MX2011003144A

MX2011003144A - Aptamero para factor de crecimiento de nervio y uso del mismo.

Info

Publication number: MX2011003144A
Application number: MX2011003144A
Authority: MX
Inventors: Ling Jin; Masatoshi Fujiwara; Shin Miyakawa; Yoshikazu Nakamura; Hisanao Hiramatsu
Original assignee: Ribomic Inc
Priority date: 2008-09-24
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-05-19
Also published as: BRPI0919268A8; IL211929A0; ZA201102682B; EP2354225B1; US20110251266A1; CA2738129A1; RU2011116175A; JP5602020B2; BRPI0919268B8; EP2354225A9; US10260070B2; EP2354225A4; CN102171339B; CN102171339A; BRPI0919268A2; ES2543222T3; AU2009297626A1; EP2354225A1; KR101694559B1; DK2354225T3

Abstract

Se provee un aptámero que tiene una actividad inhibidora contra NGF; un complejo que contiene un aptámero que tiene una actividad de unión o actividad inhibidora contra NGF y una sustancia funcional (v.gr., sustancias de afinidad, sustancias de marcaje, enzimas, vehículos de suministro de fármaco, fármacos y similares); un medicamento, un agente de diagnóstico, un agente de marcaje y similares que contienen un aptámero que tiene una actividad de unión o actividad inhibidora contra NGF, o un complejo que contiene el aptámero y la sustancia funcional; y similares.

Description

APTÁMERO PARA FACTOR DE CRECIMIENTO DE NERVIO Y USO DEL MISMO CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un aptámero para NGF, un método para utilizar el mismo y similares.

TÉCNICA DE ANTECEDENTE El factor de crecimiento de nervio (NGF) es la primera neurotrofina identificada en 1951, y es una proteína secretora importante implicada en el desarrollo y supervivencia de neuronas periféricas y superficiales. Consiste de 118 aminoácidos, tiene un peso molecular de 13 kDa, y tiene enlaces S-S en tres posiciones en una molécula. BDNF, NT-3 and NT-4/5 están presentes en la familia de proteína que son estructural mente bien conservadas y forman un homodimero por un enlace no covalente. Tiene una estructura de lamina ß que está de frente a tres direcciones diferentes, y se considera que es dimerizada en esta parte. También tiene cuatro estructuras de bucle con homología baja entre familias, y se considera que estas partes definen especificidad a receptores.

Como receptores de NGF, el receptor de tipo tirosina cinasa TrkA con alta afinidad y p75 con baja afinidad que pertenece a una superfamilia de receptor de factor de necrosis tumoral son conocidos. Estos receptores actúan como un homodímero o hetereodímero y están profundamente implicados en el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso. TrkA es un receptor de transmembrana de un solo paso y tiene una sola estructura de tirosina cinasa en el dominio intracelular. Cuando se une NGF, o cuando ocurre fosforilación de tirosina, la señal es transmitida corriente abajo y ocurre promoción de diferenciación y mantenimiento de supervivencia de la célula.

Como receptores de familia de TrkA se conocen TrkB y TrkC. TrkB se une a BDNF y NT-4/5, y TrkC se une a NT-3. p75 muestra especificidad de ligando más baja en comparación con TrkA que también se une a BDNF, NT-3 y NT-4/5 además de NGF. Aunque p75 es un receptor de transmembrana de un solo paso, no tiene un dominio de tirosina cinasa en el lado citoplásmico. Igual que TrkA, se expresa no sólo en células nerviosas sino también en células no nerviosas. Se sabe que este receptor está implicado en la promoción de diferenciación y mantenimiento de supervivencia de la célula, y también está relacionado con la inducción de apoptosis y migración celular. Los resultados de análisis de estructura de cristal han sugerido que un homodímero de NGF se una a TrkA a 2:2 y a p75 a 2:1. Un homodímero de NGF algunas veces se une a un heterodímero de TrkA y p75.

NGF es producida por células de Schwann, células queratinizadas, células epiteliales bronquiales, fibroblastos, linfocitos T, macrófagos, células cebadas, linfocitos B, queratinocitos, células de músculo lizo, células glomerulares renales, células del músculo esquelético y similares. Por otra parte, se sabe que TrkA es expresado en las células nerviosas, asi como monocitos, linfocitos T, linfocitos B y células cebadas distintas de las células nerviosas. De manera similar, p75 se expresa en células nerviosas así como en células no nerviosas.

Es bien sabido que NGF juega un papel clave en el sistema nervioso. Se ha esclarecido que NGF tiene una acción para mantener la supervivencia de neuronas colinérgicas y se considera que está relacionado de alguna forma con enfermedad de Alzheimer. Además, puesto que la administración intracerebral de NGF mejora los trastornos de memoria de ratas viejas, también es esperado como un fármaco terapéutico para demencia senil.

Se ha encontrado que NGF también actúa sobre los tejidos y células del sistema nervioso, y está implicado en la defensa del cuerpo y procesos de reparación de tejido. Por ejemplo, se sabe que la administración de NGF a un animal incrementa la permeabilidad de vasos sanguíneos, mejora las respuestas inmunológicas de células T y células B, induce diferenciación de linfocitos, induce crecimiento de células cebadas, induce liberación de varias citocinas a partir de células cebadas y similares.

NGF está relacionado con inflamación, y expresión incrementada de NGF se ha observado en pacientes con enfermedades inflamatorias y modelos animales inflamatorios. Lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis, cistitis intersticial, asma y similares, son ejemplos de las mismas. Se ha reportado que el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide muestra concentración de NGF más alta. Además, se ha reportado la expresión de NGF incrementada en ratas modelo con artritis reumatoide, y el incremento en células cebadas y la expresión de NGF incrementada en ratón modelo con artritis.

NGF está profundamente implicado en dolor. Cuando NGF se administra subcutáneamente a humanos, un dolor profundo tal como dolor muscular continúa por varios días, y la hiperalgesia del sitio de inyección ocurre. El ratón knockout para NGF y ratón knockout para TrkA carece de nervio no mielinado y no siente dolor. Cuando NGF se administra intraperitonealmente a 1 mg/kg a una rata madura, ocurre hiperalgesia contra calor nocivo y estímulos mecánicos. El ratón transgénico para NGF muestra hiperalgesia no acompañada por condiciones inflamatorias. Además, se sabe que el gen de TrkA de pacientes con insensibilidad congénita al dolor con anhidrosis (CIPA) tiene anormalidad y la sensación al dolor disminuye cuando el gen NGF tiene anormalidad.

A partir de lo anterior, un inhibidor de NGF se puede usar como un fármaco terapéutico para dolor tal como dolor nociceptivo, dolor inflamatorio, dolor neuropático, carcinomatoso, dolor de fibromialgia y similares. Una terapia de combinación de anticuerpo de NGF y NSAID (WO04/073653), una terapia de combinación de anticuerpo NGF y analgésico opioide (WO04/096122), un método de tratamiento de dolor post-quirúrgico que usa un anticuerpo NGF (WO04/032870, WO05/000194), un método de tratamiento de dolor de cáncer de hueso que usa un anticuerpo NGF (WO05/1 11077), y un método de tratamiento de dolor de osteoartritis que usa un anticuerpo NGF (WO06/ 10883) se han reportado.

Tanezumab (PF-43831 19 o RN624) es un anticuerpo contra NGF, muestra efecto en experimento de dolor usando un modelo animal de osteoartritis, y está actualmente bajo ensayo clínico. Aunque se desconoce la presencia o ausencia de actividad inhibidora de NGF y receptor de NGF, existe un reporte relacionado con ARN natural que se une a NGF (documento que no es patente 1 ).

En años recientes, aplicaciones de aptámeros de ARN a medicamentos, agentes de diagnóstico, y fármacos de prueba han atraído la atención; algunos aptámeros de ARN ya han estado en una etapa de estudio clínico o en uso práctico. En diciembre del 2004, el primer fármaco de aptámero de ARN a nivel mundial, Macugen, fue aprobado como un fármaco terapéutico para degeneración macular relacionada con la edad en los Estados Unidos. Un aptámero de ARN se refiere a un ARN que se une específicamente a una molécula objetivo tal como una proteína, y se puede preparar usando el método de SELEX (Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Potencial) (referencias de patentes 1-3). En el método de SELEX, un ARN que se une específicamente a una molécula objetivo se selecciona de un acervo de ARN con aproximadamente 1014 secuencias de nucleótidos diferentes. La estructura de ARN usada tiene una secuencia aleatoria de aproximadamente 40 residuos, que es flanqueada por secuencias de iniciador. Este acervo de ARN se deja ensamblar con una sustancia objetivo, y solo el ARN que se ha unido a la sustancia objetivo es colectada usando un filtro y similares. El ARN colectado es amplificado por RT-PCR, y este se usa como una plantilla para la siguiente ronda. Al repetir esta operación aproximadamente 10 veces, un aptámero de ARN que se une específicamente a la sustancia objetivo se puede adquirir.

Los fármacos de aptámero, como fármacos de anticuerpo, pueden dirigir factores extracelulares. Con referencia a muchos documentos científicos y otros materiales de referencia en el dominio público, se juzga que los fármacos de aptámero exceden potencialmente a los fármacos de anticuerpos en algunos aspectos. Por ejemplo, los aptámeros a menudo muestran fuerza de unión más alta y especificidad más alta que los anticuerpos. Los aptámeros es poco probable que sufran inmuno-eliminación, y reacciones adversas características de los anticuerpos, tales como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), es probable que ocurran con el uso de aptámeros. Desde el aspecto de suministro, puesto que los aptámeros son aproximadamente 1/10 del anticuerpo ep tamaño, el suministro de un fármaco al sitio objetivo es más fácil. Puesto que los aptámeros son producidos por síntesis química, varias modificaciones se pueden hacer fácilmente, la reducción de costo por producción a gran escala es posible. Mientras tanto, las vidas medias en la sangre de los aptámeros son generalmente más cortas que la de los anticuerpos; sin embargo, esta propiedad es algunas veces ventajosa en vista de toxicidad. Este hecho conduce a la conclusión de que incluso cuando la misma molécula es dirigida, los fármacos de aptámero exceden potencialmente a los fármacos de anticuerpo.

Lista de Documentos Documentos de patente Documento de patente 1: WO91/19813 Documento de patente 2: WO94/08050 Documento de patente 3: WO95/07364 Documento que no es patente Documento que no es patente 1 : Binkley J et al., (1995) Nucleic Acids Res, 23, 3198-3205 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problemas que han de ser resueltos por la invención La presente invención está dirigida a proveer un aptámero para NGF y un método para utilizar el mismo, y similares Medios para resolver los problemas Los inventores de la presente investigaron diligentemente resolver el problema descrito anteriormente y tener éxito en la preparación de un aptámero de buena calidad para NGF, que dio por resultado la conclusión de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención provee lo siguiente: [1] Un aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF y un NGF receptor de NGF; [2] Un aptámero que se une a NGF e inhibe una actividad de crecimiento de neuritas de NGF; [3] El aptámero de conformidad con [2], que tiene un 50% de concentración inhibidora (CI50) de no más de 100 nM; [4] El aptámero de conformidad con [2], que tiene un 50% de concentración inhibidora (CI50) de no más de 10 nM; [5] El aptámero de conformidad con cualquiera de [1] a [4], en donde por lo menos un nucleótido es modificado; [6] El aptámero de conformidad con cualquiera de [1] a [4], que comprende una secuencia mostrada por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106), en donde N es cualquier nucleótido, H es un nucleótido excluyendo G, Y es un nucleótido de pirimidina, y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado; [7] El aptámero de conformidad con cualquiera de [1] a [4], que comprende una secuencia mostrada por UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) o AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109), en donde N es cualquier nucleótido, Y es un nucleótido de pirimidina y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado; [8] El aptámero de conformidad con cualquiera de [1] a [4], que comprende una secuencia mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111 ), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112) o CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113), en donde Y es un nucleótido de pirimidina y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado; [9] El aptámero de conformidad con cualquiera de [5] a [8], en donde los grupos hidroxilo en la posición 2' de una ribosa de nucleótidos de pirimidina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi; [10] El aptámero de conformidad con cualquiera de [5] a [8], en donde los grupos hidroxilo en la posición 2' de una ribosa de nucleótidos de purina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi; [11] El aptámero de conformidad con [1], que comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos (a), (b) y (c) siguientes: (a) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina); (b) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina), en donde 1 o varios nucleótidos son reemplazados, deletados, insertados o añadidos; y (c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 70% o más a una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina); [12] El aptámero de conformidad con [11], en donde por lo menos uno de los nucleótidos ha sido modificado; [13] El aptámero de conformidad con [12], en donde los grupos hidroxilo en la posición 2' de nucleótidos de pirimidina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi; [14] El aptámero de conformidad con [12], en donde los grupos hidroxilo en la posición 2' de nucleótidos de purina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi; [15] Un complejo que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] y una sustancia funcional; [16] El complejo de conformidad con [15], en donde la sustancia funcional es una sustancia de alta afinidad, una sustancia de mareaje, una enzima, un vehículo de suministro de fármaco o un fármaco; [17] Un medicamento que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [18] Un agente anti-dolor que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [19] Un agente anti-inflamatorio que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [20] Un agente de diagnóstico que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [21] Una sonda para detección de NGF, que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [22] Un vehículo de fase sólida para purificación de NGF, que comprende el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [23] Un método de detección de NGF, que comprende usar el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [24] Un método de purificación de NGF, que comprende usar el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16]; [25] Un método de tratamiento o prevención de una enfermedad que acompaña un dolor o inflamación, que comprende administrar el aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16] a un sujeto que necesita el mismo; [26] El uso del aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16] para un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad que acompaña un dolor o inflamación; [27] El uso del aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16] para usarse como un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad que acompaña un dolor o inflamación; [28] El uso del aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16] para usarse como un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad que acompaña un dolor o inflamación; [29] El uso del aptámero de cualquiera de [1] a [14] o el complejo de [15] o [16] para la producción de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad que acompaña un dolor o inflamación.

Efecto de la Invención El aptámero y el complejo de la presente invención pueden ser útiles como medicamentos, agentes de diagnóstico o reactivos para enfermedades tales como dolor, enfermedad inflamatoria y similares. El aptámero y el complejo de la presente invención también pueden ser útiles para la purificación y concentración de NGF, así como detección y cuantificación de NGF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 1 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 2 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 2 predicha por el programa MFOLD.

