HRP20020007A2

HRP20020007A2 - Vitamin d3 analogs

Info

Publication number: HRP20020007A2
Application number: HR20020007A
Authority: HR
Inventors: Andrew David Batcho; Bernard Michael Hennessy; Milan Radoje Uskokovic
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2002-01-04
Publication date: 2003-04-30
Also published as: PT1200399E; EG23909A; CN1174964C; EP1200399B1; ZA200110487B; AU779408B2; HK1047578B; JP3803579B2; DE60009303T2; US6331642B1; RU2235721C2; MA26808A1; PL201877B1; JP2003504354A; WO2001004089A1; ATE262508T1; NO20020161L; BR0012419A; RS50229B; NZ516339A

Description

Izum se odnosi na spoj formule

[image]

u kojoj

R1 je vodik ili alkilna skupina;

R2 je vodik ili alkilna skupina;

R1, R2 i C20 zajedno predstavljaju ciklopropil;

[image]

R3 je alkil, hidroksialkil ili fluoroalkil; i

R4 je alkil, hidroksialkil ili fluoroalkil.

Pronađeno je da spojevi formule I potiču inhibiciju proliferacije staničnih linija karcinoma prostate, dojke i mijeloidne leukemije. Stoga su spojevi formule I korisna sredstva za liječenje karcinoma prostate, karcinoma dojke i za liječenje leukemije.

Također je pronađeno da spojevi formule I imaju antiandrogeno djelovanje. Stoga su spojevi formule I korisni u liječenju benignog rasta prostate, ćelavosti i karcinoma prostate.

Također je pronađeno da spojevi formule I imaju djelovanje zbog kojeg su korisni u liječenju bolesti lojne žlijezde kao što su akne ili seborejni dermatitis.

Također je pronađeno da spojevi formule I imaju djelovanje koje ih čini korisnim za liječenje osteoporoze.

Detaljan opis izuma

Kako se ovdje rabi, pojam «alkilna skupina» označava alkilnu skupinu ravnog ili razgranatog lanca s 1-4 ugljikova atoma, na primjer, metil, etil, propil, izopropil, butil, t-butil i slično. Pojam «hidroksialkil» obuhvaća alkilne skupine koje imaju hidroksi supstituent s bilo kojim od ugljikovih atoma iz alkilne skupine. Pojam «fluoroalkil» znači alkilnu skupinu s jednim, dva ili tri atoma fluora supstituiranih s bilo kojim od ugljikovih atoma iz alkilne skupine.

U ovdje prikazanim formulama različiti supstituenti ilustrirani su kao povezani s nukleusom jednom od sljedećih oznaka: puna klinasta crta ([image] ) označava supstituent koji se nalazi iznad ravnine molekule, a točkasta klinasta crta ([image] ) označava supstituent koji se nalazi ispod ravnine molekule.

Poželjno je da R1 bude vodik, a R2 alkil, ili da R1 bude alkil, a R2 vodik. Povoljnije je da je R1 bude vodik, a R2 metil, ili da R1 bude metil, a R2 vodik.

Poželjno je da R3 i R4 nezavisno predstavljaju alkil, hidroksialkil ili trifluoroalkil. Još povoljnije je da R3 i R4 nezavisno predstavljaju metil, hidroksimetil ili trifluorometil.

Poželjno je da A bude

[image]

Najpovoljniji spoj formule I je 1,25-dihidroksi-16-en-5,6-trans-kolekalciferol.

Spojevi formule I pripravljeni su kako je opisano u nastavku, s posebnim osvrtom na donju Formulsku Shemu.

Formulska Shema

[image]

R5 je vodik ili trimetilsilil.

U gornjoj Formulskoj Shemi, u kojoj je Ph fenil, spoj formule II, koji je spoj [3S-(1E,3β,5α)-2-[3,5-bis(dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilen-cikloheksiliden]etil]-difenilfosfin-oksid, pretvoren je u spoj formule IA reakcijom sa spojem formule III.

Reakcija je izvedena na -60°C do -90°C, u polarnom aprotičkom, organskom otapalu kao što je suhi eter, ili/ još povoljnije, suhi tetrahidrofuran, uz dodatak jake baze kao što je alkillitij, poput butillitija.

Zaštitne skupine spojeva formule IA uklonjene su reakcijom s fluoridnom soli, kao što je tetrabutil-amonij fluorid u polarnom, organskom otapalu kao što je eter, ili, još povoljnije, tetrahidrofuran, kako bi se dobio odgovarajući spoj formule I.

Spoj formule II pripravlja se kako je u nastavku opisano u Primjerima 1-6, ili alternativno, kako je opisano u Primjerima 7-8.

Spojevi formule III su poznati (na primjer, u U.S. Patent br. 5,087,619) ili se mogu pripraviti u skladu s poznatim metodama.

Korisno djelovanje spojeva formule I kao sredstava za liječenje karcinoma prostate, karcinoma dojke ili za liječenje leukemije može se demonstrirati sljedećim, u struci poznatim, postupcima testiranja.

Materijali izabrani za uporabu i primjenjeni postupci bili su kako slijedi:

Stanične linije. Stanična linija karcinoma dojke (MCF-7), stanična linija karcinoma prostate (LNCaP) i stanična linija mijeloidne leukemije (HL-60) održavane su kako slijedi: MCF-7 stanice su održavane u Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) s 10% telećeg fetalnog seruma (FCS); LNCaP i HL-60 su uzgajane u RPMI1640 s 10% FCS; sve tri stanične linije održavane su na 37°C, u inkubatoru s 5% CO2.

