JP5696830B2 - Ｐａｒ−２活性化阻害物質 - Google Patents

Description

本発明は、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ−２）の活性化を阻害する物質に関する。

血液凝固反応は、活性化された凝固因子が下流の凝固因子を活性化する一連の酵素反応であるが、同時に、血液中の細胞や血管内皮細胞、さらに血管周囲の細胞の活性化をひき起こす。凝固因子によるこれらの細胞の活性化には、プロテアーゼ活性化受容体（Protease activated receptors:ＰＡＲ）と呼ばれる受容体が重要な役割を演じている。ＰＡＲは７回膜貫通型のＧ蛋白共役受容体の１ファミリーである。ＰＡＲは、細胞外に伸びる受容体のＮ末端にリガンド部位を有するが、非活性の状態ではリガンド部位のさらにＮ末端側にあるペプチドにより、リガンド活性が抑制されている。このＮ末端ペプチドがプロテアーゼで切断されると、リガンドが受容体の第２ループ周辺に結合することで受容体が構造変化し、Ｇ蛋白質を活性化すると考えられている（非特許文献１）。

現在までにＰＡＲ−１からＰＡＲ−４までの４種類が知られている。ＰＡＲ類のうち、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４はトロンビンによって活性化されるが、ＰＡＲ−２はトロンビンによって活性化されず、他のセリンプロテアーゼ（トリプシン、トリプターゼなど）によって活性化される（非特許文献１）。

ＰＡＲ−２は、血管内皮細胞あるいは血管周囲の細胞に存在するのみならず、神経細胞、消化器系の細胞、気道の上皮細胞と平滑筋細胞などに存在する。ＰＡＲ−２は、上記のようにトリプシンおよび肥満細胞に存在するトリプターゼで活性化されて、ＣＧＲＰ（calcitonin gene related peptide）を放出させ、神経性の浮腫、炎症に関係する（非特許文献２）。また、気道緊張性の制御および呼吸器炎症の発生・進展に関与する（非特許文献３）。例えば、上皮からのプロスタノイド産生を介した気道弛緩、平滑筋や繊維芽細胞の増殖、炎症細胞の浸潤および炎症誘導物質の産生亢進などに関与する。気管支喘息の病的状態でＰＡＲ−２の発現増大が認められていることからも、ＰＡＲ−２の起炎症作用が臨床的に注目されている（非特許文献３）。このように、ＰＡＲ−２は、循環器系、呼吸器系、神経系、皮膚・骨系、消化器系、血液、泌尿器系、外分泌腺など、生体現象と深い関わりを有しており（非特許文献４）、各種の炎症に関連している。

そこで、新規抗炎症治療薬を目的としたＰＡＲ−２のアンタゴニストあるいはアゴニストの開発が進められており、いくつかの候補物質がスクリーニングされている（特許文献１および２）。例えば、ＰＡＲ−２に結合する抗体が報告されている（特許文献３）。しかし、より有効なＰＡＲ−２活性化阻害物質がさらに求められている。

ところで、一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡが種々の立体構造をとり、低分子からタンパク質までの種々の化合物を認識して結合して、抗体のような機能を有し得ることが明らかになっている（非特許文献５）。このような核酸分子をアプタマーと称する。アプタマーは、例えば、ランダム配列の中からＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）という選別方法によって得られる（非特許文献５）。

アプタマーは、試験管内で大量に合成できること、抗体よりも結合力が強いものが得られる可能性があること、安定化できることなどの利点を有する。そのため、アプタマーは抗体と同様に、医療や医学用途などに応用され得る。医療などへの応用が検討されている例として、ＨＩＶ−１逆転写酵素に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献６）、老人性黄斑変性症の治療薬として開発中の血管内皮細胞増殖因子に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献７）などが報告されている。しかし、ＰＡＲ−２活性化阻害物質としてアプタマーが用いられた例は報告されていない。

特表２００３−５３０８７５号公報 特表２００８−５１９０３９号公報 特表２００９−５２５７５８号公報

内場ら, 血管医学, 2005-2006年, 6巻, pp.39-45 丸山征郎, Surgery Frontier, 2000年, 7巻, pp.69-71 大谷ひとみら, Surgery Frontier, 2005年, 12巻, pp.27-34 小川道雄, Surgery Frontier, 2005年, 12巻, pp.105-107 Tuerk C.およびGold L., Science,1990年, 249巻, pp.505-510 Kensch O.ら, J.Biol.Chem., 2000年, 275巻, pp.18271-18278 Ruckman J.ら, J.Biol.Chem., 1988年, 273巻, pp.20556-20567 Nystedt S.ら, Eur. J. Biochem., 1995年, 232巻, pp.84-89 Hollenberg M.およびCompton S., Pharmacol. Rev., 2002年, 54巻, pp.203-217 Ossovskaya V.およびBunnett N., Physiol. Rev., 2004年, 84巻, pp.579-621

