JP2012024026A - Ｓｍ菌特異的アプタマー、Ｓｍ菌増殖抑制剤及びＳｍ菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｓｍ菌特異的アプタマー、Ｓｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤及びＳｍ菌特異的アプタマーを使用したＳｍ菌の検出方法の提供。
【解決手段】下記式（１）で表される塩基配列からなり、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）菌に結合する活性を有する核酸からなるＳｍ菌特異的アプタマー。５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’…（１）［式中、Ｙは特定の塩基配列において１若しくは２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であり、Ｘはグアニン塩基の割合が２０％以下である５〜３０塩基の塩基配列であり、Ｚはアデニン塩基の割合が２０％以下であり、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上である１〜４０塩基の塩基配列である。］
【選択図】図１

Description

本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、以下「Ｓｍ」という。）菌に特異的に結合するアプタマーに関する。より具体的には、Ｓｍ菌特異的アプタマー、Ｓｍ菌増殖抑制剤及びＳｍ菌の検出方法に関する。

アプタマーは、標的分子と特異的に結合する核酸分子であり、分子認識が可能な生体物質として様々な応用が検討されている。アプタマーは、化学的に短時間で合成可能であり、抗体などのタンパク質と比べて熱や乾燥に強く、部位特異的な修飾や固定化が容易であるなどの利点を有している。

う蝕原因菌であるＳｍ菌の口腔内における存在とう蝕の発症との間には密接な関係があることが知られており、Ｓｍ菌を検出する技術が求められている。従来、Ｓｍ菌を検出するためには、培養法、ＰＣＲ法及びインベーダー法などの分子生物学的方法や、抗Ｓｍ菌抗体を使用する免疫学的方法（例えば、特許文献１及び２を参照。）などの方法が用いられてきた。

特許文献３には、抗Ｓｍ菌抗体を有効成分とするう蝕予防剤が開示されており、特定の抗Ｓｍ菌抗体がＳｍ菌の歯面への付着に対する十分な阻害効果を有し、う蝕予防の有効成分として優れた効果を与えることが記載されている。

特開２００５−２４１３３５号公報 特開２００３−１８３２９９号公報 特開平６−１２２６３３号公報

特許文献１や２に記載のＳｍ菌の検出方法や特許文献３に記載のう蝕予防剤は抗Ｓｍ菌抗体を必要とする。しかしながら、抗体には、製造に時間とコストがかかること、品質保持期間が短いこと、保管管理が困難であることなどの問題があった。一方、アプタマーは、抗体と比較して、製造に時間がかからず、より低コストであり、品質保持期間がより長く、保管管理がより容易であるが、Ｓｍ菌に特異的に結合するアプタマー（Ｓｍ菌特異的アプタマー）を同定することは困難であった。そこで本発明は、Ｓｍ菌特異的アプタマーを提供することを目的とする。別の目的として、本発明は、Ｓｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤及びＳｍ菌特異的アプタマーを使用したＳｍ菌の検出方法を提供する。

本発明は、下記式（１）で表される塩基配列からなり、Ｓｍ菌に結合する活性を有する核酸からなるＳｍ菌特異的アプタマーを提供する。式（１）中、Ｙは配列番号７２に記載の塩基配列又は配列番号７２に記載の塩基配列において１若しくは２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であり、Ｘはグアニン塩基の割合が２０％以下である５〜３０塩基の塩基配列であり、Ｚはアデニン塩基の割合が２０％以下であり、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上である１〜４０塩基の塩基配列である。
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’ …（１）

上記本発明のＳｍ菌特異的アプタマーによれば、特異的にＳｍ菌を検出することができる。また、抗体と比較して、製造に時間がかからず、より低コストであり、品質保持期間がより長く、保管管理がより容易である。さらに、本発明のＳｍ菌特異的アプタマーは、部位特異的な修飾や固定化が容易であるため、さまざまな機能を容易に持たせることができる。

上記本発明のＳｍ菌特異的アプタマーにおいて、Ｙは配列番号７２〜７７からなる群から選択される塩基配列であり、Ｘは配列番号７８〜１３６からなる群から選択される塩基配列であり、Ｚは配列番号１３７〜１９３からなる群から選択される塩基配列であることが好ましい。

このような塩基配列からなるアプタマーは、より良好なＳｍ菌との結合性を示す。

上記本発明のＳｍ菌特異的アプタマーは、（ｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列からなる核酸、（ｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）菌に結合する活性を有する核酸、又は（ｉｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＳｍ菌に結合する活性を有する核酸からなることが更に好ましい。

