DE60117566T2

DE60117566T2 - Erhöhte herstellung von 2-keto-l-gulonsäure

Info

Publication number: DE60117566T2
Application number: DE60117566T
Authority: DE
Inventors: Manoj Fremont KUMAR; Fernando Burlingame VALLE; A. Veronique Delmar DARTOIS; A. James La Jolla HOCH
Original assignee: Microgenomics Inc Carlsbad; MicroGenomics Inc; Genencor International Inc
Current assignee: Microgenomics Inc Carlsbad; MicroGenomics Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2021-08-04
Also published as: JP4975938B2; ATE510017T1; DE60117566D1; CA2417970C; CN100547073C; JP2004519213A; CN1527880A; EP1305423A2; MXPA03001030A; AU2001283132A1; BR0113034A; CA2417871A1; BR0113036A; AU2001281068A1; JP4975937B2; CA2417871C; JP2004514421A; CN100378222C; BR0113034B1; WO2002012481A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verbesserung der industriellen Erzeugung von 2-KLG und spezifisch die Überexpression eines Genoms, welches das Protein codiert, welches 2,5-Diketoglutarat aus dem Periplasma in die cytosolische Region der Zelle transportiert. Die vorliegende Erfindung sieht Expressionsvektoren, Verfahren und Systeme für die verbesserte Erzeugung von 2-KLG in Mikroorganismen vor.
Hintergrund der Erfindung
Es ist allgemein gut bekannt, dass 2-Keto-L-gulonsäure (2-KLG) ohne weiteres zu L-Ascorbinsäure (Vitamin C) durch ein chemisches Einschritt-Verfahren im Reichstein-Verfahren umgewandelt wird (Reichstein, T., et al., Helv. Chim. Acta, 1934, 17, 311–328; Reichstein, T., et al., 1933, Helv. Chim. Acta, 16, 561, 1019). Es gibt rekombinante Mikroorganismen, welche heterologe Enzyme exprimieren, um ein Ausgangssubstrat in 2-KLG umzuwandeln. Rekombinante DNA-Techniken sind angewandt worden, um D-Glucose in Erwinia herbicola in einem einzelnen Fermentationsschritt biologisch in 2-KLG umzuwandeln (Anderson, S., et al., Science 230, 144–149 (1985)). Allerdings richtet sich diese Untersuchung auf die Erhöhung der Expression der 2,5-DKG-Reduktase oder einer anderen synthetischen Produktion ohne Erkennen der Bedeutung des Substrattransports bei der industriellen Herstellung des Endprodukts. Tatsächlich zeigten Untersuchungen durch die Erfinder eine minimale Erhöhung der Produktion von 2-KLG als Ergebnis der Überexpression der Reduktase. Somit besteht eine Notwendigkeit für eine Methode zur Erhöhung der industriellen Produktion von 2-KLG über biosynthetische Wege unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen durch andere Mittel als Erhöhen des Expressionsspiegels des umwandelnden Proteins innerhalb der Zelle.
Die Lipid-Doppelschicht von biologischen Membranen ist im Allgemeinen für Ionen und polare Moleküle undurchlässig. Diese biologischen Membranen kompartimentieren eine Zelle, wobei verschiedene Sektionen der Zelle voneinander getrennt werden. Somit können Substrate, welche von der Zelle zum Synthetisieren verschiedener Produkte verwendet werden, wie auch Metabolite, welche von der Zelle zum Erzeugen von Energie oder Wachstum verwendet werden, von den synthetischen und/oder katabolischen Reaktionen, welche diese verwenden, getrennt sein. Im Hinblick auf eine Produktsynthese können unterschiedliche Synthesewege oder Teile hiervon in verschiedenen Abschnitten der Zelle angetroffen werden. Manche oxidativen Reaktionen können außerhalb des Cytosols stattfinden. Zum Beispiel können membrangebundene Proteine verwendet werden, um eine Kohlenstoffquelle zu einem anderen Intermediat zu oxidieren.
Cytosolische Reaktionen oder Wege, beispielsweise manche Reduktionen oder Dehydrierungen, können ebenfalls angewandt werden, um ein Substrat oder Intermediat in ein anderes Produkt umzuwandeln. Wenn das Substrat und die synthetische Maschinerie auf entgegengesetzten Seiten einer Membran liegen, kann die Produktion des gewünschten Endprodukts die Translokation des Substrats zur Stelle der synthetischen Reaktion erfordern, um dessen Umwandlung in das gewünschte Endprodukt zu ermöglichen. Alternativ dazu können innerhalb der Zellmembran erzeugte Endprodukte eine Translokation aus dem Inneren der Zelle heraus erfordern. Da die abgeteilten Sektionen der Zelle unterschiedliche Umgebungsparameter aufweisen können, z. B. Konzentrationen an gelösten Stoffen, Ionen, Endprodukt etc., oder eine Translokation über eine normalerweise undurchlässige Barriere erfordern können, kann irgendeine Form an aktivem Transport erforderlich sein.
In Antwort auf diese Probleme ist es zu Forschungen in Hinsicht auf die Erhöhung des Transports von Materialien über bzw. durch Membranen hindurch gekommen. Lösungsmittel oder lysierende Mittel sind verwendet worden, um die Membranen zu zerstören, wodurch der Durchtritt der Materialien durch die Membran ermöglicht wird. Allerdings besitzen derartige Verfahren nachteilige Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Wirtszelle. Wenn die synthetischen oder metabolischen Wege abhängig von den eigenen metabolischen oder katabolischen Wegen einer Wirtszelle sind oder davon angetrieben werden, wie beim Erfordernis nach Co-Faktoren, wie NADH oder NADPH, führt die Zerstörung der Lebensfähigkeit der Zelle zum Stillstand einer weiteren oder fortgesetzten Syntheseproduktion durch die Wirtszelle. Obgleich die Erhöhung des Transports von Glukose oder anderen Sacchariden bei der Erhöhung des Wachstums der Zelle erforscht worden ist (Parker, C., et al., Mol. Microbiol. 15(5): 795–802 (1995)), ist, darüber hinaus, eine Veränderung von zellulären Transportsystemen zur Erhöhung der industriellen Erzeugung chemischer Endprodukte oder Intermediate über biosynthetische Wege unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen nicht erkundet worden.
Cornish (J. of. Gen. Microbiol., 134: 3111–3122 (1988)) erörtert die Verwandtschaft zwischen Glukosetransport und der Erzeugung eines Succinoglucan-Exopolysaccharides durch Agrobacterium radiobacter. Cornish schlug vor, dass die Glukoseaufnahme ein hauptsächlicher kinetischer Kontrollpunkt für die Succinoglucan-Herstellung ist, und dass es möglich sein müsste, sogar höhere Raten der Succinoglucan-Herstellung unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren zu erreichen, um noch höhere Raten der Succinoglucan-Produktion zu erzielen. Allerdings lagen die Produktionsraten von Cornish nicht in der Größenordnung industrieller Anforderungen. Ferner konnten die hohen Spiegel an aufgewendeter Energie und der komplexe regulatorische Mechanismus, welche beim Transport von Glukose beteiligt sind, eher von seiner Anwendung abschrecken als dazu ermutigen.
Volschenk, H., et al. (Nat. Biotechnol. 15: 253 (März 1997)) beschreiben die Einführung von Malat-Abbauwegen in Saccharomyces cerevisiae durch die Klonierung und Expression von heterologer DNA, welche selbige codiert, zum Zwecke der Erschöpfung der in Wein vorhandenen Malatspiegel. Volschenk beschäftigte sich hauptsächlich mit der Entfernung von Malat aus dem umgebenden Medium, nicht mit der Herstellung irgendeines gewünschten Endprodukts in einem industriellen Maßstab.
Darüber hinaus trägt das bloße Wissen, dass ein Transportsystem beteiligt ist, wenig dazu bei, die verbesserte Produktion des gewünschten Endprodukts oder Intermediats zu garantieren. Die Synthesemaschinerie kann bereits gesättigt sein, und somit wird ein erhöhtes Vorhandensein des Substrats nicht notwendigerweise zur erhöhten Herstellung des gewünschten Endprodukts führen. Darüber hinaus kann der erhöhte Transport eines Substrats, welches, zusätzlich zu seiner Verwendung als ein Produktionssubstrat, direkt oder indirekt als ein Metabolit verwendet wird, nicht zu der gewünschten gesteigerten Herstellung führen.
Die bloße Erhöhung des Expressionsspiegels des Enzyms, welches das Substrat in das gewünschte Endprodukt umwandelt, mag nicht zu einer erhöhten Produktion von chemischen Verbindungen unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen führen. Es besteht eine Notwendigkeit für eine Methode zur Erhöhung der Produktion von chemischen Verbindungen unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen durch andere Mittel, als der Erhöhung der Expressionsspiegel von Substraten innerhalb der Zelle.
Es besteht ebenfalls eine Notwendigkeit für eine Methode zur Erhöhung der industriellen Produktion von 2-KLG durch biosynthetische Wege unter Verwendung von rekombinanten Mik roorganismen durch andere Methoden, als der Erhöhung des Expressionsspiegels der cytosolischen Reduktasen in der Zelle.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Fähigkeit eines Mikroorganismus zum 2,5-DKG-Transport kann ein limitierender Faktor oder Engpass für eine gewünschte 2-KLG-Erzeugung werden, insbesondere, weil die 2-KLG-Erzeugung im Cytosol kompartimentiert ist und den Transport von 2,5-DKG von seiner Erzeugungsstelle, extrazellulären membrangebundenen Wegen, erfordert. Die vorliegende Erfindung sieht eine Methode zur Linderung dieses Engpasses vor.
Hierin beschrieben werden isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für P. citrea-PE1, -PE6, -YiaX2, -PermA und -PermB. Die Aminosäuresequenz und die Nukleinsäuresequenz für PE1, PE6, YiaX2, PermA und PermB von P. citrea ist in den 1A–1E, SEQ ID NR: 1 und 2, gezeigt.
Die vorliegende Erfindung sieht verbesserte Verfahren zur Steigerung einer biosynthetischen Produktion von 2-KLG aus 2,5-DKG durch eine Wirtszelle vor. Folglich wird ein Verfahren zur Verstärkung der biosynthetischen 2-KLG-Produktion einer Wirtszelle vorgesehen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Auswählen einer Wirtszelle, welche einen Syntheseweg aufweist, der 2,5-DKG in 2-KLG umwandelt; Verstärken des Transports des 2,5-DKG in die Wirtszelle, während die Unversehrtheit der Wirtszelle aufrechterhalten wird; Kultivieren der Wirtszelle zur Herstellung der 2-KLG; und Herstellung der 2-KLG. In einer anderen Ausführungsform schließt der Schritt des Erhöhens des Transports des 2,5-DKG in die Wirtszelle den Schritt des Transformierens von DNA, codierend für ein oder mehrere Proteine, welche das 2,5-DKG in das Cytosol-Material der Wirtszelle transportieren, in die Wirtszelle ein. Das eine oder die mehreren Proteine können gewählt werden aus der Gruppe, welche aus YiaX2, PE1, PE6, PrmA und PrmB besteht. Die DNA, welche das eine oder die mehreren Proteine codiert, kann in der Lage sein, mit der passenden Sequenz von 1 zu hybridisieren. Die DNA kann mindestens 65% oder mindestens 90% Identität mit der passenden Sequenz von 1 aufweisen.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zur Verstärkung des Transports von 2,5-DKG in das Cytosol über die innere Zellmembran vor, wobei das Verfahren umfasst: Auswählen einer Wirtszelle; und Transformieren von DNA in die Wirtszelle, codierend für ein oder mehrere Proteine, welche in der Lage sind, 2,5-DKG in die Wirtszelle zu transportieren. Das eine oder die mehreren Protein(e) werden aus der Gruppe gewählt, welche aus YiaX2, PE1, PE6, PrmA und PrmB besteht. In einer Ausführungsform wird die Wirtszelle aus der Gruppe gewählt, welche aus Bakterien und Hefe besteht. Vorzugsweise wird die Wirtszelle aus der Gruppe gewählt, welche aus E. coli, Pantoea und Klebsiella besteht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen von YiaX2 von Klebsiella oxytoca; PE1 (Umwelt-Permease); PE6 (Umwelt-Permease); PermA von Pantoea citrea; PermB von Pantoea citrea; YiaX2 von Pantoea citrea.
