MXPA05002316A - Vesiculas de membrana externa bacteriana mejoradas. - Google Patents

Abstract

Los metodos existentes de preparacion de OMV meningocosicas involucran el uso de detergente durante la desintegracion de la membrana bacteriana. De acuerdo a la invencion, la desintegracion de las membranas es realizada sustancialmente en ausencia de detergente. Las OMVs resultantes que retienen los componentes inmunogenicos bacterianos importantes, particularmente (i) la proteina superficial NspA protectora, (ii) la proteina NMB2132 y (iii) la proteina NMB 1870. un proceso tipico involucra los siguientes pasos: (a) el tratamiento de las celulas bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b) la centrifugacion de la composicion del paso (a) para separar las vesiculas de la membrana externa de las celulas tratadas y de los desechos celulares, y la recoleccion del sobrenadante, (c) la realizacion de una centrifugacion de alta velocidad del sobrenadante del paso (b) y la recoleccion de las vesiculas de la membrana externa en un boton; (d) la re-dispersion del boton del paso (c) en un amortiguador; (e) la realizacion de una segunda centrifugacion a alta velocidad de acuerdo con el paso (c), la recoleccion de las vesiculas de la membrana externa en un boton; (f) la re-dispersion del boton del paso (e) en un medio acuoso.

Description

VESICULAS DE MEMBRANA EXTERNA BACTERIANA MEJORADAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención es en el campo de la preparación de vesículas para fines de inmunización.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Uno de los diversos procedimientos para inmunizar contra la infección por N. meningitidis es utilizar vesículas de membrana interna (OMVs, por sus siglas en inglés) . Una vacuna de OMV eficaz contra el serogrupo B ha sido producida por el Instituto Nacional Noruego de Salud Pública [por ejemplo, referencia 1] aunque esta vacuna es segura y previene la enfermedad MenB, su eficacia está limitada a la cepa utilizada para elaborar la vacuna. La vacuna "RIVM" está basada en vesículas que contienen seis diferentes subtipos PorA y han mostrado que es inmunogénica en niños en pruebas clínicas en fase II [2]. La referencia 3 describe una vacuna contra diferentes serotipos patógenos de meningococus del serogrupo B, basados en OMVs que conservan un complejo proteico de 65-kDa. La referencia 4 describe una vacuna que comprende OMVs provenientes de cepas meningocócicas manipuladas mediante ingeniería genética, con las OMVs que comprenden: al menos una proteína de membrana externa de la Clase 1 (OMP) pero no que comprende una OMP de la Clase 2/3. La referencia 5 describe OMVs que comprende OMPs que tienen mutaciones en sus rizos superficiales, y OMVs que comprenden derivados del lipopolisacárido meningocócico (LPS) . La referencia 6 describe composiciones que comprenden OMVs suplementadas con proteínas de enlace a la transferrina (por ejemplo TbpA y TbpB) y/o Cu, Zn-superóxido-dismutasa. La referencia 7 describe las composiciones que comprenden OMVs suplementadas por diversas proteínas. La referencia 8 describe preparaciones de vesículas membranales obtenidas a partir de N. eningitidis con un gen fur modificado. Así como N. meningitidis serogrupo B, las vesículas han sido preparadas para otras bacterias. La referencia 9 describe un proceso para preparar vacunas basadas en OMV para meningococus del serogrupo A. Las referencias 10 y 11 describen vesículas provenientes de N. gonorrhoeae. La referencia 12 describe preparaciones de vesículas provenientes de N. lactamica. Las vesículas han sido también preparadas a partir de Moraxella catarrhalis [13, 14], Shigella flexneri [15, 16], Pseudomonas aeruginosa [15, 16], Porphyromonas gingivalis [17], Treponema pallidum [18], Haemophilus influenzae [19 y 20] y Halicobacter pylori [21]. Un inconveniente con las preparaciones de vesículas bacterianas es que no están presentes antígenos protectores importantes . Para conservar los antígenos tales como NspA en las preparaciones de O V, la referencia 20 enseña que la expresión de nspA debe ser suprarregulada con la supresión concomitante de un gen por A y cps . Un objetivo de la presente invención es proporcionar preparaciones de vesículas adicionales y mejoradas, junto con los procesos para su fabricación. En particular, un objetivo de la invención es proporcionar vesículas que conservan componentes inmunogénicos bacterianos importantes de N. meningitidis.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos de la técnica anterior de la preparación de OMV meningocócica involucran el uso del detergente durante el rompimiento de la membrana bacteriana [por ejemplo, ver referencia 22, donde se utiliza un detergente desoxicolato] . La invención está basada en el descubrimiento sorprendente de que el rompimiento de la membrana sustancialmente en ausencia de detergente da como resultado una vez que conservan componentes inmunogénicos bacterianos importantes, particularmente (i) la proteina superficial NspA protectora, (ii) la proteina "287" y (iii) la proteína "741" . Por lo tanto, la invención proporciona un proceso para la fabricación de una preparación de vesícula de membrana externa proveniente de una bacteria, en donde la membrana bacteriana es desintegrada sustancialmente en ausencia de detergente. Se proporcionan también las preparaciones de OMV obtenibles mediante los procesos de la invención. Para obtener vesículas de NspA+ve, el proceso de la invención es mucho más simple que realizar manipulaciones genéticas múltiples como se describe en la referencia 20. El proceso de la invención involucrará típicamente los siguientes pasos básicos: (a) el tratamiento de las células bacterianas en ausencia sustancial del detergente; (b) la centrifugación de la composición del paso (a) para separar las vesículas de membrana externa de las células tratadas y los desechos celulares, y recolectar el sobrenadante, (c) realizar una centrifugación de alta velocidad del sobrenadante del paso (b) y recolectar las vesículas de membrana externa en un botón (d) re-dispersar el botón del paso (c) en un amortiguador; (e) realizar una segunda centrifugación a alta velocidad de acuerdo con el paso (c) , recolectar las vesículas de membrana externa en un botón; (f) re-dispersar el botón del paso (e) en un medio acuoso . El proceso puede también comprender los siguientes pasos: (g) realizar la esterilización por filtración a través de al menos dos filtros del tamaño de poro decreciente de la composición re-dispersada del paso (f) ; y (h) incluir opcionalmente la composición del paso (g) en una composición portadora y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable . El paso (a) da origen a vesículas de membrana externa bacteriana, y las vesículas comprenden en general componentes de la membrana externa sustancialmente en su forma nativa. Ventajosamente, los componentes membranales NspA, "287" y "741" son preservados. El paso (b) involucrará típicamente la centrifugación alrededor de 5000 - 10000 g por hasta 1 hora. Los pasos (c) y (e) involucrarán típicamente la centrifugación alrededor de 35000 - 100000 g por hasta 2 horas . Los pasos de centrifugación son preferentemente realizados entre 2°C y 8°C. Cualquier amortiguador adecuado puede ser utilizado con el paso (d) por ejemplo amortiguador de Tris, amortiguador de fosfato, amortiguador de histidina, etc. El paso (f) puede también involucrar el uso de un amortiguador, el cual puede ser el mismo amortiguador que se utiliza en el paso (d) , o puede simplemente involucrar el uso de agua (por ejemplo, agua por inyección) . i El paso (g) termina preferentemente con un filtro de tamaño de poro de aproximadamente 0.2 µa?. La invención también proporciona una composición de vesículas de N. meningitidis, caracterizada porgue las vesículas incluyen (i) la proteína NspA, (ii) la proteína 287" y (iii) la proteína "741" .