このような塩基配列からなるアプタマーは、更に良好なＳｍ菌との結合性を示す。

本発明はまた、上記のＳｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤を提供する。

上記本発明のＳｍ菌増殖抑制剤によれば、抗体を有効成分とするものと比較して、製造に時間がかからず、より低コストであり、品質保持期間がより長く、保管管理がより容易なＳｍ菌増殖抑制剤を提供することができる。また、口腔内の主要な菌床バランスを崩すことなくＳｍ菌の増殖のみを抑制することができ、口腔内に存在する他の常在菌への影響が少ないため、安全性が高い。

上記のＳｍ菌増殖抑制剤において、Ｓｍ菌特異的アプタマーは、細菌増殖抑制物質で修飾されていることが好ましい。

細菌増殖抑制物質で修飾されていることにより、よりＳｍ菌増殖抑制剤効果が高いＳｍ菌増殖抑制剤を提供することができる。

本発明はまた、チオール基修飾を有する上記のＳｍ菌特異的アプタマーと、チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーとを混合し、多量体を形成したアプタマーを得る、多量体形成ステップと、多量体を形成したアプタマーに、チオール基修飾を介して金コロイドを結合して金コロイド標識アプタマーを得る、金コロイド標識ステップと、上記の金コロイド標識アプタマーをＳｍ菌と結合させる、アプタマー結合ステップとを有する、Ｓｍ菌の検出方法を提供する。

上記本発明のＳｍ菌の検出方法によれば、チオール基修飾を有するＳｍ菌特異的アプタマーのみを使用した場合と比較して、Ｓｍ菌の検出感度を高めることができる。

上記のＳｍ菌の検出方法において、チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーは、ＦＩＴＣ標識を有することが好ましい。

チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーがＦＩＴＣ標識を有することにより、Ｓｍ菌の検出感度を更に高めることができる。

上記のＳｍ菌の検出方法の多量体形成ステップにおいて、チオール基修飾を有するＳｍ菌特異的アプタマーと、チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーの混合比が、質量比で１：１〜１：１０であることが好ましい。

チオール基修飾を有するＳｍ菌特異的アプタマーと、チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーの混合比が上記の範囲にあることによって、Ｓｍ菌の検出感度を更に高めることができる。

本発明によれば、Ｓｍ菌特異的アプタマーが提供される。また、上記のＳｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤及び上記のＳｍ菌特異的アプタマーを使用したＳｍ菌の検出方法が提供される。

Ｓｍ菌特異的アプタマーの構造を示す模式図である。 （ａ）〜（ｃ）は、ＣＤ−スペクトルの結果を示すグラフである。 アプタマーのＳｍ菌に対する結合強度を示すグラフである。 （ａ）〜（ｅ）は、アプタマーの各種細菌への結合を評価した結果を示す写真である。図中の略号は以下の通りである。Ｓｍ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌａ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓａｌ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ。 （ａ）及び（ｂ）は、アプタマーの各種細菌への結合を評価した結果を示す写真である。図中の略号は以下の通りである。Ｓｍ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｌａ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓａｌ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓａｎ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ａｕｇ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｍｉｔ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｏｒａ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｅｃ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。 Ｓｍ菌特異的アプタマーのアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。 Ｓｍ菌の検出結果を示すグラフである。

本発明のＳｍ菌特異的アプタマーにおいて、核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）などの核酸類似体であってもよく、部分的にこれらの核酸や核酸類似体が混合したものであってもよいが、安定性やコストの観点からＤＮＡであることが好ましい。

発明者らは、抗体と同等のＳｍ菌結合能をもつ複数のアプタマー配列の設計に成功し、それらに共通する配列特性を解明した。その結果、Ｓｍ菌特異的アプタマーの塩基配列は３つのブロックからなる配列で構成されていることが明らかとなった。

図１に示すように、本発明のＳｍ菌特異的アプタマーは、５’側領域、コア領域及び３’側領域から構成されている。５’側領域は上記式（１）におけるＸであり、コア領域は上記式（１）におけるＹであり、３’側領域は上記式（１）におけるＺである。５’側領域は５〜３０塩基の塩基配列からなる。３’側領域は１〜４０塩基の塩基配列からなる。

コア領域は、配列番号７２又は配列番号７２に記載の塩基配列において１若しくは２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列である。コア領域は、配列番号７２〜７７からなる群から選択される塩基配列であることが好ましく、配列番号７２に記載の塩基配列であることが更に好ましい。

５’側領域は、グアニン塩基の割合が２０％以下である５〜３０塩基の塩基配列である。グアニン塩基の割合とは、５’側領域の塩基配列を構成する塩基数に対するグアニン塩基の割合を意味する。５’側領域は、配列番号７８〜１３６からなる群から選択される塩基配列であることが好ましく、配列番号７８〜１１９からなる群から選択される塩基配列であることが更に好ましく、配列番号７８〜１０７からなる群から選択される塩基配列であることが特に好ましい。

