JP2010150287A

JP2010150287A - 改良された細菌外膜小胞

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Publication number: JP2010150287A
Application number: JP2010067009A
Authority: JP
Inventors: Mariagrazia Pizza; ピッツァマリアグラーツィア; Davide Serruto; セルートダビデ; Rini Rappuoli; ラップオーリリニ
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2010-07-08
Also published as: US20150258188A1; BR0314094A; CY1107737T1; EP2258389A1; DK1864679T3; FR13C0046I2; JP2013139471A; JP2006503822A; EP2258390A1; RU2005108994A; WO2004019977A3; CA2497165C; US20060166344A1; EP2258389B1; SI1864679T1; LU92239I2; DE60314756D1; BRPI0314094A8; CN1688334A; SI2258389T1

Abstract

【課題】さらに改良された小胞調製物を、その製造プロセスとともに提供すること。
【解決手段】代表的なプロセスは、（ａ）界面活性剤の実質的な非存在下で細菌細胞を処理する工程；（ｂ）工程（ａ）からの組成物を遠心分離して、処理した細胞および細胞破片から外膜小胞を分離し、そして上清を収集する工程；（ｃ）工程（ｂ）からの上清の高速遠心分離を実施し、そしてその外膜小胞をペレット中に収集する工程；（ｄ）工程（ｃ）からのペレットを緩衝液中に再分散させる工程；（ｅ）工程（ｃ）に従って第２回目の高速遠心分離を実施し、その外膜小胞をペレット中に収集する工程；（ｆ）工程（ｅ）からのペレットを水性媒体中に再分散させる工程；を包含する。
【選択図】図２

Description

本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

（発明の分野）
本発明は、免疫目的のための小胞調製物の分野にある。

（発明の背景）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して免疫するための種々のアプローチのうちの１つは、外膜小胞（ＯＭＶ）を使用することである。血清群Ｂに対する有効なＯＭＶワクチンが、ノルウェーの国立公共衛生研究所によって生成された［例えば、参考文献１を参照のこと］が、このワクチンは、安全でありそしてＭｅｎＢ疾患を予防するが、その効力は、このワクチンを生成するために使用した株に限定される。

「ＲＩＶＭ」ワクチンは、６つの異なるＰｏｒＡサブタイプを含む小胞に基づき、フェーズＩＩ臨床試験において小児において免疫原性であることが示された［２］。

参考文献３は、６５ｋＤａのタンパク質複合体を保持するＯＭＶに基づく血清群Ｂ髄膜炎菌の種々の病理学的血清型に対するワクチンを開示する。参考文献４は、遺伝子操作した髄膜炎菌由来のＯＭＶを含むワクチンを開示し、そのＯＭＶは、少なくとも１種のクラスＩ外膜タンパク質（ＯＭＰ）を含むが、クラス２／３ＯＭＰは含まない。参考文献５は、その表面ループに変異を有するＯＭＰと、髄膜炎菌リポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体を含むＯＭＰとを含む、ＯＭＶを開示する。

参考文献６は、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）および／またはＣｕ，Ｚｂ−スーパーオキシドジスムターゼを補充した、ＯＭＶを含む組成物を開示する。参考文献７は、種々のタンパク質を補充されたＯＭＶを含む組成物を開示する。参考文献８は、改変型ｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得られる膜小胞の調製物を開示する。

血清群ＢＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓと同様に、他の細菌についての小胞が調製されている。参考文献９は、血清群Ａ髄膜炎菌についてのＯＭＶベースのワクチンを調製するためのプロセスを開示する。参考文献１０および１１は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの小胞を開示する。参考文献１２は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａからの小胞調製物を開示する。小胞はまた、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ［１３、１４］、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ［１５、１６］、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ［１５、１６］、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ「１７］、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ［１８］、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ［１９および２０］、ならびにＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ［２１］からも調製されている。
細菌小胞調製物に関する１つの欠点は、重要な防御抗原が存在しないことである。ＯＭＶ調製物中にＮｓｐＡのような抗原を保持するために、参考文献２０（特許文献１）は、ｎｓｐＡ発現が、ｐｏｒＡおよびｃｐｓの同時ノックアウトによってアップレギュレートされるべきであることを教示する。さらに改良された小胞調製物を、その製造プロセスとともに提供することが、本発明の目的である。特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の重要な細菌免疫原性成分を保持する小胞を提供することが、本発明の目的である。

