MXPA02000313A - Analogos de vitamina d3. - Google Patents

Abstract

Compuestos de la formula (ver formula) en donde R1 es hidrogeno o un grupo alquilo; R2 es hidrogeno o un grupo alquilo; o R1 R2 Y C20 conjuntamente son ciclopropilo; R3 es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo; y R4 es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo los cuales son utiles en el tratamiento de cancer de mama, cancer de prostata, leucemia mieloide, crecimiento benigno de la prostata, calvicie y osteoporosis.

Description

ANÁLOGOS DE VI .AMINA D3 Descripción de la invención La invención se refiere a un compuesto de la fórmula en donde Ri es hidrógeno o un grupo alquilo; R es hidrógeno o un grupo alquilo; 6 Ri Ra. y C2o conjuntamente son ciclopropilo; H / A eí ~ a —C=C- ../ H?i p H H R3 es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquílo; y R, es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo . Se ha descubierto que los compuestos de la fórmula I inducen la inhibición de la proliferación en las líneas celulares de leucemia ieloide, cáncer de próstata y de mama . Según esto, los compuestos de la fórmula I son útiles como agentes para el tratamiento del cáncer de próstata, cáncer de mama y para el tratamiento de la leucemia.

REF. 135074 También se ha descubierto que los compuestos de la fórmula I tienen actividad antiandrogénica. Según esto, los compuestos de la fórmula I son útiles para el tratamiento del crecimiento benigno de la próstata, calvicie y cáncer de próstata. También se ha descubierto que los compuestos de la fórmula I presentan una actividad que los hace útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las glándulas sebáceas tales como el acné o la dermatitis seborreica. También se ha descubierto que los compuestos de la fórmula I presentan una actividad que hace a los compuestos útiles para el tratamiento de la osteoporosis.

Descripción detallada de la invención Tal como se emplea aquí, el término "grupo alquilo" denota un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que presenta entre 1-4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, t-butilo y similares. El término "hidroxi-alquilo" denota un grupo alquilo que presenta un substituyente hidroxi en cualquiera de los átomos de carbono del grupo alquilo. El término "fluoro-alquilo" denota un grupo alquilo que presenta uno, dos o tres átomos de fluoro substituidos en cualquiera de los átomos de carbono del grupo alquilo.

En las fórmulas presentadas aquí, varios substituyentes se ilustran unidos al núcleo por uno de las siguientes notaciones: una línea continua con forma de cuña(-«) indicando un substituyente que se encuentra por encima del plano de la molécula; y una línea discontinua con forma de cuña (^ ) indicando un substituyente que se encuentra por debajo del plano de la molécula. Preferiblemente Rj es hidrógeno y R2 es alquilo, o Ri es alquilo y Ri és hidrógeno. Más preferiblemente, Ri es •hidrógeno y R2 es metilo o Ri es metilo y R2 es hidrógeno.

Preferiblemente R3 y R son, independientemente, alquilo, hidroxi-alquilo o trifluoro-alquilo. Más preferiblemente, R3 y R4 son independientemente, metilo, hidroxi-metilo o trifluorometilo.

Preferiblemente. A ß» ~ T rl El compuesto más preferido de la fórmula I es 1,25-dihidroxi-16-en-5, 6-trans-colecalciferol . Los compuestos de la fórmula I se preparan como se describe a continuación, haciendo mención especial al Esquema de Reacción siguiente.

Esquema de Reacción R5 es hidrógeno o trimetilsililo. En el anLerior Esquema de Reacción, en donde Ph es feniio, el compuesto de fórmula II, el cual es el compuesto óxido de [3S- (1E, 3ß, 5a) -2- [3, 5-bis (dimetiletil) dimetilsilil] oxi] -2-metilen-ciclohexiliden] etil] difenilfosfina, se convierte en un compuesto de fórmula IA mediante la reacción con un compuesto de la fórmula III. La reacción se lleva a cabo entre -60°C y -90°C, en un disolvente orgánico, aprótico polar, tal como éter seco o más preferiblemente tetrahidrofurano seco, en presencia de una base fuerte tal como un alquil litio como butil litio. Los grupos protectores de los compuestos de fórmula IA se eliminan mediante la reacción con una sal de fluoruro, tal como fluoruro de tetrabutil-amonio en un solvente polar orgánico tal como éter, o más preferiblemente tetrahidrofurano, para dar lugar al correspondiente compuesto de fórmula I. El compuesto de fórmula II se prepara como se describe a continuación en los Ejemplos 1-6, o de forma alternativa, como se describe en los Ejemplos 7-8. Los compuestos de la fórmula III son conocidos . (por ejemplo en la Patente U.S No 5.087.619) o se pueden preparar siguiendo métodos conocidos. La actividad útil de los compuestos de la fórmula I como agentes para el tratamiento de cáncer de próstata, cáncer de mama y para el tratamiento de leucemia, se puede demostrar por los siguientes ensayos que son conocidos en el arte. Los materiales que se seleccionaron para utilizarlos aquí y los procedimientos empleados fueron los siguientes: Líneas celulares. La línea celular de cáncer de mama (MCF-7), la línea celular de cáncer de próstata (LNCaP) y la línea celular de leucemia mieloide (HL-60) se mantuvieron del modo siguiente: las células MCF-7 se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) con suero fetal de ternera (FCS) al 10%; LNCaP y HL-60 se cultivaron en RPMI1640 con FCS al 10%. Las tres líneas celulares se mantuvieron en un incubador a 37 °C conteniendo C02 al 5%.