３’側領域は、アデニン塩基の割合が２０％以下であり、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上である、１〜４０塩基の塩基配列である。アデニン塩基の割合とは、３’側領域の塩基配列を構成する塩基数に対するアデニン塩基の割合を意味する。同様に、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合とは、３’側領域の塩基配列を構成する塩基数に対するグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合を意味する。３’側領域は、配列番号１３７〜１９３からなる群から選択される塩基配列であることが好ましく、配列番号１３７〜１７６からなる群から選択される塩基配列であることが更に好ましく、配列番号１３７〜１６５からなる群から選択される塩基配列であることが特に好ましい。

ところで、各核酸塩基の酸解離定数（ｐＫａ）として、表１に示す値が報告されている。表中の（ａ）についてはＪ．Ｃｌａｕｗａｅｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｓｔｏｃｋｘ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，２３ｂ，２５，１９６８を参照されたい。（ｂ）についてはＩ．Ｗｅｍｐｅｎ，Ｒ．Ｄｕｓｃｈｉｎｓｋｙ，Ｌ．Ｋａｐｌａｎ ａｎｄ Ｊ．Ｊ．Ｆｏｘ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３，４７５５，１９６１を参照されたい。（ｃ）についてはＪ．Ｊ．Ｆｏｘ ａｎｄ Ｄ．Ｓｈｕｇａｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９，３６９，１９５２を参照されたい。

これらの報告によると、ｐＫａの値はアデニン塩基とシトシン塩基が低く、グアニン塩基とチミン塩基が高い。この性質により、グアニン塩基とチミン塩基にプロトンが付加されると相互作用を引き起こす可能性が考えられる。また、アプタマーは核酸であり、リン酸骨格が負に帯電していることから、Ｓｍ菌の膜上に存在する正に荷電している部分に結合しやすいと考えられる。しかし、アプタマー中のグアニン塩基やチミン塩基が多い領域は正に荷電し、Ｓｍ菌の膜上に存在する負に帯電している部分と結合しやすい可能性が考えられる。

特定の理論に拘泥するものではないが、本発明のＳｍ菌特異的アプタマーの５’側領域は、グアニン塩基の割合が少ないことにより、上述したようにリン酸骨格に由来して負に荷電し、Ｓｍ菌との結合が生じている可能性が考えられる。また、３’側領域は、グアニン塩基及びチミン塩基の割合が高く、アデニン塩基の割合が低いことにより、上述したようにグアニン塩基及びチミン塩基が正に荷電し、Ｓｍ菌の膜上に存在する局所的に負に帯電している部分との結合が生じている可能性が考えられる。

Ｓｍ菌特異的アプタマーは、（ｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列からなる核酸、（ｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）菌に結合する活性を有する核酸、又は（ｉｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＳｍ菌に結合する活性を有する核酸からなることが更に好ましい。

１若しくは数個の塩基とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の塩基を意味する。また、「９０％以上の相同性を有する塩基配列」とは、２つの塩基配列をアラインメントして比較した場合に、９０％以上の塩基が同一である塩基配列を意味する。塩基配列をアラインメントする際には、最大の相同性を与えるようにギャップを挿入してもよい。ギャップとは空白（空白の塩基）を意味する。下記実験例において示すように、例えば、配列番号１〜６１に記載の塩基配列からなるアプタマーは、Ｓｍ菌に対して良好な反応性（Ｓｍ菌に結合する活性）を示す。

ここで、コア領域には変異が入らないことが好ましい。変異が入る場合、１若しくは２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であり、１若しくは２個の塩基の置換であることが好ましい。コア領域は、配列番号７２〜７７からなる群から選択される塩基配列であることが好ましく、配列番号７２に記載の塩基配列であることが更に好ましい。

発明者らは、下記実験例において示すように、（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）ＣＤ−スペクトルの結果から、コア領域がＧ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン４重鎖）構造をとっていることを明らかにした。Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とは、ＤＮＡの高次構造の一種であり、グアニンの４量体が形成した面が２〜３面重なったものである。この構造は１本鎖ＤＮＡ単体が形成することもできるが、２量体や４量体の１本鎖ＤＮＡが形成することも知られている。下記実験例のＣＤ−スペクトルは、４量体構造を意味する可能性が高い。Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造は、内部に１価の金属イオンを取り込むことで安定化することが知られている。

