JPS62155081A - 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は新規微生物及びそれを用いるビオチンの製造法
に関する。

［従来の技術］ ビオチンは動植物、微生物にとって重要なビタミンの一
種である。

従来微生物を用いたビオチンの製造法としては、バシル
ス属、クロモバクテリウム属、シュ−トモナス属、アー
スロバフタ−属等の微生物を用いる方法か知られている
。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起せしめて
ビオチン生産能を付与する方法も提案されている。（特
開昭５８−６０９９６号ｗｆ＆） ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら微生物を用いてビオチンを製造しようとす
る場合、野生株はビオチンによる強力なフィードバック
阻害機構の為（Ｙ、Ｉｚｕｍｉ、に、Ｏｇａｔａ、Ａｄ
ｖ、Ａｐｐｌ、旧ｃｒｏｂｉａ１．　Ｖｏｌ、２２，１
５５−１５７．１９７７）ビオチンは極少量しか生成さ
れない。また変異株を用いる方法でも生成量は必ずしも
満足し得るものではなかった。

本発明名等はこれらの手法とは異なる遺伝子操作による
育種に着目し、ビオチン生産能の優れた微生物を得るべ
く鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア・コリ野生株を
人工的に変異きせることによりビオチンによるフィード
バック阻害が解除された変異株を取得し、該変異株より
ビオチンの生合成に関与する酵素の遺伝情報を担うＤＮ
Ａを単離し、次いて該ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込
ませた組換えＤＮＡプラスミドを得、該組換えＤＮＡプ
ラスミドを前記変異株に導入することに成功するととも
に、かくして得られた微生物が優れたビオチン生産能を
有することを見い出し先に特許出願をした（特願昭６０
−４２９２８号）が、上記方法によると時として組換え
ＤＮＡプラスミド中に遺伝子欠失が起きる等の不安定な
状態にあった。

［問題点を解決するための手段１ 上記の事情に鑑み、本発明者らはこれらの欠点を解決す
べく更に研究を重ねた結果、ビオチン生産能を有するエ
シェリヒア・コリ野生株から片側の末端が特定された塩
基対以下になるようにビオチンオペロンを取りだし、次
いで該ビオチンオペロンをベクターＤＮＡに組み込ませ
た組換えＤＮＡプラスミドを得、該組換えＤＮＡプラス
ミドを、エシェリヒア・コリ野生株を人工的に変異させ
ることにより得たビオチンによるフィードバック阻害が
解除された変異株に導入することに成功するとともに、
かくして得られた微生物は前記した欠点もなく安定で、
優れたビオチン生産能を有することを見い出し、これら
の知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）ビオチン生産能を有するエシ
ェリヒア・コリより得たビオチンオペロンで該ビオチン
オペロンの片側の末端がデスチオビオチンからビオチン
への変換に関与する酵素の遺伝情報を担うＤＮＡの翻訳
開始点から下流３７６０塩基対以下であるビオチンオペ
ロンをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡプラス
ミドを、ビオチンによるフィードバック阻害が解除され
たエシェリヒア・コリ変異株に含有せしめてなる微生物
および（２）該微生物を培養し、培地中に生成蓄積され
たビオチンを採取することを特徴とするビオチンの製造
法である。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明で言うビオチンオペロンとは、ビオチン生合成に
関与する第１図に示すＡ、Ｂ、Ｆ、Ｃ。

Ｄ遺伝子及びＡ、８間に存在するそれらの遺伝子を発現
させるに必要な制御領域全てを含むＤＮＡ領域のことを
言う。なお、上記Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｃ。

Ｄは夫々下、記の酵素の遺伝子情報を担うＤＮＡ領域を
表す。（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｖｏｌ、５６．
５３−６２゜Ａニア、８−ジアミノペラルゴン酸シンテ
ターゼＢ：デスチオビオチンからビオチンへの変換に関
与する酵素 Ｆニア−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ Ｃ：ピメリルＣｏＡシンテターゼ Ｄ：デスチオビオチンシンテターゼ 「に　７′　　の′。

