MX2007015010A - Anticuerpos dirigidos a cd20 y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos dirigidos al antigeno CD20 y a usos de tales anticuerpos. En particular, a anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos al antigeno CD20. Tambien se describen secuencias de nucleotido codificantes, y secuencias de aminoacido que comprenden, moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada, particularmente secuencias que corresponden a secuencas de cadena ligera y pesada contiguas que recorren las regiones de estructura y/o las regiones que determinan la complementariedad (CDR), especificamente desde FR1 hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3. Tambien se describen hidribomas u otras lineas celulares que expresan tales moleculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

Description

ANTICUERPOS DIRIGIDOS A CD20 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a anticuerpos monoclonales contra el antígeno objetivo CD20 y usos de tales anticuerpos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos a CD20 y usos de estos anticuerpos. Los aspectos de la invención también se refieren a hibndomas u otras líneas celulares que expresan tales anticuerpos. Los anticuerpos descritos son útiles como diagnósticos y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o sobre-expresión de CD20, y/o la presencia y/o actividad de células CD20P ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La CD20 es una glico-fosfoprotema de PM 33,000 que es de 298 aminoácidos de longitud. El gen CD20 humano es de 1653 pares base de longitud. El 5 ' UTR es de 147 pares base de longitud. La secuencia de codificación es de 893 pares base mientras que el 3 ' UTR es de 613 pares base de longitud. La CD20 se expresa a alta densidad solamente en la superficie de células normales y neoplásicas del linaje de linfocito B y se pone a funcionar como un receptor durante la activación de la célula B. Las células madre y progenitores de célula B aparentemente carecen del antígeno CD20. La secuencia de aminoácido predicha de CD20 revela una proteína altamente hidrofóbica con dominios de 4 segmentos de membrana, con los términos amino y carboxi de la proteína ubicada dentro del citoplasma. Una región hidrofílica corta se ubica entre los residuos 142 y 185 y puede estar expuesta en la superficie celular. Tres isoformas de CD20 humano que tienen pesos de 33, 35 y 37 kDa resultan de la fosforilación diferencial de una proteína única. La CD20 no comparte alguna homología significativa con otras proteínas conocidas. Existe un 73% de homología entre las secuencias humana y de ratón con la similitud más grande en las regiones de transmembrana. La CD20 está estrechamente asociada con otras proteínas, en particular la proteína que enlaza la src cinasa C-terminal (Cbp), CD40, y la mayoría de proteínas Clase II de histocompatibilidad compleja (HMC II) . El anticuerpo que enlaza a CD20 se ha encontrado en algunos casos que induce la translocación rápida de la molécula a balsas de lípido. Diversas compañías actualmente venden agentes terapéuticos que se dirigen a la proteína CD20. Rituxan© (Rituximab) (Genentech, South San Francisco, CA) , Tositumomab® (GlaxoSmithKline, Brentford, Middiesex, Reino Unido) , y HuMax-CD20 (Genmab, Copenhagen, Dinamarca) son terapéuticos de anticuerpo monoclonal que se dirigen a la proteína CD20.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención se refieren a agentes de enlace de objetivo que específicamente enlazan a CD20 e inhiben el crecimiento de células que expresan CD20. Los mecanismos por los cuales esto se puede lograr pueden incluir, y no se limitan a, inducción de apoptosis de células que expresan CD20, inducción de citotoxicidad celular de anticuerpo (ADCC) en células que expresan CD20, o inducción de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en células que expresan CD20, erradicando las células B positivas a CD20 incluyendo células de linfoma CD20+, células de leucemia CD20+ y células B normales. En una modalidad de la invención, el agente enlazante de objetivo es un anticuerpo completamente humano que enlaza a CD20 e induce la apoptosis de las células que expresan CD20. Todavía otra modalidad de la invención es un anticuerpo monoclonal completamente humano que enlaza a CD20 e induce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en células que expresan CD20. Otra modalidad de la invención es un anticuerpo monoclonal completamente humano que enlaza a CD20 e induce la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en células que expresan CD20. En algunas modalidades, el anticuerpo enlaza a CD20 e induce la apoptosis de células que expresan CD20 con un EC50 de aproximadamente 0.5 µg/ml o menos en un ensayo de viabilidad CellTiterGlo estándar de células Ramos. En algunas modalidades, el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, tiene un EC50 de no más de aproximadamente 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, ó 0.02 µg/ml para inducir la apoptosis de células B en un ensayo de viabilidad CellTiterGlo estándar de células Ramos. En algunas modalidades, el anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, enlaza a CD20 e induce la apoptosis de células que expresan CD20 con un EC50 de aproximadamente 0.2 µg/ml o menos en un ensayo de viabilidad Alamar Blue estándar de células Ramos. En algunas modalidades, el anticuerpo, o porción de enlace del mismo, tiene un EC¡,o de no más de aproximadamente 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, ó 0.04 µg/ml en un ensayo de viabilidad Alamar Blue estándar de células Ramos . Otra modalidad de la invención es un anticuerpo que compite por enlace con cualquiera de los agentes o anticuerpos de enlace de objetivo descritos en la presente. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza con CD20 con una KD de menos de 12 nanomolar (nM) . En otra modalidad, el anticuerpo se enlaza con una KD de menos de 10 nM, 9 nM, 8 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM o 1 nM . En una modalidad, el anticuerpo se enlaza con una KD de 500, 100, 30, 20, 10, ó 5 pM. Las mediciones de afinidad y/o avidez se pueden medir por FMAT, FACS, KinExA® y/o BIACORE®, como se describe en la presente. En una modalidad, al anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que tiene una región determinante de complementariedad (CDR) con una de las secuencias mostradas en la tabla 8. Se señala que aquellos de experiencia ordinaria en la técnica fácilmente pueden realizar las determinaciones de CDR. Véase por ejemplo, Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunologícal In teres t , Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Una modalidad es un agente enlazante de objetivo que enlaza a CD20 y comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDRl) que tiene una secuencia de aminoácido de GYSFTSYWIG (SEC ID NO.: 201). Todavía otra modalidad es un anticuerpo que enlaza a CD20 y comprende una secuencia de aminoácido de cadena ligera que tiene una CDR que comprende una de las secuencias mostradas en la tabla 9. En ciertas modalidades el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano. Por consiguiente, una modalidad es un agente enlazante de objetivo que enlaza a CD20 y comprende una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene una secuencia de aminoácido de KISNRFS (SEC ID NO. : 202) . Una modalidad adicional es un anticuerpo que enlaza a CD20 y comprende una secuencia de aminoácido de cadena pesada que tiene una de las secuencias de CDR mostradas en la tabla 8 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera que tiene una de las secuencias de CDR mostradas en la tabla 9. En ciertas modalidades el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que enlaza el mismo epítope como cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. Una modalidad proporciona un anticuerpo monoclonal, o porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo, o porción de enlace, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 2. En una modalidad, el anticuerpo, o porción de enlace del mismo, adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 4. Otra modalidad es un anticuerpo monoclonal, o porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo, o porción de enlace, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 30. En una modalidad, el anticuerpo, o porción de enlace del mismo, adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 32. Aún otra modalidad es un anticuerpo monoclonal, o porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo, o porción de enlace, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 46. En una modalidad, el anticuerpo, o porción de enlace del mismo, adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 48. Modalidades adicionales de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que específicamente enlazan a CD20, en donde los anticuerpos comprenden una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDRl) correspondiente a la clase canónica 1. Los anticuerpos proporcionados en la presente también pueden incluir una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (CDR2) correspondiente a la clase canónica 2, una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (CDRl) correspondiente a la clase canónica 4, una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2) correspondiente a la clase canónica 1, y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (CDR3) correspondiente a la clase canónica 1.

Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que enlazan a CD20 y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea germinal VH5-51. Algunas modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que enlazan a CD20 y comprenden una cadena ligera VK . Aún otras modalidades de la invención incluyen un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera VK apareada con una cadena pesada codificada por, o derivada de, un gen de cadena pesada VH5-51. En algunas modalidades, el polipéptido de cadena ligera VK es codificado por, o derivado de, un gen de cadena ligera A23. Todavía otra modalidad es un agente enlazante de objetivo que enlaza a los residuos aminoácido 171-179 del dominio extracelular CD20 humano. En otras modalidades, la invención proporciona un agente enlazante de objetivo que enlaza un epítope que comprende el péptido NPSEKNSPS (SEC ID NO.: 196). En aún otras modalidades, la invención proporciona agente enlazante de objetivo que no requiere Alanina 170 para enlace al dominio extracelular de CD20. Una modalidad de la invención comprende anticuerpos monoclonales completamente humanos 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329), 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328), y 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) los cuales específicamente enlazan a CD20, como se discute con más detalle posteriormente. Una modalidad de la invención es un anticuerpo que enlaza a los mismos epítopes como anticuerpos monoclonales 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329) , 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328), y 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) . Otras modalidades de la invención proporcionan composiciones, incluyendo un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable . Modalidades aún adicionales de la invención incluyen métodos para tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad neoplásica, que incluyen seleccionar un animal en necesidad de tratamiento para una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal completamente humano que específicamente enlaza a CD20. Las enfermedades neoplásicas tratables, incluyen, por ejemplo, linfomas, incluyendo linfomas de célula B, tal como linfoma no de Hodgkin (NHL) , incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico de célula B precursora y neoplasmas de célula B madura, tal como leucemia linfocítica crónica de célula B (CLL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítica, linfoma de célula manto (MCL) , linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y esplénico) , leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de aldenstróm, y linfoma de célula grande anaplásica (ALCL) . Además, los ejemplos incluyen B-NHL recaído o refractario después de terapia con Rituxan®. Modalidades adicionales de la invención incluyen métodos para tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad del sistema inmune, que incluyen seleccionar un animal en necesidad de tratamiento de una enfermedad del sistema inmune, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal completamente humano que específicamente enlaza a CD20. Las enfermedades del sistema inmune tratables incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, Granulomatosis de Wegener, psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa, síndrome de dificultad respiratoria, encefalitis por meningitis, uveítis, glomerulonefritis, eczema, asma, ateroesclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias inmuno-mediadas, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis por lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA) , dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Omenn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, y enfermedades asociadas con virus herpes. Los trastornos adicionales incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda severa y coreoretinitis . Otros ejemplos son enfermedades y trastornos causados por infección de células B con virus, tal como virus de Epstein Barr (EBV) . Modalidades adicionales de la invención incluyen métodos para inhibir el crecimiento de tumor de célula B en un animal. Estos métodos incluyen seleccionar un animal en necesidad de tratamiento para crecimiento de tumor de célula B, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal completamente humano en donde el anticuerpo específicamente enlaza a CD20. Modalidades adicionales de la invención incluyen el uso de un anticuerpo en la preparación de medicamento para el tratamiento de enfermedades que involucran la expresión de CD20 en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal específicamente enlaza a CD20. En otras modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se pueden usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neoplásicas en un animal, en donde el anticuerpo específicamente enlaza a CD20. Las enfermedades neoplásicas tratables incluyen linfomas, incluyendo linfomas de célula B, tal como linfoma no de Hodgkin (NHL) . Modalidades adicionales incluyen el uso de un anticuerpo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inmunes en un animal, en donde el anticuerpo específicamente enlaza a CD20. Las enfermedades tratables que involucran la expresión de CD20 incluyen, por ejemplo, enfermedades neoplásicas, tal como NHL, incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico de célula B precursora y neoplasmas de célula B madura, tal como leucemia linfocítica crónica de célula B (CLL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítica, linfoma de célula manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y esplénico) , leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstróm, y linfoma de célula grande anaplásica (ALCL). Además, los ejemplos incluyen B-NHL recaído o refractario después de terapia con RituxanT. Los ejemplos de enfermedades inmunes incluyen enfermedad de Crohn, Granulomatosis de Wegener, psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa, síndrome de dificultad respiratoria, encefalitis por meningitis, uveítis, glomerulonefritis, eczema, asma, ateroesclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias inmuno-mediadas, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis por lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA) , dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Omenn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, y enfermedades asociadas con virus herpes. Los trastornos adicionales incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda severa y coreoretinitis . Otros ejemplos son enfermedades y trastornos causados por infección de células B con virus, tal como virus de Epstein Barr (EBV) . Las modalidades de la invención descritas en la presente se refieren a anticuerpos monoclonales que enlazan a CD20 y afectan la función anti-CD20. Otras modalidades se refieren a anticuerpos anti-CD20 completamente humanos y preparaciones de anticuerpo anti-CD20 con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo alta afinidad de enlace para CD20, la capacidad de erradicar las células B positivas CD20 y células de linfoma B in vi tro e ín vivo, la capacidad de inducir apoptosis in vi tro e in vivo, la capacidad de producir actividad ADCC in vi tro e in vivo, la capacidad de inducir CDC in vi tro e in vivo, y/o la capacidad de inhibir el crecimiento de tumor de célula B. Aún otras modalidades se refieren a anticuerpos anti-CD20 completamente humanos y preparaciones de anticuerpo anti-CD20 que no resultan en una respuesta de Anticuerpo Anti-Quimérico Humano (HACA) significativa, permitiendo la administración repetida. Por consiguiente, una modalidad descrita en la presente incluye anticuerpos aislados, o fragmentos de estos anticuerpos, que enlazan a CD20. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos ventajosamente pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales, oligoclonales , monoclonales, quiméricos, humanizados, y/o completamente humanos. Las modalidades de la invención descritas en la presente también proporcionan células para producir estos anticuerpos . Se apreciará que las modalidades de la invención no se limitan a cualquier forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD20 puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')2). Además, el anticuerpo se puede manufacturar de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o de una célula recombinantemente modificada que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican el anticuerpo. Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de dominio único tales como dominios VH o VL únicos humanos o camélidos que enlazan a CD20. Otras modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican anticuerpos anti-CD20 o una célula hospedadora transformada con cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico. Además, una modalidad de la invención es un método para producir un anticuerpo anti-CD20 cultivando células hospedadoras bajo condiciones en donde una molécula de ácido nucleico es expresada para producir el anticuerpo seguido por recuperación del anticuerpo. Una modalidad adicional en la presente incluye un método para producir anticuerpos de alta afinidad a CD20 inmunizando un mamífero con células que expresan CD20 humano, membranas de célula aisladas que contienen CD20 humano, CD20 humano purificado, o un fragmento del mismo, y/o una o más secuencias ortólogas o fragmentos de las mismas . Otras modalidades se basan en la generación e identificación de anticuerpos aislados que enlazan específicamente a CD20. La CD20 se expresa sobre 90% de linfomas de células B. Los anticuerpos que median la eliminación de células B que expresan CD20 pueden prevenir el crecimiento de tumor inducido por CD20 y otros efectos deseados. Los anticuerpos que median la eliminación de células B no malignas se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades inmunes . Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnósticas enfermedades o condiciones en las cuales un anticuerpo preparado como se describe en la presente se utiliza para detectar el nivel de CD20 en un paciente. En modalidades adicionales, se presentan métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnóstico de enfermedad, y etapas de enfermedad los cuales involucran la identificación de la expresión y/o sobre-expresión de CD20 usando anticuerpos anti-CD20. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar a un paciente un conjugado de anticuerpo completamente humano que selectivamente enlaza a una proteína CD20 en una célula. El conjugado de anticuerpo comprende un anticuerpo que selectivamente enlaza a CD20 y una etiqueta. Los métodos adicionalmente comprenden observar la presencia de la etiqueta en el paciente. Una cantidad relativamente alta de la etiqueta indicará un riesgo relativamente alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja de la etiqueta indicará un riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una modalidad, la etiqueta es una proteína fluorescente verde . La invención adicionalmente proporciona métodos para someter a ensayo el nivel de CD20 en una muestra de paciente, que comprenden poner en contacto un anticuerpo anti-CD20 con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de enlace entre el anticuerpo y CD20 en la muestra. En modalidades más específicas, la muestra biológica es sangre o suero. Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnósticas una condición asociada con la expresión de CD20 en una célula poniendo en contacto el suero o una célula con un anticuerpo anti-CD20, y después detectar la presencia de CD20. En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar CD20 en tejidos, células, o fluidos corporales de mamífero para seleccionar enfermedades que involucran células que expresan CD20. El kit incluye un anticuerpo que enlaza a CD20 y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con CD20, si está presente. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que enlaza CD20 es etiquetado. En otra modalidad el anticuerpo es un anticuerpo primario no etiquetado y el kit adicionalmente incluye un medio para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, el medio incluye un segundo anticuerpo etiquetado que es una anti-inmunoglobulina . Preferiblemente el anticuerpo es etiquetado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radio-opaco.