2 ist ein Flussdiagramm, welches den Syntheseweg für die Herstellung des Ascorbinsäurevorläufers 2-KLG aus Glukose zeigt.
3 ist ein Diagramm, welches den Syntheseweg des Ascorbinsäurevorläufers 2-Keto-L-gulonsäure (2-KLG) zeigt.
4 ist ein Flussdiagramm, welches die verschiedenen Synthesewege zeigt, denen Glukose folgen kann, um zu 2-KLG zu werden; Boudrant, J., Enzym. Microb. Tech., 1990, 12, 322–329.
4A ist ein Diagramm, welches die Synthesewege von D-Sorbitol zu 2-KLG zeigt, wobei die zelluläre Lokalisierung der Reaktionen relativ zu anderen Reaktionen innerhalb des Weges sowie der Transport von Substraten über Zellmembranen gezeigt werden; Saito, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 58(2/3): 305–315 (1998).
5 zeigt den Syntheseweg von D-Glukose (G) zu 2,5-DKG zu 2-KLG, wobei die Lokalisierung der Reaktionen relativ zu anderen Reaktionen innerhalb des Weges sowie der Transport der jeweiligen Substrate über die Zellmembran gezeigt werden.
6 ist eine Liniengrafik, welche die DKG-Transportrate mit der KLG-Produktionsrate vergleicht, wobei die Menge der 2,5-DKG-Aufnahme (nmol/OD 600) gegen die Zeit gezeigt wird (-♦- = Fructosezufuhr 139-2a, 0,0486x + 0,67; -
- = Glukosezufuhr 139-2a, y = 0,0497 + 0,5877; -•- = Animpfkolben 139-2a, y = 0,0075x + 0,0569).
7 ist ein Schema des yia-Operons des Ascorbinsäure-Katabolismus in Klebsiella oxytoca.
8 ist eine Grafik, welche die Menge der 2,5-DKG-Aufnahme (nmol) durch Klebsiella oxytoca zeigt, die gemessen wurde durch den Silikonöltransport-Assay (-♦- = Tester + Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid [IPTG]); -
- = ΔyiaaX2 + IPTG); -
- = Tester – IPTG).
9 ist eine schematische Zeichnung, welche das Selektions-Design zum Schließen auf bzw. Aufspüren von Permeasen aus P. citrea, K. oxytoca und Umweltquellen zeigt.
10 ist eine Balkengrafik, welche die 2,5-DKG-Aufnahmeaktivität in K. oxytoca-Stämmen (YiaX2, pcp1, pcp10, pcp32, pK1, Umwelt #1; und Umwelt #6) zeigt.
11 ist eine Balkengrafik, welche einen 2,5-DKG-Aufnahme-Assay von Schüttelkolben, aufweisend verschiedene DKG-Permeasen (139-2A, 139-2A + PCP32; 139-2A + PCP10; 139-2A + PK1; 139-2A + PCP1) und 139-2A + PE6 im gleichen Plasmidkonstrukt (pBCL 1920), zeigt, wobei die DKG-Aufnahmerate (g/l/h) bei 28°C gemessen wird. 9A–9B.
12 ist eine Liniengrafik, welche die spezifische Produktivitätssteigerung mit überexprimierter DKG-Permease/Spez. Produktionsrate (g/l/h) zeigt (-♦- = Wildtyp; -x- = WT, prmA).
13 ist eine schematische Zeichnung des PermA-Transporters in einer Membranoberfläche. Die vermutlichen membrandurchspannenden Domänen sind mit I–XI nummeriert. Die Positionen der konservierten Reste sind in Fettdruck angegeben. N ist der Aminoterminus und C ist der Carboxylterminus. Vermutliche membrandurchspannende Domänen von Permease A aus Pantoea citrea wurden unter Anwendung des Fach-Programms abgeleitet, welches unter http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosulframeD.html erhältlich ist.
Ausführliche Beschreibung
Definitionen
Transporter-Definitionen
Bakterielle Kanaltransporter beziehen sich auf diejenigen Transporter, welche allgemein in der TC-Klassifizierung #1.A liegen (Saier, M., et al., 1998, Advances in Microbial Physiology (Hrsg.: Poole, R. K.), S. 81–136, Academic Press, San Diego, CA.). ("TC" steht für "Transport Council", ein Klassifizierungssystem, das die phylogenetischen Aspekte des Transporters berücksichtigt). Selbige transportieren im Allgemeinen Substrate, Ionen oder anderes Material über einen energieunabhängigen Mechanismus der erleichterten Diffusion unter Verwendung einer Transmembran-Pore.
Primäre Transporter bezieht sich auf diejenigen Transporter, welche allgemein in der TC-Klassifizierung (TC #3.A) liegen (Saier, M., et al., 1998) und bei denen es sich um jene handelt, welche chemische Energie, typischerweise in der Form von ATP-Hydrolyse, als einen Modus der Energiekopplung für die aktive Aufnahme und Transport-Ausscheidung von Substraten verwenden.
Gruppen-Translokationssysteme bezieht sich auf Transporter in der TC-Klassifikation TC #4.A (Saier, M., et al., 1998), und es handelt sich um Transporter, welche gleichzeitig ihre Substrate transportieren und während des Transports phosphorylieren. Die Mitglieder dieser Kategorie sind im Allgemeinen Teil des bakteriellen spezifischen Phosphotransferase-Systems (PTS) und sind durch die Kopplung an die Oxidation zur Phosphoenolpyruvat (PEP)-Verwertung gekennzeichnet.
Sekundäre Transporte bezieht sich auf diejenigen Transporter, die allgemein in der TC-Klassifizierung #2.A (Saier, M., et al., 1998) liegen, welche im Allgemeinen chemiosmotische Energie, zum Beispiel in der Form eines Protonengradienten verwenden, um Energie für den Transport des Substrats, von Ionen oder Endprodukten über die Membran vorzusehen.
"Major facilitator superfamily" (MFS) bezieht sich auf sekundäre Transporter, welche allgemein in der TC-Klassifizierung #2 liegen (Saier, M., et al., 1998).
Ein Transporter bezeichnet jedwedes Makromolekül, welches die Translokation einer chemischen Verbindung über eine Zellmembran und hinein in oder heraus aus einer Zelle oder ein zelluläres Kompartiment ermöglicht. Transporter sind auch als Permeasen bekannt oder werden derartig bezeichnet. Ohne auf eine spezifische Theorie beschränkt zu sein, nimmt man an, dass der Transporter ein Protein ist, welches mit einer Membran mittels Portionen des Proteins wechselwirkt, die sich aus der Außenoberfläche der Membran heraus, durch die Membran und von der Innenoberfläche der Membran aus erstrecken.
Aktiver Transport bezieht sich auf einen Transport, welcher mit einem Energieverbrauch gekoppelt ist, zum Beispiel der Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) oder Phosphoenolpyruvat (PEP).
Ein Anionen/Kationen-Symporter bezieht sich auf einen Transporter, welcher einen chemosmotischen Gradienten verwendet, um das Substrat über die Membran zu transportieren (TC Klasse 14). Sie werden ebenfalls als Substrat/H+-Symporter bezeichnet.
TMS bezieht sich auf Transmembran(durchspannende)-Domänen.
Definitionen in Bezug auf Wege
Cytoplasmatisch bezieht sich auf die Lage innerhalb der inneren Zellmembran.
Exogenes Substrat bezieht sich auf ein Material, welches auf der der Synthesereaktion entgegengesetzten Seite der trennenden Membran gefunden wird, z. B. außerhalb der inneren Zellmembran, wenn das Substrat durch einen intrazellulären Syntheseweg oder einen intrazellulären Abschnitt eines Synthesewegs in das gewünschte Endprodukt oder Intermediat umgewandelt werden soll.
Extrazellulär oder außerhalb der inneren Zellmembran bezieht sich auf Zellörtlichkeiten auf der dem Cytoplasma entgegengesetzten Seite einer Membran, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, das Periplasma.
Innere Zellmembran bezieht sich auf die Barriere, welche das Cytoplasma von dem Periplasma trennt.
Membran bezieht sich auf eine Lipid-Doppelschicht, welche intrinsisch für das Substrat undurchlässig ist.
Intrazellulär bezieht sich auf den Teil der Zelle auf der Seite der Membran, welche am nächsten zum oder beim Cytosol liegt. Intrazellulär schließt auch cytosolisch ein.
Intrazelluläre Reaktion bezieht sich auf eine synthetische Reaktion oder Biokonversion, welche innerhalb des cytosolischen Zellmaterials lokalisiert ist, d. h. Material, welches innerhalb der inneren Zellmembran eingeschlossen ist.
Geschwindigkeitsbegrenzender Schritt bezieht sich auf den Schritt innerhalb des 2-KLG-Biosyntheseweges, an welchem eine Erhöhung der über diesen Schritt erfolgenden Umwandlung zu einer Erhöhung der Herstellung von 2-KLG führt.
Steigerung der Produktion bezieht sich auf einen erhöhten Titer (Gesamtmenge) des gewünschten Intermediates, Endproduktes oder Vorläufers einer synthetischen Reaktion, was im Allgemeinen durch eine Erhöhung in g/l/Stunde gemessen wird, welche durch das Verfahren erhalten wird. Sie kann sich auch auf eine Erhöhung der Geschwindigkeit beziehen, mit welcher die gewünschten Produkte hergestellt werden, welche im Allgemeinen in g/l pro Zeiteinheit der rekombinanten Produktion gemessen wird, wobei die hergestellte Menge an Endprodukt, Intermediat oder Vorläufer als Ergebnis der Transformierung von DNA erhöht wird, welche das mindestens eine Protein codiert, das den Transport des Substrats über eine Membran in Gegenwart des überexprimierten Transporters erhöht.
Ein Substrat bezieht sich auf 2,5-DKG, welches durch eine synthetische Reaktion biologisch umgewandelt wird, wobei der cytosolische Reaktionsort von dem Substrat durch eine Membran getrennt ist.
Synthetische Reaktion bezieht sich auf die rekombinante Biokonversion eines Substrates in ein Intermediat oder ein Endprodukt.
2,5-DKG-Reduktase bezieht sich auf ein Protein, welches in der Lage ist, die Umwandlung von 2,5-DKG in stereoselektiver Weise zu 2-KLG zu katalysieren.
2,5-DKG-Transporter bezieht sich auf ein Protein, welches in der Lage ist, das 2,5-DKG für die Umwandlung in 2-KLG durch eine 2,5-KLG-Reduktase über die innere Zellmembran zu transportieren.
Definitionen in Bezug auf Expression
Promotoren beziehen sich auf DNA-Elemente, welche die RNA-Polymerase lenken, um die Transkription eines Gens an der korrekten Stelle zu beginnen, wodurch eine Boten-RNA erzeugt wird, welche in der Lage ist, ein Polypeptid zu bilden, sobald sie von der Translations-Maschinerie der Zelle translatiert worden ist.
Eine "stromaufwärts gelegene aktivierende Sequenz" ist eine Bindungsposition für einen positiv wirkenden DNA-bindenden Regulator. Wie von ihrem Namen angedeutet, liegt die stromaufwärts gelegene aktivierte Sequenz stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle und ist eine Nukleinsäure.