La bacteria La bacteria a partir de la cual se preparan la OMVs puede ser Gram-positiva, pero es preferentemente Gram-negativa. La bacteria puede ser del género Moraxella, Shigella, Pseudo onas, Treponema, Porphyromonas o Helicobacter (ver arriba para las especies preferidas) pero es preferentemente del género Neisseria. Las especies preferidas de Neisseria son N. meningitidis y N. gonorrhoeae . Dentro de N. meningitidis, cualquiera de los serogrupos A, C, W135 e Y pueden ser utilizados, pero se prefiere preparar vesículas del serogrupo B. Las cepas preferidas dentro del serogrupo B son MC58, 2996, H4476 y 394/98. Para reducir la actividad pirogénica, se prefiere que la bacteria deba tener bajos niveles de endotoxina (LPS) . Las bacterias mutantes adecuadas son conocidas, por ejemplo, la Neisseria mutante [23] y helicobacter imitante [24]. Los procesos para preparar las membranas externas agotadas en LPS provenientes de bacterias Gram-negativas se describen en la referencia 25. La bacteria puede ser una bacteria de tipo silvestre, o ésta puede ser una bacteria recombinante . Las bacterias recombinantes preferidas sobre-expresan (con relación a la cepa de tipo silvestre correspondiente) inmunógenos tales como NspA, 287, 741, TbpA, TbpB, superóxido-dismutasa [6], etc. La bacteria puede expresar más de una proteina de la membrana externa PorA de la clase I, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6 de los subtipos PorA: Pl, 7, 16; P1.5, 2; P1.19, 15; P1.5C, 10; Pl .12 , 13; y Pl .7h, 4 [por ejemplo referencias 26, 27]. El proceso de la invención involucrará típicamente un paso inicial de cultivo de las bacterias, seguido opcionalmente de un paso de concentración de las células cultivadas .

