JPH01174385A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
Ｄｎａおよびその用途Info
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- JPH01174385A JPH01174385A JP62328840A JP32884087A JPH01174385A JP H01174385 A JPH01174385 A JP H01174385A JP 62328840 A JP62328840 A JP 62328840A JP 32884087 A JP32884087 A JP 32884087A JP H01174385 A JPH01174385 A JP H01174385A
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- gene
- bacillus
- imp dehydrogenase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は５′−イノシン酸の合成原料として重要な物質
であるイノシンの製造法、その製造に用いられる新規微
生物および該新規微生物を造成するに用いられる新規Ｄ
ＮＡに関する。
であるイノシンの製造法、その製造に用いられる新規微
生物および該新規微生物を造成するに用いられる新規Ｄ
ＮＡに関する。
従来の技朱
発酵法によるイノシンの製造法に関しては、アデニン要
求性であるか、さらにそれに加えて各種の薬剤耐性を付
与したバチルス属細菌（特公昭５５−２９５６．特公昭
５７−４１９１５．特開昭５９−４２８９５）、ブレビ
バクテリウム属細菌［特公昭５１−５０７５．アグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）４２、 ３９９（１
９７８）］等を用いる方法が知られている。これらはプ
リンヌクレオチドの生合成系が強化された菌株と考えら
れる。
求性であるか、さらにそれに加えて各種の薬剤耐性を付
与したバチルス属細菌（特公昭５５−２９５６．特公昭
５７−４１９１５．特開昭５９−４２８９５）、ブレビ
バクテリウム属細菌［特公昭５１−５０７５．アグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）４２、 ３９９（１
９７８）］等を用いる方法が知られている。これらはプ
リンヌクレオチドの生合成系が強化された菌株と考えら
れる。
一方、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（５′−イノノン酸脱水
素酵素）を欠損させるとイノシン生成の中間体である５
′−イノノン酸が５′−グアニル酸に転換することなく
、効率よくイノシンに転換することが期待されることか
ら、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ欠損性株を取得することは
、イノシンの多量蓄積のための一つの有力な方法である
と考えられる。このような目的のためには、従来、紫外
線照射、ニトロソグアニジン（Ｎ ”Ｉ” Ｇソｊ：
Ｊ二’の変異誘起処理を行い、レプリカ・プレート法な
どを用いてキサンチン又はグアニン要求性株を選択する
方法が行なわれてきた。
素酵素）を欠損させるとイノシン生成の中間体である５
′−イノノン酸が５′−グアニル酸に転換することなく
、効率よくイノシンに転換することが期待されることか
ら、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ欠損性株を取得することは
、イノシンの多量蓄積のための一つの有力な方法である
と考えられる。このような目的のためには、従来、紫外
線照射、ニトロソグアニジン（Ｎ ”Ｉ” Ｇソｊ：
Ｊ二’の変異誘起処理を行い、レプリカ・プレート法な
どを用いてキサンチン又はグアニン要求性株を選択する
方法が行なわれてきた。
Ｒ［が解決しようとする問題点
しかしながら、このようにして得られた要求性変異株は
当該酵素遺伝子の変異以外にも、染色体上の他の部位に
於て変異を起こしていることが多く、生産性が親株に比
べ低下したり、あるいは発酵中に復帰変異があるために
、生産性が低下したり安定性を欠くなどの問題点があっ
た。
当該酵素遺伝子の変異以外にも、染色体上の他の部位に
於て変異を起こしていることが多く、生産性が親株に比
べ低下したり、あるいは発酵中に復帰変異があるために
、生産性が低下したり安定性を欠くなどの問題点があっ
た。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、このような現状に鑑み、ＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ欠損性株の取得方法について鋭意検討を行った
結果、組換えＤ Ｎ Ａ技法を用いて、ＩＭＰデヒトロ
ケナーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ中に、他から選ばれ
た適当なりＮＡ断片が挿入されたような構造の染色体Ｄ
ＮＡを有する新規微生物を造成することに成功した。本
手法を用いて、アデニン要求性を有するバチルス属細菌
から選ばれた微生物を受容菌として、これから誘導され
た該新規微生物は、多量のイノシンを蓄積し、発酵中に
於てＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性の復帰変異率は検出限
界以下であるために、きわめて安定性のある生産がくり
かえし実施できることを見出した。本発明は、このよう
な知見に基いて完成された。
ゲナーゼ欠損性株の取得方法について鋭意検討を行った
結果、組換えＤ Ｎ Ａ技法を用いて、ＩＭＰデヒトロ
ケナーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ中に、他から選ばれ
た適当なりＮＡ断片が挿入されたような構造の染色体Ｄ
ＮＡを有する新規微生物を造成することに成功した。本
手法を用いて、アデニン要求性を有するバチルス属細菌
から選ばれた微生物を受容菌として、これから誘導され
た該新規微生物は、多量のイノシンを蓄積し、発酵中に
於てＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性の復帰変異率は検出限
界以下であるために、きわめて安定性のある生産がくり
かえし実施できることを見出した。本発明は、このよう
な知見に基いて完成された。
すなイっち、本発明は、
（１））＜ヂルス属菌のＩＭＰデヒｌ仙゛ｌゲナーゼ遺
伝子領域および（または）その周辺領域と高い相同性を
有し、かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝
子をコードするＤＮＡ。
伝子領域および（または）その周辺領域と高い相同性を
有し、かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝
子をコードするＤＮＡ。
（２） ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域内にその
遺伝子を損わせるＤＮＡフラグメントを組み込ませてな
る第（１）項記載のＤＮＡ、 （３） ＤＮＡフラグメントがＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子以外の他遺伝子である第（２）項記載のＤＮＡ
。
遺伝子を損わせるＤＮＡフラグメントを組み込ませてな
る第（１）項記載のＤＮＡ、 （３） ＤＮＡフラグメントがＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子以外の他遺伝子である第（２）項記載のＤＮＡ
。
（４）他遺伝子が選択マーカ遺伝子である第（３）項記
載のＤＮＡ。
載のＤＮＡ。
（５） ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部または
全部を欠失させてなる第（１）項記載のＤＮＡ。
全部を欠失させてなる第（１）項記載のＤＮＡ。
（６）第（’１ ）、（２）、（３）、（４）および（
５）項記載のＤＮＡが組み込まれたベクター、 （７）第（４）項または（５）項記載のＤＮＡあるいは
第（６）項記載のベクターで形質転換され、ＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼを欠損しイノノン生産能を有するバチルス
属菌、および （８）バチルス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領
域および（または）その周辺領域と高い相同性を有し、
かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子をコ
ードするＤＮＡ、あるいはこれらのＤＮＡが組み込まれ
たベクターで形質転換され、ＩＭＰデヒドロゲナーゼを
欠損しイノシン生産能を有するバチルス属菌を培地に培
養し、イノシンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするイノシンの製造法、である。
５）項記載のＤＮＡが組み込まれたベクター、 （７）第（４）項または（５）項記載のＤＮＡあるいは
第（６）項記載のベクターで形質転換され、ＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼを欠損しイノノン生産能を有するバチルス
属菌、および （８）バチルス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領
域および（または）その周辺領域と高い相同性を有し、
かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子をコ
ードするＤＮＡ、あるいはこれらのＤＮＡが組み込まれ
たベクターで形質転換され、ＩＭＰデヒドロゲナーゼを
欠損しイノシン生産能を有するバチルス属菌を培地に培
養し、イノシンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするイノシンの製造法、である。
本発明に用いられるＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域
を含むＤＮＡは、微生物の染色体ＤＮＡより常法により
制限酵素で切り出されたものが用いられる。たとえば特
開昭６０−１５６３８８号に記載した方法で単離クロー
ン化したものを用いることができる。この場合、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼをコードする全てのＤＮＡ部分と更に
その前後に若干の周辺部分を含んでいるＤＮＡであるこ
とが望ましいが、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部
あるいは該遺伝子の一部とその周辺部分を含んでいるＤ
ＮＡであってもさしつかえない。
を含むＤＮＡは、微生物の染色体ＤＮＡより常法により
制限酵素で切り出されたものが用いられる。たとえば特
開昭６０−１５６３８８号に記載した方法で単離クロー
ン化したものを用いることができる。この場合、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼをコードする全てのＤＮＡ部分と更に
その前後に若干の周辺部分を含んでいるＤＮＡであるこ
とが望ましいが、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部
あるいは該遺伝子の一部とその周辺部分を含んでいるＤ
ＮＡであってもさしつかえない。
上記において、ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードする全
てのＤＮＡとは、１．８５キロベースペア１１ｔＩｔｌ
に：Ｘｂａ Ｉ −Ｈｉｎ ＣＩ［の断片を有するも
のであればよい。
てのＤＮＡとは、１．８５キロベースペア１１ｔＩｔｌ
に：Ｘｂａ Ｉ −Ｈｉｎ ＣＩ［の断片を有するも
のであればよい。
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の供与菌は、該菌株のＩ
ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列が後述の受容菌
として用いられるバチルス属菌の染色体上のＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列との相同性が高いもので
あれば、原則としてその由来については特別な制限はな
く、どのような微生物でも供与菌として用いることがで
きる。
ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列が後述の受容菌
として用いられるバチルス属菌の染色体上のＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列との相同性が高いもので
あれば、原則としてその由来については特別な制限はな
く、どのような微生物でも供与菌として用いることがで
きる。
とりわけ、バチルス属菌を用いればいわゆるセルフクロ
ーニングとなり取扱いのうえからも好ましく、また得ら
れた形質転換株も安定であることが期待される。また該
供与菌は必ずしもイノシン。
ーニングとなり取扱いのうえからも好ましく、また得ら
れた形質転換株も安定であることが期待される。また該
供与菌は必ずしもイノシン。
グアノシン、キザントシンあるいは、これらのプリン塩
基を生産する能力を有している必要はないが、ＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼの欠損性のないものが好ましい。このよ
うなりＮＡ供与菌としては、バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プ
ミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）あるい
はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉ
ｃｈｅｎｉｆ’ｏｒｍｉｓ）のバチルス属菌が挙げられ
る。
基を生産する能力を有している必要はないが、ＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼの欠損性のないものが好ましい。このよ
うなりＮＡ供与菌としては、バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プ
ミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）あるい
はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉ
ｃｈｅｎｉｆ’ｏｒｍｉｓ）のバチルス属菌が挙げられ
る。
たとえば、次のような菌株が例示される。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎ Ａ −
６０１１（ＩＰＯ１４１８９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９
１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−
６０１２（ＩＰＯ１４１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９
２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−
７８２１（ＩＦＯ１４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１
８）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｊｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１２８（Ｉ Ｆ Ｏ１４３７３、Ｆ’ＥＲＭ
ＢＰ−６１７）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｎｏ、１１５（Ｉ Ｐ ０ １４１８７） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎｏ、１
６８（ＢＧＳＣＮｏ、 ＩＡＩ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ
１１４［Ｇｅｎｅ、 ２４．２５５（１９８３）］Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ
−２１１６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ
（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ −４８３２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ −４８２９）
Ｂ Ｇ Ｓ Ｃ； Ｔ ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋｅｎｔｅｒ ＩＦＯ、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の寄託番号 Ｆ、ＥＲＭ Ｐ ； 工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）の寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ、 ブタペスト条約に基づ＜Ｆ’Ｒ