La figura 3 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 3 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 4 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 4 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 5 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 5 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 6 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 7 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 7 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 8 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 8 predicha por el programa MFOLD.

La figura 9 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 9 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 10a muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 12 predicha por el programa MFOLD.

La figura 10b muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 12 predicha por el programa MFOLD.

La figura 11 es un sensograma que muestra que el aptámero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 se une a NGF humano, en donde 40N es un ARN que contiene una secuencia aleatoria con 40 nucleótidos. Usando, como un ligando, Apt o 40N como un control negativo, y NGF humano como un analito, la medición fue realizada por BIAcore2000 fabricado por BIAcore.

La figura 12 es un diagrama que muestra que el aptámero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 inhibe la unión de NGF humano y receptor de TrkA humano, en donde 40N es un ARN que contiene una secuencia aleatoria con 40 nucleótidos. Usando TrkA como un ligando, una mezcla de NGF y Apt como un analito, NGF solo como un control negativo, y una mezcla de NGF y 40N, la medición fue realizada por BIAcore2000 fabricado por BIAcore.

La figura 13 es un diagrama que muestra que el aptámero (Apt) mostrado por SEQ ID NO: 6 inhibe la unión de human NGF y human P75 receptor, en donde 40N es un ARN que contiene una secuencia aleatoria con 40 nucleótidos. Usando TrkA como un ligando, una mezcla de NGF y Apt como un analito, NGF solo como un control negativo, y una mezcla de NGF y 40N, la medición fue realizada por BIAcore2000 fabricado por BIAcore.

La figura 14 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 31 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

La figura 15 muestra la estructura secundaria del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 36 predicha por el programa MFOLD, en donde la parte encerrada en círculo negro muestra una secuencia de consenso.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES La presente invención provee un aptámero que tiene una actividad de unión a NGF. El aptámero de la presente invención se une a NGF y puede inhibir la actividad de NGF al inhibir la unión de NGF y receptor de NGF.

Un aptámero se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una afinidad de unión para una molécula objetivo particular. El aptámero puede inhibir la actividad de una molécula objetivo particular al unirse a la molécula objetivo particular. El aptámero de la presente invención puede ser un ARN, un ADN, un ácido nucleico modificado o una mezcla de los mismos. El aptámero de la presente invención también puede estar en forma lineal o circular.

NGF es una neurotrofina conocida, y es una proteína secretora importante implicada en el desarrollo y supervivencia de neuronas periféricas y centrales. NGF es una abreviatura de factor de crecimiento de nervio. En la presente invención, NGF particularmente significa un NGF de tipo ß. Las secuencias de aminoácidos de ß-NGF humanos son aquellas mostradas por los números de acceso NP002497, P01138, AAI26151 , AAI26149 y CAB75625, que también pueden ser uno con mutación, su dominio o péptido. Puede ser no sólo un monómero sino también un dímero o multímero.

El aptámero de la presente invención se une a NGF en un regulador de pH fisiológico (por ejemplo, solución A: véase ejemplo 1). El aptámero de la presente invención se une a NGF a una intensidad detectabe por la siguiente prueba.

Para la medición, se usa BIAcore2000 fabricada por BIAcore. Un aptámero es inmovilizado sobre un chip sensor. La cantidad que ha de ser inmovilizada se fija a 1000RU. Un regulador de pH fisiológico que contiene NaCI 0.3M (solución A: véase ejemplo 1) se usa para preparar solución de NGF (0.5 µ?). Esta solución de NGF (20 µ?) es inyectada y la unión de NGF al aptámero es detectada. Usando ARN que contiene una secuencia de nucleótido aleatoria que consiste de 40 nucleótidos como un control negativo, cuando NGF se une fuertemente de manera significativa al aptámero en comparación con el ARN de control, el aptámero se evalúa que tiene capacidad de unión a NGF.

El aptámero de la presente invención inhibe la actividad de NGF al unirse a NGF e inhibir la unión de NGF y receptor de NGF. En la presente especificación, la "actividad inhibidora contra NGF" significa una capacidad inhibidora sobre cualquier actividad que tenga NGF. Por ejemplo, significa una actividad para inhibir NGF a partir de la unión a receptor de NGF.

Además, ejemplos de otra "actividad inhibidora contra NGF" incluyen la inhibición de transduccion de señal corriente abajo del receptor de NGF (vía de Ras-MAP cinasa, vía de PI3 cinasa), inhibición de expresión incrementada de TRPV1 , SP, BDNF y similares, actividad inhibidora de expresión de HA, BK, PG, NGF y otras citocinas liberadas de las células cebadas, etc. y similares, que resultan de la unión de NGF a receptor de NGF.

Además, la diferenciación de células nerviosas inducidas por NGF, incremento de supervivencia, crecimiento de neuritas y permeabilidad de vasos sanguíneos, incremento de respuesta inmunológica de células T y células B, diferenciación de linfocitos, inhibición de crecimiento y similares de varias células tales como células cebadas, células eritroleucémicas, células cancerosas y similares, alivio de dolor, hiperalgesia y similares se pueden mencionar.

La "actividad inhibidora contra NGF" preferible que el aptámero de la presente invención tiene es una actividad para inhibir la unión de NGF a receptor de NGF, y una actividad para unir actividad de crecimiento de neuritas inducida por NGF.

En la presente especificación, el "receptor de NGF" significa una proteína de superficie celular a la cual se une NGF. Como receptor de NGF se conocen TrkA y p75. El receptor de NGF referido en la presente invención puede ser una proteína que contenga una secuencia de aminoácidos natural o una variante de la misma. Aquí, la "variante de la misma" significa una proteína o péptido en donde varios aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de "receptor de NGF" ha sido reemplazada o una secuencia de aminoácidos parcial de la misma, que tiene una actividad de unión a NGF e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF.

El aptámero de la presente invención se une a NGF e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF. El que el aptámero inhiba o no la unión de NGF a receptor de NGF se pude evaluar por la siguiente prueba.

Para la medición, se usa BIAcore2000 fabricado por BIAcore. En un chip sensor CM5 es inmovilizada una proteína de fusión de receptor de NGF y Fe (v.gr., Trk A-Fc (175-TK, R&D systems)) o p75-Fc (R&D systems)). La cantidad que ha de ser inmovilizada es 1100RU. NGF (0.1 µ?) y un aptámero (0.33 µ?) se mezclan en un regulador de pH fisiológico (solución A: véase ejemplo 1), y la mezcla se prepara durante 30 min. Esta mezcla (20 µ?_) es inyectada, y la unión de NGF a receptor de NGF es detectada. Cuando la actividad inhibidora (%) no es menor que 60%, el aptámero se evalúa para inhibir la unión de NGF a receptor de NGF. La actividad inhibidora (%) se calcula con la cantidad de unión de NGF libre de un aptámero y receptor de NGF como 0, y una cantidad de unión por inyección de una solución libre de NGF como 100. Aquí, la cantidad de unión significa un valor de RU en un pico del sensograma de BIAcore (valor de RU inmediatamente después de completarse la inyección de NGF).

En una modalidad, el aptámero de la presente invención puede inhibir tanto la unión de NGF y TrkA, y como la de NGF y p75.

El aptámero de la presente invención puede presentar actividad inhibidora contra NGF derivado de cualesquiera mamíferos. Dichos mamíferos incluyen primates (v.gr., humanos, monos), roedores (v.gr., ratones, ratas y cobayos) y animales de compañía, animales domésticos y animales de trabajo (v.gr., perros, gatos, caballos, bovinos, cabras, ovejas cerdos).

El aptámero de la presente invención no está particularmente limitado siempre que se una a cualquier porción de NGF y pueda inhibir la unión de NGF y receptor de NGF.

En una modalidad preferible, el aptámero de la presente invención contiene una secuencia mostrada por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106) en donde N es cualquier nucleótido, H es un nucleótido que excluye G, y Y es un nucleótido de pirimidina, se une a NGF, e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF. La secuencia de nucleótidos mostrada por SEQ ID NO: 106 se incluye en el aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF, que se obtiene por el método de SELEX antes mencionado. Por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es preferiblemente modificado.

En una modalidad preferible, el aptámero de la presente invención contiene una secuencia de consenso mostrada por UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAAN N AAACY (SEQ ID NO: 108) o AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109) en donde N es cualquier nucleótido, e Y es un nucleótido de pirimidina, se une a NGF, e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF. Las secuencias de nucleótido mostradas por SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 se incluyen en el aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF, que se obtiene por el método de SELEX antes mencionado. Por lo menos un nucleótido de estas secuencias es preferiblemente modificado.

En una modalidad preferible, el aptámero de la presente invención contiene una secuencia de consenso mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112) o CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113) en donde Y es un nucleótido de pirimidina, se une a NGF, e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF. Las secuencias de nucleótido mostradas por SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 , SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113 se incluyen en el aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF y receptor de NGF, que se obtiene por el método de SELEX antes mencionado. Por lo menos un nucleótido de estas secuencias es preferiblemente modificado.

Además, el aptámero de la presente invención puede ser un aptámero que se une a NGF e inhibe una actividad de crecimiento de neuritas por NGF. Ya sea que el aptámero inhiba o no la actividad de crecimiento de neuritas de NGF se puede evaluar por la prueba descrita en el ejemplo 7 o ejemplo 8.

Además, la concentración de aptámero (CI50) para dar una actividad de crecimiento de neuritas de 50% también se puede determinar realizando la prueba descrita en el ejemplo 8 con diferentes concentraciones de aptámero. La CI50 del aptámero de la presente invención es preferiblemente no más de 100 nM, muy preferiblemente no más de 10 nM.

La longitud del aptámero de la presente invención no está limitada, y puede ser usualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nucleótidos, y puede ser, por ejemplo, no más de aproximadamente 100 nucleótidos, preferiblemente no más de aproximadamente 60 nucleótidos, muy preferiblemente no más de aproximadamente 50 nucleótidos, muy preferiblemente no más de aproximadamente 45 mus. Cuando el número total de nucleótidos es más pequeño, la síntesis química y producción masiva será más fácil, y hay una mayor ventaja en términos de costo. También se piensa que la modificación química es más fácil, la estabilidad en el cuerpo es más alta y la toxicidad es más baja.

Cada nucleótido contenido en el aptámero de la presente invención es el mismo o diferente y puede ser un nucleótido que comprende un grupo hidroxilo en la posición 2' de ribosa (v.gr., ribosa de nucleótido de pirimidina, ribosa de nucleótido de purina) (es decir, un nucleótido no reemplazado) o un nucleótido reemplazado por cualquier átomo o grupo en la posición 2' de ribosa. Como ejemplos de dicho átomo o grupo, un nucleótido reemplazado por un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, o un grupo-O-alquilo (v.gr., grupo -O-Me), o un grupo -O-acilo (v.gr., grupo -O-CHO), o un grupo amino (v.gr., grupo -NH2) se pueden mencionar.

El aptámero de la presente invención también puede ser el nucleótido en donde por lo menos un tipo (v.gr., 1 , 2, 3 ó 4 tipos) de nucleótido comprende un grupo hidroxilo, o cualquier átomo o grupo anteriormente descrito, por ejemplo, por lo menos dos tipos (v.gr., 2, 3 ó 4 tipos) de grupos seleccionados del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo hidroxilo y un grupo -O-Me, en la posición 2' de ribosa.

También, en el aptámero de la presente invención, todos los nucleótidos de pirimidina son los mismos o diferentes y cada uno puede ser un nucleótido reemplazado por un átomo de flúor, o un nucleótido reemplazado por cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, preferiblemente un átomo o grupo seleccionado del grupo que cosiste de un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo y un grupo metoxi en la posición 2' de ribosa.

En los aptámeros de la presente invención, además, todos los nucleótidos de purina son los mismo o diferentes y cada uno puede ser un nucleótido reemplazado por un grupo hidroxilo en la posición 2' de ribosa, o un nucleótido reemplazado por cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, preferiblemente un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un grupo metoxi, y un átomo de flúor.

El aptámero de la presente invención también puede ser uno en donde todos los nucleótidos comprenden un grupo hidroxilo, o cualquier átomo o grupo mencionado anteriormente, por ejemplo, el grupo idéntico seleccionado por el grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo hidroxilo o un grupo -O-Me, en la posición 2' de ribosa.

En esta especificación, los nucleótidos que constituyen el aptámero se supone que son ARNs (es decir, los grupos azúcar se supone que son ribosa) en la descripción de cómo los grupos azúcar son modificados en los nucleótidos. Sin embargo, esto no significa que el ADN esté exento de nucleótidos que constituyen aptámero, y una modificación de ARN debe leerse como una modificación de ADN según sea apropiado. Cuando el nucleótido que constituye el aptámero es ADN, por ejemplo, la sustitución del grupo hidroxilo en posición 2' de ribosa por X debe leerse como una sustitución de un átomo de hidrógeno en la posición 2' de desoxirribosa por X.

El aptámero de la presente invención también puede ser: (a) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (con la condición de que el uracilo pueda ser timina); (b) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (con la condición de que el uracilo pueda ser timina), en donde uno a varios nucleótidos son reemplazados, deletados, insertados o añadidos; (c) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 70% o más (preferiblemente 80% o más, muy preferiblemente 90% o más, muy preferiblemente aún 95% o más) a una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (con la condición de que el uracilo pueda ser timina); o (d) un conjugado seleccionado del grupo que consiste de un conjugado de una pluralidad de aptámeros (a) anteriormente, un conjugado de una pluralidad de aptámeros (b) anteriormente, un conjugado de una pluralidad (c) anteriormente y un conjugado de una pluralidad de aptámeros (a), (b) y (c) anteriormente.

Los aptámeros de (b) - (d) antes mencionados se pueden unir a NGF y/o inhibir la actividad de NGF (actividad de unión a receptor de NGF, etc.).

Además, preferiblemente, los aptámeros de (b) - (d) antes mencionados se unen a NGF e inhiben la unión de NGF y receptor de NGF, y/o se unen a NGF, e inhiben la actividad de crecimiento de neuritas de NGF.

Muy preferiblemente, los aptámeros de (b) - (d) antes mencionados muestran una concentración inhibidora de crecimiento de neuritas de NGF de no más de 100 nM, muy preferiblemente de no más de 10nM.