本発明は、ＰＡＲ−２に特異的に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る物質を提供することを目的とする。

本発明は、配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害する、アプタマーを提供する。

１つの実施態様では、上記アプタマーは、一本鎖ＤＮＡである。

他の実施態様では、上記アプタマーは、３５〜１２０塩基の塩基配列を有する。

さらに他の実施態様では、上記アプタマーは、配列表の配列番号９の１位から５０位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む。

本発明はまた、配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害する、モノクローナル抗体を提供する。

本発明はまた、上記アプタマーまたはモノクローナル抗体を含む、抗炎症剤、ＰＡＲ−２が関与する疾患の診断試薬、診断用キット、予防剤、治療剤を提供する。

本発明はまた、上記アプタマーまたはモノクローナル抗体を含む、ＰＡＲ−２の検出試薬を提供する。

本発明によれば、ＰＡＲ−２に特異的に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る、アプタマーおよびモノクローナル抗体が提供される。したがって、ＰＡＲ−２が関与する種々の炎症、例えば神経性の炎症、呼吸器系の炎症、気管支炎などの抗炎症剤としての効果が期待される。

ＳＥＬＥＸ法の概要を示す工程図である。 抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーの、トリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化の阻害効果を示すグラフである。 抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体の、トリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化の阻害効果を示すグラフである。 抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーの、トリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入阻害効果を示すグラフである。 抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体の、トリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入阻害効果を示すグラフである。 蛍光標識された抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーＥＥＬ４が、細胞表面に発現しているヒトＰＡＲ−２を認識することを示すヒストグラムである。 蛍光標識された抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体２２Ｃｆあるいは２７Ｄが、細胞表面に発現しているヒトＰＡＲ−２を認識することを示すヒストグラムである。

本明細書中で「アプタマー」とは、特定の化合物に特異的に結合し得る一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡをいう。本発明においては、この特定の化合物がＰＡＲ−２である。

本発明のアプタマーは、配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る（以下、このようなアプタマーを、単に「抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマー」または「抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマー」とも称する）。本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、３５塩基以上であることが好ましく、４５塩基以上がより好ましい。本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、１２０塩基以下であることが好ましく、１００塩基以下がより好ましい。３５塩基未満あるいは１２０塩基を超えると、アプタマーとしての機能が低下する。好ましくは、４５塩基から８０塩基程度である。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーの具体的な例としては、配列表の配列番号９の１位から５０位までの塩基配列で示されるＤＮＡからなる一本鎖ＤＮＡが挙げられる。配列番号９の一本鎖ＤＮＡは、５０塩基からなるが、このＤＮＡを含む塩基長のより長い抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーも、配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る限り、本発明に含まれる。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、アプタマーを得るための一般的な方法であるＳＥＬＥＸ法によって得られ得る。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を図１に基づいて説明する。

まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡを上記プライマー配列を用いるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、（１）このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。（２）得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ^２＋存在下でＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡアプタマーの複製の正確性を低下させてＤＮＡアプタマーに変異を導入しやすくする。この結果、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、標的物質との結合力がより強い可能性がある。すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールについて、上記の（１）、（２）の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に特異的に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。

このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、およびクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。

