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CN114045243B - 一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法 - Google Patents

一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，所述缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，包括配制培养基、发酵罐培养、发酵终点控制。本发明通过添加乳化硅油可以有效减少发酵周期，发酵周期缩短至38.1‑39.9h，L‑山梨糖生产速率达到8.48g/l/h‑9.89g/l/h；L‑山梨糖含量达到337.80g/l‑371.20g/l；乳化硅油还可以通过L‑山梨糖溶液转移至后续发酵液中继续发挥作用，消除因搅拌带来的泡沫，不影响正常发酵反应；而且不参与代谢，不会产生毒害物质，后续发酵步骤可持续起效，且提取产物时易于去除。

Description

一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法。
背景技术
维生素 C在医药和临床方面都具有重要的应用价值，亦广泛用于食品工业和化妆品工业。
目前工业上主要用两步发酵法生产Vc，此种方法初始需以D-山梨醇为底物，但是发酵过程长，操作工艺烦琐，易受杂菌、噬菌体污染等。根据生黑葡萄糖酸杆菌的生长特性，发酵过程中生黑葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为 L-山梨糖所需氧气含量较高；因此，提高菌种的氧气利用量，降低溶氧值是目前面临的主要问题。
现有工业上降低溶氧值的方法主要为增大罐压和通气量；罐压在工艺设备一定的情况下，提升能力有限；增加通气量会缩短空气过滤器使用寿命大幅增加成本；由上可知，现有技术降低溶氧值的成本较高，不便施行。
因此，提供一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，在降低生产成本的同时，提高菌种氧气利用量，降低溶氧值，提高L-山梨糖生产效率是现有技术亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明提供了一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，克服上述现有技术存在的缺陷，实现以下发明目的：
提供一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，在降低生产成本的同时，提高菌种氧气利用量，降低溶氧值，提高L-山梨糖生产效率。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，包括配制培养基、发酵罐培养、发酵终点控制；
步骤一：配制培养基
所述配制培养基，主要成分包括，D-山梨醇38-42g/L，玉米浆 0.14-0.16g/L，碳酸钙 0.08-0.12g/L；用一次水配制，定容，调节PH调至4.8-5.2；按照4‰体积浓度在发酵反应开始前加入乳化硅油；
所述玉米浆和碳酸钙均为标准产品。
步骤二：发酵罐培养
所述发酵罐培养，灭菌后，冷却发酵罐，按照初始通气量1.6-2.0 L/min，转速420-480r/min，培养温度35-37℃，接种生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，进行培养；
所述灭菌，灭菌温度为112-118℃，灭菌时间为23-27min；
所述冷却，冷却温度为37-39℃；
所述接种，接种量为15%；
所述生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，培养温度35-37℃，搅拌速度180-220rpm，培养时间23-25h，OD＞2时培养结束。
步骤三：发酵终点控制
所述发酵终点控制，根据发酵培养条件培养，持续发酵，每2h取样检测发酵进程，至D-山梨醇浓度降为1%以下，L-山梨糖含量不再增加，结束发酵。
本发明所述生黑葡萄糖酸杆菌，分类命名为：Gluconobacter oxydanssubsp.melanogenus，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省微生物研究所，保藏日期为2020年4月29日，保藏编号为GDMCC No：61006。
采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
1、乳化硅油还可以通过L-山梨糖溶液转移至后续发酵液中继续发挥作用，消除因搅拌带来的泡沫，不影响正常发酵反应；
2、本发明通过添加乳化硅油可以有效减少发酵周期，发酵周期缩短至38.1-39.9h，从而大大减少人力物力的消耗；
3、本发明通过添加乳化硅油可以有效提高发酵液氧接触面积，加快L-山梨糖生产速率，使其达到8.48g/l/h-9.89g/l/h；
4、本发明通过添加乳化硅油可以有效提高L-山梨糖含量，使其达到337.80g/l-371.20g/l；
5、乳化硅油价格低廉，易于添加、操作方便；
6、乳化硅油不参与代谢，不会产生毒害物质，后续发酵步骤可持续起效，且提取产物时易于去除。
附图说明
图1为实施例1中2#、3#、4#罐OD值；
图2为实施例1中2#、3#、4#罐山梨糖含量；
图3为实施例1中2#、3#、4#罐溶氧量。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
（1）配制培养基
选四个5L搅拌发酵罐紧密组合而成一组，按照一步发酵培养基配方配制发酵罐，其主要组成如下：D-山梨醇 40g/L，玉米浆 0.15g/L，碳酸钙 0.1g/L，用一次水配制，定容至3L，PH调至5.0；
所述玉米浆和碳酸钙均为标准产品；
1#罐不添加乳化硅油；
2#罐按照1‰体积浓度在发酵反应开始前加入乳化硅油；