国際公開第０２／０９７４６号パンフレット

（項目１）
細菌から外膜小胞調製物を製造するためのプロセスであって、該細菌膜は、デオキシコール酸界面活性剤の非存在下で実質的に破壊される、プロセス。
（項目２）
項目１に記載のプロセスであって、前記細菌膜は、あらゆる界面活性剤の非存在下で実質的に破壊される、プロセス。
（項目３）
項目１または２に記載のプロセスであって、該プロセスは、以下の基本工程：
（ａ）界面活性剤の実質的な非存在下で細菌細胞を処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの組成物を遠心分離して、処理した細胞および細胞破片から外膜小胞を分離し、そして上清を収集する工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの上清の高速遠心分離を実施し、そして該外膜小胞をペレット中に収集する工程；
（ｄ）工程（ｃ）からのペレットを緩衝液中に再分散させる工程；
（ｅ）工程（ｃ）に従って第２回目の高速遠心分離を実施し、該外膜小胞をペレット中に収集する工程；
（ｆ）工程（ｅ）からのペレットを水性媒体中に再分散させる工程；
を包含する、プロセス。
（項目４）
項目３に記載のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ｇ）工程（ｆ）からの再分散された組成物を、漸減する孔径の少なくとも２つのフィルターを通して滅菌濾過する工程；および
（ｈ）必要に応じて、工程（ｇ）からの組成物を、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバント組成物中に含める工程；
をさらに包含する、プロセス。
（項目５）
項目３または項目４に記載のプロセスであって、
工程（ｂ）は、約５０００ｇ〜１００００ｇにて１時間までの遠心分離を含み、
工程（ｃ）および（ｅ）は、約３５０００ｇ〜１０００００ｇにて２時間までの遠心分離を含む、
プロセス。
（項目６）
項目１〜５のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、膜破壊が、超音波処理、ホモジナイゼーション、マイクロフルイダイゼーション、キャビテーション、浸透圧性ショック、粉砕、フレンチプレス、混合、または他の任意の物理的技術による、プロセス。
（項目７）
項目１〜６のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、工程（ｄ）および／または工程（ｆ）において使用される緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液である、プロセス。
（項目８）
項目５〜７のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、工程（ｇ）は、孔径約０．２μｍのフィルターを用いて終了する、プロセス。
（項目９）
項目１〜８のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、外膜小胞が調製される細菌は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ属に由来する、プロセス。
（項目１０）
項目９に記載のプロセスであって、前記細菌は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである、プロセス。
（項目１１）
項目１０に記載のプロセスであって、前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、血清群Ｂに由来する、プロセス。
（項目１２）
項目１〜１１のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、該プロセスは、
免疫学的に有効な量の前記外膜小胞を、免疫原性組成物として処方する工程
をさらに包含する、プロセス。
（項目１３）
項目１〜１２のうちのいずれか１項に記載のプロセスによって入手可能な、外膜小胞組成物。
（項目１４）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ小胞組成物であって、該小胞は、（ｉ）ＮｓｐＡタンパク質、（ｉｉ）「２８７」タンパク質、および（ｉｉｉ）「７４１」タンパク質を含むことを特徴とする、組成物。
（項目１５）
項目１３または項目１４に記載の組成物であって、前記組成物は、滅菌されており、かつ／または発熱物質を含まず、かつ／またはｐＨ６．０とｐＨ７．０との間のｐＨにて緩衝化されている、組成物。
（項目１６）
医薬として使用するための、項目１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
（項目１７）
患者において免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、
患者に、項目１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
（項目１８）
患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、項目１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の外膜小胞の使用。
（発明の開示）
髄膜炎菌性ＯＭＶを調製する先行技術の方法は、細菌膜の破壊の間に界面活性剤を使用すること［例えば、デオキシコール酸界面活性剤が使用される、参考文献２２を参照のこと］を包含する。本発明は、界面活性剤の実質的に非存在下で膜を破壊すると、重要な細菌免疫原性成分（特に、（ｉ）防御ＮｓｐＡ表面タンパク質、（ｉｉ）「２８７」タンパク質、および（ｉｉｉ）「７４１」タンパク質）を保持するＯＭＶを生じるという、驚くべき発見に基づく。