まず、ビオチン生産能を有するエシェリヒア・コリ野生
株（例えばエシェリヒア・コリＪＡ２２１　）に変異を
誘起せしめて、ビオチン要求株（以下、ＢＲ変異株と称
す。）を取得する。次にエシェリヒア・コリ野生株（例
えばエシェリヒア・コリＷ３１１０）に変異を誘起せし
めて、ビオチンによるフィードバック阻害が解除された
変異株（以下、ＤＲＫ変異株と称す。）を取得する。変
異の誘起は通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチル−Ｎ
’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのごとき変異誘起
剤で処理することにより実施することができる。ＢＲ変
異株の取得は変異誘起処理して得られた菌体を緩衝液で
適当に希釈後、ビオチンを含む最少培地寒天平板で培養
し、適当数（約５０〜２００（ＩＷ）のコロニーが出現
した平板を選び、ビオチン無添加の最少培地寒天平板に
レプリカして培養後、レプリカ平板をマスター平板と比
較し、レプリカ平板では生育しないコロニーをマスター
平板より釣の分離することにより行う。

このようにして得られたＢＲ変異株には例えばエシェリ
ヒア・コリＢＲ−４があげられる。本ＢＲ変異株はデス
チオビオチン添加最少培地でも生育できないことより、
デスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素
が欠損したことがゎがる。

また公知のＢＲ変異株としては、例えばＪ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　、Ｖｏｌ、１１２　、８３０−８３９　
（１９７２）に記載のＲ８７６株、Ｒ８７４株、Ｒ８７
３株、Ｒ８７７株、Ｒ８７５株（それぞれＣ遺伝子、Ｆ
遺伝子、Ａ遺伝子、Ｄ遺伝子、Ｂ遺伝子が欠損した株）
があげられる。

一方ＤＲＫ変異株の取得は変異誘起処理して得られた菌
体を、緩衝液で適当に希釈後、上記のようにして得たＢ
Ｒ変異株と２．３．５−　トリフェニルテトラゾリウム
クロリドとを含むビオチン無添加の最少培地寒天平板に
、一定量のビオチン無添加の最少寒天培地を重層して作
成した平板上で培養し、生じた小コロニーの下層がピン
ク色のゾーンを呈スル小コロニーを釣菌分離することに
よりおこなう。この原理は、ビオチンによるフィードバ
ック阻害が解除されたＤＲＫ変異株はビオチンを多量に
生産し、下層のＢＲ変異株の生育を助け、その増殖に伴
い２，３．５−　トリフェニルテトラゾリウムクロリド
が還元されピンク色のゾーンを呈することにある。従っ
て変異が誘発されなかった野生株ではこのような現象は
観察されない。このようにして得られたＤＲＫ変異株と
しては、例えばエシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２（黴
工研菌寄第２９８９号）があげられる。

本ＤＲＫ−３３２株がオペレーター変異でないことは、
後述するような方法によりビオチンオペロンを単離精製
後、そのオペレーターを含む遺伝子発現の調節領域の塩
基配列を化学分解法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、６５．４９９−５８０．１９８
０）またはジデオキシヌクレオチド酵素法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１０１．
２０−７８．１９８３）によって、野生株の同領域と比
較することにより確認することができる。つまり、野生
株の同領域と塩基配列が全く同じで有ればオペレーター
変異ではなく、おそらくリプレッサー変異であると推定
される。

次いでビオチンオペロンを含むＤＮＡ　（以下、染色体
ＤＮＡと称す。）を野生株から単離精製するには、例え
ばＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　Ｖ
ｏｌ、７２゜６１９〜６２９　（１（１６３）に記載の
フェノール法等常法に従って行うことができる。

次に得られた染色体ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込ん
で組換えＤＮＡを調整する。染色体ＤＮＡのベクターＤ
ＮＡへの組み込みは常法に従って行うことができる。例
えば、染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーゼで切断して染色体ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡ断片を調整したのち、両者の混合物をＤＮＡリ
ガーゼで処理することにより行うことができる。ここで
用いられるベクターとしてはエシェリヒア・コリを宿主
とするｐＢＲ３２２プラスミド、コリシン（Ｃｏ　ｌ　
）Ｅ１プラスミド、ラムダファージなど通常用いられる
ものが採用されうる。とりわけｐＢＲ３２２プラスミド
が好適に用いられる。また制限エンドヌクレアーゼとし
ては、例えば旧ｎｄｌ１１．．ＥｃｏＲＴ、　ＰｓｔＩ
、ＢａｍＨＩ等があげられるが、制限エンドヌクレアー
ゼの操作を浅く、即ちＤＮＡ１の切断が部分切断で止ま
るようにすれば多くの制限エンドヌクレアーゼが本実験
に使用できる。