Todavía otra modalidad incluye métodos para tratar enfermedades o condiciones asociadas con la expresión de CD20 en un paciente, administrando al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CD20. El anticuerpo anti-CD20 se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con anticuerpos adicionales o fármaco quimioterapéutico o terapia de radiación. Por ejemplo, una mezcla monoclonal, oligoclonal o policlonal de anticuerpos CD20 que inducen la apoptosis de células de linfoma B, y/o producen ADCC, y/o inducen CDC se pueden administrar en combinación con un fármaco que muestra inhibir la proliferación de célula de tumor directamente. El método se puede realizar ín vivo y el paciente preferiblemente es un paciente humano. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD20 se pueden modificar para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 se pueden modificar para mejorar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) . En todavía otras modalidades, los anticuerpos anti-CD20 se pueden modificar tanto para mejorar su capacidad de activar células efectoras como participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) y para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de manufactura que incluye un contenedor. El contenedor incluye una composición que contiene un anticuerpo anti-CD20, y un inserto o etiqueta de envase que indica que la composición se puede usar para tratar enfermedades caracterizadas por la expresión o sobre-expresión de CD20. En otras modalidades, la invención proporciona un kit para tratar enfermedades que involucran la expresión de CD20, que comprende anticuerpos monoclonales anti-CD20 e instrucciones para administrar los anticuerpos monoclonales a un sujeto en necesidad de tratamiento. En otro aspecto, se proporciona un método para eliminar selectivamente una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un conjugado de anticuerpo completamente humano a un paciente. El conjugado de anticuerpo completamente humano comprende un anticuerpo que puede enlazar el dominio extracelular de CD20 y un agente. El agente ya sea es una toxina, un radioisótopo, u otra sustancia que eliminará una célula cancerosa. El conjugado de anticuerpo selectivamente elimina la célula cancerosa. El agente puede ser saporina. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo completamente humano conjugado que enlaza a CD20. Unido al anticuerpo está un agente, y el enlace del anticuerpo a una célula resulta en el suministro del agente a la célula. En una modalidad, el anticuerpo completamente humano conjugado anterior enlaza a un dominio extracelular de CD20. En otra modalidad, el anticuerpo y toxina conjugada son incorporados por una célula que expresa CD20. En otra modalidad, el agente es un agente citotóxico. En otra modalidad, el agente es saporina. En aún otra modalidad, el agente es un radioisótopo. En algunas modalidades de la invención, las configuraciones de glicosilación de los anticuerpos proporcionados en la presente son modificadas para mejorar la función efectora de ADCC y CDC. Véase Shields RL et al., (2002) JBC. 277:26733; Shinka a T et al., (2003) JBC . 278:3466 y Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336:1239.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1 y 2 son gráficas que muestran los resultados de ensayos de viabilidad de célula CellTiterGlo sin reticulación de células Ramos incubadas con mAbs 1.1.2, 1.2.1, 1.3.3, 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2 (figura 1), 1.9.2, 1.12.3, 1.13.2, 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1 (figura 2), y el control de anticuerpo Rituxan® ( "Rituximab'J . El porcentaje de viabilidad de células Ramos se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x. Las figuras 3A-3D son gráficas que muestran los resultados de ensayos de viabilidad de célula Alamar Blue sin reticulador de células Ramos incubadas con mAbs 1.6.2, 1.5.3, 1.4.3 (figura 3A) , 1.3.3, 1.1.2, Bl (figura 3B) , 2.4.1, 2.2.2, 2.1.2 (figura 3C) , 1.13.2, 1.12.3, Bl (figura 3D) Rituximab, IgM e IgGl . El % de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x . Las figuras 4A-4D son gráficas que muestran los resultados de ensayos de viabilidad de célula WST-1 sin reticulación de células Ramos incubadas con mAbs 1.1.2, 1.3.3, 1.4.3 (figura 4A) , 1.5.3, 1.6.2 (figura 4B) , 1.12.3, 1.13.2 (figura 4C) , 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1 (figura 4D) , Bl, Rituximab, IgGl e IgM. El % de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x . Las figuras 5 y 6 son gráficas que muestran los resultados de ensayos de apoptosis V/PI de Anexina sin reticulador de células Ramos incubadas con mAbs 1.1.2, 1.3.3, 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2 (figura 5), 1.12.3, 1.13.2, 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1 (figura 6), Rituximab y Bl . El % de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x.

Las figuras 7A-7D, 8A-8D, y 9A-9D son gráficas que muestran los resultados de ensayos de CDC de líneas celulares Ramos (figuras 7A-7D) , Raji (figuras 8A-8D) , y Daudi (figuras 9A-9D) , respectivamente, incubadas con mAbs 1.1.2, 1.2.1, 1.3.3 (A), 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2 (B) , 1.9.2, 1.12.3, 1.13.2 (C), 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1 (D), control de Rituximab e IgGl . El porcentaje de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el ej e x . La figura 10 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de ADCC de línea celular Ramos incubada con mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3, 1.10.31, y 1.11.3.1, control de Rituximab e IgGl. El % de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x. Las figuras 11-12 son gráficas que muestran los resultados de ensayos de ADCC de líneas celulares Raji (figura 11), y Daudi (figura 12) incubadas con mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.3.3, 1.5.3, Rítuxímab e IgGl. El % de viabilidad se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x. La figura 13 es una gráfica de barras que muestra los resultados de ensayos de sangre entera de células Raji, Ramos, y Daudi incubadas con mAbs 1.1.2, 2.1.2, control de Rituximab e IgGl usando ensayos de Sangre Entera. El porcentaje de lisis se muestra en el eje y y las líneas celulares Raji, Ramos, y Daudi, respectivamente, se muestran en el eje x. Los resultados demuestran que los mAbs 1.1.2 y 2.1.2 median mayor lisis celular cuando se comparan con Rituximab. Las figuras 14A y 14B son gráficas que muestran los resultados de ensayos de sangre entera de líneas celulares Karpas-422 (figura 14A) y EHEB (figura 14B) incubadas con mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3, 1.10.3.1, 1.11.3.1, control de Rituximab, e IgGl. El % de lisis se muestra en el eje y y la concentración de anticuerpo se muestra en el eje x. Los resultados demuestran que las líneas celulares EHEB y Karpas-422 son resistentes a tratamiento con Rituximab mientras que los anticuerpos anti-CD20 anteriores median niveles significativamente mayores de lisis celular. La figura 15 es un diagrama de dispersión que muestra los resultados de una comparación de ensayo de sangre entera de actividad lítica usando mAbs 1.5.3, 1.1.2, y Rituximab en un panel de líneas celulares. Cada símbolo representa un donante humano de sangre entera. El porcentaje de lisis a 10 µg/ml se muestra en el eje y y las líneas celulares ARH-77, Daudi, EHEB, JMV2 , MV3, Karpas422, Namal a, Raji, Ramos, SCI, SU-DHL-4, y WSU-NHL, respectivamente, se muestran en el eje x.

La figura 16 es un diagrama de dispersión que muestra la relación de lisis en un ensayo de sangre entera en un panel de lineas celulares entre mAb 1.1.2 y Rituximab y entre mAb 1.5.3 y Rituximab. Cada símbolo representa un donante humano de sangre entera. La relación entre el porcentaje de lisis a 10 µg/ml para cada mAb ant?-CD20 y el porcentaje de lisis logrado por Rituximab a 10 µg/ml para el mismo donante de sangre entera se muestra. Las líneas celulares ARH-77, Daudí, EHEB, JMV2 , MV3, Karpas422, Namalwa, Ra í, Ramos, SCI, SU-DHL-4, y WSU-NHL, respectivamente, se muestran en el eje x. La figura 17 es una gráfica de barras que muestra la lisis de células RRl-Rají resistentes a Rituximab en un ensayo de sangre entera por Rituximab, mAb 1.1.2, y mAb 1.5.3. El porcentaje de lisis se muestra en el eje y y las células parentales Rají tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente y células RRl-Rají tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, se muestran en el e e x. La figura 18 es una gráfica de barras que muestra la lisis de células RRl-Ramos, RR6-Ramos, y RR8-Ramos resistentes a Rituximab en un ensayo de sangre entera por Rituximab y mAb 1.5.3. El porcentaje de lisis se muestra en el eje y y las células parentales Ramos tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, células RRl-Ramos tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, células RR6-Ramos tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, células RR8-Ramos tratadas a una concentración de anticuerpo de 1 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente, se muestran en el eje x. La figura 19 es una gráfica de líneas que muestra el efecto de anticuerpos anti-CD20, Rituximab, 2.1.2, 1.1.2, y 1.5.3 en supervivencia de ratones en un modelo de parálisis i.v. Ramos (CB17 SCID). Los resultados muestran que tres anticuerpos anti-CD20 demuestran actividad anti-linfoma potente cuando se administran como una monoterapia de dosis única. El número de días de tratamiento postimplantación de célula de tumor se muestra en el eje x y el porcentaje de supervivencia se muestra en el eje y. La figura 20 es una gráfica de líneas que muestra la eficacia de anticuerpos anti-CD20 en el modelo de tumor subcutáneo Daudi. El número de días de tratamiento después del tiempo de inoculación de célula de tumor se muestra en el eje x y el volumen de tumor en milímetros cúbicos se muestra en el eje y. La figura 21 es una gráfica de líneas que muestra la eficacia de anticuerpos anti-CD20 en el modelo de tumor subcutáneo Namalwa. El número de días de tratamiento después del tiempo de inoculación de célula de tumor se muestra en el eje x y el volumen de tumor en milímetros cúbicos se muestra en el eje y. La figura 22 es una gráfica de líneas que muestra la eficacia de anticuerpos anti-CD20 en el modelo de tumor subcutáneo RRl-Raji. El número de días de tratamiento después del tiempo de inoculación de célula de tumor se muestra en el eje x y el volumen de tumor en milímetros cúbicos se muestra en el eje y. La figura 23 es una gráfica de líneas que muestra la eficacia de anticuerpos anti-CD20 en el modelo de tumor subcutáneo RR6-Ramos. El número de días de tratamiento después del tiempo de inoculación de célula de tumor se muestra en el eje x y el volumen de tumor en milímetros cúbicos se muestra en el eje y. La figura 24 es una gráfica de barras que muestra la depleción de células B de tejido en mono cinomolgo después del tratamiento con vehículo de control (solución salina), Rituximab (10 mg/kg), y mAb 1.5.3 (10 mg/kg). El porcentaje de tejido CD20+CD40+ se muestra en el eje y y las muestras de nodulo linfático auxiliar, mesentérico, e inguinal, médula ósea, y bazo se muestran en el eje x.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención descritas en la presente se refieren a anticuerpos monoclonales que enlazan a CD20. En algunas modalidades, los anticuerpos enlazan a CD20 e inducen la apoptosis de células de linfoma B. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos anti-CD20 completamente humanos, y preparaciones de anticuerpo que son terapéuticamente útiles. Tales preparaciones de anticuerpo anti-CD20 preferiblemente tienen propiedades terapéuticas deseables incluyendo fuerte afinidad de enlace para CD20, la capacidad de inducir apoptosis de células de linfoma B ín vi tro e in vivo, la capacidad de producir actividad ADCC in vi tro e in vivo, y la capacidad de inducir CDC in vi tro e in vivo . Las modalidades de la invención también incluyen fragmentos de enlace aislados de anticuerpos anti-CD20. Preferiblemente, los fragmentos de enlace son derivados de anticuerpos anti-CD20 completamente humanos. Los fragmentos ejemplares incluyen Fv, Fab' u otros fragmentos de anticuerpo bien conocidos, como se describe con más detalle posteriormente. Las modalidades de la invención también incluyen células que expresan anticuerpos completamente humanos contra CD20. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células recombinantemente creadas, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) que producen anticuerpos contra CD20. Además, las modalidades de la invención incluyen métodos de uso de estos anticuerpos para tratar enfermedades. Los anticuerpos anti-CD20 son útiles para erradicar células B CD20 positiva y/o células de linfoma B. El mecanismo de acción puede incluir inducir la apoptosis de células que expresan CD20, inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en célula que expresa CD20, o inducir la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en células que expresan CD20. Las enfermedades que son tratables a través de este mecanismo incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas, tales como linfomas, incluyendo linfomas de célula B, tal como linfoma no de Hodgkin (NHL) , incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico de célula B precursora y neoplasmas de célula B madura, tal como leucemia línfocítica crónica de célula B (CLL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítica, linfoma de célula manto (MCL) , linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma B de zona marginal (tipo Tejido Linfoide Asociado a Mucosa (MALT) , tipo nodal y esplénico) , leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstróm, y linfoma de célula grande anaplásica (ALCL). Además, los ejemplos incluyen B-NHL recaído o refractario después de terapia con Rituximab. Las enfermedades inmunes incluyen enfermedad de Crohn, Granulomatosis de Wegener, psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa, síndrome de dificultad respiratoria, encefalitis por meningitis, uveítis, glomerulonefritis, eczema, asma, ateroesclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias inmuno-mediadas, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis por lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA) , dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Grave, tiroidítis de Hashimoto, síndrome de O enn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), y enfermedades asociadas con virus herpes. Los trastornos adicionales incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda severa y coreoretinitis. Otros ejemplos son enfermedades y trastornos causados por infección de células B con virus, tal como virus de Epstein Barr (EBV) . Otras modalidades de la invención incluyen ensayos de diagnóstico para determinar específicamente la presencia y/o cantidad de CD20 en un paciente o muestra biológica. El kit de ensayo puede incluir anticuerpos anti-CD20 conjuntamente con las etiquetas necesarias para detectar tales anticuerpos. Estos ensayos de diagnósticos son útiles para seleccionar enfermedades relacionadas con CD20 que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas, tales como linfomas, incluyendo linfomas de célula B, tal como linfoma no de Hodgkin (NHL) , incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico de célula B precursora y neoplasmas de célula B madura, tal como leucemia linfocitica crónica de célula B (CLL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítica, linfoma de célula manto (MCL) , linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y esplénico) , leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstróm, y linfoma de célula grande anaplásica (ALCL) . Además, los ejemplos incluyen B-NHL recaído o refractario después de terapia con Rituximab. Las enfermedades inmunes incluyen enfermedad de Crohn, Granulomatosis de Wegener, psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa, síndrome de dificultad respiratoria, encefalitis por meningitis, uveítis, glomerulonefritis, eczema, asma, ateroesclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias inmuno-mediadas, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis por lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA) , dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Omenn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, y enfermedades asociadas con virus herpes. Los trastornos adicionales incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda severa y coreoretinitis. Otros ejemplos son enfermedades y trastornos causados por infección de células B con virus, tal como virus de Epstein Barr (EBV) .

En una modalidad se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 2. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 4. Otra modalidad proporciona un anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 30. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 32. Aún otra modalidad proporciona un anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 46. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de SEC ID NO.: 48. En una modalidad se proporciona un hibridoma que produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de anticuerpo como se describe anteriormente. Preferiblemente el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Más preferiblemente el hibridoma produce la cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo monoclonal completamente humano 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329), 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328), y 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) . Alternativamente el hibridoma produce un anticuerpo que enlaza al mismo epítope o epítopes como anticuerpo monoclonal completamente humano 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329), 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328), y 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330). En una modalidad se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo como se describe anteriormente. Preferiblemente se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. Más preferiblemente se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo monoclonal completamente humano 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329), 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328), y 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330). En una modalidad de la invención se proporciona un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico como se describe anteriormente, en donde el vector codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo como se define anteriormente. En una modalidad de la invención se proporciona una célula hospedadora que comprende un vector como se describe anteriormente. Alternativamente la célula hospedadora puede comprender más de un vector. Además, una modalidad de la invención es un método para producir un anticuerpo cultivando las células hospedadoras bajo condiciones en donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por recuperación del anticuerpo. En una modalidad de la invención se proporciona un método para hacer un anticuerpo que comprende transfectar al menos una célula hospedadora con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se describe anteriormente, expresar la molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora y aislar el anticuerpo. De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un método para inhibir el crecimiento de células que expresan CD20 que comprende administrar un agente enlazante de objetivo como se describe anteriormente. El método puede incluir seleccionar un animal en necesidad de tratamiento de enfermedad relacionada con la expresión de CD20, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método para tratar una enfermedad del sistema inmune en un animal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. El método puede incluir seleccionar un animal en necesidad de tratamiento para una enfermedad inmune, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método para tratar una enfermedad neoplásica en un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. El método puede incluir seleccionar un animal en necesidad de tratamiento de una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. El agente se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con un segundo agente anti-neoplásico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterapéutico, o un fármaco radioactivo. De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método para tratar cáncer en un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. El método puede incluir seleccionar un animal en necesidad de tratamiento de cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20. El agente se puede administrar solo, o se puede administrar en combinación con un segundo agente anti-neoplásico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterapéutico, o un fármaco radioactivo. De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedades del sistema inmune . De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona el uso de un agente enlazante de objetivo que específicamente enlaza a CD20 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica . Una modalidad de la invención es particularmente adecuada para el uso en la inhibición del crecimiento de tumor de célula B en pacientes con un tumor que es dependiente solo, o en parte, de la expresión de CD20. Otra modalidad de la invención incluye un kit de ensayo para detectar CD20 en tejidos, células, o fluidos corporales de mamífero para seleccionar enfermedades neoplásicas y/o del sistema inmune. El kit incluye un agente enlazante de objetivo que enlaza a CD20 y un medio para indicar la reacción del agente enlazante de objetivo con CD20, si está presente. El agente enlazante de objetivo puede ser un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que enlaza a CD20 es etiquetado. En otra modalidad el anticuerpo es un anticuerpo primario no etiquetado y el kit adicionalmente incluye un medio para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, el medio incluye un segundo anticuerpo etiquetado que es una anti-inmunoglobulina . Preferiblemente el anticuerpo es etiquetado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radio-opaco. Modalidades adicionales, características, y similares con respecto a los anticuerpos anti-CD20 se proporcionan con detalle adicional posteriormente.