Ｉの寄託番号 さらに当然のことながら、既にクローン化されたバチル
ス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子もまた、用いら
れた宿主ベクター系のいかんにかかわらず本発明におけ
るＤＮＡ供与の目的に用いることができる。このような
りローン化されり■ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の例と
しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ
−６０１２株由来のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含
むＤＮＡがＩ）ＢＲ３２２上にクローン化された１）Ｅ
Ｘ１１７あるいはこれらからサブクローニングによって
得られるｐＥＸ１４７などが挙げられる（特開昭６０−
１５６３８８号）。ｐＥＸ１１７あるいはｐＥＸ１４７
は該プラスミドを保持するエシェリヒアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏ坪）ＴＥＸ１１７あるいはＴＥＸ
１４７より「モレキュラークローニング」（書名：
Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＡ、 Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 東大出版会刊
１９８２年）第８６頁〜第９３頁に記載の方法で抽出
することができる。
６０１１（ＩＰＯ１４１８９、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９
１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−
６０１２（ＩＰＯ１４１９０、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９
２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−
７８２１（ＩＦＯ１４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１
８）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｊｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１２８（Ｉ Ｆ Ｏ１４３７３、Ｆ’ＥＲＭ
ＢＰ−６１７）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｎｏ、１１５（Ｉ Ｐ ０ １４１８７） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎｏ、１
６８（ＢＧＳＣＮｏ、 ＩＡＩ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ
１１４［Ｇｅｎｅ、 ２４．２５５（１９８３）］Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ
−２１１６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ
（Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ −４８３２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ −４８２９）
Ｂ Ｇ Ｓ Ｃ； Ｔ ｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋｅｎｔｅｒ ＩＦＯ、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の寄託番号 Ｆ、ＥＲＭ Ｐ ； 工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）の寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ、 ブタペスト条約に基づ＜Ｆ’Ｒ
Ｉの寄託番号 さらに当然のことながら、既にクローン化されたバチル
ス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子もまた、用いら
れた宿主ベクター系のいかんにかかわらず本発明におけ
るＤＮＡ供与の目的に用いることができる。このような
りローン化されり■ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の例と
しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ
−６０１２株由来のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含
むＤＮＡがＩ）ＢＲ３２２上にクローン化された１）Ｅ
Ｘ１１７あるいはこれらからサブクローニングによって
得られるｐＥＸ１４７などが挙げられる（特開昭６０−
１５６３８８号）。ｐＥＸ１１７あるいはｐＥＸ１４７
は該プラスミドを保持するエシェリヒアコリ（Ｅｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏ坪）ＴＥＸ１１７あるいはＴＥＸ
１４７より「モレキュラークローニング」（書名：
Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＡ、 Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 東大出版会刊
１９８２年）第８６頁〜第９３頁に記載の方法で抽出
することができる。
本発明のＤＮＡを造成・単離するには、組換えＤＮＡ技
法を用いるのが簡便であり、この目的に用いられるポス
ト・ベクター系としては通常用いられるＥＫ系すなわち
宿主としてはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ −１
２株由来のたとえばＥｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｃ
６００ｆ「モレキュラークローニング」第５０４頁）、
Ｅｓｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ａ ２２
］ （ＩＦＯＩ ４３５９）、 Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ２９４［Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７３゜４Ｉ７
４（１９７６）］あるいはその誘誘導口例、０６００株
から誘導されたギザンヂン要求性株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｘ−８９５（ｒＦｏ １４３０８
、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４）］が好適に用いられ、ま
たベクターとしては、ｐＢＲ３２２，ｐＡｃＹＣ１８４
，ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＣ＋８．ｐＵＣ１９，ｐＨ３
Ｇ ３９６．ｐＨ９Ｇ ２９８などが好適に用いら
れる。
法を用いるのが簡便であり、この目的に用いられるポス
ト・ベクター系としては通常用いられるＥＫ系すなわち
宿主としてはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ −１
２株由来のたとえばＥｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｃ
６００ｆ「モレキュラークローニング」第５０４頁）、
Ｅｓｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ａ ２２
］ （ＩＦＯＩ ４３５９）、 Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ２９４［Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１．
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７３゜４Ｉ７
４（１９７６）］あるいはその誘誘導口例、０６００株
から誘導されたギザンヂン要求性株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｘ−８９５（ｒＦｏ １４３０８
、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４）］が好適に用いられ、ま
たベクターとしては、ｐＢＲ３２２，ｐＡｃＹＣ１８４
，ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＣ＋８．ｐＵＣ１９，ｐＨ３
Ｇ ３９６．ｐＨ９Ｇ ２９８などが好適に用いら
れる。
本発明の新規ＤＮＡはＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を
含むプラスミドから次のような手順で造成単離すること
ができる。
含むプラスミドから次のような手順で造成単離すること
ができる。
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドを常法
により制限酵素で切断し、また一方組込まれるべきＤＮ
Ａフラグメントを常法により制限酵素で切断して、必要
に応じては該切断をたとえばアガロースゲル電気泳動で
分離後抽出単離し、両者を混合し、接着末端が同一の場
合はそのままＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリカーゼを用いて連結
し、また接着末端が異なる場合はＴ ４ Ｄ Ｎ Ａポ
リメラーゼを用いて平滑末端に転換してからＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結することによって目的とするＤＮＡを得
ることができる。
により制限酵素で切断し、また一方組込まれるべきＤＮ
Ａフラグメントを常法により制限酵素で切断して、必要
に応じては該切断をたとえばアガロースゲル電気泳動で
分離後抽出単離し、両者を混合し、接着末端が同一の場
合はそのままＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリカーゼを用いて連結
し、また接着末端が異なる場合はＴ ４ Ｄ Ｎ Ａポ
リメラーゼを用いて平滑末端に転換してからＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結することによって目的とするＤＮＡを得
ることができる。
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドを切断
する制限酵素としては、該遺伝子ＤＮＡ上に切断個所を
有するものであればどのようなものでも使用可能である
が、該遺伝子」二の切断個所が少なくかつ当該プラスミ
ドの他の部分を切断しないものが好ましく選ばれる。た
とえば、Ｎ珪■、 戊匣１． 戊翌１． 堕ＨＩ 。
する制限酵素としては、該遺伝子ＤＮＡ上に切断個所を
有するものであればどのようなものでも使用可能である
が、該遺伝子」二の切断個所が少なくかつ当該プラスミ
ドの他の部分を切断しないものが好ましく選ばれる。た
とえば、Ｎ珪■、 戊匣１． 戊翌１． 堕ＨＩ 。
圧蛙Ｉ、ジｇｉｌｌ、 胆 ＥＩＩ、 以圓Ｉ。
１ｌ−
Ｘｂａ １． Ｘｈｏ Ｔ などが適宜用いられる
。
。
次に、本発明においてＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領
域内に組み込まれるＤＮＡフラグメントは、該遺伝子を
損わせるものであればよく、原核生物、真核生物のＤＮ
Ａ断片など由来を問わず用いることができる。通常は、
ＩＭＰデヒドロゲナーゼを欠損させると共に形質転換株
の選択が容易となるように、選択マーカ遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメントを用いるのか実用上有利である。
域内に組み込まれるＤＮＡフラグメントは、該遺伝子を
損わせるものであればよく、原核生物、真核生物のＤＮ
Ａ断片など由来を問わず用いることができる。通常は、
ＩＭＰデヒドロゲナーゼを欠損させると共に形質転換株
の選択が容易となるように、選択マーカ遺伝子を含むＤ
ＮＡフラグメントを用いるのか実用上有利である。
このような、選択可能な遺伝子マーカーとしては、バチ
ルス属菌内で発現するものてあればいずれでもよいが、
大腸菌の宿主内で発現すれば更に好適である。この場合
、バチルス属菌内での発現および大腸菌の宿主内での発
現はいわゆるリードスルー（ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇ
ｈ）であっても差しつかえなく、従って挿入ＤＮＡ断片
中に必ずしも当該宿主中で発現するプロモータを有して
いる必要はない。
ルス属菌内で発現するものてあればいずれでもよいが、
大腸菌の宿主内で発現すれば更に好適である。この場合
、バチルス属菌内での発現および大腸菌の宿主内での発
現はいわゆるリードスルー（ｒｅａｄ ｔｈｒｏｕｇ
ｈ）であっても差しつかえなく、従って挿入ＤＮＡ断片
中に必ずしも当該宿主中で発現するプロモータを有して
いる必要はない。
このようなマーカー遺伝子の一例として、薬剤耐性遺伝
子、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミ
ン生合成遺伝子などが挙げられる。
子、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミ
ン生合成遺伝子などが挙げられる。
薬剤耐性遺伝子としては、たとえばＢａｃｉｌｌｕｓｐ
ｕｍｉｌｕｓのクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子［Ｄ、λ１． Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ｅｔ ａｌ、。
ｕｍｉｌｕｓのクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子［Ｄ、λ１． Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ｅｔ ａｌ、。
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６． Ｉ １
６２（１９８１）］。
６２（１９８１）］。
プラスミドｐｃＩ９４のクロラムフェニコールアセデル
トランスフェラーゼ遺伝子［３，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ
ａｎｄ Ｂ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ 、 Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、 ］ ５０゜８１５（］ ９８２
）］、プラスミドｐＵＢ］１０のカナマイシンヌクレオ
チンルトランスフェラーゼ遺伝子［Ｍ、 Ｍａｔｓｕｍ
ｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、。
トランスフェラーゼ遺伝子［３，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ
ａｎｄ Ｂ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ 、 Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、 ］ ５０゜８１５（］ ９８２
）］、プラスミドｐＵＢ］１０のカナマイシンヌクレオ
チンルトランスフェラーゼ遺伝子［Ｍ、 Ｍａｔｓｕｍ
ｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、。
１６０、 ４＋３（１９８４）］などが挙げられる。
アミノ酸生合成遺伝子としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ のロイノン生合成系遺伝子［Ｔ、 Ｔ
ａｎａｋａａｎｄ Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、
Ｍｏｌｅｃ９ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、。
ｂｔｉｌｉｓ のロイノン生合成系遺伝子［Ｔ、 Ｔ
ａｎａｋａａｎｄ Ｋ、 Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、
Ｍｏｌｅｃ９ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、。
伝子［Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
上５９． ９０５（１９８４）］などがまた核酸生合成
系遺伝子の例としてはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔチミジン合成酵素［Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ、、
Ｇｅｎｅ １０゜２２７（１９８０）１などが、さら
にビタミン合成系遺伝子の例としては、マウスのジヒド
ロ葉酸還元酵素［Ｄ、 Ｍ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ １６゜１９９（１９８１