特定の理論に拘泥するものではないが、発明者らは、下記実験例において示すように、コア領域の塩基配列からなる核酸がＳｍ菌と結合しないことから、本発明のＳｍ菌特異的アプタマーは、コア領域が５’側領域及び３’側領域を特定の空間に立体配置するための骨格となっており、５’側領域及び３’側領域でＳｍ菌と結合していると考えられる。コア領域によって複数のアプタマー分子が束ねられて４量体などの多量体を形成することによって、アプタマーの立体配置が固定され、Ｓｍ菌に対する反応性が飛躍的に向上していると考えられる。

本発明のＳｍ菌特異的アプタマーを用いてＳｍ菌を検出することができる。例えば、次のような方法が使用できる。まず、Ｓｍ菌特異的アプタマー配列を標識物質で標識する。次に、標識Ｓｍ菌特異的アプタマーとＳｍ菌を反応させる。反応後、未反応の標識Ｓｍ菌特異的アプタマーを遠心及び洗浄、吸引ろ過などの方法によって除去し、その後、フィルター、メンブレン、ろ紙などの検出基材上に載せる。検出基材の上には、Ｓｍ菌と反応した標識Ｓｍ菌特異的アプタマーが残っているため、その標識物質を検出することにより、Ｓｍ菌の存在を確認できる。

標識物質としては、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、白金コロイド粒子などの貴金属コロイド、ビーズ、着色した脂質小胞（リボソーム）や小胞、ラテックス粒子、着色ラテックス粒子、磁気微粒子などの各種微粒子、ＦＩＴＣなどの各種蛍光物質、酵素、補酵素、ビオチン、色素、化学発光物質、放射性同位元素、酸化還元物質などを使用することができる。

標識物質として金コロイドを使う場合、金コロイドとアプタマーの結合にはビオチン−アビジン結合を利用する方法及びチオール基を利用する方法などが使用できる。チオール基を利用する場合、チオール基修飾アプタマーを使うと容易にアプタマーを金コロイド標識することができる。

本発明はまた、Ｓｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤を提供する。本発明のＳｍ菌増殖抑制剤は、上記のＳｍ菌特異的アプタマーを単独で、又は適宜、薬理学的に許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などの製剤として使用することができる。

これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。

賦形剤は、有機系賦形剤又は無機系賦形剤であり得る。有機系賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのようなデンプン誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；又はプルランなどであり得る。無機賦形剤は、例えば、軽質無機ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムのようなケイ酸塩誘導体；リン酸水素カルシウムのようなリン酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；又は硫酸カルシウムのような硫酸塩などであり得る。

滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガムのようなワックス類；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬ−ロイシン；脂肪酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水ケイ酸、ケイ酸水和物のようなケイ酸類；又は上記デンプン誘導体であり得る。

結合剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、又は上記賦形剤と同様の化合物であり得る。

崩壊剤は、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；又はカルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類であり得る。

安定剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなクレゾール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；又はソルビン酸であり得る。

矯味矯臭剤は、例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料であり得る。

希釈剤は、例えば、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液などの通常使用されるものであり得る。

本発明のＳｍ菌増殖抑制剤において、Ｓｍ菌特異的アプタマーに細菌増殖抑制物質を修飾することにより、Ｓｍ菌増殖抑制効果を更に高めることができる。細菌増殖抑制物質とは、公知の殺菌剤や阻害剤や抗菌剤を意味し、例えば、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化第一錫、フッ化ストロンチウム、モノフルオロリン酸ナトリウムなどのフッ化物；正リン酸のカリウム塩、ナトリウム塩などの水溶性リン酸化合物；アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、ヒノキチオール、アスコルビン酸、塩化リゾチーム、グリチルリチン酸及びその塩類、塩化ナトリウム、トラネキサム酸、イプシロンアミノカプロン酸、酢酸ｄｌ−トコフェロール、α−ビサボロール、イソプロピルメチルフェノール、クロルヘキシジン塩類、塩化セチルピリジニウム、アズレン、グリチルレチン酸、銅クロロフィリンナトリウム、グルコン酸銅などの銅化合物、乳酸アルミニウム、塩化ストロンチウム、硝酸カリウム、ベルベリン、ヒドロキサム酸及びその誘導体、トリポリリン酸ナトリウム、ゼオライト、アミラーゼ、メトキシェチレン、無水マレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、エピジヒドロコレステリン、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロコレステロール、トリクロロカルバニド、クエン酸亜鉛塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、トリクロサン、イソプロピルフェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、イソプロピルメチルフェノール、トリクロロカルバニド、ハロゲン化ジフェニルエーテル類、プロアントシアニジン類（ポリフェノール化合物、フェノール化合物）、ハロゲン化カルバニリド、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、コウジ酸、コウジ酸誘導体、ペニシリン系試薬、マイクロライド系試薬、クリンダマイシン系試薬を使用することができる。