従って、本発明は、細菌から外膜小胞調製物を製造するためのプロセスを提供し、該細菌膜は、界面活性剤の非存在下で実質的に破壊される。本発明のプロセスによって入手可能なＯＭＶ調製物もまた、提供される。

ＮｓｐＡ^＋小胞を得るために、本発明のプロセスは、参考文献２０に記載されるような複数の遺伝子操作を実施するよりも、かなり単純である。

本発明のプロセスは、代表的には、以下の基本工程：
（ａ）界面活性剤の実質的な非存在下で細菌細胞を処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの組成物を遠心分離して、処理した細胞および細胞破片から外膜小胞を分離し、そして上清を収集する工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの上清の高速遠心分離を実施し、そして上記外膜小胞をペレット中に収集する工程；
（ｄ）工程（ｃ）からのペレットを緩衝液中に再分散させる工程；
（ｅ）工程（ｃ）に従って第２回目の高速遠心分離を実施し、上記外膜小胞をペレット中に収集する工程；
（ｆ）工程（ｅ）からのペレットを水性媒体中に再分散させる工程；
を包含する。

上記プロセスはまた、以下の工程：
（ｇ）工程（ｆ）からの再分散され組成物を、漸減する孔径の少なくとも２つのフィルターを通して滅菌濾過する工程；および
（ｈ）必要に応じて、工程（ｇ）からの組成物を、薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバント組成物中に含める工程；
をさらに包含する。

工程（ａ）は、上記細菌外膜の小胞を生じ、この小胞は、一般的には、他の外膜成分を、実質的にはその天然形態で含む。有利なことに、膜成分であるＮｓｐＡ、「２８７」および「７４１」は、保存される。

工程（ｂ）は、代表的には、約５０００ｇ〜１００００ｇにて１時間までの遠心分離を含む。

工程（ｃ）および（ｅ）は、代表的には、約３５０００ｇ〜１０００００ｇにて２時間までの遠心分離を含む。

遠心分離工程は、好ましくは、２℃と８℃との間で実施される。

適切な任意の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液など）が、工程（ｄ）において使用され得る。工程（ｆ）もまた、緩衝液の使用を包含し得、その緩衝液は、工程（ｄ）において使用されるのと同じ緩衝液であってもよい。または工程（ｆ）は、単に水（例えば、注射用水）の使用を包含し得る。

工程（ｇ）は、好ましくは、孔径約０．２μｍのフィルターを用いて終了する。
本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ小胞組成物を提供し、この小胞は、（ｉ）ＮｓｐＡタンパク質、（ｉｉ）「２８７」タンパク質、および（ｉｉｉ）「７４１」タンパク質を含むことを特徴とする。

図１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＭＣ５８株、Ｈ４４７６株、および３９４／９８株から調製された、細菌（「ＴＯＴ」）および外膜小胞（「ＯＭＶ」）における（１）タンパク質「２８７」の存在／非存在を示す。矢印は、図１において「２８７」の位置を示す。図２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＭＣ５８株、Ｈ４４７６株、および３９４／９８株から調製された、細菌（「ＴＯＴ」）および外膜小胞（「ＯＭＶ」）における（２）タンパク質［７４１」の存在／非存在を示す。矢印は、図２において「７４１」の位置を示す。図３は、２００２年８月２９日当時のＧｅｎＢａｎｋエントリーＧＩ：７２２７１２８、ＧＩ：７２２７３８８およびＧＩ：１５１８５２２のアミノ酸配列を示す。

（細菌）
ＯＭＶが調製される細菌は、グラム陽性であり得るが、好ましくは、グラム陰性である。この細菌は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属（好ましい種については、上記を参照のこと）に由来し得るが、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属に由来する。好ましいＮｅｉｓｓｅｒｉａ種は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの内には、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのいずれかが使用されるが、血清群Ｂから小胞を調製することが好ましい。血清群Ｂ内の好ましい株は、ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４７６、および３９４／９８である。

発熱活性を減少するために、細菌は、低エンドトキシン（ＬＰＳ）レベルを有するべきであることが、好ましい。適切な変異細菌（例えば、変異Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ［２３］および変異Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ［２４］が、公知である。グラム陰性細菌からＬＰＳを除去した外膜を調製するためのプロセスが、参考文献２５に開示される。

