KR102150419B1 - Pd-l1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PD-L1에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 PD-L1과 특이적 결합하여 이를 억제함으로써 암세포에 대한 면역세포의 기능을 활성화하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 PD-L1 단백질을 높게 발현시킨 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 두 종의 펩타이드(PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2)를 선별한 것으로, 사람 및 마우스의 PD-L1과 결합하여 이의 기능을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 항체와 유사한 수준의 효과를 보였으며, 비교적 혈액 내 안정하여 향후 암 면역치료제로서 높은 가능성을 나타내고 있다.
Description
본 발명은 PD-L1에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것이다.
암 면역치료의 발달은 암 치료의 역사에서 중요한 변곡점에 도달했다. 면역 체크포인트 분자의 하나인 프로그램된 세포사멸(Programmed cell death; PD-1)은 여러 암에서 매력적인 치료 표적이 되었다. PD-1은 활성화시 T 세포에서 상향 조절되고, 종양-침윤 림프구에서 일반적으로 나타나는 소진된 T 세포에 많이 존재한다. PD-1과 이의 리간드인 PD-L1의 상호작용을 차단하면, 일부 환자에게서는 우수한 항종양 반응 및 임상 효과를 확인할 수 있었다.
최근에, 면역 체크포인트 분자를 표적으로 하는 선택적 단일 클론 항체는 넓은 범위로 인간에게서 발병하는 암 치료에 있어 전례 없는 성공을 거두었다. 인간 및 마우스 종양 샘플에 대한 패널 조사에 따르면, PD-L1은 종양 미세환경에서 숙주 면역 및 기질 세포뿐만 아니라 종양 세포에서도 높게 발현된다는 것이 밝혀졌다. PD-L1은 다양한 형태의 종양 세포에서 발현된다. PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 작동자(effector) T 세포의 기능을 강화 및 재활성화시키고, 사이토카인 생산을 증가시킨다.
PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 항체는 광범위하게 진행되고, 고도의 불응성 암을 가진 환자의 상당수에서 장기간 지속되었고, 좋은 임상 효과를 나타냈다. 따라서, PD-1 및 PD-L1에 대한 고효율, 저비용의 억제제를 개발할 의학적 필요성이 크다. 비록 상당수의 암 환자가 PD-1 차단 치료로 효과를 보지만, 많은 환자에서는 임상 효과가 나타나지 않는다. PD-1 차단 분자가 암 환자의 면역 체계를 어떻게 조절하는지는 부분적으로만 확인되었고, 상기 치료는 여전히 높은 생산 비용과 면역원성으로 인해 여전히 적용이 제한적이므로, 상기 치료에 대한 임상 효과를 결정하는 인자들을 시급히 밝힐 필요가 있다.
본 발명은 PD-L1에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학조성물, 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 약물 전달용 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 PD-L1에 결합하는 펩타이드 및 이를 이용한 암 면역치료 및 항암 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 펩타이드는 PD-L1과 특이적 결합하여 이를 억제함으로써 암세포에 대한 면역세포의 기능을 활성화하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 PD-L1 단백질을 높게 발현시킨 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 두 종의 펩타이드(PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2)를 선별한 것으로, 사람 및 마우스의 PD-L1과 결합하여 이의 기능을 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 항체와 유사한 수준의 효과를 보였으며, 비교적 혈액 내 안정하여 향후 암 면역치료제로서 높은 가능성을 나타내고 있다.
도 1은 PD-L1 플라스미드 벡터의 일시적인 형질감염 및 바이오 패닝 결과를 나타낸다. (a) 플라스미드 DNA는 일시적으로 형질감염되었고, GFP 형광도는 24 시간 및 48 시간에서 현미경으로 가시화되었다(스케일 바: 20μm). (b) 24시간 및 48 시간 간격에서 PD-L1 발현을 확인하기 위한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다. (c) 5회의 바이오-패닝을 수행하였고, 각 회에서 파지 역가(pfu)를 측정하였다. (d) Hek-293 형질감염된 세포 및 형질감염되지 않은 세포에서 파지 클론들의 파지 결합 ELISA 분석 결과를 나타낸다. (e) MDA-MB231 및 MCF-7 세포에서의 파지 클론들의 파지 결합 ELISA 분석 결과를 나타낸다. 광학 밀도(Optical Density; OD)는 450nm 파장에서 측정하였다.
도 2는 PD-L1 결합 펩타이드의 세포 결합 및 내재화 결과를 나타낸다. (a) HEK-293T 세포를 PD-L1 플라스미드 벡터로 형질감염시켰고, 펩타이드의 결합을 검증한 결과이다(미-형질감염 세포 및 형질감염 세포). (b) MDA-MB231 세포에서 PD-L1 결합 펩타이드(PD-L1Pep-1, PD-L1Pep-2)의 결합을 확인한 결과이다. (c) PD-L1 펩타이드들의 내재화를 나타내는 공초점 이미지이다. (d) PD-L1 결합 펩타이드들의 내재화 후, 세포 표면 상 PD-L1 항체 결합이 감소된 결과를 나타낸다(스케일 바: 20μm).