本発明においては、ＳＥＬＥＸ法における標的物質はＰＡＲ−２である。ＰＡＲ−２の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）は、非特許文献８に記載されており、この塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を元に、例えば、遺伝子組換え技術によりＰＡＲ−２を生産し、入手できる。必ずしもＰＡＲ−２の全長アミノ酸配列を用いる必要はなく、本発明では、ヒトＰＡＲ−２のアミノ酸配列（配列番号２）の２１２位〜２２６位に相当するアミノ酸配列（配列番号３）を利用できる。この配列番号３のアミノ酸配列は、ＰＡＲ−２の活性化に重要な役割を担い得る（非特許文献９および１０）。この配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、以下のようにして化学合成され得る。ペプチドの合成は、９−fluorenylmethoxycarbonyl（Fmoc）法に従い、自動化シンセサイザを使って行われ得る。tert-butoxycarbonylによって保護されたFmoc-レジンを充填したWang-PHB樹脂が固相化の支持体として用いられ得る。０．１ｍＭアミノ酸をそれぞれの結合に使用し得る。使用されるアミノ酸（側鎖の保護基）は、例えば、アスパラギン（triphenylmethyl）、セリン（tert-butyl）、リジン（tert-butoxy-carbonyl）などが挙げられる。樹脂（レジン）に結合したFmoc-アミノ酸の遊離は、ピペリジンを使用して行われ得る。アミノ酸の結合には2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborateおよびhydroxybenzotriazole（HOBt）が用いられ得る。５％フェノール含有ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、５％thioanisole、５％ethanedithiole、および７％水を用いて、樹脂からのペプチドの切り出しおよびすべての保護基の除去を行い得る。合成の進行は、エレクトロスプレーイオン化質量分析機によってモニターされ得る。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法で決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。合成の手順の一例を以下に示す。まず、３’末端のヌクレオチドが３’水酸基を介して結合されたＣＰＧ（controlled pore glass）担体をカラムに詰め、次いで、ヌクレオチドのリボースの５’位の保護基であるジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸によって除去して、脱トリチル化を行い得る。リボースの３’位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイト誘導体である２番目のヌクレオチドを、脱トリチル化された１番目のヌクレオチドの５’水酸基に、塩基触媒（テトラゾール）を用いてカップリングさせ、未反応の５’水酸基を無水酢酸によってアセチル化し得る。２つのヌクレオチド間の結合を、ヨードを用いて酸化して、３価のリンから５価のリン酸エステルへ変換し得る。上記の脱トリチル化からリン酸エステルへの変換までの操作を目的のＤＮＡ鎖長になるまで繰り返し得る。すべての反応終了後、カラムからアンモニア処理によってオリゴＤＮＡを切り出し、逆相カートリッジカラムによって精製し、凍結乾燥し得る。

なお、本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーをより安定化させるために、抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーを、修飾ヌクレオチドを用いて合成してもよい。あるいは、抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーに蛍光または発光ドメインが付加されていてもよい。蛍光または発光ドメインが付加された抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーは、ＰＡＲ−２に特異的に結合するので、ＰＡＲ−２の検出試薬として使用できる。

本発明のモノクローナル抗体は、配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る（以下、このようなモノクローナル抗体を、単に「抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体」または「抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体」とも称する）。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体は、例えば、以下のようにして調製され得る。上述のようにして調製される配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に相当する）を免疫原（必要に応じて、そのシステイン残基に、ペプチドの免疫活性を高めるために、ＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）を結合させ得る）としてマウスを免疫し、免疫したマウスから脾臓細胞を取り出し、取り出された脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合して不死化させ得る。ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン（H）、アミノプテリン（A）およびチミジン（T）を含む培地）での培養で生存する細胞を融合細胞（ハイブリドーマ）として選抜し、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法またはイムノブロット法でスクリーニングし、陽性と判定した細胞株をクローニングして、モノクローナル抗体を取得し得る。

ＰＡＲ−２の活性化の阻害は、トリプシン刺激によるＰＡＲ−２の活性化が、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘導することを利用して検出および測定できる。例えば、ＮＦ−κＢ結合ＤＮＡ断片の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクターとヒトＰＡＲ−２発現ベクターとを動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）に導入し、培養後、培地にトリプシンおよびＰＡＲ−２活性化阻害候補物質（例えば、アプタマー、モノクローナル抗体など）を添加し、一定時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＰＡＲ−２の活性化阻害の検出および測定ができる。ＰＡＲ−２の活性化の阻害はまた、ヒトＰＡＲ−２活性化が、細胞内カルシウムイオン濃度上昇を誘導することを利用して検出および測定できる。例えば、ヒトＰＡＲ−２発現ベクターを動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）に導入し、培養後、培地にＰＡＲ−２活性化阻害候補物質（例えば、アプタマー、モノクローナル抗体など）を添加した後にトリプシンを添加した直後に生じる細胞内カルシウムイオン濃度を例えば蛍光プレートリーダーを用いて測定することにより、ＰＡＲ−２の活性化阻害の検出および測定ができる。このようにして、ＰＡＲ−２との親和性の強いアプタマーまたはモノクローナル抗体を選択することができる。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーまたは抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体は、ＰＡＲ−２の活性化としてヒトＰＡＲ−２活性化を介して誘導される転写因子ＮＦ−κＢの活性化について、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約４０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、抑制し得る。本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーまたは抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体は、ＰＡＲ−２の活性化として、ヒトＰＡＲ−２活性化を介して誘導される細胞内カルシウムイオン濃度上昇について、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約４０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、抑制し得る。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーまたは抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体は、ＰＡＲ−２の活性化としてヒトＰＡＲ−２活性化を介して誘導される細胞内カルシウムイオン濃度上昇について、５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０）が、好ましくは１μＭ以下であり、より好ましくは１００ｎＭ以下であり、さらに好ましくは７０ｎＭ以下である。