Desintegración de la membrana La desintegración de la membrana para la formación de las vesículas es realizada sustancialmente en ausencia de detergente . En particular, la desintegración de la membrana es realizada sustancialmente en ausencia de un detergente de desoxicolato, con otros detergentes que están opcionalmente presentes . La desintegración de la membrana puede ser realizada sustancialmente en ausencia de detergente iónico, con el detergente no iónico que está opcionalmente presente. Alternativamente, esto puede ser realizado sustancialmente en ausencia de detergente no iónico, con el detergente iónico que está opcionalmente presente. En algunas modalidades, no está presente ni detergente iónico ni detergente no iónico. Los pasos posteriores a la desintegración de la membrana y al formación de vesículas puede involucrar el uso de detergente. De este modo, un proceso en donde ocurren la desintegración de la membrana en ausencia de detergente, pero en el cual el detergente es posteriormente agregado a las vesículas preparadas, es abarcado dentro de la invención. El término "sustancialmente en ausencia" significa que el detergente en cuestión está presente en una concentración no mayor de 0.05% (por ejemplo, < 0.025%, < 0.015%, < 0.010%, < 0.005%, < 0.002%, < 0.001% o incluso 0%) durante la desintegración de la membrana. De este modo, los procesos donde están presentes cantidades en trazas de detergente durante la preparación de las vesículas, no son excluidos .

La desintegración de las membranas en ausencia de detergente puede ser realizada sobre bacterias intactas utilizando técnicas físicas, por ejemplo, sonicación, homogenización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, molienda, prensa de French, mezclado, etc.

Las vesículas Los procesos de la invención producen vesículas de membrana externa. Las OMVs son preparadas a partir de la membrana externa de las bacterias cultivadas . Estas pueden ser obtenidas a partir de bacterias desarrolladas en caldo o en cultivo en medio sólido, preferentemente mediante la separación de las células bacterianas del medio del cultivo (por ejemplo, mediante filtración o mediante una centrifugación a baja velocidad para concentrar las células), la lisis de las células (sin detergente) , y la separación de una fracción de la membrana externa a partir de las moléculas citoplásmicas (por ejemplo mediante filtración, mediante precipitación diferencial o agregación de las membranas externas y/o OMVs, mediante métodos de separación por afinidad utilizando ligandos que reconocen específicamente las moléculas de la membrana externa, o mediante una centrifugación a alta velocidad que concentra las membranas externas y/o OMVs) . Las OMVs pueden ser distinguidas de las microvesículas (MVs [28]) y las wOMVs nativas" (¾NOMVs" [66]) , que son vesículas membranales de origen natural que se forman espontáneamente durante el desarrollo bacteriano y son liberadas hacia el medio de cultivo. Las MVs pueden ser obtenidas mediante el cultivo de Neisseria en el medio de cultivo en caldo, separando las células completas del medio de cultivo con caldo (por ejemplo mediante filtración o mediante centrifugación de baja velocidad para concentrar únicamente las células y no las ampollas más pequeñas) y luego recolectar la MVs que están presentes en el medio agotado en células (por ejemplo mediante filtración, por precipitación diferencial o agregación de MVs, mediante centrifugación a alta velocidad para concentrar las MVs) . Las cepas para el uso en la producción de MVs pueden ser en general seleccionadas con base en la cantidad de MVs producidas en el cultivo. Las referencias 29 y 30 describen Neisseria con alta producción de MV.

