CN118852427A

CN118852427A - 靶向cd70的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN118852427A
Application number: CN202310480076.8A
Authority: CN
Inventors: 何立珍; 林嘉熙; 彭雍博; 周亮; 徐飞虎; 王同映; 孙汉栋
Original assignee: Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co ltd
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-10-29

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向CD70的单克隆抗体及其用途。本发明制备的CD70抗体或其抗原结合部分与CD70具有高亲和力，能够高效阻断CD70结合CD27，同时具有ADCC、ADCP和CDC效应，能诱导内吞效应，能够抑制肿瘤细胞生长。本发明提供的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα抗体等药物可用于治疗肿瘤和其它相关疾病。

Description

靶向CD70的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分及其制备方法和用途。

背景技术

CD70是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor[TNF])超级家族的成员之一，属于II类转膜分子，它一过性(瞬时)表达于活化的树突状细胞、T细胞和B细胞，以三聚体形式与免疫细胞表面的受体分子CD27结合(Hintzen et al.,1994；Tesselaar etal.,1997)。由于CD27持续表达于大多数T细胞、部分NK细胞以及记忆性B细胞，CD70-CD27通路信号的开关与强弱是由CD70表达与否所调控的(Agematsu et al.,2000；Hintzen et al.,1995；vanLier et al.,1987；Vossen et al.,2008)。CD70-CD27通路激活能够放大T细胞受体(Tcell receptor[TCR])的信号或降低T细胞活化的阈值，对于T细胞受到抗原刺激后的活化、增殖起着增强作用，即所谓的T细胞共刺激信号(Keller et al.,2008；Rowley et al.,2004；Van Gisbergen,et al.,2011)。CD70-CD27通路也对NK细胞活化、次级淋巴组织中B细胞活化后滤泡生发中心形成和诱导分化产生抗体的浆细胞有着重要影响(Vossen et al.,2008；Takeda et al.,2000；Xiao et al.,2004)。所以，正常生理状态下的CD70-CD27通路对于天然免疫(NK细胞)、尤其是适应性免疫(T、B细胞)具有增强作用。

由于CD70-CD27轴对T细胞、B细胞以及NK细胞的重要调控作用，以抗体或重组蛋白分子来刺激或阻断该信号通路在治疗肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病、器官移植中的异体排斥反应等领域已有大量的探索性研究。CD70重组蛋白或CD27激动型抗体在小鼠肿瘤模型展现出很好的T细胞介导的抗癌效应(Arens et al.,2004；French et al.,2007；He etal.,2013；Keller et al.,2008；Rowley et al.,2004；Sakanishi etal.,2010；Vitale etal.,2012)。CD70阻断型抗体在实验性结肠炎、胶原蛋白诱导性关节炎等自身免疫性疾病小鼠模型可缓解炎症或病理改变(Manocha et al.,2009；Oflazoglu et al.,2009)。在敲除CD27基因的小鼠或应用CD70阻断型抗体可延长角膜、心脏等移植物在宿主小鼠的存活时间(Narimatsu et al.,2020；Yamada et al.,2005；Yamaura et al.,2010；Zhao et al.,2021)。

然而，大量的科学研究表明，CD27共刺激信号可能增强或减弱T细胞的功能，取决于CD70-CD27相互作用的环境、强度和时长(Nolte et al.,2009；van Gisbergen etal.,2011；Wensveen et al.,2012)。长期或持续性的CD70-CD27通路信号将导致T细胞活性衰退和耗竭(O’Neill RE,et al.,2017；Tesselaar et al.,2003)。在人为构建CD70持续性表达的转基因小鼠，T细胞首先极度活化，继而衰竭并刁亡。慢性病毒感染病灶部位或者肿瘤微环境中可检测到CD70阳性的T或B淋巴细胞增加，这些细胞具有衰竭样表型，比如PD-1表达增高(Burton et al.,2018；Hazenberg et al.,2003；Yang et al.,2014)。