Spojevi vitamina D3. Spojevi vitamina D3 otopljeni su u apsolutnom etanolu na 10-3M kao štok otopini, koja je čuvana na -20°C i zaštićena od svjetla. Za in vitro primjenu, spojevi su razrijeđeni u DMEM ili RPMI mediju. Za in vivo uporabu spojevi su razrijeđeni sa slanom otopinom puferovanom fosfatom (PBS). Samo jednom je primijenjen alikvot te su LNCaP stanice podvrgnute djelovanju tripsina. Isprane suspenzije stanica jedne vrste su prebrojene te stavljene na ploče koje imaju 24 jažice ravnog dna s ukupno 1x10-3 stanica/jažici u volumenu od 400 μl/jažici. Hranjivi sloj pripravljen je s agarom koji je prije toga uravnotežen na 42°C. Prije tog koraka, spojevi su pipetirani u jažice. Nakon inkubacije, prebrojane su kolonije. Svi eksperimenti su učinjeni najmanje tri puta koristeći trostruke ploče po eksperimentalnoj točki.

Razine kalcija u serumu in vivo. Dvadeset i osam mužjaka Balb/c miševa starosti 8 do 9 tjedana čuvani su u nepatogenim uvjetima te hranjeni standardnom laboratorijskom dijetom. Četirima miševima po skupini je 3 tjedna, svaki drugi dan (osim subote i nedjelje) intraperitonealno injektiran ili spoj vitamina D3 ili razrjeđivač (100 μl/mišu). Doze od 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 bile su: 0.1, 0.5, 1.0 i 2.0 μg. Doze od 1,25(OH)2D3 bile su 0.1 μg/mišu. Kontrolnim miševima je injektirano 100 μl PBS. Vrijednosti kalcija u serumu mjerene su svaki tjedan kvantitativnim kolorimetrijskim određivanjem.

Eksperimenti u kojima se primjenjuju pulsne metode. MCF-7 stanice su različito vrijeme trajanja inkubirane u tekućoj kulturi s 10-7 1,25(OH)2D3 ili 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3. Nakon inkubacije, stanice su pažljivo dvaput isprane s PBS, a žive stanice su prebrojene i stavljene na ploče od 24 jažice za ispitivanje s mekanim agarom, kako je prethodno opisano.

Analiza staničnog ciklusa protočnom citometrijom. Analiza staničnog ciklusa izvedena je na MCF-7 stanicama inkubiranim 4 dana bilo s 1,25(OH)2D3 ili 1, 25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 na 10-7 M. Stanice su prije bojanja s 50 μg/ml propidijevog jodida, 1 mg/ml Rnase (100 jedinica/ml) i 0.1% NP40 preko noći fiksirane u ledenom metanolu. Odmah nakon bojenja provedena je analiza. Svi eksperimenti obavljeni su nezavisno najmanje tri puta. Svi podaci su statistički analizirani Student-ovim testom.

Elektroforeza na SDS-poliakrilamidnom gelu. Stanice su dvaput isprane s PBS, suspendirane u Lysis puferu (50 mM Tris Ph 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% natrijevog deoksikolata, 1% NP40, 100 μg/ml fenilmetilsulfonil fluorida, 2 μg/ml aprotinina, 1 μg/ml pepstatina, 10 μg/ml leupeptina) te stavljene 30 minuta na led. Nakon centrifugiranja na 15,000 g 20 min pri 4°C, skupljen je supernatant. Određene su koncentracije proteina. Cijeli lizati (15 μq) rastvoreni su s 15%-tnim natrij-dodekil-sulfat-poliakrilamid gelom, premješteni u imobilon polivinildien difluorid membranu te istraživani s anti-p27kip 1 zečjim poliklonalnim protutijelom i anti-Aktin monoklonalnim protutijelom murine. Razvijeni su blotovi.

Djelovanje telomeraze. Za otkrivanje relativnog djelovanja telomeraze, provedena su TRAP ispitivanja. Za humanu telomerazu, reverznu transkriptazu (hTERT), ukupni RNA su izolirani iz HL-stanica obrađivanih bilo s 1,25(OH)2D3 ili s 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (10-9, 10-8 i 10-7 M) 4 dana s monofaznom otopinom fenola i gvanidin izotiocijanata. RT-PCR je izvedena s 1 μg od ukupne RNA i slučajnih heksamernih primera. cDNA je upotpunjena primjenom primera specifičnih za hTERT gen ili GAPDH gen, upotrijebljen kao kontrolni. Primeri upotrijebljeni za hTERT bili su: 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’ (smjer) (SEQ ID N0:1), i 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'-(protusmjer) (SEQ ID NO:2). Termalni ciklusi bili su 94°C kroz 90 minuta, a zatim 33 ciklusa od 95°C kroz 20 sekundi, 68°C kroz 40 sekundi i 72°C kroz 30 sekundi. PCR produkti su podvrgnuti elektroforezi na 1%-tnom agaroznom gelu te obojeni etidij-bromidom.

Učinak analogona vitamina D3 na klonogeno ispitivanje.