Componentes inmunogénicos bacterianos retenidos La ausencia sustancial de detergente en los procesos de la invención da como resultado preparaciones de vesículas que conservan los componentes inmunogénicos de la superficie bacteriana los cuales, utilizando los métodos basados en detergentes de la técnica anterior, podrían de otro modo ser perdidos o disminuidos. El N. meningitidls, tres inmunógenos que son ventajosamente retenidos utilizando la invención incluyen, pero no están limitados a: (1) NspA; (2) la proteína "741"; y (3) la proteína "287". NspA (proteína A superficial de Neisserial) se describe en las referencias 31 a 37 y como SEQ ID Nos.: 4008-4033 de la referencia 38. Esta es una vacuna candidata para la prevención de la enfermedad meningocócica. Esta está altamente conservada entre cepas. A pesar de la esperanza inicial, no obstante, se cree ahora que NspA no será un antígeno protector adecuado por sí solo, y necesitará ser administrado con antígenos adicionales [por ejemplo, referencia 36, y ejemplo 11 de referencia 38]. Se ha encontrado que NspA es eliminada por los métodos de preparación basados en detergente, la técnica anterior, de acuerdo a la presente invención, no obstante, NspA puede ser retenido en vesículas. Tales vesículas de NspA+ve son ventajosas debido a que es preparada una combinación de dos potentes inmunógenos (por ejemplo vesículas + NspA) en un proceso simple, con cada inmunógeno que aumenta la eficacia del otro . La proteína "741" es descrita en "NMB1870" en la referencia 39 (GenBank: AAF42204, GI : 7227128). Esta es también descrita en las referencias 40 y 41. Esta promueve anticuerpos bactericidas fuertes. Se ha encontrado que la proteína "741" es parcialmente removida en las vesículas preparadas mediante los métodos basados en detergente, de la técnica anterior. De acuerdo a la presente invención, no obstante, "741" puede ser retenida en las vesículas. Tales vesículas 741+ve son ventajosas debido a que es preparada una combinación de dos potentes inmunógenos conocidos (por ejemplo, vesículas + 741) en un proceso simple, con cada inmunogeno que aumenta la eficacia del otro. La proteína "287" es descrita como "NMB2132" en la referencia 39 (GenBank: AAF42440, GI : 7227388). Esta se describe también en las referencias 40 y 42. Esta promueve fuertes anticuerpos bactericidas. La proteína "287" típicamente no está presente en las vesículas preparadas mediante los métodos basados en detergente de la técnica anterior y, para superar su retiro, se ha propuesto previamente que las preparaciones de OMV pueden ser suplementadas con 287 [43]. De acuerdo a la presente invención, no obstante, "287" puede ser retenido en las vesículas. Tales vesículas 287*ve son ventajosas debido a que se prepara una combinación de dos inmunógenos potentes conocidos (por e emplo, vesículas + 287) en un proceso simple, con cada inmunogeno que aumenta la eficacia del otro. La NspA preferida (a) tiene al menos a% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos (GI : 1518522 y/o (b) comprende un fragmento de al menos x aminoácidos de la secuencia de aminoácidos GI : 1518522. La ¾741" preferida (a) tiene al menos b% de entidad secuencial a la secuencia de aminoácidos GI: 7227128 y/o (b) comprende un fragmento de al menos x aminoácidos de la secuencia de aminoácidos GI : 7227128. La "287" preferida (a) tiene al menos c% de identidad secuencial a la secuencia de aminoácidos GI . 7227388 y/o (b) comprende un fragmento de al menos x aminoácidos de la secuencia de aminoácidos GI : 7227388. Los valores de a, b y c son independientes uno del otro, pero cada valor de al menos de 70 (por ejemplo, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 ó 100). Los valores de x, y z son independientes uno del otro, pero cada valor es al menos 8 (por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, etc) . Los fragmentos comprenden preferentemente epitopos . Las proteínas NspA, 287 y 741 preferidas conservan sustancialmente la habilidad de las proteínas de tipo silvestre (como son encontradas en bacterias intactas) para promover anticuerpos bactericidas en pacientes.

Composiciones farmacéuticas inmunogénicas proceso de la presente invención proporciona una preparación de vesículas . Para la administración de un paciente, las vesículas son preferentemente formuladas como composiciones inmunogénicas , y más preferentemente como composiciones adecuadas para el uso como una vacuna en humanos (por ejemplo, niños o adultos) . Las vacunas de la invención pueden ser ya sea profilácticas (por ejemplo, para prevenir la infección) o terapéuticas (por ejemplo, para tratar la enfermedad después de la infección) , pero serán típicamente profilácticas. La composición de la invención es preferentemente estéril . La composición de la invención es preferentemente libre de pirógenos. La composición de la invención tiene en general un pH de entre 6.0 y 7.0, más preferentemente entre 6.3 y 6.9, por ejemplo, 6.6 ± 0.2. La composición es preferentemente amortiguada a este pH. Otros componentes adecuados para la administración a humanos son descritos en la referencia 44. La composición comprenderá en general un adyuvante.