En (b), el número de nucleótidos remplazados, deletados, insertados o añadidos no están particularmente limitado siempre que el aptámero se una a NGF, y pueda inhibir la cantidad de NGF (actividad de unión a receptor de NGF, etc.). Por ejemplo, puede ser de no más de aproximadamente 30, de aproximadamente no más de 20, muy preferiblemente no más de aproximadamente 10, muy preferiblemente aun no más de 5, muy preferiblemente 4, 3, 2 o 1.

Con respecto a (c) anterior, "una identidad" significa una relación (%) de residuos de nucleótido idénticos a todos los residuos de nucleótidos traslapables en la alineación óptima en donde dos secuencias de nucleótidos están alineadas usando un algoritmo matemático conocido en el campo técnico (preferiblemente, el algoritmo considera la introducción de espacios en una o ambas de las secuencias para la mejor alineación).

La identidad de secuencia de nucleótidos en la presente especificación se puede calcular, por ejemplo, alineando las dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de cálculo de homología NCBI BLAST-2 (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool: Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica del Centro Nacional para Información de Biotecnología) bajo las siguientes condiciones (abertura de espacio=5 sanciones; extensión de espacio=2 sanciones; x_ caída=50; valor de expectatíva=10; filtración=activada).

En (d) anterior, la conjugación se puede lograr mediante unión en tándem. En la conjugación, se puede utilizar un enlazador. Como el enlazador, se pueden mencionar cadenas de nucleótidos (v.gr., 1 a aproximadamente 20 nucleótidos) y cadenas de no nucleótidos (v.gr., enlazador -(CH2)n- , enlazador -(CH2CH20)n-, enlazador de hexaetilenglicol, enlazador de TEG, enlazador que contiene péptido, enlazador que contiene enlace de -S-S-, enlazador que contiene enlace de -CONH-, enlazador que contiene enlace de -OPO3-). La pluralidad como se menciona en los conjugados plurales antes descritos no está particularmente limitada, siempre que sea dos o más, y la pluralidad puede ser, por ejemplo, 2, 3 o 4. Cada uno de los nucleótidos en (a) a (b) anteriores, ya sea el mismo o diferente, puede ser un nucleótido que comprende un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, o un nucleótido remplazado por cualesquiera grupos (v.gr., un átomo de hidrogeno, un átomo de flúor o un grupo -O-Me) en la posición 2' de la ribosa (v.gr., ribosa de nucleótido de pirimidina).

El aptámero de la presente invención puede ser uno en donde un residuo de azúcar (v.gr., ribosa) de cada nucleótido haya sido modificado para incrementar la actividad de unión a NGF, para incrementar la actividad de unión de NGF-receptor de NGF, actividad inhibidora de unión de NGF-receptor de NGF, actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NGF, estabilidad del aptámero, capacidad de suministro de fármaco y similares. Como ejemplos de la modificación en un residuo de azúcar, el reemplazo de átomo de oxigeno en la posición 2', posición 3' y/o posición 4' del residuo de azúcar con otro átomo, y similares se pueden mencionar. Como el tipo de modificación, se pueden mencionar fluoración, O-alquilación (v.gr., O-metilación, O-etilación), O-arilación, S-alquilación (v.gr., S-metilación, S-etilación), S-arilación y aminación (v.gr., -NH2). Dichas alteraciones en el residuo de azúcar pueden ser realizadas por un método conocido como tal (véase, por ejemplo, Sproat et al., (1991) Nucí. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucí. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).

El aptámero de la presente invención también puede tener una base de ácido nucleico (v.gr., purina o pirimidina) alterada (v.gr., sustitución química) para incrementar la actividad de unión de NGF, actividad inhibidora de unión de NGF- receptor de NGF, actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NGF y similares. Como ejemplos de dichas alteraciones, la alteración de pirimidina en la posición 5, alteración de purina en la posición 6 y/u 8, alteración con una amina extra cíclica, sustitución con 4-tiouridina, y sustitución con 5-bromo o 5-yodo-uracilo se pueden mencionar. El grupo fosfato contenido en el aptámero de la presente invención puede ser alterado para conferir resistencia a nucleasa e hidrólisis. Por ejemplo, el grupo P (O) O puede ser remplazado por P(0)S (tioato), P(S)S (ditioato), P(0)NR2 (amidato), P(0)R, R(0)OR', CO o CH2 (formacetal) o 3 -amina (-NH-CH2-CH2-) [en donde cada unidad de R o R' es independientemente H o un alquilo remplazado o no remplazado (v.gr., metilo, etilo)].

El grupo de unión es, por ejemplo, -O-, -N- o -S-, y los nucleótidos se pueden unir a un nucleótido adjunto mediante estos grupos de unión.

Las alteraciones también pueden incluir alteraciones tales como bloqueo en 3' y 5'.

Una alteración además puede realizar añadiendo a un extremo un polietilen glicol, aminoácido, péptido, dT invertido, ácido nucleico, nucleósidos, miristolilo, oleilo-litocólico, docosanilo, lauroilo, estearolilo, palmitoilo, oleoilo, linoleoilo, otros lípidos, esteroides, colesterol, cafeína, vitaminas, pigmentos, sustancias fluorescentes, agente anticanceroso, toxina, enzimas, sustancia radioactiva, biotina y similares. Para dichas alteraciones véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. 5,660,985 y 5,756,703.

El aptámero de la presente invención puede ser químicamente sintetizado como se describe en la presente y por un método conocido como tal en la técnica. Un aptámero se une a la molécula objetivo en una amplia variedad de modos de unión, tales como enlaces iónicos basados en la carga negativa del grupo fosfato, enlaces hidrofóbicos y enlaces de hidrogeno basados en ribosa, y enlaces de hidrogeno e interacción de apilamiento basada en bases de ácido nucleico. En particular, los enlaces iónicos basados en la carga negativa del grupo fosfato, que están presentes en el mismo número que el número de nucleótidos constituyentes, son fuertes, y la unión a lisina y arginina estando presentes sobre la superficie de la carga positiva de la proteína. Por esta razón, las bases de ácido nucleico no implicadas en la unión directa a la molécula objetivo pueden ser sustituidas. En particular, debido a que la región de la estructura de tallo ya ha formado pares de bases y está de frente al interior de la estructura de doble hélice, es poco probable que las bases de ácido nucleico se unan directamente a la molécula objetivo. Por lo tanto, aun cuando un par de bases es remplazado por otro par de bases, la actividad del aptámero a menudo no disminuye. En estructuras en donde no se forman pares de bases, tales como estructuras de bucle, siempre que la base de ácido nucleico no esté implicada en la unión directa de la molécula objetivo, es posible la sustitución de bases. Con respecto a modificaciones de la posición 2' de ribosa, el grupo funcional de la posición 2' de la ribosa de manera poco frecuente interactúa directamente con la molécula objetivo, pero en muchos casos, no es relevante, y puede ser sustituida por otra molécula modificada. Por lo tanto, un aptámero, a menos que el grupo funcional implicado en la unión directa a la molécula objetivo sea sustituido o deletado, con frecuencia retiene la actividad del mismo. También es importante que la estructura tridimensional global no cambie sustancialmente.

Un aptámero se puede preparar utilizando el método de SELEX o una versión mejorada del mismo (v.gr., Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510). En el método de SELEX, al incrementar el número de rondas o al usar una sustancia competente, un aptámero que presenta un potencial de unión más fuerte para la molécula objetivo es concentrado y seleccionado. Por lo tanto, al ajusfar el número de rondas de SELEX y/o al cambiar la condición competitiva, los aptámeros con diferentes fuerzas de unión, aptámeros con diferentes modos de unión y aptámeros con la misma fuerza de unión o modo de unión pero diferentes secuencias de bases se pueden obtener en algunos casos. El método de SELEX comprende un procedimiento de amplificación por PCR; al causar una mutación mediante el uso de iones de manganeso y similares en el proceso, es posible realizar SELEX con diversidad más alta.

Los aptámeros obtenidos por SELEX son ácidos nucleicos que presentan alta afinidad para la sustancia objetivo, pero esto no significa unión a un sitio activo de la sustancia objetivo. Por lo tanto, los aptámeros obtenidos por SELEX no necesariamente actúan sobre la función de la sustancia objetivo. NGF es una proteína básica y se piensa que es probable que permita que los ácidos nucleicos se unan al mismo de manera no específica. Un aptámero que no se une a un sitio activo no influye en la actividad de la sustancia objetivo. De hecho, el ARN usado para control no inhibió la unión de NGF y receptor de NGF.

Con base en un aptámero activo así seleccionado, SELEX se puede realizar cambiando además un iniciador para adquirir un aptámero que posea actividad más alta. De manera específica, después de preparar una plantilla en donde un aptámero con una secuencia determinada es parcialmente aleatorizado o una plantilla impurificada con aproximadamente 10 a 30% de secuencias aleatorias, se realiza SELEX nuevamente.

Un aptámero obtenido por SELEX tiene una longitud de aproximadamente 80 nucleótidos, y esto es difícil para preparar como un agente farmacéutico como tal. Por lo tanto es necesario repetir esfuerzos de ensayo y error para acortar el aptámero a una longitud de aproximadamente 50 nucleótidos o menos que permita una síntesis química fácil. Dependiendo del diseño del iniciador para un aptámero obtenido por SELEX, la facilidad de la operación de minimización subsecuente cambia. A menos que el iniciador este diseñado exitosamente, el desarrollo subsecuente será imposible incluso si un aptámero con actividad es seleccionado por SELEX. En la presente invención un aptámero que retiene actividad incluso con 38 nucleótidos se obtuvo.

Los aptámeros son modificados fácilmente ya que permiten la síntesis química. Para aptámeros, al predecir la estructura secundaria usando el programa MFOLD, o al predecir la estructura estérica por análisis de rayos X o análisis de RMN, es posible predecir hasta cierto grado que nucleótidos pueden ser sustituidos o deletados, y donde insertar un nuevo nucleótido. Un aptámero predicho con la nueva secuencia puede ser fácilmente químicamente sintetizado, y puede ser determinado ya sea o no que el aptámero retenga la actividad mediante el uso de un sistema de prueba existente.

Si una región importante para la unión del aptámero obtenido con la molécula objetivo es identificada por esfuerzos repetidos de ensayo y error como se describió antes, la actividad permanece sin cambiar en muchos casos aun cuando se añada una nueva secuencia a ambos extremos de la secuencia. La longitud de la nueva secuencia no está particularmente limitada. En particular, las secuencias antes mencionadas mostradas por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106), UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108), AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109), UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), U GAAAG AAAC Y (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAAC (SEQ ID NO: 112) y C GAAAG AAAC (SEQ ID NO: 113) son porciones importantes para unión del aptámero de la presente invención a NGF e inhibición de la unión de NGF y receptor de NGF. Aun cuando se añada una nueva secuencia a ambos extremos de estas secuencias, la actividad permanece sin cambiar en muchos casos.

Modificaciones, secuencias similares, dan una amplia gama de diseño o alteraciones.

Como se estableció anteriormente, los aptámeros permiten una amplia gama de diseño o alteraciones de modificaciones. La presente invención también provee un método de producción de aptámero que permite una amplia gama de diseño o alteración de un aptámero que comprende una secuencia especifica (v.gr., una secuencia correspondiente a una porción seleccionada de entre regiones de tallo, regiones de bucle internas, regiones de bucle de horquilla y regiones de una sola cadena: de aquí en adelante, abreviada como secuencia fija según se requiera).

Por ejemplo, el método de producción de dicho aptámero incluye la producción de dicho aptámero comprende una secuencia fijada al usar un solo tipo de molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos mostrada por: ISecuencia de iniciador (i)| -(N)a-secuencia fija— {N)b- [Secuencia de iniciador (¡i) [En donde (N)a representa una cadena de nucleótidos que consiste de "a" unidades de n; (N)b representa una cadena de nucleótidos que consiste de unidades "b" de n; cada una de las unidades de n, ya sea idéntica o diferente, es un nucleótido seleccionado del grupo que consiste de A, G, C, U y T (preferiblemente, A, G, C y U). Cada uno de "a", ya sea idéntico o diferente, puede ser cualquier número y puede ser, por ejemplo, uno a aproximadamente 100, preferiblemente 1 a aproximadamente 50, muy preferiblemente 1 a aproximadamente 30, muy preferiblemente aun 1 a aproximadamente 20 o 1 a aproximadamente 10], o una pluralidad de tipos de moléculas de ácido nucleico (v.gr., genoteca de molécula de ácido nucleico diferente en el número de a, b etc.) y pares de iniciadores correspondientes a las secuencias de iniciador (i) y (¡i), respectivamente.

La presente invención también provee un complejo que comprende el aptámero de la presente invención y una sustancia funcional unida al mismo. La unión entre el aptámero y la sustancia funcional en el complejo de la presente invención puede ser un enlace covalente o un enlace no covalente. El complejo de la presente invención puede ser uno en donde el aptámero de la presente invención y uno o más (v.gr., 2 o 3) de sustancias funcionales del mismo tipo o diferentes tipos se unen entre sí. La sustancia funcional no está particularmente limitada, en cuanto a que recientemente confiere una cierta función en un aptámero de la presente invención, o es capaz de cambiar (v.gr., mejorar) una cierta característica que un aptámero de la presente invención puede poseer. Como ejemplos de la sustancia funcional, se pueden mencionar proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, azúcares, monosacáridos, polinucleótidos y nucleótidos. Como ejemplos de la sustancia funcional, se pueden mencionar sustancias de afinidad (v.gr., biotina, estreptavidina, polinucleótidos que poseen afinidad para secuencia complementaria objetivo, anticuerpos, Glutation Sefarosa, histidina), sustancias para mareaje (v.gr., sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, radioisótopos), enzimas (v.gr., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina), vehículos de suministro de fármaco (v.gr., liposoma, microesferas, péptidos, polietilenglicoles), fármacos (v.gr., aquellos usados en terapia de misiles tales como caliquemicina y duocarmicina; análogos de mostaza nitrogenada tales como ciclo fosfamida, melfalan, ifosfamida o trofosfamida; etileniminas tales como tiotepa, nitrosoureas como carmustine; agentes alquilantes tales como tesolomida o decarbazina; antagonistas metabólicos similares a folatos tales como metotraxato o retitrexed; análogos de purina tales como tioguanina, cladribina o fludarabina; análogos de pirimidina tales como fluorouracil, tegafur o gemcitabine; alcaloides de vinca tales como vinblastine, vincristine o vinorelbine y análogos de los mismos; derivados de podofilotoxina tales como etopósido, taxanos, docetaxel o paclitaxel; antraciclinas tales como doxorubicina, epirubicina, idarubicina y mitoxantrona, y análogos de los mismos; otros antibióticos citotóxicos tales como bleomicina y mitomicina; compuestos de platino tales como cisplatin, carboplatin y oxaliplatin; pentostatin, miltefosine, estramustine, topotecan, irinotecan y bicalutamida), y toxinas (v.gr., toxina de ricino, liatoxina y verotoxinas). Estas moléculas funcionales son finalmente removidas en algunos casos. Además, las moléculas pueden ser péptidos que pueden ser reconocidos y digeridos por enzimas tales como trombina, metaloproteinasa de matriz (MMP), y factor x, y pueden ser polinucleótidos que pueden ser digeridos por nucleasas o endonucleasa de restricción.

