産のためにf
、本発明に従うＤＮＡ断片またはベクターを、所望であり、かつ発現に適当な宿主株の中に取り込まなければならない。この目的のために、常用されているそれ自体は既知の手法で、本発明に従うＤＮＡ断片を含有するベクターを使用して、好都合に微生物が形質転換される。そうすると微生物は、本発明に従うＤＮＡ断片を、ベクター分子上またはその染色体中に集積して含む。
適当な生産株は、Ｌ−カルニチンをクロトノベタインおよび（または）γ−ブチロベタインから生産することができ、そのＬ−カルニチン分解（代謝分解）の能力が完全に、または部分的に抑制されたもののすべてである。Ｌ−カルニチン代謝分解が抑制されている微生物は、たとえば、カルニチンデヒドゲナーゼ陰性の菌株、つまりその中のカルニチンデヒドロゲナーゼ遺伝子ｂｃｏＥが、たとえば突然変異や削除によってスイッチオフされている菌株、および（または）Ｌ，Ｄ−カルニチンラセマーゼ陰性であってＬ−カルニチンデヒドロラターゼ陰性である菌株である。
適当な宿主菌株は、好ましくは高い基質および出発物質許容度をもつものであって、たとえば、エシェリチア、シュードモナス、アグロバクテリウム、リゾビウム、コマモナスおよびリゾビウム／アグロバクテリウム属の微生物であり、最後のものが好ましい。すでに記述したリゾビウム／アグロバクテリウムｓｐ．種の微生物ＨＸ１３，ＨＫ１３３１ｂおよびＨＫ１３４９、ならびに、ＨＫ１３４９、４種（ＥＰ−Ａ−０５４３３４４に記述されている）がとくに好適である。
Ｌ−カルニチンの収量が、組換えのための宿主菌株の能力すなわちその組換え傾向および組換え頻度が減少すると、さらに改善できることが、上記に続いて判明した。染色体相同性にもとづいてベクターとの組換えが、それによって制限される。宿主菌株の組換え能力は、たとえば既知の方法でそのｒｅｃＡ遺伝子を特定的に変異（ｒｅｃＡ突然変異）させることによって、減少させることができる。その組換え能力を低下させたとくに好ましい微生物は、リゾビウム／アグロバクテリウムｓｐ．種、たとえば本発明に従って前記のようにして得られるリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９．４９株である。
適当な生産株は、このようにして、たとえばリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９，ＨＫ１３４９．９およびＨＫ１３４９．４９種であり、いずれも、プラスミドｐＶＫ１００ｑ，ｐＶＫ１００１，ｐＡＺ７，ｐＡＺ：：ｂｅｕ，ｐＡＺ１０１またはｐＬＯ４１を含有するものである。
形質転換された宿主菌株（生産菌株）は、ベクターまたはＤＮＡ断片上に位置するマーカー遺伝子に起因して菌株がそれに対して耐性をもつ抗生物質を添加した、選択的栄養培地から単離される。ＥＰ−Ａ−０５４３３４４に従う微生物を生産菌株として使用するとき、すなわちベタイン利用のための染色体遺伝子コーディングが変異を受け、ベタイン利用のための遺伝子コーディングを含むプラスミドと形質転換を受けている微生物もまた、ベタイン利用に関して選択使用することができる。ベタイン利用に関して選択可能な微生物の例は、すでに述べたＨＫ１３４９．４およびＨＫ１３４９．４９であって、これらは、たとえばプラスミドｐＬＯ４１，ｐＡＺ１０１，ｐＡＺ７：：ｂｅｕまたはｐＶＫ１０１１を含有する。
Ｌ−カルニチンのバイオ技術による生産は、本発明に従うＤＮＡ断片またはベクターを含有する微生物を利用して実施する。Ｌ−カルニチンの製造方法は、それ自体は既知の、たとえばＥＰ−Ａ−０１５８１９４に記述された方法で、たとえばγ−ブチロベタインから出発して、適当な炭素源および窒素源の存在下に実施する。使用できる炭素源および窒素源は、たとえば、グルタミン酸塩、酢酸塩およびベタイン、またはグリセリンおよびベタインである。バイオ技術による生産がベタイン利用に関して選択可能な微生物を手段とするならば、ベタインが唯一の窒素源として利用される。
培養およびそれに続くＬ−カルニチンの単離は、ＥＰ−Ａ−０１５８１９４に記述された方法と同様な方法によって実施できる。