Los adyuvantes preferidos para aumentar la efectividad de la composición incluyen, pero no están limitados: (A) F59 (5% escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de span 85, formulados en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador) [ver Capitulo 10 de la referencia 45; ver también referencia 46]; (B) micropartículas (por ejemplo, una partícula de ~ 100 nm a ~ 150 µ?? de diámetro, más preferentemente de ~ 200 nm a ~ 30 µ? de diámetro, y lo más preferentemente de ~ 500 nm a ~ 10 µ? de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (a-hidroxiácido) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con el poli (láctido-co-glicólido) que es el preferido, que está opcionalmente cargado en la superficie (por ejemplo, mediante la adición de un detergente catiónico, aniónico o no iónico tal como SDS (negativo) o CTAB (positivo) [por ejemplo, referencias 47 y 48]) ; (C) liposomas [ver Capítulos 13 y 14 de la referencia 45]; (D) ISCOMs [ver Capítulo 23 de la referencia 45], que pueden estar desprovistos de detergente adicional [49]; (E) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero en bloque plurónic L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en torbellino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande [ver Capítulo 12 de la referencia 45]; (F) sistema adyuvante Ribi^ (RAS) , (Ribi Inmunochen) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, uno ó más componentes de la pared celular bacteriana provenientes del grupo que consiste de monofosforilipido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TD ) , y esqueleto de la pared celular (CWS) , preferentemente MPL + CWS (Detox") ; (G) adyuvantes de saponina, tales como QuilA o QS21 [ver Capítulo 22 de la referencia 45], también conocido como Stimulon™1, (H) quitosano (por ejemplo, 50]; (I) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) ; (J) citocinas, tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferon-?) , factor de estimulación de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral, etc. [ver Capítulos 27 y 28 de la referencia 45]; (K) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [51]; (L) monofosforil-lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) [por ejemplo, capítulo 21 de la referencia 45]; (M) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [52]; (N) oligonucleótidos que comprenden porciones CpG, [53], por ejemplo, que contienen al menos un dinucleótido CG, con 5-metilcitosina que es opcionalmente utilizada en lugar de la citosina; (0) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [54]; (P) un surfactante de éster de polioxietilensorbitan en combinación con un octoxinol [55] o un surfactante de éster o éter alqu lico de polioxie ileno en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como octoxinol [56] ; (Q) un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina [57]; (R) un inmunoestimulador y una partícula de sal metálica [58]; (S) una saponina y una emulsión aceite en agua [59]; (T) una enterotoxina lábil al calor de E. coli ("LT" ) , o mutantes destoxificados de la misma, tales como los mutantes K63 ó R72 [por ejemplo, Capitulo 5 de la referencia 60]; (U) toxina del cólera ("CT")/ o los mutantes destoxificados de la misma [por ejemplo, Capítulo 5 de la referencia 60]; (V) ARN de doble hebra ; ( ) sales de aluminio, tales como hidróxidos de aluminio (incluyendo oxihidróxidos) , fosfatos de aluminio (incluyendo hidroxifosfatos) , sulfato de aluminio, etc. [Capítulo 8 y 9 en la referencia 61]; (X) miméticos de monofosforil-lípido, tales como derivados de aminoalquil-glucosamimida-fosfato, por ejemplo RC-529 [62]; (Y) polifosfaceno (PCPP) ; o (Z) un bioadhesivo [63] tal como microesferas de ácido hialurónico esterificado [64] o un mucroadhesivo seleccionado del grupo que consiste de derivados reticulados de poli (ácido acrílico) , alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa . Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para aumentar la efectividad de la composición [por ejemplo, ver Capítulo 7 de la referencia 45] pueden ser también utilizados. Las sales de aluminio (especialmente fosfatos y/o hidróxidos de aluminio) son adyuvantes preferidos para la administración parenteral . Las toxinas mutantes son adyuvantes mucosales preferidos . Las vesículas en las composiciones de la invención estarán presentes en "cantidades inmunológicamente efectivas" por ejemplo la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, que es efectiva para el tratamiento o prevención de la enfermedad. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va ser tratado, la edad, el grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico que trata de la situación médica y/o los factores relevantes . Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias. El tratamiento de dosis puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La vacuna puede ser administrada en conjunto con otros agentes inmunorreguladores .