El aptámero o el complejo de la presente invención se puede usar, por ejemplo, como un medicamento o un agente de diagnóstico, un fármaco de prueba, un reactivo, un aditivo para agua potable y alimento, un incrementador y un mitigador.

El aptámero y complejo de la presente invención puede tener una actividad para inhibir la función de NGF al unir a NGF e inhibir la unión de NGF y receptor de NGF. Como se mencionó antes, NGF está implicado profundamente en el dolor e inflamación. Por lo tanto, el aptámero y complejo de la presente invención son útiles como medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades que acompañan dolor o inflamación (agente antidolor, agente anti-inflamatorio, etc.).

Aquí, ejemplos de dolor incluyen dolor nociceptivo (dolor muscular, dolor de espalda, dolor de extremidades superiores, lesión por latigazo, artragia, osteoartritis, gota, artritis reumatoide crónica, dolor de cabeza, dolor de cabeza por migraña, dolor de cabeza catatónico, dolor de cabeza agregado, dolor de cabeza secundario, dolor oro facial, dolor de muelas, causalgia después de extracción de muelas, dolor de muelas fantasma, dolor visceral, dolor cardiaco, dolor abdominal, Mittelschmerz, dismenorrea, dolor por trabajo de parto, nefralgia, ureteralgia, ostalgia y similares), dolor inflamatorio, dolor neuropático (neuropatía diabética, neuropatía tóxica, dolor después de operación, dolor de extremidades fantasma, dolor de muñón, distrofia simpática refleja, causalgia, dolor postherpético, neuralgia trigeminal, dolor central), dolor carcinomatoso (dolor debido a infiltración de cáncer en órgano visceral, dolor causado por obstrucción de vasos sanguíneos debido a infiltración de tejido canceroso en vasos sanguíneos, dolor de metástasis de hueso, dolor asociado con metástasis intracerebral, dolor causado por infiltración de tejido canceroso en nervio periférico), dolor por fibromialgia y similares.

Aunque la enfermedad asociada con inflamación aquí no está particularmente limitada, se pueden mencionar lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, osteoartritis, artritis reumatoide crónica, cistitis intersticial, asma y similares.

Aunque el cáncer antes mencionado no está particularmente limitado, se pueden mencionar, cáncer de esófago, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga urinaria, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer torácico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, neuroblastoma, glioblastoma, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de ovario, tumor de Wilms, cáncer de próstata y similares.

Cuando NGF se une a un receptor del mismo, TrkA, activa la fosforilación por tirosina de TrkA y Ras-MAPK, PLC-?, PI3K y hacia el extremo 3' de TrkA, y presenta acciones fisiológicas tales como supervivencia y diferenciación de células nerviosas. Por otra parte, induce muerte celular en la vía de señal mediante receptor de p75. Por lo tanto, el aptámero y complejo de la presente invención se pueden usar como medicamentos, agentes de diagnóstico, fármacos de prueba o reactivos para enfermedades relacionadas con activación de estas vías de traducción de señal. Ejemplos de las enfermedades relacionadas con la activación de estas vías de traducción de señal incluyen los dolores y canceres antes mencionados.

Cuando el aptámero y complejo de la presente invención se usan como medicamentos, los agentes de diagnóstico, fármacos de prueba, reactivos y similares, el sujeto al que se administra el aptámero no está particularmente limitado y, por ejemplo, se pueden mencionar primates (v.gr., humanos, monos), roedores (v.gr., ratón, rata, cobayo), y animales de compañía, animales domésticos y animales de trabajo (perros, gatos, caballos, bovinos, cabras, ovejas, cerdos).

El aptámero y complejo de la presente invención son capaces de unirse específicamente a NGF. Por lo tanto, el aptámero y complejo de la presente invención son útiles como sondas para detección de NGF. Las sondas son útiles en información de imagen in vivo de NGF, mediciones de concentraciones en la sangre, tinción de tejido, ELISA y similares. Las sondas también son útiles como agentes de diagnóstico, fármacos de prueba, reactivos y similares para enfermedades implicadas por NGF (enfermedades acompañadas por dolor o inflamación, y similares).

Con base en su unión especifica a NGF, el aptámero y complejo de la presente invención se pueden usar como ligandos para purificación de NGF.

Además, el aptámero y complejo de la presente invención se pueden usar como fármacos de prueba para examinar la condición mental de ilusiones y similares, o medicamentos, reguladores, incrementadores o mitigadores para controlar la condición mental.

El aptámero y complejo de la presente invención se pueden usar como vehículos de suministro de fármacos.

El agente farmacéutico de la presente invención puede ser uno formulado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable, excipientes tales como sacarosa, almidón, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato de calcio y carbonato de calcio; aglutinantes tales como celulosa, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polipropilpirolidona, gelatina, goma arábiga, polietilenglicol, sacarosa y almidón; desintegrantes tales como almidón, carboximetilcelulosa, hidroxipropil-almidón, sodio-glicol-almidón, bicarbonato de sodio, fosfato de calcio y citrato de calcio; lubricantes tales como estearato de magnesio, aerosil, talco y laurilsulfato de sodio; agentes saborizantes tales como ácido cítrico, mentol, sal de glicirrizina-amonio, glicina y polvo de naranja; conservadores tales como benzoato de sodio, sulfito, ácido de sodio, metil-parabeno y propil-parabeno; estabilizadores tales como ácido cítrico, citrato de sodio y ácido acético; agentes de suspensión tales como metilcelulosa, polivinilpirrolidona y estearato de aluminio; agentes de dispersión tales como agentes tensoactivos; diluyentes tales como agua, solución salina fisiológica y jugo de naranja; ceras de base tales como manteca de cacao; polietilenglicol y queroseno; y similares se pueden mencionar, pero estas no son limitantes.

Preparaciones adecuadas para administración oral son una solución preparada disolviendo una cantidad efectiva de ligando en un diluyente tal como agua, solución salina fisiológica o jugo de naranja; cápsulas, sacos o tabletas que comprenden una cantidad efectiva de ligando en forma sólida o granulada; una suspensión preparada suspendiendo una cantidad efectiva de ingrediente activo en un dispersante apropiado; una emulsión preparada dispersando y emulsionando una solución de una cantidad efectiva de ingrediente activo en un dispersante apropiado, y similares.

El agente farmacéutico de la presente invención puede ser revestido por un método conocido como tal para el propósito de encubrimiento de sabor, disolución entérica, liberación sostenida y similares. Como ejemplos de agentes de revestimiento usados para el revestimiento se usan, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polioxietilenglicol, Tween 80, Pluronic F68, acetato-estearato de celulosa, estearato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de hidroximetilcelulosa, Eudragit (fabricado por Rohm, Alemania, copolímero de ácido metacrílico/ácido acrílico), pigmentos (v.gr., rojo de oxido férrico, dióxido de titanio y similares) y similares. El agente farmacéutico puede ser una preparación de liberación rápida o una preparación de liberación sostenida. Ejemplos de bases de liberación sostenida incluyen liposoma, atelocolágeno, gelatina, hidroxiapatita, PLGA y similares.

Como preparaciones adecuadas para administración parenteral (v.gr., administración intravenosa, administración subcutánea, administración intramuscular, administración tópica, administración intraperitoneal, administración intranasal, administración pulmonar y similares), están disponibles líquidos inyectables estériles isotónicos acuosos y no acuosos, que pueden comprender un antioxidante, una solución reguladora de pH, un agente bacteriostático, un agente isotonizante y similares. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas también se pueden mencionar, las cuales pueden comprender un agente de suspensión, un solubilizante, un espesante, un estabilizador, un antiséptico y similares. La preparación se puede incluir en un contenedor tal como una ampolleta o un frasco en un volumen de dosis unitaria o en varias dosis divididas. Un ingrediente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable también pueden ser secados por congelamiento y almacenarse en un estado que pueda ser disuelto o suspendido en un vehículo estéril apropiado inmediatamente antes de usarse. Las preparaciones de liberación sostenidas también son preparaciones adecuadas. Las preparaciones de liberación sostenida incluyen liberaciones sostenidas de vehículos o contenedores embebidos en el cuerpo tales como huesos artificiales, esponjas biodegradables o no degradables, bolsas, bombas de fármaco, bombas de presión osmótica y similares. Los dispositivos para suministro sistémico o tópico continuo o intermitente desde el exterior del cuerpo también se incluyen en el alcance de las preparaciones de liberación sostenida. Las bases biodegradables incluyen liposoma, liposoma cationico, ácido poli (láctico-co-glicólico) ácido (PLGA), aterocolágeno, gelatina, hidroxiapatita, polisacárido sizofiran. Además de inyecciones líquidas y preparación de liberación sostenida, también son aceptables inhalantes y ungüentos. En el caso de un inhalante, un ingrediente activo en un estado secado por congelamiento es micronizado y administrado por inhalación usando un dispositivo de inhalación apropiado. Un inhalante se puede formular como apropiado con un agente tensoactivo convencionalmente usado, aceite, sazonador, ciclodextrina o derivado de la misma y similares según se requiera.

Aquí, como ejemplos de agente tensoactivo, ácido oleico, lecitina, dioleato de dietilenglicol, oleato de tetrahidrofurfurilo, oleato de etilo, miristato de isopropilo, trioleato de glicerilo, monolaurato de glicerilo, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, monolisinoato de glicerilo, alcohol cetilico, alcohol estearilico, polietilen glicol 400, cloruro de cetilpiridinio, trioleato de sorbitán (nombre comercial, Span 85), monooleato de sorbitán comercial, Span 80), monolaurato de sorbitán (nombre comercial, Span 20), aceite de ricino endurecido por polioxietileno (nombre comercial, HCO-60), monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán (nombre comercial, Tween 20), monooleato de polioxietilen (20) sorbitán (nombre comercial, Tween 80), lecitina de origen de recurso natural (nombre comercial, EPICLON), éter de oleilpolioxietileno (2) (nombre comercial, Brij 92), éter de estearil polioxietileno (2) (nombre comercial, Brij 72), éter de lauril polioxietileno (4) (nombre comercial, Brij 30), éter de oleilpolioxietileno (2) (nombre comercial, Genapol 0-020), copolímero de bloque de oxietileno y oxipropileno (nombre comercial, Synperonic) y similares de pueden mencionar. Como ejemplos del aceite se pueden mencionar aceite de maíz, aceite de olivo, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol y similares. En el caso de una pomada, una base farmacéuticamente aceptada (petrolato amarillo, petrolato blanco, parafina, plastibase, silicón, pomada blanca, cera de abeja, manteca de cerdo, aceites vegetales, ungüento hidrofílico, petrolato hidrofílico, lanolina purificada, lanolina hidrolizada, ungüento absorbente de agua, plastibase hidrofílica, ungüento de macrogol y similares) se mezcla con un ingrediente activo, y se usa como una preparación.

Un inhalante puede ser producido de conformidad con un método convencional. De manera específica, un inhalante puede ser producido pulverizando o licuando el aptámero anteriormente descrito y complejo de la presente invención, mezclándolo en un propelente de inhalación y/o vehículo, y llenándolo en un recipiente de inhalación adecuado. Cuando el aptámero y complejo anteriormente descritos de la presente invención es un polvo, un inhalador mecánico de polvo ordinario se puede usar; en el caso de un líquido, se puede usar un inhalador tal como un nebulizador. Aquí, como el propelente, convencionalmente conocidos se puede usar ampliamente': Compuestos de la serie de clorofluorocarbono tales como clorofluorocarbono-11 , clorofluorocarbono-12, clorofluorocarbono-21 , clorofluorocarbono-22, clorofluorocarbono-113, clorofluorocarbono-114, clorofluorocarbono-123, clorofluorocarbono-142c, clorofluorocarbono-134a, clorofluorocarbono-227, clorofluorocarbono-C318, y 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, hidrocarburos tales como propano, isobutano y n-butano, éter dietílico, gases comprimidos tales como nitrógeno gaseoso y dióxido de carbono gaseoso y similares se pueden mencionar.

La dosis del agente farmacéutico de la presente invención varía dependiendo del tipo y actividad de ingrediente activo, severidad de la enfermedad, especie del animal que es el sujeto de administración, tolerabilidad a fármacos del sujeto de administración, peso corporal, edad y similares, y la dosis usual, con base en la cantidad de ingrediente activo por día para un adulto, puede ser de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 1 mg/kg.

La presente invención también provee un vehículo de fase sólida que tiene el aptámero y el complejo de la presente invención inmovilizados sobre el mismo. Como ejemplos del vehículo de fase sólida, un sustrato, una resina, una placa (v.gr., placa de pozos múltiples), un filtro, un cartucho, una columna y un material poroso se pueden mencionar. El sustrato puede ser uno usado en chips de ADN, chips de proteína y similares; por ejemplo, sustratos de níquel-PTFE (politetrafluoroetileno), sustratos de vidrio, sustratos de apatita, sustratos de silicio, sustratos de alúmina y similares, y sustratos preparados revistiendo esos sustratos con un polímero y similares se pueden mencionar. Como ejemplos de la resina, partículas de agarosa, partículas de sílice, un copolímero de acrilamida y ?,?'-metilenbisacrilamida, partículas de divinilbenceno entrelazadas con poliestireno, partículas de dextrano entrelazadas con epiclorhidrina, fibras de celulosa, polímeros entrelazados de arildextrano y ?,?'-metilenbisacrilamida, polímeros sintéticos monodispersos, polímeros hidrofílicos monodispersos, Sefarosa, Toyopearl y similares se pueden mencionar, y también resinas preparadas uniendo varios grupos funcionales a estas resinas se incluyeron. El vehículo de fase sólida de la presente invención puede ser útil en, por ejemplo, purificación, detección y cuantificación de NGF.