Definiciones A menos que se defina de otra forma, los términos científicos y técnicos usados en la presente tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra forma por contexto, los términos singulares deberán incluir pluralidades y los términos plurales deberán incluir lo singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y técnicas de, cultivo de célula y tejido, biología molecular, y química de proteína y oligo- o polinucleótido e hibridación descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación son realizadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se realizan en la técnica o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores son generalmente realizados de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas en toda la presente especificación. Véase, por ej emplo , Sambrook et al . Molecular Cloning: A Labora tory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), la cual se incorpora en la presente para referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorios, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes. Cuando se utilizan de conformidad con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otra forma, se deberá entender que tienen los significados siguientes: Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de peso molecular pequeño con un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 Daltons. El término "CD20" se refiere a la glico-fosfoproteína CD20 de PM 33,000 que es de 298 aminoácidos de longitud y codificada por el gen CD20. El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente deberá significar un polinucleótido que se ha aislado de su ambiente naturalmente presente. Tales polinucleótidos pueden ser genómicos, ADNc, o sintéticos. Los polinucleótidos aislados preferiblemente no están asociados con todos o una porción de los polinucleótidos de asociados por naturaleza. Los polinucleótidos aislados pueden ser operativamente enlazados a otro polinucleótido que no está enlazado por naturaleza. Además, los polinucleótidos aislados preferiblemente no se presentan en la naturaleza como parte de una secuencia grande. El término "proteína aislada" referido en la presente significa una proteína que se ha aislado de su ambiente naturalmente presente. Tales proteínas se pueden derivar de ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, la cual por virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas murina, (3) se expresa por una célula de una diferente especie, o (4) no se presenta en la naturaleza. El término "polipéptido" se usa en la presente como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos, y análogos son especies del género de polipéptido. Los polipéptidos preferidos de conformidad con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lambda, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. Los polipéptidos preferidos de conformidad con la invención también pueden comprender solamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana o fragmentos de las mismas. El término "que se presenta naturalmente" como se usa en la presente cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido o polipéptido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y la cual no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra forma que se presenta naturalmente. El término "operativamente enlazado" como se usa en la presente se refiere a posiciones de componente descritos que están en una relación que permite que funcionen en su manera propuesta. Por ejemplo, una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia codificante se conecta de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótído que son necesarias para efectuar o afectar la expresión y procesar las secuencias codificantes a la cuales se conectan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de enlace ribosomal, y secuencia de terminación de transcripción, en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control pueden incluir promotores, mejoradores, intrones, secuencias de terminación de transcripción, secuencias de señal de poliadenilación, y regiones no traducidas 5' y 3'. El término "secuencias de control" se propone que incluya, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de socio de fusión. El término "polinucleótido" como es referido en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, o hetero-dúplex ARN-ADN. El término incluye formas de hebra única o doble de ADN. El término "oligonucleótido" referido en la presente incluye nucleótidos que se presentan naturalmente y modificados enlazados conjuntamente por enlaces que se presentan naturalmente, y que no se presentan naturalmente. Los oligonucleótidos son un sub-conjunto de polinucleótido generalmente que comprende una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y muy preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de hebra única, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser de hebra doble, por ejemplo para el uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos ya sea sentido o anti-sentido . El término "nucleótidos que se presentan naturalmente" referido en la presente incluye desoximbonucleótidos y ribonucleótidos. El termino "nucleótidos modificados" referido en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótido" referido en la presente incluye enlaces de oligonucleotidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase , por ej emplo, LaPlanche et al . Nucí . Acíds . Res . 14:9081 (1986); Stec et al . J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein et al . Nucí . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al . Anti -Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al . Ol igonucleotides and Analogues : A Practical Approach , pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al . Patente de los Estados Unidos No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las descripciones de las cuales son incorporadas para referencia. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para detección, si se desea. El término "selectivamente hibridar" referido en la presente significa enlazar de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos selectivamente hibridan a hebras de ácido nucleico bajo hibridación y condiciones de lavado que minimizan las cantidades apreciables de enlace detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de alta severidad para lograr condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y se discute en la presente. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos 80%, y más típicamente con homologías preferiblemente incrementadas de al menos 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácido son "homologas" si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias son alineadas para máxima igualación. Las aberturas (en cualquiera de las dos secuencias que son igualadas) se dejan en igualación maximizada; las longitudes de abertura de 5 o menos son preferidas con 2 o menos siendo más preferido. Alternativamente o preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homologas, como este término se usa en la presente, si tienen un registro de alineación de a lo mucho 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad de abertura de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp . 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 a este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son preferiblemente más homologas si sus aminoácidos son mayores que o igual a 50% idénticas cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN. Se deberá apreciar que pueden existir diferentes regiones de homología dentro de dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales de ortologías de ratón y humanas pueden tener un grado mayor de homología que las regiones no funcionales. El término "corresponde a" se usa en la presente para significar que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente de manera evolucionada relacionada) a toda o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En distinción en contraste, el término "complementariedad con" se usa en la presente para significa que la secuencia de complementariedad es homologa a toda o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria con una secuencia de referencia "GTATA", El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido o aminoácido son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o residuo aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, dividiendo el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" como se usa en la presente denota una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácido, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia, cuando se compara con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos) , frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia la cual puede incluir supresiones o adiciones las cuales completan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un sub-conjunto de una secuencia mayor . Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Inmunology - A Syn thesis (2a Edición, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), la cual se incorpora en la presente para referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácido no naturales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil-lisina, N-acetil-lisina, O-fosfoserina, e-N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación de polipéptido usada en la presente, la dirección izquierda es la dirección terminal amino y la dirección derecha es la dirección carboxi-terminal, de conformidad con el uso y convención estándar. De manera similar, a menos que se especifique de otra forma, el extremo izquierdo de secuencias de polinucleótido de hebra única es el extremo 5'; la dirección izquierda de secuencias de polinucleótído de hebra doble es referida como la dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de transcriptos de ARN naciente es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el ARN y las cuales están 5' al extremo 5' del transcripto de ARN son referidas como "secuencias corriente arriba"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el ARN y las cuales están 3 ' al extremo 3 ' del transcripto de ARN son referidas como "secuencias corriente abajo". Cuando se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando se alinean óptimamente, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de abertura por defecto, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y muy preferiblemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácido conservadoras. Las sustituciones de aminoácido conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonína; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadora preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamico-aspártico, y asparagma-glutamina . Como se describe en la presente, variaciones menores en las secuencias de aminoácido de moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina se contemplan siendo incluidas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácido mantengan al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, y muy preferiblemente 99% de identidad de secuencia a las moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina descritas en la presente. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácido conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácido genéticamente codificados son generalmente divididos en familias: (1) aspartato ácido, glutamato; (2) lisina básica, arginina, histidina; (3) alamna no polar, valina, leucina, isoleucina, prolma, fenilalanina, metionina, triptofan; y (4) glicina polar no cargada, asparagma, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias mas preferidas son: serina y treonina son una familia hidroxi alifatica; asparagma y glutamina son una familia que contiene amida; alanma, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalamna, tpptofan, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor en la función de enlace o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio de armazón. Si un cambio de aminoácido resulta en un péptido funcional se puede determinar fácilmente sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen con detalle en la presente. Los fragmentos o análogos de moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina se pueden fácilmente preparar por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Los amino y carboxi-términos preferidos de fragmentos o análogos se presentan cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar por comparación de los datos de la secuencia de nucleótido y/o aminoácido a las bases de datos de secuencia pública o propietaria. Preferiblemente, se usan métodos de comparación computarizados para identificar las porciones de secuencia o dominios de conformación de proteína predicha que se presentan en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar las secuencias de proteína que se doblan en una estructura de tres dimensiones conocida. Bowie et al Science 253:164 (1991). Por consiguiente, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos de experiencia en la técnica pueden reconocer porciones de secuencia y conformaciones estructurales que se pueden usar para definir dominios estructurales y funcionales de conformidad con los anticuerpos descritos en la presente. Las sustituciones de aminoácido preferidas son aquellas en las cuales: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de enlace, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia de péptido que se presenta naturalmente. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácido únicas o múltiples (preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras) se pueden hacer en la secuencia que se presenta naturalmente (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácido conservadora sustancialmente no deberá cambiar las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no deberá tender a romper una hélice que se presenta en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen) . Los ejemplos de estructuras secundaria y terciara de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins , Structures and Mol ecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984); In troduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Na t ure 354:105 (1991), las cuales son incorporadas en la presente para referencia. El término "fragmento de polipéptido" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que tiene supresión de amino terminal y/o carboxi terminal, pero donde la secuencia de aminoácido restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se presenta naturalmente deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, usualmente al menos 50 aminoácidos de largo, y aún más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se usa en la presente se refiere a polipéptidos los cuales están comprendidos de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial a una porción de una secuencia de aminoácido deducida y la cual tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) enlace específico a una CD20, bajo condiciones de enlace adecuadas, (2) capacidad de inducir la apoptosis de células que expresan CD20, (3) capacidad de producir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), o (4) capacidad de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución de aminoácido conservadora (o adición o supresión) con respecto a la secuencia que se presenta naturalmente. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de largo, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de largo o más largos, y frecuentemente pueden ser tan largos como un polipéptido que se presenta naturalmente de longitud completa. Los análogos de péptido son comúnmente usados en la industria farmacéutica como fármacos no péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuesto no péptido son llamados "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" . Fauchere J. Adv. Drug Res . 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al . J. Med. Chem . 30: 1229 (1987), las cuales se incorporan en la presente para referencia. Tales compuestos son frecuentemente desarrollados con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: --CH2NH--, --CH2S--, —CH2-CH?~ , ~CH=CH~ (cis y trans), —COCH2— , —CH)OH)CH7--, y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica se puede generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporada aquí como referencia); por ejemplo, adicionando residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramolecular los cuales ciclizan el péptido. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que se comprimen de al menos un dominio de enlace que se forma del doblez de cadenas de polipéptidos que tienen espacios de enlace tridimensionales con formas de superficie interna y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo típicamente tiene una forma tetramérica, que comprende dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera" y una "pesada". Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forma un sitio de enlace de anticuerpo . Como se usa en la presente, un "agente enlazante objetivo" es un anticuerpo, o fragmento de enlace de los mismos, que preferiblemente se enlazan a un sitio objetivo. En una modalidad, el agente enlazante objetivo es específico para solamente un sitio objetivo. En otras modalidades, el agente enlazante objetivo es específico para más de un sitio objetivo. En una modalidad, el agente enlazante objetivo puede ser un anticuerpo monoclonal y el sitio objetivo puede ser un epítope. Los "fragmentos de enlace" de un anticuerpo se producen por técnicas de ADN recombinantes, o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de enlace incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única. Un anticuerpo diferente de un anticuerpo "biespecífico" o "bífuncional" se entiende que tiene cada uno sus sitios de enlace idénticos. Un anticuerpo sustancíalmente inhibe la adhesión de un receptor a un contra-receptor cuando un exceso de anticuerpos reduce la cantidad de enlace de receptor a contra-receptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% u 80%, y más usualmente mayor que aproximadamente 85% (cuando se mide en un ensayo de enlace competitivo in vitro) . Un anticuerpo puede ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado por CDR, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo anti-idiotípico y anticuerpos que se pueden etiquetar en forma soluble o enlazada así como también fragmentos, variantes o derivados de los mismos, ya sea solos o en combinación con otras secuencias de aminoácidos provistas por técnicas conocidas. Un anticuerpo puede se de cualquier especie. El término anticuerpo también incluye fragmentos de enlace de los anticuerpos de la invención; fragmentos ejemplares incluyen Fv, Fab, Fab', anticuerpo de hebra única (svFC), región variable dimérica (Diacuerpo) y región variable estabilizada de disulfuro (dsFv) . El término "epítope" incluye cualquier proteína determinante capaz de enlace específico a un receptor de célula T o inmunoglobulina. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de superficies químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y pueden, pero no siempre, tener características estructurales tri-dimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Un anticuerpo es el que se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 µM, preferiblemente < 100 nM y en forma más preferible < 10 nM. El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. "Activo" o "actividad" en vista de un polipéptido CD20 se refiere a una porción de un polipéptido CD20 que tiene una actividad biológica o una actividad inmunológica de un polipéptido CD20 nativo. "Biológico" cuando se usa en la presente se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido CD20 nativo. Una actividad biológica CD20 preferida incluye, por ejemplo, proliferación de linfocito B. "Mamífero" cuando se usa en la presente se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es humano. La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, resulta en dos fragmentos de enlace de antígenos idéntico, conocido también como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe", que no tiene actividad de enlace de antígenos pero que tiene capacidad para cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, resulta en el fragmento F(ab')2 en la cual los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden sitios de enlace de dos antígenos. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de reticular el antígeno. "Fv" cuando se usa en la presente se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que pertenece tanto a los sitios de enlace de antígeno como reconocimiento de antígeno. "Fav" cuando se usa en la presente se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada . El término "mAb" se refiere a un anticuerpo monoclonal . "Liposoma" cuando se usa en la presente se refiere a una vesícula pequeña que puede ser útil para el suministro de fármacos que pueden incluir el polipéptido CD20 de la invención o anticuerpos tales como un polipéptido CD20 a un mamífero. "Etiqueta" o "etiquetado" se usa en la presente cuando se refiere a la adición de una porción detectable para un polipéptido, por ejemplo, un grupo biotinilado o etiquetado quimioluminiscente de etiqueta enzimática, etiqueta fluorescente, radioetiqueta. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, lbN, 35S, 90Y, 99Tc, nlIn, 125I, 131I, etiquetas fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos de lantanuro o FITC y etiquetas enzimáticas pueden incluir peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina. El término "agente farmacéutico o fármaco" como se usa en la presente se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Otros términos químicos en la presente se usan de acuerdo al uso convencional en la técnica, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed . , MacGraw-Hill, San Francisco (1985)), (incorporado en la presente como referencia). Como se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde las especies objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustanclalmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente mas de aproximadamente 85%, 90%, 95%, y 99%. De manera más preferible, la especie objeto se purifica a homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular única. "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Ig Fc (FcRS) (por ejemplo, células Exterminadoras Naturales (por sus siglas en inglés, NK) , monocitos, neutrófilos, y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula objetivo y subsecuentemente causa lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar células ADCC, NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan Fc?RI , Fc?RII y FcyRIII. La expresión FcRS en células hematopoyéticos se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad de ADCC de una molécula de ínteres, se puede realizar un ensayo ADCC ín vitro, tal como aquel descrito en la Patente Norteamericana No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Exterminadoras Naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de ínteres puede ser valorada m vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como aquel descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988). "Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren al mecanismo por el cual los anticuerpos realizan su función de exterminar. Se inicia por el enlace de Clq, un constituyente del primer componente de complemento, al dominio Fc de Igs, IgG o IgM, los cuales están en complejo con antigenos (Hughs-Jones, N.C., y B. Garder. 1979. Mol. Immunol . 16:697). Clq es una glicoprotema estructuralmente compleja, grande, de ~410 kDa presente en suero humano a una concentración de 70 µg/ml (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol . 37:151). Junto con dos sepna proteasas, Clr y Cls, Clq forma el complejo Cl, el primer componente de complemento. Al menos dos de las cabezas globulares N-terminal de Clq deben ser unidas a la Fc o Igs para activación de Cl, por consiguiente para iniciación de la cascada de complemento (Cooper, N.R. 1985, Adv. Immunol. 37:151).

"Ensayos de sangre completa" usan sangre no fraccionada como una fuente de efectores naturales. La sangre contiene complemento en el plasma, junto con efectores celulares que expresión FcR, tales como células polimorfonucleares (PNMs) y células mononucleares (MNCs) . Por consiguiente, los ensayos de sangre completo permiten la evaluación simultánea de la sinergia de tanto los mecanismos efectores de ADCC y CDC in vitro. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios.

Estructura de Anticuerpo La unidad estructural de anticuerpo básico es conocida porque comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptídos, cada par que tiene cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables para reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante primariamente responsable para la función de efector. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada para de cadena ligera/pesada forman el sitio de enlace de anticuerpo. Por consiguiente, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de enlace son los mismos. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de estructura (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hiper variables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones de estructura, habilitando el enlace a un epítope específico. De N-terminal a C-terminal, tanto cadenas ligera como pesadas comprenden los dominios FRl, CDRl, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de conformidad con las definiciones de Kabat Seguetees of Proteins of Immunological In teres t (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al. Na ture 342:878-883 (1989) . Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de enlace. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab1. Véase, por ej empl o , Songsvilai & Lauchmann Cl in . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol . 148:1547-1553 (1992). Los anticuerpos biespecíficos no existen en la forma de fragmentos que tienen un sitio de enlace único (por ejemplo, Fab, Fab J y Fv) .

Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de rata o murina. La presencia de tales proteínas derivadas de rata o murina puede conducir a la rápida limpieza de anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Para evitar la utilización de anticuerpos derivados de rata o murina, los anticuerpos completamente humanos se pueden generar a través de la introducción de loci de anticuerpo humano funcional en un roedor, otro mamífero o animal de modo que el roedor, otro mamífero o animal produce anticuerpos completamente humanos. Un método para generar anticuerpos completamente humanos es a través del uso de cepas XenoMouse® de ratones que se han modificado para contener fragmentos configurados de línea germinal hasta pero menos de 1000 kb de tamaño del locus de cadena pesada humana y locus de cadena ligera kappa. Las cepas XenoMouse® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) . Tales ratones, luego, son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humana y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina de murina. Las tecnologías utilizadas para lograr lo mismo se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Serie No. 08/759,620, presentada el 3 de Diciembre de 1996 y Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 98/24893, publicada el 11 de Junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de Diciembre de 2000, las descripciones de las cuales son incorporadas para referencia. Véase también Méndez et al . Na ture Genetícs 15:146-156 (1997), la descripción de la cual se incorpora para referencia. En general, los anticuerpos producidos por los hibridomas fusionados fueron cadenas pesadas de IgGl o IgG4 humana con cadenas ligeras kappa o lambda completamente humanas. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo cadenas pesadas de IgG2. Los anticuerpos poseen altas afinidades, típicamente teniendo un Kd de aproximadamente 10~6 hasta aproximadamente 10~12 M o inferior, cuando se mide contra células en técnicas de medición de afinidad basadas en FACS. La afinidad también se puede medir por técnicas de fase sólida y fase solución. En una modalidad, los anticuerpos descritos en la presente enlazan a CD20 con un Kd de menos de 12 nanomolar (nM) e inducen la apoptosis de B-linfocitos . En algunas modalidades, los anticuerpos enlazan a CD20 con un Kd de menos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, ó 4 nM. Como se apreciará, los anticuerpos anti-CD20 se pueden expresar en líneas celulares diferentes de líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares se pueden usar para transformar una célula hospedadora de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula hospedadora con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455 (las patentes se incorporan en la presente para referencia) . El procedimiento de transformación usado depende del hospedador a ser transformado. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) , incluyendo pero no limitado a células de ovario de hámster Chino (CHO) , células de riñon de hámster bebé (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humana (por ejemplo, Hep G2 ) , 293 células de riñon epiteliales humanas, y un número de otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de cuales líneas celulares tienen niveles de expresión altos y producen anticuerpos con propiedades de enlace de CD20 constitutivas . Los anticuerpos anti-CD20 son útiles en la detección de CD20 en muestras de paciente y por consiguiente son útiles como diagnósticos para estados de enfermedad como se describe en la presente. Además, basado en su capacidad de inducir apoptosis, producir ADCC, y/o inducir CDC (como se demuestra en los ejemplos posteriormente) , los anticuerpos anti-CD20 tienen efectos terapéuticos en síntomas de tratamiento y condiciones resultantes de expresión de CD20 en células B. En modalidades específicas, los anticuerpos y métodos en la presente se refieren al tratamiento de síntomas resultantes de crecimiento de tumor inducido por CD20. Las modalidades adicionales involucran el uso de anticuerpos y métodos descritos en la presente para tratar enfermedades neoplásícas, tal como NHL, incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico de célula B precursora y neoplasmas de célula B madura, tal como leucemia linfocítica crónica de célula B (CLL) , linfoma linfocítico pequeño (SLL) , leucemia prolinfocítica de célula B, linfoma linfoplasmacítica, linfoma de célula manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluyendo FL de grado bajo, grado intermedio y grado alto, linfoma de centro de folículo cutáneo, linfoma B de zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y esplénico) , leucemia de célula pilosa, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de célula plasmática, trastorno linfoproliferativo post-transplante, macroglobulinemia de Waldenstróm, y linfoma de célula grande anaplásica (ALCL) . Además, los ejemplos incluyen B-NHL recaído o refractario después de terapia con Rituximab. Las enfermedades inmunes incluyen enfermedad de Crohn, Granulomatosis de Wegener, psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerativa, síndrome de dificultad respiratoria, encefalitis por meningitis, uveítís, glomerulonefritis, eczema, asma, ateroesclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias inmuno-mediadas, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis por lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA) , dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Omenn, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, y enfermedades asociadas con virus herpes. Los trastornos adicionales incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda severa y coreoretinitis. Otros ejemplos son enfermedades y trastornos causados por infección de células B con virus, tal como virus de Epstein Barr (EBV) .

Secuencias de Anticuerpo Las modalidades de la invención incluyen los anticuerpos anti-CD20 específicos listados posteriormente en la tabla 1. Esta tabla reporta el número de identificación de cada anticuerpo anti-CD20, conjuntamente con el número ID de SEC de las regiones variables de los genes de cadena ligera y cadena pesada correspondientes. A cada anticuerpo se ha dado un número de identificación que incluye ya sea dos o tres números separados por uno o dos puntos decimales. En algunos casos, solamente dos números de identificación separados por un punto decimal se listan. Sin embargo, en algunos casos, diversos clones de un anticuerpo fueron preparados. Aunque los clones tienen las secuencias de ácido nucleico y aminoácido idénticas como la secuencia de origen, también pueden ser listados separadamente, con el número de clon indicado por el número a la derecha de un segundo punto decimal. Por consiguiente, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico y aminoácido de anticuerpo 1.2 son idénticas a las secuencias de anticuerpo 1.2.1, 1.2.2, y 1.2.3.

TABLA 1 Administración Terapéutica y Formulaciones Los anticuerpos anti-CD20 pueden tener efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y condiciones relacionadas con la expresión de CD20. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inducir la apoptosis de células que expresan CD20, inhibiendo el crecimiento de tumor, o los anticuerpos se pueden asociar con un agente y suministrar una toxina letal a una célula de objetivo. Además, los anticuerpos anti-CD20 son útiles como diagnóstico para los estados de enfermedad, especialmente enfermedades neoplásicas e inmunes. Si se desea, el isotipo de un anticuerpo anti-CD20 se puede cambiar, por ejemplo para tomar ventaja de una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias puede ser deseable en conexión con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra CD20 que los anticuerpos sean capaces de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo, sin limitación, lo siguiente: IgM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgM humana, IgA humana, IgGl humana, e IgG3 humana. En otras modalidades puede ser deseable en conexión con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra CD20 que los anticuerpos sean capaces de enlazar receptores Fc en células efectoras y participar en citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) . Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo, sin limitación, lo siguiente: IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgGl humana, e IgG3 humana. Se apreciará que los anticuerpos que se generan necesariamente no poseen inicialmente tal isotipo sino, más bien, el anticuerpo cuando se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser isotipo cambiado después del uso de técnicas convencionales que son bien conocidas en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas ( véase por ej emplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula ( véase, por ej emplo , Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,916,771 y 6,207,418) entre otras. Por vía de ejemplo, los anticuerpos anti-CD20 discutidos en la presente son anticuerpos completamente humanos. Si un anticuerpo posee enlace deseado a CD20, podrá ser fácilmente isotipo cambiado para generar una IgM humana, IgGl humana, o isotipo de IgG3 humana, mientras que aún posee la misma versión variable (la cual define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad) . Tal molécula luego podría ser capaz de fijar el complemento y participar en CDC y/o ser capaz de enlazar a receptores Fc en células efectoras y participar en ADCC. En la técnica de fusión célula-célula, se prepara un mieloma, célula CHO u otra linea celular que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma, célula CHO u otra línea celular que posee la cadena ligera. Tales células, después, se pueden fusionar y una línea celular que expresa un anticuerpo intacto se puede aislar. Por consiguiente, cuando se generan candidatos de anticuerpo que cumplen los atributos "estructurales" deseados como se discutió anteriormente, generalmente se pueden proporcionar con al menos algo de los atributos "funcionales" deseados a través de cambio de isotipo. Las modalidades de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos anti-CD20 que son útiles como tratamientos para enfermedades. Tales formulaciones podrían inducir la apoptosis de célula de linfoma B, tratando efectivamente las condiciones patológicas donde, por ejemplo, la expresión de CD20 es anormalmente elevada o estados de enfermedad mediados por células que expresan CD20. Los anticuerpos anti-CD20 preferiblemente poseen afinidad adecuada para enlazar específicamente a CD20, y preferiblemente tienen una duración adecuada de acción para permitir la dosificación infrecuente en humanos . Una duración prolongada de acción permitirá programas de dosificación menos frecuente y más conveniente por rutas parenterales alternas tal como inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones estériles se pueden crear, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estéril, previo a o después de liofilización y reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo ordinariamente será almacenado en forma liofilizada o en solución. Las composiciones de anticuerpo terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable por una aguja hipodérmica para inyección. La ruta de administración de anticuerpo es de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, inhalación o intralesional, o por sistemas de liberación sostenida como se señala posteriormente. El anticuerpo preferiblemente se administra continuamente por infusión o por inyección de bolo. Una cantidad efectiva de anticuerpo a ser empleada terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, es preferido que el terapista titule la dosificación y modifique la ruta de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico clínico administrará anticuerpo hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. El progreso de esta terapia es fácilmente monitoreado por ensayos convencionales o por ensayos descritos en la presente. Los anticuerpos, como se describe en la presente, se pueden preparar en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica se puede administrar intravenosamente o a través de la nariz o pulmón, preferiblemente como un aerosol líquido o polvo (liofilizado) . La composición también se puede administrar parenteralmente o subcutáneamente como se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica deberá ser estéril, libre de pirógeno y en una solución parenteralmente aceptable que tiene consideración debida para pH, isotonicidad, y estabilidad. Estas condiciones son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Brevemente, las formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en la presente son preparadas por almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptable. Tales materiales son no tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tal como HCl TRIS, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes tal como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos) tal como poliarginina, proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tal como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol. Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional como se describe en Remington : The Science and Practice of Pharmacy (20a ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003) ) . Por ejemplo, la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que se presenta naturalmente tipo aceite de sésamo, cacahuate o semilla de algodón o un vehículo graso sintético tipo oleato de etilo o similar puede ser deseado. Los amortiguadores, conservadores, antioxidantes, y similares se pueden incorporar de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, las matrices están en la forma de artículos conformados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer et al . , J. Biomed Ma ter . Res . , (1981) 15:167-277 y Langer, Chem . Tech . , (1982) 12:98-105, o poli (vinil alcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al . , Biopolymers , (1983) 22:547-556), acetato de etilen-vinilo no degradable (Langer et al . , supra ) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) , y ácido polí-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Mientras que los polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico habilitan la liberación de moléculas por alrededor de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a humedad a 37°C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios de inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden contemplar para estabilización de proteína dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio de disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas. Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones adecuadas capaces de mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos liposomalmente atrapados. Los liposomas gue contienen tales anticuerpos se preparan por métodos conocidos per se: Patente Norteamericana No. DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; Solicitud de patente japonesa 83-118008; Patente Norteamericana No. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. La dosificación de la formulación de anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico que atiende tomando en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de fármacos incluyendo severidad y tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Las dosificaciones terapéuticamente efectivas se pueden determinar por cualquiera de los métodos in vitro o in vivo. Una cantidad efectiva de los anticuerpos, descritos en la presente, para ser empleados terapéuticamente dependerá, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, se prefiere por el terapista titular la dosificación y modificar la vía de administración cuando sea requerido para obtener el efecto terapéutico óptimo. Un dosis diaria típica deberá variar desde aproximadamente 0.001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el médico será administrador del anticuerpo terapéutico hasta que se alcance la dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por ensayos convencionales o como se describe en la presente. Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y métodos en la presente se determinarán con portadores adecuados, excipientes, y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar transferencia suministro, tolerancia mejoradas, y similares. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípido (catiónico o aniónico) (tales como Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas precedentes pueden ser apropiadas en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, proveen que el ingrediente activo en la formulación no es activado por la formulación y la formulación es fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parental formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en la presente para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos para químicos farmacéuticos.

Diseño y Generación de otros Terapéuticos De acuerdo con la presente invención y basado en la actividad de los anticuerpos que son producidos y caracterizados en la presente con respecto a CD20, el diseño de otras modalidades terapéuticas se facilita y describe para un experto en la técnica. Tales modalidades incluyen, sin limitación, terapéuticos de anticuerpos avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, terapéuticos radioetiquetados, y dominios V de anticuerpo único, agente enlazante similar a anticuerpos basados en diferentes andamios de región V, generación de terapéuticos de péptido, terapias por gen, particularmente intracuerpos, terapéuticos antisentido, y moléculas pequeñas. En conexión con la generación de terapéuticos de anticuerpo avanzado, donde la fijación de complemento es un atributo deseable, puede ser posible evadir la dependencia en complemento para exterminar células a través del uso de biespecíficos, inmunotoxinas, o radietiquetas, por ejemplo.

Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se pueden generar lo que comprende (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad a CD20 y otro a una segunda molécula, que son conjugadas conjuntamente, (ii) un anticuerpo único que tiene una cadena específica a CD20 y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena única que tiene especificidad para ambos CD20 y la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos se pueden generar usando técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, en conexión con (i) y (ii), véase por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright and Harris, supra. Y en conexión con (iii) véase por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad se puede hacer si se desea. Por ejemplo, la segunda especificidad se puede hacer a los receptores de activación de cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (véase, por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) o CD89 (véase, por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)). Los anticuerpos también se pueden modificar para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Véase por ej empl o, Vitetta Inmunol Today 14:252 (1993) . Véase también Patente de los Estados Unidos No. 5,194,594. En conexión con la preparación de anticuerpo radioetiquetados, tales anticuerpos modificados también se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Véase por ej emplo . , Junghans et al. en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véa se también Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, y 5,697,902. Cada una de las moléculas radioetiquetadas o inmunotoxinas podría ser probablemente para eliminar células que expresan el dominio oligomerización de sub-unidad de enzima multimérica deseado. En algunas modalidades, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD20 se enlaza a un agente (por ejemplo, radioisótopo, composición farmacéutica, o una toxina) . Preferiblemente, tales anticuerpos se pueden usar para el tratamiento de enfermedades, tales enfermedades pueden relacionarse con células que expresan CD20 o células que sobre-expresan CD20. Por ejemplo, se contempla que el fármaco posea la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos, de alquilación, antimetabolitos, antiangiogénicos, apoptóticos, alcaloides, COX-2, y antibióticos y combinaciones de los mismos. El fármaco se puede seleccionar del grupo de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, vinca alcaloides, ureas sustituidas, derivados de metil hidrazina, supresores adrenocórticos , antagonistas, endostatina, taxoles, camptotecinas, oxaliplatina, doxorrubicinas y sus análogos, y una combinación de los mismos . Los ejemplos de toxinas adicionalmente incluyen gelonina, Pseudomonas exotoxina (PE) , PE40, PE38, difteria toxina, ricina, ricina, abrina, alfa toxina, saporina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina-A Estafilocócica, proteína antiviral de hierba camín, gelonina, Pseudomonas endotoxina, así como derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores gamma, emisores positrones, y emisores de rayos x que se pueden usar para la localización y/o terapia, y emisores beta y emisores alfa que se pueden usar para terapia. Los radioisótopos descritos previamente como útiles para diagnóstico, pronóstico y andamiaje también son útiles para terapéuticos. Los ejemplos no limitantes de agentes anti-cáncer y anti-leucemia incluyen antraciclinas tales como doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina (daunomicina), idarrubicina, detorrubicina, carminomicina, epirrubicina, esorrubicina, y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los agentes farmacéuticos ejemplares incluyen cis-platino, taxol, caliqueamicina, víncristina, citarabina (Ara-C) , ciclofosfamida, prednisona, daunorrubicina, idarrubicina, fludarabina, clorambucil, interferón alfa, hidroxiurea, temoxolomida, talidomida, y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Preferiblemente, el anti-cáncer o anti-leucemia es doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina, o morfolinodaunorrubicina . Como se apreciará por uno de experiencia en la técnica, en las modalidades anteriores, mientras los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser tan importantes o más, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo) , el acto de enlace del anticuerpo al objetivo puede ser útil; sin embargo, en algunas modalidades, la internalización de la toxina en la célula es el resultado final deseado. Como tal, los anticuerpos con un alto porcentaje de internalización pueden ser deseables en estas situaciones.