Compuestos dß vitamina D3. Los compuestos de vitamina D3 se disolvieron en etanol absoluto a 10"3 M como solución madre, la cual se conservó a -20°C y se protegió de la luz. Para su uso in vi tro, los compuestos se diluyeron en medio DMEM o RPMI. Para su uso in vivo, los compuestos se diluyeron con una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se utilizó una alícuota sólo una vez y las células LNCaP fueron tripsinizadas. Las suspensiones de células con células únicas lavadas se enumeraron y se plaquearon en placas de fondo plano de 24 pozos con un total de 1 X 10-3 células/pozo en un volumen de 400 µl/pozo. La capa de nutrientes se preparó con agar que se equilibró a 42°C De forma previa a este paso, los compuestos se dispusieron en los pozos. Tras la incubación, se contaron las colonias. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces utilizando placas por triplicado para un punto experimental.

Niveles de Calcio en Suero ¿n vivo. Veintiocho ratones macho Balb/c de 8 a 9 semanas de edad se mantuvieron en condiciones sin patógenos y se alimentaron con una dieta de laboratorio estándar. Cuatro ratones por grupo fueron inyectados intraperitonealmente cada día (excepto el sábado y el domingo) con un compuesto de vitamina D3 o bien con un diluyente (100 µl/ratón) durante 3 semanas. Las dosis de 1, 25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 fueron: 0.1, 0.5, 1.0 y 2.0 µg. Las dosis de l,25(OH)2D3 fueron 0.1 µg/ratón. Los ratones control fueron inyectados con 100 ml de PBS. Los valores de calcio en suero se .midieron cada semana mediante un ensayo de detección colorimétrico y cuantitativo.

Experimentos de exposición a pulsos. Las células MCF-7 se incubaron en cultivo líquido con 10~7 de l,25(OH)2D3 ó l,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 durante diferentes períodos. Tras la incubación, estas células se lavaron con cuidado dos veces con PBS y las células viables se contaron y plaquearon en placas de 24 pozos para llevar a cabo el ensayo de colonia en agar blando, tal como se ha descrito previamente.

Análisis del Ciclo Celular Mediante Citometría de Flujo. El análisis del ciclo celular se llevó a cabo en células MCF-7 incubadas durante 4 días con l,25(OH)2D3 ó bien con 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 a 10"7 M. Las células se fijaron en metanol frío durante toda la noche antes de la tinción con 50 µg/ml de yoduro de propidio, Rnasa 1 mg/ml (100 unidades/ml) y NP40 al 0.1%. El análisis se realizó de forma inmediata tras la tinción. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de ferina independiente. Todos los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de Student. Análisis Western Blot. Las células se lavaron dos veces con PBS, se suspendieron en amortiguador de Lysis (Tris 50 mM pH 8,0. NaCl 150 mM, SDS 0.1%, desoxicolato sódico 0.5%, NP40 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo lOOµg/ml, aprotinina 2 µg/ml, pepstatina 10 µg/ml y leupeptina 10 µg/ml), y se dejaron en hielo durante 30 minutos. Tras la centrifugación a 15,000 9 durante 20 minutos a 40C, se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se cuantificaron. Los usados completos (15 µg) se analizaron por gel de dodecil sulfato de poliacrilamida sódica al 15%, se transfirieron a una membrana immobilon poliviniliden difurida y se analizaron mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-p27k?pl y anticuerpo monoclonal anti-Actina murina. Las membranas se revelaron.

Actividad dß la Telomerasa. Para detectar la actividad relativa de la telomerasa, se realizaron ensayos de protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP) . Para la transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) , se aislaron los .ARN totales de las células HL que se trataron con l,25(OH)2D3, ó l,25(OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 (10"~9, 10"8, y 10~7 M) durante 4 días con una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio. El RT-PCR se realizó con 1 µg de ARN total y cebadores hexámeros al azar. El cADN se amplificó utilizando cebadores específicos para el gen hTERT o el gen GAPDH, que se usó como control. Los cebadores utilizados para hTERT fueron: 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' (sentido) (SEQ ID NO: 1), y 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 2) . Los ciclos térmicos fueron de 94 °C durante 90 segundos, seguido por 33 ciclos de 95°C durante 20 segundos, 68°C durante 40 segundos y 72°C durante 30 segundos. Los cebadores para el gen GAPDH fueron: 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3' (sentido) (SEQ ID NO: 3), y 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 4). Las condiciones para las amplificaciones GAPDH fueron: 94 °C durante 2 minutos, 26 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 62°C durante 40 segundos, 72°C durante 60 segundos, seguido por 72 °C durante 4 minutos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%, el cual se tiñó con bromuro de etidio.

Efecto de análogos de Vitamina D, en el Ensayo Clonogénico. Las células LNCaP, las células MCF-7 y las células HL-60 se sometieron a clonación en agar blando en presencia de análogos de vitamina D, a concentraciones de entre 10-11 y 107 M. Se representaron las curvas dosis-respuesta y se determinó la dosis efectiva que inhibía el 50% de la formación de colonias (ED5o) • El 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3, fue eficaz en cuanto a la inhibición de la proliferación clonal de las tres líneas celulares de una forma dependiente a la dosis. La ED50 de 1, 25 (OH)2-16-en.-5, 6-trans-D3, fue 1.4 x 10-9 M para las células LNCaP, 4,3 x 10~9 M para las células MCF-7 y 3.0 x 10"11 M para las células HL-60. que fue alrededor de 10-100 veces más potente que l,25(OH)2D3.