本発明はまた、チオール基修飾を有するＳｍ菌特異的アプタマーと、チオール基修飾を有しないＳｍ菌特異的アプタマーとを混合し、多量体を形成したアプタマーを得る、多量体形成ステップと、多量体を形成したアプタマーに、チオール基修飾を介して金コロイドを結合して金コロイド標識アプタマーを得る、金コロイド標識ステップと、金コロイド標識アプタマーをＳｍ菌と結合させる、アプタマー結合ステップとを有する、Ｓｍ菌の検出方法を提供する。

下記実験例において示すように、本発明者らは、チオール基修飾アプタマーと金コロイドとを結合させると、多量体を形成したアプタマーの全てのチオール基が金コロイドと結合することにより、標的であるＳｍ菌と結合する際に結合部位の柔軟性が乏しくなり、本来の結合性が発揮できない場合があることを見出した。

本発明のＳｍ菌の検出方法により、上記の問題を解消することができる。すなわち、チオール基修飾アプタマーに、チオール基修飾を有しないアプタマー又は未標識のアプタマーを混合して多量体を形成させ、その後、多量体を形成したアプタマーのうち、チオール基修飾のものと金コロイドとを結合させるとよい。これにより、多量体を形成したアプタマー中のチオール基修飾を有しないアプタマーの存在により、結合部位の柔軟性を確保することができる。

チオール基修飾を有しないアプタマーとしては、未標識アプタマーやＦＩＴＣ標識アプタマーなどが使用できるが、Ｓｍ菌への結合がより向上することからＦＩＴＣ標識アプタマーを用いることが好ましい。

チオール基修飾アプタマーと、チオール基修飾を有しないアプタマーとの混合比は、質量比で１：１〜１：１０であることが好ましく、１：２〜１：７であることがより好ましく、１：３〜１：５であることが特に好ましい。

（実験例１）
ＣＤ−スペクトルの測定
配列番号７３に示すコア領域の塩基配列からなるＤＮＡ断片、配列番号１の塩基配列からなるアプタマー及び配列番号２の塩基配列からなるアプタマーのＣＤ−スペクトルを、Ｔｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、及びＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）中で測定した。Ｔｒｉｓ緩衝液はカリウムイオンを含んでおらず、ＴＢＳ緩衝液はカリウムイオンを含んでいる。

図２に結果を示す。（ａ）は、コア領域の塩基配列からなるＤＮＡ断片の結果を示すグラフであり、「Ａ」はＴｒｉｓ緩衝液中での結果を、「Ｂ」はＴＢＳ緩衝液中での結果を示す。（ｂ）は、配列番号１の塩基配列からなるアプタマーの結果を示すグラフであり、「Ｃ」はＴｒｉｓ緩衝液中での結果を、「Ｄ」はＴＢＳ緩衝液中での結果を示す。（ｃ）は、配列番号２の塩基配列からなるアプタマーの結果を示すグラフであり、「Ｅ」はＴｒｉｓ緩衝液中での結果を、「Ｆ」はＴＢＳ緩衝液中での結果を示す。

パラレル型Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と呼ばれる構造を有する場合には、２４０ｎｍにおいて負のピークが、２６５ｎｍにおいて正のピークが検出されることが知られている。図２の結果から、コア領域の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、カリウムイオンの存在の有無にかかわらずパラレル型Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成することが明らかとなった。また、配列番号１の塩基配列からなるアプタマー及び配列番号２の塩基配列からなるアプタマーは、いずれもカリウムイオンの存在下でパラレル型Ｇ−Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成することが明らかとなった。

（実験例２）
アプタマーのＳｍ菌に対する結合強度の測定
Ｓｍ菌をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）で１．０×１０^９ｃｆｕ／ｍｌに調製した。この溶液に、５’末端をＦＩＴＣ標識した、配列番号１〜６８の塩基配列からなるアプタマー（終濃度 １μＭ）及びＴＢＳ−Ｔ緩衝液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）で５００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＦＩＴＣ抗体を混合し反応させた。続いて、Ｓｍ菌をＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄し、Ｓｍ菌に結合しなかったアプタマーや抗体を除去した。洗浄後の反応液１μｌをニトロセルロースメンブレンにブロットし、ＥＣＬ ａｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を添加して、酵素−基質反応による化学発光を生じさせた。生じた発光量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて測定し、測定値と陰性対象の発光量との比を算出し、アプタマーのＳｍ菌に対する結合強度として数値化した。

結果を図３に示す。特に、配列番号１〜４３の塩基配列からなるアプタマーはＳｍ菌に対する良好な反応性を示した。

配列番号６２の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７６に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であり、グアニン塩基の割合が２０％未満であり（６％）、５’側領域に必要な条件を満たす。また、３’側領域のアデニン塩基の割合が２０％未満であり（１４％）、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上であるが（７７％）、３’領域の長さが４０塩基を超えており（６４塩基）、３’側領域に必要な条件を満たしていない。配列番号６２の塩基配列からなるアプタマーは、上記の方法により測定したＳｍ菌に対する結合強度（相対値）が０．６３であり、Ｓｍ菌に対する結合性は比較的低かった。