El aptámero y el complejo de la presente invención pueden ser inmovilizados sobre un vehículo de fase sólida por un método conocido como tal. Por ejemplo, un método que introduce una sustancia de afinidad (v.gr., aquellos descritos anteriormente) o un grupo funcional predeterminado en el aptámero o en el complejo de la presente invención, y después inmoviliza el aptámero y complejo sobre un vehículo de fase sólida mediante la sustancia de afinidad o grupo funcional predeterminado se puede mencionar. La presente invención también provee esos métodos. El grupo funcional predeterminado puede ser un grupo funcional que puede ser sometido a una reacción de acoplamiento; por ejemplo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo hidroxilo y un grupo carboxilo se pueden mencionar. La presente invención también provee un aptámero que tiene dicho grupo funcional introducido en el mismo.

La presente invención también provee un método de purificación y concentración de NGF. En particular, la presente invención hace posible separar NGF de las proteínas de otras proteínas de la familia. El método de purificación y concentración de la presente invención puede comprender absorber NGF al vehículo de fase sólida de la presente invención, y eluir el NGF absorbido con eluyente. La adsorción de NGF al vehículo de fase sólida de la presente invención se puede lograr por un método conocido como tal. Por ejemplo, una muestra que contiene NGF (v.gr., cultivo bacteriano o de células o sobrenante de cultivo, sangre) se introduce en el vehículo de fase sólida de la presente invención o una composición que contiene el mismo. NGF puede ser eluido usando un eluyente tal como unan solución neutra. No hay limitación sobre el eluyente neutro, que puede tener un pH, de por ejemplo, aproximadamente 6 a aproximadamente 9, preferiblemente aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5 y muy preferiblemente aproximadamente 7 a aproximadamente 8. La solución neutra también puede comprender, por ejemplo, urea, un agente quelatador (v.gr., EDTA), una sal de potasio (v.gr., KCI), una sal de magnesio (v.gr., MgC ), un agente tensoactivo (v.gr., Tween 20, Tritón, NP40), y glicerina. El método de purificación y concentración de la presente invención puede comprender además lavar el vehículo de fase sólida usando una solución de lavado después de adsorción de NGF. Ejemplos de la solución de lavado incluyen aquellos que contienen urea, un agente quelatador (v.gr., EDTA), Tris, un ácido, un álcali, ARN de trasferencia, ADN, agentes tensoactivos tales como Tween 20, sales tales como NaCI, y similares. El método de purificación y concentración de la presente invención puede comprender además calentar el vehículo de fase sólida. Este paso permite la regeneración y esterilización del vehículo de fase sólida.

La presente invención también provee un método de detección y cuantificación de NGF. En particular, la presente invención hace posible detectar y cuantificar NGF separado de las proteínas de otras proteínas de la familia. El método de detección y cuantificación de la presente invención puede comprender medir NGF al utilizar el aptámero de la presente invención (v.gr., mediante el uso del complejo y el vehículo de fase sólida de la presente invención). El método de detección y cuantificación de NGF se puede realizar de la misma manera que un método inmunológico, excepto que el aptámero de la presente invención se usa en lugar de un anticuerpo. Por lo tanto, al usar el aptámero de la presente invención como una sonda en lugar de un anticuerpo, de la misma manera que métodos tales como inmunoensayo de enzima (EIA) (v.gr., ELISA competitiva directa, ELISA competitiva indirecta, ELISA intercalada), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo fluorescente (FIA), técnica de Western blot, método de tinción inmunohistoquímica, y método de distribución de células, se pueden realizar la detección y cuantificación. El aptámero de la presente invención también se puede usar como una sonda molecular para PET y similares. Estos métodos pueden ser útiles, por ejemplo, en la medición de contenidos de NGF en organismos vivos o muestras biológicas, y en el diagnóstico de una enfermedad asociada con NGF.

Las descripciones en todas las publicaciones mencionadas aquí, incluyendo patentes y especificaciones de solicitud de patente, son incorporadas por referencia aquí en la presente invención al grado que todas ellas hayan sido expresadas.

EJEMPLOS La presente invención se describe aquí con más detalle por medio de los siguientes ejemplos, que, sin embargo, nunca limitan el alcance de la invención.

EJEMPL0 1 Preparación de aptámeros de ARN que se unen específicamente a NGF 1 Los aptámeros de ARN que se unen específicamente a NGF se preparan usando el método de SELEX. El SELEX se realizó por referencia al método de (Ellington et al. (Ellington y Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) y el método de Tuerk et al. (Tuerk y Gold, Science 249, 505-510, 1990). NGF humano (fabricado por R&D Systems) se usó como una sustancia objetivo.

El ARN usado en la primera ronda (40N-ARN) se obtuvo transcribiendo un ADN químicamente sintetizado usando el kit de transcripción DuraScribe™ T7 (usado por Epicentre). El ARN obtenido por este método tiene la posición 2' de la ribosa del nucleótido de pirimidina fluoro-reemplazado. El ADN de 79 nucleótidos de largo mostrado a continuación, que tiene una secuencia de iniciador en cada extremo de secuencia aleatoria de 40 nucleótidos se usó como plantilla de ADN. La plantilla de ADN y los iniciadores se prepararon por síntesis química.

Plantilla de ADN: 5'-ccagttgttggtgacaatgc-40N-gcagctccacaggcttccc-3' (SEQ ID NO: 114) Iniciador hacia adelante: 5'-taatacgactcactatagggaagcctgtggagctgc-3' (SEQ ID NO: 115) Iniciador de reversa: 5'-ccagttgttggtgacaatgc-3' (SEQ ID NO: 116) N representa cualquiera de A, G, C y T. el iniciador hacia adelante comprende una secuencia de promotor de 7 ARN polimerasa. La variación del acervo de ARN usado en la primera ronda fue teóricamente 1014.

Después de 10 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas; la convergencia de secuencia se vio. En 48 clones, 6 secuencias mostradas por SEQ ID NO: 1 , y 5 secuencias mostradas por SEQ ID NO: 2 estuvieron presentes. Tres secuencias mostradas por SEQ ID NOs: 3 - 5, y dos secuencias mostradas por SEQ ID NOs: 6 - 8 estuvieron presentes. Solo una secuencia fue mostrada por SEQ ID NOs: 9 - 23. Muchas secuencias contenían una secuencia de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Las estructuras secundarias de estas secuencias fueron predichas usando el programa MFOLD (M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003) y estructuras de abultamiento que tenían porciones de secuencia de consenso similares fueron predichas. Estructuras secundarias putativas de los aptámeros de las secuencias mostradas por SEQ ID NOs: 1-9 y 12 se dan en las figuras 1 -10, en donde las secuencias de consenso son encerradas en un círculo.

Las secuencias de nucleótidos actualmente obtenidas, que corresponden a cada SEQ ID NO, se muestran a continuación. Los paréntesis en cada nucleótido muestran modificaciones en la posición 2' y F es un átomo de flúor (de aquí en adelante el mismo).

SEQ ID NO: 1 : gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa aac(F)aaagac(F)aau(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)a ac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 2: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu (F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au (F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 3: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac( F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 4: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa u(F)au(F)gac(F)aaau(F)aaaac(F)ggc(F)aac(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F )aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 5: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)ga aaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)aaau(F)gu(F)aaaaagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c( F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 6: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)u(F)aaau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)a ac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 7. gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)u(F)agau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)a ac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 8: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F )gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c( F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 9: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaa aaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu (F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 10: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa u(F)u(F)aaagagc(F)u(F)u(F)gac(F)aaaac(F)au(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F) c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 1 1 : gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaa aaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)g u(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 12: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F)gaaac(F)aaac(F)c( F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aac(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c( F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 13: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)u(F)aaau(F)aaaaaaaaau(F)ggac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c( F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 14: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)gaau(F)u(F)ggau(F)ac(F)agau( F)agu(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)aau(F)gau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F )c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 15: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaa aaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)gau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu (F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 16: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaa aaac(F)c(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)gu(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u( F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 17: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)ggaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac( F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 18: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)gaaau(F)ggac(F)u(F)gu(F)aaa gc(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)au(F)u(F)c(F)aau(F)c(F)gaggc(F)au(F)u(F)gu(F)c( F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 19: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa c(F)u(F)aaagu(F)u(F)u(F)aaaac(F)u(F)gau(F)ac(F)gagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)a c(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 20: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa u(F)u(F)aaaaac(F)u(F)u(F)gc(F)c(F)gagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F) aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 21 : gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaaac(F)c(F)c(F)aa aaac(F)aaagac(F)aac(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F) aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 22: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)u(F)gu(F)c(F)c(F)ac(F)agaaaau(F)ggau(F)u(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac (F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg SEQ ID NO: 23: gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F)gaaac(F)aaac(F)c( F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aaaagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)a ac(F)aac(F)u(F)gg Las actividades de unión para NGF de los ácidos nucleicos mostrados por SEQ ID NOs:1-9 y 12 se evaluaron por el método de resonancia de plasmón de superficie. Las mediciones se tomaron usando BIAcore 2000 (fabricado por BIAcore). El chip de SA se usó como el chip sensor, que tenia estreptavidina inmovilizada en el mismo. Unido al mismo había aproximadamente 1500 RU de Poly dT de 16 nucleótidos con biotina unida al extremo 5' del mismo. El ácido nucleico de ligando tenía un Poly A de 16 nucleótidos añadido al extremo 3' del mismo, y fue inmovilizado sobre el chip SA mediante un enlace entre T y A. la cantidad inmovilizada fue de aproximadamente 1000 RU. 20 µ? de NGF para analito, preparado a 0.5 µ?, se inyectó, con la adición de una concentración final de 0.3M de NaCI para reducir la adsorción no especifica. La solución A se usó como un regulador de pH de corrimiento. Aquí, la solución A es una solución mixta de 145 mM de cloruro de sodio, 5.4 mM de cloruro de potasio, 1.8 mM de cloruro de calcio, 0.8 mM de cloruro de magnesio, 20 mM de Tris (pH 7.6), y 0.5% de Tween 20. Como un resultado de la medición, se encontró que todos los ácidos nucleicos mostrados por SEQ ID NOs: 1-9 y 12 se unen a NGF significativamente más que el control 40N. Aquí, 40N se refiere al acervo de ácido nucleico usado para la primera ronda, que comprende una secuencia aleatoria de 40 nucleótido. Como un ejemplo, un sensograma que muestra un estado de la unión del aptámero mostrada por SEQ ID NO:6 y NGF se muestra en la figura 11. De lo anterior, se mostró que estos ácidos nucleicos son aptámeros que se unen a NGF.

EJEMPLO 2 Preparación de aptámeros de ARN que se unen específicamente a NGF 2 SELEX se realizó de la misma manera que en el ejemplo 1 excepto que se usó una plantilla que tenía una secuencia aleatoria de 30 nucleótidos y secuencias de iniciador diferentes de aquellas usadas en el ejemplo 1. La plantilla y las secuencias de iniciador usadas se muestran a continuación. Como la plantilla, se usó una secuencia aleatoria de 30 nucleótidos. La plantilla de ADN e iniciadores fueron producidos por síntesis química.

Plantilla de ADN: 5'-tgaggatccatgtatgcgcacata-30N-cttctggtcgaagttctccc-3' (SEQ ID NO: 1 7) Iniciador hacia adelante: 5'-cggaattctaatacgactcactatagggagaacttcgaccagaag-3' (SEQ ID NO: 118) Iniciador de reversa: 5'-tgaggatccatgtatgcgcacata-3' (SEQ ID NO: 119) Después de 13 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas. Aunque la convergencia de secuencia aun no se veía, muchas secuencias contenían una secuencia de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Además, algunas secuencias contenían mutación en secuencias de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91 ) tales como UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105) y similares.

Aunque la secuencia primaria es un poco diferente, AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102) estuvo presente como una secuencia que se esperaba que tuviera una estructura de abultamiento similar por el programa MFOLD.

Un subconjunto de estas secuencias es mostrado por SEQ ID NOs: 37 - 42.

Después de 16 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas nuevamente. La convergencia de otras secuencias no se vio pero dos secuencias mostradas por SEQ ID NOs: 43 y 51 estuvieron presentes. Muchas de estas secuencias contenían, como las secuencias después de 13 rondas, la secuencia de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Además, algunas secuencias contenían mutación en la secuencia de consenso UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) tales como UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAACAAACC (SEQ ID NO: 94), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), UGAAAAAACCU (SEQ ID NO: 97), y similares.

Un subconjunto de estas secuencias se muestra por SEQ ID NOs: 43 - 53.

Después de 19 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas nuevamente. Aunque tres secuencias mostradas por SEQ ID NO: 56 y 2 secuencias mostradas por cada una de SEQ ID NOs: 54, 57 y 67 estuvieron presentes, la convergencia de otras secuencias no se vio aun. Muchas de las secuencias contenían una secuencia de consenso tal como UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91 ), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92) y UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95).

Un subconjunto de estas secuencias se muestra ahora por SEQ ID NOs: 54 - 59.

Después de 22 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas nuevamente. Seis secuencias mostradas por SEQ ID NO: 67 y 3 secuencias mostradas por SEQ ID NO: 68 estuvieron presentes. Estas secuencias contenían secuencias de CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103) y CGAAAGAÁACU (SEQ ID NO: 104) similares a las secuencias de consenso mostradas por SEQ ID NO: 91. Las convergencias de otras secuencias no se vieron, pero muchas secuencias contenían las secuencias de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) y UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92).

Un subconjunto de estas secuencias se muestra por SEQ ID NOs: 60 - 68.

Las secuencias de nucleótido realmente obtenidas que corresponden a SEQ ID NOs mencionadas anteriormente se muestran a continuación. Los paréntesis en los nucleótidos muestran la modificación en la posición 2' y F es un átomo de flúor.