도 3은 PD-L1 결합 펩타이드의 결합 친화도 및 기능 분석 결과를 나타낸다. (a) 및 (b) SPR 방법을 통해 확인한 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 결합 친화도 결과이다. (c) PD-L1 재조합 단백질을 비오틴-펩타이드와 반응한 후 스트렙트아비딘으로 풀다운 및 PD-L1 항체로 면역블랏팅한 결과이다. (d) 면역블랏팅을 통해, MDA-MB231 세포에서 PD-L1의 siRNA 녹다운 결과이다. (e) PD-L1의 siRNA 침묵(silencing) 후, PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 결합율을 나타낸다. (f) mPD-L1 코팅된 플레이트와 CD8+ T 세포의 공배양을 통한 IFNγ 분비 향상 결과이다. (g) mPD-L1 코팅된 플레이트에서의 T 세포 증식 결과이다(N=3). (h) 및 (i) OT-I 마우스로부터 분리된 수지상세포 및 CD8+ T 세포를 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 또는 양성 대조군인 anti-PD-L1 항체와 공배양한 결과이다. n=3; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 4는 마우스 동일계통(syngeneic) CT26 종양이식 모델에서 PD-L1 결합 펩타이드의 호밍(homing) 결과를 나타낸다. (a) CT26 종양세포에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 호밍(homing) 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) CT26 종양을 가진 마우스에 Flamma-675 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2를 정맥 주입하여 캡처한 이미지를 나타낸다. (c) 종양 부위의 총 프로톤 플럭스를 정량한 결과이다(프로톤 수/초, p/s). (d) 마우스 신체의 모든 장기에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 흡수 분포를 나타낸 결과이다. (e) 전체 장기에서의 프로톤 플럭스를 정량한 결과이다. (f) 동결 종양 조직 절편에서 PD-L1 항체와 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 동시-위치화 결과이다(스케일 바: 50μm). n=3; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 5는 마우스 동일계통(syngeneic) CT26 종양이식 모델에서 PD-L1 결합 펩타이드가 종양 성장을 억제한다는 결과를 나타낸다. (a) CT26 종양세포에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 항-종양 효과 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) 24일 동안 격일로 측정한 종양 부피 변화 결과이다. (c) 처리 과정 중 격일로 측정한 체중 변화 결과이다. (d) 각 군의 생존율 결과이다. n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 Student t-test/ one-way ANOVA. (e) 처리 마지막 날, 종양 세포에 대한 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포 분석 결과이다. (f) 각 군의 종양 조직상 IFNγ 및 granzyme B 면역염색 결과이다(스케일 바: 50μm). n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 6은 PD-L1 결합 펩타이드와 독소루비신을 조합한 종양 치료 결과, T 세포를 증가시킨다는 결과이다. (a) PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2와 독소루비신을 조합한 종양 치료 효과 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) 격일로 측정한 종양 부피 변화 결과이다. (c) PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2와 독소루비신 조합 항암 처리 과정 중 격일로 측정한 체중 변화 결과이다. (d) 각 군의 생존율 결과이다. n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 Student t-test/ one-way ANOVA. (e) 종양 세포군을 분석하기 위해 수행된 종양 세포 분석 결과이다. (f) 공초점 현미경을 통한, 각 군의 종양 조직상 IFNγ 및 granzyme B 면역염색 결과이다(스케일 바: 50μm). n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 7은 PD-L1 결합 펩타이드와 PD-L1의 상호작용에 대한 분자 도킹 분석 결과를 나타낸다. (a) PD-L1/PD-1 결합 위치, (b) PD-L1과 PD-L1Pep-1의 예상 결합 위치, (C) PD-L1과 PD-L1Pep-2의 예상 결합 위치.
도 2는 PD-L1 결합 펩타이드의 세포 결합 및 내재화 결과를 나타낸다. (a) HEK-293T 세포를 PD-L1 플라스미드 벡터로 형질감염시켰고, 펩타이드의 결합을 검증한 결과이다(미-형질감염 세포 및 형질감염 세포). (b) MDA-MB231 세포에서 PD-L1 결합 펩타이드(PD-L1Pep-1, PD-L1Pep-2)의 결합을 확인한 결과이다. (c) PD-L1 펩타이드들의 내재화를 나타내는 공초점 이미지이다. (d) PD-L1 결합 펩타이드들의 내재화 후, 세포 표면 상 PD-L1 항체 결합이 감소된 결과를 나타낸다(스케일 바: 20μm).
도 3은 PD-L1 결합 펩타이드의 결합 친화도 및 기능 분석 결과를 나타낸다. (a) 및 (b) SPR 방법을 통해 확인한 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 결합 친화도 결과이다. (c) PD-L1 재조합 단백질을 비오틴-펩타이드와 반응한 후 스트렙트아비딘으로 풀다운 및 PD-L1 항체로 면역블랏팅한 결과이다. (d) 면역블랏팅을 통해, MDA-MB231 세포에서 PD-L1의 siRNA 녹다운 결과이다. (e) PD-L1의 siRNA 침묵(silencing) 후, PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 결합율을 나타낸다. (f) mPD-L1 코팅된 플레이트와 CD8+ T 세포의 공배양을 통한 IFNγ 분비 향상 결과이다. (g) mPD-L1 코팅된 플레이트에서의 T 세포 증식 결과이다(N=3). (h) 및 (i) OT-I 마우스로부터 분리된 수지상세포 및 CD8+ T 세포를 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 또는 양성 대조군인 anti-PD-L1 항체와 공배양한 결과이다. n=3; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 4는 마우스 동일계통(syngeneic) CT26 종양이식 모델에서 PD-L1 결합 펩타이드의 호밍(homing) 결과를 나타낸다. (a) CT26 종양세포에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 호밍(homing) 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) CT26 종양을 가진 마우스에 Flamma-675 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2를 정맥 주입하여 캡처한 이미지를 나타낸다. (c) 종양 부위의 총 프로톤 플럭스를 정량한 결과이다(프로톤 수/초, p/s). (d) 마우스 신체의 모든 장기에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2 흡수 분포를 나타낸 결과이다. (e) 전체 장기에서의 프로톤 플럭스를 정량한 결과이다. (f) 동결 종양 조직 절편에서 PD-L1 항체와 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 동시-위치화 결과이다(스케일 바: 50μm). n=3; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 5는 마우스 동일계통(syngeneic) CT26 종양이식 모델에서 PD-L1 결합 펩타이드가 종양 성장을 억제한다는 결과를 