Regulatorische Regionen bezieht sich auf Regionen auf der DNA, welche die Expression von Genen modulieren. Ein Mechanismus für diese Modifikation besteht darin, dass manche regulatorischen Regionen als Bindungsstellen für Proteine (ebenfalls bekannt als Repressoren) dienen. Sobald er gebunden hat, stört ein Repressor das Vermögen von RNA-Polymerase, ein Gen zu transkribieren.
Ein Expressionssystem schließt ein oder mehrere Proteine und/oder Nukleinsäuren ein, welche, wenn sie zusammenwirken, die Expression eines Proteins in einer Wirtszelle erhöhen können. Das Expressionssystem kann auf einem oder mehreren Plasmiden codiert werden und kann oder kann nicht auf demselben Plasmid wie das Gen liegen, welches das Protein von Interesse codiert.
Der Ausdruck "funktionell verknüpft" oder "funktionell gekoppelt" bedeutet, dass die regulierenden Elemente (DNA oder Protein) physikalisch wechselwirken, um ihre Funktion auszuüben. Dies kann eine Protein/Protein-, DNA/Protein- oder eine DNA/DNA-Wechselwirkung sein. Zum Beispiel wechselwirkt der DNA-bindende Regulator mit dem Promotor, aber Gene, welche für diese codieren, können sich an anderen Stellen auf dem Chromosom befinden. Als solches können die Gene, welche die Elemente codieren, auf voneinander und zu dem Gen, codierend das Protein von Interesse, verschiedenen Plasmiden liegen und dennoch zusammenwirken, um die Expression des Proteins zu regulieren.
Bei der Beschreibung von Proteinen und der Gene, welche diese codieren, wird üblicherweise der Ausdruck für das Gen nicht groß geschrieben und kursiv gedruckt, d. h. permA. Der Ausdruck für das Protein wird im Allgemeinen in Normal-Lettern gedruckt und der erste Buchstabe wird großgeschrieben, d. h. PermA.
Organismen-Definitionen
"Bakterien" schließen Mikroorganismen der Klasse Schizomycetes ein. Bakterien können entweder gramnegativ oder grampositiv sein. Gramnegative Bakterien schließen Mitglieder der Gattungen Escherichia, Hämophilus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Gluconobacter, Acetobacter, Yersinia, Shigella, Vibrio, Acinetobacter, Pantoea und Serratia ein. Grampositive Bakterien schließen Mitglieder der Gattungen Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptomyces, Lactobacillus und Lactococcus ein.
Gramnegative Bakterien können Pantoeane sein, bei welchen es sich um Stämme handelt, die Mitglieder der Gattung Pantoea sind. Ein bevorzugtes Bakterium ist Pantoea citrea. Pantoea citrea wird auch manchmal als Erwinia herbicola oder Acetobacter ceremius bezeichnet.
Die Begriffe "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder eine Aminosäure, welche von wenigstens einer Komponente entfernt ist, mit welcher sie natürlicherweise assoziiert ist.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Eine Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit einem Plasmid, welches die Nukleinsäure einschließt, welche das Expressionssystem codiert. Eine andere Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit einem Plasmid, welches DNA einschließt, die für ein oder mehrere Proteine codiert, welche(s) den Transport des Substrats über die Membran erhöhen. Eine Wirtszelle ist eine Zelle, in der ein Plasmid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch Transformation eingebracht werden kann. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium und stärker bevorzugt aus der Gruppe von Pantoea, Escherichia; Klebsiella oder Bacillus.
In einer anderen Ausführungsform stammen, falls regulierende Elemente eingebaut sind, solche Elemente des Expressionssystems aus E. coli und B. subtilis. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle vorzugsweise ein gramnegatives Bakterium. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Pantoea. Dieselbe Wirtszelle kann mit einem weiteren Plasmid transformiert sein, welches eine Nukleinsäure einschließt, die einen oder mehrere Transporter codiert. Vorzugsweise sind die codierten Transporter MFS-Transporter, weiter bevorzugt Anion/Kation-Symporter. Beispielhafte Transporter schließen diejenigen ein, codiert oder exprimiert von yiaX2, permA, permB, pe6, pe1 von Pantoea citrea oder Klebsiella oxytoca und heterologen Quellen.
Die vorliegende Erfindung sieht neue Verfahren zur Erhöhung der biosynthetischen Produktion einer 2-KLG durch eine Wirtszelle mittels Erhöhung des Transports von 2,5-DKG vor, um den Engpass beim Syntheseweg und der Herstellung von gewünschten Endprodukten zu beheben, insbesondere, wenn die Transporter rekombinant eingebracht und von der Wirtszelle überexprimiert werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit einem Plasmid, welches die Nukleinsäure einschließt, die ein Expressionssystem codiert. Eine Wirtszelle ist eine Zelle, in welche ein Plasmid der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch Transformation eingebracht werden kann. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle vorzugsweise ein gramnegatives Bakterium. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Pantoea. Vorzugsweise handelt es sich bei der Wirtszelle um Pantoea citrea, und, wenn regulierende Elemente eingebracht werden, stammen derartige Elemente des Expressionssystems aus Pantoea. Dieselbe Wirtszelle kann mit einem weiteren Plasmid transformiert sein, welches eine Nukleinsäure einschließt, die einen oder mehrere Transporter codiert. Vorzugsweise werden die Transporter von yiaX2, permA, permB, pe6, pe1 aus Pantoea citrea codiert oder exprimiert.
Synthetische Reaktion
Die vorliegende Erfindung sorgt für den erhöhten Transport von 2,5-DKG über eine Membran, um die Herstellung von 2,5-DKG aus 2-KLG zu verstärken. Der erhöhte Transport ermöglicht die Translokation des 2,5-DKG über eine Membran, welche 2,5-DKG von der zellulären Lokalisierung der Reduktionsreaktion trennt (2 und 3).
Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich im Zusammenhang mit Ascorbinsäure-Intermediatsynthese, beispielsweise der Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG; der Umwandlung von Sorbose oder Sorbitol in 2-KLG über Sorboson; der Reduktion von 5-Keto-D-gluconsäure (5-KDG) zu L-Idonsäure; und der Reduktion von 5-Keto-D-gluconsäure zu L-Gulonsäure. Jeder dieser Wege ist durch einen Abschnitt des Synthesewegs, eine synthetische Reaktion, gekennzeichnet, welche innerhalb des Cytoplasmas liegt, z. B. die Reduktion von 2,5-DKG durch 2,5-DKG-Reduktase; die Reduktion von L-Sorboson zu 2-KLG durch eine Sorboson-Dehydrogenase; die Reduktion von 5-Keto-D-Gluconsäure (5-KDG) zu L-Idonsäure durch 5-KDG-Dehydrogenase; und die Reduktion von 5-Keto-D-Gluconsäure zu L-Gulonsäure durch 5-KDG-Reduktase. Diese Wege sind ebenfalls durch die Notwendigkeit des Transportierens des Substrats, z. B. 2,5-DKG; L-Sorboson etc., über die Membran für die Biokonversion durch die im Cytoplasma angesiedelte synthetische Reaktion gekennzeichnet.
Das Substrat ist im Allgemeinen ein solches, welches ohne irgendeine Art von aktivem Transportmechanismus nicht effizient durch die Membran hindurchtreten kann. Diese können vorzugsweise, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Ascorbinsäure-Intermediate (2,5-DKG, Sorboson) einschließen. Weiterhin ist das Substrat ein Material, welches für die synthe tische Verwendung in einem industriellen Maßstab und allgemein nicht zur metabolischen Verwendung durch die Wirtszelle transportiert wird. "Industrieller Maßstab" bezieht sich auf den Titer und die volumetrische Produktivität, welche größer als 1 g/l/Stunde, vorzugsweise größer als 2 g/l/h, weiter bevorzugt größer als 3 g/l/h und noch weiter bevorzugt größer als 5 g/l/h ist. In einer anderen Ausführungsform liegt der Produktivititäts-Titer zwischen 2 und 14 g/l/Stunde, vorzugsweise zwischen 3 und 12 g/l/h und noch weiter bevorzugt zwischen 5 und 10 g/l/h, damit es sich um ein wirtschaftlich lebensfähiges industrielles Herstellungsverfahren handelt. Besonders bevorzugte Substrate schließen 2,5-DKG und Sorboson ein. Die erfinderischen Aspekte der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich in diesen Ausführungsformen.
Eine in der Praxis dieser Erfindung besonders nützliche Reaktion ist der Transport von 2,5-DKG über die innere Zellmembran für die cytosolische Reduktion desselbigen zu 2-KLG durch die cytosolische Dehydrogenase 2,5-DKG-Reduktase (Boudrant, J. (1990) Enzyme Microb., Technol., 1990: 322–329). 2,5-DKG wird aus 2-Keto-D-gluconat (2-KDG) durch membrangebundene 2-Ketogluconat-Dehydrogenase umgewandelt. 2-KDG wird aus Glucose durch Oxidation von D-Gluconat (GA) umgewandelt. Die Erfinder stellen fest, dass der Transport von 2,5-DKG über die innere Zellmembran zu der Stelle der cytosolischen Reduktion zu 2-KLG durch die DNA erzielt werden könnte, welche eine Erhöhung des Transports von 2,5-DKG codiert.
Eine andere Reaktion, welche in der Ausführung dieser Erfindung speziell nützlich ist, ist der Transport von Sorboson, einem Intermediat in der Erzeugung von 2-KLG über Sorbose, Sorbitol (Saito, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 58(2/3): 309–315 (1998)). Die Umwandlung von Sorbitol und/oder Sorbose zu Sorboson ist ein Schritt in dem Weg zur Umwandlung von Sorbitol oder Sorbose in 2-KLG (Boudrant, J., 1990; Saito (1997)). Nun folgt eine Erörterung der gentechnischen Handhabung von Sorbosontransportern gemäß der vorliegenden Erfindung.
Wie Saito beschrieben hat, schließt der Weg von D-Sorbose zu 2-KLG die Oxidation von L-Sorbose zu L-Sorboson durch L-Sorbose-Dehydrogenase (SDH), gefolgt von der Oxidation von L-Sorboson zu 2-KLG durch L-Sorboson-Dehydrogenase, ein. Es ist eine rekombinante Wirtszelle beschrieben worden, welche D-Sorbitol zu L-Sorboson durch membrangebundene Dehydrogenasen umwandelt (Saito, Y., et al. (1997)). L-Sorboson wird dann für die Reduktion durch L-Sorboson-Dehydrogenase im Cytoplasma aus dem Periplasma abtransportiert. Es wird davon ausgegangen, dass die Überexpression des Sorbosontransporters zur Erleichterung des Transports des Sorboson-Intermediates zu dem Weg für die Umwandlung in 2-KLG einen nutzbringenden Effekt aufweist.
Ein alternativer Weg von D-Glucose zu 2-KLG schließt die Oxidation von D-Gluconsäure zu 5-Keto-D-gluconsäure (5KDG) ein, welche ihrerseits zu L-Idonsäure (IA) oder L-Gulonsäure für die Oxidation zu 2KLG reduziert wird (Boudrant, J. (1990)). Der Transport von 5-Keto-D-gluconsäure in das Cytosol für die Reduktion durch Keto-Reduktase könnte ebenfalls durch die Überexpression des 5KDG-Transporters erleichtert werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die synthetische Reaktion extracytosolisch oder, relativ zum Substrat, außerhalb der Membran lokalisiert sein. Das Endprodukt der ersten Reaktion kann ein Intermediat-Substrat für eine zweite Reaktion auf der entgegengesetzten Seite einer Membran sein. Zum Beispiel führt, in der Synthese von 2-KLG aus D-Sorbitol in Gluconobacter oxydans T-100 aus japanischer Persimone (FERM BP-4188), die Umwandlung von D-Sorbitol in L-Sorbose durch cytosolische L-Sorbitol-Dehydrogenase zu einem Intermediat, welches über die Zellmembran hinweg aus dem Cytoplasma heraus für die Umwandlung zu L-Sorboson durch die membrangebundene L-Sorbose-Dehydrogenase abtransportiert wird. Somit ziehen die Erfinder die Erhöhung des Transports des cytosolischen Intermediats, eines Substrats, von der cytosolischen Seite der inneren Membran über die Membran hinweg zur Außenseite der Membran für eine anschließende Umwandlung in Betracht; Saito, Y., (1997).