Típicamente, las composiciones de la invención son preparadas como inyectables. La distribución directa de las composiciones será en general parenteral (por ejemplo, mediante inyección, ya sea subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente o distribuida al espacio intersticial de un tejido) o mucosal (por ejemplo, oral o intransal) [65, 66]. Las composiciones pueden también ser administradas dentro de una lesión. Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales, en particular, pueden ser tratados sujetos humanos. Las vacunas son particularmente útiles para vacunar a niños y adolescentes . La composición puede comprender vesículas provenientes de más de un serosubtipo de N. meningitidis [28].

Similarmente, la composición puede comprender más de un tipo de vesículas, por e emplo MVs y OMVs. Así como vesículas, la composición de la invención puede comprender antígenos adicionales. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos adicionales . antígenos de Helicobacter pylori tales como CagA [67 a 70], VacA [71, 72], NAP [73, 74, 75], HopX [por ejemplo 76], HopY [por ejemplo 76] y/o ureasa. un antígeno sacárido proveniente de N. meningitidis serogrupo A, C W135 y/o Y, tales como aquellos descritos en la ref. 77, del serogrupo C [ver también referencia 78] o el oligosacárido de la ref. 79. un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 80, 81, 82] . un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 83, 84] . - un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo 84, 85] . un antígeno de Bordetella pertusís, tal como holotoxina de pertusis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FEA) de B. pertusís, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo refs. 86 y 87] . un antígeno de la difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo Capítulo 3 de la ref. 88] por ejemplo el mutante CR a97 [por ejemplo 89] . un antígeno del tétanos, tal como el toxoide tetánico [por ejemplo Capítulo 4 de la ref. 108] . un antígeno sacárido de Hae ophilus influenzae B [por ejemplo 78] . un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo 90] . - un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo 91, 92, 93, 94] . un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo refs. 95 a 101] . un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo 102] . - un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo 103] . uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo 104, 105] tales como OPV o preferentemente IPV. uno o varios antígenos de la rabia [por ejemplo 106] tales como el virus inactivado liofilizado [por ejemplo 107, RabAvert™] . antígenos del sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo Capítulos 9, 10 y 11 de la ref . 108] . uno varios antígenos de la influenza [por ejemplo Capítulo 19 de la ref. 108], tal como las proteínas superficiales de hemaglutinina y/o neuraminidas . un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo 109] . un antígeno de la proteína de Streptococcus agalactiae (estreptococo grupo B) [por ejemplo 110, 111] . - un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo grupo B) . un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo grupo A) [por ejemplo 111, 112, 113] . un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo 114] . - un antígeno de Bacillus anthracis [por ejemplo 115, 116, 117] . un antígeno de un virus en la familia flaviridae (género flavivirus) , tales como el virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis Japonesa, cuatro serotipos de virus del Dengue, virus de la encefalitis llevada por las garrapatas, virus del Nilo Occidental . un antígeno de pestivirus, tal como proveniente del virus de la fiebre porcina clásica, virus de la diarrea viral bovina, y/o virus de la enfermedad de la frontera. - un antígeno de parvovirus por ejemplo de parvovirus B19. una proteína de prión (por ejemplo la proteína de prxón CJD) una proteína amiloide, tal como un péptido beta [118] . un antígeno del cáncer, tales como aquellos listados en la Tabla 1 de la ref. 119 o en las Tablas 3 y 4 de la ref. 120. La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales : Los antígenos proteicos tóxicos pueden ser destoxificados donde sea necesario (por ejemplo, la destoxificación de la toxina pertusis por medios químicos y/o genéticos [87]) . Donde se incluye un antígeno de la difteria en la composición, se prefiere también incluir el antígeno del tétanos y antígeno de pertusis. Similármente, donde se incluye un antígeno del tétanos, se prefiere también incluir antígenos de la difteria y de pertusis. Similarmente, donde es incluido un antígeno de pertusis, se prefiere también incluir antígenos de la difteria y del tétanos. Son de este modo preferidas las combinaciones de DTP. Los antígenos sacáridos están preferentemente en la forma de conjugados. Las proteínas portadoras para los conjugados incluyen la proteína de la membrana exterior de N. meningitidis [121], péptidos sintéticos [122, 123], proteínas de choque por calor [124, 125], proteínas de pertusis [12S, 127], proteína D de H. trifleunzae [128], citocinas [129], linfocinas [129], hormonas [129], factores de crecimiento [129], toxina A o B de C. difficile [130], proteínas de captación de hierro [131], etc. Una proteína portadora preferida es el toxoide de la difteria CRM197 [132]. Pueden ser también agregados antígenos de N. meningitidis serogrupo B a las composiciones de OMV. En particular, un antígeno proteico tal como se describe en las referencias 133 a 139, puede ser agregado. Los antígenos en la composición estarán típicamente presentes en una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno.