）］などが挙げられる。
系遺伝子の例としてはＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔチミジン合成酵素［Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ、、
Ｇｅｎｅ １０゜２２７（１９８０）１などが、さら
にビタミン合成系遺伝子の例としては、マウスのジヒド
ロ葉酸還元酵素［Ｄ、 Ｍ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ １６゜１９９（１９８１
）］などが挙げられる。
たとえば薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡを用いる場合、選
択用培地に当該抗生物質を添加する等の方法によって、
また生合成遺伝子をマーカーとする場合は栄養要求性の
相補によって挿入不活性化されたＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を有する形質転換株の選択が容易に行うことが
できる。
択用培地に当該抗生物質を添加する等の方法によって、
また生合成遺伝子をマーカーとする場合は栄養要求性の
相補によって挿入不活性化されたＩＭＰデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を有する形質転換株の選択が容易に行うことが
できる。
選択マーカー遺伝子ＤＮＡフラグメントの造成は次のよ
うにして実施できる。
うにして実施できる。
選択マーカー遺伝子ＤＮＡを単離するには、該遺伝子を
含む組換え体を適当に選ばれた制限酵素を用いて切断し
、アガロースゲル電気泳動で分画後該遺伝子を含むアガ
ロースゲル断片から公知の方法たとえばモレキュラーク
ローニング第１６４頁〜１６６頁記載の方法に従って単
離することができる。この際用いられる制限酵素として
は該遺伝子上に切断部位をもたずにかっ、該遺伝子を含
む出来得る限り小さな断片を与えるようなものが好まし
く選ばれる。必要に応じては、適当な二つの制限酵素を
組合わせて用いることも可能である。
含む組換え体を適当に選ばれた制限酵素を用いて切断し
、アガロースゲル電気泳動で分画後該遺伝子を含むアガ
ロースゲル断片から公知の方法たとえばモレキュラーク
ローニング第１６４頁〜１６６頁記載の方法に従って単
離することができる。この際用いられる制限酵素として
は該遺伝子上に切断部位をもたずにかっ、該遺伝子を含
む出来得る限り小さな断片を与えるようなものが好まし
く選ばれる。必要に応じては、適当な二つの制限酵素を
組合わせて用いることも可能である。
またこのようにして得られた選択マーカー遺伝子ＤＮＡ
断片の両端が挿入しようとするＩＭＰデヒドロゲナーゼ
遺伝子の切断部位の接着末端と一致せぬ場合にはＴ４ポ
リメラーゼを用いて該接着末端を平滑末端に転換するこ
とにより連結が可能となる。
断片の両端が挿入しようとするＩＭＰデヒドロゲナーゼ
遺伝子の切断部位の接着末端と一致せぬ場合にはＴ４ポ
リメラーゼを用いて該接着末端を平滑末端に転換するこ
とにより連結が可能となる。
一方、本発明においてＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の
周辺領域を有し該遺伝子の一部または全部を欠失するＤ
ＮＡの調製は該遺伝子上に切断点を有する制限酵素を用
いて、常法により切断し、あるいは必要に応じては、部
分分解した後に、また必要に応じてはＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて接着末端を平滑末端に転換した後に、再
連結を行うことによって目的とするＤＮＡを得ることが
できる。ここでいう周辺領域のＤＮＡとしては、ＩＭＰ
遺伝子領域の５′−上流域および３′−下流域からそれ
ぞれ約０．０５キロベ一スベア以上、好ましくは約０．
１〜１０キロベースペア離れた領域までのものがあげら
れる。
周辺領域を有し該遺伝子の一部または全部を欠失するＤ
ＮＡの調製は該遺伝子上に切断点を有する制限酵素を用
いて、常法により切断し、あるいは必要に応じては、部
分分解した後に、また必要に応じてはＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて接着末端を平滑末端に転換した後に、再
連結を行うことによって目的とするＤＮＡを得ることが
できる。ここでいう周辺領域のＤＮＡとしては、ＩＭＰ
遺伝子領域の５′−上流域および３′−下流域からそれ
ぞれ約０．０５キロベ一スベア以上、好ましくは約０．
１〜１０キロベースペア離れた領域までのものがあげら
れる。
本発明のＤＮＡを得る方法をたとえば該ＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子上に２つの切断点を有する制限酵素を用
いた場合について更に具体的に説明する。先ず、該酵素
遺伝子を含むプラスミドを常法により制限酵素で切断し
、該酵素をたとえば加熱により失活させた後、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱を行い、その沈澱物をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて再び連結を行なわせる。この際、制
限酵素での切断後たとえばアガロースゲル電気泳動を用
いて、欠失させるべきＤＮＡ断片を分離除去した後にＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて再連結する方法も用いること
ができる。かくして、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を
コードするＤＮＡ上の制限酵素切断点に挟さまれた小断
片が欠失した構造を有する本発明のＤＮＡを得ることが
できる。
ゲナーゼ遺伝子上に２つの切断点を有する制限酵素を用
いた場合について更に具体的に説明する。先ず、該酵素
遺伝子を含むプラスミドを常法により制限酵素で切断し
、該酵素をたとえば加熱により失活させた後、フェノー
ル抽出、エタノール沈澱を行い、その沈澱物をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて再び連結を行なわせる。この際、制
限酵素での切断後たとえばアガロースゲル電気泳動を用
いて、欠失させるべきＤＮＡ断片を分離除去した後にＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて再連結する方法も用いること
ができる。かくして、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を
コードするＤＮＡ上の制限酵素切断点に挟さまれた小断
片が欠失した構造を有する本発明のＤＮＡを得ることが
できる。
次に、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子上に３ケ所以上の
切断点を有していたり、あるいは、更にＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を含むプラスミド上の該酵素遺伝子以外
の他の部分に切断点を有している制限酵素を用いて本発
明のＤＮＡを作製する場合には、該制限酵素で部分分解
を行った後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連結すれば
よい。
切断点を有していたり、あるいは、更にＩＭＰデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を含むプラスミド上の該酵素遺伝子以外
の他の部分に切断点を有している制限酵素を用いて本発
明のＤＮＡを作製する場合には、該制限酵素で部分分解
を行った後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連結すれば
よい。
また、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子上にただ１ケ所の
切断点を有する制限酵素を用いても本発明のＤＮＡを得
ることが出来る。この場合は、制限酵素での切断後に接
着末端を生ずる場合にはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い
て接着末端を平滑末端に転換させた後にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結する。このような方法によると接着末
端を平滑末端に転換する際に塩基の付加あるいは削除が
おこり、本発明の目的とするＤＮＡを得ることができる
。また当然のことながらＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子
上に切断点を有する適当な複数の制限酵素を用いて、そ
れらの切断点に挟まれた小断片を欠失させることも可能
である。
切断点を有する制限酵素を用いても本発明のＤＮＡを得
ることが出来る。この場合は、制限酵素での切断後に接
着末端を生ずる場合にはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い
て接着末端を平滑末端に転換させた後にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結する。このような方法によると接着末
端を平滑末端に転換する際に塩基の付加あるいは削除が
おこり、本発明の目的とするＤＮＡを得ることができる
。また当然のことながらＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子
上に切断点を有する適当な複数の制限酵素を用いて、そ
れらの切断点に挟まれた小断片を欠失させることも可能
である。
次に本発明の新規ＤＮＡを大型に得るには、上述のＴ４
ＤＮＡリガーセで連結させた反応液を用いて宿主菌を形
質転換し、挿入されている選択マーカーに対応する選択
用培地に生育してきた形質転換株を得、この形質転換株
から自体公知の方法、たとえば前出の「モレキユラー・
クローニング」第８６頁〜第９３頁に記載の方法に従っ
て行うことができる。
ＤＮＡリガーセで連結させた反応液を用いて宿主菌を形
質転換し、挿入されている選択マーカーに対応する選択
用培地に生育してきた形質転換株を得、この形質転換株
から自体公知の方法、たとえば前出の「モレキユラー・
クローニング」第８６頁〜第９３頁に記載の方法に従っ
て行うことができる。
かくして得られたプラスミドからマーカーが組み込まれ
たＩＭＰデヒトロゲナーセ遺伝子部分を単離するには、
常法により制限酵素を用いて該プラスミドを切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、たとえばエレクト
ロエルータを用いることによって容易に抽出単離するこ
とができる。
たＩＭＰデヒトロゲナーセ遺伝子部分を単離するには、
常法により制限酵素を用いて該プラスミドを切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、たとえばエレクト
ロエルータを用いることによって容易に抽出単離するこ
とができる。
一方、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部または全部
を欠失させたＤＮＡを犬歯に得るには、上述のＴ ４
Ｄ Ｎ Ａリガーゼで連結させた反応液を用いてギザン
ヂン要求性宿主菌を形質転換し、該宿主菌の生育に必須
な物質および選択薬剤を加えた最少培地および該最少培
地からキサンチンを除いた培地を用いて、前者には生育
するが後者には生育しないような形質転換株を得ること
によって実施できる。
を欠失させたＤＮＡを犬歯に得るには、上述のＴ ４
Ｄ Ｎ Ａリガーゼで連結させた反応液を用いてギザン
ヂン要求性宿主菌を形質転換し、該宿主菌の生育に必須
な物質および選択薬剤を加えた最少培地および該最少培
地からキサンチンを除いた培地を用いて、前者には生育
するが後者には生育しないような形質転換株を得ること
によって実施できる。
次に、かくして得られた新規ＤＮＡを用いてバチルス属
菌を形質転換させ新規微生物を造成する方法について説
明する。
菌を形質転換させ新規微生物を造成する方法について説
明する。
この形質転換に用いられる受容菌としては、菌体外に与
えられた線状ＤＮＡを取り込み、染色体上に於て該ＤＮ
Ａの塩基配列と相同性の高い部分で組換えをおこし形質
が変化する性質、いわゆる形質転換能を有する菌であれ
ばよく、その染色体ＤＮＡの塩基配列が線状ＤＮＡに含
まれているＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子のものと高い
相同性を示しているものであれば、必ずしもＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の供与菌と同一である必要はない。
えられた線状ＤＮＡを取り込み、染色体上に於て該ＤＮ
Ａの塩基配列と相同性の高い部分で組換えをおこし形質
が変化する性質、いわゆる形質転換能を有する菌であれ
ばよく、その染色体ＤＮＡの塩基配列が線状ＤＮＡに含
まれているＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子のものと高い
相同性を示しているものであれば、必ずしもＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の供与菌と同一である必要はない。
イノシン生産能の高い形質転換株を得る目的からはプリ
ン系物質、たとえばイノシン、グアノンン、キザントン
ンの１種以上を蓄積することが知られており、かつ形質
転換能を有し、病原性がなく、工業的にも安全に使用さ
れてきた歴史があるという観点からは、バチルス属菌、
特にＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ 、 堕叶
ｕ亜ｐｕｍｉｌｕｓあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ などの菌が好適である。
ン系物質、たとえばイノシン、グアノンン、キザントン
ンの１種以上を蓄積することが知られており、かつ形質
転換能を有し、病原性がなく、工業的にも安全に使用さ
れてきた歴史があるという観点からは、バチルス属菌、
特にＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ 、 堕叶
ｕ亜ｐｕｍｉｌｕｓあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ などの菌が好適である。
また、たとえばこれらの菌に更にプリン系物質の蓄積に
有利とされている公知の性質、たとえば８−アザグアニ
ン耐性などのプリンアナログ耐性、ヌクレオンドポスフ
ォリラーゼ欠損性、葉酸拮抗剤耐性などが１または２以
」二付与されたものを受容菌として用いた場合は、イノ
ノン生産性の向上のために一層好適な結果を得ることが
多い。
有利とされている公知の性質、たとえば８−アザグアニ
ン耐性などのプリンアナログ耐性、ヌクレオンドポスフ
ォリラーゼ欠損性、葉酸拮抗剤耐性などが１または２以
」二付与されたものを受容菌として用いた場合は、イノ
ノン生産性の向上のために一層好適な結果を得ることが
多い。
バチルス属菌の受容菌としては次のものが例示される。
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ （Ｂ、 Ｇ、 Ｓ、
Ｃ，Ｎｏ、 Ｉ Ａ ３ ）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ Ｉ Ｏ３２（Ｉ ＦＯｌ ４、５５９、
ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＮＡ−６０１１（ＴＰＯ＋４１８９、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２９１）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ−ＮＡ
−６０１２（Ｉ ＦＯ１４＋９０、Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ
〜２９２）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−６１
２８（ＩＦＯ１４３７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６］
７）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−７８２］（
ＩＦＯ１４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６］ ８）Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣＩ ９２２１Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣＩ ４ ６６２Ｂ
、 Ｉ）ｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ−２１
１６）Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ
−４８３２）Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ
Ｐ−４８２９）Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ Ｉ Ｆ Ｏ１２４８５次に本発明の新規ＤＮ