나타낸다. (a) CT26 종양세포에서 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2의 항-종양 효과 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) 24일 동안 격일로 측정한 종양 부피 변화 결과이다. (c) 처리 과정 중 격일로 측정한 체중 변화 결과이다. (d) 각 군의 생존율 결과이다. n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 Student t-test/ one-way ANOVA. (e) 처리 마지막 날, 종양 세포에 대한 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포 분석 결과이다. (f) 각 군의 종양 조직상 IFNγ 및 granzyme B 면역염색 결과이다(스케일 바: 50μm). n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 6은 PD-L1 결합 펩타이드와 독소루비신을 조합한 종양 치료 결과, T 세포를 증가시킨다는 결과이다. (a) PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2와 독소루비신을 조합한 종양 치료 효과 분석을 위한 모식도를 나타낸다. (b) 격일로 측정한 종양 부피 변화 결과이다. (c) PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2와 독소루비신 조합 항암 처리 과정 중 격일로 측정한 체중 변화 결과이다. (d) 각 군의 생존율 결과이다. n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 Student t-test/ one-way ANOVA. (e) 종양 세포군을 분석하기 위해 수행된 종양 세포 분석 결과이다. (f) 공초점 현미경을 통한, 각 군의 종양 조직상 IFNγ 및 granzyme B 면역염색 결과이다(스케일 바: 50μm). n=5; Mean ±SD, *P<0.05; ***P<0.0005 one-way ANOVA.
도 7은 PD-L1 결합 펩타이드와 PD-L1의 상호작용에 대한 분자 도킹 분석 결과를 나타낸다. (a) PD-L1/PD-1 결합 위치, (b) PD-L1과 PD-L1Pep-1의 예상 결합 위치, (C) PD-L1과 PD-L1Pep-2의 예상 결합 위치.
이에, 본 발명자들은 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD1/PD-L1 상호작용을 기능적으로 차단할 수 있고 친화성 높은 펩타이드를 확인하기 위해서, T7 파지 무작위 라이브러리를 사용하였다. 본 발명자들은 CT26 종양 세포 및 수지상세포(dendritic cells, DCs) 상에서의 PD-L1 차단이 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 향상시키는지 확인하였다. 본 발명의 PD-L1Pep-1 및 PD-L1Pep-2를 이용한 항종양 치료가 생체 내에서(in- vivo) 종양 부피 및 면역 세포 집단에 강력한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 결과적으로 본 발명자들은 PD1/PD-L1 상호작용을 억제하는데 효과적으로 사용할 수 있는 펩타이드를 성공적으로 스크리닝하였으며, 상기 펩타이드의 항암 치료제로서의 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다. 상세하게는, 상기 펩타이드는 PD-1 및 PD-L1의 상호작용을 차단할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 합성한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 PD-L1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않는 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “재조합벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 암은 PD-L1이 과발현되는 암일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 PD-L1이 과발현되는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 또는 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
본 발명의 펩타이드를 이용한 암의 진단은 혈액, 소변이나 바이옵시(biopsy)에 의해 직접 얻은 해당 조직 또는 세포에 본 발명의 펩타이드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 펩타이드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 (nitrosourea)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 암은 PD-L1이 과발현되는 암일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 PD-L1이 과발현되는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 또는 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 약학조성물은 암세포에 대한 면역세포 활성화를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 본 발명의 조성물은 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 약물을 암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
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실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포주 및 시약
Hek-293T (인간 배아 신장 세포), CT26 (마우스 대장암 세포), MDA-MB231 및 MCF-7 (인간 유방암 세포)는 American type culture collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 얻었다. Hek-293T 및 MDA-MB231 세포는 DMEM low glucose (Gibco, Carslbad, CA, USA)로, CT26 및 MCF-7 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; Gibco), 100U/ml 페니실린(penicillin) 및 100ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 RPMI-1640 medium (Gibco, Carsl bad, CA, USA)로, CO2 배양기를 사용하여 37℃에서 배양하였다.
사람 재조합 PD-L1 및 마우스 재조합 PD-L1 (Acro Biosystems), 사람 재조합 IFN-γ (R&D), 사람 PD-L1 항체 (Santa Cruz Biotechnology), CD3 및 CD28 항체 (Bio Xcell), 마우스 IFNγ 항체 (Proteintech), Granzyme B 항체 (St John's Laboratory)에서 구입하였다. 마우스 IL-2, 마우스 PD-L1 항체, CD8 항체, CD45 항체, CD3 항체, CD4 항체, FoxP3 항체, Gr-1 항체, F4/80 항체, MHCII 항체, 및 CD206 항체, 마우스 PD-1, 사람 PD-1 등은 모두 Bio legend에서 구입하였다. 생체 내(in vivo) 실험을 위한 PD-L1 항체는 Bio X cell로부터 구입하였다. 마우스 IFN-γ Elisa kit, 마우스 IL2 측정 킷, 마우스 TNF-a, 사람 IFNγ 측정 킷, 사람 IL-2 측정 킷은 모두 Bio legend로부터 구입하였다. 사람 CD28 및 CD3은 Miltenyi Biotech로부터 구입하였다. CD4+ T cell 및 CD8+ T cell isolation kit는 Stem cell에서 구입하였다. CD274 siRNA는 Ambion에서 구입하였다. Ovalbumin323 -339 및 Ovalbumin257 -264는 Sigma Life science로부터 구입하였다. Lipofectamine 2000은 Invitrogen로부터 구입하였고, GFP-PD-L1 plasmid vector는 Origene으로부터 구입하였다.