本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーおよび抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体はともに、ＰＡＲ−２と特異的に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得るため、循環器系、呼吸器系、神経系、皮膚・骨系、消化器系、血液、泌尿器系、外分泌腺などの各種の炎症に対する抗炎症剤として使用される。したがって、ＰＡＲ−２が関与する疾患の治療剤あるいは予防剤として用いることができる。

さらに、本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーおよび抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体はともに、例えば、ＥＬＩＳＡ、組織染色などのような、通常抗体が用いられ得る種々の分析において、ＰＡＲ−２が関与する疾患の診断試薬あるいは診断用キットとして用いることができる。

このようなＰＡＲ−２の検出に供する試料としては、種々の生体試料（血液、細胞、組織など）およびその処理物が挙げられる。このような試料について、ＰＡＲ−２を検出することにより、ＰＡＲ−２が関与する疾患、例えば、循環器系、呼吸器系、神経系、皮膚・骨系、消化器系、血液、泌尿器系、外分泌腺などの各種の炎症を検出／診断することができる。

さらに、本発明の抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーおよび抗ＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体はともに、ＰＡＲ−２が関与する疾患の発症機構の解明などの基礎研究にも用いられ得る。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。

（実施例１：抗ＰＡＲ−２ペプチドアプタマーの取得）
（１−１：一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの作製）
５０塩基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４および５）を含む種々の一本鎖ランダムオリゴＤＮＡを調製した。これらの一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの合成は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託し、精製標品を得た。精製標品をＳＥＬＥＸライブラリーのテンプレートＤＮＡとした。

（１−２：ヒトＰＡＲ−２ペプチドの合成）
ヒトＰＡＲ−２のアミノ酸配列（配列番号２）の２１２位〜２２６位に相当するアミノ酸配列（配列番号３：ＶＫＱＴＩＦＩＰＡＬＮＩＴＴＣ）のペプチドを調製した。このペプチドの合成は、オペロンバイオテクノロジー株式会社に委託し、精製標品を得た。

（１−３：ヒトＰＡＲ−２ペプチドのビーズへの結合）
上記１−２で得たヒトＰＡＲ−２ペプチドを、PIERCE社製のSulfoLink（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号20401）を用いて製品の指示書に従って、次のようにビーズに固定化した。

まず、カップリングゲルをカラムに詰め、カップリング緩衝液（５０ｍＭ Tris-HCl，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）で平衡化した。ヒトＰＡＲ−２ペプチドをカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で１時間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液でカラムを数回洗浄した。Ｌ−システインをカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液およびリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-buffered saline;PBS）（８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．２）でカラムを数回洗浄した。なお、反応前および反応後の吸光度を測定することによって、ヒトＰＡＲ−２ペプチドの固定化量を算出した。固定化後のゲル（ビーズ）を小分けし、使用するまで冷暗所に保存した。また、ヒトＰＡＲ−２ペプチドを固定化していないビーズは、ヒトＰＡＲ−２ペプチドをカップリング緩衝液に溶解しないこと以外は同様の操作で調製した（SulfoLinkビーズの活性部位をシステインでブロックしたもの）。

（１−４：ＳＥＬＥＸ法）
上記１−１で合成したランダムオリゴＤＮＡを鋳型にして、forwardプライマー（配列番号４）とreverseプライマー（配列番号５）とによるＰＣＲ（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×１２サイクル）を行った。増幅後、forwardプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲによりプラス鎖を増幅した（１サイクル：９４℃，１５秒；５５℃，１５秒；７２℃，１５秒×４５サイクル）。増幅したプラス鎖をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーとした。このＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーをＰＢＳに溶解し、９５℃で５分間加熱し、室温に戻した。次いで、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーと上記１−３で調製したヒトＰＡＲ−２ペプチドを固定化させたビーズとを混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳでビーズを数回洗浄した。適量の水をビーズに加えて混合し、１００℃で５分間加熱し、ＰＡＲ−２ペプチドビーズに結合したＤＮＡを解離させて回収した。回収したＤＮＡと上記１−３で調製したヒトＰＡＲ−２ペプチドを固定化していないビーズとを混合し、室温で１０分間インキュベートした。素通りしたＤＮＡ（ヒトＰＡＲ−２ペプチドに結合するＤＮＡ）を回収して、エタノール沈殿法によって濃縮した。濃縮したＤＮＡを鋳型にして、上記の操作を５〜１５ラウンド繰り返した。この時、５〜８ｍＭのＭｇ^２＋存在下でＰＣＲを行って、変異を導入した。