LNCaP stanice, MCF-7 stanice i HL-60 stanice klonirane su u mekanom agaru u prisutnosti analogona vitamina Da na 10-11 do 10-7 M. Konstruirane su krivulje reakcije na dozu te je određena učinkovita doza koja je inhibirala 50% nastanak kolonija (ED50). 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-Da bio je učinkovit u inhibiranju klonalne proliferacije tri stanične linije na način ovisan o dozi. ED50 za 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 bio je 1.4x10-9 M za LNCaP stanice, 4.3x10-9 M za MCF-7 stanice i 3.0x10-11 M za HL-60 stanice, što je 10-100-struko jače nego za 1,25(OH)2D3.

Razine kalcija u serumu in vivo. Zbog toga što je hiperkalcemija glavni negativni učinak spojeva vitamina D3, kalcemijski učinci 1,25(OH)2D3 uspoređeni su s 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-Da. Svi miševi su preživjeli tijekom trotjednog ispitivanja. Miševi koji su dobili 0.1 μg 1,25(OH)2D3 bili su hiperkalcemični s razinama kalcija u serumu od približno 12 mg/dl (normalno 8.5-10.5 mg/dl). Nasuprot tome, miševi koji su dobili 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (0.1-2.0 μg/mišu) imali razine kalcija gotovo jednake (8-10 mg/dl) kao kontrolni miševi (8-9 mg/dl).

Eksperimenti u kojima se primjenjuju pulsne metode. Kako bi se ustanovilo da li je inhibicija klonogene proliferacije analogonima vitamina D3 bila reverzibilna, izvedeni su eksperimenti pulsnim metodama. MCF-7 stanice su različito vrijeme trajanja izložene ili 1,25(OH)2D3 ili 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3, temeljito isprane, stavljene u mekani agar te su 14 dana kulture prebrojene kolonije. Približno četrdeset i trideset posto klonogenih stanica inhibirano je izlaganjem redom 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 po 4 dana.

Analiza staničnog ciklusa. Određen je učinak 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 (10-7, 4 dana) na stanični ciklus MCF-7 stanica. Došlo je do značajnog povećanja (P ≤ 0.05) u broju stanica u G0-G1 fazi staničnog ciklusa te popratnog smanjenja omjera stanica u S fazi.

Elektroforeza na SDS-poliakrilamidnom gelu. Inhibitori kinaze ovisni o ciklinu poznati kao p21wafl i p27kipl mogu inhibirati djelovanje ciklin kinaze te time usporiti rast stanica u staničnom ciklusu. Kontrolne MCF-7 stanice sastavno su imale srednju razinu ekspresije p21wafl i p27kipl, kako je određeno elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu. Izlaganje od jednog dana 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (10-7M) je oko 3.2-3.5 puta povećalo ekspresiju p21wafl i p27kipl, dok je kultura s 1,25(OH)2D3 (10-7M) oko 1.6-1.8 puta smanjila ekspresiju p21wafl i p27kipl. Izlaganje MCF-7 stanica 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 tijekom tri dana rezultiralo je 2.8-strukim i 3.4-strukim povećanjem ekspresije redom p21wafl i p27kipl. Izlaganje 1,25(OH)2D3 (10-7, 3 dana) je 4.8-struko i 3.3-struko povećalo ekspresiju redom p21wafl i p27kipl.

Ispitivan je učinak ovisan o dozi spojeva vitamina D3 na ekspresiju p27kipl HL-60 stanica. I 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 pojačali ekspresiju p27kipl ekspresije, a te razine su značajno povećane nakon inkubacije s 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 (4 dana, 10-9M). Razine p27kipl su se značajno povećale kada su HL-60 stanice uzgajane s 10-8-10-7 M 1,25(OH)2D3.

Djelovanje telomeraze. Učinak 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 (10-9-10-7M) na djelovanje telomeraze vrednovan je TRAP ispitivanjem. Djelovanje telomeraze značajno se smanjilo u HL-60 stanicama koje su uzgajane bilo s 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 10-9M ili 10-7M, 1,25(OH)2D3.

Učinci analogona vitamina D3 na ekspresiju hTERT u HL-60 stanicama vrednovani su primjenom RT-PCR. Oba 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 inhibirala su ekspresiju hTERT mRNA na način ovisan o doze s gotovo potpunom inhibicijom ekspresije na 10-8M 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i 10-7M 1,25(OH)2D3.

Korisno djelovanje spojeva formule I kao sredstava za liječenje benignog rasta prostate može se pokazati sljedećim, u struci poznatim postupcima testiranja.

1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 vrednovan je s obzirom na antiandrogeno djelovanje u kastriranih, testosteronom stimuliranih mužjaka sirijskog hrčka. Ispitivanja su pokazala da su 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 značajno potisnuli hipertrofiju induciranu androgenom sjemenih vrećica i prostate u tih životinja, dok je 1,25(OH)2D3 u netoksičnim dozama (1 μg) bio neaktivan.

Kastriranim mužjacima sirijskog hrčka dnevno je injektirano s.c. s 20 μg testosteron propionata i 1 μg 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 uzastopno 14 dana. Oba spoja su davana u vehiklu od po 0.2 ml sezamovog ulja. 15. dana je obavljena nekropsija. Podaci su analizirani za statističku signifikantnost primjenom Student-ovog testa te su izraženi kao postotak inhibicije stimuliranog odgovora.