Ａを用いてバチルス属菌を形質転換する。この場合、該
ＤＮＡをプラスミドに組み込んだ状態で利用に供するこ
とも可能であるが、一般にはプラスミドを開裂させた線
状ＤＮＡとしであるいは本発明のＤＮＡを切り出して用
いるのが好ましい。
Ｃ，Ｎｏ、 Ｉ Ａ ３ ）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ Ｉ Ｏ３２（Ｉ ＦＯｌ ４、５５９、
ＦＥＲＭ ＢＰ−１２４２）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＮＡ−６０１１（ＴＰＯ＋４１８９、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２９１）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ−ＮＡ
−６０１２（Ｉ ＦＯ１４＋９０、Ｆ’ＥＲＭ ＢＰ
〜２９２）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−６１
２８（ＩＦＯ１４３７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６］
７）Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ−７８２］（
ＩＦＯ１４３６８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６］ ８）Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣＩ ９２２１Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣＩ ４ ６６２Ｂ
、 Ｉ）ｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ−２１
１６）Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ Ｐ
−４８３２）Ｂ、 ｐｕｍｉｌｕｓ （ＦＥＲＭ
Ｐ−４８２９）Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ Ｉ Ｆ Ｏ１２４８５次に本発明の新規ＤＮ
Ａを用いてバチルス属菌を形質転換する。この場合、該
ＤＮＡをプラスミドに組み込んだ状態で利用に供するこ
とも可能であるが、一般にはプラスミドを開裂させた線
状ＤＮＡとしであるいは本発明のＤＮＡを切り出して用
いるのが好ましい。
線状ＤＮＡ断片を用いてのバチルス属菌の形質転換は公
知の方法［ＣΔｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｓ ａｎｄ
ＪＳｐｉｚｉｚｅｎ 、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 ８１ 、 ７４１ （１９６１）］を用いて
行うことができ、形質転換株は選択マーカーを用いて選
択用培地上での生育コロニーから釣菌することができる
。たとえば選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を挿入し
た場合には、当該薬剤を含ｔ′ぎ択用培地から釣菌する
ことができる。かくして得られた形質転換株が本発明の
目的とするＩＭＰデヒドロゲナーゼ欠損性株となってい
るか否かを判定するには、受容菌の生育に必須な物質を
加えた最少培地および該最少培地にキサンチンを含む補
足培地を用いて各々の培地上での生育を調べればよい。
知の方法［ＣΔｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｓ ａｎｄ
ＪＳｐｉｚｉｚｅｎ 、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 ８１ 、 ７４１ （１９６１）］を用いて
行うことができ、形質転換株は選択マーカーを用いて選
択用培地上での生育コロニーから釣菌することができる
。たとえば選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を挿入し
た場合には、当該薬剤を含ｔ′ぎ択用培地から釣菌する
ことができる。かくして得られた形質転換株が本発明の
目的とするＩＭＰデヒドロゲナーゼ欠損性株となってい
るか否かを判定するには、受容菌の生育に必須な物質を
加えた最少培地および該最少培地にキサンチンを含む補
足培地を用いて各々の培地上での生育を調べればよい。
該形質転換株が新規微生物であることは該形質転換株の
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断しアガロースゲル
電気泳動を行いアルカリ変性させてニトロセルロースフ
ィルタに移しとり、一方挿入するに用いたＤＮＡ断片、
たとえば薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を放射能で標
識し、これをプローブとしてサザンハイプリダイゼーシ
ョンを行うことによって確認することができる。すなわ
ち、受容菌の染色体ＤＮＡ中にはプローブとハイブリダ
イズする断片は存在しないが該形質転換株の染色体ＤＮ
Ａ中にはプローブとハイブリダイズする断片が存在する
ことから該形質転換株が本発明の目的とする微生物であ
ることが容易に判断できる。
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断しアガロースゲル
電気泳動を行いアルカリ変性させてニトロセルロースフ
ィルタに移しとり、一方挿入するに用いたＤＮＡ断片、
たとえば薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を放射能で標
識し、これをプローブとしてサザンハイプリダイゼーシ
ョンを行うことによって確認することができる。すなわ
ち、受容菌の染色体ＤＮＡ中にはプローブとハイブリダ
イズする断片は存在しないが該形質転換株の染色体ＤＮ
Ａ中にはプローブとハイブリダイズする断片が存在する
ことから該形質転換株が本発明の目的とする微生物であ
ることが容易に判断できる。
また該ＤＮＡ断片がＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子上に
挿入されていることは、供与菌から単離されたＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼをプローブとしてサザンハイプリダイゼ
ーションを行ったときに、形質転換株の染色体ＤＮＡの
該プローブとハイブリダイズする断片が受容菌のそれと
比べて挿入されたＤＮＡ断片の分だけ大きくなっている
ことから確認することができる。また一方、ＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子上に欠失を有するＤＮＡを用いた場
合にも、同様にして、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の
大きさと比較することによって、本発明の形質転換株で
あることが確認できる。
挿入されていることは、供与菌から単離されたＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼをプローブとしてサザンハイプリダイゼ
ーションを行ったときに、形質転換株の染色体ＤＮＡの
該プローブとハイブリダイズする断片が受容菌のそれと
比べて挿入されたＤＮＡ断片の分だけ大きくなっている
ことから確認することができる。また一方、ＩＭＰデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子上に欠失を有するＤＮＡを用いた場
合にも、同様にして、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の
大きさと比較することによって、本発明の形質転換株で
あることが確認できる。
上述の形質転換株は染色体ＤＮＡ上のＩＭＰデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子上にマーカー遺伝子が組み込まれており、
マーカー遺伝子の発現に伴って、たとえばマーカー遺伝
子が薬剤耐性遺伝子の場合には薬剤耐性となっているこ
と、およびマーカー遺伝子の組み込みによってＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼ欠損性となりキサンチン要求性となって
いるが、その他の菌学的性質は形質転換前の受容菌と変
らない。
ナーゼ遺伝子上にマーカー遺伝子が組み込まれており、
マーカー遺伝子の発現に伴って、たとえばマーカー遺伝
子が薬剤耐性遺伝子の場合には薬剤耐性となっているこ
と、およびマーカー遺伝子の組み込みによってＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼ欠損性となりキサンチン要求性となって
いるが、その他の菌学的性質は形質転換前の受容菌と変
らない。
また該形質転換株の特徴の一つはキサンチン要求性の復
帰変異率がきわめて低く検出限界以下になっていること
である。復帰変異率はキサンチンを含まぬ寒天平板培地
に塗布した菌数に対する該寒天平板培地での生育コロニ
ーの比で表わすことができる。該形質転換株の場合、復
帰変異率はきわめて低く、継代培養、あるいは変異誘起
剤処理を行っても復帰変異株は出現しない。
帰変異率がきわめて低く検出限界以下になっていること
である。復帰変異率はキサンチンを含まぬ寒天平板培地
に塗布した菌数に対する該寒天平板培地での生育コロニ
ーの比で表わすことができる。該形質転換株の場合、復
帰変異率はきわめて低く、継代培養、あるいは変異誘起
剤処理を行っても復帰変異株は出現しない。
このような本発明の形質転換株としては、後述の実施例
のように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂ Ｍ１０４１（ＩＦＯ１４５６０、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１２４，３）、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ ＮＡ −６１４１（ＩＦＯ１４５６１ＳＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−（ＩＦＯ１４６５５，ＦＥＲＭ ＢＰ−１
５０１）などが挙げられる。 もちろん、選択マーカー
遺伝子や受容菌を選ぶことによって、本願明細書の記載
方法に従って同様に種々の形質転換株を容易に造成する
ことができる。
のように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂ Ｍ１０４１（ＩＦＯ１４５６０、ＦＥＲＭ ＢＰ
−１２４，３）、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ ＮＡ −６１４１（ＩＦＯ１４５６１ＳＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−（ＩＦＯ１４６５５，ＦＥＲＭ ＢＰ−１
５０１）などが挙げられる。 もちろん、選択マーカー
遺伝子や受容菌を選ぶことによって、本願明細書の記載
方法に従って同様に種々の形質転換株を容易に造成する
ことができる。
次に、本発明で得られる形質転換株を用いてイノシンを
製造するには、該形質転換株の要求物質であるキザンチ
ン源を添加する点を除き、従来のイノシン生産菌の培養
方法と同様の方法が用いられる。
製造するには、該形質転換株の要求物質であるキザンチ
ン源を添加する点を除き、従来のイノシン生産菌の培養
方法と同様の方法が用いられる。
すなわち、培地としては炭素源窒素源金属イオン類のほ
かに必要に応じてアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄
答源を含有する培地が用いられる。
かに必要に応じてアミノ酸、核酸、ビタミン類などの栄
答源を含有する培地が用いられる。
たとえば炭素源としてはグルコース、シュークロース、
マルトース、澱粉、＃粉糖化液、糖蜜などが用いられる
。窒素源としては、ペプトン、コーンステイープリカー
、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素源のほかに、硫酸
、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩やアンモニア
ガス、アンモニア水などの無機窒素源がそれぞれ単独も
しくは混合して用いられる。その他の栄養源としては菌
の生育に必要な各種の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン
類などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して
用いられる。キザンチン源としてはキサンチン。
マルトース、澱粉、＃粉糖化液、糖蜜などが用いられる
。窒素源としては、ペプトン、コーンステイープリカー
、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素源のほかに、硫酸
、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩やアンモニア
ガス、アンモニア水などの無機窒素源がそれぞれ単独も
しくは混合して用いられる。その他の栄養源としては菌
の生育に必要な各種の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン
類などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して
用いられる。キザンチン源としてはキサンチン。
キザントンン、キザンチル酸またはこの代替物としてグ
アニン、グアノシン、グアニル酸、核酸はもとよりそれ
らを含有する微生物菌体や、それらの抽出物などが用い
られる。アデニン源としてはアデニン、アデノシン、ア
デニル酸、核酸はもとより、それらを含有する微生物菌
体やそれらの抽出物などが用いられる。
アニン、グアノシン、グアニル酸、核酸はもとよりそれ
らを含有する微生物菌体や、それらの抽出物などが用い
られる。アデニン源としてはアデニン、アデノシン、ア
デニル酸、核酸はもとより、それらを含有する微生物菌
体やそれらの抽出物などが用いられる。
さらに培地には必要に応じてシリコンオイル。
ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤や界面
活性剤などを添加することができる。
活性剤などを添加することができる。
培養は通常振盪あるいは通気攪拌深部培養などの好気条
件下に行なわれる。培地のｐＨは通常４ないし９の範囲
が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される場合は、
これを好ましい範囲に修正するために硫酸、炭酸カルン
ウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アンモニア
水などを適宜添加してもよい。培養温度は通常２０°Ｃ
ないし４５°Ｃの範囲から使用される微生物の生育およ
びイノシンの蓄積に好適な温度が選択される。培養は実
質的にイノシンの蓄積量が最大になるまで行なわれるが
通常２４時間ないし１４４時間の培養で目的を達するこ
とができる。
件下に行なわれる。培地のｐＨは通常４ないし９の範囲
が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される場合は、
これを好ましい範囲に修正するために硫酸、炭酸カルン
ウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アンモニア
水などを適宜添加してもよい。培養温度は通常２０°Ｃ
ないし４５°Ｃの範囲から使用される微生物の生育およ
びイノシンの蓄積に好適な温度が選択される。培養は実
質的にイノシンの蓄積量が最大になるまで行なわれるが
通常２４時間ないし１４４時間の培養で目的を達するこ
とができる。
培養物からイノシンを分離採取するにはすでに公知にさ
れている通常の精製手段たとえば沈澱法。
れている通常の精製手段たとえば沈澱法。
イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法な
どの分離精製法が用いられる。
どの分離精製法が用いられる。
笈敷鯉
以下に参考例、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明
するが当然のことながら本発明はこれに限定されるもの
ではない。尚以下の参考例、実施例に於る制限酵素［全
てニラポンジーン（株）製］。
するが当然のことながら本発明はこれに限定されるもの
ではない。尚以下の参考例、実施例に於る制限酵素［全
てニラポンジーン（株）製］。
修飾酵素の反応条件は特に断りのない限りは酵素メーカ
ー指定の条件で行った。
ー指定の条件で行った。
参考例１
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｊｓ のＩＭＰデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＥＸ１１７の
単離Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ ＮＡ −
６０１２（Ｉ Ｆ ０１４］９０．ＦＥＲＭ ＢＰ−
２９２）株由来の■ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を
含む組換えプラスミドｐＥＸ］１７を保持する形質転換