（１−５：クローニング）
第１５ラウンドで得られたＤＮＡを、forwardプライマー（配列番号４）およびreverseプライマー（配列番号５）を用いるＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ヒトＰＡＲ−２ペプチド特異的ＤＮＡを得た。このＤＮＡを平滑末端クローニングベクター（Invitrogen社製Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCR Cloning Kit for Sequencing（カタログ番号K2875J10））に導入し、次のようにして配列を決定した。

まず、ヒトＰＡＲ−２ペプチド特異的ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）と平滑末端クローニングベクターとを混合し、室温で５分間インキュベーションした。反応終了後、反応液の一部をコンピテントセルに加え、氷冷下で３０分間インキュベーションした。４２℃にて３０秒間ヒートショックした後、氷上で２分間冷却した。冷却した反応液に、キット中に含まれているＳＯＣ培地を加えて３７℃にて１時間のインキュベーションを行った。適量を寒天プレート（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地）に播種し、３７℃にて一晩培養した。無作為に数十個のクローンを選び、これらのクローンからアルカリ法によってプラスミドＤＮＡを抽出・調製した。

（１−６：配列決定）
上記１−５で得られたプラスミドＤＮＡ中のヒトＰＡＲ−２ペプチド特異的ＤＮＡの配列を、Applied Biosystem社製のABI377を用いてBigDye Terminator Cycle sequence法によって決定した。

その結果、配列番号６〜９（それぞれＥＥＬ１〜４と呼ぶ）に示す５０塩基の一本鎖ＤＮＡが得られた。

配列番号６：５’−ＧＡＣＴＣＧＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＡＴＴＧＧＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣ−３’（ＥＥＬ１）
配列番号７：５’−ＧＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＡ−３’（ＥＥＬ２）
配列番号８：５’−ＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＣＧＧＧＣＴ−３’（ＥＥＬ３）
配列番号９：５’−ＣＣＧＧＣＧＡＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＣＡＡＧＣ−３’（ＥＥＬ４）

（実施例２：抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体の取得）
（２−１：免疫原の調製）
上記１−２で合成したペプチド（配列番号３：配列番号２のヒトＰＡＲ−２のアミノ酸配列の２１２位〜２２６位に相当するペプチド）のシステイン残基に、ペプチドの免疫活性を高めるために、ＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）を結合させて免疫原とした（これをＫＬＨ−ペプチドと呼ぶ）。

（２−２：マウスへの免疫）
ＰＢＳに溶解した２５μｇのＫＬＨ−ペプチドを、フロイント完全アジュバントと共に懸濁して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。その２週間後に、同量の抗原をフロイント不完全アジュバントに懸濁して、同じマウスの腹腔に注射した。これをさらに２〜４回繰り返した。

（２−３：ハイブリドーマの作成）
最終免疫から３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を分散させた。ポリエチレングリコールを用いて、脾臓細胞をミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞と融合させた（融合により脾臓細胞の増殖が半永久化される）。融合した細胞（ハイブリドーマ）のみが生育するＨＡＴ培地（ヒポキサンチン（H）、アミノプテリン（A）およびチミジン（T）を含む培地）（Sigma社製）で培養し、増殖したハイブリドーマをクローン化した。

（２−４：抗ヒトＰＡＲ−２ペプチド抗体を生産するハイブリドーマの選択）
クローン化したハイブリドーマの培養上清について、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法を利用してヒトＰＡＲ−２ペプチドに結合する抗体の有無を検定した。その結果、１６Ａ、１６Ｂ、２２Ａ、２２Ｃｆ、２７Ａ、２７Ｄの６クローンが抗ヒトＰＡＲ−２ペプチド抗体を生産するハイブリドーマとして得られた。

（２−５：各モノクローナル抗体の性質の検定）
単一クローン化されたハイブリドーマを拡大培養した後、培養上清からプロテインＧカラム（ファルマシア社製MAbTrap GII）を用いてマニュアルに従って抗体を精製した。それぞれの抗体はIsoStrip（登録商標）mouse monoclonal antibody isotyping kit（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いてアイソタイプを解析した。その結果、２２ＣｆはＩｇＧ２ａ／κで、それ以外はＩｇＧ１／κであった。