SEQ ID NO: 37: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aaggu(F)gaaac(F)aac(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c( F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 38: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)a aagu(F)ac(F)au(F)aaaac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F) c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 39: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaau (F)aaaac(F)aac(F)aau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c( F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 40: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a ggaaaau(F)ggaagac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F) c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 41 : gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)a aagc(F)gaaac(F)aaaac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c( F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 42: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a aaagagc(F)agc(F)agagau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F) c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 43: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaac(F)c(F)c(F)c(F )aau(F)au(F)gagaau(F)c(F)au(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gg au(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 44: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aaau(F)u(F)agc(F)ac(F)c(F)au(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)g gau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 45: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aa au(F)c(F)aaggac(F)aau(F)gau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F) c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 46: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)c(F )aaagu(F)u(F)ac(F)gc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)g gau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 47: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c( F)aaaau(F)gagc(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c (F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 48: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)g aaaaac(F)gc(F)au(F)aau(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F )c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 49: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aa gac(F)ggu(F)aac(F)gaaagu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F )c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 50: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaac(F)c(F)u(F)c(F)c(F)c(F )aau(F)ac(F)aaac(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau (F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 51 : gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aaaaaac(F)aac(F)au(F)au(F)gaac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F) ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 52: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aau(F)au(F)ac(F)aaaac(F)ac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau (F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 53: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)a aaaac(F)ac(F)aaaau(F)gu(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gga u(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 54: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaagu(F)gaaagaaac(F)u(F) c(F)c(F)aac(F)gaaagc(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F )c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 55: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aaaau(F)gaau(F)gc(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggac(F) c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 56: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aa c(F)ac(F)aaau(F)gc(F)ac(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gg au(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 57: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a aac(F)ac(F)c(F)gaagc(F)ac(F)aaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gg au(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 58: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)a aau(F)ac(F)agaau(F)aaau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau( F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 59: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaac(F)gu(F)u(F)u(F)gaaa aaaac(F)c(F)c(F)aaggaggau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c( F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 60: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) gaau(F)aaagau(F)aac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c( F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 61 : gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggu(F)c(F)gu(F)aac(F)gaau(F)aaaac( F)u(F)c(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)g gau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 62: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aau(F)u(F)aaagu(F)gaac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau( F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 63: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F) aaac(F)u(F)aagc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F )c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 64: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)a aaac(F)au(F)u(F)agc(F)ac(F)ac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)g gau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 65: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau (F)c(F)gagc(F)ac(F)aaaau(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F) c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 66: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a aagc(F)aagc(F)ac(F)aac(F)au(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gga u(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 67: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gau(F)aac(F)gaac(F)aaaac( F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaggaau(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)gga u(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a SEQ ID NO: 68: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gagagc(F)gaaagaaac(F)u(F) c(F)c(F)c(F)aaaac(F)ac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F) c(F)c(F)u(F)c(F)a Las actividades de unión para NGF de los ácidos nucleicos mostrados por SEQ ID NOs: 37 - 68 se evaluaron por el método de resonancia de plasmón de superficie. Un método similar al que se muestra en el ejemplo 1 se usó para el experimento. Como resultado, se encontró que todas las secuencias se unían de manera más significativa a NGF que 30N del control.

EJEMPLO 3 Preparación de aptámero de mosaico de ARN-ADN que se une específicamente a NGF El aptámero de mosaico en donde ARN es un nucleótido purina y ADN es nucleótido pirimidina se produjo de conformidad con el método SELEX. La plantilla usada contenía una secuencia aleatoria de 40 nucleótidos y los iniciadores usados fueron diferentes de aquellos usados en los ejemplos 1 y 2. El acervo de ácido nucleico de mosaico de ARN-ADN usado en la primera ronda se obtuvo transcribiendo ADN químicamente sintetizado como una plantilla, y rATP, rGTP, dCTP y dTTP como sustratos. Aquí, rNTP es ribonucleótido, y dNTP es desoxirribonucleótido. Otros métodos de experimentación son casi los mismos que los del ejemplo 1. Las secuencias de plantilla y iniciador usadas se muestran a continuación.

Plantilla de ADN-ARN: 5'-tcctaatgtctcttctcttcac-40N-gccctattcttgcctctccc-3' (SEQ ID NO: 120) Iniciador hacia adelante: 5'-taatacgactcactatagggagaggcaagaatagggc-3' (SEQ ID NO: 121) Iniciador en reversa: 5'-tcctaatgtctcttctcttcac-3' (SEQ ID NO: 122) Después de 7 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas. No se vio convergencia de secuencia, sino que muchas secuencias contenían las secuencias de consenso de TGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Después de 10 rondas de SELEX, las secuencias fueron secuenciadas nuevamente. Seis secuencias mostradas por SEQ ID NO: 72, cinco secuencias mostradas por cada una de las SEQ ID NOs: 70 y 71 , y dos secuencias mostradas por SEQ ID NOs: 69 y 73 estuvieron presentes. Además, se encontraron únicamente una vez (incluyendo una secuencia mostrada por SEQ ID NO: 74), muchas de las cuales contenían las secuencias de consenso TGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91).

Las secuencias de nucleótidos realmente obtenidas, que corresponden a SEQ ID NOs: 69 - 74, se muestran a continuación. T y C en mayúsculas muestran desoxirnbonucleótidos y a y g en minúsculas muestran ribonucleótidos.

SEQ ID NO: 69: gggagaggCaagaaTagggCCCagCTgaaaaaaaCCTggaCgTaCaCCgTTCgCCgag CgggTgaagagaagagaCaTTagga SEQ ID NO: 70: gggagaggCaagaaTagggCTggaaaTagaaCCgCgCTgTCTTCaTTaagCCgCCCaa CggTgaagagaagagaCaTTagga SEQ ID NO: 71 : gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaaTTTaCCgTCTTCagCgTCgg gTgTgaagagaagagaCaTTagga SEQ ID NO: 72: gggagaggCaagaaTagggCTggaTgggCagTaaCCTgaaaaaaaCCaCCCaCCTCTa CCgTgaagagaagagaCaTTagga SEQ ID NO: 73: gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaagaaagaaTaCTTaCCCggCg CgTgaagagaagagaCaTTagga SEQ ID NO: 74: gggagaggCaagaaTagggCaTagTgTagaCCCCTCTCaagaTaCCCCaTgaaTTgC CCCgTgaagagaagagaCaTTagga Las actividades de unión para NGF de los ácidos nucleicos mostrados por SEQ ID NOs: 69 - 74 fueron evaluados por el método de resonancia de plasmón de superficie. Un método similar al que se muestra en el ejemplo 1 se usó para experimento. Como resultado, se encontró que todos ellos se unían de manera más significativa a NGF que 40N de control.

EJEMPLO 4 Preparación de aptámeros de NGF que tienen actividad superior SELEX se llevo a cabo usando un acervo de ARN que contenía una secuencia mostrada por SEQ ID NO: 36 impurificada con 30% de secuencia aleatoria y a la que se añadieron secuencias de iniciador nuevas a ambos extremos de la misma. SELEX se llevo a cabo casi de la misma manera que en el ejemplo 1. Las secuencias de la plantilla e iniciadores se muestran a continuación.

Plantilla: 5'- GAGGATCCATGTATGCGCACATAgggtttttttcatcctgcagctccacaggcttcccCTTCT GGTCGAAGTTCT-3' a: a (70%), g (10%), c (10%), t (10%) g: g (70%), a (10%), c (10%), t (10%) c: c (70%), a (10%), g (10%), t (10%) t: t (70%), a (10%), c (10%), g (10%) (SEQ ID NO: 123) Iniciador hacia adelante: 5'-CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTCGACCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 124) Iniciador en reversa: 5'-GAGGATCCATGTATGCGCACATA-3' (SEQ ID NO: 125) Después de 10 rondas, las secuencias de 48 clones fueron secuenciadas. No se vio convergencia de secuencias, pero muchas secuencias contenían las secuencias de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91).

Además, UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), UGAAAACAACC (SEQ ID NO: 98), UGAAAUAAACC (SEQ ID NO: 99), UGAAAUAAACU (SEQ ID NO: 100), UGAAAAAAUCU (SEQ ID NO: 101) y similares, que contenían mutación en la secuencia de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), también estuvieron presentes.

De lo anterior se seleccionaron 12 secuencias en forma aleatoria, y las actividades de unión para NGF se midieron por el método de resonancia de plasmón de superficie. El método de medición es como se muestra en el ejemplo 1. Como resultado de la medición, se encontró que todas las 12 secuencias se unían en forma más significativa a NGF que la primera plantilla impurificada con 30% de secuencia aleatoria. Las secuencias de nucleótidos realmente obtenidas, que corresponden a cada una de SEQ ID NO, se muestran a continuación.

SEQ ID NO: 75: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)aa agac(F)aagau(F)aaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au( F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 76: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)aaac(F)gc(F)au(F)gu(F)au(F) u(F)u(F)gc(F)agu(F)au(F)u(F)aaaaau(F)gc(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F )au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 77: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)ag u(F)u(F)gc(F)aagac(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 78: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gu(F)au(F)u(F)gu(F)u(F)c( F)agggu(F)gu(F)gc(F)c(F)c(F)agc(F)c(F)u(F)au(F)aac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)g c(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 79: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)agc(F)c(F)au(F)gu(F)ggaggu( F)gaagac(F)u(F)gaaau(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au( F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 80: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)u(F)c(F)c(F )c(F)aau(F)aau(F)gau(F)c(F)ac(F)agaaau(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F) au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 81 : gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagau(F)gac(F)u(F)gu(F)gu(F)aac(F )c(F)ac(F)agu(F)au(F)gaaau(F)aaac(F)u(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F) ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 82: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaggau(F)gc(F)u(F)u(F)gu(F)u(F)u(F) ggu(F)u(F)ac(F)aagc(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au (F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 83: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)gaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaaac (F)c(F)c(F)aggau(F)u(F)aaac(F)agac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F) au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 84: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)ga u(F)gaaagau(F)gu(F)aac(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)a u(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 85: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)ggaagc(F)c(F)u(F)gc(F)gu(F)aac (F)c(F)gc(F)aggau(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F )au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 86: gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagu(F)agc(F)c(F)agu(F)gaac(F)c(F) u(F)ggaau(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)a u(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F) EJEMPLO 5 Preparación de aptámeros de ADN que se unen específicamente a NGF Aptámeros de ADN que se unen específicamente a NGF se prepararon usando el método SELEX. El método SELEX usado fue un método mejorado del método de Fitzwater, Polisky et al. (Fitzwater y Polisky, Methods Enzymol. 267, 275-301, 1996). Como una sustancia objetivo, se usó NGF humano usado en el ejemplo 1. El acervo para la primera ronda fue ADN con longitud de 71 (40N-ADN) obtenido añadiendo secuencias de iniciador a ambos extremos de secuencia aleatoria de 40 nucleótidos. Para obtener ADN de cadena sencilla, se añadió biotina (bio) al 5' terminal del iniciador de reversa.

Plantilla: 5'-GGGATCGACAGGGCT-40N-CCGAGTCGTGCCATCT-3' (SEQ ID NO: 126) Iniciador hacia adelante: 5'-GGGATCGACAGGGCT-3' (SEQ ID NO: 127) Iniciador en reversa: bio-AGATGGCACGACTCGG-3' (SEQ ID NO: 128) Después de completarse las 7 rondas, las secuencias de 46 clones fueron secuenciadas de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, 20 secuencias mostradas por SEQ ID NO: 87 estuvieron presentes. Las secuencias de los mismos se muestran a continuación.

SEQ ID NO: 87: GGGATCGACAGGGCTGCAGCACTGGCGTAGGTTGGAATATGGGTATTTT TGTGGTCCGAGTCGTGCCATCT EJEMPLO 6 Aptámeros que inhiben la unión de NGF y receptor de NGF El que los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs:1-9, 12 37-55 y 57-87 inhiban la unión de NGF y receptor de NGF (TrkA y P75) se determinó usando el método de resonancia de plasmón de superficie. Como es dirigido en el protocolo de BIAcore Company, la proteína A (21181 , PIERCE) fue inmovilizada en un chip de sensor de CM5. Aproximadamente 1100 RU de Trk A-Fc humano fusionado con la porción Fe de IgG fue inmovilizada sobre el mismo. Como el analito, una mezcla de NGF (0.1 µ?) y cada aptámero (0.33 µ?) fue inyectado después de dejar reposar durante 30 minutos. Si el aptámero inhibe la función de NGF y TrKA, la señal sobre el sensograma se espera que no aumente; si el aptámero no inhibe la unión, se formará un complejo triple y se espera que la señal aumente. Cuando NGF se une de manera más fuerte a un receptor que un aptámero, el aptámero puede ser removido y NGF se puede unir al receptor. Antes de empezar el experimento de inhibición, la unión de TrkA y NGF fue confirmada. Usando la cantidad de unión de NGF y receptor de NGF sin un aptámero como 100, la cantidad de unión de NGF y receptor de NGF añadida con un aptámero se determinó como un valor de corrección. Aquí, la cantidad de unión es el valor de RU en el pico del sensograma de BIAcore (valor de RU inmediatamente después de completarse la inyección de NGF). El valor de corrección se sustrajo de 100 para dar un % de actividad inhibidora, en donde no menos de 60% muestra la presencia de actividad inhibidora. Como resultado del experimento, se encontró que todos los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 - 9, 12, 37 -55, 57 - 87 inhiben la unión de NGF y TrKA (cuadro 1). Como un ejemplo, la inhibición de unión de NGF y TrKA por el aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6 se muestra en la figura 12. Un experimento similar se realizó para otro receptor P75 (p75-Fc; R&D systems). Como resultado, se encontró que todos los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 - 9, 12, 37 - 55, 57 - 87 inhiben la unión de NGF y P75 por no menos de 60% (cuadro 1). Como un ejemplo, la inhibición de unión de NGF y P75 por el aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6 se muestra en la figura 13.