既存の手法において、培地中の栄養素を変更することによって、また培養条件を個々の微生物に適合させることによって、Ｌ−カルニチンの収量は、さらに改善することができる。
実施例１
トランスポゾン挿入突然変異種（Ｔｎ５）の生産およびその表現形的同定
野生種のリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ４株（ＤＳＭ２９３８，ＥＰ−Ｂ−０１５８１９４）を選択圧力により突発的に変異させ、ストレプトマイシン（Ｓｍ，１０００μｇ／ml）耐性をもたせた。この耐性は、選択を行なわなくても５０世代にわたって明らかに安定であり、選択マーカーとして利用された。
Ｅ．コリＳ１７−１／ｐＳＵＰ２０２１（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８３，１，784-790）のＴｓＳドナー培養物０．２mlを、受容体培養物ＨＫ４の２mlと混合し、遠心分離にかけた。細胞を０．９％塩水（ＮａＣｌ溶液）で洗い、０．９塩水１００μｌ中に再懸濁させた。受容体菌株とドナー菌株との接合を、一夜、３０℃において乾いた栄養寒天の上で行なった。収穫された細胞は、受容体（Ｓｍ^Ｒ）およびトランスポゾン（ネオマイシン耐性（Ｎｍ^Ｒ））のための選択媒体上に稀釈してのせた。
Ｔｎ⁵変異体を、栄養寒天上で、Ｓｍ（１０００μｇ／ml）およびＮｎ（１００μｇ／ml）を使用して得た。突然変異種の表現形上の同定を、図１に従ってブチロベタイン代謝中間生産物を最小限培地中の炭素（Ｃ）源としての不利用を検知することによって行なった。
実施例２
Ｔｎ⁵で標識をつけたＤＮＡ断片のＨＫ４ゲノムからのクローニング
Ｔｎ⁵変異を行なったＨＫ４（５μｇ)から単離されたゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ（４Ｕ／μｇ）で完全に消化した。ｐＢＲ３２５（２．５μｇ）（Ｇｅｎｅ，１９７７，２，95-115）を、ＥｃｏＲＩによる完全な消化ののち、アルカリ性のフォスファターゼで処理した。ゲノムＤＮＡおよびｐＢＲ３２５をＴ４−ＤＮＡリガーゼをＴ４−ＤＮＡ４００μｌのリゲーション緩衝液（２０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ７．２、１０ｍＭ−ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、０．６ｍＭ−ＡＴＰ）中のリガーゼ（０．２Ｕ／μｇＤＮＡ）と混合したのち、組換えハイブリッドプラスミドが得られた。
接合混合物をいくつかに分けたものを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＤ８６５４（Ｂａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．，１４５，199-207，１９７６）の形質転換に使用した（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２，ＰＮＡＳ，６９，2110-2114）。トランスフォーマントは、栄養培地中でアンピシリン（Ａｐ，１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（Ｋｍ，２５μｇ／ml）に対する耐性によって選択された。選択されたハイブリッドプラスミドはすべて、Ｔｎ５で標識されたＨＫ４挿入部を担持していた。挿入部は、図２の制限地図に対応して、種々の制限酵素によって地図化された。制限地図の比較から、種々の表現形を有するＴｎ５突然変異種のシリーズにおける同じゲノム断片中へのトランスポゾン挿入を確認した。
この観察結果を、同一に解裂したプラスミドＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション（“Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ”「遺伝子工学の方法」Ｓ．ＢｅｒｔｒａｍおよびＨ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ編、Ｇ．Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９１，219ｆ）、およびそれに続く電気泳動分離によって確認することができた。使用したプローブは、トランスポゾン突然変異種からクローン化したＤＮＡのサブ断片である。