この細菌は、野生型細菌であってもよいし、または組換え細菌であってもよい。好ましい組換え細菌は、免疫原（例えば、ＮｓｐＡ、２８７、７４１、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、スーパーオキシドジスムターゼ［６］など）を、（対応する野生型株と比較した）過剰発現する。この細菌は、１種より多くのＰｏｒＡクラスＩ外膜タンパク質（例えば、２種、３種、４種、５種または６種のＰｏｒＡサブタイプ（Ｐ１．７、１６；Ｐ１．５、２；Ｐ１．１９、１５；Ｐ１．５ｃ、１０；Ｐ１．１２、１３；およびＰ１．７ｈ、４）を発現し得る［例えば、参考文献２６、２７］。

本発明のプロセスは、代表的には、細菌を培養する初期工程を包含し、必要に応じて、その後、培養した細胞を遠心分離する工程を包含する。

（膜破壊）
小胞形成のための膜破壊は、界面活性剤の実質的に非存在下で実施される。

特に、膜破壊は、デオキシコール酸界面活性剤の実質的に非存在下で実施され得、他の界面活性剤が、必要に応じて存在する。

膜破壊は、イオン性界面活性剤の実質的に非存在下で実施され得、非イオン性界面活性剤は、必要に応じて存在する。あるいは、膜破壊は、非イオン性界面活性剤の実質的に非存在下で実施され得、イオン性界面活性剤が、必要に応じて存在する。いくつかの実施形態において、イオン性界面活性剤も、非イオン性界面活性剤も、存在しない。

膜破壊および小胞形成の後の工程は、界面活性剤の使用を包含し得る。従って、膜破壊が界面活性剤の非存在下で生じるが、後に、調製された小胞に界面活性剤が添加される、プロセスが、本発明内に包含される。

用語「実質的に非存在下」とは、問題となる界面活性剤が、膜破壊の間に、０．０５％以下の濃度（例えば、≦０．０２５％、≦０．０１５％、≦０．０１０％、≦０．００５％、≦０．００２％、≦０．００１％、または０％）で存在することを、意味する。従って、微量の界面活性剤が小胞調製の間に存在するプロセスは、排除されない。

界面活性剤の非存在下での膜破壊は、物理的技術（例えば、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、ホモジナイゼーション（ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｉｏｎ）、マイクロフルイダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）、キャビテーション（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）、浸透圧性ショック、粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ）、混合（ｂｌｅｎｄｉｎｇ）など）を使用して、インタクトな細菌に対して実施され得る。

（小胞）
本発明のプロセスは、外膜小胞（ＯＭＶ）を生成する。ＯＭＶは、培養された細菌の外膜から調製される。ＯＭＶは、ブロス中または固体培地培養中で増殖した細菌から、好ましくは、その培養培地から細菌細胞を（例えば、濾過によって、または低速遠心分離して細胞をペレットにすることによって）分離すること、その細胞を（界面活性剤を用いずに）溶解すること、そして好ましくは、細胞質分子から（例えば、濾過によって、外膜および／もしくはＯＭＶの差次的沈殿または凝集によって、外膜分子を特異的に認識するリガンドを使用するアフィニティ分離方法によって、または外膜および／もしくはＯＭＶをペレットにする高速遠心分離によって）外膜画分を分離することによって、得られ得る。

ＯＭＶは、微小胞（ＭＶ［２８］）、および細菌増殖の間に自然に形成して培養培地中に放出される天然に存在する膜小胞である「ネイティブＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［６６］）とは、区別され得る。ＭＶは、ブロス培養培地中でＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養すること、そのブロス培養培地から細胞全体を（例えば、濾過によって、または低速遠心分離によって細胞のみをペレットにし、より小さい破片はペレットにしないことによって）分離すること、その後、細胞を除去した培地中に存在するＭＶを（例えば、濾過によって、ＭＶの差次的沈殿もしくは凝集によって、高速遠心分離によってＭＶをペレットにすることによって）収集することによって、入手され得る。ＭＶの生成において使用するための株は、一般的には、培養中で生成されるＭＶの量に基づいて選択される。参考文献２９および３０は、ＭＶ生成が多いＮｅｉｓｓｅｒｉａを記載する。

（保持される細菌免疫原性成分）
本発明のプロセスにおいて界面活性剤が実質的に存在しないことは、細菌表面の免疫原性成分を保持する小胞調製物を生じる。この細菌表面の免疫原性成分は、界面活性剤に基づく先行技術の方法を使用すると、失われるかまたは減少される。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、本発明を使用して有利に保持される３つの免疫原としては、（１）ＮｓｐＡ、（２）タンパク質「７４１」、および（３）タンパク質「２８７」が挙げられるが、これらに限定されない。

ＮｓｐＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ表面タンパク質Ａ）は、参考文献３１〜３７において開示され、そして参考文献３８の配列番号４００８〜４０３３として開示される。ＮｓｐＡは、髄膜炎菌疾患の予防のための候補ワクチンである。ＮｓｐＡは、菌株間で高度に保存される。しかし、初期の希望にも関わらず、ＮｓｐＡは、それ自体は十分な防御抗原ではなく、さらなる抗原とともに投与される必要があると、現在では考えられている［例えば、参考文献３６、および参考文献３８の実施例１１］。ＮｓｐＡは、先行文献の界面活性剤に基づく調製方法によって除去されることが、見出されている。しかし、本発明によると、ＮｓｐＡは、小胞中に保持され得る。そのようなＮｓｐＡ^＋小胞は、有利である。なぜなら、２種の公知の強力な免疫原の組み合わせ（すなわち、小胞＋ＮｓｐＡ）が、単一プロセスで調製され、各免疫原は、もう一方の効力を増強するからである。

タンパク質「７４１」は、参考文献３９において「ＮＭＢ１８７０」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ４２２０４、ＧＩ：７２２７１２８）。これはまた、参考文献４０および４１においても開示される。これは、強力な殺菌抗体を惹起する。タンパク質「７４１」は、先行技術の界面活性剤に基づく方法によって調製される小胞においては部分的に除去されることが、見出されている。しかし、本発明によると、「７４１」は、小胞中に保持され得る。そのような７４１^＋小胞は、有利である。なぜなら、２種の公知の強力な免疫原の組み合わせ（すなわち、小胞＋７４１）が、単一プロセスで調製され、各免疫原は、もう一方の効力を増強するからである。

タンパク質「２８７」は、参考文献３９において「ＮＭＢ２１３２」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ４２４４０、ＧＩ：７２２７３８８）。これはまた、参考文献４０および４２においても開示される。これは、強力な殺菌抗体を惹起する。タンパク質「２８７」は、先行技術の界面活性剤に基づく方法によって調製される小胞においては代表的には存在せず、この除去を克服するためには、ＯＭＶ調製物に２８７を補充し得ることが、以前に提唱されている［４３］。しかし、本発明によると、「２８７」は、小胞中に保持され得る。そのような２８７^＋小胞は、有利である。なぜなら、２種の公知の強力な免疫原の組み合わせ（すなわち、小胞＋２８７）が、単一プロセスで調製され、各免疫原は、もう一方の効力を増強するからである。

好ましいＮｓｐＡは、（ａ）アミノ酸配列ＧＩ：１５１８５２２に対して少なくともａ％配列同一性を有し、かつ／または（ｂ）アミノ酸配列ＧＩ：１５１８５２２からの少なくともｘアミノ酸のフラグメントを含む。好ましい「７４１」は、（ａ）アミノ酸配列ＧＩ：７２２７１２８に対して少なくともｂ％配列同一性を有し、かつ／または（ｂ）アミノ酸配列ＧＩ：７２２７１２８からの少なくともｙアミノ酸のフラグメントを含む。好ましい「２８７」は、（ａ）アミノ酸配列ＧＩ：７２２７３８８に対して少なくともｃ％配列同一性を有し、かつ／または（ｂ）アミノ酸配列ＧＩ：７２２７３８８からの少なくともｚアミノ酸のフラグメントを含む。ａ、ｂおよびｃの値は、互いに独立しており、各値は、少なくとも７０（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または１００）である。ｘ、ｙおよびｚの値は、互いに独立しているが、各値は、少なくとも８（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０など）である。フラグメントは、好ましくは、エピトープを含む。

好ましいＮｓｐＡタンパク質、２８７タンパク質、および７４１タンパク質は、患者において殺菌抗体を惹起する野生型タンパク質（インタクトな細菌において見出されるような）の能力を実質的に保持する。

（免疫原性薬学的組成物）
本発明のプロセスは、小胞調製物を提供する。患者に投与するために、その小胞は、好ましくは、免疫原性組成物として、より好ましくは、ヒト（例えば、小児または成人）においてワクチンとして使用するために適切な組成物として、処方される。本発明のワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。