2. T7 파지
펩타이드
라이브러리를 이용한 바이오-
패닝
(Bio-panning)
T7 파지 펩타이드 라이브러리는 Novagen로부터 파지 벡터를 구입한 뒤 라이브러리를 제작하여 사용하였다. Hek-293T 세포는 35mm 접시에 배양하였고, 70-80%로 컨플루언트(confluent) 하면, PD-L1 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 세포들은 인산-완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 5분 동안 각각 2번 씻어냈다. 음성 선별 과정(subtraction procedure)을 위해, 1×109 플라크-형성 유닛(plaque-forming unit; pfu)의 파지 라이브러리를 Hek-293T 세포에서 1시간 동안 4℃로 배양하였다. 상기 세포에 비결합한 파지를 회수하였고, PD-L1 형질감염된 Hek 293T 세포와 함께 1시간 동안 4℃로 배양하였다. 그 후, 비결합 파지는 10 mg/ml 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함한 PBS로 씻어냈다. 세포에 결합한 파지는 BL21 (OD: 1) 배양액으로 상온에서 10분 동안 용출시켰다. 용출물은 적정에 사용하였고, 잔여 용출 파지 클론은 10ml BL21 (OD: 0.5)에 넣어, T7 파지가 용해 사이클을 겪어 투명하게 용해될 때까지 3-4 시간 동안 반응시켰다. 상기 과정은 총 4번 반복하였고, 이후 연속적으로 희석하였다. 용출물은 LB medium Petri plates에 접종하였고, 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 파지의 역가는 콜로니의 수를 계수하여 측정하였다.
3. 서열분석 및
펩타이드
합성
5회의 바이오-패닝 후, 삽입된 클론은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 확인하였다. DNA 삽입된 44개 각각의 클론들을 서열분석하였다(Macrogen , Seoul, South korea). 서열 유사성은 Clustal W 프로그램을 사용하여 분석하였고, 확인하였다. PD-L1 결합 펩타이드들로서, PD-L1Pep-1 (CLQKTPKQC; 서열번호 1) 및 PD-L1Pep-2 (CVRARTR; 서열번호 2)를 합성하였다(Peptron Inc. Daejeon, Korea). 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITC), 비오틴(biotin) 및 Flamma-675를 각 펩타이드의 N-말단에 접합시켰다. 동결건조된 펩타이드들은 10 mM 농도까지 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 재구성되었다. 그 후, 인산-완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 10μM 농도까지 추가적으로 희석하였다. 파지 코팅 단백질에 존재하는 펩타이드 서열인 NSSSVDK를 대조군 펩타이드로 사용하였다.
4. 파지 결합 ELISA 분석
MDA-MB231 및 MCF7 (5×105) 세포를 96 웰 플레이트에 접종하였고, 밤새도록 배양하였다. 플레이트는 5 mg/ml BSA로 상온에서 1시간 동안 차단시켰다. TBST (0.1% Tween20)로 웰을 6번 씻어낸 후, 100μl 파지 클론(1×109 pfu/well)을 첨가하였고, 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 씻어낸 후, horse-radish peroxidase (HRP)가 접합된 T7 tail fiber 항체 (블롯킹 완충액으로 1: 10,000 비율로 희석)을 첨가하였고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 다시 6번 씻어낸 후, TMB 기질을 첨가하였고, 상온에서 10-15분 동안 반응시켰다. 반응은 100μl의 1 MH2S04 (정지 용액)을 첨가함으로써 최종적으로 중단시켰고, 플레이트들은 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 분석하였다.
5. PD-L1
펩타이드
결합의
면역형광분석
및
유세포
분석
MDA-MB231, CT26, MCF7, Hek29 세포(1×105)를 8-웰 챔버 슬라이드에 접종하고, 밤새도록 배양하였다. 다음 날, 세포들을 PBS로 2번 씻어냈고, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 펩타이드의 비특이적 결합을 감소시켰다. 그 후, 세포들은 다른 농도(10mM, 25mM 및 50mM)의 FITC 접합 펩타이드로 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 고정 후, 세포들을 씻어냈고, DAPI로 대비염색하였으며, 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany) 분석하였다. 펩타이드 내재화 분석을 위해, MDA-MB231 세포를 25mM 농도의 FITC-접합된 펩타이드와 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰고, 상기 과정은 기존에 보고된 바에 따라 진행하였다. 수용체 내재화 분석을 위해, 펩타이드 내재화는 상기에 기재한 바와 같이 진행하였고, PBS로 여러 번 씻어낸 후, PD-L1 항체 (1:100 희석)를 세포와 함께 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 세포들은 공초점 현미경으로 488nm/520nm의 여기/방출 파장에서 관측하였다. 유세포 분석을 위해, 세포들(1×106)을 수확한 후, 차단을 위해 1% BSA가 포함된 배양 배지에 상온에서 1시간 동안 현탁시켰다. 그 후, FITC-표지된 PD-L1 결합 펩타이드로 4℃에서 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. 여러 번 씻어낸 후, PBS로 현탁시킨 300ul의 세포 현탁액을 유세포 분석(BD, Franklin Lakes, NJ)에 적용하였다. PD-L1 차단 항체와의 경쟁 분석을 위해, 세포들은 항체(1:100 희석)로 반응시킨 후, 다른 농도의 PD-L1 결합 펩타이드로 반응시켰다. 세포들을 고정시켰고, 유세포 분석에 적용하였다. PD-L1 항체 염색을 위해, 세포들을 BSA로 차단하였고, PFA로 고정시켰으며, 항체(1:100 희석)와 반응시켰다. IFN-γ (25ng/ml)를 세포에 24시간 동안 처리하였고, PBS로 씻어낸 후, 항체로 염색하였다.