另一方面，CD70已经被发现在多种癌细胞上有高表达，比如淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、髓系白血病、肾透明细胞癌、肝癌、胰腺癌等(Balsas et al.,2021；Flieswasseret al.,2019；McEarchern et al.,2008；Ranheim et al.,1995；Riether et al.,2017；Roux et al.,2020)，使其成为可供抗体介导的细胞毒杀伤(antibody-dependentcellular cytotoxicity[ADCC])、补体杀伤(complement-dependent cytotoxicity[CDC])和吞噬(antibody-dependent cellular phagocytosis[ADCP])发挥作用的一个癌细胞靶点。CD70与CD27结合导致后者从细胞表面脱落，以游离形式(soluble CD27[sCD27])存在于血循环中，因此sCD27的血清水平可作为CD70阳性肿瘤的一个荷瘤量指标(Flieswasser etal.,2019；Kara et al.,2007；Molica et al.,1998；Ranheim et al.,1995；Riether etal.,2017)。癌细胞高表达CD70与更差的临床预后相关联，可能由于它诱导肿瘤微环境内调控性T细胞(regulatory T cell[Treg])增生、杀伤性CD8 T细胞衰竭，造成免疫逃逸(Balsas et al.,2021；Claus et al.,2012；Riether et al.,2017；Yang et al.,2014)。

在非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma[NHL])，半数以上病理标本见到10％以上的淋巴瘤细胞为CD70阳性，尤其是在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma[MCL])、外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma[PTCL])等对现有标准治疗方案R-CHOP不敏感的淋巴瘤亚型以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(difused large B cell lymphoma[DLBCL])这个最常见的淋巴瘤亚型(Flieswasser et al.,2019)。另外，虽然人体正常造血干细胞和各分化阶段的髓系细胞都不表达CD70或CD27，但是急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia[AML])的白血病干细胞(leukemic stem cell[LSC])和幼稚细胞(blast)表面却有CD70阳性和/或CD27阳性，CD70-CD27通路信号可能维持白血病细胞的干细胞属性，对现有化疗方案不敏感，形成微小残余病灶(minimal residual disease[MRD])，成为白血病复发的细胞来源。阻断该通路则抑制干细胞基因表达并引导白血病干细胞和白血病祖细胞朝向高分化阶段(Perna et al.,2017；Riether et al.,2017)。

将CD70作为一个癌症治疗靶点进行抗体开发已有数十年历史。美国生物技术和制药公司Medarex(已被百时美施贵宝[BMS]收购)、Amgen(安进)和Seatle Genetics(公司已更名Seagen并已被辉瑞收购)以及比利时生物技术公司Argenx都在CD70抗体开发方面付出了长期的努力。早期开发策略大多集中在抗体-药物偶联体形式(antibody-drugconjugates[ADC])，比如MDX-1203(BMS-936561)(Owonikoko etal.,2016)、SGN-70A(Palet al.,2019；Phillips et al.,2019)、SGN-75(Tannir etal.,2014)、AMG172(Massard etal.,2019)，期望CD70抗体通过结合靶点后内吞将所携带的细胞毒素释放杀死癌细胞。这几个ADC的探索性临床试验都选择NHL或肾透明细胞癌为适应症，数据看起来并不理想，目前基本陷于停滞状态。

当下走在临床最前沿的CD70抗体当数Argenx公司的Cusatuzumab(也称ARGX-110)。这是一款通过去岩藻糖增强ADCC活性的IgG1单抗，也有强力的CDC和ADCP活性，还能阻断CD70-CD27通路，从而不仅杀死白血病幼稚细胞还能诱导分化去除白血病干细胞(Riether et al.,2020；Silence et al.,2014)。Cusatuzumab与阿扎胞苷联合用于AML治疗的最初数据非常亮眼，12例患者全部对治疗有响应，其中8例完全缓解(CR)，2例完全缓解但血液学指标尚未恢复到正常(CRi)，其余2例部分缓解，整体半数以上患者存活时间超过1年(Riether et al.,2020)。然而该试验后续临床II期的结果不尽如人意，2021年1月的研究间期报告揭示完全缓解率40％(21/52)。Argenx后续增开了Cusatuzumab与阿扎胞苷加维奈克拉联合应用于不宜接受化疗的AML患者的临床Ib期试验，阶段性数据在2021年12月召开的美国血液学会(American Society of Hematology[ASH])年会上报告(Roboz et al.,2021)，在可评估药效的42例患者中总响应率93％，完全缓解率(CR+CRi)达81％(34/42)。

国内有百济神州从美国Seagen公司引进SEA-CD70的亚洲权益，2021年6月获得国家药监局药品审评中心(CDE)默许开展临床试验。SEA-CD70单抗与Cusatuzumab一样，通过去岩藻糖增强ADCC活性(Aribi et al.,2020；Diolaiti et al.,2020)。国内还有宜明昂科自主开发的CD70单抗IMM40H，已经登记临床试验(NCT05549557；CTR20222285)，计划入组实体瘤和血液癌患者进行剂量爬坡，评价安全性、耐受性和推荐扩展剂量。另外，最近获悉博锐生物的CD70单抗正在申报IND。