株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｅ Ｘ
１１７ （特開昭６０−１５６３８８号）から、該プ
ラスミドの抽出を「モレキュラー・クローニング」第８
６頁〜第９３頁に記載の方法に従って行った。ずなわぢ
Ｅｓｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＥＸ Ｉ Ｉ
７をＬ Ｂ培地（バクトドリプトン１０バ／Ｑ、、酵
母エキス５ｇ＃！、塩化ナトリウム５ｇ／ρ）に接種し
、プラスミドを増幅させるためにクロラムフェニコール
を１４０μｇ／−となるように添加して一夜培養後集菌
洗浄した。洗浄菌体にリゾデームを加え、更に１％ラウ
リル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶
液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウムを加えた後遠心分
離によりプラスミドを含む上澄液を得た。上澄液に０．
６容のイソプロパツールを加えプラスミドＤＮＡを沈澱
させエタノールで洗浄した後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ＩｍＭＥＤＴΔ ｐＩ（８，０）に溶解し
た。これに比重が１．６０となるように塩化セシウムを
加え、終濃度が６００μｇ／滅となるようにエチジウム
・ブロマイドを加えた。超遠心機（ロータ Ｖ６５Ｔｉ
）を用いて２０℃で５０．００Ｏｒｐｍ １２時間遠
心分離し、紫外線によって検出されるプラスミドのバン
ドを取りｎ−ブタノールを用いてエチジウム・ブロマイ
ドを抽出除去した後、ＴＥ緩衝液に透析して３００滅の
培養液から約２００μｇ相当の組換えプラスミドｐＥＸ
１１７を得た。
ヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＥＸ１１７の
単離Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ ＮＡ −
６０１２（Ｉ Ｆ ０１４］９０．ＦＥＲＭ ＢＰ−
２９２）株由来の■ＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域を
含む組換えプラスミドｐＥＸ］１７を保持する形質転換
株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｅ Ｘ
１１７ （特開昭６０−１５６３８８号）から、該プ
ラスミドの抽出を「モレキュラー・クローニング」第８
６頁〜第９３頁に記載の方法に従って行った。ずなわぢ
Ｅｓｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＥＸ Ｉ Ｉ
７をＬ Ｂ培地（バクトドリプトン１０バ／Ｑ、、酵
母エキス５ｇ＃！、塩化ナトリウム５ｇ／ρ）に接種し
、プラスミドを増幅させるためにクロラムフェニコール
を１４０μｇ／−となるように添加して一夜培養後集菌
洗浄した。洗浄菌体にリゾデームを加え、更に１％ラウ
リル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶
液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウムを加えた後遠心分
離によりプラスミドを含む上澄液を得た。上澄液に０．
６容のイソプロパツールを加えプラスミドＤＮＡを沈澱
させエタノールで洗浄した後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液ＩｍＭＥＤＴΔ ｐＩ（８，０）に溶解し
た。これに比重が１．６０となるように塩化セシウムを
加え、終濃度が６００μｇ／滅となるようにエチジウム
・ブロマイドを加えた。超遠心機（ロータ Ｖ６５Ｔｉ
）を用いて２０℃で５０．００Ｏｒｐｍ １２時間遠
心分離し、紫外線によって検出されるプラスミドのバン
ドを取りｎ−ブタノールを用いてエチジウム・ブロマイ
ドを抽出除去した後、ＴＥ緩衝液に透析して３００滅の
培養液から約２００μｇ相当の組換えプラスミドｐＥＸ
１１７を得た。
ｐＥＸ］１７を種々の制限酵素で切断しラムダファージ
のＨ４ｎｄｌＩ１分解物の分子量を基準にしてアガロー
ス・ゲル電気泳動のパターンから第１図中に示すような
制限酵素切断地図を得た。ｐＥＸ１１７はｐＢＲ３２２
の胆Ｉ ザイトに約６．４キロベースペアのＤＮＡ断片
が挿入された組換えプラスミドである。
のＨ４ｎｄｌＩ１分解物の分子量を基準にしてアガロー
ス・ゲル電気泳動のパターンから第１図中に示すような
制限酵素切断地図を得た。ｐＥＸ１１７はｐＢＲ３２２
の胆Ｉ ザイトに約６．４キロベースペアのＤＮＡ断片
が挿入された組換えプラスミドである。
次に、３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素Ｈｉｎｄ■で部
分分解し、一方１）ＢＲ３２２を川ｉｎｄ ＩＩＩで完
全分解して、前記の方法に従って両者を混合し、Ｔ４由
来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行った。
分分解し、一方１）ＢＲ３２２を川ｉｎｄ ＩＩＩで完
全分解して、前記の方法に従って両者を混合し、Ｔ４由
来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行った。
次に、このＤＮＡ溶液を用いて前記の方法でエシェリヒ
ア・コリＸ−８９５株を形質転換して、テトラザイクリ
ン耐性を獲得し、かつキザンヂン要求性の消失している
形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ−１４７株を得た
。該形質転換株から、前記の方法でプラスミドを抽出し
、約２２０μｇの組換えプラスミドを得、これをｐＥＸ
１４７と命名した。Ｉ）ＥＸ１４７の制限酵素切断地図
を第３図に示した。ｐＥＸ１４．７はｐＢＲ３２２のＨ
ｉｎｄｎｌサイトに２．９キロベースのＤＮＡ断片が挿
入された組換えプラスミドである。
ア・コリＸ−８９５株を形質転換して、テトラザイクリ
ン耐性を獲得し、かつキザンヂン要求性の消失している
形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ−１４７株を得た
。該形質転換株から、前記の方法でプラスミドを抽出し
、約２２０μｇの組換えプラスミドを得、これをｐＥＸ
１４７と命名した。Ｉ）ＥＸ１４７の制限酵素切断地図
を第３図に示した。ｐＥＸ１４．７はｐＢＲ３２２のＨ
ｉｎｄｎｌサイトに２．９キロベースのＤＮＡ断片が挿
入された組換えプラスミドである。
参考例２
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＢＴＭ１２４の単離 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ 由来のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドｐＢＴＭ１２４の作製はＷｉｌｌｉ
ａｍｓらの方法り、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４
６ 、 １１６２（１９８１）］に従って次のように行
った。
子を含むプラスミドｐＢＴＭ１２４の単離 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ 由来のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドｐＢＴＭ１２４の作製はＷｉｌｌｉ
ａｍｓらの方法り、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４
６ 、 １１６２（１９８１）］に従って次のように行
った。
財匣」旦墜ｐｕｍｉｌｕｓ ＮＣＩ Ｂ ８６００
（Ｉ Ｆ ０１２０８９、財団法人発酵研究所発行のリ
スト・オブ・カルチャー、第７版に掲載）よりＤＮＡを
調製し、そのＤＮＡ（６，５μｇ）を４０ユニツトの制
限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃で１時間反応させて切断した
のち６８℃で１５分間加熱しエタノール沈設を行った。
（Ｉ Ｆ ０１２０８９、財団法人発酵研究所発行のリ
スト・オブ・カルチャー、第７版に掲載）よりＤＮＡを
調製し、そのＤＮＡ（６，５μｇ）を４０ユニツトの制
限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃で１時間反応させて切断した
のち６８℃で１５分間加熱しエタノール沈設を行った。
一方、プラスミドｐＵＢ１１０（２，０μｇ）を２０ユ
ニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃で１時間反応させ
て切断したのち６８°Ｃで１５分間加熱しエタノール沈
澱を行った。
ニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃で１時間反応させ
て切断したのち６８°Ｃで１５分間加熱しエタノール沈
澱を行った。
両沈澱を水に溶かして混合し、これに６０ ｎｍｏｌｅ
のＡＴＰ、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼおよびリ
ガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｇ）ヲ１１ ’
Ｃで３０時間保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱を
ＴＥ緩衝液（５０μｉ２）に溶解しその２５μＱを用い
てＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ
−１１４［Ｇｅｎｅ、２４． ２５５（１９８３）］の
形質転換を行い、クロラムフェニコール耐性の形質転換
株を得た。クロラムフェニコール耐性の形質転換株より
プラスミドを調製し該プラスミドをＩ）ＢＴＭ １２４
と命名した。ｐＢＴＭ １２４はｐＵＢｌｌｏのＥｃ
ｏＲＩザイトに約２．１キロベースペアのクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が挿入された組換えプラスミドである。
のＡＴＰ、１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼおよびリ
ガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μｇ）ヲ１１ ’
Ｃで３０時間保温し、エタノール沈澱を行った。沈澱を
ＴＥ緩衝液（５０μｉ２）に溶解しその２５μＱを用い
てＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ
−１１４［Ｇｅｎｅ、２４． ２５５（１９８３）］の
形質転換を行い、クロラムフェニコール耐性の形質転換
株を得た。クロラムフェニコール耐性の形質転換株より
プラスミドを調製し該プラスミドをＩ）ＢＴＭ １２４
と命名した。ｐＢＴＭ １２４はｐＵＢｌｌｏのＥｃ
ｏＲＩザイトに約２．１キロベースペアのクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が挿入された組換えプラスミドである。
実施例１
３０μｇのｌ）ＢＴＭ１２，４を制限酵素堕ＲＩおよび
Ｐｓｔｌで３７°ＣＩ時間反応させて二重切断し、アガ
ロース・ゲル電気泳動を行い１．１キロベースペアのＤ
ＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース・ゲル
を切りとった。次いでユニディレクショナル・エレクト
ロエルータ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、製）を用いて、
上述アガロース・ゲル断片から当該ＤＮＡを抽出し、エ
タノール沈澱を行い、沈澱をＴＥ緩衝液（１０μＱ）に
溶解した。一方、３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素５ａ
ｃｌＩで３７℃１時間反応させて切断したのち、６５℃
で１５分間加熱し、エタノール沈澱を行い、沈澱をＴＥ
緩衝液＝３２− （１０μＱ）に溶解した。次に両者を混合し、２ ｎｍ
ｏｌｅのｄＮＴＰ、５ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造製）を加えＴＡ緩衝液（３３ｍＭトリス−酢
酸 ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸
マグネシウム、 ０ 、５ ｍＭジヂオスレイトール、
０゜０１％牛血清アルブミン）中で３７℃２０分間反応
させ、６５°ＣＩ５分間加熱した後、フェノール抽出、
次いでエタノール沈澱を行った。沈毅をＴＥ緩衝液に溶
解し６６ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、２００ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加
えた反応液３０μＣを１６℃で一昼夜保温した。この反
応液の５μＱを用いてＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ Ｘ８９５（ＩＦＯ１４３０８゜ＦＥＲＭ ＢＰ−
６１４）株のコンピテント・セルを形質転換し、クロラ
ムフェニコール耐性形質転換株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｘ ８９５ （ｐＥ Ｘ ２０３ ）を
得た。この形質転換はＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏ。
Ｐｓｔｌで３７°ＣＩ時間反応させて二重切断し、アガ
ロース・ゲル電気泳動を行い１．１キロベースペアのＤ
ＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース・ゲル
を切りとった。次いでユニディレクショナル・エレクト
ロエルータ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、製）を用いて、
上述アガロース・ゲル断片から当該ＤＮＡを抽出し、エ
タノール沈澱を行い、沈澱をＴＥ緩衝液（１０μＱ）に
溶解した。一方、３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素５ａ
ｃｌＩで３７℃１時間反応させて切断したのち、６５℃
で１５分間加熱し、エタノール沈澱を行い、沈澱をＴＥ
緩衝液＝３２− （１０μＱ）に溶解した。次に両者を混合し、２ ｎｍ
ｏｌｅのｄＮＴＰ、５ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造製）を加えＴＡ緩衝液（３３ｍＭトリス−酢
酸 ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸
マグネシウム、 ０ 、５ ｍＭジヂオスレイトール、
０゜０１％牛血清アルブミン）中で３７℃２０分間反応
させ、６５°ＣＩ５分間加熱した後、フェノール抽出、
次いでエタノール沈澱を行った。沈毅をＴＥ緩衝液に溶
解し６６ ｎｍｏｌｅのＡＴＰ、２００ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ緩衝液を加
えた反応液３０μＣを１６℃で一昼夜保温した。この反
応液の５μＱを用いてＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ Ｘ８９５（ＩＦＯ１４３０８゜ＦＥＲＭ ＢＰ−
６１４）株のコンピテント・セルを形質転換し、クロラ
ムフェニコール耐性形質転換株Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｘ ８９５ （ｐＥ Ｘ ２０３ ）を
得た。この形質転換はＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （Ｕ、Ｓ、Ａ）６
９ 、 ２１１０（１９７２）］に従って行った〇 次に前記参考例１の方法に従って形質転換株ｆｉ−ｇｂ
ｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉ Ｘ ８９５ （ｐＥＸ
２０３）からプラスミドを抽出し、Ｉ）ＥＸ２０３と命
名した。
９ 、 ２１１０（１９７２）］に従って行った〇 次に前記参考例１の方法に従って形質転換株ｆｉ−ｇｂ
ｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉ Ｘ ８９５ （ｐＥＸ
２０３）からプラスミドを抽出し、Ｉ）ＥＸ２０３と命
名した。
ｐＥＸ２０３を種々の制限酵素て切断しラムダファージ
のＨｊｎｄｌｌＩ 分解物の分子型を基準にしてアガ
ロース・ゲル電気泳動のパターンから制限酵素切断地図
を作製１．た（第１図参照）。
のＨｊｎｄｌｌＩ 分解物の分子型を基準にしてアガ
ロース・ゲル電気泳動のパターンから制限酵素切断地図
を作製１．た（第１図参照）。
次に１００μｇのｐＥＸ、２０３を制限酵素胆■で切断
しアガロース・ゲル電気泳動を行い、７５キロベースペ
アのＤＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース
・ゲル断片を切り出し、前述のエレクトロエルータを用
いてＤＮＡを抽出し約３５μｇのＤＮＡを単離した。制
限酵素による切断パターンから該ＤＮＡはｐＢＲ３２２
のＰｓｔＩサイトに挿入された７、５ギロベースペアの
Ｉ） Ｎ Ａ断片であって、部月山＋ｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子上のΣａｃ