（実施例３：ヒトＰＡＲ−２活性化を介して誘導されるＮＦ−κＢ活性化の抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーまたは抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体による阻害）
トリプシン刺激によるＰＡＲ−２活性化は、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘導する。実施例１で得られたアプタマーあるいは実施例２で得られたモノクローナル抗体がＰＡＲ−２活性化の阻害能を示すかをＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。以下にその手順を示す。

ＮＦ−κＢ結合ＤＮＡ断片の下流にルシフェラーゼ遺伝子を結合させたレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃを、Stratagene社から購入した。４ｍＭ L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌのpenicillin G、および１００μｇ／ｍｌのstreptomycinを含有するＤ−ＭＥＭ（ニッスイ社製）で培養した１×１０^５個のＣＯＳ−７細胞（ATCC（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から購入、ATCC Number:CRL-1651）に０．０１μｇのレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃおよび０．１μｇのヒトＰＡＲ−２発現ベクター（Sigma社製pFLAG-CMV1ベクターに、ヒトＰＡＲ−２のシグナルペプチドを除去したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを挿入したもの）をＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて導入した。４８時間培養後、培地にトリプシン（最終濃度２５ｎＭ、カルビオケム社製）とアプタマー（最終濃度１μＭ）あるいはモノクローナル抗体（最終濃度６８ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ））を添加し、さらに６時間培養後、ルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase Reporter Assay System（プロメガ社製）により測定した。対照として、アプタマーまたは抗体無添加、およびマウスＩｇＧ（Invitrogen社より入手）添加を用いた。

図２は、種々のアプタマーのトリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化の阻害の結果を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性を相対光単位（Relative light units）で表し、横軸は試験物質の結果を表す。横軸は、左から順に、トリプシンおよびアプタマー無添加、トリプシン添加＋アプタマー無添加、トリプシン添加＋ＥＥＬ１添加、トリプシン添加＋ＥＥＬ２添加、トリプシン添加＋ＥＥＬ３添加、トリプシン添加＋ＥＥＬ４添加を表す。図２に示されるように、トリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化は、対照のアプタマー非存在下と比較してＥＥＬ４の存在下では、約５０％抑制された。

図３は、種々のモノクローナル抗体のトリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化の阻害の結果を示す。縦軸はルシフェラーゼ活性を相対光単位（Relative light units）で表し、横軸は試験物質の結果を表す。横軸は、左から順に、マウスＩｇＧ、抗体１６Ａ、抗体１６Ｂ、抗体２２Ａ、抗体２２Ｃｆ、抗体２７Ａ、および抗体２７Ｄを表す。各試験物質において、白の棒グラフはトリプシン無添加を表し、黒の棒グラフはトリプシン添加を表す。図３に示されるように、トリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化は、対照のマウスＩｇＧ存在下と比較して、モノクローナル抗体２２Ｃｆあるいはモノクローナル抗体２７Ｄ存在下では約５０％抑制された。また、それら以外のモノクローナル抗体の存在下では約２０〜３０％の抑制が認められた。

これらの結果は、ＥＥＬ４（アプタマー）；ならびに１６Ａ、１６Ｂ、２２Ａ、２２Ｃｆ、２７Ａ、および２７Ｄ（モノクローナル抗体）が、ヒトＰＡＲ−２活性化の阻害能を発揮することを示している。

（実施例４：ヒトＰＡＲ−２活性化を介して誘導される細胞内カルシウムイオン濃度上昇の抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーまたは抗ヒトＰＡＲ−２モノクローナル抗体による阻害）
ＰＡＲ−２の活性化により誘導される細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が、抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーあるいは抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体によって阻害されるかどうかをカルシウム蛍光指示薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製Ｆｌｕｏ ４−ＡＭ）により評価した。以下にその手順を示した。使用した試薬は特に記載がある場合を除いてナカライテスク社製である。