Obgleich eine bevorzugte Ausführungsform die synthetische Reaktion oder die Wege, welche selbige einschließen, als innerhalb eines Einzelorganismus befindlich einschließt, wird auch das Vorliegen von separaten Reaktionen in separaten Organismen von den Erfindern in Betracht gezogen. In einem gemischten Kultursystem für die Erzeugung von 2-KLG aus Glucose kann zum Beispiel die Umwandlung von Glucose in ein Intermediat, 2,5-DKG, innerhalb eines Organismus erfolgen (Acetomonas, Acetobacter, Gluconobacter oder Erwinia), während die Umwandlung dieses Intermediats in das gewünschte Ascorbinsäure-Intermediat 2-KLG innerhalb des zweiten Organismus erfolgt (Brevibacterium oder Corynebacterium); siehe U.S.-Patent Nr. 3 963 574 von Sonoyama (1976); siehe ebenfalls Hoshino, U.S.-Patent Nr. 5 312 741.
Deshalb kann die synthetische Reaktion ein Intermediat erzeugen, welches selbst an einer anderen zellulären Örtlichkeit, die durch eine Zellmembran getrennt ist, umgewandelt werden kann. Das Endprodukt kann, in dieser Ausführungsform, ein Intermediat-Substrat für eine anschließende Reaktion sein.
Ein Grund für den Effekt des erhöhten Transports von 2,5-DKG über die innere Zellmembran zu der cytosolischen Zelllokalisierung in der Herstellung von 2-KLG liegt vor, weil die Erfin der festgestellt haben, dass dies der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt bei der Umwandlung von 2,5-DKG in 2-KLG ist. Die Feststellung, ob ein derartiger Schritt ein geschwindigkeitsbeschränkender Schritt ist, wurde durch Analysieren des Weges, Untersuchen der Produktion bei jedem Schritt und Verändern der Menge an 2,5-DKG, welche für die Umwandlung durch den Weg verfügbar ist, bestimmt, um zu ermitteln, ob ein derartiges erhöhtes Vorliegen von 2,5-DKG zu einer Erhöhung der Gesamtproduktion des Weges führt. Nach der Feststellung, dass die Erhöhung des Vorhandenseins von 2,5-DKG die Produktion von 2-KLG steigert, wird die Erhöhung des Transports des Substrats die Produktion von 2-KLG steigern.
Die Feststellung des geschwindigkeitsbeschränkenden Schrittes kann durch Vergleichen der Produktivität des Mikroorganismus bestimmt werden. Ein Verfahren zur Bestimmung des Geschwindigkeitsbeschränkungs-Status des Wegabschnitts besteht darin, die Intermediat-Produktivität an verschiedenen Punkten des Weges, vor und nach Erhöhen des Vorhandenseins einer bestimmten chemischen Verbindung zu vergleichen. Das Erhöhen des Vorhandenseins der Reduktase durch Überexpression der 2,5-DKG-Reduktase codierenden DNA führte nicht zu einer erhöhten Herstellung von 2,5-KLG. Allerdings führte das Erhöhen der im Cytosol vorhandenen Menge an 2,5-DKG zu einer erhöhten Produktion von 2-KLG. Somit stellten die Erfinder fest, dass die Erhöhung der Menge von 2,5-DKG ein geschwindigkeitsbeschränkender Schritt bei der Herstellung von 2-KLG war.
Ein Verfahren zur Bestimmung des Geschwindigkeitsbeschränkungs-Status des Wegabschnitts besteht darin, die Intermediatproduktivität an verschiedenen Punkten des Weges, vor und nach Erhöhen des Vorhandenseins eines besonderen biologischen Converters, zu vergleichen. Wenn es zu keiner Erhöhung der Produktion des Endprodukts, trotz erhöhtem Vorhandensein eines Intermediates oder der Überexpression des umwandelnden Weges kommt, kann der Schritt nicht geschwindigkeitsbeschränkend sein, und somit kann eine Überexpression des jeweiligen, die Synthesereaktion bewirkenden Enzyms nicht zu einer erhöhten Produktion führen. Die Mengen der individuellen Intermediate können durch verschiedene indirekte oder direkte Methoden bestimmt werden. Indirekte Methoden schließen die Messung des Verbrauchs oder der Produktion von respiratorischen Parametern, z. B. Kohlendioxiderzeugung, Sauerstoffverbrauch, durch in-line-Messungen, wie von Gaspartialdrücken, ein. Eine direkte Messung der Intermediate kann durch verschiedene im Fachgebiet bekannte Analysetechniken erreicht werden, wie beschrieben von Lazarus, Analyt. Biochem. 157, 360–366 (1986) und den darin zitierten Bezugsstellen, welche hierin zur Bezugnahme einbezogen sind, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Papier-, Gas-, Flüssigkeits- und Dünnschichtchromatographie sowie chemische und enzymatische Assays. Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie-Methodiken, speziell wie dargestellt in Lazarus, 1986, sind besonders hilfreich. Ein von den Erfindern angewandtes Verfahren schließt das Waters 2690 HPLC und Waters 410-Differenzial-Refraktometer unter Anwendung eines 50 mM Acetatpuffers, 1 ml/Minute Fließgeschwindigkeit, als dem Elutionsmedium und einer Dyonex Ionpac AS-10-Ionenaustauschsäule (4 × 250 mm) zum Trennen und Quantifizieren der vorhandenen chemischen Verbindungen ein.
Ein anderes von den Erfindern zur Bestimmung der Reinheit der im Nährmedium erzeugten 2-KLG angewandtes Verfahren war die Gesamtkohlenstoffanalyse.
Somit kann, in einer Ausführungsform, die Transportaktivität in jeder Zelle, in welcher das Substrat zu einem Produkt umgewandelt werden kann, durch Messung der Erzeugung des Produkts in Gegenwart von extrazellulärem Substrat gemessen werden. Zum Beispiel wird, in einer Zelle, welche eine 2,5-DKG-Reduktase natürlich exprimiert oder rekombinant exprimiert, intrazelluläres 2,5-DKG in 2-KLG umgewandelt. Die Fähigkeit der bakteriellen Zelle, nach Expression einer 2,5-DKG-Permease, bei Versorgung mit extrazellulärem 2,5-DKG, 2-KLG zu erzeugen, ist ein Maß der Fähigkeit der exprimierten Permease, 2,5-DKG in die Zelle hinein zu transportieren, und ist somit ein Maß von ihrer 2,5-DKG-Permease-Aktivität. Intrazelluläres 2-KLG kann zum Beispiel unter Anwendung von HPLC oder anderen im Fachgebiet bekannten, empfindlichen Nachweisverfahren nachgewiesen werden. Andere Stoffwechselprodukte von 2,5-DKG können ebenfalls durch ähnliche Verfahren nachgewiesen werden.
Der 2,5-DKG-Transporter
Es gibt vier unterschiedliche Typen von auf Grundlage des Transportmodus und der Energiekopplungs-Mechanismen funktionell charakterisierten Transportsystemen. Die ersten sind bakterielle Kanalproteine (TC #1.A), welche über einen energieunabhängigen Mechanismus der erleichterten Diffusion unter Verwendung einer Transmembranpore transportieren. Ein zweites Transportsystem, die Facilitatoren und/oder sekundären Transporter (die zweite Klasse, TC #2.A), repräsentiert die größte Kategorie von Transportern. Eine dritte Gruppe, ATP-angetriebene primäre aktive Transporter, macht von ATP-Hydrolyse als einem Modus der Energiekopplung für die aktive Aufnahme und/oder Ausstoßung von gelösten Stoffen Gebrauch. Die letzte Gruppe besteht aus Gruppentransportern, welche ihre Substrate während des Transports phosphorylieren (TC #4.A).
Bei den sekundären Familien handelt es sich bei den größten der Klasse-II-Familien um die "major facilitator superfamily" (MFS) und die Aminosäure-Polyamin-Cholin(APC)-Familie (Reizer, et al.). Diese sekundären Transporterfamilien können ferner in drei Gruppen eingeteilt werden: (1) die protonenmotorische Form (pmf-getrieben), (2) Natrium-motorische Kraft (smf)-getrieben und (3) sonstige Ionen- oder Gelöststoff-getriebene Austauscher. Diese Transportsysteme katalysieren den Uni-, Anti- und/oder Symport von gelösten Stoffen. Sekundäre aktive Transporter sind in E. coli, H. influenzae, H. pylori, B. subtilis, M. genitalium, Synechocystis, M. Jannaschii identifiziert worden (Paulsen et al., 1998, J. Mol. Biol. 277: 573–592). Alle Mitglieder dieser Kategorie sind Teil des bakteriellen spezifischen Phosphotransferase-Systems (PTS). Sekundäre Transporter sind typischerweise polytope Membranproteine, häufig mit 12 TMS, meistens mit bzw. wie bei primären Trägern, einer chemischen Form von Energieantrieb für die Gruppen-Translokation, seien es ATP-abhängige Systeme, wie es die meisten Mitglieder der ATP-Bindungs-Kassetten(ABC)-Superfamilie sind, oder PTS, welche PEP als den Phosphoryldonor für Zuckeraufnahme und Phosphorylierung verwenden. Sekundäre Transporter unterscheiden sich von den primären (ABC)-Transportern dahingehend, dass die primären Transporter ATP verwenden, wodurch der Zelle Energie entzogen wird. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von ABC-Transportern ein komplexeres Transportersystem, nämlich ein solches, das zwei hydrophobe integrale Membrandomänen und zwei ATP-Bindungs-Domänen umfasst (Hosie, et al., Molecul. Microbiol. (2001) 40(6), 1449–1459). Diejenigen ABC-Transporter, welche für die Aufnahme von gelösten Stoffen verantwortlich sind, erfordern des Weiteren die Gegenwart eines "Solute"-Bindeproteins (SBP). Somit würde eine gentechnische Erzeugung eines verbesserten ABC-Transportsystems die Expression und Transformation von komplexerer Natur erfordern, als eine solche eines sekundären Transporters.
In einer Ausführungsform wird die DNA, welche mindestens ein Protein zur Erhöhung des Transports des Substrats über die innere Zellmembran codiert, gewählt aus Acetobacter, Pseudomonas, Bacterium, Cyanococcus, Micrococcus, Brevibacterium, Arthrobacter, Staphylococcus, Bacillus, Corynebacterium, Acetomonas, Gluconobacter und Erwinia. Bevorzugte Organismen werden aus der Gruppe gewählt, welche aus E. coli, Pantoea und Klebsiella besteht. Pantoea ist der am stärksten bevorzugte Organismus zur Verwendung als Wirtszelle.
Speziell nützliche Transporter schließen diejenigen ein, welche codiert werden von yiaX2 (aus Klebsiella oxytoca), pe1 und pe6 (aus Umgebungsquellen) und yiaX2, permA und permB aus Pantoea citrea. yiaX2-, permA- und permB-Gene können in einer Vielzahl von Bakterien gefunden werden, wie Erwinia, Acetobacter, Gluconobacter, E. coli, Agrobacter, Yersinia, Salmonella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Citrobacter. Spezies schließen Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium, Psuedomonas aeruginosa und Streptomyces coelicolor ein.