ＨサイＩ・にＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ
Ｉ−Ｊ ＣＩ Ｂ ８６００のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入された構造
を有しでいることを確認した。ｐＥＸ２０３の作製カー
および制限酵素地図を第１図に示した。
しアガロース・ゲル電気泳動を行い、７５キロベースペ
アのＤＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース
・ゲル断片を切り出し、前述のエレクトロエルータを用
いてＤＮＡを抽出し約３５μｇのＤＮＡを単離した。制
限酵素による切断パターンから該ＤＮＡはｐＢＲ３２２
のＰｓｔＩサイトに挿入された７、５ギロベースペアの
Ｉ） Ｎ Ａ断片であって、部月山＋ｓ ５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子上のΣａｃ
ＨサイＩ・にＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ
Ｉ−Ｊ ＣＩ Ｂ ８６００のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入された構造
を有しでいることを確認した。ｐＥＸ２０３の作製カー
および制限酵素地図を第１図に示した。
実施例２
ｉ）ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子」二にクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入され
たにうな構造の染色体Ｉ） Ｎ Ａを有する新規なバヂ
ルス属菌の誘導 通常の栄養要求性株の取得法を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ −１１４からアデニン要
求性株Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ ］ ０３２（
ＩＦＯ＋４５５９゜ＦＥＲＭ Ｂｌ”−１２４２）を
取得した。
ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入され
たにうな構造の染色体Ｉ） Ｎ Ａを有する新規なバヂ
ルス属菌の誘導 通常の栄養要求性株の取得法を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ −１１４からアデニン要
求性株Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ ］ ０３２（
ＩＦＯ＋４５５９゜ＦＥＲＭ Ｂｌ”−１２４２）を
取得した。
次にＣ，Ａｎａｇｎｏｓｔｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ
Ｊ、５ｐｉｚｉｚｅｎの方法に従って、該菌のコンピテ
ントセルを調製した。該コンピテントセル懸濁液の１錐
に実施例１で得られた７ ５キロベースベアのＤＮＡ断
片を加え３７℃で１時間振盪した後ｌＯμｇ／＋Ｊ、の
クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布して
３７°Ｃで一昼夜保温し、生じたコロニーからクロラム
フェニコール耐性形質転換株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ＋
１ｌｉｓ ＢＭ １０４］（ＩＦＯ１４５６０゜Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１２４３）を得た。該形質転換株をＭ
−９ＣＡＴＡ培地（Ｎａ２１（ＰＯ４６ｇ／ＬＫＨ７Ｐ
Ｏ４３ｇ／Ｌ ＮａＣ１Ｏ，５ｇ／Ｃ，ＮＨ。
Ｊ、５ｐｉｚｉｚｅｎの方法に従って、該菌のコンピテ
ントセルを調製した。該コンピテントセル懸濁液の１錐
に実施例１で得られた７ ５キロベースベアのＤＮＡ断
片を加え３７℃で１時間振盪した後ｌＯμｇ／＋Ｊ、の
クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布して
３７°Ｃで一昼夜保温し、生じたコロニーからクロラム
フェニコール耐性形質転換株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ＋
１ｌｉｓ ＢＭ １０４］（ＩＦＯ１４５６０゜Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１２４３）を得た。該形質転換株をＭ
−９ＣＡＴＡ培地（Ｎａ２１（ＰＯ４６ｇ／ＬＫＨ７Ｐ
Ｏ４３ｇ／Ｌ ＮａＣ１Ｏ，５ｇ／Ｃ，ＮＨ。
ＣＩ Ｉｇ／１２． Ｍｇ５Ｏ，ＩｍＭ、 Ｃａ
ＣｌｐｌｍＭ。
ＣｌｐｌｍＭ。
グルコース ２ｇ／Ｌカザミノ酸 ２ｇ／ρ、 アデニ
ン ５０ｍｇ／（！、 ）リプトファン ５０ｍｇ／
Ｑ。
ン ５０ｍｇ／（！、 ）リプトファン ５０ｍｇ／
Ｑ。
寒天 ３５ ｇ／Ｑ、、 ｐＴ（７、２）および更に
これにキザンヂンを含む培地に接種し、その生育を凋へ
：たところ、該クロラムフェニコール耐性形質転換株は
キザンヂン要求性を同時に示ず７：−５になつでいるこ
とを確認した。 またＭａｇａｓａｎｉｋの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ■、１
０６−１１０）に従ってＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を
測定したところ本菌に於ては該酵素活性は検出できなか
つノこ。
これにキザンヂンを含む培地に接種し、その生育を凋へ
：たところ、該クロラムフェニコール耐性形質転換株は
キザンヂン要求性を同時に示ず７：−５になつでいるこ
とを確認した。 またＭａｇａｓａｎｉｋの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ■、１
０６−１１０）に従ってＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を
測定したところ本菌に於ては該酵素活性は検出できなか
つノこ。
１１）染色体上にクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子が組込まれた証拠Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０４１をＬＢ培地
に接種して２８℃で一夜培養後、培養液ｌρの菌体から
フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法［Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ１ａ、 ７２．
６１９（１９６３）］によって染色体ＤＮＡを取得
した。
スフェラーゼ遺伝子が組込まれた証拠Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０４１をＬＢ培地
に接種して２８℃で一夜培養後、培養液ｌρの菌体から
フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法［Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ１ａ、 ７２．
６１９（１９６３）］によって染色体ＤＮＡを取得
した。
かくして得られた染色体ＤＮＡの１０μｇを制限酵素及
ｌ■およびＳｍａＩで二重切断後アガロース・ゲル電気
泳動を行い、前出「モレキュラークローニング」第３８
２頁〜第３８６頁に記載の方法に従ってニトロセルロー
スフィルターに転写しノこ。 ま ノこ同時（こ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ
−１０３２の染色体ＤＮＡの埃ｇｌｌＴ、見胆Ｉ消化
物もニトロセルロース・フィルターに転写した。
ｌ■およびＳｍａＩで二重切断後アガロース・ゲル電気
泳動を行い、前出「モレキュラークローニング」第３８
２頁〜第３８６頁に記載の方法に従ってニトロセルロー
スフィルターに転写しノこ。 ま ノこ同時（こ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ
−１０３２の染色体ＤＮＡの埃ｇｌｌＴ、見胆Ｉ消化
物もニトロセルロース・フィルターに転写した。
一方、ｐＢＴＭ １２４から実施例１に記載した方法
で１１ギロベースペアのＤＮＡ断片を抽出単離し、これ
を３２Ｐ−ＣＴＰで標識してプローブとした。尚、該プ
ローブの作製は、ニックトランスレンヨン・キット２に
ッポンジーン製）を用いてメーカ指定のプロトコールに
従って行った。
で１１ギロベースペアのＤＮＡ断片を抽出単離し、これ
を３２Ｐ−ＣＴＰで標識してプローブとした。尚、該プ
ローブの作製は、ニックトランスレンヨン・キット２に
ッポンジーン製）を用いてメーカ指定のプロトコールに
従って行った。
次いで「モレキュラークローニング」第３８７頁〜第３
８９頁に記載の方法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ってところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ −１０４］の染色体ＤＮＡの３．９キロベー
スのＤＮＡの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼ
ーションのバンドがみられた。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２の染色体Ｉ
） Ｎ Ａとの間にはハイブリダイゼーションはみられ
なかった。
８９頁に記載の方法に従ってサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行ってところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ −１０４］の染色体ＤＮＡの３．９キロベー
スのＤＮＡの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼ
ーションのバンドがみられた。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２の染色体Ｉ
） Ｎ Ａとの間にはハイブリダイゼーションはみられ
なかった。
次に３０μｇのｐＥＸ１１７をＸｂａＩとＨｉｎｃ■で
二重切断した後アガロース・ゲル電気泳動を行い１．８
５キロベースペアのＤＮＡの泳動距離に相当する部分か
らアガロース・ゲル断片を切りとりこれよりＤＮＡを抽
出し先と同様にニックトランスレーション法を用いて標
識した。このプローブを用いて先と同様にザザンハイブ
リダイゼーションを行ったところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０３２の染色体ＤＮＡと
の間では２．１キロベースペアと３．０キロベースペア
のＤＮＡの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼー
ションのバンドがみられ、一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０４１染色体ＤＮＡとの間で
は２．１キロベースペアと３．９キロベースペアのＤＮ
Ａの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼーション
のバンドがみられた。第２図はこの結果を表わしたもの
である。
二重切断した後アガロース・ゲル電気泳動を行い１．８
５キロベースペアのＤＮＡの泳動距離に相当する部分か
らアガロース・ゲル断片を切りとりこれよりＤＮＡを抽
出し先と同様にニックトランスレーション法を用いて標
識した。このプローブを用いて先と同様にザザンハイブ
リダイゼーションを行ったところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０３２の染色体ＤＮＡと
の間では２．１キロベースペアと３．０キロベースペア
のＤＮＡの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼー
ションのバンドがみられ、一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０４１染色体ＤＮＡとの間で
は２．１キロベースペアと３．９キロベースペアのＤＮ
Ａの泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼーション
のバンドがみられた。第２図はこの結果を表わしたもの
である。
１ｉｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ １０４１のキサンチン要求性の復帰変異 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１の１白金耳を第１表に記載の種培地２０威に接種
し、３７℃で１８時間振盪培養後そのｌ滅を第１表記載
の主発酵培地（２（ｈＪ）に移植し３７℃で２日間振盪
培養した。このｌ滅を前出の第１表の主発酵培地に移植
し３７℃で２日間振盪培養した。このように植継ぎを５
回繰り返した後、培養液中の生菌数を調べたところ、培
養液１ｄあたりの生菌数はｌＸｌ０’であって、その全
てがキサンチン要求性を有しており、復帰変異株は認め
られなかった。
ＢＭ １０４１のキサンチン要求性の復帰変異 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１の１白金耳を第１表に記載の種培地２０威に接種
し、３７℃で１８時間振盪培養後そのｌ滅を第１表記載
の主発酵培地（２（ｈＪ）に移植し３７℃で２日間振盪
培養した。このｌ滅を前出の第１表の主発酵培地に移植
し３７℃で２日間振盪培養した。このように植継ぎを５
回繰り返した後、培養液中の生菌数を調べたところ、培
養液１ｄあたりの生菌数はｌＸｌ０’であって、その全
てがキサンチン要求性を有しており、復帰変異株は認め
られなかった。
一方、従来の変異株取得法で誘導されたキサンチン要求
性株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮ
６３株（ＩＦ’０ １４３０７．ＦＥＲＭ ＢＰ−６
１３）を上記と同様の操作を行った結果、培養液１ｄあ
たりの生菌数はｌＸｌ０’であってその内の２０％にあ
たる２Ｘ１０６がキサンチン要求性を示さぬ復帰変異株
であった。
性株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮ
６３株（ＩＦ’０ １４３０７．ＦＥＲＭ ＢＰ−６
１３）を上記と同様の操作を行った結果、培養液１ｄあ
たりの生菌数はｌＸｌ０’であってその内の２０％にあ
たる２Ｘ１０６がキサンチン要求性を示さぬ復帰変異株
であった。
第 １ 表
培地成分 濃度（ｇ／ （１）種培地
主発酵培地 グルコース ３０ １４０グル
タミン酸ソーダ １０１０ 硫酸アンモニウム ７，５尿素
３ １０ コーンステイープリカー ２０３０ 硫酸マグネシウム ２２ アデニン ０．２ ０．０７
５キサンチン ０．２ ０．０
５０リン酸ｌ水素２カリウム ２１ 塩化カリウム ０．５塩化
カルシウム ２５ 硫酸マンガン Ｏ，［＋０
２５炭酸カルシウム ３０ｉｖ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１イノシン生産性 第１表に示す種培地１２５ｄを含む１１２容三角フラス
コにＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１株の１白金耳を接種し３７℃で１２時間振盪培養
してその全量を第１表の主発酵培地２．５Ｑを含む５ρ
容ジヤーに移植し、培養開始後５時間から３５時間まで
キサンチンをｌＯμｇ／ｄ・ｈｒの割合となるように連
続フィードを行い、かつ主発酵培養開始後２４時間目に
１２．５％硫酸アンモニウムおよび６．２５％尿素を含
む混溶液を１０〇−添加しながら３７℃で６０時間培養
した。培養終了液のイノシンおよびグアノンンの蓄積量
を高速液体クロマトグラフィーで調べたところ、イノシ
ンが１０ 、１ ｍｇ／−の割合で蓄積していた。
主発酵培地 グルコース ３０ １４０グル
タミン酸ソーダ １０１０ 硫酸アンモニウム ７，５尿素
３ １０ コーンステイープリカー ２０３０ 硫酸マグネシウム ２２ アデニン ０．２ ０．０７
５キサンチン ０．２ ０．０
５０リン酸ｌ水素２カリウム ２１ 塩化カリウム ０．５塩化
カルシウム ２５ 硫酸マンガン Ｏ，［＋０
２５炭酸カルシウム ３０ｉｖ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１イノシン生産性 第１表に示す種培地１２５ｄを含む１１２容三角フラス
コにＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １
０４１株の１白金耳を接種し３７℃で１２時間振盪培養
してその全量を第１表の主発酵培地２．５Ｑを含む５ρ
容ジヤーに移植し、培養開始後５時間から３５時間まで
キサンチンをｌＯμｇ／ｄ・ｈｒの割合となるように連
続フィードを行い、かつ主発酵培養開始後２４時間目に
１２．５％硫酸アンモニウムおよび６．２５％尿素を含
む混溶液を１０〇−添加しながら３７℃で６０時間培養
した。培養終了液のイノシンおよびグアノンンの蓄積量
を高速液体クロマトグラフィーで調べたところ、イノシ
ンが１０ 、１ ｍｇ／−の割合で蓄積していた。
Ｂａｅｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔＮｉｓ ＢＭ １０
３２株を上記と同一の条件で培養したところ、イノシン
は５．２ｍｇ／！の割合で蓄積したにすぎなかった。
３２株を上記と同一の条件で培養したところ、イノシン