本発明の組成物は、好ましくは、滅菌してある。

本発明の組成物は、好ましくは、発熱物質を含まない。

本発明の組成物は、一般的には、６．０と７．０との間のｐＨを有し、より好ましくは、６．３と６．９との間（例えば、６．６±０．２）のｐＨを有する。この組成物は、好ましくは、このｐＨにて緩衝化される。

ヒト投与のために適切な他の成分は、参考文献４４において開示される。

本発明の組成物は、一般的には、アジュバントを含む。本組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、（Ａ）ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してミクロン未満の粒子へと処方された、５％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５［参考文献４５の第１０章を参照のこと；参考文献４６もまた参照のこと）、（Ｂ）生分解性かつ非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましく、必要に応じて、荷電した表面である（例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ（負）またはＣＴＡＢ（正）を添加することによる）から形成された、微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒子、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）［例えば、参考文献４７および４８を参照のこと］；（Ｃ）リポソーム［参考文献４５の第１３章および第１４章を参照のこと］；（Ｄ）ＩＳＣＯＭ［参考文献４５の第２３章を参照のこと］（このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る［４９］）；（Ｅ）１０％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ（ミクロン未満のエマルジョンにマイクロフルイダイズされているか、もしくはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するようにボルテックスされているかのいずれかである）［参考文献４５の第１２章を参照のこと］；（Ｆ）２％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択され、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）である）を含む、Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（Ｇ）サポニンアジュバント（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１［参考文献４５の第２２章を参照のこと］（これは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとしても公知である）；（Ｈ）キトサン［例えば、５０］；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など）［参考文献４５の第２７章および第２８章を参照のこと］；（Ｋ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［５１］；（Ｌ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）［例えば、参考文献４５の第２１章］；（Ｍ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／もしくは水中油エマルジョンとの組み合わせ［５２］；（Ｎ）ＣｐＧモチーフ［５３］を含む（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）オリゴヌクレオチド（５−メチルシトシンが、必要に応じてシトシンの代わりに使用される）；（Ｏ）ポリオキシエチレンエーテルもしくはポリオキシエチレンエステル［５４］；（Ｐ）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［５５］、または少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［５６］；（Ｑ）免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）＋サポニン［５７］；（Ｒ）免疫刺激剤＋金属塩粒子［５８］；（Ｓ）サポニン＋水中油エマルジョン［５９］；（Ｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン（「ＬＴ」）またはその無毒化変異体（例えば、Ｋ６３変異体もしくはＲ７２変異体）［例えば、参考文献６０の第５章］；（Ｕ）コレラ毒素（「ＣＴ」）またはその無毒化変異体［例えば、参考文献６０の第５章］；（Ｖ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｗ）アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム（アルミニウムオキシヒドロキシドを含む）、リン酸アルミニウム（ヒドロキシリン酸アルミニウムを含む）、硫酸アルミニウムなど）［参考文献６１の第８章および第９章］；（Ｘ）モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））［６２］；（Ｙ）ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；あるいは（Ｚ）生体接着物質［６３］（例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［６４］）または粘膜接着物質（ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体からなる群より選択される）が挙げられるが、これらに限定されない。本組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質［例えば、参考文献４５の第７章を参照のこと］もまた、使用され得る。アルミニウム塩（特に、リン酸アンモニウムおよび／または水酸化アルミニウム）が、非経口免疫のための好ましいアジュバントである。変異毒素は、好ましい粘膜アジュバントである。

本発明の組成物中の小胞は、「免疫学的に有効な量」」で存在する。すなわち、単回投与でかまたは一連の投与の一部としてかのいずれかで、個体にその量を投与すると、疾患の処置または予防のために有効である。この量は、処置されるべき個体の健康および身体状態、年齢、処置されるべき個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、その医学的状態についての主治医の評価、および他の関連要因に依存して、変化する。その量は、慣用的試行を介して決定され得る比較的広い範囲内にあることが、予期される。投与処置は、単回投与スケジュールまたは他回投与スケジュール（例えば、ブースター投与を含む）であり得る。そのワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

代表的には、本発明の組成物は、注射可能物質として調製される。その組成物の直接送達は、一般的には、非経口的送達である（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射もしくは筋肉内注射によるか、もしくは組織間隙空間へ送達される）、または粘膜送達である（例えば、経口送達または鼻内送達［６５、６６］）。この組成物はまた、病巣に投与され得る。