Niveles de calcio en suero ±n vxtro. Debido a que la hipercalcemia representa una toxicidad importante de los compuestos de vitamina D3, se compararon los efectos calcémicos de l,25(OH)2D3 con 1, 25 (OH)2-16-en-5, 6-trans- D3. Todos los ratones sobrevivieron a las 3 semanas de estudio. Los ratones que recibieron 0.1 µg de l,25(OH)2D3, todos fueron hipercalcémicos con niveles de calcio en suero de aproximadamente 12 mg/dl (valor normal 8.5-10.5 mg/dl) . En contraste, los ratones que recibieron l,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (0.1-2.0 µg/ratón) presentaron casi el mismo nivel de calcio (8-10 mg/dl) que los ratones control (8-9 mg/dl) .

Experimentos de exposición a pulsos. Para investigar si la inhibición de la proliferación clonogénica por los análogos de vitamina D3 era reversible, se llevaron a - cabo experimentos de exposición a pulsos. Las células MCF-7 se expusieron a 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 ó l,25(OH)2D3 durante diferentes períodos, se lavaron y plaqueron en agar blando y el número de colonias se contó el" día 14 de cultivo. Aproximadamente el cuarenta y el treinta por ciento de las células clonogénicas fueron inhibidas a los 4 días de exposición a 1, 25 (OH) 2-16-en- 5,6-trans-D3 y l,25(OH)2D3, respectivamente.

Análisis del ciclo celular. Se determinó el efecto de l,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 y l,25(OH)2D3 (10~7, 4 días) en el ciclo celular de las células MCF-7. Se observó un incremento significativo (P = 0.05) en el número de células en fase Go-Gi del ciclo celular, conjuntamente con una disminución concomitante en la proporción de células en , fase S. Análisis Western Blot. Los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina conocidos como p21wafl y ?27k?pl son capaces de inhibir la actividad de la cíclina quinasa y así disminuir la progresión de las células a través del ciclo celular. Las células MCF-7 de control presentaban constitutivamente un nivel moderado de expresión de p21wafl y p27kipl, tal como se determino por el análisis Western blot. La exposición durante un día a l,25(OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 (10~7 M) aumentó la expresión de p21wafl y p27k?pl entre 3.2-3.5 veces, mientras que el cultivo con l,25(OH)2D3 (10-7 M) . aumentó la expresión de p21wafl y p27klpl entre 1.6-1.8 veces. La exposición de las células MCF-7 a l,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (10~7 M) durante 3 dias resultó en un aumento de 2.8 veces y 3.4 veces en la expresión de p21wafl y p27kipl, respectivamente. l,25(OH)2D3 (10-7 M, 3 días) aumentó la expresión de p21wa£1 y p27klpl en 4.8 veces y 3.3 veces, respectivamente. Se estudió el efecto dependiente de la dosis de los compuestos de vitamina D3 en la expresión de ?27k:Lpl en células HL-60. Tanto l,25(OH)2D3 como 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 estimulan la expresión de p27k?pl y estos niveles aumentan de forma significativa tras la incubación con l,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (4 días, 10.-9a M) . Los niveles de p27kipl aumentan de forma notable cuando las células HL-60 se cultivan con 10"8 - 10"7 M de l,25(OH)2D3.

Actividad Telomerasa. El efecto de 1, 25 (OH)2-16-en- 5,6-trans-D3 y de l,25(OH)2D3 (10~9 - 10"' M, 4 días) en la actividad telomerasa se evaluó mediante el ensayo TRAP.

La actividad telomerasa disminuyó de forma notable en células HL-60 incubadas con 1, 25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 10~9 M o l,25(OH)2D3 10"7 M. Los efectos de los análogos de la vitamina D3 en la expresión de hTERT en células HL-60 se evaluó mediante RTPCR. Tanto 1, 25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 como 1,25 (OH) D3 inhibieron . la expresión del mARN de hTERT de forma dependiente de la dosis, consiguiendo casi la total inhibición de la expresión con 10"8 M de 1,25 (0H)2-16-en-5,.6-trans-D3 y con 10"7 M de l,25(OH)2D3. La actividad benéfica de los compuestos de fórmula I como agentes para el tratamiento del crecimiento benigno de próstata se puede demostrar mediante los siguientes ensayos que son conocidos en el arte. Se evaluó 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 en cuanto a actividad antiandrogénica en hámsters Syrian machos, castrados y estimulados con testosterona. Los estudios demostraron que 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3, suprimió substancialmente la hipertrofia inducida por andrógenos de las vesículas seminales y de la glándula de. la próstata ventral en estos animales, mientras que l,25(OH)2D3 fue inactivo a dosis no tóxicas (1 µg) . Los hámsters Syrian machos castrados fueron inyectados diariamente, s.c. con 20 µg de testosterona propionato y 1 µg de 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 durante 14 días consecutivos. Ambos compuestos se administraron en un vehículo de 0.2 ml de aceite de sésamo cada uno. La necropsia se llevó a cabo en el día 15. La próstata y las vesículas seminales se retiraron, se secaron y se pesaron. Los datos se analizaron para determinar su significado estadístico mediante la prueba t de Student y se expresaron como porcentaje de inhibición de la respuesta estimulada.

TABLA 1 Inhibición del crecimiento de la próstata y de la vesicula seminal en hámsters castrados estimulados con testosterona ^p < O.001 La actividad benéfica de los compuestos de la fórmula I como agentes para el tratamiento de la osteoporosis se puede demostrar mediante los ensayos siguientes, los cuales son conocidos en el arte.