近年来国内外开发CD70 CAR-T细胞治疗的热情也在不断升温(Leick et al.,2022；Perna et al.,2017；Sauer et al.，2021；Yang et al.,2020),当下从clinicaltrials.gov可检索到15项CD70 CAR-T细胞治疗的临床试验，其中2/3由中国的企业或医疗机构申办，涵盖血液癌和实体瘤多种适应症。

总之，到目前为止，虽然靶向CD70的开发有单抗、ADC、CAR-T细胞等多种形式，它们中尚未有任何一个项目进入验证性临床试验阶段，更没有靶向CD70的药物获批上市。鉴于CD70高选择性地表达在肿瘤细胞上，而在正常细胞的表达非常有限(只在活化的树突状细胞和淋巴细胞有瞬时表达)，而且CD70-CD27又是一条重要的免疫调控信号通路，使得CD70成为一个不可多得的抗体药开发靶点，如何在保障安全性的前提下实现药效仍然需要在抗体筛选、分子设计和临床设计各个方面继续进行纵深的探索。本专利描述我们所开发的CD70抗体。

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发明概述

本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

(a)重链可变区CDR1，其包含与SEQ ID NO：25所示一致的氨基酸序列；

(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：

36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：43所示一致的氨基酸序列；

(c)重链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：44所示一致的氨基酸序列；

(d)轻链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：33所示一致的氨基酸序列；

(e)轻链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：34所示一致的氨基酸序列；和

(f)轻链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：42所示一致的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQID NO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示一致的氨基酸序列；

(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31和SEQID NO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(c)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQID NO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37所示一致的氨基酸序列；

(d)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38和SEQID NO：39所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(e)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：40和SEQID NO：41所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(f)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQID NO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：42所示一致的氨基酸序列；

(g)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQID NO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37所示一致的氨基酸序列；

(h)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQID NO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示一致的氨基酸序列；

(i)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43和SEQID NO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(j)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38和SEQID NO：39所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(k)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43和SEQID NO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；或

(l)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31和SEQID NO：44所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区和轻链可变区的CDR序列可通过保守序列修饰，包括一处或多处氨基酸的取代、添加和缺失等。所述一处或多处氨基酸的添加、缺失和/或取代(例如，保守性取代)不超过五处，优选地不超过三处。

在又一个实施方案中，本发明提供靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链可变区序列：

(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48或SEQ ID NO：49所示一致的氨基酸序列；

(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52所示一致的氨基酸序列。

(a)重链可变区具有与SEQ ID NO：1所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：2所示序列一致的氨基酸序列；

(b)重链可变区具有与SEQ ID NO：3所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：4所示序列一致的氨基酸序列；

(c)重链可变区具有与SEQ ID NO：5所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：6所示序列一致的氨基酸序列；

(d)重链可变区具有与SEQ ID NO：7所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：8所示序列一致的氨基酸序列；

(e)重链可变区具有与SEQ ID NO：9所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：10所示序列一致的氨基酸序列；

(f)重链可变区具有与SEQ ID NO：11所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：12所示序列一致的氨基酸序列；

(g)重链可变区具有与SEQ ID NO：13所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：14所示序列一致的氨基酸序列；

(h)重链可变区具有与SEQ ID NO：15所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：16所示序列一致的氨基酸序列；

(i)重链可变区具有与SEQ ID NO：17所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：18所示序列一致的氨基酸序列；

(j)重链可变区具有与SEQ ID NO：19所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：20所示序列一致的氨基酸序列；

(k)重链可变区具有与SEQ ID NO：21所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：22所示序列一致的氨基酸序列；

(l)重链可变区具有与SEQ ID NO：23所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：24所示序列一致的氨基酸序列；

(m)重链可变区具有与SEQ ID NO：45所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：50所示序列一致的氨基酸序列；

(n)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：50所示序列一致的氨基酸序列；

(o)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(p)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(q)重链可变区具有与SEQ ID NO：47所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(r)重链可变区具有与SEQ ID NO：47所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(s)重链可变区具有与SEQ ID NO：48所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(t)重链可变区具有与SEQ ID NO：48所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(u)重链可变区具有与SEQ ID NO：49所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；或

(v)重链可变区具有与SEQ ID NO：49所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列.