実施例３
ラムダファージ中のゲノムＨＫ４遺伝子バンクの構成
ＤＮＡがラダムファージ中に包まれるためには、４０〜５２kbのサイズと「コスサイト」が必要である。ゲノムＨＫ４遺伝子バンクをラムダファージ中に構成するために、コスミドベクターｐＶＫ１００（ＫｎａｕｆおよびＮｅｓｔｅｒ，１９８２，Ｐｌａｓｍｉｄ，８，45-54）を使用した。これはサイズ２３kbであり、従って１７〜２９kbの間のＤＮＡ断片のクローニングを可能にする。
ｐＶＫ１００をＥｃｏＲＩと消化し、デフォスフォリレートしてから、部分的にＥｃｏＲＩと消化したＨＫ４ＤＮＡに接合した。ＨＫ４ＤＮＡの部分的消化のための理論的ＥｃｏＲＩ濃度は、ＤＮＡ０．５８Ｕ／μｇまたは反応混合物０．０２Ｕ／μｇとして試験消化の手段によって決定された。ＨＫ４ＤＮＡの８．５μｇを反応混合物中で使用した。１７kbより大きいサイズ範囲のＤＮＡ断片は、アガロース電気泳動ゲルから分離した。接合は、１００ngのコスミドベクターと４００ngのパッセンジャーＤＮＡとを含有する１０μｌの容積の中で行なった。ついで「インビトロ・パッケージング」を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の混合物中で、製造業者の定めた手順に従って、２時間にわたり、２５℃で実施した。ＥｃｏＲＩ Ｓ１７−１のトランスフェクションの後、コスミドベクターのＫｍ耐性に関して選別を行なった。１バッチを使用して、約５５００のコロニー（個々のクローン）が得られた。この遺伝子バンクのコロニーを冷凍媒体（栄養イーストブロス、ＮＹＢ、オキソイドおよび５０％グリセリン）中に入れた各１０００クローンほどのバッチ５箇に分け、−７０℃で貯蔵した。この遺伝子バンクの増殖を、各バッチの５０μｇを使用して、ＮＹＢ１０ml中で一夜培養し分画することによって行なった。
実施例４
ＨＫ４コスミド遺伝子バンクのスクリーニング、ｂｃｏ遺伝子担持コスミドクローンのＨＫ突然変異種のコロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションまたは直接相補による同定
クローニングされたＴｎ５標識をもつＤＮＡ断片を、直接ハイブリダイゼーションのプローブとして使用することが可能であった。
適切なＤＮＡ配列を有するクローンはハイブリダイゼーション信号を出し、ＨＫ４突然変異種の各場合において、欠陥のある遺伝子の相補に導いた。種々の突然変異種からのＤＮＡのクロスハイブリダイゼーションが、１０．６kbのＤＮＡ断片（図２）上におけるブチロベタイン代謝遺伝子の、若干の「クラスタリング」を裏付けた。
コロニーハイブリダイゼーションは、常法（Ｓ．ＢｅｒｔｒａｍおよびＨ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ，１９９１，ｉｂｉｄ，211ｆ）に従って実施した。ドットブロッティングも、既知の方法（Ｓ．ＢｅｒｔｒａｎおよびＨ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ，１９９１，ｉｂｉｄ，217ｆ）に従って実施した。
実施例５
ＨＫ突然変異種の相補
固定されたペプチド鎖にもとづく分子サイズを考慮に入れてブチロベタイン代謝の個々の遺伝子の正確な局在化を行なったのち、個々の突然変異種の特定の遺伝子セクションによる相補を行なうことができた。
特定の発現プラスミドｐＶＫ１００：：ＨＫ−ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１のリゾビウム／アグロバクテリウムｓｐ．ＨＫ４株への、実施例１に従う接合を経由して一体化した。この株は、異なる代謝段階（図１参照）のための突然変異を含んでいる。ドナーのプロリン（ｐｒｏ）要求性およびベクターの抗生物質耐性（Ｋｍ^ＲＴＣ「テトラサイクリン^Ｒ」）にもとづいて、選別を行なった。
実施例６