Por consiguiente, en una modalidad, se contemplan anticuerpos con una alta eficiencia de internalización. Una alta eficiencia de internalización se puede medir como un porcentaje de anticuerpo internalizado, y puede ser desde un valor bajo a 100%. Por ejemplo, en modalidades variadas, 0.1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99, y 99-100% puede ser una alta eficiencia. Como se apreciará por uno de experiencia en la técnica, la efíciencia deseable puede ser diferentes en modalidades diferentes, dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que se puede administrar a un área, los efectos secundarios del complejo anticuerpo-agente, el tipo (por ejemplo, tipo de cáncer) y severidad del problema a ser tratado. En otras modalidades, los anticuerpos descritos en la presente proporcionan un kit de ensayo para la detección de expresión de CD20 en tejidos o células de mamífero para seleccionar una enfermedad o trastorno asociado con los cambios de expresión de CD20. El kit comprende un anticuerpo que enlaza CD20 y medio para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, si está presente . En algunas modalidades, se proporciona un artículo de manufactura que comprende un contenedor, que comprende una composición que contiene un anticuerpo anti-CD20, y un inserto o etiqueta de envase que indica que la composición se puede usar para tratar enfermedad mediada por expresión de CD20. Preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente, un humano, recibe el anticuerpo anti-CD20.

Combinaciones El tratamiento anti-neoplásico definido en la presente se puede aplicar como una terapia sola o puede involucrar, además de los compuestos de la invención, cirugía convencional, transplantes de célula madre periférica y médula ósea o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes anti tumor: (i) agentes citotóxicos tales como fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina, clorambucil o doxorrubicina y combinación de los mismos tal como Fludarabina + ciclofosfamida, CVP : ciclofosfamida + vincristina + prednisona, ACVBP: doxorrubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHP: ciclofosfamida + doxorrubicina + vincristina + prednisona, CNOP: cíclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexametasona + leucovorin, MACOP-B: metotrexato + dororrubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fija de prednisona + bleomicina + leucovorin, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorrubicina + ciclofosfamida + etoposido + citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorin. (ii) agentes los cuales inhiben la invasión de célula cancerosa (por ejemplo inhibidores de metaloproteinasa tipo marimastat e inhibidores de la función de receptor de activador de plasminógeno de urocinasa) ; (iii) inhibidores de factor de crecimiento o función de señalización de supervivencia, por ejemplo, tales inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento (por ejemplo anticuerpos dirigidos contra B-Lys) , anticuerpos de receptor de factor de crecimiento (por ejemplo anticuerpos dirigidos contra CD40 o receptores TRAIL TRAILR1 y TRAILR2), inhibidores de farnesil transferasa o inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa, inhibidores MEK, inhibidores de proteínas de señalización de supervivencia tal como Bcl-2, Bcl-XL por ejemplo ABT-737; (iv) agentes antiangiogénicos tales como aquellos los cuales inhiben los efectos de factor de crecimiento endotelial vascular, (por ejemplo el anticuerpo de factor de crecimiento de célula endotelial anti vascular bevacizumab [Avastin™] , anticuerpos de receptor de factor de crecimiento endotelial anti-vascular tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-fltl, compuestos tales como aquellos descritos en las Solicitudes de Patente Internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651) y compuestos que trabajan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de función avb3 de integrina y angioestatina) ; (v) agentes de daño vascular tal como Combretastatina A4 y compuestos descritos en las Solicitudes de Patente Internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213; (vi) terapias antisentido, por ejemplo aquellas las cuales se dirigen a los objetivos listados anteriormente, tal como G-3139 (Genasense), y antisentido anti bcl2; (vii) procedimientos de terapia de gen, incluyendo por ejemplo procedimientos para reemplazar genes aberrantes tal como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrante, procedimientos GDEPT (terapia de pro fármaco de enzima dirigido al gen) tales como aquellos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitroreductasa bacteriana y procedimientos para incrementar la tolerancia del paciente a quimioterapia o radioterapia tal como terapia de gen de resistencia a fármacos múltiples; y (viii) procedimientos de inmunoterapia, incluyendo por ejemplo tratamiento con Alemtuzumab (campath-lH™) , un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o tratamiento con anticuerpos dirigidos a CD22, procedimientos ex vivo e in vivo para incrementar la inmunogenicidad de células de tumor del paciente, transfección con citocinas tal como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos, procedimientos para disminuir la energía de célula T tal como tratamiento con anticuerpos monoclonales que inhiben la función de CTLA-4, procedimientos que usan células inmune transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocina, procedimientos que usan líneas celulares de tumor transfectadas con citocina y procedimientos que usan anticuerpos anti-idíotípicos; (ix) inhibidor de degradación de proteína tal como inhibidor de proteasoma al como Velcade (bortezomid) ; (x) procedimientos terapéuticos bioterapéuticos por ejemplo aquellos los cuales usan péptidos o proteínas (tales como anticuerpos o construcciones de dominio de receptor externo soluble) los cuales ya sea secuestran ligandos de receptor, bloquean el enlace de ligando al receptor o disminuyen la señalización de receptor (por ejemplo, debido a la degradación de receptor mejorada o niveles de expresión disminuidos) . En una modalidad de la invención los tratamientos anti-neoplásicos de la invención se combinan con agentes los cuales inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), (por ejemplo el anticuerpo de factor de crecimiento de célula endotelial anti-vascular bevacizumab (Avastin®) , anticuerpos de receptor de factor de crecimiento endotelial anti-vascular tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-fltl, compuestos tales como aquellos descritos en las Solicitudes de Patente Internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651) y compuestos que trabajan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función avb3 de integrina y angioestatina) . En otra modalidad de la invención los tratamientos anti-angiogénicos de la invención son agentes combinados los cuales inhiben la actividad de tirosina cinasa del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular, KDR (por ejemplo AZD2171 o AZD6474) . Los detalles adicionales sobre AZD2171 se pueden encontrar en Wedge et al (2005) Cáncer Research. 65 ( 10) : 4389-400. Los detalles adicionales sobre AZD6474 se pueden encontrar en Ryan & Wedgw (2005) British Journal of Cáncer. 92 Suppl 1:S6-13. Ambas publicaciones son incorporadas para referencia en sus totalidades. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos completamente humanos 1.1.2, 1.5.3, 2.1.2 son combinados solos o en combinación con Avastin™, AZD2171 o AZD6474. Tal tratamiento conjunto se puede lograr por vía de dosificación simultánea, consecutiva o separada de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención, o sales de los mismos farmacéuticamente aceptables, dentro del intervalo de dosificación descrito antes y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y resultados logrados se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no serán construidos como limitantes en las enseñanzas en la presente .

EJEMPLO 1 INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN Clonación de plásmido CD20 humano El ARN total se aisló de células RAJI usando solución de aislamiento de ARN B RNAzol (Tel-Test, INC, Friendswood, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cuantificó por absorción ultravioleta a 260 nm (Bio-RAD smartspec™ 3000) . Dos microgramas de ARN total se cebaron al azar con kit de síntesis de ADNc de hebra única (GIBCO-BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de hebra única se amplificó usando Taq ADN polimerasa (QIAGEN, Valencia, CA) con cebadores de oligonucleótido (Operon, Huntsville, AL) como sigue: Cebador delantero: 5 ' -TCAGGAGTTTTGAGAGCAAAATG-3 ' (SEC ID NO. : 137) y Cebador inverso: 5 ' -AACAGAAGAAATCACTTAAGGAG-3 ' (SEC ID NO. : 138) . Las condiciones de RCP fueron como sigue: una desnaturación inicial a 94°C por 5 minutos, 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 45 segundos, 72°C por 1 minuto y un ciclo de extensión por 10 minutos a 72°C. Los productos de RCP fueron resueltos por electroforesis en gel de agarosa, aislados usando un kit de extracción en gel Qiaquick (QIAGEN, Valencia, CA) y ligados con ligasa T4 (New England Bíolabs, Beverly, MA) en vector de expresión TA eucariótico bidireccional pCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La cepa de Escherichia col i ToplOF, se usó para transformaciones. Los clones resistentes a ampicilina fueron propagados en bacterias y evaluados para determinar la presencia del inserto de lkb por digestión con EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) , Todos los productos de amplificación por PCR, fueron secuenciados para asegurar las secuencias de ADN correctas, usando métodos terminadores BigDye con Analizador Genético 3100 (PE Biosystems, Foster City, CA) .

Células y transfección Se hicieron crecer células HEK 293F y CHO Kl en medio DMEM/F12 (mezcla 50/50) , suplementado con FBS al 10%, 2 mM de L-Glutamina, 50 µm de BME, 100 unidades de Penicilina-g/ml, 100 unidades de MCG Estreptomicina/ml . Se transfectó el plásmido humano CD20/pCR3.1 en células HEK 293F y CHO Kl usando Reactivo LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. La transfección procedió por 48 horas, seguida por selección con 1 mg/ml de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por dos semanas. Los clones resistentes a G418 estables, se tiñeron con anticuerpo monoclonal CD20 anti-humano de ratón primario (BD) , seguido por IgG anti-ratón de cabra conjugado a PE (CalTag Laboratories, Burlingame, CA) y se analizó por FACS con FACS Vantage (BD, Frankiin Lakez, NJ) .

Inmunización CD20 expresada en líneas de células de cáncer humano células, células Daudi y CD20-CHO, fueron usadas como un antígeno. Anticuerpos monoclonales contra CD20 fueron desarrollados inmunizando secuencialmente ratones XenoMouse® (Cepas XenoMouse: XM3B3:IgGlK, XM3B3L3 : IgGlKL, XM3B3L:IgGlL, XM3C-1 : IgG4K, XM3C-IL-3 : IgG4KL, y XM3C-lL:IgG4L, Abgenix, Inc. Fremont, CA) . Los animales XenoMouse fueron inmunizados vía la ruta de la almohadilla adiposa para todas las inyecciones por medios convencionales. El volumen total de cada inyección fue de 50 µl por ratón, 25 µl por almohadilla adiposa.

EJEMPLO 2 RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS Ratones inmunizados seleccionados fueron sacrificados por dislocación cervical y nodos linfáticos de drenaje fueron colectados y combinados de cada grupo. Las células linfoides fueron disociadas triturándolas en DMEM para liberar las células de los tejidos, y las células fueron suspendidas en DMEM. Las células se contaron, y 0.9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos, se agregó a la pelotilla celular para resuspender las células suavemente pero completamente. Usando lOOul de perlillas magnéticas CD90+ por 100 millones de células, las células fueron etiquetadas incubando las células con las perlillas magnéticas a 4°C por 15 minutos. La suspensión de células magnéticamente etiquetadas que contiene hasta 108 células positivas (o hasta 2xl09 células totales), se cargó en una columna LS+ y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se colectó como la fracción CD90-negativa (la mayoría de estas células se espera sean células B) . Se realizó una fusión mezclando células B enriquecidas de las anteriores y células de mieloma no secretorio P3X63Ag8.653, se adquirieron de ATCC (cat. No. CRL 1580) (Kearney et al., J. Immunol . 123, 1979, 1548-1550) a una relación de 1:1. La mezcla de células fue suavemente formada en pelotillas por centrifugación a 800 x g. Después de la remoción completa del sobrenadante, las células fueron tratadas con 2-4 ml de solución Pronase (CalBiochem, cat# 53702; 0.5 mg/ml en PBS) por no más de 2 minutos. Después, se agregaron 3-5 ml de FBS para detener la actividad enzímática y la suspensión se ajustó a 40 ml de volumen total usando solución de fusión electro celular, ECFS (0.3 M Sucrose, Sigma, Cat# S7903, 0.1 mM de acetato de magnesio, Sigma, Cat# M2545, 0.1 mM de acetato de calcio, Sigma, Cat# C4705) . El sobrenadante se removió después de la centrifugación y las células se resuspendieron en 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió y las células nuevamente fueron resuspendidas en ECFS a una concentración de 2 x 106 células/ml.

Se realizó electro-fusión celular usando un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de la cámara de fusión usada fue de 2.0 ml, usando los siguientes ajustes de instrumento: Condición de alineamiento: voltaje: 50 V, tiempo: 50 segundos, rompimiento de membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 µsegundos; tiempo de mantenimiento de postfusión: 3 segundos. Después de ECF, las suspensiones celulares fueron cuidadosamente removidas de la cámara de fusión bajo condiciones estériles y transferidas en un tubo estéril que contiene el mismo volumen de medio de cultivo de hibridoma (DMEM (JRH Biosciences), 15% de FBS (Hyclone), suplementado con L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxoloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) y IL-6 (Boehringer Mannheim) . Las células fueron incubadas por 15-30 minutos a 37°C, y después centrifugadas a 400 x g (1000 rpm) por cinco minutos. Las células fueron suavemente resuspendidas en un volumen pequeño de medio de selección de hibridoma (Medio de Cultivo de Híbridoma, suplementado con 0.5 x HA (Sigma, cat. # A9666) ) , y el volumen se ajustó apropiadamente con más Medio de Selección de Hibridoma, basado en un plaqueado final de 5xl06 células B totales por placa de 96 cavidades y 200 µl por cavidad. Las células fueron mezcladas suavemente y pipeteadas en placas de 96 cavidades y dejadas crecer. Al día 7 ó 10, se removió la mitad del medio, y las células fueron re-alimentadas con Medio de Selección de Hibridoma.

EJEMPLO 3 SELECCIÓN DE ANTICUERPOS CANDIDATOS POR FMAT Y FACS Después de 14 días de cultivo, se seleccionaron los sobrenadantes de hibridoma por anticuerpos monoclonales específicos de CD20 por Tecnología de Ensayo Microvolumen Fluorométrico (FMAT), seleccionando contra células transfectantes CD20 humanas CHO recombinantes y seleccionando a revisión contra células CHO parenterales. Los sobrenadantes del cultivo a partir de las cavidades de crecimiento de células de hibridoma positivo, basadas en selección primaria, fueron removidas y las células de hibridoma positivas CD20, fueron suspendidas con medio de cultivo de hibridoma fresco y fueron transferidas a placas de 24 cavidades. Después de dos días en cultivo, estos sobrenadantes están listos para una selección de confirmación secundaria. En la selección de confirmación secundaria, los positivos en la primera selección fueron seleccionados por FACS con dos series o tres series de anticuerpos de detección usados separadamente: 1.25 ug/ml de GAH-Gamma Cy5 ( JIR#109-176-098 ) para detección de cadena ligera gamma humana; 1.25 ug/ml de GAH-Kappa PE (S.B. #2063-09) para detección de cadena ligera kappa humana y 1.25 ug/ml de GAH-lambda PE (S . B . #2073-09) para detección de cadena ligera lambda humana para confirmar que los anticuerpos anti-CD20, fueron completamente humanos. Se generaron 78 anticuerpos monoclonales específicos de CD20 lambda/kapa o IgG/IgG completamente humano.

TABLA 2 ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS DE CD20 COMPLETAMENTE HUMANOS EJEMPLO 4 ACTIVIDAD APOPTÓTICA Se implementaron dos procedimientos experimentales para seleccionar e identificar líneas de anticuerpo que exhiben actividad pro-apoptótica en la línea de células de linfoma humano Ramos. Más específicamente, la actividad apoptótica se evaluó usando el ensayo CellTiterGlo y por teñido de Yoduro de Propidio/Hoechst en conjunto con un microscopio fluorescente automatizado. En corto, para el ensayo CellTiterGlo (Promega, Madison, Wl), se obtuvieron células Ramos a partir del ATCC y se mantuvieron en medio RPMI suplementado con FBS al 10%, piruvato de sodio al 1%, y amortiguador HEPES al 1%. Las células se sembraron a una concentración de 100,000 células/ml (100 µl/cavidad) en placas de 96 cavidades. Las células se incubaron a 37°C y 5% de C02 por 72 horas. El ensayo se terminó 72 horas posteriores a la adición de los anticuerpos y se realizó por instrucciones proporcionadas en el kit. Las células se trataron con sobrenadante de hibridoma de anticuerpo a una concentración de ya sea 1 ó 10 µg/ml en la presencia o ausencia de anticuerpo de reticulación secundario. El isotipo (IgGl e IgG4), así como también anticuerpos Rituxan® (Rituximab --Genentech Inc.) y Bl (Beckeman Coulter, Mia í, FL) , se usaron como controles. (Nota: la diálisis se realizó en el anticuerpo Bl para remover la azida de sodio a partir de la solución de amortiguador base (0.10% de azida de sodio) . La determinación del porcentaje de supervivencia para las muestras de tratamiento se basa en normalizar las muestras de control (es decir, sin tratamiento), a 100% viables. Para el estudio de teñido de yoduro de propidio/Hoechst , las células se sembraron a una concentración de 100,000 células/ml (50ul/cavidad) , en una placa de 96 cavidades. Las células se incubaron a 37°C y a 5% de C02 por 48 horas. Las células se trataron con sobrenadante de hibridoma de anticuerpo (purificado sobre una columna de Sepharosa de Proteína A seguida por diálisis en PBS) en una titulación con concentraciones que varían desde 5000 ng/ml hasta 8 ng/ml. Todos los experimentos se corrieron por duplicado en la presencia (N=2) o ausencia (N=l) de anticuerpo de reticulación secundario. El isotipo (IgGl y controles de diluyentes) , así como también anticuerpos Rítuximab y Bl, fueron usados como controles. Después de 48 horas de incubación, las células se tiñeron con PI/Hoechst y se visualizaron usando un microscopio fluorescente automatizado. El porcentaje de apoptosis se determinó tomando una proporción del número de células positivas a Pl (apoptóticas) contra el número de células positivas a Hoechst (totales). Para el análisis de CellTiterGlo, las células fueron plaqueadas por duplicado y se determinó el error estándar de la media usando software Excel. Para el análisis de teñido Hoechst/Yoduro de propidio, los valores promedio fueron generados a partir de puntos duplicados. Estos promedios fueron usados para generar una curva de respuesta de dosis y estas curvas fueron comparadas con el isotipo y controles diluyentes para valorar la actividad apoptótica.