一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与され得る。処置されるべき被験体は、動物であり得る。特に、ヒト被験体が、処置され得る。このワクチンは、小児およびティーンエイジャーにワクチン接種するために特に有用である。

この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１種よりも多くの血清サブタイプ［２８］からの小胞を含み得る。同様に、この組成物は、１種より多くの型の小胞（ＭＶおよびＯＭＶの両方）を含み得る。

小胞だけでなく、本発明の組成物は、さらなる抗原を含み得る。例えば、この組成物は、以下のさらなる抗原のうちの１種以上を含み得る：
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ［６７〜７０］、ＶａｃＡ［７１、７２］、ＮＡＰ［７３、７４、７５］、ＨｏｐＸ［例えば、７６］、ＨｏｐＹ［例えば、７６］および／またはウレアーゼ）
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖高原（血清群Ｃからの参考文献７７に開示されるオリゴ糖［参考文献７８もまた参照のこと］、または参考文献７９のオリゴ糖）
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、８０、８１、８２］、
−Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活化ウイルス）由来の抗原［例えば、８３、８４］
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原［例えば、８４、８５］
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ））（必要に応じて、ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／またはアグルチノーゲン（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ）２および３［例えば、参考文献８６および８７］と組み合わせる）
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献８８の第３章］（例えば、ＣＲＭ_ｌ９７変異体［例えば、８９］）
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド［例えば、参考文献１０８の第４章］
−ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ由来の糖抗原［例えば、７８］
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、９０］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、９１、９２、９３、９４］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、９５〜１０１］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、１０２］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１０３］
−ポリオ抗原［例えば、１０４、１０５］（例えば、ＯＰＶ、または好ましくはＩＰＶ）
−狂犬病抗原［例えば、１０６］（例えば、凍結乾燥不活化ウイルス［例えば、１０７、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］）
−麻疹抗原、流行性耳下腺炎抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献１０８の第９章、第１０章および第１１章］
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献１０８の第１９章］、（例えば、赤血球凝集素タンパク質および／またはノイラミダーゼ表面タンパク質）
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１０９］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来のタンパク質抗原［例えば、１１０、１１１］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１１１、１１２、１１３］
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、１１４］、
−Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原［例えば、１１５、１１６、１１７］
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）のウイルス由来（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４種の血清型、ダニ媒介性脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）の抗原
−ペスチウイルス抗原（例えば、古典的ブタ熱ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス）
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９由来の抗原）
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）
−アミロイドタンパク質（例えば、β−ペプチド）［１１８］
−癌抗原（例えば、参考文献１１９の表１にかまたは参考文献１２０の表３および４に列挙される癌抗原）。

本組成物は、これらのさらなる抗原のうちの１種以上含み得る。

毒性タンパク質抗原は、必要な場合には、無毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による、百日咳毒素の無毒化［８７］）。

ジフテリア抗原が本組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含めることもまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含めることもまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含めることもまた、好ましい。従って、ＤＴＰの組み合わせが、好ましい。

糖抗原は、好ましくは、結合体の形態である。その結合体のキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［１２１］、合成ペプチド［１２２、１２３］、熱ショックタンパク質［１２４、１２５］、百日咳タンパク質［１２６、１２７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［１２８］、サイトカイン［１２９］、リンホカイン［１２９］、ホルモン［１２９］、増殖因子［１２９］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［１３０］、鉄取込みタンパク質［１３１］などが挙げられる。好ましいキャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドである［１３２］。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ抗原もまた、ＯＭＶ組成物に添加され得る。特に、タンパク質抗原（例えば、参考文献１３３〜１３９に開示される）が、添加され得る。

本組成物中の抗原は、代表的には、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的には、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対して免疫応答を惹起するために十分である。

本発明の組成物においてタンパク質抗原を使用することに対する代替法として、その抗原をコードする核酸が、使用され得る。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、プラスミドの形態））によって置換され得る。

（患者を処置する方法）
本発明は、医薬として使用するための本発明の小胞を提供する。

本発明はまた、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、好ましくは、髄膜炎疾患に対して防御的であり、そして体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を包含し得る。その患者は、好ましくは、小児である。