Materiales y Métodos Animales y tratamiento: Se utilizaron ratas hembras adultas de tres meses de edad. Tras una semana de aclimatación, los animales se agruparon por peso y se trataron mediante alimentación forzada de 1 ml/kg/día con diversas concentraciones de 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3. En el día 7 de dosificación, los animales se sangraron y se determinaron los niveles de calcio en suero.

Preparación del compuesto: El compuesto se disolvió en etanol de graduación 200 para obtener una concentración de 100 µg/ml. Se preparó el vehículo de aceite de sésamo y la solución del compuesto en. etanol para la concentración de la mayor dosificación y entonces se evaporaron de forma rotatoria a 37 °C para eliminar el etanol. El volumen de la dosis se calculó mediante el grupo de dosificación por peso corporal medio. Se realizaron diluciones seriadas del compuesto disuelto en el vehículo para obtener las concentraciones de dosis apropiadas.

Recolección y determinación del suero: Se recolectó la sangre (1.5 ml) de cada animal mediante punción orbital bajo anestesia por éter el día 7 de dosificación. La sangre se recogió en tubos separadores de suero, se centrifugó a 2000 r.p.m. durante 15 minutos y entonces se tomaron alícuotas del suero para realizar las determinaciones de calcio. El calcio en suero se determinó mediante ensayo colorimétrico.

Resultados Niveles de calcio en suero: Los niveles de calcio en suero para los grupos de dosificación de hasta 2 µg/kg/día de tratamiento con 1, 25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 se encontraron dentro del rango normal .

Materiales y métodos Animales y tratamiento: Ratas hembra adultas de tres meses de edad fueron sometidas a una ovariectomía bilateral o cirugía de control. Tras una semana de aclimatación, los animales se agruparon por peso y se trataron mediante alimentación forzada de 1 mg/kg de la concentración especificada. El volumen de la dosis se calculó semanalmente mediante el grupo de peso corporal medio. La dosis se inicio 17 días después de la cirugía y se continuó durante 19 días. En el día 20 los animales se sacrificaron mediante inhalación de dióxido de carbono y se les escindió los fémures izquierdos.

Calcio óseo femoral total: En la necropsia se escindieron los fémures izquierdos de todos los grupos y se eliminó el tejido blando. Los huesos se midieron y se cortaron por la mitad por la diáfisis; entonces la porción distal se cortó longitudinalmente por la mitad tras eliminar la epífisis. La médula ósea se limpió y el calcio se extrajo mediante inmersión en TCA al 5%. El contenido de calcio de los extractos de TCA se determinó mediante una determinación colorimétrica y cuantitativa de calcio. Los datos se expresaron como media del calcio en hueso total en mg/mitad distal del fémur (DHF) ± suero.

Recolección y Determinación del Suero: Se recolectó la sangre (1.5 ml) de cada animal mediante punción orbital bajo anestesia por éter el día 7 y día 18 tras la dosificación. La sangre se recogió en tubos separadores de suero, se centrifugó a 2000 r.p.m. durante 15 minutos y entonces se tomaron alícuotas del suero para realizar las determinaciones de calcio. El calcio en suero se determinó mediante ensayo colorimétrico.

Estadísticas : Para obtener una verificación del efecto de la ovariectomía en el calcio óseo, se compararon los grupos falso y vehículo ovx mediante la prueba de la t de Student. Los grupos ovx se compararon mediante el análisis de la varianza de 1 variable (ANOVA) , seguido por Fischer's LSD para comparar cada grupo de tratamiento con el vehículo cuando el efecto global era estadísticamente significativo.

Resultados Efecto en el calcio del fémur ajustado en relación al peso corporal Efecto en los Niveles de Calcio en Suero En primer lugar identificamos la actividad benéfica de los compuestos de la fórmula I como agentes para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las glándulas sebáceas, tal como se ha demostrado con los siguientes ensayos que son conocidos en el arte. Doscientos µl de 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 se disolvieron en propilenglicol, se administraron diariamente (5 días por semana) mediante alimentación forzada para obtener Golden Syrian hamsters. Los animales se sacrificaron a las 4 semanas y las orejas se procesaron para su evaluación histológica. El área de las glándulas sebáceas se midió en secciones transversales de la oreja preparadas histológicamente mediante análisis por imagen.

Resultados También se examinó la fracción de lípidos totales de una de las orejas (extracción por solvente orgánico seguida por peso del material con lípido remanente) .

Resultados Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de próstata o leucemia a humanos que necesiten dicho tratamiento. Más específicamente, los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente a un humano adulto con una dosis que se encuentra dentro del rango de entre 1 y 20 µg por día de dicho tratamiento. Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente, para el tratamiento del crecimiento benigno de la próstata y de la calvicie a humanos que necesiten dicho tratamiento. Más específicamente, los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente a un humano adulto con unas dosis que se encuentran en el rango de entre 1 y 20 µg por día de dicho tratamiento. Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente para el tratamiento de la osteoporosis a humanos, con una dosis de alrededor de 1 a 20 µg por día.

Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar tópicamente para el tratamiento de la calvicie en humanos que necesiten dicho tratamiento. Más específicamente, los compuestos de la fórmula I se pueden administrar tópicamente con dosis que se encuentran en el rango de alrededor de 5 a alrededor de 50 µg por gramo de formulación tópica por día, para dicho tratamiento. Los compuestos de la fórmula I se pueden administrar oralmente, para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con las glándulas sebáceas en humanos, con una dosis de alrededor de 1 a 20 µg por día. Las formas con dosificación oral que comprenden compuestos de la fórmula I de la invención se pueden incorporar en cápsulas, comprimidos y similares con materiales de vehículos farmacéuticamente aceptables. De forma ilustrativa, los materiales de vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden incorporar en cápsulas y similares son los siguientes: un agente de unión tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; un excipiente tal como fosfato dicálcico; un agente desintegrador tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algénico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio, un agente edulcorante tal como la sacarosa, lactosa o sacarina; un agente aromatizante tal como la menta, aceite de gaulteria o cereza. Otros materiales pueden estar presentes en forma de cubierta o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos pueden estar recubiertos con laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza o de naranja.

Las formas de dosificación tópicas que comprenden compuestos de la fórmula I de la invención incluyen: pomadas y cremas que comprenden las formulaciones con bases del tipo emulsión, solubles en agua, absorbibles y oleaginosas tales como petrolato, lanolina, polietilenglicoles y similares. Las lociones son preparaciones líquidas, que varían desde soluciones simples a preparaciones acuosas o hidroalcohólicas que contienen substancias finamente divididas. Las lociones pueden contener agentes en suspensión o en dispersión, por ejemplo, derivados de celulosa tales como etil celulosa, metil celulosa y similares; gelatina o gomas, que incorporan el ingrediente activo en un vehículo formado por agua, alcohol, glicerina y similares. Los geles y las preparaciones semisólidas se preparan mediante la gelificación de una solución o suspensión del ingrediente activo en un vehículo transportador. Los vehículos, que pueden estar hidratados o deshidratados, se gelifican mediante un agente gelificante, tal como carboxi polimetileno y se neutralizan para obtener una consistencia característica del gel mediante el uso de álcalis tales como hidróxido de sodio y aminas, tales como polietilencocoamina.

Como se emplea aquí, el término "tópico" denota el uso del ingrediente activo, incorporado en un vehículo farmacéuticamente adecuado y aplicado en la zona de inflamación para que se produzca la acción local. Según esto, las composiciones tópicas incluyen aquellas formas farmacéuticas en las que el compuesto se aplica externamente mediante el contacto directo con la piel. Las formas de dosificación comprenden geles, cremas, lociones, pomadas, polvos, aerosoles y otras formas convencionales de aplicación de la medicación sobre la piel, obtenidas por la mezcla de los compuestos de fórmula I con materiales de transporte tópico farmacéuticamente conocidos. Los .siguientes Ejemplos se proporcionan para describir la invención y no pretenden limitarla de ninguna forma.

Ejemplo 1 Acetato de (2R,3S,5S,7S) -2- [5, 7-Bis [1,1-dimetiletil) dimetilsilil] oxi] -4-metilen-l-oxaspiro [2 , 5] ostano-2-metanol A una solución agitada magnéticamente de_ 18.5 g (0.0523 moles) de acetato de (2R, 3R, 5S, 7S)-5-hidroxi-4-metilen-7 [ (1, 1, -dimetiletil) dimetilsililoxij-1-oxaspiro[2, 5]octano-2-metanol (Y.Kiegiel, P.M. Wovkulich and M.R. Uskokovic, Tetrahedron Letters, .32, pgs. 6057- 6060 (1991)) y 6.8 g (0.099 moles) de imidazol en 50 ml de dimetilformamida bajo una atmósfera de argón, se añadieron 9.8 g (0.065 moles) de cloruro de t-butildimetilsililo. La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas, se apagó con 5 ml de agua, se agitó durante 30 minutos y se vació en 400 ml de agua. Entonces se extrajo con 2 x 500 ml de hexano y 2 x 500 ml de éter. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con 300 ml de agua, se secaron sobre Na2S04 y se evaporaron. La cromatografía en una columna de gel de sílice dio 22.31 g (92 %) del compuesto del título en forma de aceite incoloro.

Ejepflo 2 Acetato de [3S- (lE,3ß,5a) ] -2- [3,5-Bis[ [ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]oxi] -2-metilenciclohexiliden]etanol Un recipiente de 3 bocas de 3 litros provisto de válvula para el argón, agitador mecánico y termómetro se cargó con 500 ml de tetrahidrofurano y se enfrió a -60°C en un baño de acetona en hielo seco. La adición con respecto a las porciones de 43.23 g (0.108 moles) de hexacloruro de tungsteno anhidro se llevó a cabo mientras se mantenía la temperatura a -60°C, y entonces la rápida adición gota a gota de 200 ml de n-butil-litio 1.6 M en hexano mantuvo la temperatura por debajo de - 5°C (aproximadamente 5 minutos) . El baño de acetona en hielo seco se sustituyó por un baño de agua-hielo, permitiendo alcanzar una temperatura de 5°C. Se produjeron cambios de color del azul al caqui y al negro rojizo. Tras 30 minutos a.5°C, se afíadió rápidamente gota a gota una solución de 22.31 g (0.04884 moles) de acetato de (2R, 3S, 5S, 7S) -2- [5, 7-bis [ (1, 1-dimetil-etil) dimetilsilil] -oxi] -4-metilen-l-oxaspiro[2, 5] octano-2-metanol en 50 ml de hexano durante 3 minutos. Tras 4 horas, la mezcla de reacción se diluyó con 2 litros de hexano, se filtró a través de un depósito de gel de sílice, el cual se lavó con 3 x 500 ml de hexano-etilacetato 9:1 y se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía mediante una columna de gel de silice de 75 g para dar 22.56 9 de producto crudo. La cromatografía mediante una columna de gel de sílice de presión media y la elusión con una mezcla de diclorometano-acetato de etilo 100:1 proporcionó 17.42 g (80.1%) del compuesto del título y una pequeña cantidad del correspondiente epímero 1Z.