Die 1 zeigt Nukleinsäuresequenzen von DNA, welche YiaX2, PermA, PermB, PE1 und PE6 codiert, welche als DNA verwendet werden kann, codierend das wenigstens eine Enzym, welches den Transport des Substrats über die Membran in der Wirtszelle erhöht.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung von YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Polynukleotidhomologen, welche die Transporter YiaX2, PermA, PermB, PE1 bzw. PE6 codieren, ungeachtet dessen, ob sie von einem oder mehren Polynukleotiden codiert werden, welche mindestens 65%, 70%, 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% Identität zu P. citrea-YiaX2, PermA, PermB, PE1 bzw. PE6 besitzen, solange das Homolog ein Protein codiert, welches zur Wirkung durch Modulieren des Transports, vorzugsweise Erhöhen des Transports, eines Substrats in einem Mikroorganismus in der Lage ist. Wie vom Fachmann verstanden werden wird, kann, aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes, eine Vielzahl von Polynukleotiden, d. h. YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Polynukleotidvarianten, die Pantoea-citrea-Transporter von den Faktoren YiaX2, PermA, PermB, PE1 und PE6 codieren. Die vorliegende Erfindung deckt die Verwendung aller solcher Polynukleotide ab.
Mikroorganismus-Polynukleotidhomologe von YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Transportern aus P. citrea-, Klebsiella oxytoca- und Umwelt-Isolaten können durch Nukleinsäurehybridisierung von Mikroorganismus-Nukleinsäure von entweder Genom- oder cDNA-Herkunft identifiziert werden. Die Polynukleotid-Homolog-Sequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Abschnitten oder Fragmenten der DNA nachgewiesen werden, welche das mindestens eine Polynukleotid codiert, welches das 2,5-DKG in das cytosolische Material der Wirtszelle transportiert.
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist die Verwendung von YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Polynukleotidsequenzen, welche in der Lage sind, mit einem Teil oder der Gesamtheit der YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Nukleotidsequenz von 1 unter Bedingungen von mäßiger bis maximaler Stringenz zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungs-Komplexes, wie es in Berger und Kimmel (1987, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego CALIF.) gelehrt wird, was hierin durch die Bezugnahme darauf einbezogen ist, und vermitteln eine definierte "Stringenz", wie nachstehend erläutert.
"Maximum-Stringenz" tritt typischerweise bei etwa Tm –5 Grad C auf (5 Grad C unterhalb der Tm der Sonde); "hohe Stringenz" bei etwa 5 Grad C bis 10 Grad C unter der Tm; "mäßige Stringenz" bei etwa 10 Grad C bis 20 Grad C unterhalb der Tm; und "niedrige Stringenz" bei etwa 20 Grad C bis 25 Grad C unterhalb der Tm. Wie vom Fachmann verstanden werden wird, kann eine Hybridisierung bei Maximum-Stringenz angewandt werden, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, wohingegen eine Hybridisierung bei mäßiger oder niedriger Stringenz angewandt werden kann, um Polynukleotid-Sequenzhomologe zu identifizieren oder nachzuweisen.
Der Begriff "Hybridisierung", wie hierin verwendet, soll "das Verfahren, durch welches ein Strang Nukleinsäure sich über Basenpaarung mit einem komplementären Strang verknüpft" einschließen (Coombs J. (1994), Lexikon der Biotechnologie, Stockton Press, New York, N.Y.).
Das Verfahren der Amplifikation, wie durchgeführt in Polymerasekettenreaktion(PCR)-Technologien, wird beschrieben in Dieffenbach, C. W., und G. S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.). Eine Nukleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nukleotiden und so viel wie etwa 60 Nukleotiden aus der PermA-Nukleotidsequenz von 1A–1E, vorzugsweise etwa 12 bis 30 Nukleotiden und weiter bevorzugt etwa 20–25 Nukleotiden, kann als eine Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
Aminosäuresequenzen
Das P. citrea-PermA-Polynukleotid, wie gezeigt in 1, codiert P. citrea-PermA. Das P. citrea-permA-Gen spezifiziert ein Protein von 436 Resten mit einer berechneten molekularen Masse von 47801,94 Dalton. Die durchschnittliche Hybrophobizität belief sich auf 0,62, und der isoelektrische Punkt belief sich auf 9,24. Der permA-Protein ist ein integrales Membranprotein mit 11 putativen Transmembranhelizes. Diese Domänen zeigen signifikante Sequenzähnlichkeit zu anderen bekannten Transporterproteinen aus anderen Organismen, wobei die höchste Ähnlichkeit mit KDG-Transporterproteinen aus Pseudomonas gefunden wird. Die 13 zeigt die vermuteten membrandurchspannenden Domänen (I–XI) von PermA.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Transporter schließen diejenigen ein, die von yiaX2, permA, pe1, pe6 und permB aus Pantoea citrea, Klebsiella oxytoca und Umwelt-Quellen codiert werden. Die Gene yiaX2, permA, pe1, pe6 und permB können in einer Vielzahl von Bakterienspezies gefunden werden, wie Erwinia, Acetobacter, Gluconobac ter, E. coli, Agrobacter, Yersinia, Salmonella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas und Bacillus.
II. Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung verwendet Expressionssysteme für die gesteigerte Produktion und den gesteigerten Transport von gewünschten heterologen oder homologen Proteinen in Mikroorganismen, einschließlich Bakterien und Hefe.
a. Codierende Sequenzen
Ein Vektor für die Expression eines Transporters kann mindestens eine Kopie von Nukleinsäure, welche einen Transporter codiert, umfassen und umfasst vorzugsweise mehrere Kopien. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mikroorganismus um Pantoea. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus Klebsiella. In einer Ausführungsform werden Polynukleotide, welche das permA-Gen umfassen, verwendet, um den Vektor zu konstruieren. Diese Polynukleotidsegmente können eine größere Anzahl von Resten umfassen, als permA. Zum Beispiel sind pcp1, pcp10 und pcp32 Nukleotidfragmente, welche Operons oder Domänen des Genoms von Pantoea citrea sind. Diese Polynukleotidsegmente sind etwa 9 Kilobasen (kb), 13 kb bzw. 67 kb groß. In einer bevorzugten Ausführungsform können Polynukleotide, welche P. citrea-PermA, -YiaX2, -PermB, -PE1 und/oder -PE6 codieren, oder Fragmente davon, oder Fusionsproteine oder Polynukleotid-Homologsequenzen, welche Aminosäurevarianten von PermA, YiaX2, PermB, PE1 und/oder PE6 codieren, verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, welche die Expression von PermA, YiaX2, PermB, PE1 und/oder PE6 bzw. Aminosäurevarianten davon jeweilig in grampositiven Wirtszellen steuern. In einer Ausführungsform wird die Wirtszelle aus der Gruppe gewählt, welche aus Acetobacter, Pseudomonas, Bacterium, Cyanococcus, Micrococcus, Brevibacterium, Arthrobacter, Staphylococcus, Bacillus, Corynebacterium, Acetomonas und Gluconobacter besteht. Bevorzugte Wirtszellen werden aus der Gruppe gewählt, welche aus Escherichia, Pantoea und Klebsiella besteht. Pantoea citrea und Klebsiella sind die am stärksten bevorzugten Organismen zur Verwendung als Wirtszelle. Pantoea ist auch als Erwinia bekannt.
Wie vom Fachmann auf dem Gebiet verstanden werden wird, kann es vorteilhaft sein, Polynukleotidsequenzen herzustellen, welche nicht-natürlich vorkommende Codons besitzen. Von einer besonderen Wirtszelle bevorzugte Codons (Murray, E., et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17: 477–508) können zum Beispiel ausgewählt werden, um die Expressionsrate zu erhöhen oder rekombinante RNA-Transkripte mit wünschenswerten Eigenschaften, wie einer längeren Halbwertszeit als von einer natürlich vorkommenden Sequenz erzeugte Transkripte, herzustellen.
Veränderte Polynukleotidsequenzen von PermA, YiaX2, PermB, PE1 und/oder PE6, welche gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten ein, welche zu einem Polynukleotid führen, welches dasselbe oder ein funktionell äquivalentes PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Homolog jeweilig codiert. Wie hierin verwendet, ist eine "Deletion" als eine Änderung entweder in der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz definiert, in welcher ein oder mehrere Nukleotide bzw. Aminosäurereste abwesend sind.
Wie hierin verwendet, ist eine "Insertion" oder eine "Addition" diejenige Änderung in einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, welche zur Addition von einem oder mehreren Nukleotiden bzw. Aminosäureresten im Vergleich zu natürlicherweise bei Grampositiven vorkommendem PermA, YiaX2, PermB, PE1 und/oder PE6 geführt hat.
Wie hierin verwendet, resultiert eine "Substitution" aus der Ersetzung von einem oder mehreren Nukleotiden oder Aminosäuren durch andere Nukleotide bzw. Aminosäuren.
Das codierte Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten zeigen, welche eine stille Änderung hervorrufen und zu einer funktionell äquivalenten grampositiven PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Variante führen. Willkürliche Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste vorgenommen werden, solange die Variante die Fähigkeit beibehält, den Transport zu modulieren, vorzugsweise den Transport zu erhöhen. Beispielsweise schließen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten schließen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin ein.
Die PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können gentechnisch manipuliert werden, um die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genproduktes zu modifizieren. Zum Beispiel können Mutationen unter Anwendung von Techniken eingeführt werden, welche im Fachgebiet gut bekannt sind, z. B. orts gerichteter Mutagenese, beispielsweise zum Einführen neuer Restriktionsstellen, oder zur Änderung der Codon-Präferenz.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Polynukleotid an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Ein Fusionsprotein kann auch gentechnisch manipuliert werden, um eine Spaltungsstelle zu enthalten, welche lokalisiert ist zwischen der PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Nukleotidsequenz und der heterologen Proteinsequenz, so dass das PermA-, YiaX2-, PermB-, PE1- und/oder PE6-Protein abgespalten und von der heterologen Einheit abgereinigt werden kann.
b. Vektorsequenzen
Bei der Expression von Transportern in Mikroorganismen verwendete Expressionsvektoren umfassen mindestens einen Promotor, der mit einem Transporter-Faktor assoziiert ist, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus PermA, YiaX2, PermB, PE1 und/oder PE6, wobei der Promotor in der Wirtszelle funktional ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor der Wildtyppromotor für den ausgewählten Transporter, und in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor hinsichtlich des Transporters heterolog, aber in der Wirtszelle noch funktional.