En resumen, este estudio interroga un total neto de 25 sobrenadantes de hibridoma. El análisis reveló que la mayoría de las líneas de hibridoma de anticuerpo anti-CD20, exhibe actividad apoptótica en los ensayos mencionados anteriormente. Se seleccionaron un total de 22 líneas para clonación .

TABLA 3 SUMARIO DE SOBRENADANTES DE LÍNEA DE HIBRIDOMA ANTI-CD20 EVALUADOS EN ENSAYOS DE APOPTOSIS La tabla lista las líneas negativas de cada ensayo. Las líneas indicadas en negritas, fueron consistentemente TABLA 4 SUMARIO DE SOBRENADANTES DE LÍNEA DE HIBRIDOMA ANTI-CD20 PROBADAS NEGATIVAS EN ENSAYOS DE APOPTOSIS Debe realizarse que los procesos descritos anteriormente, producen una mezcla oligoclonal en donde el número de linajes de hibridoma presentes encada muestra, varía de varios a muchos. Existe probablemente, un linaje de anticuerpo específico de CD20 por mezcla de hibridomas en cada cavidad. Adicionalmente, las células específicas del antígeno actual en la mezcla oligoclonal, pueden variar ampliamente en su productividad (la cantidad de anticuerpo que producen y secretan) . Una señal fuerte en un ensayo puede ser el resultado de una alta concentración de anticuerpo, un anticuerpo con una alta afinidad para el objetivo, o una combinación de estos factores. De este modo, mientras resultados cuantitativos son presentados a partir de estos ensayos, estos resultados son interpretados en una forma "positiva" contra "negativa", observando en los varios puntos de datos obtenidos y comparándolos con los controles. La clonación se inició en todas las líneas recuperadas a partir de las fusiones 1 y 2 (en donde el anticuerpo fue IgGl). Las líneas de las fusiones 3 y 4 también fueron clonadas con la excepción de las líneas 3.6, 4.1 y 4.7.

EJEMPLO 5 ENSAYO DE APOPTOSIS: ENSAYO DE VIABILIDAD EN CELLTITERGLO SIN RETICULADOR Para determinar la cantidad de ATP presente en la célula, la cual se correlaciona con el número de células viables presentes, se realizaron ensayos CellTiterGlo. Brevemente, las células de linfoma (Ramos), se plaquearon en una placa de fondo plano de 96 cavidades Costar (Catálogo #3603) a 10,000 células por cavidad en un volumen de 50 µl . Los anticuerpos primarios se agregaron como 25 µl/cavidad en medio de cultivo de tejido y se dejaron incubar con células por 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, el reactivo CellTiterGlo (Promega Catálogo #G7571) , se agregó a las células y se dejó incubar por 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las placas fueron leídas por instrucciones de protocolo. Los resultados se muestran en las Figuras 1 (placa 1 de 2 a 72 horas) y 2 (placa 2 de 2 a 72 horas) , y se resume en las Tablas 5 y 6 abajo. Los valores remarcados indican valores EC50 que fueron superiores al control de Ritixumab.

EJEMPLO 6 ENSAYO DE APOPTOSIS: ENSAYO DE VIABILIDAD ALAMAR AZUL SIN RETICULADOR Para medir la apoptosis en células Ramos, se realizaron ensayos de viabilidad de Alamar Azul (Biosource Camarillo, CA) . El alamar azul es un indicador de reducción que cambia de color en respuesta a la actividad metabólica.

El ambiente interno de las células proliferantes es más reducido que aquel de las células no proliferantes; el Alamar Azul es reducido en células proliferantes y es acompañado por un cambio medible en color. En corto, las células Ramos fueron plaqueadas en placas de fondo plano de 96 cavidades (cat. No. 3603) a 10,000 células/50 µl . Las muestras de anticuerpo primario se agregaron a 50 µl/cavidad en medio de cultivo de tejidos y se dejaron incubar a 37°C por 48 horas. 10 µl por cavidad de tinte Alamar Azul, se agregaron y dejaron incubar durante la noche a 37°C. Después de la incubación, la fluorescencia se midió usando Víctor (Perkin Ele er, Wellesley, MA) . Los resultados son mostrados en las Figuras 3A hasta 3D (a 72 horas), y se resumen en las Tablas 5 y 6 abajo. Los valores remarcados indican valores EC50 que fueron superiores al control de Ritixumab.

EJEMPLO 7 ENSAYO DE APOPTOSIS: ENSAYO DE VIABILIDAD WST-1 SIN RETICULADOR Para medir la apoptosis en células Ramos, se realizaron ensayos de viabilidad ST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN) . El ensayo de reducción ST-1 es un ensayo colorimétrico para cuantificación de citotoxicidad, basado en el desdoblamiento de la sal de tetrazolio WST-1, por deshidrogenasas mitocondriales en células viables. En corto, las células Ramos fueron colectadas, contadas y resuspendidas en medio de crecimiento RPMI completo a una concentración de 66,667 células/ml. Las células fueron plaqueadas en 50 µl (10,000 células/cavidad) en placas de fondo plano (Costar, cat. No. 3595) . El anticuerpo se agregó a las células objetivo a concentración apropiada como 50 µl/cavidad y se dejaron incubar por 68 horas a 37°C. Se agregaron 10 µl de WST-1 (Roche 1 644 807) y se incubaron por 4 horas a 37°C. Las placas se colocaron en un sacudidor por 1 minuto y se leyeron a 450 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 4A hasta 4D, y se resumen en las Tablas 5 y 6 abajo. Los valores remarcados indican valores EC50 que fueron superiores al control de Rituximab.

EJEMPLO 8 ENSAYO DE APOPTOSIS: ENSAYO DE ANEXINA V/APOPTOSIS Pl SIN ENLAZADOR Las células de linfoma se plaquearon en placas de fondo plano de 96 cavidades Costar (Catálogo #3603) a 200,000 células por cavidad, en un volumen de 50 µl . Los anticuerpos primarios fueron agregados como 25 µl/cavidad en medio de cultivo de tejido y se dejaron incubar con células por 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas fueron centrifugadas por 5 minutos a 1,200 rpm y el sobrenadante se aspiró. Las placas fueron resuspendidas en 100 µl de amortiguador FACS (2% de FBS en PBS lx) y las placas fueron centrifugadas por 5 minutos a 1,200 rpm. Las pelotillas fueron resuspendidas en 100 µl de amortiguador de incubación (95% de amortiguador de enlace Ix, 2.5% de Anexina V, Pl al 2.5%), e incubadas por 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, el volumen en los tubos tituladores se elevó a 300 µl agregando 200 µl de amortiguador lx (p/o Anexina V y Pl) . El análisis se realizó usando canales FL-1 (Anexina V) y FL-3 (Pl) con FACS Calibur. Los resultados se muestran en las Figuras 5 (placa 1 de 2 a 24 horas) y 6 (placa 2 de 2 a 24 horas) y se resumen en las Tablas 5 y 6 abajo. Los valores remarcados indican valores EC5o que fueron superiores al control de Rituximab.

EJEMPLO 9 ENSAYO CDC Las células de linfoma (Ramos, Raji o Daudi), fueron plaqueadas en placas de fondo plano de 96 cavidades Costar (Catálogo #3603) a 100,000 células por cavidad, en un volumen de 25 µl . Las muestras de anticuerpo primario fueron agregadas como 25 µl/cavidad en medio de cultivo de tejidos y se dejaron incubar a temperatura ambiente por 10 minutos . Se agregó suero humano normal a una concentración de entre 10a 50% y se diluyó con medio de crecimiento (la concentración de suero fue titulada) (suero obtenido de Advanced Research Technologies, San Diego, CA) , y se dejaron incubar a 37°C por 1 hora. Se agregó reactivo CellTiterGlo (Promego Catálogo #G7571) a las células y se dejó incubar por 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las placas fueron leídas por instrucciones de protocolo . Los resultados se muestran en las Figuras 7A-7D (línea de células Ramos a 1 hora), 8A-8D (línea de células Raji a 1 hora) y 9A-9D (línea de células Daudi a 1 hora) .

Para todos los ensayos n=2, excepto Rituximab e IgGl n=3.

Los valores EC50 promedio, se muestran en las Tablas 5 y 6 a bajo. Los valores marcados, indican valores EC50 que fueron superiores al control de Rituximab.

EJEMPLO 10 ADCC DE ANTICUERPOS ANTI-CD20 HUMANOS Aislamiento de PBMC a partir de Sangre Completa (35-45-ml) Se realizó enriquecimiento NK a partir de PMBC usando protocolo y cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep® (Cat. No. 15065) . Los cócteles de anticuerpo RosetteSep®, reticulan células indeseadas en sangre completa humana a múltiple (RBCs) , formando Inmunorosetas . Esto incrementa la densidad de células indeseadas (roseteadas) , tal como forman pelotillas junto con las RBC libres cuando se centrifugan sobre una densidad media flotante, tal como Ficol-Plaque®. Las células deseadas no están nunca entre el plasma y la densidad media flotante . En corto, la sangre completa de donadores, se colectó en tubos revestidos de EDTA o heparinizados y se incubó con 2.25 ml de cóctel de enriquecimiento de células NK humanas RosetteSep® (Cat. No. 15065) por 20 minutos a temperatura ambiente por protocolo RosetteSep®. Las muestras fueron entonces diluidas con volumen igual de PBS + 2% de FBS y se estratificaron 30 ml de mezcla de sangre sobre 15 ml de Ficoll (Amersham 17-1440-02) en 50 ml de tubos cónicos. Los tubos fueron centrifugados a 2150 RPM (centrífuga de mesa superior) , con FRENO por 30 minutos a temperatura ambiente. La capa de interfaz se transfirió a 2 tubos cónicos limpios de 50 ml . Se agregó PBS + 2% de FBS a 50 ml y se centrifugó por 10 minutos a 1200 RPM en una centrífuga de mesa superior (Beckman Allegra 6) con freno apagado por 30 minutos a temperatura ambiente. La capa de interfaz fue transferida a 2 tubos cónicos limpios de 50 ml . Se agregó PBS + FBS al 2% a 50 ml y se centrifugó por 10 minutos a 1200 RPM en una centrífuga de mesa superior (Beckman Allegra 6) con freno encendido. Los sobrenadantes se descargaron y las pelotillas fueron resuspendidas en 1 ml de PBS y se almacenaron en hielo. Las células fueron contadas usando un hematocitómetro y se determinó las células NK/ml en solución [(células totales/# de cuadrantes)* 10e4* factor de dilución] .

Etiquetado de Células Objetivo Tumorales con Calceína-AM La calceína-AM es la versión permeable a la célula de calceína. Fácilmente pasa a través de la membrana celular de células viables debido a la hidrofobicidad mejorada comparada con la calceína. Cuando la Caclceína-AM permea en el citoplasma, es hidrolizada por esterasas en las células a calceína, que es también retenida dentro de la célula. De este modo, la Calceína-AM es una sonda adecuada para teñido de células viables. Los ensayos de viabilidad usando calceína son confiables y se correlacionan también con el ensayo de liberación de 51-Cr estándar . En corto, las células objetivo tumorales (Ramos, Raji y Daudi), fueron colectadas y resuspendidas en medio a 1 x 106células/ml. Se agregó Calceína-AM (Sigma C1359) a una concentración final de 10 µM (5 µl en 2 ml de células) . Las células fueron incubadas por 45 minutos a 37°C. Las células entonces se centrifugaron a 1200 RPM por 10 minutos, los sobrenadantes se descargaron, y las pelotillas se resuspendieron en medio de crecimiento fresco (2x) . Las pelotillas fueron resuspendidas a 10,000 células/75 µl . Las células objetivo fueron plaqueadas en 75 µl (10,000 células/cavidad) en placas de fondo redondo (Costar, cat. No. 3799). Los anticuerpos fueron entonces agregados a las células objetivo a concentraciones apropiadas como 50 µl/cavidad, diluidas en medio y dejadas incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, 75 µl de células efectoras fueron agregadas a 100,000 células/cavidad y dejadas incubar por 4 horas a 37°C. Después de la incubación, las placas fueron centrifugadas a 1200 RPM por 5 minutos. Se transfirieron 100 µl de sobrenadantes a las placas de fondo transparente, oscuras, planas (Costar, cat. No. 3603) y se midió la fluorescencia. Los resultados se muestran en las Figuras 10-12, y se resumen en las Tablas 5 y 6 siguientes. Los valores marcados indican valores EC5o que fueron superiores al control de Rituximab. Se seleccionaron candidatos de plata en el número de casos en donde el anticuerpo de prueba exhibe potencia superior, comparada con los controles en apoptosis, CDC, y ADCC. mAbs anti-CD20 2.1.2, 1.1.2, y 1.5.3 (nota: mAbs 1.5.3 y 1.3.3, se encontraron por tener secuencias de aminoácido idénticas), fueron identificados como los tres candidatos superiores.

TABLA 5 SUMARIO DE ENSAYO 10 15 EJEMPLO 11 ENSAYO DE SANGRE COMPLETA Etiquetado de células objetivo con calceína-AM Se colectaron células objetivo tumorales (Ramos, Raji, Daudi), y se resuspendieron en medio a 1 x 106células/ml . Se agregó calceína-AM (Sigma, cat. No. C1359) a una concentración final de 10 µM (5 µl en 2 ml de células) y se dejó incubar por 45 minutos a 37°C. Después de la incubación, las células se centrifugaron a 1200 RPM por 10 minutos, los sobrenadantes se descargaron y las pelotillas se resuspendieron en medio de crecimiento fresco (2x) . Las pelotillas fueron resuspendidas a 10,000 células/75 µl . Las células objetivo fueron entonces plaqueadas en 75 µl (10,000 células/cavidad), en placas de fondo redondo (Costar, cat. No. 3799). Se agregaron anticuerpos a las células objetivo a concentración apropiada como 50 µl/cavidad diluido en medio y se dejó incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se agregó 50 µl de sangre completa por cavidad y se dejó incubar por 4 horas a 37°C. (Nota: la sangre completa se colectó en tubos que contienen heparina) . Después de la incubación, las placas fueron centrifugadas a 1200 RPM por 5 minutos. Se transfirieron 100 µl de sobrenadantes a las placas de fondo transparente, oscuras, planas (Costar, cat. No. 3603) y se midió la fluorescencia . Los resultados de citotoxicidad en ensayo de sangre completa al inicio de la concentración de anticuerpo de 10 µg/ml, mostrados en la Figura 13, demuestran que los anticuerpos 1.1.2 y 2.1.2 median la lisis celular mayor, comparada con el anticuerpo de control de Rituximab, especialmente como se demuestra en la línea de células Raj i . La actividad citotóxica de un panel de mAbs anti-CD20, se valoró contra las líneas de células EHEB y Karpas-422, usando sangre no fraccionada como una fuente de efectores naturales. EHEB es una línea de leucemia de células B crónicas humanas (CLL) , mientras Karpas-422 es una línea de células de linfoma no Hodgkin. La línea Karpas-422 ha sido previamente reportada por ser resistente a Rituximab y complemento (Br J Haematol. 2001:114:800-9). Estas líneas de células fueron evaluadas en el ensayo de sangre completa para comparar su sensibilidad relativa con los anticuerpos anteriores y Rituximab. Los datos mostrados en la Figura 14, indican que tanto las líneas de células EHEB como Karpas-422, son resistentes al tratamiento de Rituximab; sin embargo, anticuerpos anti-CD20 2.1.2, 1.1.2, y 1.5.3, median significantemente, niveles superiores de lisis celular en líneas de células Karpas-422 y anticuerpos anti-CD20 1.1.2, 1.5.3, 1.10.3.1 y 1.11.3.1, niveles significantemente superiores mediados de lisis celular en líneas de células EHEB.