は５．２ｍｇ／！の割合で蓄積したにすぎなかった。
実施例３
実施例２の方法に従って Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓＮＡ−６１２８（ＩＦＯ１４３７３，ＦＥＲ
ＭＢＰ−６１７）株のコンピテント・セルを作製し、こ
れに実施例１で得た７ ５キロヘースペアのＤＮＡ断片
を加え、３７℃で１時間振盪して形質転換を行い、ｌＯ
μｇ／滅のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に生育
したコロニーからクロラムフェニコール耐性形質転換株
（Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ 肪徊」川ＮＡ−６１４１（ｒ
Ｆｏ １７１５６１． ＦＥＲＭＢＰ−１２４−４
）を取得した。
ｔｉｌｉｓＮＡ−６１２８（ＩＦＯ１４３７３，ＦＥＲ
ＭＢＰ−６１７）株のコンピテント・セルを作製し、こ
れに実施例１で得た７ ５キロヘースペアのＤＮＡ断片
を加え、３７℃で１時間振盪して形質転換を行い、ｌＯ
μｇ／滅のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に生育
したコロニーからクロラムフェニコール耐性形質転換株
（Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ 肪徊」川ＮＡ−６１４１（ｒ
Ｆｏ １７１５６１． ＦＥＲＭＢＰ−１２４−４
）を取得した。
Ｍ−９ＣＡＴＡ培地およびさらにキサンチンを含むＭ−
９０ＡＴＡ培地上での生育の有無から該形質転換株はキ
サンチン要求性を有していることがわかった。
９０ＡＴＡ培地上での生育の有無から該形質転換株はキ
サンチン要求性を有していることがわかった。
また実施例２に記載した同じ方法でザザンハイプリダイ
ゼーンヨンを行ったところ、ｐＢＴＭ＋２４の１．１キ
ロベースペアのＤＮＡ断片をプローブとして用いたとき
にはＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＮＡ−６１２
８株の染色体ＤＮＡとの間にはハイブリダイゼーション
のバンドはみられなかったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ −６１４１株の染色体ＤＮＡ
の３．９キロベースペアのＳｍａ Ｉ −Ｂｇ（ＩＮ断
片との間には、ハイブリダイゼーションが認められた。
ゼーンヨンを行ったところ、ｐＢＴＭ＋２４の１．１キ
ロベースペアのＤＮＡ断片をプローブとして用いたとき
にはＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＮＡ−６１２
８株の染色体ＤＮＡとの間にはハイブリダイゼーション
のバンドはみられなかったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＡ −６１４１株の染色体ＤＮＡ
の３．９キロベースペアのＳｍａ Ｉ −Ｂｇ（ＩＮ断
片との間には、ハイブリダイゼーションが認められた。
またｐＥＸ］Ｉ７の１．８５キロベースペアの Ｘｂａ
Ｉ −Ｈｌｎ ｃＩＩ断片をプローブとしたときには
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１２８株の染色体ＤＮＡの旦１色Ｉ−則吐■消化物
との間に＋ｊ： ２ 、 Ｉキロベースペア、３０ギロ
ベースペアに相当するＤＮＡ断片との間にハイブリダイ
ゼーションがみられ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＮＡ−６１４１株の染色体ＤＮＡとの間には２．
１ギロベースペア、３．９キロベースペアのＤＮＡ断片
との間にハイブリダイゼーションが認められた。
Ｉ −Ｈｌｎ ｃＩＩ断片をプローブとしたときには
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１２８株の染色体ＤＮＡの旦１色Ｉ−則吐■消化物
との間に＋ｊ： ２ 、 Ｉキロベースペア、３０ギロ
ベースペアに相当するＤＮＡ断片との間にハイブリダイ
ゼーションがみられ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＮＡ−６１４１株の染色体ＤＮＡとの間には２．
１ギロベースペア、３．９キロベースペアのＤＮＡ断片
との間にハイブリダイゼーションが認められた。
実施例４
第１表に示す種培地１２５成を含むＩＱ容三角フラスコ
に Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１４１株の１白金耳を接種し３７℃で１２時間振
盪培養してその全量を第１表の主発酵培地２．５ａを含
む５Ｑ容ジヤーに移植し、培養開始後５時間から３５時
間まではキサンチンを１０μｇ／成・ｈｒの割合で、ま
た３５時間以后培養終了時まではキサンチンを５μｇ／
成・ｈｒの割合となるように連続フィードを行い、かつ
主発酵培養開始後２４時間および４８時間目に１２．５
％硫酸アンモニウムおよび６．２５％尿素を含む混溶液
をそれぞれ各時間に１００滅づつ添加しなから３７°Ｃ
で８６時間培養した。培養終了液のイノシンおよびグア
ノシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィーで調べた
ところイノシンが３５ 、０ ｍｇ／ ｔｎｌ。
に Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｎ Ａ
−６１４１株の１白金耳を接種し３７℃で１２時間振
盪培養してその全量を第１表の主発酵培地２．５ａを含
む５Ｑ容ジヤーに移植し、培養開始後５時間から３５時
間まではキサンチンを１０μｇ／成・ｈｒの割合で、ま
た３５時間以后培養終了時まではキサンチンを５μｇ／
成・ｈｒの割合となるように連続フィードを行い、かつ
主発酵培養開始後２４時間および４８時間目に１２．５
％硫酸アンモニウムおよび６．２５％尿素を含む混溶液
をそれぞれ各時間に１００滅づつ添加しなから３７°Ｃ
で８６時間培養した。培養終了液のイノシンおよびグア
ノシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィーで調べた
ところイノシンが３５ 、０ ｍｇ／ ｔｎｌ。
の割合で蓄積していた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔ
ｉｌｉｓＮＡ−６１２８株を上記と同一の条件で培養し
たところイノシンはＩ ９ 、８ ｍｇ／滅の割合で蓄
積したにすぎなかった。
ｉｌｉｓＮＡ−６１２８株を上記と同一の条件で培養し
たところイノシンはＩ ９ 、８ ｍｇ／滅の割合で蓄
積したにすぎなかった。
また、上述培養終了液の生菌数およびキサンチン要求性
の復帰変異株数を調べたところ、生菌数はｌ−あたり４
Ｘ１０８であって、この内にはキサンチン要求性の復帰
変異株は全く見出させなかった。なお、参考のためにア
デニン要求性の復帰変異株の出現を調へたところ、上述
培養終了液１ｄあたり４Ｘ１０２存在しており、復帰変
異率の比較から本発明の効果は明らかである。
の復帰変異株数を調べたところ、生菌数はｌ−あたり４
Ｘ１０８であって、この内にはキサンチン要求性の復帰
変異株は全く見出させなかった。なお、参考のためにア
デニン要求性の復帰変異株の出現を調へたところ、上述
培養終了液１ｄあたり４Ｘ１０２存在しており、復帰変
異率の比較から本発明の効果は明らかである。
実施例５
１） ３μｇのｐＥＸＩ４−７を１ユニツトの制限酵素
Ｈｉｎｄｌｌｌを用いて１０分間反応さぜ６５°Ｃて酵
素を加熱失活させて部分分解した後、エタノール沈澱を
行い沈澱物をＴＥ緩衝液（２０μｇ）に溶解した。次い
てＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行った。次に
このＤＮＡ溶液を用いて実施例１に記載の方法に従って
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｘ８９５株の
形質転換を行いＭ−９０ＡＴＡ培地にアンピノリン（２
５μｇ／滅）とキサンチンを含む寒天平板に塗布し、３
７°Ｃ−夜培養して、コロニーを生じせしめ、これをマ
スタープレートとして、Ｍ−９ＣＡＴＡ寒天平板にレプ
リカして、アンピンリン耐性でかつキサンチン要求性を
有している形質転換株ＴＥＸ１８１株を分離した。
Ｈｉｎｄｌｌｌを用いて１０分間反応さぜ６５°Ｃて酵
素を加熱失活させて部分分解した後、エタノール沈澱を
行い沈澱物をＴＥ緩衝液（２０μｇ）に溶解した。次い
てＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行った。次に
このＤＮＡ溶液を用いて実施例１に記載の方法に従って
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｘ８９５株の
形質転換を行いＭ−９０ＡＴＡ培地にアンピノリン（２
５μｇ／滅）とキサンチンを含む寒天平板に塗布し、３
７°Ｃ−夜培養して、コロニーを生じせしめ、これをマ
スタープレートとして、Ｍ−９ＣＡＴＡ寒天平板にレプ
リカして、アンピンリン耐性でかつキサンチン要求性を
有している形質転換株ＴＥＸ１８１株を分離した。
参考例１に記載の方法に従ってＴＥＸ１８１株からプラ
スミドの分離を行い、得られたプラスミドをｐＥＸ１８
１と命名した。ｐＥＸ１８１の作製方法及び制限酵素地
図を第３図に示した。
スミドの分離を行い、得られたプラスミドをｐＥＸ１８
１と命名した。ｐＥＸ１８１の作製方法及び制限酵素地
図を第３図に示した。
ｐＥＸ＋８１はこの図から明らかなようにｐＥＸ １４
７のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む挿入断片のほ
ぼ中央部に位置する約０．２５キロベースペアのＨ４ｎ
ｄｌＩ［断片が欠失したプラスミドであり、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦Ｘ８９５のキサンチン要求性の
相補能を失ったものである。
７のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む挿入断片のほ
ぼ中央部に位置する約０．２５キロベースペアのＨ４ｎ
ｄｌＩ［断片が欠失したプラスミドであり、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦Ｘ８９５のキサンチン要求性の
相補能を失ったものである。
ｉｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ １０３２のコンピテントセル懸濁液（１蔵）にｐ
ＥＸ１８１のＰｓｔＩ消化物（５μｇ）を加えて３７℃
で１時間振盪した後、滅菌水で希釈し、キサンチンを含
むＭ−９０ＡＴＡ寒天平板上に塗布して３７℃で一夜保
温しコロニーを生じせしめた。次にこれをマスタープレ
ートとしてＭ−９０ＡＴＡ培地にレプリカして、さらに
２４時間培養した後、キサンチン要求性を示すコロニー
を得、該菌株をＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ−１０４３（ＩＦＯ１４６５５ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５０１）と命名した。
ＢＭ １０３２のコンピテントセル懸濁液（１蔵）にｐ
ＥＸ１８１のＰｓｔＩ消化物（５μｇ）を加えて３７℃
で１時間振盪した後、滅菌水で希釈し、キサンチンを含
むＭ−９０ＡＴＡ寒天平板上に塗布して３７℃で一夜保
温しコロニーを生じせしめた。次にこれをマスタープレ
ートとしてＭ−９０ＡＴＡ培地にレプリカして、さらに
２４時間培養した後、キサンチン要求性を示すコロニー
を得、該菌株をＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ−１０４３（ＩＦＯ１４６５５ＦＥＲＭ ＢＰ−
１５０１）と命名した。
本閑に於てはＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性は検出できな
かった。
かった。
１ｉｉ） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ １０４３をＬＢ培地に接種して２８℃で一夜培
養後、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法によって
染色体ＤＮＡを取得した。かくして得られた染色体ＤＮ
ＡのｌＯμｇを制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびΣｍａ Ｉ
で二重切断した後、アガロースゲル電気泳動を行いニト
ロセルロースフィルターに転写した。また同時にＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２の
染色体ＤＮＡのＢｇｌ Ｉ［−９ｍａ Ｉ消化物もニト
ロセルロースフィルターに転写した。次に実施例２−ｉ
ｉ）項で作製した標識されたＸｂａ Ｉ −Ｈｌｎｃ
ＩＩ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーショ
ンを行った結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｂ Ｍ１０３２株の染色体ＤＮＡとの間では２．
１キロベースペアと３．ＱキロベースペアのＤＮＡの泳
動距離に相当する部分にハイブリダイゼーションのバン
ドがみられるのに対しＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ −１０４３株の染色体ＤＮＡとの間では２
．１キロベースペアと２．７５キロベースベアのＤＮＡ
の泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼーションの
バンドがみられた。
ＢＭ １０４３をＬＢ培地に接種して２８℃で一夜培
養後、フェノールを用いる染色体ＤＮＡ抽出法によって
染色体ＤＮＡを取得した。かくして得られた染色体ＤＮ
ＡのｌＯμｇを制限酵素Ｂｇｌ ＩＩおよびΣｍａ Ｉ
で二重切断した後、アガロースゲル電気泳動を行いニト
ロセルロースフィルターに転写した。また同時にＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２の
染色体ＤＮＡのＢｇｌ Ｉ［−９ｍａ Ｉ消化物もニト
ロセルロースフィルターに転写した。次に実施例２−ｉ
ｉ）項で作製した標識されたＸｂａ Ｉ −Ｈｌｎｃ
ＩＩ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーショ
ンを行った結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｂ Ｍ１０３２株の染色体ＤＮＡとの間では２．
１キロベースペアと３．ＱキロベースペアのＤＮＡの泳
動距離に相当する部分にハイブリダイゼーションのバン
ドがみられるのに対しＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ＢＭ −１０４３株の染色体ＤＮＡとの間では２
．１キロベースペアと２．７５キロベースベアのＤＮＡ
の泳動距離に相当する部分にハイブリダイゼーションの
バンドがみられた。
ｉｖ） 実施例２− ｉｉｉ ）の方法でキサンチン
要求性のＢＭ−１０４３株はキサンチン要求性の復帰変
異は認められなかった。
要求性のＢＭ−１０４３株はキサンチン要求性の復帰変
異は認められなかった。
Ｖ）実施例２−ｉｖ）の方法でＢａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓＢＭ−１０４３株を培養したところ、９
、８ ｍｇ／旙のジノシンの蓄積が認められた。
ｕｂｔｉｌｉｓＢＭ−１０４３株を培養したところ、９
、８ ｍｇ／旙のジノシンの蓄積が認められた。
発明の効果
本発明によると、呈味性物質として重要な５′−イノシ
ン酸の原料であるイノシンを収率よく工業的に有利に製
造することができる。
ン酸の原料であるイノシンを収率よく工業的に有利に製
造することができる。
すなわち、本発明のＤＮＡを用いてイノシン、キサント
シンまたはグアノシンの１種以上を生産し得るバチルス
属菌を受容菌として形質転換させることにより、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼを欠損し、イノシン生産能の高い新菌
株を得ることができる。
シンまたはグアノシンの１種以上を生産し得るバチルス
属菌を受容菌として形質転換させることにより、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼを欠損し、イノシン生産能の高い新菌
株を得ることができる。
該生産菌はイノシンの蓄積量が高いと共に、復帰変異を
起こさず、安定性が高いので生産管理上も極めて有利で
ある。
起こさず、安定性が高いので生産管理上も極めて有利で
ある。
第１図は実施例で得られたｐＥＸ２０３の作製法を示す
。図中のＰ、Ｓｍ、Ｘ、Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｅは、それぞれ制
限酵素Ｐｓｔｌ、灸組１． Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ■１則
規Ｈ１，几用ｃＩ［、見弦 ＲＩの切断すイトを表わす
。また・・はＳ、ａｃ ＩＩ の接着末端およびＰｓｔ
ｌの接種末端をそれぞれＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端に転換した後に連結したことを表わす。図中の斜線