配列番号６３の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７２に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であるが、グアニン塩基の割合が２０％を超えており（２２％）、５’側領域に必要な条件を満たしていない。また、３’側領域の長さが２３塩基であるが、アデニン塩基の割合が２０％を超えており（２６％）、更にグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％未満であり（６１％）、３’側領域に必要な条件を満たしていない。配列番号６３の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

配列番号６４の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７２に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であるが、グアニン塩基の割合が２０％を超えており（４４％）、５’側領域に必要な条件を満たしていない。また、３’側領域の長さが２３塩基であるが、アデニン塩基の割合が２０％を超えており（３０％）、更にグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％未満であり（５２％）、３’側領域に必要な条件を満たしていない。配列番号６４の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

配列番号６５の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７２に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であるが、グアニン塩基の割合が２０％を超えており（２２％）、５’側領域に必要な条件を満たしていない。また、３’側領域の長さが１２塩基であり、アデニン塩基の割合が２０％未満であり（０％）、更にグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上であり（８３％）、３’側領域に必要な条件を満たす。配列番号６５の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

配列番号６６の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７３に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であるが、グアニン塩基の割合が２０％を超えており（２８％）、５’側領域に必要な条件を満たしていない。また、３’領域の長さが３８塩基であり、アデニン塩基の割合が２０％未満であり（１６％）、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上であり（７１％）、３’側領域に必要な条件を満たす。配列番号６６の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

配列番号６７の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７２に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが１８塩基であり、グアニン塩基の割合が２０％未満であり（１７％）、５’側領域に必要な条件を満たす。また、３’側領域の長さが２３塩基であるが、アデニン塩基の割合が２０％以上であり（３０％）、更にグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％未満であり（６５％）、３’側領域に必要な条件を満たしていない。配列番号６７の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

配列番号６８の塩基配列からなるアプタマーは、配列番号７２に記載の塩基配列からなるコア領域を有し、コア領域に必要な条件を満たす。また、５’側領域の長さが２１塩基であり、グアニン塩基の割合が２０％未満であり（１９％）、５’側領域に必要な条件を満たす。また、３’側領域の長さは２１塩基であり、アデニン塩基の割合は２０％未満であった（１９％）。しかしながら、３’側領域のグアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％未満であり（６７％）、３’側領域に必要な条件を満たしていない。配列番号６８の塩基配列からなるアプタマーを用いて検討した結果、Ｓｍ菌に対する結合能が検出されなかった。

（実験例３）
アプタマーの各種細菌への結合性の評価
配列番号１、配列番号２、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７３の塩基配列からなるアプタマーの、Ｓｍ菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌａ）菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（Ｓｓ）菌及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｓａｌ）菌への結合性を評価した。配列番号７３はコア領域の塩基配列である。

上記のアプタマーの５’末端をＦＩＴＣ標識した。これらのアプタマーを、実験例２と同様にして、上記の各菌体及びＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体とそれぞれ反応させて、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、化学発光を生じさせ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて撮影した。

結果を図４に示す。（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、配列番号２、配列番号１、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７３の塩基配列からなるアプタマーの各種細菌への結合を評価した結果である。配列番号１（図４（ｂ））及び２（図４（ａ））の塩基配列からなるアプタマーは、Ｓｍ菌に対して強く結合する一方、Ｌａ菌、Ｓｓ菌及びＳａｌ菌との結合性は弱く、Ｓｍ菌特異的なアプタマーであることが確認された。

配列番号１及び２の塩基配列からなるアプタマーとはコア領域の塩基配列が異なる、配列番号７０（図４（ｃ））及び７１（図４（ｄ））の塩基配列からなるアプタマーは、Ｓｍ菌と結合したものの、配列番号１及び２の塩基配列からなるアプタマーよりも弱い結合性を示した。コア領域の塩基配列が異なることでＳｍ菌への結合能が変化することが示された。

コア領域の塩基配列（配列番号７３）からなるアプタマーは、Ｓｍ菌とはほとんど結合せず、Ｌａ菌との結合性が認められた（図４（ｅ））。このことから、これらのアプタマーのコア領域がＳｍ菌結合部位ではないことが確認された。