Tablica I

Inhibicija rasta prostate i sjemenih vrećica u kastriranih, testosteronom stimuliranih hrčaka

[image] *p<0.001 ;Korisno djelovanje spojeva formule I kao sredstava za liječenje osteoporoze može se pokazati sljedećim, u struci poznatim testnim postupcima. ;Materijali i metode ;Životinje i obrada: ;Korištene su tri mjeseca stare odrasle ženke štakora. Nakon tjedna prilagođavanja životinje su grupirane prema masi te obrađivane oralnim davanjem po 1 ml/kg/dan s različitim koncentracijama 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3. 7. dan doziranja životinjama je uzeta krv te su određene razine kalcija u serumu. ;Pripravljanje spoja: ;Spoj se otopi u 200 proof etanola kako bi se dobila koncentracija od 100 μg/ml. Za dozu najviše koncentracije pripravljena je otopina vehikla sezamovog ulja i etanola, uparena s rotavaporom na 37°C kako bi se uklonio etanol. Volumen doze izračunat je na temelju prosječne tjelesne mase pojedine skupine. Načinjena su serijska razrjeđenja spoja otopljenog u vehiklu do odgovarajućih koncentracija doze. ;Skupljanje seruma i određivanje: ;Uzeta je krv (1.5 ml) iz svake životinje punkturom iz orbite pod anestezijom eterom, 7. dana doziranja. Krv se skuplja u cijevima za odvajanje seruma, centrifugira na 2000 okr/min kroz 15 minuta, a zatim uzme alikvot seruma za određivanje kalcija. Kalcij u serumu određen je kolorimetrijski. ;Rezultati ;Razine kalcija u serumu: ;[image] ;Razine kalcija u serumu bile su unutar normalnog raspona za dozne skupine sve do 2 μg/kg/dan obradom s 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3. ;Materijali i metode ;Životinje i obrada: ;Tri mjeseca stare odrasle ženke štakora podvrgnute su obostranoj ovariektomiji ili sham operaciji. Nakon tjedna prilagodbe, životinje su grupirane prema masi te im je oralno davana određena koncentracija l mg/kg. Volumen doze je proračunat tjedno uzimajući prosječnu tjelesnu masu skupine. Doziranje je počelo 17 dana nakon operacije te se nastavilo 19 dana: 20. dan životinje su eutanizirane udisanjem ugljikova dioksida te su im izrezane lijeve bedrene kosti. ;Ukupni kalcij u bedrenoj kosti: ;Pri nekropsiji izrezane su lijeve bedrene kosti iz svih skupina te je uklonjeno mekano tkivo. Kosti su izvagane te prerezane napola po srednjoj dijafizi; distalni dio je razrezan popola longitudinalno nakon uklanjanja epifize. Koštana srž je isprana, a kalcij je ekstrahiran uranjanjem u 5% TCA. Sadržaj kalcija u TCA ekstraktima određen je kvantitativno, kolorimetrijskim određivanjem kalcija. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ukupnog kalcija u kostima u mg/distalna polovina bedrene kosti (DHF) ± u serumu. ;Skupljanje seruma i određivanje: ;Uzeta je krv (1.5 ml) iz svake životinje orbital punkturom pod anestezijom 7. dana i 18. dana doziranja. Krv se skuplja u cijevima za odvajanje seruma, centrifugira na 2000 okr/min kroz 15 minuta, a zatim uzme alikvot seruma za određivanje kalcija. Kalcij u serumu je određen kolorimetrijski. ;Statistika: ;Za provjeru učinka ovariektomije na kalcij u kostima, sham i ovx vehikl skupine uspoređene su Student-ovim t-testom. Ovx skupine uspoređene su «one-way» analizom varijance (ANOVA), a zatim Fisherovim LSD radi usporedbe svake obrađivane skupine s vehiklom kada je ukupan učinak bio statistički značajan. ;Rezultati ;Učinak na kalcij u bedrenoj kosti podešen za tjelesnu masu ;[image] ;Učinak na razine kalcija u serumu ;[image] ;Prvo je identificirano korisno djelovanje spojeva formule I kao sredstava za liječenje bolesti lojne žlijezde, kako je pokazano sljedećim, u struci poznatim testnim postupcima. ;Dvjesto μl 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans-D3 otopljeno je u propilen glikolu, davano dnevno (5 dana tjedno) šopanjem zlatnim sirijskim hrčcima. Životinje su žrtvovane nakon 4 tjedna, a uši su obrađene za histološku procjenu. Područja lojne žlijezde izmjerena su na histološki pripravljenim poprečnim presjecima uha «image» analizom. ;Rezultati ;[image] ;Također je ispitana ukupna lipidna frakcija iz jednog od ušiju (ekstrakcija organskim otapalom, a zatim vaganje preostalog lipidnog materijala). ;Rezultati ;[image] ;Spojevi formule I se ljudima kojima je takvo liječenje potrebno mogu davati oralno, za liječenje karcinoma dojke, karcinoma prostate ili leukemije. Posebno, spojevi formule I mogu se davati oralno odraslom čovjeku u dozama koje su u rasponu od 1 do 20 μg dnevno za takvo liječenje. ;Spojevi formule I mogu se davati oralno, za liječenje benignog rasta prostate i ćelavosti, ljudima kojima je takvo liječenje potrebno. Posebno, spojevi formule I mogu se davati oralno odraslom čovjeku u