Ejemplo 3 Acetato de [3S- (lE,3ß,5a) ] -2- [3,5-Bis [ [ (1,1-dimetiletil) -dimetilsilil] oxi] -2-metilenciclohexiliden]etanol (E-dieno) Acetato de [3S- (lZ,3ß,5a) ] -2- [3,5-Bis[ [ (1,1-dimetiletil) -dimetilsilil] oxi] -2-meti enciclohexiliden]etanol (2-dieno) A 465 ml de THF anhidro a -78 °C se añadió, bajo agitación, 64.3 9 (160 mmoles) de WClß, (solución azul), seguido por la adición de 337.5 ml de n-BuLi 1.43 M en hexano (a tal velocidad que la temperatura interna no subió por encima de los -20°C) . Entonces la mezcla se dejó calentando a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota una solución de 24.5 g (53.6 mmoles) de acetato de (2R, 3S, 5S, 7S) -2- [5, 7-bis [ ( 1, 1-dimetil-etil) dimetilsilil] -oxi]-4-metilen-l-oxaspiro [2, 5] octano-2-metanol en 65 ml de THF y la mezcla se agitó durante 4 h. La mezcla se diluyó con 600 ml de pentano y se filtró a través de un lecho de 4 cm de gel de sílice, se lavó con hexano/EtOAc (19:1) para dar, tras la evaporación de los agentes volátiles bajo presión reducida, 27 g de mezcla de dieno crudo. Otra purificación mediante cromatografía eluyendo con hexano/EtOAc (25:1) dio 21.6 g (91%) de una mezcla de dienos Z/E 2:3 (compuestos del título), los cuales se pueden separar mediante cromatografía en gel de sílice (hexano/EtOAc 40:1). Z-dieno XH RMN d 0.052 (s, 6H) , 0.06 (s, 6H) , 0.87 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.74-1.90 (m, 2H) , 2.04 (s, 3H) , 2.20 (dd, J=6.0, 12.8 Hz, ÍH) , 2.41 (d, J=ll, 1 Hz, ÍH) , 4.19 (m, 1H), 4.42 (m, ÍH) , 4.61 (dd, J= 7.3, 12.1 Hz, 1H), 4,68 (dd, J= 7.3, 12.1 Hz, ÍH) , 4.80 (s, ÍH) , 5.20 (s, 1H), 5,47 (t,. J= 7.2 Hz, 1H) . [a]D25 = +1.2° (c = 0.4, EtOH). Anal. Caled, para C23H40Si2: C, 62.27; H, 10.01; Encontrado: C. 62.55, H, 10.33. E-dieno H RMN d 0.046 (s, 3H) , 0.057 (s, 3H) , 0.065 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 0.89 (s, 9H) , 1.77 (ddd, J= 3.1, 9.4, 11.9 Hz, ÍH), 1.89 (m, ÍH) , 2.09 (s, 3H) , 2.31 (dd, J= 2.0, 15.2 Hz, ÍH), 2.39 (dd, J= 6.3, 15.2 Hz, 1H) , 4.21 (br s, ÍH), 4.50 ( , ÍH) , 4,58 (dd, J= 7.2, 12.9 Hz, ÍH) , 4.65. (dd, J= 7.2, 12.9 Hz, ÍH) , 4.95 (s, ÍH) , 4.99 (s, 1H), 5.69 (t, J= 7.2 Hz, ÍH) . [a]D25 = +8.0° (c = 0.5, EtOH) .. Anal . Caled , para C23H4404Si2 : C, 62 .27 ; H, 10 . 06; Encontrado : C, 62 . 42 , H, 10 . 01 . Ejemplo 4 [3S- (1E, 3ß,5a) ] -2- [3,5-Bis [ [ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil] oxi] -2-metilenciclohexiliden]etanol A una solución agitada magnéticamente de 10.84 g (0.0246 moles) de acetato de [3S- (1E, 3ß, 5a) 1-2- [3, 5-bis [ [ ( 1, 1-dimetiletil) dimetilsilil] oxi] -2-metilen-ciclohexiliden] etanol en 100 ml de metanol bajo una atmósfera de argón, se añadió 3.5 g de perlas de hidróxido sódico y la mezcla de reacción se agitó bajo argón durante 3 horas. Entonces se evaporó bajo presión reducida hasta obtener un volumen de 50 ml, se diluyó con 500 ml de agua, se extrajo con 2 x 500 ml de hexano: éter 1:1. La capa orgánica (100%) del compuesto del título se lavó con agua, se secó sobre Na2SO, y se evaporó. Resultaron 9.80 g (100%) del compuesto del titulo en forma de sólido de color blanco. , Ejepg>lo 5 IR- (la,3ß,5E) - [ [-2-cloroetiliden) -4-metilen-l,3-ciclohexandiil]bis (oxi) ]bis (1,1-dimetiletil)dimetilsilano A una solución agitada de 6.67 g (0.050 moles) de N-clorosuccinimida en 150 ml de diclorometano bajo una atmósfera de argón enfriada a 2°C en un baño de hielo-acetona, se le añadió gota a gota durante 2 minutos 4 ml (0.055 moles) de dimetilsulfuro. Se formó un precipitado de color blanco. Tras 30 minutos a 0°C, el baño se sustituyó por un baño de acetona en hielo seco y la temperatura de la mezcla de reacción se ajustó a -20°C. Se añadió una solución de 9.8 g (0.0246 moles) de [3S- (lE,3ß,5a) ] -2- [3, 5-bis [ [ (1, 1-dimetiletil) dimetilsilil] -oxi] -2-metilen-ciclohexiliden] etanol en 60 ml de diclorometano. Tras 15 minutos, el baño enfriado se retiró y la mezcla de reacción se agitó durante 50 minutos y entonces se transfirió a un embudo de separación que contenía 500 ml de agua. Se extrajo con 2 x 350 ml de hexano. La capa orgánica se lavó con 500 ml de agua, se secó sobre sulfato s6dico y se evaporó para dar 10.49 g de producto crudo en forma de líquido de color amarillo. La purificación mediante cromatografía instantánea dio el compuesto del título puro en forma de aceite incoloro. RMN (CDC13) : d 0.03 (s, 3H) 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 6H), 0.87 (s, 9H) , 0.89 (s, 9H) , 1.70-1.94 (m, 2H), 2.34 (m, 2H) , 4.13 (m, 2H) , 4.28 (m, 1H) , 4.53 (m, 1H), 5.00 (m, 1H) , 5.03 (m, ÍH) , 5.78 (tm, J= 8Hz, ÍH) .