Zusätzliche Promotoren, welche assoziiert sind mit heterologer Nukleinsäure, codierend gewünschte Proteine oder Polypeptide, können mittels rekombinanter DNA-Techniken eingeführt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle fähig zum Überexprimieren eines heterologen Proteins oder Polypeptids, und Nukleinsäure, welche einen oder mehrere Transporter codiert, wird(werden) rekombinant eingebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Nukleinsäuren, welche das mindestens eine Protein oder mehrere Proteine codieren, welche den Transport des Substrates erhöhen, stabil in das Genom des Mikroorganismus integriert werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Wirtszelle gentechnisch manipuliert, um DNA zu überexprimieren, die ein oder mehrere Proteine codiert, welche den Transport des Substrates in die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung erhöhen, und Nukleinsäure, welche das heterologe Protein oder Polypeptid codiert, wird durch rekombinante DNA-Techniken eingebracht. Die Wirtszellen können in der Lage sein, andere dem Fachmann bekannte Transporter zu überexprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Mehrfachklonierungsstellen-Cassette, welche vorzugsweise mindestens eine Restriktionsendonuklease-Stelle umfasst, die für den Vektor einzigartig ist, um die Einfachheit der Nukleinsäure-Manipulation zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor auch einen oder mehrere selektierbare Marker. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck selektierbarer Marker auf ein Gen, welches fähig zur Expression in dem grampositiven Wirt ist, was die Einfachheit der Selektion dieser Wirte, die den Vektor enthalten, ermöglicht. Beispiele derartiger selektierbarer Marker schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Antibiotika, wie Erythromycin, Aspectinomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin, ein. Ebenfalls vorgesehen werden Ausführungsformen, welche einen Transporter verwenden, der von einer Nukleinsäure mit mindestens 90% Homologie zu einer der in 1 gezeigten DNA-Sequenzen codiert wird. Vorzugsweise beläuft sich die Homologie auf mindestens 95%, stärker bevorzugt mindestens 98%. Die Homologie kann bestimmt werden durch Aneinanderreihen der beanspruchten Aminosäure- oder DNA-Sequenz mit einer anderen Sequenz und Bestimmen, wieviele der Aminosäuren oder Nukleotide sich, als Prozentsatz der Gesamtheit, entsprechen. Die Homologie kann auch unter Einsatz eines der Sequenzanalyse-Softwareprogramme bestimmt werden, welche im Handel erhältlich sind, zum Beispiel dem "TFastA Data Searching Program", welches in dem "Sequence Analysis Software Package" Version 6.0 (Genetic Computer Group, Universitiy of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wis. 53705) verfügbar ist.
Man kann nach homologen Sequenzen unter Verwendung von Hybridisierung, wie hierin beschrieben, oder unter Anwendung von PCR mit degenerierten Primern screenen; Chen und Suttle (1995) Biotechniques 18(4): 609–610, 612.
Des Weiteren können, in mehreren Ausführungsformen der Erfindung, Nukleinsäuren verwendet werden, welche unter stringenten Bedingungen mit der DNA oder Fragmenten davon hybridisieren können, die in der 1 gezeigt sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen schließen stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein, wie es dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Hybridisierung und passende stringente Bedingungen werden beschrieben in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Verfahren zur Erhöhung der Erzeugung von rekombinanten Peptiden aus Wirtszellen, welche transformierte DNA aufweisen, die Transportproteine codiert.
Ein besonders wirkungsvolles Verfahren zur Erhöhung des Transportes des Substrates von einer zellulären Stelle zu einer anderen bezieht die Deletion von Genen, welche zu metabolischen Umleitungen führen, aus der transformierten Wirtszelle und die gleichzeitige Vorse hung von codierender DNA, welche den Transport des gewünschten Substrates erhöht, ein. Dies wird vorteilhafterweise bewirkt, indem der Zelle ein Deletions-Transporter-Chimären- oder -Fusionsprotein zur Verfügung gestellt wird, bei welchem die metabolischen Umleitungen von dem deletierten Abschnitt minimiert sind, und bei welchem der Abschnitt mit dem Transportervermögen überexprimiert ist. Chemisch fusionierte Polypeptide oder verschobene Sektionen des Genoms sind eine Möglichkeit, aber rekombinante Proteine werden natürlich zur Verwendung in dieser Weise am stärksten bevorzugt. Die Identifizierung von passenden Permease-Fragmenten zur Verwendung in einer derartigen Chimäre ist hierin obenstehend beschrieben worden.
In Hinsicht auf die Transport-Abschnitte dieser Fusionsproteine wird jedwede aus Permease abgeleitete Sequenz, welche ausreichend Primärsequenz-Information enthält, um der Chimäre eine Transportaktivität zu vermitteln, in diesem Zusammenhang nützlich sein. Es wird jedoch häufig bevorzugt, das gesamte Transporterenzym zu verwenden, da dies hinsichtlich der Methodik geradliniger ist. Wiederum kann man auf die umfangreiche Information blicken, welche in verschiedenen veröffentlichten Bezugsstellen verfügbar ist, um bei der Identifizierung von passenden Transportern oder Fragmenten davon zu helfen.
Transformation
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Steigerung oder Erhöhung der Fähigkeiten von Zellen in Betracht, biologisch aktive Polypeptide herzustellen, wobei solche Polypeptide den Transport eines Substrates von einer ersten Stelle der Zelle über eine Membran zu einer zweiten Stelle der Zelle erhöhen. Dies kann, in manchen Fällen, durch Überexprimieren der Proteine bewerkstelligt werden, welche am Transport eines Substrates zu einer anderen zellulären Lokalisierung für eine weitere Biokonversion beteiligt sind, wie einem sekundären Transporter von dem Anion/Kation-Symporter (Saier, 1988), in einer Ausführungsform einem Anion/Kation-H+-Symporter. Beispielhafte Symporter, welche von den Erfindern in Betracht gezogen werden, schließen die Permeasen YiaX2, PE1, PE6, prmA und prmB aus Klebsiella oxytoca und Pantoea citrea ein.
Die Expression von Transportern, welche bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und produktiven Qualitäten von Wirtszellen, speziell ihrem Transportvermögen, beteiligt sind, ist bedeutsam. In dem Fall, dass es sich bei den Wegen um NADPH oder NADH erfordernde Reaktionen handelt, ist die fortgesetzte Lebensfähigkeit der Wirtszellen eine Notwendigkeit für eine erfolgreiche kontinuierliche Produktion mittels des gewünschten Weges. Bestimmte Erwägungen und Faktoren können im Gedächtnis behalten werden, während die Anzahl von mehrfachen Kopien oder Promotoren bestimmt wird, welche überexprimiert werden können, während die Lebensfähigkeit des Organismus aufrechterhalten wird. Im allgemeinen kann eine übermäßige Expression von Transportern für die Zellen schädlich sein, weil der verfügbare Platz, um die Transporter in die Membran einzubauen, begrenzt ist. Deshalb kann eine sehr übermäßige Überproduktion eines Transporters den Einbau anderer Transporter in die Membran verringern, welche beim Transport anderer Nährstoffe aus dem Medium beteiligt sein können. Das gentechnische Herbeiführen der Überexpression eines Zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktors könnte die Transporter-Fähigkeiten der gentechnisch veränderten Wirtszellen erhöhen oder stabilisieren.
Eine stabile Überexpression von H+-Symportern in bakteriellen Wirtszellen wird mehreren Zwecken dienen. Sie wird die transgene Expression erhöhen, während die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus beibehalten wird. Die Überexpression der Symporter ist einfacher als die Überexpression von ABC-Transportern, da Symporter keine übermäßige Codierung für die mehrfachen Komponenten des ABC-Transporters erfordern. Zum Dritten wird, durch Überexpression eines sekundären Transporters anstatt von ATP- oder PTS-gekoppelten Transporten, eine Umleitung von Energieanforderungen aus der Wirtszelle minimiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Nukleinsäure, codierend einen oder mehrere Transporter, über einen Expressionsvektor, der zur Replikation innerhalb der Wirtszelle fähig ist, in eine Wirtszelle eingebracht. Geeignete replizierende Plasmide für Pantoea sind in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, auf Grundlage der Tatsache beschrieben, dass Pantoea die Replikation der gleichen Plasmide aufrechterhält, wie E. coli.
In einer anderen Ausführungsform wird Nukleinsäure, welche einen oder mehrere Transporter codiert, stabil in das Mikroorganismen-Genom integriert. Bevorzugte Wirtszellen stammen aus der Gattung Pantoea. Eine andere bevorzugte Wirtszelle ist K. oxytoca. Mehrere Strategien sind in der Literatur für die Integration von DNA in das Chromosom beschrieben worden (siehe zum Beispiel Balbas et al., 1996, Gene 172: 65–69; LeBorge et al., 1998, Gene 223: 213–219).
Eine Transformation von P. citrea kann durch das Elektroporationsverfahren bewerkstelligt werden, wobei das für E. coli entwickelte Protokoll angewandt wird (Dotter, H., 1988, Anal. Biochem. 174: 361–373).
III. Identifikation von Transformanten
Nach Einbringen der DNA in den Wirt werden die Transformanten durch Antibiotikumresistenz, welche in dem Vektor codiert ist, oder im allgemeinen durch Selektieren hinsichtlich einer Funktion, welche innerhalb des Plasmids codiert wird, selektiert. Sobald Transformanten von nicht-transformierten Zellen unterschieden worden sind, kann das Vorhandensein des Plasmides mit einer intakten Struktur unter Anwendung von Standardprotokollen bestätigt werden (Sambrook et al., 1989).
Das Vorhandensein der YiaX2-, PermA-, PermB-, PE1- und PE6-Polynukleotidsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifizierung unter Verwendung von Sonden, Abschnitten oder Fragmenten der Polynukleotidsequenz, wie offenbart in der 1, nachgewiesen werden.
IV. Transport-Assays
Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Spiegel der Ascorbinsäure-Intermediate mittels HPLC-Methodik ist obenstehend erörtert worden.
Darüber hinaus ist dem Fachmann eine große Vielzahl an Markierungen und Konjugationstechniken bekannt und kann in verschiedenen Nuklein- und Aminosäureassays zum Einsatz kommen. Methoden zur Erzeugung einer markierten Hybridisierung oder von PCR-Sonden zum Nachweisen spezifischer Polynukleotidsequenzen schließen Oligo-Markierung, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotides ein. Alternativ dazu kann die Nukleotidsequenz, oder ein beliebiger Abschnitt davon, in einen Vektor für die Erzeugung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind im Fachgebiet bekannt, sind im Handel erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer passenden RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und markierter Nukleotide zu synthetisieren.
Eine Reihe von Firmen, wie Pharmacia Biotech (Piscataway, N. J.), Promega (Madison, Wis.) und US Biochemical Corp (Cleveland, Ohio) liefert kommerzielle Kits und Protokolle für diese Vorgehensweisen. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen schließen diese Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemolumineszente oder chromogene Mittel sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen ein. Patente, welche die Anwendung derartiger Markierungen lehren, schließen die U.S.-Patente Nr. 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149 und 4 366 241 ein. Des Weiteren kön nen rekombinante Immunoglobuline hergestellt werden, wie gezeigt im U.S.-Patent Nr. 4 816 567. Ebenfalls können rekombinante Immunoglobuline hergestellt werden, wie gezeigt im U.S.-Patent Nr. 4 816 567.