dozama koji su u rasponu od 1 do 20 μg dnevno za takvo liječenje. ;Spojevi formule I mogu se davati oralno za liječenje osteoporoze u ljudi, u dozama od oko 1 do 20 μg dnevno. ;Spojevi formule I mogu se nanositi lokalno, za liječenje ćelavosti, ljudima kojima je takvo liječenje potrebno. Posebno, spojevi formule I se za takvo liječenje mogu nanositi lokalno u dozama koje su u rasponu od oko 5 do oko 50 μg lokalne formulacije dnevno. ;Spojevi formule I mogu se davati oralno za liječenje bolesti lojne žlijezde u ljudi u dozama od oko 1 do 20 μg dnevno. ;Oralni oblici doziranja koji sadrže spojeve formule I iz izuma mogu se uključiti u kapsule, tablete i slično s farmaceutski prihvatljivim materijalima kao nosačima. Primjeri farmaceutski prihvatljivih materijala za nosače uključeni u kapsule i slično su sljedeći: vezivo kao što je guma tragacanth, kukuruzni škrob, ili želatina; ekscipijens kao što je dikalcijev fosfat; sredstvo za razgradnju kao što je kukuruzni škrob, krumpirov škrob, algenička kiselina i slično; lubrikant kao što je magnezijev stearat, sladilo kao što je sukroza, laktoza ili saharin; aroma kao što je pepermint, ulje zimzelena ili trešnja. Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao sredstva za presvlačenje ili sredstva kojima se na drugi način modificira fizički oblik doze. Tablete, na primjer, mogu biti presvučene šelakom, šećerom ili oboma. Sirup ili eliksir može sadržavati aktivan sastojak, sukrozu kao sladilo, metil ili propil parabene kao konzervanse, boju, i aromu kao što je aroma naranče ili trešnje. ;Oblici doziranja za površinsko nanošenje koji sadrže spoj formule I iz izuma uključuju: pomasti ili masti koje sadrže formulacije koje imaju uljaste baze, baze koje se mogu apsorbirati, baze topljive u vodi i baze nalik emulziji kao što je petrolat, lanolin, polietilen glikoli i slično. ;Losioni su tekući pripravci koji variraju od jednostavnih otopina do vodenih ili hidroalkoholnih pripravaka koji sadrže sitno podijeljene tvari. Losioni mogu sadržavati sredstva za suspendiranje ili disperziju, na primjer derivate celuloze kao što je etilceluloza, metilceluloza i slično; želatinu ili gume, koji uključuju aktivni sastojak u vehikulu načinjen od vode, alkohola, glicerina i slično. ;Gelovi su polučvrsti pripravci načinjeni želiranjem otopine ili suspenzije aktivnog sastojka u nosaču vehiklu. Vehikli koji mogu biti vodeni ili bezvodni, želiraju se primjenom sredstva za želiranje kao što je karboksi polimetilen, i neutraliziraju u odgovarajuću gela konzistenciju pomoću alkalija, kao što je natrijev hidroksid i amina kao što je polietilenkokoamin. ;Kako se ovdje rabi, pojam «lokalno» označava primjenu aktivnog sastojka, uključenog u odgovarajući farmaceutski nosač, i nanesenog na mjestu upale za poticanje lokalnog djelovanja. Sukladno tome, lokalni pripravci obuhvaćaju one farmaceutske oblike s kojima se spoj nanosi izvana izravnim kontaktom s kožom. Oblici za lokalno doziranje obuhvaćaju gelove, kreme, losione, masti, praške, aerosolove i druge uobičajene oblike za nanošenje lijeka na kožu dobivene miješanjem spoja formule I s poznatim materijalima za farmaceutske nosače za lokalno doziranje. ;Dani su sljedeći Primjeri radi daljnjeg opisa izuma i svrha im nije ograničiti izum na bilo koji način. ;Primjer 1 ;[image] ;(2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-Bis[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-4-metilen-1-oksaspiro[2,5]oktan-2-metanol-acetat ;Magnetskom miješalicom promiješanoj otopini od 18.5 g (0.0523 mol) (2R,3S,5S,7S)-5-hidroksi-4-metilen-7[(1,1-dimetiletil)dimetilsililoksi]-1-oksaspiro[2,5]oktan-2-metanol-acetata (Y.Kiegiel, P.M. Wovkulich i M.R. Uskokovic, Tetrahedron Letters, 32, str. 6057-6060 (1991)) i 6.8 g (0.099 mol) imidazola u 50 ml dimetilformamida, u atmosferi argona, doda se 9.8 g (0.065 mol) t-butildimetilsililklorida. Reakcijska smjesa se miješa 5 sati, zaustavi s 5 ml vode, miješa 30 min te izlije u 400 ml vode, a zatim se ekstrahira s 2x500 ml heksana i 2x500 ml etera. Organski slojevi se kombiniraju, isperu s 300 ml vode, isuše s Na2SO4 te upari. Kromatografijom na koloni silikagela dobije se 22.31 g (92%) spoja iz naslova kao bezbojnog ulja. ;Primjer 2 ;[image] ;[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]etanol-acetat ;Tikvica s 3 grla od 3 l opremljena s umetkom za argon, magnetskom miješalicom i termometrom se napuni s 500 ml tetrahidrofurana te ohladi na -60°C u kupelji aceton-suhi led. Održavajući temperaturu na -60°C, u obrocima se doda 43.23 g (0.108 mol) bezvodnog tungsten heksaklorida, a zatim se, održavajući temperaturu ispod -45°C (oko 5 min), brzo doda kap