En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para promover una respuesta inmune contra ese antígeno .

Como una alternativa al uso de los antigenos proteicos en la composición de la invención, puede ser utilizado el ácido nucleico que codifica para el antigeno. Los componentes proteicos de las composiciones de la invención pueden ser de este modo reemplazados por el ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica para la proteína.

Métodos de tratamiento de los pacientes La invención proporciona vesículas de la invención para el uso como medicamentos . La invención también proporciona un método para promover una respuesta inmune a un paciente, que comprende administrarle a un paciente, una composición de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora contra la enfermedad meningocócica, y puede comprender una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular. El paciente es preferentemente un niño. El método puede promover una respuesta reforzadora, en un paciente que ha sido ya retado contra N. meningitidis. Los regímenes de aprestamiento/refuerzo subcutáneo e intranasales para O Vs se describen en la referencia 65. La invención también proporciona el uso de una vesícula de la invención en la fabricación de un medicamento para promover una respuesta inmune en un paciente. El medicamento es preferentemente una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) . El medicamento es preferentemente para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria. (por ejemplo, meningitis, septicemia, gonorrea, etc.). Los métodos y usos de la invención pueden involucrar la administración de vesículas de más de un serosubtipo de N. meningitidis [por ejemplo, referencia 28].

Formulación de OMV La invención proporciona una composición que comprende vesículas de membrana exterior de meningococos, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un amortiguador de histidina, y cloruro de sodio, en donde: (a) la concentración de cloruro de sodio es mayor de 7.5 mg/ml; y/o (b) la concentración de los OMVs es menor de 100 µg/ml . La concentración de cloruro de sodio es preferentemente mayor de 8 mg/ml, y es más preferentemente de aproximadamente 9 mg/ml. La concentración de OMVs es preferentemente menor de 75 mg/ml por ejemplo aproximadamente 50 mg/ml. El amortiguador de histidina está preferentemente entre H 6.3 y pH 6.7, por ej eraplo pH 6.5 El adyuvante puede ser utilizado aproximadamente a 3.3 mg/ml (expresado como concentración de Al+3) .

Definiciones Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando están alineados, el porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Este alineamiento de la homología porcentual o la identidad secuencial pueden ser determinados utilizando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 140. Un alineamiento preferido es determinado por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Wateman utilizando una búsqueda de espacio vacio afín, con una penalidad por espacio vacío abierto de 12 y una penalidad por extensión de espacio vacío de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith- aterman es bien conocido y es descrito en la referencia 141. El término "que comprende" significa "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico X significa, por ejemplo, X ± 10%. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando es necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1 y 2 muestran la presencia/ausencia de (1) la proteína "287" y (2) la proteína "741" en bacterias ("TOT") y vesículas de la membrana exterior ("O V") preparadas a partir de las cepas MC58, H4476, y 394/98 de N. meningitidis. La flecha muestra la posición de "287" en la figura 1 y "741" en la figura 2. La figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de las entradas GI : 7227128, GI : 7227388 y GI : 1518522 de GenBank del 29 de Agosto del 2002.

MODALIDADES PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Preparación de OMV Fueron preparadas OMVs ya sea mediante los métodos "Noruegos" de la técnica anterior (cepas H4476 y 394/98) o mediante el siguiente proceso (cepa MC58) : las bacterias provenientes de 2-5 placas fueron cosechadas en 10 mi de amortiguador de Tris HCl de 10 mM (pH 8.0) y muertas por calor a 56°C por 45 minutos. Las muestras fueron luego sonicadas sobre hielo (ciclo de trabajo 50 por 10 minutos con la punta a 6/7) para desintegrar las membranas . Los desechos celulares fueron removidos mediante centrifugación a 5000 g por 30 minutos a 4°C, 10000 g por 10 minutos, - El sobrenadante fue recentrifugado a 50000 por 75 minutos a 4°C, El botón fue resuspendido en 7 mi de sarcocinato de N-lauroilo 2% (Sarkosyl) en Tris-HCl 10 mM (pH 8.0) por 20 minutos a temperatura ambiente para solubilizar las membranas citoplásmicas , La muestra fue centrifugada a 10000 g por 10 minutos para eliminar los particulados y el sobrenadante fue centrifugado a 75000 g por 75 minutos. El botón fue resuspendido en Tris-HCl 10 mM (pH 8.0) o agua destilada. Las bacterias y las preparaciones de OMV fueron probadas por transferencia de Western para la presencia de NspA, 287 y 741 (figuras 1 y 2) y los resultados se resumen en la siguiente tabla: NspA 287 741 Cepa Detergente Bacterias OMV Bacterias OMV Bacterias OMV MC58 - +++ -H-+ +++ +++ +++ +++ H44/76 + +++ .[20] +++ — +++ + 394/98 + -H-+ n.d. +++ ++ +++ + En contraste, a los métodos basados en el detergente de la técnica anterior, por lo tanto, la ausencia del detergente da como resultado que el NspA sea retenido en las OMVs y evita la pérdida de 287 y 741.