また２種類の制限エンドヌクレアーゼを併用することも
可能である。

第１図にビオチンオペロンの制限エンドヌクレアーゼ切
断地図を示す。本発明で用いられる制限エンドヌクレア
ーゼは該図中に存在するものが特に好適に用いられる。

ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリ
ガーゼが好適に用いられる。

次に、上記のことくしで得た組換えＤＮＡを常法例えば
［Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　Ｖｏｌ、
１２４．１−１０　（１９７３）　］に記載のカルシウ
ム処理法によりＢＲ変異株（例えばエシェリヒア・コリ
ＢＲ−４）に導入し、ビオチン無添加の最少培地寒天平
板上で培養することにより生じたコロニーを釣菌分離し
てビオチン生産能を有する菌株（即ちビオチンオペロン
又はビオチンオペロンの一部が組み込まれた組換えＤＮ
Ａプラスミドを含有した結果ビオチン要求性か回復した
菌株）を採取する。

次いで、上記方法で得られた組換えＤＮＡプラスミド含
有菌株より組換えＤＮＡプラスミドを単離する。

組換えＤＮＡプラスミドの単離は常法に従って行うこと
かできる。例えばＮｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、７．１５１３−１５２３　（１９
７９）に記載のアルカリ抽出法かあげられる。

このようにして得られた組換えＤＮＡプラスミドにビオ
チンオペロンか含まれることは次のようにして確認する
ことができる。

即ち各ビオチン生合成酵素活性の欠損したエシェリヒア
・コリＢＲ変異株に木組換えＤＮＡプラスミドを導入す
ることによりビオチン要求性が回復きれることをもって
確認するものである。なお、組換えＤＮＡプラスミドを
得る時に用いた制限エンドヌクレアーゼの種類によって
は、処理を完全に行った時などは、ビオチンオペロンの
全ては含まない即ち幾つかの遺伝子が欠落する場合があ
る。このような時は、異なる制限エンドヌクレアーゼを
用いて得られる規程かの組換えＤＮＡプラスミドからの
再構成行い、結果としてビオチンオペロンを含む組換え
ＤＮＡプラスミドを得ることができる。

ここで用いた制限エンドヌクレアーゼの種類によっては
、ビオチンオペロンの片側の末端がデスチオビオチンか
らビオチンへの変換に関与する酵素の遺伝情報を担うＤ
ＮＡの翻訳開始点から下流３７６０塩基対を超える場合
が存在する。この場合その部位より下流に存在する遺伝
子領域の為、得られた組換えＤＮＡプラスミド中に遺伝
子欠失が起きるなど組換えＤＮＡプラスミドの不安定ざ
がしばしば観察されるため、この不安定遺伝子領域を削
除しなくてはならない。デスチオビオチンからビオチン
への変換に関与する酵素の遺伝情報を担うＤＮＡの翻訳
開始点は、第１図に示す制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ
Ｉの認識部位５°−ＣＣＡＴＧＧ−３°（Ｃ：シトシン
、Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｇニゲアニン）のＡＴＧ
である（Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ。

２７６．６８９−６’１４．０１７８）。

本特許で限定される領域はこのＡＴＧより３７６０塩基
対以下であれば良いが、ビオチンオペロン内つまり第１
図に示されるＤａ伝子領域以下であってはならないこと
は当然のことである。つまりビオチンオペロンの片側の
末端は、デスチオビオチンからビオチンへの変換に関与
する酵素の遺伝情報を担うＤＮＡの翻訳開始点から下流
３６０３塩基対以上、３７６０塩基対以下であり、特に
好ましくは３６６４塩基対以上３７６０塩基対以下であ
る。

組換えＤＮＡプラスミド中のＤ遺伝子下流の不必要遺伝
子領域の削除は、組換えＤＮＡを適当な制限エンドヌク
レアーゼで切断後、切断点を起点としてエンドヌクレア
ーゼにより部分消化し、再結合後、ＢＲ変異株に導入し
て得ることができる。

上記のごとくして得た組換えＤＮＡプラスミドを前記の
ＤＲＫ変異株に導入すれば、組換えＤＮＡプラスミド含
有ＤＲＫ変異株を調整することができる。

組換えＤＮＡプラスミド含有ＤＲＫ変異株はベクターの
持つ形質により、組換えＤＮＡプラスミドを含有する菌
のクローンを選択的に生育せしめる寒天培地平板にて培
養し出現するコロニーとして取得することができる。