po kap 200 ml 1.6 M n-butillitija u heksanu. Kupelj aceton-suhi led se zamijeni s ledenom kupelji puštajući da temperatura dosegne 5°C. Došlo je do promjene u boji od plave preko khaki do crvenkasto-crne. Nakon 30 min na 5°C, brzo se, preko 3 minute, dodaje kap po kap otopine od 22.31 g (0.04884 mol) (2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-4-metilen-1-oksaspiro[2,5]oktan-2-metanol-acetat u 50 ml heksana. Nakon 4 sata, reakcijska smjesa se razrijedi s 2 litre heksana, profiltrira preko silikagela, koji je ispran s 3x500 ml heksan-etilacetata 9:1 te upari. Talog se kromatografira na koloni 75 g silikagela dajući 22.56 g sirovog produkta. Kromatografijom uz srednji tlak na koloni silikagela te eluiranjem sa smjesom 100:1 diklorometan-etil-acetata dobije se 17.42 g (80.1%) spoja iz naslova i mala količina odgovarajućeg 1Z epimera. ;Primjer 3 ;[image] ;[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]-etanolacetat (E-dien) i ;[3S-(1Z,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]-etanolacetat (Z-dien) ;U 465 ml bezvodnog THF na -78°C se miješajući doda 64.3 g (160 mmol) WCl6 (plava otopina), a zatim 337.5 ml 1.43 M n-BuLi u heksanu (takvom brzinom da unutrašnja temperatura ne poraste iznad -20°C). Smjesa se zatim zagrije na sobnu temperaturu. Doda se kap po kap otopine od 24.5 g (53.6 mmol) (2S,3R,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-4-metilen-1-oksaspiro-[2,5]oktan-2-metanol-acetat u 65 ml THF te se smjesa miješa 4 h. Smjesa se razrijedi s 600 ml pentana i profiltrira kroz sloj silikagela debljine 4 cm, ispirući s heksan/EtOAc (19:1), dajući nakon uparavanja volatila pod smanjenim tlakom, 27 g sirove smjese diena. Daljnjim pročišćavanjem kromatografijom eluirajući s heksan/EtOAc (25:1) dobije se 21.6 g (91%) smjese diena 2:3 Z/E (spojevi iz naslova) koji se mogu razdvojiti kromatografijom preko silikagela (heksan/EtOAc 40:1). ;Z dien 1H NMR σ 0.052 (s, 6H), 0.06 (s, 6H) 0.87 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.74-1.90 (m, 2H), 2.04 (s, 3H), 2.20 (dd, J=6.0, 12.8 Hz, 1H), 2.41 (d, J=11.1 Hz, 1H) 4.19 (m, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.61 (dd, J=7.3, 12.1 Hz, 1H), 4.68 (dd, J=7.3, 12.1 Hz, 1H), 4.80 (s, 1H), 5.20 (s, 1H), 5.47 (t, J=7.2 Hz, 1H). ;[α]D25=+1.2° (c=0.4, EtOH). Izračunato na C23H44O4Si2: C, 62.27; H, 10.01; pronađeno: C, 62.55, H, 10.33. ;E dien 1H NMR σ 0.046 (s, 3H), 0.057 (s, 3H) 0.065 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.77 (ddd, J=3.1, 9.4, 11.9 Hz, 1H), 1.89 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.31 (dd, J=2.0, 15.2 Hz, 1H), 2.39 (dd, J=6.3, 15.2 Hz, 1H), 4.21 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.58 (dd, J=7.2, 12.9 Hz, 1H), 4.65 (dd, J=7.2, 12.9 Hz, 1H), 4.95 (s, 1H), 4.99 (s, 1H), 5.69 (t, J=7 .2 Hz, 1H). [α]D25=+8.0° (c=0.5, EtOH). Izračunato na C23H44O4Si2: C, 62.27; H, 10.06; pronađeno: C, 62.42, H, 10.01. ;Primjer 4 ;[image] ;[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]-etanol ;Magnetskom miješalicom promiješanoj otopini od 10.84 g (0.0246 mol) [3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]-etanol-acetata u 100 ml metanola, u atmosferi argona, doda se 3.5 g natrijevog hidroksida u obliku tableta te se reakcijska smjesa miješa u atmosferi argona 3 sata. Zatim se upari u reakcijskoj smjesi pod smanjenim tlakom na volumen 50 ml, razrijedi s 500 ml vode, ekstrahira s 2x500 ml 1:1 heksan-etera. Organski sloj se dvaput ispere s vodom, isuši s Na2SO4 te upari. Dobije se 9.80 g (100%) spoja iz naslova kao bijela krutina. ;Primjer 5 ;[image] ;1R-(1α,3β,5E)-[[-2-Kloroetiliden)-4-metilen-1,3-cikloheksandiil]bis(oksi)]bis(1,1-dimetiletil)dimetilsilan ;Promiješanoj otopini od 6.67 g (0.050 mol) N-klorosukcinimida u 150 ml diklorometana u atmosferi argona, ohlađenoj na 2°C u kupelji aceton-led se dodaje kap po kap preko 2 minute 4 ml (0.055 mol) dimetilsulfida. Oblikuje se bijeli talog. Nakon 30 minuta na 0°C, kupelj se zamijeni s kupelji aceton-suhi led te se temperatura reakcijske smjese podesi na -20°C. Doda se otopina od 9.8 g (0.0246 mol) [3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilen-cikloheksiliden]-etanola u 60 ml diklorometana. Nakon 15 minuta, ukloni se kupelj za hlađenje te se reakcijska smjesa miješa 50 minuta, a zatim prenese u lijevak za odjeljivanje koji sadrži 500 ml vode. Ekstrahira se s 2x350 ml heksana. Organski sloj se dvaput ispere s 500 ml vode, isuši s natrijevim sulfatom te upari dajući 10.49 g sirovog produkta kao žute tekućine. Pročišćavanjem flash kromatografijom dobije se čisti spoj iz naslova kao bezbojno ulje. NMR (CDCl3): σ 0.03 (s, 3H), 