在另一实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ IDNO：49的氨基酸序列具有至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链可变区与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。

在另一实施方案中，所述抗体为全长抗体,包括人或鼠IgG抗体的Fc结构域。又一方面，所述人抗体恒定区Fc结构域选自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4组成的组。在另一实施方案中，所述人恒定区Fc结构域是IgG1、IgG2或IgG4。在另一实施方案中，所述人恒定区Fc结构域是IgG1w或IgG1突变体(LALA)。

在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。

在另一实施方案中，本发明抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体ScFv或多特异性抗体。

在另一实施方案中，本发明抗体为双抗体。

在另一实施方案中，本发明抗体为ADC药物。

在另一实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体，其包含：

(a)重链，其序列与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列一致；轻链，其序列与SEQIDNO：54所示的氨基酸序列一致；或

(b)重链，其序列与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列一致；轻链，其序列与SEQ IDNO：54所示的氨基酸序列一致。

在另一实施方案中，本发明还提供了编码所述CD70的单克隆抗体抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。本发明提供了包含所述分离的多核苷酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

在另一实施方案中，本发明提供了药物组合物，包含所述靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分以及可药用载体。

在另一实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分给予需要治疗的肿瘤患者。

在另一实施方案中，本发明提供了所述的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分联合靶向CD47/SIRPα抗体在治疗肿瘤疾病中的用途。

附图说明

图1.候选抗体结合人CD70的ELISA分析(实施例4)

图2.候选抗体阻断CD70-CD27结合的ELISA分析(实施例5)

图3.流式细胞仪分析筛选CD70阳性细胞株(实施例6)

图4.候选抗体结合CD70阳性细胞的流式分析(实施例7)

图5.候选抗体阻断CD27结合Raji细胞的流式细胞仪分析(实施例8)

图6.候选抗体的ADCC活性分析[报告基因法](实施例9)

图7.候选抗体的ADCC活性分析[PBMC法](实施例10)

图8.候选抗体的ADCP活性分析[报告基因法](实施例11)

图9.流式细胞仪分析鉴定诱导分化的巨噬细胞(实施例12)

图10.候选抗体的ADCP活性分析[巨噬细胞法](实施例13)

图11.候选抗体单用或联合SIRPa抗体的促吞噬作用[巨噬细胞法](实施例14)

图12.候选抗体的CDC活性分析(实施例15)

图13.候选抗体结合CD70的特异性验证(实施例16)

图14.候选抗体A47在小鼠体内的抗肿瘤活性(实施例17)

图15.候选抗体结合猴CD70的ELISA分析(实施例18)

图16.候选抗体结合鼠CD70的ELISA分析(实施例19)

图17.候选抗体A47的重链可变区序列与人类免疫球蛋白胚系序列库IMGT进行比对(实施例20)

图18.候选抗体A47的轻链可变区序列与人类免疫球蛋白胚系序列库IMGT进行比对(实施例20)

图19.人源化候选抗体结合人CD70的ELISA分析(实施例21)

图20.人源化候选抗体结合猴CD70的ELISA分析(实施例22)

图21.人源化候选抗体结合鼠CD70的ELISA分析(实施例23)

图22.人源化候选抗体阻断CD70-CD27结合的ELISA分析(实施例24)

图23.人源化候选抗体结合Raji细胞的流式细胞仪分析(实施例25)

图24.人源化候选抗体阻断CD27结合Raji细胞的流式细胞仪分析(实施例26)

图25.人源化候选抗体的ADCC活性分析[报告基因法](实施例27)

图26.人源化候选抗体的ADCC活性分析[PBMC法](实施例28)

图27.人源化候选抗体的ADCP活性分析[报告基因法](实施例29)

图28.人源化候选抗体的ADCP活性分析[巨噬细胞法](实施例30)

图29.人源化候选抗体的CDC活性分析(实施例31)

图30.CD70抗体的内吞效应检测(实施例32)

图31.CD70抗体在小鼠体内的抗肿瘤活性(实施例33)

发明详述

定义

为使本发明更易于理解，首先定义某些术语。别的定义将在整个详述中阐明。

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内，这些技术在本领域的技术文献和通用教科书中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)等。

术语“CD70蛋白”、“CD70抗原”或“CD70”可互换使用，是指TNFRSF27/CD27之配体的TNF配体家族的成员。术语“人CD70蛋白”或“人CD70抗原”或“人CD70”可互换使用以尤其指人的同源物，包括天然地表达于人体中和/或培养的人细胞系表面上的天然人CD70蛋白及其重组形式和片段(参考NCBI序列登录号NP_001243)。