かくして得られた組換えＤＮＡプラスミド含有ＤＲＫ変
異株すなわち本発明の新規微生物の例としては、例えば
エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２［ｐＫＨＮ３１］（
黴工研菌寄第　８５３ら　　号）があげられる。

上二しチ」Ｌｏ」ヨｉ 上記の如くして取得した本発明の微生物を培養すれば培
養液中にビオチンを著量生成蓄積する。

本発明に係る微生物の培養に際して用いられる培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。炭素源として
は、グルコース、グリセリン、フラクトース、シューク
ロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解
液、糖蜜などの炭水化物が使用でき、その使用量は０．
５〜５．０％程度が好ましい。また窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種の無機および有機アンモニウム塩類あるいは肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの天
然有機窒素源が使用可能であり、その使用量は０．５〜
２．０％程度が好ましい。

天然有機窒素源の多くの場合は、窒素源であるとともに
炭素源にもなりうる。

ざらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸鋼、塩化
マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモン、硼酸
などが使用でき、その使用量は０．００５〜０．５％程
度が好ましい。

また、造成された微生物に抗菌薬剤耐性か付与されてい
る場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによ
って汚染菌の混入を防ぐことができる。

培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下で行うのが好ましい。培Ｒ？Ｈ度は２５〜３７℃か好
適であり、培養中の培地のｐｏは中性付近に維持するこ
とが望ましく、培養期間は通常１６〜４８時間程度で充
分である。培養を終了した後、培養液からのビオチンの
抽出精製にあたっては、ビオチンの諸性質を利用して一
般の天然物からの抽出精製法が応用できる。ずなわら、
培養物から菌体を除き活性炭に吸着させ、しかるのＰ）
溶出させイオン交換樹脂で精製するか、あるいは培養濾
液を直接イオン交換樹脂で処理して精製し、水またはア
ルコールより再結晶することによりビオチンを取得する
ことができる。

［実施例］ 次に実施例をあげて本発明をざらに詳細に説明するが、
本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　Ｄ　ＲＫ変異株の調整 ビオチン生産能を有する野生株エシェリヒア・コ！、Ｉ
　Ｗ３１１０（ＩＦＯ１２７１３）　ヲＬ−培地（ペプ
トン１０ｇｚ”ｌ　。

酵母エキス５ｇ／１．グルコースＩｇ／ｌ、塩化ナトリ
ウム５ｇ／　（Ｌ　、　ｐ　Ｈ７，２に調整）中３７℃
で３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を実況後、
これをＮ−メチル−Ｎ″−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン１００μｇ／ｍＬを含有するＴＭ緩衝液（トリス−
塩基０．６１％、マレイン酸０．５％、ｐＨ６，０に調
整）に懸濁し、３７℃３０分間静置し変異処理を行った
。菌体を実況後回懸濁液を、実況された１０５ｃｅ　ｌ
　ｌ／　ｒｒＬのＢＲ変異株エシェリヒア・コυＢＲ−
４と５０ｕｇ／ｍｅの２．３．５−　トリフェニルテト
ラゾリウムクロリドを含む２０ｍＬのビオチン無添加の
最少培地寒天平板（グルコース５ｇ／４．硫酸アンモニ
ウム４ｇ／Ｌ、燐酸第二水素カリウム２ｇ／ｉ、燐酸第
−水素カリウムＩｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．１８／Ｌ、ビタミンフリーのカザミノ酸４ｇ／　ｌ
　、寒天１５ｇ／ｌ！、）に１５＋＋＋ｅのビオチン無
添加最少寒天培地を重層しておいた通常の大きざのシャ
ーレ上に出現するコロニーが約５０〜２００個となるよ
うに塗抹した。３７℃４８時間培養後、出現した小コロ
ニーの下層がピンク色のゾーンを呈した１株を釣菌分離
し、ビオチンによるフィードバック阻害が解除されたＤ
ＲＫ変異株エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２（＠”Ｉ
工研菌寄第８９３９　　　号）を取得した。

（２）染色体ＤＮＡの調整 ビオチン生産能を有するエシェリヒア・コリｖ３１１０
を５００ｍＱ、のし−培地中３７℃で３時間１辰盪培養
を行い、対数増殖期の菌体を巣洗後、フェノール法にょ
る通常のＤＮＡ抽出法によって抽出精製し、１．８ｍｇ
の染色体ＤＮＡを得た。