CUADRO 1 Experimento de inhibición por BIACore Longitud TrKA P75 SEQ ID NO: 1 79 + + SEQ ID NO: 2 78 + + SEQ ID NO: 3 79 + + SEQ ID NO: 4 79 + + SEQ ID NO: 5 79 + + SEQ ID NO: 6 79 + + SEQ ID NO: 7 79 + + SEQ ID NO: 8 78 + + SEQ ID NO: 9 79 + + SEQ ID NO: 12 79 + + SEQ ID NO: 24 69 + + SEQ ID NO: 25 47 + + SEQ ID NO: 26 46 + + SEQ ID NO: 27 45 + + SEQ ID NO: 28 40 + + SEQ ID NO: 29 61 + + SEQ ID NO: 30 41 + + SEQ ID NO: 31 34 + + SEQ ID NO: 32 38 + + SEQ ID NO: 33 36 + + SEQ ID NO: 34 34 + + SEQ ID NO: 35 38 + + SEQ ID NO: 36 35 + + SEQ ID NO: 37 74 + + SEQ ID NO: 38 74 + + SEQ ID NO: 39 74 + + SEQ ID NO: 40 74 + + SEQ ID NO: 41 74 + + SEQ ID NO: 42 74 + + SEQ ID NO: 43 73 + + SEQ ID NO: 44 73 + + SEQ ID NO: 45 74 + + SEQ ID NO: 46 74 + + SEQ ID NO: 47 74 + + SEQ ID NO: 48 74 + + SEQ ID NO: 49 74 + + SEQ ID NO: 50 74 + + SEQ ID NO: 51 77 + + SEQ ID NO: 52 73 + + SEQ ID NO: 53 74 + + SEQ ID NO: 54 74 + + SEQ ID NO: 55 72 + + SEQ ID NO: 57 75 + + SEQ ID NO: 58 74 + + SEQ ID NO: 59 74 + + SEQ ID NO: 60 74 + + SEQ ID NO: 61 74 + + SEQ ID NO: 62 74 + + SEQ ID NO: 63 74 + + SEQ ID NO: 64 74 + + SEQ ID NO: 65 74 + + SEQ ID NO: 66 74 + + SEQ ID NO: 67 74 + + SEQ ID NO: 68 74 + + SEQ ID NO: 69 83 + + SEQ ID NO: 70 82 + + SEQ ID NO: 71 82 + + SEQ ID NO: 72 82 + + SEQ ID NO: 73 81 + + SEQ ID NO: 74 82 + + SEQ ID NO: 75 78 + + SEQ ID NO: 76 78 + + SEQ ID NO: 77 78 + + SEQ ID NO: 78 78 + + SEQ ID NO: 79 78 + + SEQ ID NO: 80 78 + + SEQ ID NO: 81 78 + + SEQ ID NO: 82 78 + + SEQ ID NO: 83 79 + + SEQ ID NO: 84 78 + + SEQ ID NO: 85 78 + + SEQ ID NO: 86 78 + + SEQ ID NO: 87 71 + + SEQ ID NO: 88 33 + + SEQ ID NO: 89 34 + + SEQ ID NO: 90 32 + + El cuadro 1 muestra aptámeros que inhiben la unión de TrkA o p75 y NGF. "+" muestra una actividad inhibidora (%) de no menos de 60%, y "-"muestra una de menos de 60%.

En cuanto al aptámero mostrado por SEQ ID NO: 87, un experimento inhibidor similar al mencionado anteriormente se realizó bajo condiciones de relación molar de NGF-aptámero de 1 :1 (0.1 µ?). La misma solución mixta preparada de NGF y aptámero se usó para el experimento de TrkA y P75, y el experimento se realizó bajo ninguna influencia de variación en la preparación de la muestra. Como resultado, el aptámero mostrado por SEQ ID NO: 87 inhibió la unión de NGF y TrKA por 93%, pero inhibió la unión de NGF y P75 solo por 29%.

EJEMPLO 7 Evaluación de actividad fisiológica de aptámero usando células PC-12 La actividad fisiológica del aptámero se evaluó por un experimento supresor de crecimiento de neuritas usando células PC-12. La célula PC-12, que es una línea celular derivada de feocromositoma de glándula suprarrenal de rata, en una célula modelo del sistema nervioso, alarga las neuritas por estimulación de NGF, y se diferencia como células nerviosas. El que un aptámero inhiba o no el crecimiento de neuritas se evaluó. Células CP-12 fueron sembradas en una placa de fondo plano de 96 pozos revestida con colágeno, y una solución mezclada de NGF (concentración final 25 ng/ml o 1.9 nM) pre-reaccionó durante 1 hora a 37°C y un aptámero (concentración final 500 nM) se añadió para iniciar el cultivo de células. Posteriormente, la misma cantidad del aptámero se añadió 2 veces cada 24 horas y el nivel de crecimiento de neuritas se observó y se evaluó el día 3 con un microscopio. Para la evaluación, su usaron puntuaciones 0-3, en donde la puntuación 0 es sin crecimiento de neuritas, puntuación 1 es ligero crecimiento de neuritas, puntuación 2 es crecimiento de neuritas a las células circundantes, y puntuación 3 es crecimiento de neuritas marcadamente reticulado. El sistema en donde las células PC-12 fueron cultivadas durante 3 días con la adición de NGF solo se tomó como un control negativo, y el sistema en donde las células se cultivaron durante tres días sin adición de NGF se tomó como un control positivo. Para confirmar la supresión de crecimiento de neuritas por un inhibidor de NGF, 133 n de anticuerpo anti-NGF (MAB2561 , R&D Systems) como un inhibidor de NGF de control se añadió con NGF, las células se cultivaron durante 3 días y la supresión de crecimiento de neuritas se confirmó. La fijación de la puntuación del control negativo como un 0% de actividad inhibidora, y la puntuación del control positivo como un 100% de actividad inhibidora, la actividad inhibidora (%) del aptámero se calculó. Los resultados se muestran en el cuadro 2. Una actividad inhibidora de no menos del 50% se muestra con +, una de menos del 50% se muestra con -. Se esclareció que los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 , 3 - 9 y 12 inhiben remarcablemente el crecimiento de neuritas (cuadro 2). El aptámero mostrado por SEQ ID NO: 2 libre de una secuencia de consenso no mostró una actividad inhibidora. Por otra parte, los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 5, 6 y similares que contienen una secuencia de consenso mostraron una actividad inhibidora. El aptámero mostrado por SEQ ID NO: 8 mostró una actividad inhibidora, aun cuando estaba libre de una secuencia de consenso. Lo anterior muestra que los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 1 , 3 - 9 y 12 pueden ser inhibidores de NGF.

CUADRO 2 Actividad inhibidora SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 3 + SEQ ID NO: 4 + SEQ ID NO: 5 + SEQ ID NO: 6 + SEQ ID NO: 7 + SEQ ID NO: 8 + SEQ ID NO: 9 + SEQ ID NO: 12 + SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 27 - SEQ ID NO: 28 + SEQ ID NO: 29 + SEQ ID NO: 30 + SEQ ID NO: 30(1) + SEQ ID NO: 30(2) + SEQ ID NO: 30(3) + SEQ ID NO: 31 - SEQ ID NO: 32 + SEQ ID NO: 32(1) + SEQ ID NO: 32(2) + SEQ ID NO: 32(3) + SEQ ID NO: 33 - SEQ ID NO: 34 - SEQ ID NO: 35 + SEQ ID NO: 35(1) + SEQ ID NO: 35(2) + SEQ ID NO: 35(3) + SEQ ID NO. 36 - SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 anticuerpo anti-NGF El cuadro 2 muestra aptámeros capaces de inhibir crecimiento de neuritas de células PC-12. Una actividad inhibidora de no menos de 50% es "+", y una de menos de 50% es EJEMPLO 8 Evaluación de actividad fisiológica de aptámero usando células Neuroscreen-1 La actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de aptámero se evaluó usando células Neuroscreen-1 , que es un subclon de células PC-12. 2500 células por pozo se cultivaron durante un día en un medio RPMI-1640 que contenía 2.5% de suero de caballo y 1.25% de suero de bovino fetal en una placa de fondo plano de 96 pozos revestida con colágeno tipo IV. Una solución mixta de NGF (concentración final 15 ng/ml o 1.1 nM) pre-reaccionó en un medio RPMI-1640 libre de suero a temperatura ambiente o 37°C durante 30 minutos a 1 hora y un aptámero (concentración final 500 - 3 nM) se añadió. Dos o tres días más tarde, el citoplasma y los núcleos se tiñeron usando kits Cellomics Neurite Outgrowth Kits (fabricados por Thermo Scientific), y la longitud de las neuritas por células se midió por Cellomics ArrayScan VTI (fabricados por Thermo Scientific). Por la longitud de neuritas por célula obtenida cultivando la célula durante dos días con la adición de NGF solo como 0% de actividad inhibidora, y la de la célula obtenida por cultivo libre de NGF como 100% de actividad inhibidora, la actividad inhibidora del aptámero se calculó a partir de la longitud de neuritas por célula obtenidas cultivando con la adición de NGF y el aptámero en mezcla. La actividad inhibidora cuando las concentraciones de aptámero eran 100 nM y 10 nM, y el 50% de concentración inhibidora (CI50) se muestran en el cuadro 3. Cuando la actividad inhibidora era 0% o más baja, ?%' es indicada. Cuando no era menos de 100%, '100%' es indicada. El 50% de concentración inhibidora se determinó a partir de las concentraciones en dos, por arriba y por debajo de los puntos que intercalan el 50% de actividad inhibidora. Un valor de CI50 indicado como < significa una actividad inhibidora de no menos del 50% incluso a la concentración de medición más baja, y el número indicado muestra la concentración medida más baja. Como resultado del experimento, la presencia de aptámeros que tienen una actividad alta que muestra una CI50 de 10 nM o más baja fue confirmada.

Dichos aptámeros contenían secuencias de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), UGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 93), UGAAAAGAACC (SEQ ID NO: 95), UGAAAAAACCC (SEQ ID NO: 96), UGAAAGGAACC (SEQ ID NO: 105), CGAACAAAACU (SEQ ID NO: 103), CGAAAGAAACU (SEQ ID NO: 104) y AGAAUGAAACU (SEQ ID NO: 102). Seis tipos y cinco tipos de aptámeros contenían UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) y UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92), respectivamente.

CUADRO 3 SEQ ID NO: 63 100.0 52.0 <10 SEQ ID NO: 64 100.0 96.1 4.8 SEQ ID NO: 65 100.0 0.0 22.2 SEQ ID NO: 66 100.0 68.7 <10 SEQ ID NO: 67 99.6 96.1 2.7 SEQ ID NO: 68 100.0 99.8 1.9 SEQ ID NO: 83 90.0 84.6 7.1 SEQ ID NO: 84 92.7 37.5 14.6 (N.D. en el cuadro significa no medido).

El cuadro 3 muestra la actividad inhibidora (%) cuando las concentraciones del aptamero que inhiben el crecimiento de neuritas de las células Neuroscreen-1 fueron 100 nM y 10 nM, y 50% de concentración inhibidora (CI50).

EJEMPLO 9 Acortamiento de cadena del aptámero Se realizó el acortamiento de cadena de los aptámeros mostrada por SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 8. Los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 5, 6 contienen una secuencia de consenso de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91). Los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 2 y 8 no contienen dichas secuencias de consenso. Las secuencias de las variantes son como se describe más adelante.

SEQ ID NO: 24: aptámero de 69 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 2 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu (F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au (F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F) SEQ ID NO: 25: aptámero de 47 nucleótidos que es una vanante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 2 ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c( F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F) SEQ ID NO: 26: aptámero de 46 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 5 gggc(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac (F)c(F)ac(F)agc(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 27: aptámero de 45 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F)u(F)aaau(F) SEQ ID NO: 28: aptámero de 40 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa au(F) SEQ ID NO: 29: aptámero de 61 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 8 ggu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac( F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F) SEQ ID NO: 30: aptámero de 41 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 8 gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u( F)aaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 31 : aptámero de 34 nucleótidos que es una vanante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 26 gggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 32: aptámero de 38 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 26 u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F) ac(F)a SEQ ID NO: 33: aptámero de 36 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 26 u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)aaac(F)agc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F) a SEQ ID NO: 34: aptámero de 34 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 26 gu(F)ggagc(F)u(F)gu(F)u(F)aaac(F)aac(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F) SEQ ID NO: 35: aptámero de 38 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 28 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa SEQ ID NO: 36: aptámero de 35 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 28 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 88: aptámero de 33 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggaagc(F)c(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 89: aptámero de 34 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 90: aptámero de 32 nucleótidos que es una variante del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 36 gggagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F) Estructuras secundarias putativas de los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 31 y 36 se muestran en la figura 14 y la figura 15. La secuencia de consenso se muestra con un círculo negro.

Los aptámeros con una longitud de 40 nucleótidos o más larga se separaron por transcripción y los aptámeros con una longitud más corta que esa se prepararon por síntesis química. El que estos ácidos nucleicos inhiba la unión de NGF y receptor de NGF se examinó de la misma manera como en el ejemplo 6 por el método de resonancia de plasmón de superficie.

Como resultado, todos estos ácidos nucleicos se encontró que tenían una actividad inhibidora (cuadro 1).

Además, la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas contra células PC 12 se examinó de la misma manera que en el ejemplo 7. Como resultado, una fuerte actividad inhibidora se encontró en SEQ ID NOs: 28 - 30, 32, 35 (cuadro 2).

El aptámero mostrado por SEQ ID NO: 32 ha sido acortado a 38 nucleótidos manteniendo la secuencia de consenso del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 5. Además, el aptámero mostrado por SEQ ID NO: 35 ha sido acortado a 38 nucleótidos manteniendo la secuencia de consenso del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 6. De lo anterior, se ha mostrado que la secuencia de consenso es importante por lo menos para SEQ ID NOs: 5 y 6.

Por otra parte, el aptámero mostrado por SEQ ID NO: 30 es una secuencia de cadena acortada del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 8 libre de la secuencia de consenso, y la actividad fue confirmada con la longitud de 41 nucleótidos. Se mostró que estos aptámeros eran utilizables como Inhibidores de NGF.

EJEMPLO 10 Modificación de aptámeros de cadena acortada Para incrementar la estabilidad de los aptámeros mostrado por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 en la sangre, variantes en donde el grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa ha sido reemplazada por un grupo o-metilo se prepararon. De la misma manera que en el ejemplo 7, la inhibición de crecimiento de neuritas por células PC 12 se examinó. Como resultado, todos estos aptámeros mostraron una actividad inhibidora fuerte.