この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対してすでに初回免疫されている患者において、ブースター応答を惹起し得る。ＯＭＶについての皮下および鼻内での初回免疫／ブーストのレジメンは、参考文献６５に開示される。

本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、本発明の小胞の使用を提供する。この医薬は、好ましくは、免疫原性組成物（例えば、小胞）である。この医薬は、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａなど）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のための医薬である。

本発明の方法および使用は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１種より多い血清サブタイプからの小胞［例えば、参考文献２８］の投与を包含し得る。

（ＯＭＶ処方物）
本発明は、髄膜炎菌外膜小胞と、水酸化アルミニウムアジュバントと、ヒスチジン緩衝液と、塩化ナトリウムとを含む、組成物を提供し、ここで、（ａ）塩化ナトリウムの濃度は、７．５ｍｇ／ｍｌより高く、そして／または（ｂ）ＯＭＶの濃度は、１００μｇ／ｍｌ未満である。

塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、８ｍｇ／ｍｌよりも高く、より好ましくは、約９ｍｇ／ｍｌである。

ＯＭＶの濃度は、好ましくは、７５ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、約５０ｍｇ／ｍｌである。

上記ヒスチジン緩衝液は、好ましくは、ｐＨ６．３とｐＨ６．７との間（例えば、ｐＨ６．５）である。

上記アジュバントは、約３．３ｍｇ／ｍｌ（Ａｌ^３＋濃度として表す）で使用され得る。

（定義）
２つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセントに対する言及は、整列された場合に、その割合のアミノ酸が、その２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。この整列および相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１４０の第７．７．１８節に記載されるソフトウェア）を使用して、決定され得る。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップエクステンションペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２とともにアフィンギャップサーチを使用して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性サーチアルゴリズムによって決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性サーチアルゴリズムは、周知であり、参考文献１４１に開示される。

用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む、含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」とを意味し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいし、またはさらなる何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

数値ｘに関する用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。

用語「実質的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」とは、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないかもしれない。必要な場合、用語「実質的」とは、本発明の定義から省かれる。

（発明を実行する様式）
（ＯＭＶ調製物）
ＯＭＶを、先行技術の「ノルウェー」法（Ｈ４４７６株および３９４／９８株）によってか、または以下のプロセス（ＭＣ５８株）によってかのいずれかで調製した：
−２〜５個のプレートからの細菌を、１０ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に採集し、５６℃にて４５分間加熱死滅させた。その後、サンプルを氷上で超音波処理（チップを６／７に配置しデューティーサイクル５０を１０分間）して、膜を破壊した。
−細胞破片を、４℃において５０００ｇで３０分間、または１００００ｇで１０分間の遠心分離によって、除去した。
−その上清を、４℃において５００００ｇで７５分間再遠心分離した。
−ペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の２％Ｎ−ラウロイルサルコシネート（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）７ｍｌ中に室温で２０分間再懸濁して、細胞質膜を可溶化した。
−そのサンプルを１００００ｇで１０分間遠心分離して、粒状物質を除去し、その上清を、４℃にて７５０００ｇで７５分間遠心分離した。そのサンプルを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、７５０００ｇで７５分間遠心分離した。
−ペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中または蒸留水中に再懸濁した。

上記の細菌およびＯＭＶ調製物を、ＮｓｐＡ、２８７および７４１の存在についてウェスタンブロットによって試験した（図１および図２）。結果を、以下の表にまとめる。

従って、先行文献の界面活性剤に基づく方法とは対照的に、界面活性剤が存在しないことは、ＯＭＶ中に保持されるＮｓｐＡをもたらし、２８７および７４１の喪失を回避する。

（ＭｅｎＢのニュージーランド株から調製したＯＭＶの処方）
ＯＭＶを、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ３９４／９８株から調製した。これらは、２つの異なる様式で処方した。成分は、以下の濃度を有した：

処方物「Ｂ」は、処方物「Ａ」よりも免疫学的に優れていることが見出された。処方物「Ｂ」は、参考文献１４２において開示される処方物とは、半分のＯＭＶ濃度、より高いＮａＣｌ濃度、およびわずかに異なるｐＨを有することによって、異なる。

本発明は、例示のためだけに記載されており、本発明の範囲および趣旨の範囲内に保持しつつ、改変がなされ得ることが、理解される。

（参考文献）（その内容は、本明細書中に参考として援用される）

Claims

本明細書に記載される発明。