（３）ベクターＤＮＡの調整 アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性を有する
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを次のように調整した。

まず、ｐＢＲ３２２をプラスミドとして保有するエシェ
リヒア・コリに一１２株の一種を、アンシピリン５０７
１ｇ／　ｍＬ添加したＬ−培地１０１００Ｏ中で３７℃
で培養し、対数増９１ａ期に１５０Ｌｔｇ／ｍｌｌのク
ロラムフェニコールを添加してざらに一夜培養した。こ
の操作により細胞内にプラスミドＤＮＡが多量に生産き
れる。

クロラムフェニコール添加後、１５時時間和菌体を集注
し、リゾチウムおよびソジウムドデシルサルフエートで
溶菌させ、次いで３００００　Ｘ　ｇで２時間遠心分離
して上清を得た。この上清液からプラスミドＤＮＡを濃
縮後、リボ核酸分解酵素で３７℃２時間処理し、ついで
セシウムクロリドーエチジウムブロミト平衡密度勾配遠
心法によって最終４５０　ｕ　ｇのｐＢＲ３２２プラス
ミドＤＮＡを分画採取した。

（４）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（２）で得
たＤＮＡ２μｇをとり、制限エンドヌクレアーゼｐｓｔ
Ｉを加え３０℃で３時間反応させ完全に切断した。また
（３）で調整したベクターＤＮＡ１．５μｇをｐｓｔＩ
で完全に切断した。両反応液を各ノン６５℃５分間の加
熱処理をした後、両反応液を混合し、ＡＴＰ（アデノシ
ン三燐酸）およびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファ
ージ由来のＤＮＡリガーゼによって１５℃１６時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行った。

同様に（２）で得た染色体ＤＮＡ　２μｇを２つの制限
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用い
、同時に３７℃３時間反応させ６５℃５分間の熱処理後
、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ旧で完全に切断したベクター
ＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を１５℃１６時間
行った。反応後は夫々６５℃５分間の熱処理後、反応液
に２倍容のエタノールを加えて連結反応後のＤＮＡを沈
澱採取した。

（５）ビオチンオペロンまたはビオチンオペロンの一部
を含む組換えＤＮＡによる形質転換エシェリヒア・コリ
ＪＡ２２１より変異誘導したビオチン要求株エシェリヒ
ア・コリＢＲ−４をＬ−培地１０ｍＮに接種し、３７℃
で４時間振盪培養を行い対数増殖期中期まで生育させた
後集菌し、これを塩化カルシウム５０ｍ）４を含むトリ
ス緩衝液（５０ｍＭ、ｐ）１７゜０）で２回洗浄後、同
じ緩衝液１シに再懸濁させた。

この′Ｐ濁液０　、２　ｍＱ、に（４）のｐｓｔｌを用
いて得た組換えＤＮＡ溶液を加え、０℃に３０分保持し
た後、直ちに４２℃２分間のヒートショックを与え、Ｄ
ＮＡを細胞内に取り込ませた。ついでそれぞれの細胞懸
（ｖＡ液の一定量を新たなＬ−培地に摂取し、３７℃２
時間静置培養を行った。それぞれ菌体を集注後、再懸濁
液を最少培地寒天平板に塗抹し、３７℃２日間培養した
。生じたコロニーを釣菌し、形質転換を末エシェリヒア
・コリＢＲ−４［ｐＯＦＴ５３］を得た。

全く同様の方法で（４）の２つの制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍ［を用いて得た組換えＤＮ　
Ａ　ｉ８′液により形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ
−４［ｐＢＤＲ７２］を得た。

得られた形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯ
ＦＴ５３］およびエシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤ
Ｒ７２］をそれぞれＬ−培地１００ｍ１中で培養し、（
３）と同様にしてクロラムフェニコール処理を行った。

菌体を集注後、アルカリ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、ヱ＋　１５１３〜１５２３　
、１９７９　）により、エシェリヒア・コリＢＲ−４［
ｐＯＦＴ５３］から組換えＤＮＡプラスミドｐＯＦＴ５
３を、エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＲ？２］か
ら組換えプラスミドｐＢＤＲ７２を多量に得た。