（実験例４）
アプタマーの各種細菌への結合性の評価
配列番号１及び配列番号２の塩基配列からなるアプタマーの、Ｓｍ菌、Ｓｓ菌（２種類）、Ｌａ菌、Ｓａｌ菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（Ｓａｎ）菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ（Ａｕｇ）菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ（Ｍｉｔ）菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ（Ｏｒａ）菌及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅｃ）菌への結合性を評価した。Ｓｓ菌としてはＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＡＴＣＣ株（Ｓｓ１）菌及びＳｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＪＣＭ株（Ｓｓ２）菌を使用した。

各種細菌との反応は実験例３と同様にして行った。結果を図５に示す。配列番号１（図５（ｂ））及び２（図５（ａ））の塩基配列からなるアプタマーは、Ｓｍ菌に対して強く結合する一方、Ｓｓ菌、Ｌａ菌、Ｓａｌ菌、Ｓａｎ菌、Ａｕｇ菌、Ｍｉｔ菌、Ｏｒａ菌及びＥｃ菌との結合性は弱く、Ｓｍ菌特異的なアプタマーであることが確認された。

（実験例５）
Ｓｍ菌特異的アプタマーのアガロースゲル電気泳動
配列番号１（４７ｍｅｒ）及び配列番号２（４４ｍｅｒ）の塩基配列からなるアプタマーのアガロースゲル電気泳動を行った。結果を図６に示す。レーン２は、１μＭの配列番号２の塩基配列からなるアプタマーの結果であり、レーン３は、１０μＭの配列番号２の塩基配列からなるアプタマーの結果であり、レーン４は、１μＭの配列番号１の塩基配列からなるアプタマーの結果であり、レーン５は、１０μＭの配列番号１の塩基配列からなるアプタマーの結果であり、レーン６は、１μＭの６６ｍｅｒのＤＮＡ断片（対照）の結果であり、レーン７は、１０μＭの６６ｍｅｒのＤＮＡ断片（対照）の結果である。

図６のレーン２〜５において、配列番号１（レーン２及び３）及び配列番号２（レーン４及び５）の塩基配列からなるアプタマーの分子量よりも大きな分子量のバンドがそれぞれ２本ずつ観察された。この結果から、これらのアプタマーが多量体を形成していることが明らかとなった。

（実験例７）
金コロイド標識アプタマーを用いたＳｍ菌の検出
配列番号２に記載のアプタマーを用いて、５’チオール基修飾アプタマー、５’チオール基修飾アプタマー及び未標識アプタマーの質量比１：３の混合物並びに５’チオール基修飾アプタマー及び５’ＦＩＴＣ標識アプタマーの質量比１：３の混合物を用いたＳｍ菌の検出を行った。

カラムを用いて上記の各アプタマー溶液からジチオスレイトール（ＤＴＴ）を除去した後、０．２５μｌのＤＴＴを添加し、９５℃で４分間保持後、２５℃まで２．３℃／分で降温の条件下でフォールディングさせた。続いてアプタマーに金コロイド（４０ｎｍ、ＣＲＬ社）を混合して室温で一晩放置して反応させた。続いて１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いてブロッキングした。続いて遠心及び洗浄を２回繰り返した。以上の操作により、金コロイド標識アプタマーが調製された。

Ｓｍ菌懸濁液及び上記の金コロイド標識を混合して反応させた。続いて、フロースルーアッセイにより、アプタマーを反応させたＳｍ菌をメンブレン（ウルトラバインド、Ｐａｌｌ社）上にトラップした。フロースルーアッセイ用のドットブロッターのウェルの直径は３ｍｍであった。吸引しながら反応液をドットブロッターのウェルに添加した。以上の操作により、メンブレン上にＳｍ菌−金コロイド標識アプタマー複合体が吸着した。メンブレン上にはＳｍ菌と反応した標識アプタマーのみが残るため、メンブレン上に残った金コロイドを検出することにより、Ｓｍ菌を検出することができる。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ装置（ＧＥ社）を用いて各サンプルのスポット強度（金コロイドの量）を測定した。

２回の実験結果をそれぞれ図７（ａ）及び（ｂ）に示す。図７において、サンプル番号１はチオール基修飾アプタマーのみを反応させた結果であり、サンプル番号２は、チオール基修飾アプタマー及び未標識アプタマーの質量比１：３の混合物を反応させた結果であり、サンプル番号３は、チオール基修飾アプタマー及びＦＩＴＣ標識アプタマーの質量比１：３の混合物を反応させた結果である。

図７（ａ）において、チオール基修飾アプタマーに未標識アプタマーを混合することで、金コロイド標識したアプタマーのＳｍ菌への結合が向上することが示された。また、未標識アプタマーの代わりにＦＩＴＣ標識アプタマーを使用することにより、金コロイド標識したアプタマーのＳｍ菌への結合が更に向上することが示された。図７（ｂ）においては、チオール基修飾アプタマーにＦＩＴＣ標識アプタマーを混合することで、金コロイド標識したアプタマーのＳｍ菌への結合が向上することが示された。