Ejepflo 6 Óxido dß [3S-(lE,3ß,5a)]-2-[3,5-Bis[[(dimßtiletil)-dimetilsilil] oxi] -2-metilenciclohexiliden]etil]difenil-fosfina Un matraz de 3 bocas de 1 litro provisto de válvula de argón, termómetro y agitador mecánico se rellenó con una solución de 10.26 g (0.0246 moles) de IR- (la, 3ß, 5E)-[ [-2-cloroetiliden) -4-metilen-l, 3-ciclohexanediil]bis-(oxi) ]bis (1, 1-dimetiletil) dímetilsilano en 100 ml de tetrahidrofurano anhidro recién destilado y se enfrió en un baño de acetona en hielo seco a -65°C. Se necesitó la adición de 60 ml de difenilfosfuro potásico en tetrahidrofurano durante 30 minutos para que persistiera un color rojo. Tras la agitación durante 1 hora a -65°C, se añadió 10 ml de agua y se retiró el baño enfriado. La reacción perdió su color. Entonces se añadieron rápidamente 200 ml de diclorometano seguido por 200 ml de una solución acuosa que contenía 10 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Tras 1 hora, se añadieron 13.5 g de sulfito de sodio, 100 ml de salmuera y 200 ml de diclorometano. Tras su agitación cuidadosa, las fases se separaron y la fase acuosa se lavó con 200 ml de diclorometano. Las fases orgánicas se lavaron con 200 ml de salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron para dar 16.33 g de producto crudo. Este producto crudo se purificó mediante cromatografía (gel de sílice G-60) de presión media para dar 12.54 g (87%) del compuesto del título en forma de cristales de color blanco. RMN (CDC13) : d 0.02 (s, 3H), 0.07 (s, 6H) , 0.08 (s, 3H) , 0.84 (s, 18H), 1.76 (m, 2H) , 2.98-3.15 ( , 2H) , 4,06 (m, ÍH) , 4.37 (m, 1H), 4.53 (m, ÍH) , 4.72 (m, ÍH) , 4.79 (m, 1H) , 7,45 ( , 6H), 7.72 (m, 4H) .

Ejemplo-7 Ester metílico del ácido E-(3S,5R) -[3,5-Bis-(terc-butil-dimetil-silaniloxi) -2-metilenciclohexiliden] cético (Ro65-8821) Una solución de 4.45 g (0.01043 moles) de éster metílico del ácido Z- (3S,SR)- [3, 5-Bis- (terc-butil-dimetil-silaniloxi) -2-metilen-ciclohexiliden] acético (X) (A. Mowrino, et al., Tetrahedron Letters, _38, pgs. 4713-4716 (1997)) en 100 ml de hexano se irradió con una fuente de UV durante 3 horas. La evaporación dio 4.25 g (95.5%) del compuesto del título en forma de aceite incoloro. RMN (CDC13) d 0.06 (s, 3H), 0.07 (s, 9H) , 0.85 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.76 (m, ÍH), 1.84 (m, ÍH), 2.70 (m, ÍH), 3.36 (m, ÍH) , 3.70 (s, 3H) , 4.26 (m, ÍH) , 4.58 (m, ÍH), 5.07 ( , 2H) , 5.91 (brs, 1H) .

Ejepflo 8 l.B-?CH^ [3S- (1E,3ß,5a) ] -2- [3,5-Bis [ [ (1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oxi] -2-metilenciclohexiliden]etanol A una solución de 4.25 g (0.00996 moles) de éster metílico del ácido E- (3S, SR) - [3, 5-bis- (terc-butil-dimetil-silaniloxi) -2-metilenciclohexiliden] acético en 100 ml de tolueno a -78°C, se añadió gota a gota, 25 ml de hidruro de diisobutilaluminio 1.2M (0.03 moles) y la mezcla de reacción • se agitó durante una hora. Tras la adición de 5 ml de metanol, la mezcla de reacción se dejó atemperando a temperatura ambiente. Entonces se diluyó con 150 ml de tartrato sodio-potasio acuoso 2M y se agitó vigorosamente. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó hasta sequedad. El producto crudo se purificó por cromatografía Instantánea con hexano-acetato de etilo 8:2, dando 2.8 g (70%) del compuesto del título en forma de sólido ceroso incoloro.