組換えＤＮＡプラスミドｐＯＦＴ５３およびｐＢＤＲ７
２を種々の制限エンドヌクレアーゼで処理後、制限エン
ドヌクレアーゼ切断パターンを第１図のビオチンオペロ
ンの制限エンドヌクレアーゼ切断地図と比較したところ
、組換えＤＮＡプラスミドｐＯＦＴ５３は第１図のビオ
チンオペロンの２つのｐｓＴＩではきよれる領域約５３
８０塩基対が、また組換えＤＮＡプラスミドｐＢＤＲ７
２は第１図のビオチンオペロンのＢａｍ１ｌＩ　、　Ｅ
ｃｏＲＩではきまれる領域約５４５０塩基対が含まれて
いた。

（６）組換えＤＮＡプラスミドｐＢＤＲ７２中の不必要
遺伝子領域を削除した組換えＤＮＡプラスミドの造成 （５）で得られた組換えＤＮＡプラスミドｐＢＤＲ−７
２を２μｇとり、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで
完全に切断後、切断点を起点としてエンドヌクレアーゼ
Ｂａ１３１により部分消化し、フェノール処理で反応を
完全に止めた後、２倍容のエタノールを加えてＤＮΔを
沈戯採取した。得られたＤＮＡ断片の末端にＨｉｎｄｌ
ｌ［リンカ−をＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼの作
用で連結させた。次に該反応液に制限エンドヌクレアー
ゼＨｉｎｄｌｌ［とＢａｍ旧を添加し完全に切断後、ア
ガロース電気泳動（アガロース１％、７０Ｖ）にかけエ
チジウムプロミドで染色後、約４．５Ｋｂから約５．２
Ｋｂに相当するＤＮＡ断片を含むゲル片を紫外線照射下
で切り出し、このゲルを透析チューブに入れて再度電気
泳動を行いゲルよりＤＮＡを抽出した。抽出後フェノー
ル処理で残存するアガロースを除去した後、２倍容のエ
タノールを加えてＤＮＡを沈め採取した。

得られた約４．５Ｋｂから約５．２Ｋｂに分布するＤＮ
Ａ断片と、別に２つの制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄ１
１１、ＢａｍＨＩで切断しアガロース電気泳動後同様の
方法でゲルから回収して得られた約４．ＯＫｂのｐＢＲ
３２２ベクターＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ４ファージ由
来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行った。

次いで６５℃５分間の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した
。

゛得られた種々の大きざのＤＮＡ断片をもつ組換えＤＮ
ＡをＢＲ変異株エシェリヒア・コリＢＲ−４株に（５）
と同様の方法で形質転換し、ビオチン無添加の最少寒天
培地平板上で生じたコロニーを釣菌した。

組換えｆｆＮＡプラスミドの安定性を見る為に、得られ
た種々のコロニーをアンピシリン添加（５０μｇ／鑓）
ビオチン無添加の最少寒天培地上で３度稙継いだ後、各
コロニーより（５）と同様の方法により組換えＤＮＡプ
ラスミドを抽出し、適当な制限エンドヌクレアーゼを用
い、制限エンドヌクレアーゼ切断パターンを調べ欠失し
た遺伝子領域を含む組換えＤＮＡプラスミドの混在の有
無など組換えＤＮＡプラスミドの安定性を見た結果を第
１表に示す。

第１表には、組換えＤＮＡプラスミドに含まれるビオチ
ンオペロンの片側の末端をデスチオビオチンからビオチ
ンへの変換に関与する酵素の遺伝情報を担うＤＮＡの翻
訳開始点（制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ　Ｉのｉ、ｌ
　Ｂｇ１部位５°−ＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ−３’のＡＴ　
Ｇ　”）からの距離（塩基対数：　ｂｐ）で示す。この
塩基対はジデオキシヌクレオチド酵素法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１０１．２０
−７８．１９８３）によって確認した。また各コロニー
より抽出きれた組換えＤＮＡプラスミドを（５）と同様
の方法によりＢＲ変異株の一種Ｒ８７７（Ｄ遺伝子が欠
損した株）へ形質転換して、ビオチン要求性が回復する
がどうか調べた結果も同時に示した。結果から明らかな
ようにビオチンオペロンの片側の末端は、デスチオビオ
チンからビオチンへの変換に関与する酵素の遺伝情報を
担うＤＮＡの翻訳開始点から下流３７６０塩基対以下で
あることか組換えＤＮＡプラスミドの安定性には必須で
ある。またビオチン要求株Ｒ８７７のビオチン要求性の
回復の結果からビオチンオペロンの片側の末端は、デス
チオビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素の遺
伝情報を担うＤＮＡの翻訳開始点から下流３６０３塩基
対以上であることが好ましく、転写終結点を考慮すると
、特に好ましくは３６６４塩基対以上である。