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 6H), 0.87 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.70-1.94 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 4.13 (m, 2H), 4.28 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 5.00 (m, 1H), 5.03 (m, 1H), 5.78 (trn, J=8 Hz, 1H). ;Primjer 6 ;[image] ;[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]etil]difenilfosfin-oksid ;1 litarska tikvica s 3 grla s umetkom za argon, termometrom i mehaničkom miješalicom se napuni s otopinom od 10.26 g (0.0246 mol) 1R-(1α,3β,5E)-[[-2-Kloroetiliden)-4-metilen-1,3-cikloheksandiil]bis(oksi)]bis(1,1-dimetiletil)dimetilsilanau 100 ml svježe destiliranog bezvodnog tetrahidrofurana te ohladi na -65°C u kupelji aceton-suhi led. 30 minuta se dodaje 60 ml 0.5 M kalijevog difenilfosfida u tetrahidrofuranu dok se ne postigne postojana crvena boja. Nakon l h miješanja na -65°C doda se 10 ml vode, a kupelj za hlađenje se ukloni. Reakcijskokj smjesi se ukloni boja, a zatim se brzo doda 200 ml diklorometana te 200 ml vodene otopine koja sadrži 10 ml 30%-tnog vodikovog peroksida. Nakon l sat doda se 13.5 g natrijevog sulfita, 100 ml luga i 200 ml diklorometana. Nakon što se smjesa temeljito protrese, faze se odvoje, a vodena faza se ispere s 200 ml diklorometana. Organska faza se ispere s 200 ml luga. Kombinirani organski slojevi se isuše s natrijevim sulfatom, profiltriraju te upare dajući 16.33 g sirovog produkta. Sirovi produkt se pročisti kromatografijom uz srednji tlak (silikagel G-60) dajući 12.54 g (87%) spoja iz naslova kao bijele kristale. NMR (CDCl3): σ 0.02 (s, 3H), 0.07 (s, 6H), 0.08 (s, 3H), 0.84 (s, 18H), 1.76 (m, 2H), 2.98-3.15 (m, 2H), 4.06 (m, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.79 (m, 1H), 7.45 (m, 6H), 7.72 (m, 4H). ;Primjer 7 ;[image] ;Metil-ester E-(3S,5R)-[3,5-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloksi)-2-metilencikloheksiliden]octene kiseline (Ro 65-8821) ;Otopina od 4.45 g (0.01043 mol) metil-estera Z-(3S,5R)-[3,5-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloksi)-2-metilen-cikloheksiliden]-octene kiseline (X) (A. Mowrino, et al., Tetrahedron Letters, 38, str. 4713-4716 (1997)) u 100 ml heksana se ozračuje s UV-svjetiljkom 3 sata. Uparavanjem se dobije 4.25 g (95.5%) spoja iz naslova kao bezbojnog ulja. NMR (CDCl3): σ 0.06 (s, 3H), 0.07 (s, 9H), 0.85 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 1.76 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 3.36 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 4.26 (m, 1H), 4.58 (m, 1H), 5.07 (m, 2H), 5.91 (brs, 1H). ;Primjer 8 ;[image] ;[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]etanol ;Otopini od 4.25 g (0.00996 mol) metil-estera E-(3S,5R)-[3,5-bis-(tert-butil-dimetil-silaniloksi)-2-metilencikloheksiliden]octene kiseline u 100 ml toluena na -78°C se doda kap po kap 25 ml 1.2 M diizobutilaluminijevog hidrida (0.03 mol) te se reakcijska smjesa miješa l sat. Nakon dodavanja 5 ml metanola, reakcijska smjesa se ugrije na sobnu temperaturu, a zatim se razrijedi s 150 ml 2M vodene otopine kalij-natrij tartrata te snažno miješa. Organska faza se odvoji, isuši s natrijevim sulfatom te upari do suhog. Sirovi produkt se pročisti flash kromatografijom s heksan-etil-acetatom, 8:2, dajući 2.8 g (70%) spoja iz naslova kao bezbojne, voštane krutine. NMR (CDCl3): σ 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.91 (s, 9H), 1.74 (m, 1H), 2.06 (m, 1H), 2.26 (dm, J=13.6 Hz, 1H), 2.40 (dd, J=13.6, 5.2, 1H), 4.30-4.11 (m, 3H), 4.53 (m, 1H), 4.98 (m, 1H), 5.00 (m, 1H), 5.80 (trn, J=7 Hz, 1H). ;Primjer 9 ;1,25-Dihidroksi-16-en-5,6-trans-kolekalciferol ;Promiješana otopina od 796 mg (0.00137 mol) [3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-2-metilen cikloheksiliden]etil]difenilfosfin-oksida u 10 ml bezvodnog tetrahidrofurana na -78°C se kap po kap obrađuje s 0.83 ml (0.00133 mol) 1.6M n-butillitija u heksanu u atmosferi argona. Tako dobivenoj crvenoj otopini se dodaje kap po kap otopine od 280 mg (0.000803 mol) [3aR-[1(R*),3aα,7aβ]]-1-[1,5-dimetil-5-[(trimetilsilil)oksi]heksil]-3,3a,5,6,7,7a-heksahidro-7a-metil-4H-inden-4-on u 5 ml tetrahidrofurana preko 10 minuta u atmosferi argona. Reakcijska smjesa se miješa na -78°C 90 minuta, a zatim se reakcija zaustavi dodatkom 40 ml 1:1 Rochelle-ove soli i 2 N KHCO3 te ugrije na sobnu temperaturu. Ekstrahira se s 3x100 ml etil-acetata. Organski slojevi se isperu s 3x vodom/lugom, isuše s natrijevim sulfatom te upare do suhog. Taj sirovi produkt se pročisti flash kromatografijom na 40 mm x 6" koloni silikagela s heksan-etil-acetatom, 40:1, dajući 278 mg trisiliranog spoja iz naslova i 140 mg početnog ketona.