６．１ ＨＫ１３４９（ＤＳＭ３９９４）およびその誘導体からのｂｃｏ断片のクローニング
生産菌株の遺伝子供給量効果および生産性の向上を達成するため、ＨＫ１３４９（ＤＳＭ ３９４４，ＥＰ−Ａ−０５４３３４）からのｂｃｏオペロンのクローニングを行なった。この菌株においては、全ｂｃｏオペロンが完全な形で含有されているが、カルニチン−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼのための第一の遺伝子ｂｃｏＥが変異を受けている。ｂｃｏオペロンを有し、この株から得られたＤＮＡ断片は、このようなわけで、発現ベクターの複写数が多いという点で、生産性向上にとって理想的である。
クローニングは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１において、ＥＰ−Ａ−０５４３３４４の実施例３に対応する既知の方法に従って実施した。この目的のために、１０．６kbのｂｃｏオペロンをＨＫ１３４９遺伝子バンクから単離し、ｐＶＫ１００中にリゲーションした。その結果、プラスミドｐＶＫ１００ｑ（図６のスキーム参照）が得られた。選別を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１中で、ＮＹＢ Ｋｍ（２５μｇ／ml）上で実施した。挿入の正しさは、ＨＫ突然変異種に関して、実施例５に記載した方法に従って同定した。ＨＫ１３４９からのＥｃｏＲＩ−開裂ＤＮＡを電気泳動的に分離し、サイズ範囲１．６kbの断片をゲルから単離した。単離した断片をＥｃｏＲＩ−開裂ｐＶＫ１００中にリゲーションした。
このハイブリッドプラスミド混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−Ｉ（プロリン要求性）を形質転換し、栄養寒天Ｋｍ（２５μｇ／ml）上で選別した。ベクターからのハイブリッドプラスミドクローンおよびサイズ１０．６kbのｂｃｏオペロンを担持するＤＮＡ断片を、「パッチ・マッチング」法により、ブチロベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼ陰性突然変異種（ＨＫ４Ｖ４）上、Ｃ源およびＮ源として０．２％（ｗ／ｖ）のブチロベタインを含有する最小限培地上で同定した。正確なクローンは、このタイプを突然変異種中に接合的転移の後、このＣ源を利用して細胞を相補する能力があった。このようにして同定されたクローンｐＶＫ１００ｑは、直接、生産プラスミドとして、またはさらなるサブクローニングのためのｂｃｏオペロンを有するＤＮＡ断片のリザーバーとして使用された。
６．２ ｐＡＺ１０１，ｐＡＺ７，ｐＶＫ１０１１およびｐＶＫ１００ｑ，ｐＬＯ４１およびｐＡＺ７：：ｂｅｕの構成
ｐＡＺ１０１，ｐＡＺ７，ｐＶＫ１０１１およびｐＶＫ１００ｑを、図６の構成スキームに従って構成した。ｐＬＯ４１は、ｐＬＯ３２（ＥＰ−Ａ−０５４３３４４）から出発してｂｃｏ遺伝子（１０．６kb ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片）の挿入により、またプラスミドｐＡＺ７：：ｂｅｕはｐＡＺ７（図６）から出発してｂｅｕ遺伝子（３kbサイズ、ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩ−断片、ＥＰ−Ａ−０５４３３４４）の挿入により、それぞれ構成した。対応する制限酵素は、ＤＮＡ３〜５Ｕ／μｇとともに、製造者の指示に従って使用した。プラスミドｐＶＫ１００ｑはｂｃｏ遺伝子をｐＶＫ１００（ＫｎａｕｆおよびＮｅｓｔｅｒ，ｉｂｉｄ）中に挿入することにより得られた。出発プラスミドｐＶＫ１００ｓ１（構成スキームは図６）は、ＥｃｏＲＩプラスミドｐＶＫ１００ｓ（ＥＰ−Ａ−０５４３３４４）の削除クローニングによって得た。
実施例７
ｒｅｃＡ変異のＨＫ１３４９．４への導入
７．１ ｒｅｃＡをコードする遺伝子バンククローンの同定