（以下余白） 第１表 （以下余白） 四′　−々ドの　　−１− Ｏ二遺伝子欠失など全く起きず安定であった。

×：３回のｔｌｉ継ぎで遺伝子欠失をもつ組換えＤＮＡ
プラスミドが混在した。

一ζオ」Ｌ之Ｊし丸株　　　のロ′ ＋ニビオチン要求性の回復が見られた。

−：ビオヂン要求性の回復が見られなかった。

（７）ビオチンオペロンを含む組換えＤＮＡプラスミド
の造成 （５）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−
４［ｐＯＦＴ５３］および（６）で得られたエシェリヒ
ア・コリＢＲ−４［ｐＢＤＲ９１］をそれぞれＬ−培地
１００ｒｎｔ中で培養し、（３）と同様にしてクロラム
フェニコール処理を行った。菌体を実況後、アルカリ法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、
　Ｚ　、　１５１３−１５２３　、１９７９）により、
エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＯＦＴ５３］から組換
えＤＮＡプラスミドｐＯＦＴ５３を、エシェリヒア・コ
リＢＲ−４［ｐＢＤＲ’）１］から組換えＤＮＡプラス
ミドｐＢＤＲ９１を多量に得た。

組換えＤＮＡプラスミドｐＯＦＴ５３を２μｇとり、制
限エンドヌクレアーゼＫｐｎ　Ｉで完全に切断後、フェ
ノール処理で反応を止め、２倍容のエタノールを加えて
ＤＮＡを沈澱採取した。得られたＤＮＡ断片の末端に旧
ｎｄｌｌｌリンカ−をＴ４ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼの作用で連結させな。次に該反応液に制限エンドヌク
レアーゼ旧ｎｄｌｌ［とＮｃｏＩを添加し完全に切断後
、アガロース電気泳動（アガロース１％、７０Ｖ）にか
けエチジウムブロマイドで染色後、約２．２ＫｂのＤＮ
Ａ断片を含むゲル片を紫外線照射下で切りだし、このゲ
ル片を透析チューブに入れて再度電気泳動を行ないゲル
よりＤＮＡを抽出した。抽出後フェノール処理で残存す
るアガロースを除去した後、２倍容のエタノールを加え
てＤＮＡを沈澱採取した。別にｐＢＤＲ９１を２つの制
限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄ　ＩＩＩ　、　Ｈｅａｌで
切断しアガロース電気泳動後同様の方法でゲルから回収
して得られた約３．７ＫｂのＤＮＡ断片と、さらに制限
エンドヌクレアーゼｌ１ｉｎｄｌｌｌで完全に切断して
得られたｐＢＲ３２２ヘクターＤＮＡ断片を調整した。

上記３つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡファージ由
来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行なった。

次いで６５℃５分間の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した
。

得られた組換えＤＮＡをＢＲ変異株エシェリヒア・コリ
ＢＲ−４株に（５）と同様の方法で形質転換し、ビオチ
ン無添加の最少寒天培地上で生じたコロニー即ちエシェ
リヒア・コリＢＲ−４［ｐＫＨＮ３１］を釣菌し、その
性質を調べたところ、アンピシリン剛性、テトラサイク
リン感受性であった。

この形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−４［ｐＫＨＮ
３１］より前述と同様のアルカリ法で組換えＤＮＡプラ
スミドを抽出し、得られた組換えＤＮＡプラスミドｐＫ
ＩＩＮ３１をざらに前述のビオチンオペロンに含ま−れ
る遺伝子の夫々が欠損したＢＲ変異株に（５）と同様の
方法により形質転換した。結果を第２表に示した。

第２表 第２表から明らかなように組換えＤＮＡプラスミドＰ　
Ｋ　ＨＮ　３１が形質転換された全てのＢＲ変異株にビ
オヂン要求性の回復が見られたことより、ここで造成さ
れた組換えＤＮＡプラスミドｐＫＨＮ３１にはビオチン
オペロンが含有されていることがわかる。