２×１０^６個のＣＯＳ−７細胞に２μｇのヒトＰＡＲ−２発現ベクターを、FuGENE6を用いて導入した。４８時間培養後、細胞をPBS-based enzyme free cell dissociation buffer（Invitrogen社製）で分散させた。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を２×１０^５個／ｍＬとなるようにLoading緩衝液（２ｍＭ Ｆｌｕｏ ４−ＡＭ、０．０４％ pluronic（登録商標） F-127、１．２５ｍＭ probenecidを含むhank's balanced salt solution、ｐＨ７．４）に懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で１時間保温した後、細胞をあらかじめ３７℃で保温したＰＢＳを用いて１回洗浄した。洗浄後、細胞を２×１０^５個／ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５ｍＭ glucose、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ bovine serum albumin、１０ｍＭ HEPES、ｐＨ７．４）に懸濁し、０．１ｍＬずつ９６ウェル黒色プレート（Berthold社製）に分注した。細胞懸濁液を分注したウェルへトリプシン（最終濃度２５ｎＭ、カルビオケム社製）を添加し、直ちにTwinkle LB970蛍光プレートリーダー（Berthold社製）を用いて、蛍光変化を励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍで測定した。トリプシン添加の１０分前にアプタマー（最終濃度１μＭ）あるいはモノクローナル抗体（最終濃度６８ｎＭ（１０μｇ／ｍＬ））を添加することで、アプタマーあるいはモノクローナル抗体による細胞内カルシウムイオン濃度上昇の阻害効果を評価した。対照として、アプタマーまたは抗体無添加（すなわち、トリプシンのみ添加）、およびマウスＩｇＧ添加を用いた。それぞれの測定値はトリプシンのみで刺激したときに得られた測定値を１００％とした時の相対値として表した。

図４は、種々のアプタマーのトリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入阻害の結果を示す。縦軸はカルシウム流入量をトリプシンのみ添加に対する割合（％ control）で表し、横軸は試験物質の結果を表す。横軸は、左から順に、トリプシンのみ添加、トリプシン＋ＥＥＬ１添加、トリプシン＋ＥＥＬ２添加、トリプシン＋ＥＥＬ３添加、トリプシン＋ＥＥＬ４添加を表す。図４に示されるように、トリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入（細胞内カルシウムイオン濃度の上昇）は、対照のアプタマー非存在下と比較してＥＥＬ４の存在下では約５０％抑制された。

図５は、種々のモノクローナル抗体のトリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入阻害の結果を示す。縦軸はカルシウム流入量をトリプシンのみ添加に対する割合（％ control）で表し、横軸は試験物質の結果を表す。横軸は、左から順に、トリプシンのみ添加、トリプシン＋マウスＩｇＧ添加、トリプシン＋抗体１６Ａ添加、トリプシン＋抗体１６Ｂ添加、トリプシン＋抗体２２Ａ添加、トリプシン＋抗体２２Ｃｆ添加、トリプシン＋抗体２７Ａ添加、およびトリプシン＋抗体２７Ｄ添加を表す。図５に示されるように、トリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン流入は、対照のマウスＩｇＧ存在下と比較して、２２Ｃｆあるいは２７Ｄ存在下では約５０％抑制された。また、それら以外のモノクローナル抗体の存在下では約２０〜３０％の抑制が認められた。

これらの結果は、ＥＥＬ４（アプタマー）；ならびに１６Ａ、１６Ｂ、２２Ａ、２２Ｃｆ、２７Ａ、および２７Ｄ（モノクローナル抗体）が、ヒトＰＡＲ−２活性化の阻害能を発揮することを示している。

アプタマーＥＥＬ４ならびにモノクローナル抗体２２Ｃｆおよび２７Ｄについて、トリプシン誘導性の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０）を決定した。ＩＣ_５０は、アプタマーＥＥＬ４では４４ｎＭであり、抗体２２Ｃｆでは７０ｎＭであり、抗体２７Ｄでは６３ｎＭであった。

（実施例５：抗ヒトＰＡＲ−２アプタマーまたは抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドモノクローナル抗体によるヒトＰＡＲ−２の認識能）
実施例３および４においてトリプシン誘導性のＰＡＲ−２活性化のより高い抑制能を示したアプタマーＥＥＬ４ならびにモノクローナル抗体２２Ｃｆおよび２７Ｄについて、ヒトＰＡＲ−２の認識能を調べた。

なお、本実施例で使用した６−ＦＡＭ標識ＥＥＬ４は５’末端の合成をフルオレセイン標識ヌクレオチドアミダイト（6-FAMdCTP）で行う以外は上記１−１のようにして合成した。