6. PD-L1 결합
펩타이드
결합 특이성 및 PD-L1의 녹다운
PD-L1 결합 펩타이드의 결합 특이성은 형광-기반 ELISA 분석을 통해 측정하였다. 96 웰 플레이트를 100μl (1μg/mL)의 인간 PD-L1 및 마우스 PD-L1, 또는 TBST (0.05% Tween 20)에 녹인 BSA로 상온에서 1시간 동안 코팅하였다. 플레이트는 3번 씻어냈고, 488nm 여기 및 515nm 방출 파장에서 형광측정기로 측정되었다. siRNA 녹다운을 위해, MDA-MB231 세포는 24, 48 및 72 시간 동안 25-100nM의 농도로 녹다운되었다. PD-L1 녹다운 후, 용출물은 PD-L1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅에 적용하였다.
7. PD-L1 결합
펩타이드의
K
d
수치 측정
표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR, Woo jung bsc)을 사용하여, 친화도 상수(affinity constant; KD), 동역학(Kinetics; Ka 및 Kd)을 측정하였다. PD-L1 결합 펩타이드 (15μM)를 SA chip (13206065)의 표면 상에 고정시켰고, 1M Ethanolamine (PH 8.5)을 25μl/min으로 8분 동안 흘려보냈다. 그 후, 잔여 미결합 단백질은 20Mm HCL을 50μl/min으로 30초 동안 흘려보내 제거하였다. PD-L1 단백질은 작용 완충액에 용해시켰고, 4가지 다른 농도(0.25μM, 0.5μM, 1.0μM, 2.0μM)를 흘려보냈다. 각각의 농도로 주입하였고, 50μl/min으로 2분 30초 동안 흘려보냈다. 각각의 RU를 기록하였다. 계산은 Scribber and clamp software를 사용하여 수행하였다.
8. T-세포 활성화 분석 및 T-세포 증식
CD8+ T 세포는 WT Balb/c mice의 비장으로부터 분리하였고, CD3 및 CD28 코팅된 플레이트(1ug/ml)에 4℃로 밤새도록 활성화시켰다. 활성화된 CD8+ T 세포를 CT26 종양세포와 96 웰 플레이트에서 다른 시간 간격으로 공배양하였다. CT26 종양세포는 10ug/ml PD-L1 항체로 사전 배양시켰고, 활성화된 CFSE-염색 CD8+ T 세포와 공배양 하기 전에 4℃에서 1시간 동안 25μM 농도의 PD-L1 결합 펩타이드와 반응시켰다. 대조군 펩타이드도 비교를 위해 역시 사전 배양하였다. 비교 실험을 위해, 100μl 마우스 CD3 및 CD28 항체 (1ug/ml)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 최종 농도 0.1 μg/ml의 PD-L1를 100μl 첨가 후, 37℃에서 3시간 동안 플레이트를 반응시켰다. 상기 플레이트는 PBS로 2번 씻어냇고, PD-L1 차단 항체 및 PD-L1 결합 펩타이드와, 대조군 펩타이드를 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고, PBS로 2번 씻어냈다. 최종적으로, CFSE-염색된 CD8+ T 세포를 첨가하여, 250×g로 3분 동안 원심분리한 후, 세포들을 세포 배양기에서 배양하였다. 각각의 배양시간 후, 상등액을 수확하였고, IFNγ 측정용 ELISA kit를 사용하여 IFNγ 분비를 측정하였다. T-세포 증식 분석은 FACS 분석을 통해 측정하였다. 증식 분석을 위해, CD8+ T 세포를 serum-free RPMI-1640 배지에서 5 mM 카복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester; CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR)로 37℃에서 20분 동안 표지하였고, 원심분리하였으며, 새로운 RPMI 배지 500ul를 첨가하였다. CFSE-표지된 세포의 형광 세기는 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. CFSE의 희석으로 인해, 각각의 세포 분화 후, 딸세포의 형광 세기는 모세포보다 감소하였다. 형광 세포의 백분율은 모세포를 제외한 전체 세포군에서 측정하였다.
9. PD-L1 표적
펩타이드들의
혈청 안정성
마우스 혈액을 수집하였고, 마이크로 튜브를 사용하여 상온에서 15-20분 동안 놓아 두었다. 그 후, 혈청을 4℃, 12000rpm으로 원심분리하였다. 펩타이드 안정성을 시험하기 위해서, 윗부분(혈청)을 수집하였다. 배양된 샘플을 100 배 희석하였고, C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)로 아세토니트릴 선형 구배(평형을 위해 물에 녹인 0.1% 트리플루오로아세테이트 및 용출을 위해 아세토니트릴에 녹인 0.1% 트리플루오로아세테이트)를 이용하여 분획화하였다. 펩타이드 피크를 수집하였고, 진공으로 건조시켰다.
10.
수지상세포
분리
수지상세포는 OT-I 마우스의 비장에서 분리하였고, 상기 세포는 CDIIb 마커를 사용하여 모았으며, 20ng/ml GM-CSF 존재하에서 7일 동안 배양하였다. 동시에, CD8+ T 세포를 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트를 사용하여 분리하였다. 세포들을 수집하였고, Petri dish에서 1일 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 5ug/ml Ova257 -264 펩타이드로 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후, PD-L1 항체 및 PD-L1 결합 펩타이드로 상이한 시간 간격 동안 사전 배양하여 활성화시킨 CD8+ T 세포와 수지상세포를 공배양하였다.