（８）ビオチンオペロンを含む組換えＤＮＡプラスミド
のエシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２への形質転換光に
得られた組換えＤＮＡプラスミドｐＫＨＮ３１を（５）
と同様の方法でエシェリヒア・コリＤＲＫ３３２に形質
転換し、アンピシリン５０１１ｇ／ｍ！！を含むし一培
地寒天平板上で生じたコロニーを分離し、エシエ’）　
ヒア・コ’）　ＤＲＫ−３３２［ｐＫＩＩＮ３１］　（
？ａ　工？ｉＪＴ　Ｉ￥ｊ　？ｒ　’ｊ３５＆／）第　
　　　　　号）を取得した。

実施例２ （培地組成） グルコース　　　　　　　　　　　　５．０ｇ硫酸アン
モニウム　　　　　　　　　４．０ｇカザミノ酸（ビタ
ミンフリー）　　　　４．０　ｇ燐酸第二水素カリウム
　　　　　　　２．０ｇ燐酸第一水素カリウム　　　　
　　　１．０ｇ硫酸マグネシウム・７水和物　　　　０
．１ｇイオン交換水　　　　　　　　　　　１０００＋
ｎＬ上記組成の培地（ｐＨ７，０）に第３表に示す菌株
を接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後
、遠心分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄積きれ
たビオチン量をラクトバシリス・プランダラム（Ｌａｃ
ｔｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　、ＡＴＣＣ
８０１４）による微生物定量法により行った。その結果
を第３表に示した。

第３表 実施例３ （培地組成） グルコース　　　　　　　　　　　　５．０ｇ硫酸アン
モニウム　　　　　　　　　５．０ｇ酵母エキス　　　
　　　　　　　　　５．０ｇプロテオースペブトン（Ｄ
ｉｒｃｏ）　　　　５．０　ｇ塩化ナトリウム　　　　
　　　　　　５．０ｇ燐酸第二水素カリウム　　　　　
　　４．０ｇ硫酸マグネシウム・７水和物　　　　１．
０　ｇイオン交換水　　　　　　　　　　　１０００　
ｍぐ上記組成の培地（ｐｌ＋７．ｏ）に第４表に示す菌
株を接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を除去後、培養（々に生成蓄積
されたビオチン量を実施例２と同様の微生物定量法によ
り行った。その結果を第４表に示した。

第４表

【図面の簡単な説明】

第１図はビオチンオペロンを形成する５つの遺伝子領域
と、その中および近辺に存在する制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位を示す図面である。 第２図は実施例１の（６）に示す組換えＤＮＡブラスミ
ｌ”ｐＢＤＲ７２の不必要遺伝子領域を削除した組換え
ＤＮＡプラスミドの造成方法を示す図面である。 第３図は実施例１の（７）に示す組換えＤＮＡプラスミ
ドｐＫｔｌｆ１３１の造成方法を示す図面である。 特許出願人　　Ｆ貼１；会社資生堂 （第２１刃 よ 〜　↓εｃｏＲＩｔ７Ｆｍ’ｊ ↓８ａ１３１Ｑ分填イＣ−

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビオチン生産能を有するエシェリヒア・コリ（Ｅ
   ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）より得たビオチンオ
   ペロンで該ビオチンオペロンの片側の末端がデスチオビ
   オチンからビオチンへの変換に関与する酵素の遺伝情報
   を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の翻訳開始点から下
   流３７６０塩基対以下であるビオチンオペロンをベクタ
   ーＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡプラスミドを、ビオ
   チンによるフィードバック阻害が解除されたエシェリヒ
   ア・コリ変異株に含有せしめてなる微生物。
2. （２）ビオチン生産能を有するエシェリヒア・コリより
   得たビオチンオペロンで該ビオチンオペロンの片側の末
   端がデスチオビオチンからビオチンへの変換に関与する
   酵素の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の翻
   訳開始点から下流３７６０塩基対以下であるビオチンオ
   ペロンをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡプラ
   スミドを、ビオチンによるフィードバック阻害が解除さ
   れたエシェリヒア・コリ変異株に含有せしめてなる微生
   物を培養し、培地中に生成蓄積されたビオチンを採取す
   ることを特徴とするビオチンの製造法。
3. （３）ベクターがエシェリヒア・コリを宿主とするｐＢ
   Ｒ３２２プラスミドである特許請求の範囲第一項記載の
   微生物または特許請求の範囲第二項記載の製造法。