特定の理論に拘泥するものではないが、以上の結果から次のようなことが考えられる。実験例５の結果から明らかなように、配列番号２に記載のアプタマーは多量体を形成する。チオール基修飾アプタマーのみで多量体を形成し、金コロイドに結合した場合、多量体に含まれるアプタマーは自由に動くことができないため、Ｓｍ菌と結合した場合に最も安定な構造をとることが困難となる。これに対し、チオール基修飾アプタマーとチオール基修飾を有しないアプタマーの混合物が多量体を形成し、金コロイドに結合した場合には、多量体に含まれるチオール基修飾を有しないアプタマーは自由に動くことができるため、Ｓｍ菌と結合した場合に最も安定な構造をとることが可能となり、この結果、Ｓｍ菌への結合が向上する。

（実験例８）
Ｓｍ菌増殖抑制実験
Ｓｍ菌をＭＯＰＳ緩衝液中で配列番号１、２及び２６の塩基配列からなるＳｍ菌特異的アプタマー並びに対照としてＳｍ菌との結合性が低い配列番号６９の塩基配列からなるアプタマーと反応させた。アプタマーと反応させていないＳｍ菌も用意した。続いて、これらのＳｍ菌を液体培地（ＢＨＩＢ）中で１８時間培養し、増殖レベルを５５０ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。増殖レベル（相対値）は次のようにして計算した。
増殖レベル（相対値）＝（対象のＳｍ菌培養液のＯＤ_５５０）／（アプタマーと反応させていないＳｍ菌培養液のＯＤ_５５０）

結果を表２に示す。配列番号１、２及び２６の塩基配列からなるＳｍ菌特異的アプタマーと反応させたＳｍ菌は、配列番号６９の塩基配列からなるアプタマーと反応させたＳｍ菌及びアプタマーと反応させていないＳｍ菌と比較して、増殖が抑制されたことが確認された。

以上の結果から、Ｓｍ菌特異的アプタマーをＳｍ菌増殖抑制剤として使用してう蝕を予することができることが明らかとなった。この効果はＳｍ菌に対してのみ発揮され、口腔内に存在する他の常在菌への増殖抑制効果は確認されず、安全性も高いものである。

本発明によれば、Ｓｍ菌特異的アプタマーが提供される。また、上記のＳｍ菌特異的アプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤及び上記のＳｍ菌特異的アプタマーを使用したＳｍ菌の検出方法が提供される。

Claims (8)

1. 下記式（１）で表される塩基配列からなり、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）菌に結合する活性を有する核酸からなるＳｍ菌特異的アプタマー。
   ５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’ …（１）
   ［式中、Ｙは配列番号７２に記載の塩基配列又は配列番号７２に記載の塩基配列において１若しくは２個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であり、
   Ｘはグアニン塩基の割合が２０％以下である５〜３０塩基の塩基配列であり、
   Ｚはアデニン塩基の割合が２０％以下であり、グアニン塩基及びチミン塩基の合計の割合が７０％以上である１〜４０塩基の塩基配列である。］
2. Ｙは配列番号７２〜７７からなる群から選択される塩基配列であり、
   Ｘは配列番号７８〜１３６からなる群から選択される塩基配列であり、
   Ｚは配列番号１３７〜１９３からなる群から選択される塩基配列である、
   請求項１に記載のＳｍ菌特異的アプタマー。
3. （ｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列からなる核酸、
   （ｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｍ）菌に結合する活性を有する核酸、又は
   （ｉｉｉ）配列番号１〜６１からなる群から選択される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＳｍ菌に結合する活性を有する核酸
   からなる請求項１又は２に記載のＳｍ菌特異的アプタマー。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分とするＳｍ菌増殖抑制剤。
5. 前記アプタマーが細菌増殖抑制物質で修飾されている、請求項４に記載のＳｍ菌増殖抑制剤。
6. チオール基修飾を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーと、チオール基修飾を有しない請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーとを混合し、多量体を形成したアプタマーを得る、多量体形成ステップと、
   多量体を形成したアプタマーに、チオール基修飾を介して金コロイドを結合して金コロイド標識アプタマーを得る、金コロイド標識ステップと、
   前記金コロイド標識アプタマーをＳｍ菌と結合させる、アプタマー結合ステップと
   を有する、Ｓｍ菌の検出方法。
7. 前記チオール基修飾を有しない請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーが、ＦＩＴＣ標識を有する、請求項６に記載の検出方法。
8. 前記多量体形成ステップにおいて、チオール基修飾を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーと、チオール基修飾を有しない請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーの混合比が、質量比で１：１〜１：１０である、請求項６又は７に記載の検出方法。