11. 생체 내(
in
vivo
)
호밍
(homing) 및 항종양 치료
6-8 주령 Balb/c 마우스를 구입하였다. 경북대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 가이드라인 하에서(2014-0001-8.), 마우스는 사육되고 유지시켰다. 종양은 마우스의 오른쪽 하부 옆구리에 주입하였다. 생체 내(in vivo) 호밍(Homing) 이미지 분석을 위해, 종양을 7일 동안 진행시켰고, 종양 크기가 100mm3에 도달하면, 마우스에 100μl의 100mM Flamma-675 NIR 형광 염료 표지된 펩타이드를 주입하였으며, 1시간 동안 완전히 순환하도록 하였다. 배양 후, 마우스를 마취시켰고, IVIS imaging system을 이용하여 이미지를 얻어냈다. 이미지 분석을 마치면, 마우스를 희생시켰고, 다른 장기의 종양을 분리하여 IVIS imaging machine을 사용한 ex- vivo imaging에 적용하였다. 항종양 치료를 위해, 마우스를 무작위로 선별하였고, 종양 크기가 약 100mm3에 달하면 그룹화하였다. 그 후, 펩타이드를 정맥으로(5mg/kg) 100μg/mice, 3주 동안 주당 3번씩 주입하였다. 독소루비신은 주당 1번씩 복막 주입(4mg/kg)하였다. 종양 크기는 디지털 칼리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피는 식(Volume ¼(L-W-H)/2)을 사용하여 계산하였다(길이: 최장 치수, 너비: 짧은 치수, 마우스 몸과 평행, 높이: 길이 및 너비에 수직). 모든 마우스는 치료 후 궤양 정도를 확인하였고, 면역 세포 분석을 위해 마우스는 희생시켰다.
12. 조직의
면역형광분석
PD-L1 발현 및 PD-L1 펩타이드와 조직의 결합을 확인하기 위해서, 마우스 CT26 종양 조직을 동결 절편(10μm 두께)하여 제조하였다. 조직 절편은 1% BSA로 상온에서 30분 동안 차단시켰고, PD-L1 항체로 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. 모든 조직 절편은 DAPI로 대비염색하였고, Prolong Gold anti-fade mounting reagent (Life technologies)으로 반응시켰으며, 공초점 현미경으로 관측하였다.
13. 종양 내 면역 세포군의
유세포
분석
종양을 분리하여 잘게 썬 후, collagenase D (5mg/ml)가 함유된 소화 완충액으로 RPMI-1640 medium에서 37℃, 40분 동안 반응시켰다. 세포 현탁액은 세포 스트레이너(strainer)를 통과시켰다. 사용 전 미리 단일 세포 현택액을 만들었고, CD45 항체는 종양 침습 백혈구를 염색하기 위해 사용하였다. 그 후, CD4, CD8 및 F4/80에 대한 항체로 분석하였다. 그 후, 염색된 세포는 유세포 분석에 적용하였다(Novocyte).
14. 통계 분석
통계적 유의성은 2 그룹을 비교시에는 unpaired Student t test로 측정하였고, 다중 그룹 간 비교시에는 one or two-way ANOVA를 사용하였다. 수치는 3번의 독립적인 샘플에 대해 평균 ± SE로 나타냈다. P 수치가 <0.05이면, 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
<
실시예
>
PD-L1 발현 세포와 선택적으로 결합할 수 있거나, PD-L1을 차단할 수 있는 펩타이드를 찾아내기 위해서, PD-L1-과발현 세포에 대한 무작위 펩타이드들의 T7 파지 라이브러리를 스크리닝하였다. PD-L1-과발현 세포를 제조하기 위해서, GFP-태그된 PD-L1 플라스미드 DNA를 일시적으로 Hek-293T 세포에 형질감염시켰고, 다른 시간 포인트(24 및 48 시간) 동안 배양하였다. 형질감염후, GFP-태그된 PD-L1의 발현은 24 시간 보다 48 시간에서 높게 나타났는데, 이는 현미경 분석(도 1a) 및 웨스턴 블랏팅(도 1b)으로 확인하였다. 형질 감염 48 시간 후의 세포들을 이후 연구에 사용하였다. PD-L1-과발현 세포에 대한 5회의 바이오 패닝 후, 첫 회에 비해 파지 역가는 4배 높아졌다(도 1c). 44개의 파지 클론을 무작위로 선별하였다. 삽입된 클론의 서열을 확인하기 위해서, 선별된 클론 각각에 대해 중합효소연쇄반응 및 DNA 서열 분석을 수행하였다. 형질전환된 세포 중 형질감염되지 않은 세포에서 나타나는 서열은 제외하였고, 7개 이상의 아미노산을 가진 8개의 클론이 최종 검증을 위해 선택되었다. 파지 결합 ELISA를 통해 선택된 클론들의 결합 효과를 검증하기 위하여, 형질감염되거나 형질감염되지 않은 Hek-293T 세포를 사용하였다(도 1d). 또한, MDA-MB231 및 MCF-7 (각각 양성 및 음성 세포주)를 분석에 적용하였다(도 1e). PD-L1 과발현 세포에 대한 결합 활성에 기초하여, 본 발명자들은 4번 및 7번 클론을 선택하여 합성하였다(9mer 및 7mer). 이후, 합성된 펩타이드들은 PD-L1 결합 펩타이드들(PD-L1 binding peptides; PD-L1Pep-1)로 명명하였다. PD-L1Pep-1 (CLQKTPKQC; 서열번호 1) 및 PD-L1Pep-2 (CVRARTR; 서열번호 2)로 명명하였다.