Comparación de Actividad Lítica Estos hallazgos fueron además, extendidos a un número de linfomas no Hodgkins (Daudi, Ramos, ARH-77, Namalwa, Raji, SCI, WSU-NHL, SU-DHL-4 y Karpas 422) y líneas de células derivadas de leucemia linfocítica crónica (EHEB, JMV-2 y JMV-3) . La actividad citolítica de un panel de anticuerpos anti-CD20, fue valorada usando sangre no fraccionada de diferentes donadores humanos como variación en la actividad de varios anticuerpos anti-CD20, como una función de un polimorfismo en el receptor FcgRIIIa (Blood 2002; 99:754-758). Los datos mostrados en las Figuras 15 y 16, indican que a través de las líneas celulares y donadores, los anticuerpos anti-CD20 1.1.2 y 1.5.3, median un nivel superior de lisis celular a una concentración de anticuerpo de 10 µg/ml. Para valorar además la actividad citotóxica de anticuerpos anti-CD20, se generaron líneas de células resistentes a Rituximab mediada por la citotoxicidad mediada por el complemento, y se probó la actividad de anticuerpos monoclonales 1.5.3 y 1.1.2 en ensayo de sangre completa. Se generaron líneas de células Raji y Ramos resistentes a Rituximab, por 3 rondas de exposición repetitiva a Rituximab en la presencia de concentración incrementada de suero humano (Research Blood Components, LLC). Se obtuvieron células Raji y Ramos (linfoma Burkitt) a partir del ATCC y fueron mantenidas en medio RPMI suplementado con FBS al 10%, piruvato de sodio al 1% y amortiguador HEPES al 1%. Para la primera ronda de selección, las células fueron expuestas a 1 µg/ml de Rituximab en presencia de 20% de suero humano por 16 horas a 37°C en C02 al 5%. Para la segunda y tercera rondas, la concentración de Rituximab se incrementó a 10 y 100 µg/ml, respectivamente, en la presencia de hasta 50% de suero humano. Después de cada ronda, se valoró la viabilidad celular con el kit ViaCount Guava (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA, USA). Se clonaron células resistentes a rituximab (RR-Raji o RR-Ramos), por dilución limitada y se expandieron los clones. La resistencia a la actividad mediada por CDC por Rituximab, se confirmó por cada clon. En los 3 clones generados para las líneas de células Raji y para la Ramos, la expresión de CD20 se preservó y mostró ser equivalente a las líneas de células parenterales por análisis FACS. La Figura 17 ilustra que las células RRl-Raji no fueron eliminadas en la presencia de 1 ó 10 µg/ml de Rituximab, mientras la línea de células Raji parenteral permaneció sensible. Contrario a 10 µg/ml de 1.5.3 ó 1.1.2 fue capaz de lisar aproximadamente 50% de las células RRl-Raji en este ensayo de 4 horas. La actividad lítica incrementada fue también observada en las líneas de células RRl-Ramos, RR6-Ramos y RR8-Ramos con anticuerpos monoclonales 1.5.3 y 1.1.2 comparadas con Rituximab como se ilustra en la Figura 18.

EJEMPLO 12 DETERMINACIÓN DE Kd POR FACS POR SIETE ANTICUERPOS MONOCLONALES PURIFICADOS ENLAZADOS A CÉLULAS SB QUE EXPRESAN CD20 La afinidad de anticuerpos purificados contra CD20 (mAbs 1.1.2, 1.2.1, 2.1.2, 1.3.3, 1.5.3, 1.10.3.1, 1.13.2), Rituximab (control positivo), y Bl, se determinó por FACS, En corto, las células SB que expresan CD20, fueron resuspendidas en amortiguador FACS (2% de FBS, 0.05% de NaN3) , a una concentración de aproximadamente 5 millones de células/ml. Las células HSB fueron también resuspendidas en amortiguador FACS a una concentración de aproximadamente 9 millones de células/ml. Las células se mantuvieron en hielo. Los anticuerpos purificados fueron serialmente diluidos en lxPBS filtrado (2x) a través de 11 cavidades en placas de 96 cavidades. La doceava cavidad en cada fila, contiene amortiguador solamente. Se agregaron Ix PBS y células a cada cavidad de mAb, de manera tal que el volumen final fue de 30 µl/cavidad y cada cavidad contiene aproximadamente 375,000 células. Los intervalos de concentración molecular final para los mAbs fueron como sigue : mAb Concentración 1.1.2 = 156 - 0.304 nM 1.2.1 = 202 - 0.098 nM 2.1.2 = 396 - 0.387 nM 1.3.3 = 289 - 0.283 nM 1.5.3 = 107 - 0.104 nM 1.10.3.1 = 265 - 0.258 nM 1.13.2 = 367 - 0.358 nM Rituximab = 365 - 0.356 nM Bl = 351 - 0.343 nM Las placas fueron colocadas en un sacudidor de placa por 3 horas a 4°C, después centrifugadas y lavadas 3x con PBS. Se agregaron 200 µl de 145 nM de anticuerpo policlonal -humano de cabra Cy5 a cada cavidad, y se agregaron 200 µl de 192 nM de anticuerpo policlonal a-ratón de cabra Cy5 a las células que forman complejos con el anticuerpo Bl . Las placas fueron entonces incubadas por 40 minutos a 4°C, después, centrifugadas y lavadas 3x con PBS. La Fluorescencia Media Geométrica (GMF) de 10,000 células por cada concentración de mAb, fue determinada usando un instrumento FACSCalibur. No fue aparente el enlace no específico significante (señal no significante) a partir de las células HSB. En cada fila que contiene las células SB, la señal de la cavidad doceava (que contiene amortiguador solamente), fue sustraía de la señal a partir de las primeras 11 cavidades. Un trazo no lineal de GMF como una función de la concentración mAb molecular, se ajustó usando software científico usando la ecuación: F En la ecuación anterior, F = fluorescencia media geométrica, Lt = concentración mAb molecular total, P' = constante de proporcionalidad que se refiere a las unidades de fluorescencia arbitraria para unir mAb, y KD = constante de disociación de equilibrio. Para cada mAb, un estimado de KD se obtuvo como P' y KD fue dejado flotar libremente en el análisis no lineal. La tabla siguiente, lista los resultados de KD para cada mAb, junto con el intervalo de confianza del 95% del ajuste. Los MAb son listados para reducir la afinidad. Basados en varias mediciones independientes previas de Rituximab usando este método de análisis KD por FACS, la precisión esperada es 12%, basada en la desviación estándar (coefíciente de variación) y 30% de precisión, basada en el intervalo de confianza del 95". Sin embargo, la precisión puede variar con cada mAb.

TABLA 7 EJEMPLO 13 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS ANTI-CD20 Las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables de los anticuerpos, fueron secuenciadas para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para los anticuerpos anti-CD20, se proporciona en el listado de secuencia con secuencias de nucleótido y aminoácido para cada combinación de cadena gama y kappa. Las secuencias pesadas variables fueron analizadas para determinar la familia VH, la secuencia de región D y la secuencia de región J. Las secuencias fueron entonces traducidas para determinar la secuencia primaria de aminoácido y comparada a la línea germinal VH, D y secuencias de región J, para valorar las hipermutaciones somáticas. "-" indica identidad con la secuencia de línea germinal. "#" indica un aminoácido adicional en las secuencias de anticuerpo que no se encuentra en la línea germinal . La Tabla 8 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de anticuerpo a su región de cadena pesada de línea germinal cognada. La Tabla 9 es una tabla que compara las regiones de cadena ligera kappa de anticuerpo a su región de cadena ligera de línea germinal cognada. Las regiones variables (V) de las cadenas de inmunoglobulina, son codificadas por segmentos de ADN de línea germinal múltiple, los cuales son unidos en regiones variables funcionales (VHDJH o V?J?) durante la ontogenia de células B. La diversidad molecular y genética de la respuesta de anticuerpo a CD20 se estudió en detalle. Estos ensayos revelan varios puntos específicos a anticuerpos anti-CD20. Los análisis de 36 anticuerpos individuales específicos a CD20, los cuales fueron aislados de 8 fusiones de hibridomas, resultaron en la determinación de que la mayoría de hibridoma usa los mismos pares de cadena ligera y pesada para formar un paratope específico de CD20. El paratope seleccionado consiste de la cadena ligera V? A23 apareada con las cadenas pesadas VH5-51. Solamente dos mAbs se aislaron, en los cuales, la cadena ligera V? A23 se apareó con una cadena pesada VH1-18. Una mAb única usó la cadena ligera V? V4-3 apareada con una cadena pesada VH6-1 y un mAb único utilizó V? V2-13 apareada con VH1-18. La predominancia de VH5 se confirmó con 31 de 36 mAbs derivados de hibridomas únicos. Las cadenas pesadas derivadas de VH5-51, fueron extensivamente mutadas a través de CDRl y FR3. Las secuencias de mAb de VH5-51, representan eventos de reacomodos múltiples, como se indica por patrones diferentes de sustitutos y variaciones en el empleo de CDR3 y JH . Las sustituciones idénticas fueron vistas en cadenas pesadas VH-51 a partir de diferentes reacomodos (Ser31 a Asn31 en CDRl, y Met93 a lie93 en FR3, por ejemplo), implicando selección accionada por antígeno. 28 mAbs se analizaron utilizando cadenas ligeras derivadas de V? A23 en la formación de dominios de enlace específicos de CD20. Todas las cadenas V? A23 fueron reacomodadas con un CDR3 de 9 aminoácidos y fueron mutadas comparadas con la linea germinal en las CDR. En 21 mAbs, las cadenas kappa A23 aisladas se aparearon para derivarse de un evento de reacomodo único, como se indica por el patrón de mutación y que portan el empleo del segmento JK4. Se encontraron sustituciones idénticas en diferentes mAbs (Ser32 a Arg32 en CDRl, He56 a Val56 en CDR2, y Met89 a Val89 en CDR3), sugiriendo selección accionada por antígeno para estos residuos particulares en estas ubicaciones durante la maduración de afinidad.

Tres mAbs líderes como se determina por la actividad pro-apoptótica, así como también la capacidad para estimular a CDC y ADCC (descrito anteriormente) , mAbs 1.1.2, 1.5.3 y 2.1.2, utilizan la cadena ligera Vkappa A23 apareada con la cadena pesada VH5-51. Las cadenas tanto ligera como pesada, fueron mutadas, principalmente en las CDR. Los anticuerpos líderes representan una familia de paratope única recurrente en el hibridoma .

TABLA 8 SECUENCIAS DE CADENA PESADA DE ANTICUERPO ANT1-CD20 10 15 D 10 15 10 15 TABLA 9 SECUENCUS DE CADENA LIGERA DE ANTICUERPO ANTI-CD2 10 15 LO O LO 10 15 10 15 EJEMPLO 14 DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS DE CLASE CANÓNICA Chothia, et al . , ha descrito la estructura de anticuerpo en términos de "clases canónicas" para las regiones hipervariables de cada cadena de inmunoglobulina (J Mol Biol . 1987 Agosto 20; 196 (4) ; 901-17) . Las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas, fueron analizadas para determinar la relación entre sus secuencias de aminoácido y las estructuras tri-dimensionales de sus sitios de enlace al antigeno. Chothia et al . , encontró que existen relativamente pocos residuos que, a través de su empaquetado, enlace a hidrógeno o la capacidad para asumir conformaciones inusuales phi, psi u omega, fueron principalmente responsables de las conformaciones de cadena principal de las regiones hipervariables. Estos residuos se encontraron por ocurrir en sitios dentro de las regiones hipervariables y en la estructura de lámina ß-conservada . Examinando secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructura desconocida, Chothia et al . , muestra que muchas inmunoglobulinas tienen regiones hipervariables que son similares en tamaño a una de las estructuras conocidas y adicionalmente contienen residuos idénticos en los sitios responsables para la conformación observada. Este descubrimiento implica que estas regiones hipervariables tienen conformaciones cercanas a aquellas en las estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el reportorio de conformaciones parece ser limitada a un número relativamente pequeña de clases estructurales discretas. Estas conformaciones de cadena principal que se originan comúnmente de las regiones hipervariables, fueron llamadas "estructuras canónicas". Trabajo adicional por Chothia, et al . , ( Na ture 1989 Dic. 21-28; 342(6252); 877-83) y otros (Martin, et al . , J Mol Biol . 1996 Nov. 15; 263 (5) : 800-15) , confirma que existe un repertorio menor de conformaciones de cadena principal por al menos, cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos . Las CDR de cada anticuerpo, descritos anteriormente, fueron analizadas para determinar sus clases canónicas. Como se sabe, las clases canónicas han sido solamente asignadas para CDRl y CDR2 de la cadena pesada de anticuerpo, junto con CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de anticuerpo. Las tablas resumen los resultados del análisis. Los datos de clases canónicas están en la forma de HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR2 (H1-H2-L1-L2-L3 ) , en donde "HCDR" se refiere a CDR de cadena pesada y "LCDR" se refiere a CDR de cadena ligera. De este modo, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene una HCDRl que cae en la clase canónica 1, una HCDR2 que cae en la clase canónica 3, una LCDRl que cae en la clase canónica 2, una LCDR2 que cae en la clase canónica 1, y una LCDR3 que cae en la clase canónica 5. Se hicieron asignaciones a una clase canónica particular en donde la secuencia de anticuerpo se iguala con los aminoácidos claves definidos para cada clase canónica. Los aminoácidos definidos para cada anticuerpo se encontraron, por ejemplo, en los artículos por Chothia, et al . , referido anteriormente. La Tabla 10 y Tabla 11, reportan los datos de clases canónicas para cada uno de los anticuerpos CD20. En donde no existe apareamiento de la clase canónica con la misma longitud de CDR, la asignación de clase canónica se marca con una letra s y un número, tal como "sl8", significando que la CDR es de tamaño 18. En donde la estructura de la CDR se predice por ser similar a una clase canónica definida, pero con una probable desviación, la asignación de clase canónica se marca con una "?", en donde no hay datos de secuencia disponibles para una de las cadenas ligera o pesada, la clase canónica se marca con "Z".

TABLA 10 TABLA 11 Anticuerpo H1-H2-L1-L2-L3 (clasificado) lon2it??lH3 La Tabla 12 es un análisis del número de anticuerpos por clase. El número de anticuerpos que tiene la clase canónica particular designado en las columnas izquierda, se muestra en la columna derecha. Un mAb que carece de un dato de secuencia de cadena y de este modo tiene "Z" en la asignación canónica, no está incluido en este conteo. La estructura mayor comúnmente vista fue 1-1-4-1-1, con 25 de 34 mAb que tienen tanto secuencias de cadena pesada como ligera de esta combinación.

TABLA 12 NUMERO DE ANTICUERPOS CD20 EN CADA COMBINACIÓN DE CLASE CANÓNICA EJEMPLO 15 CARACTERIZACIÓN DE EPÍTOPE : SÍNTESIS DE PUNTO DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS Determinación de interacción de péptido-anticuerpo de baja afinidad Se preparó una exploración del péptido traslapante que recorre el dominio extracelular de 43 aminoácidos de la secuencia CD20 humana por sintesis de PUNTO automatizada. Se sintetizó una serie de 33 péptidos 12-mer como puntos en láminas de membrana de polipropileno. El arreglo peptidico recorrió resl42-185 residuos de aminoácido de la secuencia CD20. Cada péptido consecutivo se ajustó por un residuo a partir del péptido previo, produciendo una biblioteca traslapante, anidada, de oligopéptidos arreglados como se muestra en la Tabla 13.

TABLA 13 Brevemente, las exploraciones peptidicas que contienen péptidos derivados de CD20 12-mer, fueron probadas con anticuerpos monoclonales. El patrón del anticuerpo unido al péptido a péptidos derivados de CD20, fue inmovilizado por transferencia electroquímica del anticuerpo-péptido.

EJEMPLO 17 MAPEO DE EPÍTOPE USANDO MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO Estudios de mapeo de epitope usando un procedimiento de mutagénesis, han indicado que alanina en la posición 170 y prolina en la posición 172, están involucrados en el reconocimiento de CD20 humano por anticuerpos anti-CD20 conocidos. El enlace de anticuerpos conocidos Bl, 2H7, 1F5 y Rituximab, se abrogó por mutación de estos residuos a Serina. El enlace de mAbs 2F2 a CD20 humano, es insensible a las mutaciones AxP, y representa un epitope CD20 que involucra N162 y N166. El epitope de mAbs 1.1.2 y 1.5.3, se mapeó a los residuos 171-179 (NPSEKNSPS (SEC ID NO. 196)). La especificidad de estos mAbs a la secuencia humana, es a través de prolina 172. Alanina 170 no es requerida para el enlace como se muestra en la Tabla 16 abajo.

TABLA 16 ESPECIFICIDAD FINA DE MABS CD20 * Requerimiento mínimo para enalce. Pohak & Deans (2002). Blood 99 3256-62 Anticuerpos monoclonales anti-CD20 derivados de Xenouse® como se describe en este documento, tienen traslapantes pero diferentes epitopes de todos los anticuerpos CD20 conocidos, complejos sobre membranas PVDF. La electrotransferencia se llevó a cabo en una manera fraccionada en tres membranas PVDF separadas (antecedente alto a bajo) . Los anticuerpos monoclonales fueron detectados con anticuerpo IgG anti-humano de cabra etiquetado con peroxidasa y quimioluminiscencia. Se identificó una región de enlace única en las tres membranas. El enlace de mAbs 1.1.2 y 1.5.3, fue detectado en los péptidos 27-30. El péptido que representa el epitope común, fue determinado por ser: NPSEKNSPS (SEC ID NO. 196) . Este péptido corresponde a los residuos 171-179 del dominio extracelular CD20.