ゲノムＨＫ４コスミド遺伝子バンク中に、コロニーハイブリダイゼーション法（Ｓ．ＢｅｒｔｒａｍおよびＨ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ，１９９１，ｉｂｉｄ，221f）の助けを借りて、ｒｅｃＡ−エンコーディングクローンを採取した。ハイブリダイゼーションに使用したプローブは、リゾビウムレグミノサルム（leguminosarum）（Ｗ．Ｓｅｌｂｉｔｓｃｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２９９，１９９１，86-95）からのクローンされたｒｅｃＡ遺伝子である。標識をつけたコスミドクローンを単離し、ＥｃｏＲＩ消化後得られたＥｃｏＲＩＤＮＡ挿入断片を対象に、ｒｅｃＡ相同性配列をｒｅｃＡプローブ（Ｓ．ＢｅｒｔｒａｍおよびＨ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ，１９９１，ｉｂｉｄ，219f）に対するサザンブロットハイブリダイゼーションによって探索した。このようにして標識をつけられたＥｃｏＲＩ断片は、同じ程度まで開裂されたベクターｐＶＫ１００中にリゲーションされた。得られたハイブリッドプラスミドｐＶＫ１００ｒｌ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１細胞を、ＤＮＡ複製のために形質転換した。
７．２ 染色体ｒｅｃＡ遺伝子の不活性化のための、カナマイシン耐性遺伝子のＨ Ｋ１３４９．４への導入
ＥｃｏＲＩ断片のサイズ１１．０kbのものを、ｐＶＫ１００rｌからｐＡＣＹＣ１８４（Ａ．Ｃ．Ｙ．ＣｈａｎｇおよびＳ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４，１９７８，1141-1156）のＥｃｏＲＩとともに開裂させたものの中に再クローンした。
所定の制限地図に対応して、ＢｇｌII−ＮｒｕＩ開裂サブ断片で、サイズ３．１kb、ｒｅｃＡプローブに対してサザンブロットハイブリダイゼーションで標識をつけたものを、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII開裂をしたベクターｐＷＳ２３３中にクローニングした。ｐＷＳ２３３は「遺伝子置換え」ベクターであって、Ｗ．Ｓｅｌｂｉｔｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８，１９９３，615-618に記述されている。
Ｔｎ５（ｐＳＵＰ２０２１，Ｒ．Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１，１９８３，ｉｂｉｄ）からの、Ｋｍ耐性をコードしたＸｈｏＩ−ＤＮＡ断片を、得られたプラスミドｐＣＣ４５のＸｈｏＩ開裂サイトへクローニングした。その結果、ｐＣＣ４９が生じた。Ｗ．Ｓｅｌｂｉｔｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ｉｂｉｄの方法と同様にして、「遺伝子の置換え」を、つぎのように実施した。
エクスポネンシャルＨＫ１３４９．４培養物３mlをエクスポネンシャルドナー培養物（Ｓ１７−１／ｐＣＣ４９）1mlと合わせ、遠心分離にかけて、０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄した。細胞を３０℃で、ＮＹＢ５０μｌ中、栄養寒天上で一夜、インキュベータ中に置いた。０．９％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁した細胞を、適宜の稀釈度で選択媒体に適用した。Ｓｍ耐性受容体ＨＫ１３４９．４のトランス接合体が、Ｓｍ（１０００μｇ／ml）およびＮｍ（１５０μｇ／ml）を使用して栄養寒天上に得られ、「置換え」ベクター上の遺伝子ｓａｃＲＥに対応する５％シュクロース感受性が複合媒体中で認められた。
トランス接合体を栄養寒天上で選択圧力を加えることなく培養した後、二重組換えが低い頻度（１０^-8）で生じた。約一週間後、媒体中で５％シュクロース許容性をもち、Ｎｍ耐性は保存したがゲンタマイシン（Ｇｍ）感受性（ベクターマーカー）を再びもつに至った細胞を単離することができた。