PD-L1 결합 펩타이드들의 결합 활성을 확인하기 위해서, PD-L1의 발현 수준을 4종의 다른 암세포주인 MDA-MB231, CT26, MCF7 및 HEK 293에서 면역형광염색을 통해 확인하였다. MCF-7 및 HEK 293 세포에 비해 MDA-MB231 및 CT26은 높은 수준의 PD-L1 발현을 나타냈다. IFNγ로 24시간 동안 처리한 후, MDA-MB231 및 CT26 세포에서의 PD-L1 발현 수준은 크게 향상되었는데, 이는 이미 알려진 대로 IFNγ가 PD-L1의 잠재적 유도 인자이기 때문인 것으로 보인다. 일시적인 PD-L1 과발현 후, PD-L1 결합 펩타이드들은 HEK 293T 세포와 강하게 결합하는 것으로 나타났다(도 2a).
다음으로, 2종의 펩타이드들은 MDA-MB231 세포와 강하게 결합하는 것으로 나타났고, IFNγ 처리된 세포에서 결합 효율은 증가하였다(도 2b). 또한, PD-L1 발현 후에, 펩타이드 결합은 증가하였고, 4℃에서 IFNγ 처리시 증가하였다. 다만, MCF-7 세포주와는 펩타이드가 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 여러 농도의 PD-L1 결합 펩타이드에 대한 유세포분석 결과, PD-L1 결합 펩타이드의 결합율은 농도가 증가할수록 증가하였고, MCF-7 세포에 비해서는 MDA-MB231 세포에서 높게 결합하는 것으로 나타났다. PD-L1 결합 펩타이드의 결합특이성을 확인하기 위해서, PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포를 PD-L1 항체로 차단한 후, 여러 농도의 PD-L1 결합 펩타이드들을 적용하였다. 그 결과, 세포를 PD-L1 중화 항체로 차단하면, PD-L1 결합 펩타이드의 결합은 감소되었다. 또한, PD-L1 결합 펩타이드들을 37℃에서 반응시켜 내재화 여부를 조사하였다. 공초점 이미지 분석 결과, 2종의 PD-L1 결합 펩타이드 모두 잘 내재화 되었다(도 2c). 펩타이드 내재화를 확인한 후, 세포들을 PD-L1 항체로 염색한 결과, PD-L1 펩타이드들의 표면 염색은 크게 감소되었는데, 이는 PD-L1의 수용체 내재화로 명확히 확인되었으며, 대조군 펩타이드를 처리한 세포에서는 PD-L1 항체 염색이 감소하지 않았다(도 2d).
펩타이드들의 KD 수치를 측정하기 위해서, 비오틴-펩타이드로 코팅된 스트렙타비딘(streptavidin) 칩을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다(도 3a 및 도 3b). 상이한 4가지 농도의 PD-L1 결합 펩타이드는 PD-L1Pep-2에 대한 것이다. PD-L1과 펩타이드들의 직접 결합은 스트렙타비딘 풀다운 분석 및 PD-L1 항체 면역블랏 분석하여, 비오틴-펩타이드 및 재조합 PD-L1의 반응을 통해 확인하였다(도 3c). 이후, PD-L1을 발현하는 MDA-MB231 세포에서 PD-L1 발현을 녹다운시켰다. 이때 siRNA는 여러 농도에서 시험하였다(도 3d). 면역블랏팅을 통해 PD-L1의 녹다운을 확인한 후, PD-L1 결합 펩타이드들의 결합을 유세포 분석을 통해 확인하였다(도 3e). 그 결과, MDA-MB231 세포에서 PD-L1 발현이 녹다운되면, 펩타이드들의 결합도 감소하였다. PD-L1 결합 펩타이드의 안정성을 추가적으로 확인하기 위해서, 마우스로부터 얻은 전체 혈청과 펩타이드를 24시간 이상 반응시켰다. PD-L1Pep-1에 대한 펩타이드 피크는 8 시간 이상에서 온전하게 나타났고, PD-L1Pep-2에 대한 펩타이드 피크는 4 시간에서 나타났고 이후 점차 감소되었다. 상기 결과는 PD-L1 결합 펩타이드들이 혈청 존재하에서 4 - 8 시간에서 안정하다는 것을 나타냈다.
PD-1/PD-L1 상호작용에 있어 PD-L1 결합 펩타이드의 직접 효과를 확인하기 위해서, 재조합 PD-L1(0.1ug/ml) 코팅된 플레이트는 25μM PD-L1 결합 펩타이드로 미리-반응시켰고, 활성화된 CD8+ T 세포를 각 웰에 첨가시켰다. PD-L1 항체 및 펩타이드의 존재하에서, T 세포는 IFNγ를 더 방출하였고(도 3f), 더 많이 증식되었다(도 3g). 수지상세포는 1차 T 세포 반응의 강력한 활성화 인자로 알려진 전문적인 항원제시세포 (antigen presenting cells, APC)이다. 수지상세포와 CD8+ T 세포를 공배양 실험 결과, 대조군과 비교하여 PD-L1 항체 및 펩타이드의 존재하에서, IFNγ 및 IL-2의 방출이 증가하였고, T 세포의 증식도 증가하는 것으로 나타났다(도 3h 및 도 3i). 이는 PD-L1 결합 펩타이드가 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단할 수 있고, 활성화된 T 세포를 더욱 증식시킬 수 있다는 것을 뒷받침한다.