Beispiele
Beispiel I
Materialien und Methoden
a. Plasmid, Bakterienstamm und Medien: Plasmid pBCL1920, K. oxytoca, P. citrea 1392A. Der P. citrea-Stamm 1392A ist eine Variante von P. citrea, bei welchem es sich um 39140 handelt. pD92 wird zum Beispiel als ein Vektor beschrieben, welcher das DKG-Reduktase-Gen enthält; U.S.-Patent Nr. 5 376 544. Murphy-III-Medium enthielt Fructose, 0,5%, Phosphat 1,6%, MgSO₄·7H₂O 0,2%, Soytone 0,2%, Citrat 0,01%, (NH₄)₂SO₄ 1%. Spurensalze im ppm-Bereich, wie Fe, Co, Mn, Zn und Vitamine, wie Nikotinsäure, Folat und B12; M9-Medium: 0,9% Phosphat, 0,1% NaCl, 0,1% NH₄Cl, MgSO₄ 0,0005%, CaCl₂ 0,025%; Fermentationsmedium: Kaliumphosphat 1%, MgSO₄ 0,15%, Glutamat 1,5%, Fructose 2,5%, Ammoniumsulfat 0,1%, und eine Vitaminmischung, welche Biotin, Thiamin, Pyridoxin, Riboflavin, Nikotinsäure, Folsäure und B12 enthielt, und Spurenmetalle in einer Cocktail-Lösung, aufweisend Eisen-, Zn- und Mn-Ionen im Bereich von 10–100 ppm; Transport-Assay-Medium: 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,9; Antibiotika: Spectinomycin, 50 μg/ml, und Tetracyclin, 20 μg/ml, IPTG, 100 μM.
b. DNA-Techniken
c. Wachstum von Zellen: Stämme, welche unter Anwendung von rekombinanten Verfahren und Wildtyp-P. citrea und -K. oxytoca konstruiert worden waren, wurden entweder in M9-Medium, enthaltend DKG als die einzige Kohlenstoffquelle, oder MIII-Medium mit Fructose als der einzigen Kohlenstoffquelle oder mit MIII, welches eine gemischte Kohlenstoffquelle, wie Fructose, Gluconat und DKG im Bereich von 0,1% bis 1% aufwies, wachsen gelassen. Die Zellen wurden zwischen 20–37°C, jedoch vorzugsweise unter 30°C, herangezüchtet. Die Zellen wurden vorzugsweise bei neutralem pH-Wert, jedoch in einem Bereich, welcher von pH 5–8 betrug, wachsen gelassen. P.-citrea-Zellen, welche in einem Fermenter aus einem Animpfkolben herangezüchtet worden waren, verwendeten Fermentationsmedium unter Einsatz von entweder Fructose- oder Glucose-Zufuhr.
d. Biochemischer DKG-Aufnahme-Assay: Proben aus Zellen enthaltendem Fermentations-Nährmedium wurden aus der jeweiligen Wachstumsvorrichtung entnommen und wurden auf einem Eis-Wasser-Bad abgeschreckt. Das Fermentations-Nährmedium wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde unter Verwendung von 0,95 eiskalter Kochsalzlösung, gefolgt von 2 Waschungen mit DKG-Aufnahme-Assaypuffer, 100 mM eiskaltem Kaliumphosphat pH 6,9, gewaschen. Die Zellen wurden in dem gleichen Assaypuffer zu einer OD von 12 bei 550 nm resuspendiert und wurden bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei 28°C inkubiert. Der DKG-Aufnahme-Assay wurde durch Mischen der Zellen mit hinsichtlich C-14 angereichertem Radioisotop-markiertem 2,5-DKG begonnen. Der zeitliche Verlauf der DKG-Aufnahme wurde unter Einsatz von Vakuum/Filter-basierender Abschreckung unter Verwendung von eiskaltem Assay-Puffer bestimmt. Die DKG-Aufnahme-Messung erfolgte mittels Radioisotop-Einbau in die Zellen, und die erhaltenen Daten wurden gegen die Zeit aufgetragen, wodurch man die DKG-Aufnahmerate erhielt.
Ein anderer Assay unter Verwendung von Siliconöl für die zelluläre DKG-Aufnahme und für die Untersuchung des Metabolismus wurde ebenfalls durchgeführt (Johnson, J. D., et al., J. Lab. Clin. Med., 1980, 95: 429–439). 100 μl Siliconöl wurden in zum Assay bereite Eppendorf- bzw. Eppi-Röhrchen gegeben. Die Zellen und das 14C(U)-angereicherte 2,5-DKG wurden gemischt, und dann wurden in regelmäßigen Zeitintervallen 100 μl der Zell/Substrat-Mischung entnommen und in die Eppi-Röhrchen zugesetzt, welche Siliconöl enthielten, 15 Sekunden lang zentrifugiert und danach unverzüglich in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren. Nach fünf Minuten wird der Boden bzw. die Spitze des Eppi-Röhrchens, welche das Zellpellet enthält, direkt in ein Szintillationsgefäß hinein abgeschnitten. Der Rest des Röhrchens wird direkt oberhalb des gefrorenen Bereichs erneut geschnitten und in ein anderes Gefäß, welches Szintillationsfluid enthielt, fallen gelassen. Die Messung der Zähleinheiten erfolgte nach Stehenlassen über Nacht, um die Ablösung des Zellpellets aus der Spitze des Eppendorf-Röhrchens zu erleichtern. Der Unterschied zwischen der Abnahme an Zähleinheiten aus dem Oberteil und dem Auftreten von Zähleinheiten in dem Pellet ist auf den Zellstoffwechsel und das abgegebene CO₂ zurückzuführen. Am Ende des Aufnahme-Assays, als die Zellen permeabilisiert wurden, lief der niedermolekulare Inhalt der Zelle aus und lieferte Informationen über das angesammelte importierte Substrat und das Schicksal von Substrat, welches weiter verstoffwechselt wurde, um zu einer zellulären Komponente zu werden.
e. Assay auf DKG-Reduktasen: Zellpellets aus jedem Fermenter wurden aufgefangen und ungefähr 24 Stunden lang bei –70°C eingefroren. Pellets an den Zeitpunkten von 15 und 25 Stunden wurden auf Eis aufgetaut und in 50 mM PIPES-Puffer, pH 6,5, in einer French-Presse aufgeschlossen. Die Extrakte wurden 2 Minuten lang bei 14000 U/min auf einer Labortisch- Zentrifuge zentrifugiert und anschließend hinsichtlich der Gesamtproteinkonzentration und Reduktase-Aktivität gemessen. Alle Proben wurden mittels Bradford- und BCA-Assays hinsichtlich des Proteins gemessen und nach Bedarf für genaue Raten-Assays verdünnt. Die Assays wurden gegen Hintergrundraten gemessen, welche alles außer dem 2,5-DKG enthielten (und sämtlich weniger als 10% der Gesamtraten betrugen). Der Puffer enthielt: 50 mM PIPES pH 6,5, 150 μM NADPH und 5 mM 2,5-DKG.
Ein weiterer Assay unter Verwendung von Siliconöl auf zelluläre DKG-Aufnahme und zur Metabolismus-Untersuchung wurde ebenfalls durchgeführt (Johnson, J. D., et al., J. Lab. Clin. Med. 1980, 95: 429–439). 100 μl Siliconöl wurden in für den Assay bereite Eppendorf-Röhrchen zugesetzt. Zellen und 14C(U)-angereichertes 2,5-DKG wurden gemischt, und dann wurden zu regelmäßigen Zeitintervallen (zum Beispiel etwa alle 10 Sekunden) 100 μl der Zell/Substrat-Mischung entnommen und in die Eppendorf-Röhrchen, enthaltend Siliconöl, zugesetzt, 15 Minuten lang zentrifugiert und dann unverzüglich in einem Trockeneis/Ethanol-Bad gefroren. Nach fünf Minuten wird die Spitze des Eppendorf-Röhrchens, welche das Zellpellet enthielt, direkt in ein Szintillationsgefäß hinein abgeschnitten. Der Rest des Röhrchens wird direkt oberhalb des gefrorenen Bereichs erneut abgeschnitten und in ein anderes Gefäß fallen gelassen, welches das Szintillationsfluid enthielt. Die Messung der Zähleinheiten erfolgte nach Stehenlassen über Nacht, um die Ablösung des Zellpellets aus der Spitze des Eppendorf-Röhrchens zu erleichtern. Der Unterschied zwischen der Abnahme an Zähleinheiten aus dem Oberteil und dem Auftreten von Zähleinheiten in dem Pellet ist auf den Zellstoffwechsel und das abgegebene CO₂ zurückzuführen. Am Ende des Aufnahme-Assays, als die Zellen permeabilisiert wurden, lief der niedermolekulare Inhalt der Zelle aus und lieferte Informationen über das angesammelte importierte Substrat und das Schicksal von Substrat, welches weiter metabolisiert wurde, um zu zellulären Komponenten zu werden.
Beispiel II
Beispiel II liefert die Basis, dass Transporter von Substrat in einer Ganzzell-Biokonversion geschwindigkeitsbeschränkend sein können.
Dieses Beispiel führt die Schlüsselschritte der 2KLG-Bildung aus Glucose an, welche in vier Teile kompartimentiert werden kann (5). Die Produktion des Schlüssel-Intermediats 2,5-DKG unter Verwendung von drei periplasmatischen Enzymen erfolgt in P. citrea bei einer Rate von 14–15 g/l/h (Sonoyama et al., Appl. Environ. Microbiol., 1982, 43: 1064–1069). Der zweite Teil ist die Rate, mit welcher DKG benötigt wird, um in den cytoplasmatischen Raum der Zelle transportiert zu werden. Der Dritte ist die Rate der Umwandlung von DKG in 2KLG unter Verwendung von DKG-Reduktasen (U.S.-Patent Nr. 5 032 514). Die Umwandlung von DKG in 2KLG ist nicht Geschwindigkeits-beschränkend, wenn DKG-Reduktase überexprimiert wird. Bei unseren laufenden 2KLG-Produktionsfermentationen wurden induzierbare Plasmide verwendet, um Reduktase-spezifische Aktivitäten relativ zu unseren typischen Fermentationen sowohl zu erhöhen als auch zu verringern, welche derzeit pD92 verwenden, in welchem DKG-Reduktase unter einem konstitutiven trp-Promotor steht. Das induzierbare Plasmid, pD23, steht unter einem taq-Promotor und kann mit IPTG induziert werden. Es wurden drei Fermentatoren betrieben, einer mit pD92, und zwei mit pD23, von denen einer mit IPTG induziert wurde. Die Kontrolle, pD92, und das induzierte pD23 erzeugten nahezu identische Spiegel an 2-KLG, wohingegen das uninduzierte pD23 signifikant weniger erzeugte. Assays der Reduktase-spezifischen Aktivitäten zeigen, dass im Verhältnis zu der Kontrolle pD92, das uninduzierte Plasmid weniger als die Hälfte der Spiegel an Reduktase erzeugte, während das induzierte pD23 mehr als doppelt so viel herstellte. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Spiegel an Reduktase-Aktivität in unserer 2KLG erzeugenden P. citrea-Fermentation nicht der Engpaß für die Herstellung von 2-KLG ist.
Der vierte Teil ist der Transport von 2KLG, welches intrazellulär erzeugt wird und nach außen exportiert werden muß. Die Produktionsrate von 2KLG in der Fermentation (2,2 g/l/h–2,7 g/l/h) wird als gleichwertig zu der Exportrate von 2KLG aus der Zelle betrachtet. Es wird argumentiert, dass wenn die Exportrate von 2KLG limitierend ist, die Zellen dann 2KLG innerhalb der Zelle anhäufen werden, und die Zellen nicht in der Lage sein werden, bei ihrem metabolischen Potential zu funktionieren, und schließlich absterben. Allerdings zeigen 2KLG-Produktionszellen von P. citrea keinen dieser Zustände auf, und intrazelluläre Messungen von 2KLG bleiben um das 10–20-fache unterhalb der Maximumkonzentration von erzeugtem 2KLG. Es wird somit in Betracht gezogen, dass der 2KLG-Export ebenfalls nicht ein Geschwindigkeits-beschränkender Schritt bei der Produktion von 2KLG ist.
Beispiel III
Beispiel III liefert den Beweis, dass tatsächlich die Transportrate von Substrat in die Zelle hinein für die Biokonversion der Geschwindigkeits-beschränkende Schritt sein kann.
Zellpellets von drei verschiedenen Zeiten des Fermentationsverfahrens, Animpfkolben-Stadium, Fructosezufuhr-Stadium und Glucosezufuhr-Stadium, wurden abgesammelt und verarbeitet, wie im experimentellen Teil beschrieben. Der DKG-Aufnahme-Assay unter Verwendung dieser Zelltypen ergab DKG-Aufnahme-Raten von 0,5 g/l/h, 2,7 g/l/h und 2,75 g/l/h, bei denen das DKG eingebracht wurde, damit es zu KLG umgewandelt wird (9). Die Rate des DKG-Imports ist die gleiche wie die des KLG-Exports. Dieses Ergebnis demonstriert somit, dass die Rate der Biokonversion von DKG in KLG abhängig ist von der Importrate von 2,5-DKG in die Zelle hinein. Somit wird diese Erfindung zeigen, dass durch Zunahme der DKG-Aufnahme-Transporter mittels Überexpression die Importrate von 2,5-DKG verbessert werden wird, und dies somit die 2KLG-Produktionsrate steigern wird. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann ersehen, dass der ausschlaggebende limitierende Faktor in verschiedenen Biotransformationen unter Verwendung von Ganzzell-Konversions-Verfahren tatsächlich der Import und die Substratimportrate in die Zelle für die Biotransformation sein kann.