Otopina od 278 mg (0.000389 mol) trisiliranog intermedijara u 8 ml bezvodnog tetrahidrofurana se obrađuje s 1.9 (1.9 mmol) 1 M tetrabutil-amonijevog fluorida u tetrahidrofuranu u atmosferi argona 17 sati. Reakcija se zaustavi s 6 ml vode te miješa 30 minuta. Nakon uparavanja tetrahidrofurana u vakuumu, preostala otopina se ekstrahira s 3x100 ml etil-acetata. Organski slojevi se isperu s 4x vodom/lugom, isuše s natrijevim sulfatom te upare do suhog. Sirovi produkt, 192 mg, se pročisti flash kromatografijom na koloni silikagela, koja je prethodno isprana s 1%-tnom otopinom trietilamin:etil-acetata (300 ml); eluens je etil-acetat. Time se dobije 152 mg kristalnog spoja iz naslova. Uzorak prekristalizira iz tetrahidrofurana: metilformat (0.3:7) s tt 95-100°C. [α]D25 + 160.5° (EtOH, c=0.20). λmax 272/3nm (e 20600).

Primjer 10

Kapsula od mekane želatine Formulacija I

[image]

Postupak proizvodnje:

1. Suspendirati BHT i BHA u Migliolu 812. Zagrijavati na oko 50°C te miješati dok se ne otopi.

2. Otopiti 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans D3 u otopini iz koraka 1 na 50°C.

3. Ohladiti otopinu iz koraka 2 na sobnu temperaturu.

4. Puniti otopinu iz koraka 3 u kapsule od mekane želatine.

Opaska: Sve korake proizvodnje izvoditi u atmosferi dušika i zaštititi od svjetla.

Primjer 11

Kapsula od mekane želatine Formulacija II

[image]

Postupak proizvodnje:

1. Suspendirati di-α-Tokoferol u Migliolu 812. Zagrijavati na oko 50°C te miješati dok se ne otopi.

2. Otopiti 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans D3 u otopini iz koraka l na 50°C.

3. Ohladiti otopinu iz koraka 2 na sobnu temperaturu.

4. Puniti otopinu iz koraka 3 u kapsule od mekane želatine.

[image]

Claims

1. Spoj formule [image] naznačen time, da je R1 vodik ili alkilna skupina; R2 vodik ili alkilna skupina; ili R1,R2 i C20 zajedno predstavljaju ciklopropil; A [image] R3 alkil, hidroksialkil ili fluoroalkil; i R4 alkil, hidroksialkil ili fluoroalkil.

2. Spoj u skladu sa zahtjevom 1, naznačen time, da je R1 vodik, a R2 je alkil ili R1 je alkil, a R2 je vodik.

3. Spoj u skladu sa zahtjevom 2, naznačen time, da je R1 vodik, a R2 je metil ili R1 je metil, a R2 je vodik.

4. Spoj u skladu sa zahtjevom 3, naznačen time, da su R3 i R4 nezavisno alkil, hidroksialkil ili trifluoroalkil.

5. Spoj u skladu sa zahtjevom 4, naznačen time, da su R3 i R4 nezavisno metil, hidroksimetil ili trifluorometil.

6. Spoj u skladu sa zahtjevom 5, naznačen time, da je A [image]

7. Spoj u skladu sa zahtjevom 6, naznačen time, da je 1,25-dihidroksi-16-en-5,6-trans-kolekalciferol.