この表現形は、対立遺伝子マーカー交換を確認するものであり、ＨＫ１３４９．４のｒｅｃＡ変異を示すものである。ｒｅｃＡ突然変異種が典型的にもつ表現形（たとえばＵＶ感受性）を観察することができる。
このようにして得たＨＫ１３４９．４９株において、相同的配置（相同的組換え）をもったプラスミドの染色体組込みの傾向は、明瞭に減少した。この菌株はそれゆえ、実施例６．２に示したハイブリッドプラスミドにとって、高度に適切な宿主である。
実施例８
バイオ形質転換
バイオ形質転換を、振動フラスコ（１００ml）中、Ｎを含まず、０．２％（ｗ／ｖ）のγ−ブチロベタイン（出発物質）を含有し、Ｃ源として０．４％（ｗ／ｖ）のグリセリンを含有する最少限媒体（ＭＭ：Ｋｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８３，１３５，pp.1-7）を使用して行なった。Ｎ源および追加的なＣ源として、０．２％（ｗ／ｖ）のＬ−グルタミン酸塩（ベタイン利用に関して陰性の菌株に対し）、または０．２％（ｗ／ｖ）のベタインを添加した。
本発明に従って使用した生産株は、ＨＫ１３４９．４／ｐＬＯ４１，ＨＫ１３４９．４／ｐＶＫ１０１１，ＨＫ１３４９．４／ｐＡＺ７：：ｂｅｕ，ＨＫ１３４９．４／ｐＡＺ１０１，ＨＫ１３４９／ｐＶＫ１００ｑおよびＨＫ１３４９／ｐＡＺ７である。
結果を、ＥＰ−Ａ−０５４３３４４により既知であるＨＫ１３の誘導体ＨＫ１３４９（ＤＳＭ ３９４４）およびＨＫ１３４９．４と比較して、表１にまとめて示す。
γ−ブチロベタインからのＬ−カルニチンの生成は、ＤＴＮＢ（５，５′−ジチオビス（２−ニトロベンソエート））法（Ｈ．Ｋ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，１９９４，『酵素分析の方法』“Ｍｅｔｈｏｄｅｕ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａｆｉｓｃｈｅｎ Ａｒａｌｙｓｅ”フェアラーク・ヒエミー，ヴァインハイム，1810ｆに記載）に従って行なった。

Claims (17)

1. Ｌ−カルニチンの生合成のための遺伝子ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／ＢおよびｂｃｏＤの１種または２種以上からなる分離されたＤＮＡ断片であって、γ−ブチロベタイン−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（ｂｃｏＣ）、γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼ（ｂｃｏＡ／Ｂ）またはクロトノベタイン−ＣｏＡ−ヒドロラーゼ（ｂｃｏＤ）をコードするものであり、下記から選ばれたものであるＤＮＡ断片：
   ａ）寄託番号ＤＳＭ８２７６として寄託されたリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９中のプラスミドｐＶＫ１００ｑ中に挿入された１０．６ｋｂＥｃｏＲＩ断片、および
   ｂ）上記１０．６ｋｂＥｃｏＲＩ断片を混合し、γ−ブチロベタイン−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ、γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン−ＣｏＡ−シンセターゼおよび（または）クロトノベタイン−ＣｏＡ−ヒドロラーゼの活性を有する酵素をコードする断片。
2. γ−ブチロベタイン／クロトノベタイン代謝に割り当てられ、ポテンシャル輸送蛋白質をコードする遺伝子ｂｃｏＴを付加的に有する請求の範囲第１項のＤＮＡ断片。
3. 遺伝子ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＤおよび場合によってはｂｃｏＴが、エシエリチア、シュードモナス、アグロバクテリウム、リゾビウムおよびリゾビウム／アグロバクテリウム属の微生物から誘導されたものである請求の範囲第１項または第２項のいずれかのＤＮＡ断片。
4. 遺伝子が、発現に必要な遺伝子コントロール要素と操作的に結合されている請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかのＤＮＡ断片。