Las secuencias de las formas modificadas se muestran a continuación. Los paréntesis en los nucleótidos muestran la modificación de la posición 2', F es átomo de flúor, M es grupo o-metilo, e idT es dT invertida. SEQ ID NO: 30(1): idT-gggau(F)aaaaau(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M) c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)-idT SEQ ID NO: 30(2). gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)a u(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 30(3): gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u( F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F) SEQ ID NO: 30(4): idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a( M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)-idT SEQ ID NO: 30(5): idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a( M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT SEQ ID NO: 30(6): idT-g(M)g(M)g(M)au(F)a( )aa(M)a(M)a(M)u(F)a(M)g( )a(M)g( )u(F)u(F)u(F)g(M )a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(M)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a( F)c(F)c(F)c(F)-idT SEQ ID NO: 32(1 ): idT-u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)a( M)a(M)g(M)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a-idT SEQ ID NO: 32(2): u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c (F)ac(F)a(M) SEQ ID NO: 32(3): u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)aac( F)c(F)ac(F)a SEQ ID NO: 32(4): u(F)gu(F)gga(M)gc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c (F)ac(F)a SEQ ID NO: 32(5): idT-u(F)g(M)u(F)gga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M) c(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT SEQ ID NO: 32(6): idT-u(F)g(M)u(F)g(M)ga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g (M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT SEQ ID NO: 35(1): idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M) g(M)g(M)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa-idT SEQ ID NO: 35(2): idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au( F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)aaa-idT SEQ ID NO: 35(3): gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a(M )a(M)a(M) SEQ ID NO: 35(4): idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M) g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-¡dT SEQ ID NO: 35(5): idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c( F)a(M)g(M)g( )au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a( )-idT SEQ ID NO: 35(6): idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c( F)a(M)g(M)g(M)a(F)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT EJEMPLO 11 Identificación de sitio de unión de NGF del aptámero por el método de huella Para confirmar que la secuencia de consenso es un sitio de unión de NGF, un experimento de digestión con enzima se realizó en ausencia de NGF y en presencia de NGF. Cuando la secuencia de consenso es un sitio de unión de NGF, los resultados deben ser que la digestión de enzima ocurre en ausencia de NGF; la nucleasa no puede unirse a una secuencia de consenso en presencia de NGF y la digestión de enzima no ocurre. Usando un aptámero en donde la sustancia fluorescente (FAM6) fue conjugada con el 5' terminal o 3' terminal del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 62, el experimento se realizó. El aptámero mostrado por SEQ ID NO: 62 contiene una secuencia de consenso de UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92). Como la nucleasa, 3 tipos de nucleasa S1 (fabricada por TAKARA BIO) que selectivamente digiere cadenas sencillas, la nucleasa V1 (fabricada por Ambion) que selectivamente digiere dobles cadenas y la nucleasa T1 (fabricada por Ambion) que selectivamente digiere G de cadenas sencillas se usaron. Cada reacción de enzima se realizó bajo las condiciones del cuadro 4 en referencia al documento de especificación anexo. A la solución de reacción de nucleasa S1 se añadió 0.833 mM ZnCI2.

CUADRO 4 En el experimento con adición de NGF, la relación molar de aptámero y NGF se fijó a 1 :2, y se disolvieron en solución B, un regulador de pH de unión. Aquí, la solución B es una solución mixta de 145 mM de cloruro de sodio, 5.4 mM de cloruro de potasio, 1.8 mM de cloruro de calcio, 0.8 mM de cloruro de magnesio, y 20 mM de Tris (pH 7.6).

Después de una reacción de enzima, la reacción fue descontinuada por un tratamiento de fenol? cloroformo, y una fracción soluble en agua se recuperó y se concentró. Después, el ácido fosfórico terminal se removió por fosfatasa alcalina (fabricada por TAKARA BIO). El tratamiento de enzima con fosfatasa alcalina se realizó a 37°C durante 1.5 hr por referencia al documento de especificación anexo. Estas muestras fueron analizadas por 20% de electroforesis de poliacrilamida desnaturalizada. Para detección de fluorescencia, se usó Storm850 (fabricado por GE Healthcare). Como resultado del experimento, GAAAGA de UGAAAGAAACC (SEQ ID NO: 92) se fue digerido por nucleasas S1 y T1 en ausencia de NGF. Por otra parte, la digestión fue remarcablemente suprimida en presencia de NGF¡ AQUÍ, el nucleótido pirimidina es una forma modificada por fluoro. Lo anterior revela que la parte de secuencia de consenso es un sitio de unión de NGF.

EJEMPLO 12 Cambios en actividad por introducción de mutación en parte de secuencia de consenso La mutación fue introducida en la parte de secuencia de consenso y cambios en la actividad se evaluaron usando células Neuroscreen-1 de la misma manera que en el ejemplo 8. Como un aptámero que contenía una secuencia de consenso UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91), se usó una secuencia larga de 38 nucleótidos mostrada por SEQ ID NO: 35. Los resultados de esto se muestran en el cuadro 5.

Cuando un aptámero libre de introducción por mutación se añadió a 300 nM, se vio la inhibición de crecimiento de neuritas por 92%. Por otra parte, la actividad desapareció por completo mediante la introducción de una mutación de un nucleótido. Cuando A en la 3a a 5a de UGAAAAAAACC (SEQ ID NO: 91) fue sustituida por tipo ADN, la actividad desapareció por completo. De lo anterior, se muestra que la secuencia de consenso es importante para la inhibición de actividad de NGF.

CUADRO 5 El cuadro 5 muestra los resultados del experimento inhibidor de crecimiento de neuritas usando células Neuroscreen-1. El aptámero mostrado por SEQ ID NO: 35 y una variante del mismo se añadieron a 300 nM. El nucleótido de pirimidina es una forma modificada por fluoro, las - letras mayúsculas del nucleótido de purina muestran tipo ARN, y las letras minúsculas muestran tipo ADN. La mutación fue introducida en las partes subrayadas.

EJEMPLO 13 Consideración relacionada con secuencias de consenso En este experimento, las secuencias de consenso aparecieron a alta frecuencia en SELEX bajo diferentes condiciones tales como diferentes acervos, secuencias de iniciador y similares (Ejemplos 1 - 4). De las 74 secuencias obtenidas por SELEX, 59 secuencias contenían aptámeros que tenían una secuencia de consenso de UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), en donde N es cualquier nucleótido de A, G, C y U, y U puede ser T. Y es un nucleótido de pihmidina. De estos, 29 secuencias contenían UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110) y 13 secuencias contenían UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111).

Por otra parte, las secuencias de consenso mostradas por las fórmulas CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) y AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109) se encontraron en 3 secuencias y 2 secuencias respectivamente. De estas, una secuencia contenía CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112), y una secuencia contenía CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113). Pueden ser mostradas por la fórmula HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106).

Puesto que estas secuencias de consenso son necesarias para una forma de cadena cortada de 38 nucleótidos (ejemplo 9), protegida por la adición de NGF en un experimento e digestión de enzima (ejemplo 11), y la actividad fisiológica disminuye marcadamente por la introducción de una mutación (ejemplo 12), está claro que son importantes para inhibir la función de NGF.

EJEMPLO 14 Introducción de mutación en aptámero de cadena acortada El que la actividad pueda ser mantenida después de la introducción de una mutación en un aptámero de cadena acortada fue confirmado. El aptámero de SEQ ID NO: 30(6) tiene una longitud de 41 nucleótidos y no contiene una secuencia de consenso. dT invertida se añade a las terminales 5' y 3'. La actividad se evaluó usando células Neuroscreen-1 de la misma manera que en el ejemplo 8. Los resultados se muestran en el cuadro 6.

Cuando los pares de bases G1 :C41 , A10:U33, A12:U31 en la parte de tallo predicha por el programa MFOLD fueron sustituidos por C1 :G41 , U10:A33, U12:A31 , la actividad no disminuyó marcadamente. Cuando G20 y G23 en la parte de bucle fueron sustituidos por A20 y A23, la actividad no disminuyó marcadamente, tampoco. A partir de lo anterior, se muestra que la actividad del aptámero mostrado por SEQ ID NO: 30(6) fue mantenida incluso después de la introducción de varias mutaciones.

CUADRO 6 (% de inhibición) 300 nM 100 nM 30 nM G1 :C41?C:G 98.1 92.0 19.5 A10:U33?U:A 98.3 80.8 12.1 A12:U31?U:A 96.0 93.1 35.8 G20?A 98.1 96.1 47.7 G23?A 98.0 91.2 31.0 SEQ ID NO: 30 98.6 92.7 28.4 EJEMPLO 15 Comparación con aptámero de NGF descrito en referencia de la técnica anterior Los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 y los aptámeros de NGF descritos en referencia de la técnica anterior (Binkley J et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3198) se compararon para actividad de unión de NGF, actividad inhibidora de unión de NGF-receptor de NGF y actividad inhibidora de crecimiento de neuritas.

Los aptámeros descritos en la referencia de la técnica anterior fueron todos ellos ARN no modificados, y las secuencias de los mismos no concuerdan con las secuencias descritas en la presente especificación. Como los aptámeros descritos en la referencia de la técnica anterior, H1 , L2 y L6 que muestran alta actividad de unión se seleccionaron, y se transcribieron con T7 polimerasa. La actividad de unión fue evaluada por un método similar al del ejemplo 1 , la actividad inhibidora de unión de NGF-receptor de NGF se evaluó por un método similar al del ejemplo 6, y la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas se evaluó por un método similar al del ejemplo 8.

Como resultado, se encontró que H1 , L2 y L6 se unen a NGF pero la actividad es menor que los aptámeros mostrado por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 (cuadro 7). Además, H1, L2 y L6 no inhibió la unión de NGF y receptor de NGF, y no mostró una actividad inhibidora aun cuando se añadió a 500 nM en el experimento inhibidor de crecimiento de neuritas (cuadro 7). De lo anterior, se muestra que los aptámeros descritos en la presente especificación tienen actividad más alta que los aptámeros descritos en la referencia de la técnica anterior.

CUADRO 7 El cuadro 7 muestra actividad de unión de NGF, inhibición de unión de NGF-receptor de NGF, y actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NGF de los aptámeros mostrados por SEQ ID NOs: 30, 32, 35 y los aptámeros H1 , L2, L6 descritos en el documento que no es patente 1.

La actividad de unión de NGF se evaluó con base en el valor de RU máximo obtenido por unión de NGF y SEQ ID NO: 35 como 100%. Cuando no es menor que 80%, "++" es indicado, cuando no es menor que 50%, "+" es indicado, y cuando es 50% o más bajo, "-" es indicado. En cuanto a la inhibición de unión de NGF-receptor de NGF, "+" significa una actividad inhibidora (%) de no menos de 60%, y "-" significa una actividad inhibidora (%) de no menos de 60%.

La actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NGF es la actividad inhibidora (%) cuando la concentración final del aptámero es 500 nM o 250 nM.

Aplicabilidad industrial El aptámero y el complejo de la presente invención pueden ser útiles como medicamentos, agentes de diagnóstico o reactivos para enfermedades tales como dolor, enfermedad inflamatoria y similares. El aptámero y el complejo de la presente invención también pueden ser útiles para la purificación y concentración de NGF, así como detección y cuantificación de NGF.

Esta solicitud se basa en la solicitud de patente No. 2008-244982 presentada en Japón (fecha de presentación: 24 de septiembre de 2008), cuyo contenido se incorpora aquí en su totalidad.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un aptámero que se une a NGF e inhibe la unión de NGF y un receptor de NGF.

2. - Un aptámero que se une a NGF e inhibe una actividad de crecimiento de neuritas de NGF.

3. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque tiene un 50% de concentración inhibidora (CI50) de no más de 100 nM.

4. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque tiene un 50% de concentración inhibidora (CI50) de no más de 10 nM.

5.- El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque por lo menos un nucleótido es modificado.

6.- El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque comprende una secuencia mostrada por HGAANNNANCY (SEQ ID NO: 106), en donde N es cualquier nucleótido, H es un nucleótido excluyendo G, Y es un nucleótido de pirimidina, y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado.

7. - El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque comprende una secuencia mostrada por UGAAANNANCY (SEQ ID NO: 107), CGAANNAAACY (SEQ ID NO: 108) o AGAANNAAACY (SEQ ID NO: 109), en donde N es cualquier nucleótido, Y es un nucleótido de pirimidina y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado.

8. - El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque comprende una secuencia mostrada por UGAAAAAAACY (SEQ ID NO: 110), UGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 111), CGAACAAAACY (SEQ ID NO: 112) o CGAAAGAAACY (SEQ ID NO: 113), en donde Y es un nucleótido de pirimidina y por lo menos un nucleótido de la secuencia antes mencionada es modificado.

9. - El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado además porque los grupos hidroxilo en la posición 2' de una ribosa de nucleótidos de pirimidina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi.

10.- El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado además porque los grupos hidroxilo en la posición 2' de una ribosa de nucleótidos de purina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi.

11. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos (a), (b) y (c) siguientes: (a) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina); (b) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina), en donde 1 o varios nucleótidos son reemplazados, deletados, insertados o añadidos; y (c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de 70% o más a una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1-9, 12, 24-55 y 57-90 (en donde uracilo puede ser timina).

12. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque por lo menos uno de los nucleótidos es modificado.

13. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque los grupos hidroxilo en la posición 2' de nucleótidos de pirimidina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi.

14. - El aptámero de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque los grupos hidroxilo en la posición 2' de nucleótidos de purina respectivos son los mismos o diferentes y no reemplazados o reemplazados por un átomo o un grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor y un grupo metoxi.

15. - Un complejo que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y una sustancia funcional.

16. - El complejo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la sustancia funcional es una sustancia de alta afinidad, una sustancia de mareaje, una enzima, un vehículo de suministro de fármaco o un fármaco.

17. - Un medicamento que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

18. - Un agente anti-dolor que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

19. - Un agente anti-inflamatorio que comprende el aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de conformidad con la reivindicación 15 ó 16.

20.- Un agente de diagnóstico que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

21.- Una sonda para detección de NGF, que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

22. - Un vehículo de fase sólida para purificación de NGF, que comprende el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

23. - Un método de detección de NGF, que comprende usar el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.

24. - Un método de purificación de NGF, que comprende usar el aptámero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el complejo de la reivindicación 15 ó 16.