Beispiel IV
Beispiel IV gibt die Feststellung eines 2,5-DKG-Transporters in K. oxytoca unter Anwendung des DKG-Aufnahme-Assays an. Die WO 002170 beschreibt die Identifizierung und Sequenzierung eines Operons aus Klebsiella oxytoca, welches als das yia-Operon bezeichnet wird, das acht vermutliche offene Leseraster enthält. Die Funktionen dieser Polypeptide, welche von den individuellen offenen Leserastern in dem yia-Operon codiert sind, werden in der WO 002170 nicht beschrieben. Die Zerstörung dieses Operons beseitigte die Fähigkeit von K. oxytoca, Ascorbinsäure als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden. Es ist bekannt, dass Ascorbinsäure eine oxidativ instabile Substanz ist und sich durch Oxidation an Luft zu 2,3-DKG zersetzt (Kimaya, S., J. Vitaminol., 1961, 7: 19–26). Es war daher sinnvoll, anzunehmen, dass es 2,3-DKG ist, welches das wirkliche Substrat für das Wachstum ist. Eines der offenen Leseraster im yia-Operon, welches als yiaX2 bezeichnet wird, codierte ein Transmembranprotein vom Transporter-Typ und wurde daher als Kandidat für 2,3-DKG-Permease angesehen. Angesichts der parallelen Suche zum Auffinden von 2,5-DKG-Permease wurde somit, da 2,3-DKG und 2,5-DKG analoge Moleküle sind, festgestellt, dass es möglich sein kann, dass yiaX2 2,5-DKG und andere Zuckerketosäuren, wie 2KLG, transportieren kann.
Um zu bestimmen, ob yiaX2 2,5-DKG und 2-KLG transportieren kann, wurde dieses Gen aus dem Chromosom von K. oxytoca-Stamm 5Mal (siehe zum Beispiel Streicher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 68: 1174–1177 (1971)) deletiert. Die yiaX2-Deletionsmutante, welche als MGK002 bezeichnet wurde, wurde unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Standard- Molekularbiologie-Protokollen erzeugt (siehe zum Beispiel Hamilton et al., J. Bacterial., 171: 4617–4622 (1989)). Ein anderer, als Tester-Stamm bezeichneter, K. oxytoca-Stamm wurde durch Wiederzufügen das Plasmid-mäßig codierten und lac-Operon-regulierten yiaX2-Gens zum K. oxytoca-Stamm MGK002 erzeugt. Ein DKG-Aufnahme-Assay unter +/– IPTG-Induktion unter Verwendung des MGK002- und des Tester-Stamms bestätigte, dass yiaX2 ein Polypeptid codierte, welches 2,5-DKG-Transportaktivitäten aufwies (9).
Beispiel V
Das Beispiel V gibt die Selektionsmethodik zum Screenen nach 2,5-DKG-Permeasen aus Mikroorganismen an.
Mit der Information, dass das yiaX2-Gen ein Transporterprotein mit 2,5-DKG-Transportaktivitäten codierte, wurde es möglich, einen Selektionswirt zum Finden von 2,5-DKG-Transporterprotein von P. citrea und anderen biologischen Quellen zu entwerfen. Dabei handelt es sich um K. oxytoca mit einer Deletion des yiaX2-Gens und Hinzufügung von Genen zum Exprimieren von Enzymen, welche am Katabolismus von 2,5-DKG zu Gluconsäure, die für den Zentralstoffwechsel eines Organismus zugänglich ist, beteiligt sind. Enzyme, welche zum Katabolisieren von 2,5-DKG zu Gluconsäure in der Lage sind, werden von den tkr- und idno-Genen des tkr-idnD-idno-Operons codiert, das in einigen gramnegativen Organismen vorhanden ist (Bausch, C., et al., J. Bacteriol., 1998, 180: 3704–3710).
Der resultierende Tester-Stamm von K. oxytoca war yiaX2[tkr idno] und besaß alle Komponenten, die für ein Wachstum auf 2,5-DKG als alleiniger Kohlenstoffquelle benötigt werden, außer seinem Unvermögen, DKG in das Cytoplasma zu importieren. Deshalb sollte ein Nukleinsäuremolekül, welches eine 2,5-DKG-Permease codiert, bei Expression in dem Tester-Stamm, die Fähigkeit des Tester-Stamms vermitteln, auf 2,5-DKG zu wachsen. Diese Selektionsmethodik ist in der 9 gezeigt.
Der zum Konstruieren der genomischen P. citrea-Bibliotheken verwendete Klonierungsvektor ist das Plasmid pCI1920 (Lerner et al., Nucleic Acids Res., 1994, 18: 4621), ein Expressionsvektor mit geringer Kopienzahl, der eine Spectinomycin/Streptomycin-Resistenzdeterminante trägt. Die Expression wird von der lacPO-Promoter/Operator-Region gesteuert, welche von dem laclq-Genprodukt reprimiert wird, wenn es vom Wirt bereitgestellt wird. Genomische DNA aus P. citrea (ATCC 39140) wurde unter Anwendung von Standardprotokollen isoliert und eine genomische Bibliothek wurde hergestellt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992)). Die amplifizierten Bibliotheken wurden in der Form von Plasmid-DNA für die weitere Verwendung zum Aufspüren von 2,5-DKG-Permease von P. citrea aufbewahrt.
Beispiel VI
Das Beispiel VI liefert Beweise, dass man durch Überexprimieren des DKG-Transporters in der Wirtszelle die Rate des DKG-Imports in die Zelle erhöhen kann.
Die genomische Bibliothek wurde in den Tester-Stamm, K. oxytoca-Stamm yiaX2[tkr idno], eingebracht. Klone, welche auf 2,5-DKG unter Verwendung von M9-Agarplatten mit 2,5% 2,5-DKG und 0,1 mM IPTG wuchsen, wurden unter Verwendung von radioaktiv markiertem 14C(U)-DKG hinsichtlich der DKG-Aufnahme getestet. Von verschiedenen Klonen wurde festgestellt, eine bessere DKG-Aufnahme als der Kontroll-Tester-Stamm aufzuweisen (10). Die DNA der genomischen Bibliothek aus diesen positiven Klonen wurde in P. citrea (139-2A) transformiert, und ein DKG-Aufnahme-Assay wurde ausgeführt, um die Verbesserung der DKG-Aufnahme gegenüber dem P. citrea-Stamm 139-2A zu messen. Eine drei- bis fünffache Verbesserung der DKG-Aufnahmerate war in Transformanten mit zusätzlichen Kopien von Plasmid-codierten DKG-Permeasen zu beobachten, welche durch Screening der genomischen Bibliothek und Selektionsmethodik festgestellt wurden (11).
Beispiel VII
Das Beispiel VII liefert den Beweis, dass man durch Überexprimieren des DKG-Transporters in der Wirtszelle die Produktion von 2KLG erhöhen kann.
Als ein Nukleinsäuremolekül, das DKG-Permease PermA von Pantoea citrea (Seq ID No. 4) codiert, unter Verwendung des Niedrigkopien-Vektors pBCL1920 in einen Pantoea citrea-Stamm 139-2A, der für die Biosynthese von 2KLG aus Glucose geeignet war (U.S.-Patent 5 032 514), subkloniert wurde, verbesserte sich die Produktionsrate der Erzeugung von 2KLG von 2,5 g/l/h auf 3,2 g/l/h, und die Ausbeute an dem Zucker verbesserte sich von 45% zu 53% (11).
Beispiel VIII
Das Beispiel VIII beschreibt die Merkmale von 2,5-DKG-Permease PermA von P. citrea.
Dieses Beispiel beschreibt die Membrantopologie von PermA von P. citrea. Eine PFAM-Analyse (Hirokawa, T., et al., Bioinformatics, 1998, 4(4): 378) sagt vorher, dass das PermA 11 Transmembrandomänen aufweist, und zwar mit 8 primären Domänen und 3 sekundären durchspannenden Domänen (13). Das Amino-Ende liegt im Periplasma und das Carboxy-Ende liegt im Cytoplasma. Es exisitieren zwei größere und zwei kleinere Schleifen, und sowohl im Periplasma als auch im Cytoplasma liegen eine größere und eine kleinere Schleife vor. PermA ist ein Membranprotein mit einer Hydrophobizität von 0,62 und besitzt ein Molekulargewicht von 48 Dalton. Es handelt sich um einen mit einem H+ assoziierten Symporter von 2,5-DKG, basierend auf der Akkumulations-Verhältnis-Analyse (Lolkema, J. S., et al., 1996, Handbook of Biological Physics, Kapitel 11, 229–260). Auf Basis von Konsensus-Sequenzanalyse gehört es der ACS-Familie der MFS an (Pao, S. S., et al., Microbiol. Molecular Biol. Rev., 1998, 62: 1–34).
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Steigerung der biosynthetischen Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch eine Wirtszelle, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Auswählen einer Wirtszelle, die cytosolisch 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gulonsäure umwandelt; (b) Erhöhen des Transports der 2,5-Diketo-D-gluconsäure in die Wirtszelle unter Beibehalten der Unversehrtheit der Wirtszelle; (c) Kultivieren der Wirtszelle zur Herstellung der 2-Keto-L-gulonsäure; und (d) Herstellung der 2-Keto-L-gulonsäure.
Verfahren von Anspruch 1, wobei das Erhöhen des Transports von 2,5-Diketo-D-gluconsäure in die Wirtszelle den Schritt des Transformierens von DNA in die Wirtszelle umfasst, welche ein oder mehrere Proteine codiert, welche die 2,5-Diketo-D-gluconsäure in das cytosolische Material der Wirtszelle transportieren.
Verfahren von Anspruch 2, wobei das eine oder die mehreren Protein(e) gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H).
Verfahren von Anspruch 2, wobei die das Protein codierende DNA zur Hybridisierung unter Bedingungen von mäßiger Stringenz mit der Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, welche YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H) codiert.
Verfahren von Anspruch 2, wobei die das Protein codierende DNA mindestens 65% Identität mit der Nukleinsäuresequenz aufweist, welche YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H) codiert.
Verfahren von Anspruch 5, wobei die das Protein codierende DNA mindestens 90% Identität mit der Nukleinsäuresequenz aufweist, welche YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H) codiert.
Verfahren zur Steigerung des Transports von 2,5-Diketo-D-gluconsäure in das Cytosol über die innere Zellmembran, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Auswählen einer Wirtszelle; und Transformieren von DNA in die Wirtszelle, welche ein oder mehrere Proteine codiert, welche zum Transport von 2,5-Diketo-D-gluconsäure in die Wirtszelle in der Lage sind, wobei das eine oder die mehreren Protein(e) gewählt wird/werden aus YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H).
Verfahren von Anspruch 7, wobei die DNA, welche das Protein codiert, zur Hybridisierung unter Bedingungen von mäßiger Stringenz mit der Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, welche YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H) codiert.
Verfahren von Anspruch 7, wobei die das Protein codierende DNA mindestens 65% Identität mit der Nukleinsäuresequenz aufweist, welche YiaX2 (1A–B, 1I), PE1 (1C–D), PE6 (1E–F), prmA (1G) oder prmB (1H) codiert.
Verfahren von Anspruch 7, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe gewählt wird, welche aus Bakterien und Hefe besteht.
Verfahren von Anspruch 10, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe gewählt wird, welche aus E. coli, Pantoea und Klebsiella besteht.