RMN (CDC13) : d 0.05 (s, 3H) , 0.07 (s, 9H) , 0.88 (s, 9H) , 0.91 (s, 9H), 1.74 (m, ÍH) , 2.06 (m, ÍH) , 2,26 (dm, J= 13.6 Hz, ÍH), 2.40 (dd, J= 13.6, 5.2, 1H) , 4.30-4.11 (m, 3H) , 4.53 (m, ÍH) , 4.98 (m, ÍH) , 5.00 (m, ÍH) , 5.80 (tm, J= 7 Hz, 1H) .

Ejepflo 9 1,25-Dihidroxi-16-en-5, 6-trans-colecalciferol Una solución agitada de 796 mg (0.00137 moles) de óxido de [3S- (lE,3ß,5a)] -2- [3, 5-bis [[ (1,1-dimetiletil) dimetil-silil] oxil-2-metilenciclohexiliden] -etil] difenilfosfina en 10 ml de tetrahidrofurano anhidro a -78°C se trató con 0.83 ml (0.00133 moles) de n-butil litio 1,6 M en hexano, gota a gota, bajo una atmósfera de argón. Para obtener una solución de color rojo se añadió una solución de 280 mg (0.000803 moles) de [3aR-[1(R*) ,3aa, 7aß, ] ] -1- [l,5-dimetil-5-[ (trimetilsilil) -oxi] hexil] -3, 3a, 5, 6, 7, 7a-hexahidro-7a-metil-4H-inden-4-ona en 5 ml de tetrahidrofurano, gota a gota durante un período de 10 minutos bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 90 minutos, entonces se apagó por adición de 40 ml de una sal Rochelle 2N y KHC03 2N 1:1 y se dejó calentando a temperatura ambiente. Se extrajo con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Las capas orgánicas se lavaron 3 x agua/salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron hasta sequedad. Este producto crudo se purificó mediante cromatografía Instantánea en una columna de gel de sílice de 40 mm x 6" con .hexano-acetato de etilo 40:1, dando 278mg del compuesto del título trisililado y 140 mg de la cetona de partida. Una solución de 278 mg (0.000389 moles) de este intermediario trisililado en 8 ml de tetrahidrofurano anhidro, se trató con 1.9 (1.9 mmoles) de fluoruro de tetrabutilamonio ÍM en tetrahidrofurano bajo una atmósfera de argón durante 17 horas. Se apagó con 6 ml de agua y se agitó durante 30 minutos. Tras la evaporación del tetrahidrofurano al vacío, la solución residual se extrajo con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Las capas orgánicas se lavaron 4 x agua/ salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta sequedad. El producto crudo, 192 mg, se purificó mediante cromatografía Instantánea en una columna de gel de síiice, la cual fue previamente lavada con una solución al 1% de trietilamina: acetato de etilo (300 ml); la elusión se llevó a cabo con acetato de etilo. Ésta dio 152 mg del compuesto del título cristalizado. La muestra recristalizada de tetrahidrofurano:metilformato (0.3:7) tenía un p.f. 95-100°C. [a]D" + 160.5° (EtOH, c 0.20) ?max 272/3 nm (e20600) Ejemplo 10 Cápsula de gelatina blanda Formulación I Procedimiento de elaboración: 1. Poner en suspención el BHT y BHA en Migliol 812. Calentar a alrededor de 50°C y agitar hasta conseguir su disolución. 2. Disolver 1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 en la solución del paso 1 a 50°C. 3. Enfriar la solución del Paso 2 a temperatura ambiente. 4. Rellenar cápsulas de gelatina blanda con la solución del Paso 3. Nota: Realizar todos los pasos de elaboración bajo una atmósfera de nitrógeno y protección de la luz.

Ejepflo 11 Cápsula de gelatina blanda Formulación II Proceda iento de elaboración: 1. Poner en suspención di-a-Tocoferol en Migliol 812. Calentar a alrededor de 50°C y agitar hasta conseguir su disolución. 2. Disolver 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 en la solución del paso 1 a 50°C. 3. Enfriar la solución del Paso 2 a temperatura ambiente. 4. Rellenar cápsulas de gelatina blanda con la solución del Paso 3. Nota: Realizar todos los pasos de elaboración bajo una atmósfera de nitrógeno y protección de la luz.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> .Análogos de la Vitamina D3 <130> 20472 <140> <141> <150> U.S 60/143413 <150> 1999-07-12 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <210> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para hTERT (antisentido) <400> 1 cggaagagtg tctggagcaa <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para hTERT (antisentido) <400> 2 ggatgaagcg gagtctgga <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para GAPDH (sentido) <400> 3 ccatggagaa ggctgggg <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para GAPDH (antisentido) <400> 4 caaagttgtc atggatgacc Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente invención.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un compuesto de la fórmula caracterizado porque Ri es hidrógeno o un grupo alquilo; R.2 es hidrógeno o un grupo alquilo; ó R: R_ y C?_' conjuntamente son ciclopropilo;
2. R es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo; y R.; es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo . 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2 es hidrógeno y R2 es alquilo o i es alquilo y R2 es hidrógeno.
3. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque Ri es hidrógeno y R2 es metilo o es metilo y R2 es hidrógeno.
4. 4. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque R3 y R4 son, independientemente, alquilo, hidroxi-alquilo o trifluoro-alquilo.
5. 5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque R3 y R4 son, independientemente, metilo, hidroxi-metilo o trifluoro-metilo.
6. 6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque A es
7. 7. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 6, 1, 25-dihidroxi-16-en-5, 6-trans-colecalciferol.