5. Ｌ−カルニチン生合成の遺伝子が、ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／ＢおよびｂｃｏＤの順に配列され、単一転写ユニットとして存在する請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかのＤＮＡ断片。
6. Ｌ−カルニチン生合成の遺伝子が、ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴの順に配列され、単一転写ユニットとして存在する請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかのＤＮＡ断片。
7. 遺伝子制御要素が、天然のｂｃｏオペロンのプロモーターＰ_bcoからなる請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかのＤＮＡ断片。
8. 遺伝子ｂｃｏＣ，ｂｃｏＡ／Ｂ，ｂｃｏＤおよびｂｃｏＴが、下記の制限地図によって特徴づけられるものである請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかのＤＮＡ断片。
   

   
9. 請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかによるＤＮＡ断片からなるベクター。
10. 寄託番号ＤＳＭ８７２６をもって寄託されたリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９内に預けられたプラスミドｐＶＫ１００ｑ、第３図の制限地図によって特徴づけられるプラスミドｐＶＫ１０１１、および第４図の制限地図によって特徴づけられるプラスミドｐＡＺ１０１のいずれかである請求の範囲第９項のベクター。
11. 請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに従うＤＮＡ断片またはベクターを含有する組換え微生物。
12. Ｌ−カルニチン代謝の能力が完全に、または部分的に抑制されたことを特徴とする請求の範囲第１１項の微生物。
13. 組換えの能力が低減されていることを特徴とする請求の範囲第１１項および第１２項のいずれかの微生物。
14. エシエリチア、シュードモナス、アグロバイテリウム、リゾビウム、コマモナスおよびリゾビウム／アグロバクテリウム属の微生物からえらんだ請求の範囲第１１項ないし第１３項のいずれかの微生物。
15. 寄託番号ＤＳＭ８７２６をもって寄託されたリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９であって、プラスミドｐＶＫ１００ｑを有するもの、第３図の制限地図により特徴づけられるプラスミドｐＶＫ１０１１、または第４図の制限地図によって特徴づけられるプラスミドｐＡＺ１０１、およびＬ−カルニチン生合成の能力を有する微生物から誘導された遺伝子的変種および突然変異種。
16. リゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９．４であって、リゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９中に寄託番号ＤＳＭ８７２６で寄託してあるプラスミドｐＶＫ１００ｑ、図３の制限地図によって特徴づけられるプラスミドｐＶＫ１０１１、または図４の制限地図によって特徴づけられるプラスミドｐＡＺ１０１を含有するもの、ならびにそれらから誘導されるＬ−カルニチン生合成能力を有する遺伝子的変種および突然変異種。
17. Ｌ−カルニチン製造のバイオ技術的方法であって、クロトノベタインおよび（または）γ−ブチロベタインを適当な炭素および窒素源の存在下に、請求の範囲１１〜１６のいずれかに記載の微生物を手段として発酵させ、Ｌ−カルニチンを分離回収することを特徴とする方法。

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