3#罐按照1‰体积浓度在发酵反应开始前加入乳化硅油，并在发酵32h时再次加入35ml乳化硅油；
4#罐按照4‰体积浓度加入乳化硅油。
（2）发酵罐培养
115℃灭菌25min，罐内冷却至38℃后，初始通气量1.8L/min，转速450r/min，培养温度36℃，接种生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，接种量15%；培养至32h时，在3#罐再加入35ml乳化硅油；其余罐不作改变；
所述生黑葡萄糖酸杆菌，菌种保藏号为GDMCC No：61006；
所述生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，培养温度36℃，搅拌速度200rpm，培养时间24h，OD>2时培养结束。
（3）发酵终点控制
根据发酵培养条件培养，持续发酵，每2h取样检测发酵进程，至山梨醇浓度为降为1%以下，山梨糖含量不再增加，结束发酵。
采用实施例1技术方案，达到以下技术效果：
1#发酵罐不添加乳化硅油，因泡沫过多，发酵反应非常缓慢，不能正常进行发酵反应；
2#罐作为基础对照组，反应周期为47h，反应结束时OD值为3.12，L-山梨糖含量335.91g/l，产糖速率7.15g/L/h；
3#罐前期产糖速率为6.71 g/L/h，32h补加乳化硅油后溶氧突然升高，OD快速生长，产糖速率升高为12.13g/L/h，发酵周期缩短为42h；发酵终点时L-山梨糖含量是336.15g/L,平均产糖速率为8.00 g/L/h ；
4#罐发酵周期为39.5h，反应结束时，OD值为5.01，L-山梨糖含量339.18 g/L,产糖速率8.59g/L/h；到达反应终点时，4#罐较2#罐L-山梨糖生产速率提高了20.14%，较2#罐OD提高1.89，溶氧降低50.4%，4#罐全程溶氧量数据平均低于2#罐51.01%、OD高于2#罐1.98。
实施例2
用相同配方和培养条件，重复4#罐实验条件，保证实验结果准确性，避免为偶发、不可重复事件；最终实验发酵周期平均为39.5h，不同发酵罐产糖速率在8.32-9.86g/l/h之间波动，实验结论准确有效。
实施例3
在发酵培养基中添加4‰乳化硅油，利用5L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，接种量为15%，将培养好的二级种液 3.75L，接入含有25L发酵培养基的50L自动发酵罐中，初始pH值5.0，培养温度36℃，搅拌速度450r/min，发酵39.5h至终点；
所述生黑葡萄糖酸杆菌，菌种保藏号为GDMCC No：61006；
所述生黑葡萄糖酸杆菌二级种液的培养方法：培养基初始pH值为5.0，过程不控制pH，培养温度36℃，搅拌速度300r/min，发酵时间18-24h，OD>2时培养结束。
采用实施例3技术方案，达到的技术效果为：L-山梨糖含量368.20g/L，产糖速率9.32g/L/h，发酵周期为39.51h。
实施例4
在发酵培养基中添加4‰乳化硅油，利用50L自动发酵罐培养生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，接种量为15%，将培养好的二级种液 37.5L，接入含有250L发酵培养基的500L自动发酵罐中，初始pH值5.2，培养温度36℃，搅拌速度450r/min，发酵38.4h至终点；
所述生黑葡萄糖酸杆菌，菌种保藏号为GDMCC No：61006；
所述生黑葡萄糖酸杆菌二级种液的培养方法：培养基初始pH值为5.0，过程不控制pH，培养温度36℃，搅拌速度300r/min，发酵时间18-24h，OD>2时培养结束。
采用实施例4技术方案，达到的技术效果为： L-山梨糖含量359.42g/L，产糖速率9.36g/L/h，发酵周期为38.4h。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数，本发明所述的比例，均为质量比例。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，其特征在于，
所述缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，包括配制培养基、发酵罐培养、发酵终点控制；
所述配制培养基，主要成分包括：D-山梨醇、玉米浆、碳酸钙；然后用一次水配制，定容，调节pH至4.8-5.2；
所述玉米浆和碳酸钙均为标准产品；
所述配制培养基，按照4‰体积浓度在发酵反应开始前加入乳化硅油；
所述发酵罐培养，灭菌后，冷却发酵罐，按照初始通气量1.6-2.0 L/min，转速420-480r/min，培养温度35-37℃，接种生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，进行培养；
所述灭菌，灭菌温度为112-118℃，灭菌时间为23-27min；
所述冷却，冷却温度为37-39℃；
所述接种，接种量为15%；
所述生黑葡萄糖酸杆菌，菌种保藏号为GDMCC No：61006；
所述生黑葡萄糖酸杆菌二级种液，培养温度35-37℃，搅拌速度180-220rpm，培养时间23-25h，OD＞2时培养结束。
2.根据权利要求1所述的缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，其特征在于，
所述配制培养基，主要成分包括D-山梨醇38-42g/L，玉米浆 0.14-0.16g/L，碳酸钙0.08-0.12g/L。
3.根据权利要求1所述的缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，其特征在于，
所述发酵终点控制，根据发酵培养条件，持续发酵，每2h取样检测发酵进程，发酵结束。
4.根据权利要求3所述的缩短生黑葡萄糖酸杆菌发酵周期的方法，其特征在于，
所述发酵结束，D-山梨醇浓度降为1%以下，L-山梨糖含量不再增加。
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