部分はＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子部分、黒の塗りつ
ぶしはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子部分を表わす。 第２図の上図はＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂ Ｍ１０３２染色体ＤＮＡ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０４１染色体ＤＮＡの
構造をそれぞれ模式的に表わし、図中、ＳｍはΣｍａＩ
、ＢはＢｇｌ■の切断サイトを、数字は塩基対数（キロ
ベースペア）を、斜線部分はＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺
伝子部分を、また黒の塗りつぶし部分はクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子部分をそれぞ
れ表わす。第２図の下図Ａは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２およびＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ Ｉ ０４１の
染色体ＤＮＡのＳｍａｌＢｇｌ Ｉに二重消化物と３２
ｐで標識したｐＢＴＭ １２４のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｄ Ｎ Ａとの間
のハイブリダイゼーションのバンドを示し、下図ＢはＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０
３２およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ Ｉ ０４１の染色体ＤＮＡのＳｍａ １．
Ｂｇｌ Ｈ二重消化物と３２ｐで標識したｐＥＸ１１７
のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子部分との間のハイブリ
ダイゼーションのバンドをそれぞれ示す。 第３図は実施例５で得られたｐＥＸＩ８＋の作製方法を
示す。図中のｌＴ１．Ｘ、Ｐ、Ｈはそれぞれ比胆ｄｌＩ
ｌ、用Ｉ、胆■１川江Ｃ■を表わし、斜線部分はＩＭＰ
デヒドロゲナーゼ遺伝子部分を表わず。 Ｓｍ Ｂ Ｂ１−−
３．０ −−ヒー２．１← Ｓｍ Ｂ８ Ｂ＋
３．９ ＋１−−２，１→ （Ａ） Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ ｌ○３２゛−−一
簗？！、杯ＤＮＡ （ｓ） 図 手続補正書＜−Ｓ幻 １．事件の表示 昭和６２年特許願第３２８８４０号 ２、発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名称 （２９
３）武田薬品工業株式会社代表者 梅 本 純 正 ４、代理人 住所 大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号７、補
正の内容 明細書の第５０頁第１０行の「第２図の」ニスは」の前
に「第２図は実施例２におけるサザンハイブリタイゼー
ンヨンの結果を示す。ここで、」の記載を挿入する。 以上
。図中のＰ、Ｓｍ、Ｘ、Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｅは、それぞれ制
限酵素Ｐｓｔｌ、灸組１． Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ■１則
規Ｈ１，几用ｃＩ［、見弦 ＲＩの切断すイトを表わす
。また・・はＳ、ａｃ ＩＩ の接着末端およびＰｓｔ
ｌの接種末端をそれぞれＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端に転換した後に連結したことを表わす。図中の斜線
部分はＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子部分、黒の塗りつ
ぶしはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子部分を表わす。 第２図の上図はＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂ Ｍ１０３２染色体ＤＮＡ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＭ １０４１染色体ＤＮＡの
構造をそれぞれ模式的に表わし、図中、ＳｍはΣｍａＩ
、ＢはＢｇｌ■の切断サイトを、数字は塩基対数（キロ
ベースペア）を、斜線部分はＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺
伝子部分を、また黒の塗りつぶし部分はクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子部分をそれぞ
れ表わす。第２図の下図Ａは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０３２およびＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ Ｉ ０４１の
染色体ＤＮＡのＳｍａｌＢｇｌ Ｉに二重消化物と３２
ｐで標識したｐＢＴＭ １２４のクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｄ Ｎ Ａとの間
のハイブリダイゼーションのバンドを示し、下図ＢはＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ １０
３２およびＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＭ Ｉ ０４１の染色体ＤＮＡのＳｍａ １．
Ｂｇｌ Ｈ二重消化物と３２ｐで標識したｐＥＸ１１７
のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子部分との間のハイブリ
ダイゼーションのバンドをそれぞれ示す。 第３図は実施例５で得られたｐＥＸＩ８＋の作製方法を
示す。図中のｌＴ１．Ｘ、Ｐ、Ｈはそれぞれ比胆ｄｌＩ
ｌ、用Ｉ、胆■１川江Ｃ■を表わし、斜線部分はＩＭＰ
デヒドロゲナーゼ遺伝子部分を表わず。 Ｓｍ Ｂ Ｂ１−−
３．０ −−ヒー２．１← Ｓｍ Ｂ８ Ｂ＋
３．９ ＋１−−２，１→ （Ａ） Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭ ｌ○３２゛−−一
簗？！、杯ＤＮＡ （ｓ） 図 手続補正書＜−Ｓ幻 １．事件の表示 昭和６２年特許願第３２８８４０号 ２、発明の名称 ＤＮＡおよびその用途 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町２丁目２７番地名称 （２９
３）武田薬品工業株式会社代表者 梅 本 純 正 ４、代理人 住所 大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号７、補
正の内容 明細書の第５０頁第１０行の「第２図の」ニスは」の前
に「第２図は実施例２におけるサザンハイブリタイゼー
ンヨンの結果を示す。ここで、」の記載を挿入する。 以上
Claims (8)
- （１）バチルス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領
域および（または）その周辺領域と高い相同性を有し、
かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子をコ
ードするＤＮＡ。 - （２）ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領域内にその遺伝
子を損わせるＤＮＡフラグメントを組み込ませてなる特
許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ。 - （３）ＤＮＡフラグメントがＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺
伝子以外の他遺伝子である特許請求の範囲第（２）項記
載のＤＮＡ。 - （４）他遺伝子が選択マーカ遺伝子である特許請求の範
囲第（３）項記載のＤＮＡ。 - （５）ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子の一部または全部
を欠失させてなる特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮ
Ａ。 - （６）特許請求の範囲第（１）、（２）、（３）、（４
）および（５）項記載のＤＮＡが組み込まれたベクター
。 - （７）特許請求の範囲第（４）項または（５）項記載の
ＤＮＡあるいは第（６）項記載のベクターで形質転換さ
れ、ＩＭＰデヒドロゲナーゼを欠損しイノシン生産能を
有するバチルス属菌。 - （８）バチルス属菌のＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子領
域および（または）その周辺領域と高い相同性を有し、
かつ機能の損われたＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子をコ
ードするＤＮＡ、あるいはこれらのＤＮＡが組み込まれ
たベクターで形質転換され、ＩＭＰデヒドロゲナーゼを
欠損しイノシン生産能を有するバチルス属菌を培地に培
養し、イノシンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするイノシンの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-311588 | 1986-12-26 | ||
| JP31158886 | 1986-12-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01174385A true JPH01174385A (ja) | 1989-07-10 |
Family
ID=18019045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62328840A Pending JPH01174385A (ja) | 1986-12-26 | 1987-12-24 | Ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0273660B1 (ja) |
| JP (1) | JPH01174385A (ja) |
| KR (1) | KR880007735A (ja) |
| CN (1) | CN1018846B (ja) |
| AT (1) | ATE92101T1 (ja) |
| DE (1) | DE3786771T2 (ja) |
| ES (1) | ES2058133T3 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| JP2022074028A (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-17 | セメス カンパニー，リミテッド | 搬送ハンド及び基板処理装置 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0393969A3 (en) * | 1989-04-19 | 1991-03-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Dna containing imp dehydrogenase gene and its use |
| TW201793B (ja) * | 1989-08-04 | 1993-03-11 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| US5213972A (en) * | 1989-12-08 | 1993-05-25 | Chemgen Corporation | Fermentation process for the production of pyrimidine deoxyribonucleosides |
| KR920002774A (ko) * | 1990-07-03 | 1992-02-28 | 우메모또 요시마사 | Dna 및 그의 용도 |
| FR2665711B1 (fr) * | 1990-08-08 | 1993-08-13 | Centre Nat Rech Scient | Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue. |
| JP4352716B2 (ja) * | 2003-02-17 | 2009-10-28 | 味の素株式会社 | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 |
| CN104745616B (zh) * | 2015-04-17 | 2018-10-23 | 南京工业大学 | 一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌及其构建方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60156388A (ja) * | 1984-01-27 | 1985-08-16 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄνａおよびその用途 |
| WO1986001825A1 (en) * | 1984-09-21 | 1986-03-27 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0074808A3 (en) * | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
| JPS59205983A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
-
1987
- 1987-12-18 AT AT87311199T patent/ATE92101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-12-18 DE DE87311199T patent/DE3786771T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-18 EP EP87311199A patent/EP0273660B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-18 ES ES87311199T patent/ES2058133T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 JP JP62328840A patent/JPH01174385A/ja active Pending
- 1987-12-25 CN CN87101275A patent/CN1018846B/zh not_active Expired
- 1987-12-26 KR KR870014964A patent/KR880007735A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60156388A (ja) * | 1984-01-27 | 1985-08-16 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄνａおよびその用途 |
| WO1986001825A1 (en) * | 1984-09-21 | 1986-03-27 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8236531B2 (en) | 2006-04-24 | 2012-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| JP2022074028A (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-17 | セメス カンパニー，リミテッド | 搬送ハンド及び基板処理装置 |
| US11935779B2 (en) | 2020-10-30 | 2024-03-19 | Semes Co., Ltd. | Transfer hand and substrate processing apparatus with conductive ring and tilting vacuum pad |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0273660A3 (en) | 1989-04-19 |
| ATE92101T1 (de) | 1993-08-15 |
| KR880007735A (ko) | 1988-08-29 |
| CN87101275A (zh) | 1988-08-10 |
| ES2058133T3 (es) | 1994-11-01 |
| DE3786771D1 (de) | 1993-09-02 |
| CN1018846B (zh) | 1992-10-28 |
| DE3786771T2 (de) | 1993-11-11 |
| EP0273660A2 (en) | 1988-07-06 |
| EP0273660B1 (en) | 1993-07-28 |
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