Formulación de OMVs preparadas a partir de las cepas New Zealand de MenB Se prepararon OMVs a partir del serogrupo B cepa 394/98 de N. meningitidis. Estas fueron formuladas de dos diferentes maneras, con los componentes que tenían las siguientes concentraciones: Amortiguador de histidina, pH 6.5 - 5 MM Cloruro de sodio - 9 mg ml La formulación "B" se encontró que es inmunológicamente superior a la formulación "A". La formulación "B" difiere dé aquella descrita en la referencia 142 por tener la mitad de la concentración de OMV, una concentración mayor de cloruro de sodio y un pH ligeramente diferente . Se entenderá que la invención ha sido descrita por medio de ejemplos únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que estén dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la fabricación de una preparación de vesículas de membrana externa de una bacteria, caracterizado el proceso porque la membrana bacteriana es desintegrada sustancialmente en ausencia de detergente de desoxicolato .

2. El proceso de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque la membrana bacteriana es desintegrada sustancialmente en ausencia de algún detergente.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizado porque comprende los siguientes pasos básicos: (a) el tratamiento de las células bacterianas en ausencia sustancial de detergente; (b) la centrifugación de la composición del paso (a) para separar las vesículas de membrana externa de las células tratadas y de los desechos celulares, y la recolección del sobrenadante; (c) la realización de una centrifugación a alta velocidad del sobrenadante del paso (b) y la recolección de las vesículas de membrana externa en un botón; (d) la re-dispersión del botón del paso (c) en un amortiguador; (e) la realización de una segunda centrifugación a alta velocidad de acuerdo con el paso (c) , la recolección de las vesículas de membrana externa en un botón; (f) la re-dispersión del botón del paso (e) en un medio acuoso.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además los siguientes pasos: (g) la realización de la esterilización por filtración a través de al menos dos filtros de tamaño de poro decreciente de la composición re-dispersada del paso (f) ; y (h) la inclusión opcional de la composición del paso (g) en una composición portadora y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables .

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 3 ó la reivindicación 4, caracterizado porgue el paso (b) comprende la centrifugación alrededor de 5000 -10000 g por hasta 1 hora, y los pasos (c) y (e) comprenden la centrifugación alrededor de 35000 - 100000 g por hasta 2 horas .

6. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la desintegración de la membrana es mediante sonicación, homogenización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, molienda, prensa de Frenen, mezclado, o cualquier otra técnica física.

7. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el amortiguador utilizado en el paso (d) y/o en el paso (f) es un amortiguador de Tris, un amortiguador de fosfato, o amortiguador de histidina.

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el paso (g) termina con un filtro de tamaño de poro de aproximadamente 0.2 µp?.

9. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la bacteria de la cual se preparan las OMVs es de los géneros Moraxella, Shigella, Pseudomonas, Treponema, Porphyromonas, Helicobacter o Neisseria.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la bacteria es N. meningitidis o JV. gonorrhoeae.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque N. meningitidis es del serogrupo B.

12. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado además porque comprende el paso de formular una cantidad inmunológicamente efectiva de las OMVs como una composición inmunogénica .

13. Una composición de OMV, caracterizada porque es obtenible mediante el proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

14. Una composición de vesículas de JTeísseria meningitidis, caracterizada porque las vesículas incluyen (i) la proteína NspA, (ii) la proteína "287" y (iii) la proteína "741"

15. La composición de conformidad con la reivindicación 13 ó la reivindicación 14, caracterizada porque la composición es estéril y/o libre de pirógenos y/o amortiguada a un pH de entre 6.0 y 7.0.

16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 caracterizada porque se usa como un medicamento .

17. Un método para elevar una respuesta inmune en un paciente, caracterizado porque comprende administrarle a un paciente una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

18. El uso de una vesícula de membrana externa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la fabricación de un medicamento para elevar una respuesta inmune en un paciente.