El mapeo del epitope para el anticuerpo 2.1.2, fue determinado por citometria de flujo usando células CHO que expresan constructos CD20 con mutaciones dirigidas al sitio en el dominio extracelular. Se generaron cuatro lineas mutantes CHO. Se identificó una región de enlace única para los tres mAbs.

EJEMPLO 16 ALINEAMIENTO DE SECUENCIA DE REGIÓN EXTRACELULAR CD20 Reportes publicados indican que anticuerpos dirigidos contra epitopes extracelulares en el CD20 humano, no se enlazan a células B de ratón. Los dominios extracelulares de CD30 humano y de ratón, difieren en 16 de aproximadamente 43 aminoácidos. Ocho diferencias no conservativas están localizadas dentro de un estiramiento de 10 aminoácidos (ESLNFIRAHT (SEC ID NO. 197)) como se indica en el alineamiento siguiente.

TABLA 15 ALINEAMIENTO DE REGIÓN EXTRACELULAR CD20 DE RATÓN Y HUMANA Estas diferencias en la secuencia de aminoácido del dominio extracelular CD20 murino, fueron usadas como una base para conducir el estudio de mapeo de epitope anterior. Se diseñó una estrategia de mutación en la cual, los residuos extracelulares en la secuencia CD20 humana que difiere de aquellos en el ratón, fueron reemplazados con aquellos de las posiciones equivalentes en la secuencia murina .

EJEMPLO 18 Usos de Anticuerpos Anti-CD20 para el Tratamiento de Enfermedades que Involucran Expresión de CD20 Se evaluaron candidatos de anticuerpo anti-CD20 lider, en un modelo de parálisis de extremidad posterior i.v. Ramos. Cragg MS, Glennie, MJ (2004) Blood 103:2738-43. Más específicamente, ratones CB17 SCID, fueron inyectados con células de linfoma Ramos humano 1 x 106 via la vena de la cola y se evaluó por el comienzo de parálisis de extremidad trasera y supervivencia. Grupos de animales fueron tratados con tres anticuerpos anti-CD20 candidatos líderes; un grupo tratado con Rituximab se estableció como un control de punto de referencia. De este modo, seis grupos de siete ratones cada uno, fueron tratados i.p. (inyección intraperitoneal) con una dosis única de 0.05 mg/kg de anticuerpo quince dias posteriores a la inoculación de células tumorales. Los siete grupos fueron como sigue: control de PBS (vehiculo), anticuerpo de control de isotipo IgGl, Rituximab, y los anticuerpos anti-CD20, 2.1.2, 1.3.3, y 1.1.2. Se monitorearon puntos finales de supervivencia total y mediana. Nota: la secuencia de mAb 1.3.3 anti-CD20, se encontró por ser idéntica aquella de mAb 1.5.3. Por razones de disponibilidad, se usó mAb 1.3.3 como un sustituto para mAb 1.5.3. Los resultados del estudio anterior, se muestran en la Figura 19 y demuestran que los tres anticuerpos candidatos líderes demuestran actividad potente anti-linfoma cuando se administran como una monoterapia de dosis única. Sin embargo, este estudio revela que la supervivencia total de grupos tratados con los anticuerpos 1.5.3 y 2.1.2, fue significantemente mejorada comparada con el control Rituximab. Análisis estadísticos que comparan el anticuerpo 1.5.3 a Rituximab, proporcionan un valor p de 0.022; los análisis que comparan el 2.1.2 con Rituximab, proporcionan un valor p de 0.023. Por lo tanto, estos hallazgos demuestran un mejoramiento estadísticamente significante en la supervivencia total en ratones tratados con los anticuerpos anti-CD20 1.5.3 y 2.1.2.

EJEMPLO 19 INMUNOTERAPIA USANDO ANTICUERPOS HUMANOS CONTRA CD20 EN MODELOS DE TUMOR SUBCUTÁNEO Eficacia de modelo subcutáneo Daudi Se evaluó la inmunoterapia con mAb 1.5.3 y Rituximab en ratones CB17 SCID con células tumorales Daudi (ATCC) . Brevemente, los ratones CB17 SCID, se obtuvieron a partir de Charles River laboratories, Wilmington, MA, USA y se mantuvieron bajo condiciones libres de patógeno. 107 Células Daudi fueron inyectadas subcutáneamente y se dejaron formar tumores. Los tratamientos fueron iniciados cuando el tamaño de tumor promedio alcanzó 200 mm3. Cada anticuerpo, 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3 y Rituximab, fueron probados a 2 niveles de dosis, 1 mg/kg y 5 mg/kg, y comparados con el control de vehiculo y un control de isotipo IgGl. La dosificación de anticuerpos anti-CD20, control de isotipo y control de vehiculo PBS, se hizo por inyección intraperitoneal dos veces por semana por 3 semanas, y se inició al dia 18 después de la inoculación del tumor. Los resultados del estudio anterior se muestran en la Figura 20 y Tabla 17 abajo. Todos los mAbs demuestran eficacia antitumoral potente. Los mAbs 1.5.3 y 1.1.2, fueron los más potentes en la inhibición de crecimiento de tumores Daudi, con 95% (p<0.001) de inhibición de crecimiento de tumor a 5 mg/kg de dosis relativa al 71% de inhibición por Rituximab. Los análisis estadísticos que comparan 1.5.3 ó 1.1.2 con Rituximab, proporcionan un vapor p por debajo de 0.05 en una prueba t de Student, indicando un mejoramiento significante en la eficacia con mAbs 1.1.2 y 1.5.3. La regresión completa y supervivencia libre de tumor, se observó en 10% y 20% de ratones tratados con la dosis superior de mAbs 1.5.3 y 1.1.2, respectivamente.

Tabla 17 Eficacia en modelo subcutáneo Namalwa Se usó un diseño experimental similar para evaluar la eficacia de anticuerpo humano anti-CD20 en el modelo Namalwa de linfoma no Hodgkin. 107 células Namalwa (ATCC) fueron implantadas subcutáneamente en ratones puros Ncr (Taconics, Gemantown, NY, USA) . Las células Namalwa forman tumores agresivos que expresan bajo nivel de CD20. El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3. Se probaron anticuerpos a niveles de dosis de 10 y 20 mg/kg de anticuerpos anti-CD20, y se compararon con el control de vehiculo y un control de isotipo IgGl. La dosificación de anticuerpos anti-CD20, control de isotipo y control de vehiculo PBS, se hizo por inyección intraperitoneal dos veces una semana por 3 semanas y se inició al dia 9 después de la inoculación tumoral. Como se muestra en la Figura 21 y Tabla 18 siguiente, Rituximab y mAbs 1.5.3, son equivalentes a la dosis más alta de 20 mg/kg que media una inhibición del crecimiento de tumor de 78 y 73% (p<0.001) respectivamente. Sin embargo, a una dosis de 10 mg/kg, 1.5.3 fue más dramáticamente potente que la misma dosis de Rituximab. El Rituximab no fue eficaz, mientras el mAb 1.5.3 todavia exhibe 65% de inhibición de crecimiento del tumor (p<0.005) .

Tabla 18 Eficacia en modelo subcutáneo RRl-Raji También se evaluó la eficacia de anticuerpos humanos ant?-CD20 en un modelo de células resistentes a Rituximab. Se implantaron RR1-Raj? subcutáneamente en ratones recipientes CB17 SCID. Los anticuerpos fueron probados a dos niveles de dosis, 1 mg/kg y 5 mg/kg, y se compararon con el control de vehiculo y control de isotipo IgGl . La dosificación de anticuerpos anti-CD20, control de isotipo y control de vehiculo PBS, se hizo por inyección intraperitoneal dos veces una semana por 3 semanas y se inició al dia 14 después de la inoculación del tumor. El rituximab a una concentración de 5 mg/kg fue eficaz en el modelo RRl-Rají mediando 59% de inhibición de crecimiento de tumor similar al 62% logrado por mAb 1.5.3 (Figura 22). A 1 mg/kg de dosis semanal, el anticuerpo 1.5.3 parece más potente que el Rituximab, aunque las diferencias no alcanzan la significancia estadística (p=0.05f Tabla 19 Eficacia en modelo subcutáneo RR6-Ramos El modelo RR6-Ramos fue entonces intentado in vivo . 107 células RR6-Ramos se implantaron subcutáneamente en ratones recipientes CB17 SCID. Los ratones fueron tratados con 1 ó 5 mg/kg de 2.1.2, 1.5.3 ó Rituximab y la eficacia antitumoral se comparó con el control PBS de vehiculo o un control de isotipo IgGl. La dosificación de anticuerpos anti-CD20, control de isotipo y control de vehiculo PBS se hizo por inyección intraperitoneal dos veces una semana por 3 semanas y se inició al dia 14 después de la inoculación. La Figura 23 y Tabla 20 demuestran que mAbs 2.1.2 y 1.5.3, inhiben el crecimiento del tumor por 61% y 59% (p<0.05), respectivamente, mientras el Rituximab no media algún efecto antitumoral significante en este modelo.

Tabla 20 EJEMPLO 20 REDUCCIÓN DE CÉLULAS B DE TEJIDO DESPUÉS DEL TRATAMIENTO CON ANTICUERPOS HUMANOS CONTRA CD20 El grado de identidad de aminoácido/homología entre ratones cinomolgos CD20 y CD20 humano, es presumiblemente alto como muchos anticuerpos CD20 anti-humanos comercialmente disponibles reaccionan cruzado con linfocitos B de mono cinomolgo. Un total de veintiséis monos cinomolgos macho se seleccionaron, previos al inicio del estudio, para la proporción de linfocitos B de circulación (células CD20+) . Los animales que mostraron prevalencia extrema/inusual de células CD20+ en cualquier lado de la distribución de subpoblación, fueron excluidos. Veinticuatro animales fueron seleccionados como un resultado del proceso de selección, aleatorizados por peso corporal y asignados a tres grupos, cada uno que consiste de seis monos macho cinomolgos. Después de un periodo de aclimatación de 14 dias, los grupos fueron tratados intravenosamente, a los Dias de Estudio 1, 8 y 15, con vehiculo (Grupo 1, 0 mg/kg), Rituximab (Grupo 2, 10 mg/kg), como un control positivo, y mAb 1.5.3, 10 mg/kg. Los parámetros evaluados incluyen observaciones clínicas, peso corporal, consumo de alimento, hematología, análisis FACS de tejidos linfoides y sangre periférica, concentraciones de articulo de prueba en suero (farmacocinética), patología de totalidad, pesos de órganos, histopatologia e inmunohistoquimica . Todos los animales sobrevivieron hasta la necropsia terminal programada en el Estudio del Dia 18. No fueron aparentes tratamientos de cambios atribuibles al control positivo (Rituximab) o el articulo de prueba (mAb 1.5.3), en observaciones clínicas, consumo de alimentos, peso corporal, pesos de órganos o patología total. Como se esperaba, hubo efecto marcado relacionado con los artículos de prueba en conteos de linfocito total en la sangre, tan pronto como 1 hora posterior a la infusión, asi como también otros cambios esperados en hematología. Los resultados de citometria de flujo demuestran una supresión profunda en porcentajes relativos de linfocitos B positivos con relación a la linea base en subseries CD19+ y CD20+ para el Grupo 2 (Rituximab) , y Grupo 3 (mAb 1.5.3), a dosis equivalentes en sangre. Monos tratados con mAb 1.5.3., mostraron los efectos más pronunciados que ocurren inmediatamente después de la postdosificación con niveles de células B suprimidas que permanecen a aproximadamente >1% de la linea base al final del estudio en el Dia 18. Adicionalmente, los resultados de los análisis FACS de células aisladas de nodos linfáticos de varios sitios (nodos linfáticos mesentérico, inguinal, y auxiliar) , médula ósea y bazos, demuestran las mayores diferencias (P<0.05) entre animales tratados con mAb 1.5.3 tratados del Grupo 3, y el grupo de control (Figura 24). Los efectos observados con mAb 1.5.3 fueron más pronunciados que aquellos observados con Rituximab a dosis equivalentes (Figura 24) . Estos cambios incluyen supresiones de células B mínimas a marcadas dentro de los folículos y la zona marginal (bazos) e incrementos relativos y/o absolutos en células T en las vainas linfoides periarteriolares (PALS) y paracorteza. En total, no fueron notados en este estudio, hallazgos adversos atribuidos a la administración del articulo de prueba. Todos los cambios relacionados con el articulo de prueba observados en los animales de estudio, fueron consistentes con la actividad farmacológica de anticuerpos anti-CD20+ con anticuerpo ABl, demostrando los efectos más potentes.

EJEMPLO 21 Pacientes humanos con linfoma no Hodgkin fueron tratados con mAb 1.5.3 descrito en este documento. Cada paciente es dosificado semanalmente con una cantidad efectiva del anticuerpo que varia desde 50 mg/m2 hasta 2,250 mg/m2 por 4-8 semanas. A tiempos periódicos durante el tratamiento, cada paciente es monitoreado para determinar el número de células de linfoma en el paciente. Se encuentra que en pacientes que se someten a tratamiento con el mAb 1.5.3, el número de células de linfoma se reduce en comparación con pacientes de control que no se les da el anticuerpo mAb 1.5.3.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Todas las referencias citadas en este documento, incluyen patentes, solicitudes de patentes, documentos, libres de texto, y similares, y las referencias citadas en este documento, en la magnitud en que no están ya sea incorporadas por este medio aqui por referencia en su totalidad.

EQUIVALENTES La especificación escrita mencionada anteriormente, es considerada por ser suficiente para permitir a una persona experta en la técnica, practicar la invención. La descripción mencionada anteriormente y los Ejemplos, detallan ciertas modalidades preferidas de la invención, y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará sin embargo, que ninguna materia detalla como puede aparecer lo mencionado anteriormente en el texto, la invención puede ser practicada en muchas formas y la invención debe ser construida de conformidad con las reivindicaciones adjuntas y cualquiera de las equivalentes de la misma.

Claims (38)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

1. Un agente enlazante de objetivo que se enlaza a CD20 y comprende una región que determina la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRl), caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido de GYSFTSY IG (SEC ID NO: 201) .

2. Un agente enlazante de objetivo que se enlaza a CD20 y comprende una región que determina la complementariedad de cadena ligera 2 (CDR2), caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido de KISNRFS (SEC ID NO:202) .

3. Un agente enlazante de objetivo que se enlaza a CD20, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.5 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de CellTiterGlo .

4. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.2 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de CellTiterGlo.

5. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.02 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de CellTiterGlo .

6. Un agente enlazante de objetivo que se enlaza a CD20, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.2 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de Alamar Azul.

7. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.09 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de Alamar Azul.

8. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo tiene un EC50 de no más de 0.02 µg/ml para inducir apoptosis de células Ramos en un ensayo de viabilidad estándar de Alamar Azul .

9. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo induce apoptosis en células que expresan CD20, induce citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) en células que expresan CD20, o induce citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en células que expresan CD20.

10. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo se enlaza a CD20 con un Kd de menos de 12 nanomolar (nM) .

11. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo se enlaza a CD20 con un Kd de menos de 10 nanomolar (nM) .

12. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo se enlaza a CD20 con un Kd de menos de 9 nanomolar (nM) .

13. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo se enlaza a CD20 con un Kd de menos de 5 nanomolar (nM) .

14. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo se enlaza a CD20 con un Kd de menos de 4 nanomolar (nM) .

15. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo es un anticuerpo monoclonal 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329) .

16. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo es un anticuerpo monoclonal 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) .

17. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo es un anticuerpo monoclonal 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328) .

18. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO:2.

19. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 4.

20. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO:30.

21. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 32.

22. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO:46.

23. El agente enlazante de objetivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el agente enlazante de objetivo comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO: 48.

24. El agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque está en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.

25. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica el agente enlazante objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

26. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25.

27. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 26.

28. Un método para tratar un linfoma de células B en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a dicho animal en necesidad del mismo, una dosis terapéuticamente efectiva del agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicho linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicho animal es un humano .

31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicho agente enlazante de objetivo es el mAb 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7329) o mAb 1.5.3 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) o mAb 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328).

32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque además comprende administrar un segundo agente seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fármaco quimioterapéutico y un fármaco radioactivo.

33. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicha administración es en conjunto con o después de una cirugía convencional, un transplante de células troncales de médula ósea o un transplante de células troncales periféricas.

34. Uso del agente enlazante de objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de células B.

35. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicho linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin (NHL) .

36. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicho agente enlazante de objetivo es el mAb 1.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7330) o mAb 2.1.2 (Número de Acceso ATCC PTA-7328) .

37. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicho medicamento es para uso en combinación con un segundo agente anti-neoplásico seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un agente quimioterapéutico o un fármaco radioactivo.

38. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicho medicamento es para uso en conjunto con o después de una cirugía convencional, un transplante de célula troncal de médula ósea o un transplante de célula troncal periférica.