펩타이드의 종양 호밍(homing)을 확인하기 위해서, 유사한 크기의 CT26 종양을 가진 야생형 마우스에 PD-L1 결합 펩타이드를 정맥 투여하였다(도 4a). 상이한 시간 간격으로 IVIS imaging 결과를 캡쳐하였다. 675-flamma 태그된 PD-L1 결합 펩타이드들은 대조군 펩타이드에 비해 매우 높은 세기로 종양 위치에 축적되었다(도 4b). 전체 신체 플럭스 세기는 주입하고 2 시간 순환시킨 후에 최대 형광 신호를 측정하였다(도 4c). 종양 및 다른 장기에서의 ex vivo 이미지 및 장기 플럭스의 정량 분석 결과, 펩타이드 신호는 오직 종양에서만 높게 축적된 것으로 나타났고, 폐 및 신장에서는 약간 축적되었다(도 4d 및 도 4e). 신장에서의 신호는 아마도 펩타이드들의 소변 배출로 인한 것으로 여겨진다. 또한, 종양 조직의 조직학적 분석 결과, PD-L1을 높은 수준으로 발현하는 종양 위치로 PD-L1 결합 펩타이드들이 호밍하는 것으로 확인되었다(도 4f). 상기 결과는 종양 미세환경에서 PD-L1 결합 펩타이드들이 PD-L1 발현 세포를 선택적으로 표적할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 펩타이드들의 호밍은 4T1(유방암) 종양을 가진 마우스에서도 확인되었고, MDA-MB231 종양을 가진 누드 마우스에서도 확인되었다.
CT26 동일 계통(syngeneic) 마우스 모델에서 항암 활성을 확인하였는데, PD-L1 활성은 기능성 종양 미세환경에서 효과적으로 관측할 수 있었다. PD-L1 펩타이드들은 종양을 가진 마우스에 3.5주(24일) 동안 격일로 정맥 투여되었다(도 5a). PD-L1Pep-2는 종양 부피를 효과적으로 조절함으로써 좋은 항암 치료 효과를 나타냈고, PD-L1Pep-1도 대조군 및 PBS 군에 비해 큰 효과를 나타냈다(도 5b). 펩타이드 군을 양성 대조군으로 5번 복강 주입한 PD-L1 항체와 비교하였는데, 실험 기간 동안 동물의 체중은 실험군 모두 유사한 정도였다(도 5c). 처리된 마우스의 생존율은 대조군 대비 나아졌다(도 5d). 또한, 유세포 분석기를 통한 면역세포 분석 결과, PD-L1 펩타이드 처리는 침습 CD8+ T 세포의 비율을 증가시켰고, T-reg 세포 집적(enrichment)을 억제하였다(도 5e). 면역조직화학 염색 결과, 처리된 종양 조직에서 IFNγ 및 granzyme B의 발현이 증가된 것으로 나타났는데(도 5f), 이는 PD-L1 결합 펩타이드들이 종양 성장을 효과적으로 억제시키고, PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하여 T 세포를 재활성화시킨다는 것을 뒷받침한다.
PD-L1-결합 펩타이드들의 면역 치료 효과를 향상시키기 위해서, 본 발명자들은 CT26 마우스 대장 종양 모델에서 펩타이드들과 면역원성 세포 사멸을 유도하는 화학요법 제제로 알려진 독소루비신을 조합하였다. PD-L1 펩타이드들은 12번 주입에서 9번 주입으로 감소시켜 주입하였고, 독소루비신은 일주일에 한 번 주입하였다(도 6a). 조합 치료는 이전 단일 치료와 비교하여 종양 부피를 더 강하게 감소시켰다(도 6b). 조합 치료는 이전 단일 치료와 비교하여 종양 부피를 더 강하게 감소 시켰다(도 6b). 또한 조합 치료는 대조군과 비교하여 체중을 변동 없이 유지 시켰으며, 생존율을 더욱 높였다(도 6c 및 도 6d). 유세포 분석을 통한 면역세포 분석 결과, CD8+ T 세포의 종양 조직내 비율은 PD-L1Pep-1 단일 처리시의 1.5%에서 6.2%로 크게 증가하였고, PD-L1Pep-2의 경우 3.9%에서 7.9%로 크게 증가하였다. 또한, CD4+ T 세포는 PD-L1Pep-1의 경우 0.4% 에서 6%로, PD-L1Pep-2의 경우 1% 에서 6.5%로 각각 증가하였다(도 6e). 면역조직화학 염색 결과, 펩타이드 처리군에서 Granzyme B 및 IFNγ가 증가하는 것으로 나타났다(도 6f). 따라서, 조합 치료는 면역세포군이 크게 증가한 것으로 나타나, 본 발명의 펩타이드는 기존 항암화학요법제와 병용 투여시 치료효과를 더욱 높인다는 것을 뒷받침한다.
한편, PD-L1과 PD-L1 결합 펩타이드의 예상 결합 위치를 일반적인 도킹으로 예측하였다(도 7). PD-L1은 금색으로 나타냈고, PD-L1Pep-1이 결합하는 데 중요한 아미노산 잔기는 파란색 원으로 표시하였고(도 7b), PD-L1Pep-2가 결합하는 데 중요한 아미노산 잔기도 파란색 원으로 표시하였다(도 7c).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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1 5
Claims (18)
- 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 PD-1 및 PD-L1의 상호작용을 차단하는 것을 특징으로 하는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
- 제4항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체(단, 인간을 제외함).
- 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 상기 펩타이드가 PD-L1 발현 수준이 높은 대장암세포 CT26 또는 전이성 유방암세포 MDA-MB-231에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 전이성 유방암 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항의 펩타이드 및 독소루비신을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물.
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- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 약학조성물은 대장암세포에 대한 면역세포 활성화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 대장암에 대한 약물 전달용 조성물.
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