２×１０^６個のＣＯＳ−７細胞に２μｇのヒトＰＡＲ−２発現ベクターあるいは対照としてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクター（Sigma社製）を、FuGENE6を用いて導入した。４８時間培養後、細胞をPBS-based enzyme free cell dissociation buffer（Invitrogen社製）で分散させた。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を２×１０^６個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ（牛胎児血清）／ＰＢＳ）に懸濁した。１．５ｍＬチューブ（グライナー社製）に細胞懸濁液を５０μＬずつ分注した後、３．１ｐｍｏｌ（５０ｎｇ）の６−ＦＡＭ標識ＥＥＬ４または６．８ｐｍｏｌ（１μｇ）の２２Ｃｆ、２７Ｄもしくは対照のマウスＩｇＧを添加し氷上にて６０分間のインキュベーションを行った。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液５０μＬに懸濁した。細胞の入ったチューブに２次抗体として５０ｎｇのロバＦ（ａｂ’）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体−ＰＥ（Abcam社製）を添加した後、氷上にて３０分間反応させた。なお、６−ＦＡＭ標識ＥＥＬ４による染色の場合は２次抗体の代わりにＰＢＳを添加した。反応後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに懸濁してフローサイトメトリーに供した。フローサイトメトリーには日本分光社製のＣｙｔｏＡＣＥ−３００を用いた。前方散乱光（forward scatter）および側方散乱光（side scatter）のドットプロットにて生細胞集団にゲートを設定し、当該集団に含まれる細胞についてＦＬ１（６−ＦＡＭ標識ＥＥＬ４による染色の場合）あるいはＦＬ２（２２Ｃｆもしくは２７Ｄもしくは対照のマウスＩｇＧによる染色の場合）のヒストグラムを取得して認識能を評価した。

図６は、蛍光標識されたアプタマーＥＥＬ４の結果を示す。縦軸は細胞数を表し、横軸は蛍光強度を表す。図中、「hPAR-2」はヒトＰＡＲ−２発現ベクター導入細胞、「mock」は対照ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクター導入細胞の結果を表す。図６に示されるように、アプタマーである６−ＦＡＭ標識ＥＥＬ４を用いた場合、ヒトＰＡＲ−２発現ベクターを導入した細胞では、対照としてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターを導入した細胞と比較して蛍光強度の増強が認められた。この結果は、抗ヒトＰＡＲ−２ペプチドアプタマーＥＥＬ４が、細胞表面に発現しているヒトＰＡＲ−２を認識することを示している。

図７は、蛍光標識されたモノクローナル抗体２２Ｃｆおよび２７Ｄならびに対照のマウスＩｇＧの結果を示す。各結果を表すヒストグラムの縦軸は細胞数を表し、横軸は蛍光強度を表す。図中、「hPAR-2」はヒトＰＡＲ−２発現ベクター導入細胞、「mock」は対照ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクター導入細胞の結果を表す。図７に示されるように、モノクローナル抗体２２Ｃｆあるいは２７Ｄを用いた場合、ヒトＰＡＲ−２発現ベクターを導入した細胞では、対照としてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターを導入した細胞と比較して蛍光強度の増強が認められた。一方、対照のマウスＩｇＧで染色した場合は、ヒトＰＡＲ−２発現ベクターあるいは対照としてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターを導入した細胞における蛍光強度の増強は認められなかった。これらの結果は、モノクローナル抗体２２Ｃｆおよび２７Ｄが、細胞表面に発現しているヒトＰＡＲ−２を認識することを示している。

本発明によれば、ＰＡＲ−２に特異的に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し得る、アプタマーおよびモノクローナル抗体が提供される。これらは、ＰＡＲ−２が関与する疾患、例えば、循環器系、呼吸器系、神経系、皮膚・骨系、消化器系、血液、泌尿器系、外分泌腺などの各種の炎症の予防・治療剤として使用され得る。また、これらは、ＰＡＲ−２が関与する疾患の検出試薬あるいは診断薬として利用され得る。また、これらは、ＰＡＲ−２が関与する疾患の発症機構の解明などの基礎研究にも用いられ得る。

Claims (7)

1. 配列表の配列番号２の２１２位から２２６位までのアミノ酸配列で示されるＰＡＲ−２ペプチド領域に結合し、ＰＡＲ−２の活性化を阻害し、配列表の配列番号９の１位から５０位までの塩基配列で示されるＤＮＡを含む、アプタマー。
2. 請求項１に記載のアプタマーを含む、抗炎症剤。
3. 請求項１に記載のアプタマーを含む、ＰＡＲ−２が関与する疾患の診断試薬。
4. 請求項１に記載のアプタマーを含む、ＰＡＲ−２が関与する疾患の診断用キット。
5. 請求項１に記載のアプタマーを含む、ＰＡＲ−２が関与する疾患の予防剤。
6. 請求項１に記載のアプタマーを含む、ＰＡＲ−２が関与する疾患の治療剤。
7. 請求項１に記載のアプタマーを含む、ＰＡＲ−２の検出試薬。

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