术语“CD70抗体”指对人CD70蛋白表现出免疫特异性的抗体，对人CD70的“特异性”不排除与CD70的物种同源物的交叉反应。

术语“CD47”是广泛表达的具有单个Ig样结构域和五个跨膜区域的跨膜糖蛋白，细胞表面CD47与巨噬细胞上的其受体SIRPα相互作用以抑制正常、健康细胞的吞噬作用。人CD47的氨基酸序列参考Genbank登录号No.Q08722.1(GI:1171879)。

术语“SIRPα”是指野生型信号调节蛋白α、或具有野生型信号调节蛋白α的氨基酸序列的重组或非重组多肽的氨基酸序列、或天然或天然存在的信号调节蛋白α的等位基因变体。SIRPα优选指野生型哺乳动物SIRPα，最常见的蛋白质变体是SIRPαv1和v2(参考登录号NP_001035111、NP_542970(P78324)和CAA71403)，另外还包括SIRPαv8等。靶向CD47/SIRPα抗体是指对人CD47或SIRPα蛋白表现出免疫特异性的抗体。

术语“抗体”是指表现出所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导)的抗体的任何形式。因此，“抗体”以其最广泛的意义来使用，并明确包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、纳米抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼科动物中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体的每条重链由重链可变区和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3构成。每条轻链由轻链可变区和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(CDR)，其散布在更保守的区域中，称为框架区(FR)。每条V_H和V_L由三个CDR和四个FR构成，其从氨基端到羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

术语“CDR”或“互补决定区”表示见于重链多肽和轻链多肽二者的可变区中的非连续抗原组合位点。Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences ofprotein of immunological interest.(1991)，及Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述了这些特定区。优选地，术语“CDR”是根据序列比对由Kabat所限定的CDR。

“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。Fc可选自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域或经过突变其中1个或几个位点的Fc结构域。

如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”指抗体或抗原结合部分在体外测定法中，优选地在采用纯化的野生型抗原的生物光干涉测量(ForteBio)中与抗原表位结合。在某些实施方案中，在抗体或抗原结合部分优选地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中其靶抗原时，将抗体或抗原结合部分称作特异性结合抗原。

非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)高变区的残基置换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体包含至少一个且通常为两个可变结构域的几乎全部，其中全部或几乎全部超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含至少部分免疫球蛋白(通常为人免疫球蛋白)恒定区(Fc)。

术语抗体的“抗原结合部分”是指一个或多个保留了与抗原(例如CD70)特异性结合的能力的抗体片段，包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、线性抗体、单链抗体ScFv等。

术语“ADC药物”是使用特异性靶向肿瘤相关抗原的抗体作为媒介物将共价附接的小分子毒素递送至癌细胞中的一类药物，又称为抗体-药物缀合物。该抗体特异性结合某种肿瘤抗原，如CD70。ADC中使用的抗体可以是全长抗体、全长抗体的抗原结合片段或抗体衍生物。通常，小分子毒素经由接头与抗体缀合。

“分离的”抗体为业已被鉴定并与其天然环境组分相分离的抗体，其天然环境的污染组分是会干扰所述抗体的诊断性或治疗性应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述抗体纯化到超过95％纯度，更优选超过99％纯度，其由Lowry法测定。分离的抗体通常由至少一个纯化步骤制备。

“分离的”核酸分子为被鉴定并与至少一种污染性核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

本文所用术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。

本文所用序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。

本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。

“有效量”包括足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以使得可以诊断或促进诊断的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“药学上可接受载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选，用于含有抗体的组合物的载体适用于静脉内(IV)、肌内、皮下(SC)、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

“患者”表示人或非人动物(例如哺乳动物)。

“癌症”或“肿瘤”是指以异常方式增殖的细胞的集合。

本发明的各个方面将在下述分部中进一步详细描述。

CD70抗体

(b)重链可变区CDR1，其包含与SEQ ID NO：25所示一致的氨基酸序列；

(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：43所示一致的氨基酸序列；

在另一实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区和轻链可变区的CDR序列同源性至少为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在一些优选的实施方案中，与靶向CD70的单克隆抗体CDR区或可变区具有高(即90％或更高)同源性的抗体通过保守序列修饰获得，包括一处或多处氨基酸的取代、添加和缺失等。所述一处或多处氨基酸的添加、缺失和/或取代(例如，保守性取代)不超过五处，优选地不超过三处。术语“保守序列修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变编码可变区序列的核酸分子。

(v)重链可变区具有与SEQ ID NO：49所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列。

重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与上述序列的VH和VL区具有高(即90％或更高)同源性的抗体通过保守序列修饰获得，包括氨基酸的取代、添加和缺失等。术语“保守序列修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变编码可变区序列的核酸分子。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区域外的一个或多个氨基酸残基，并使用本文所述的功能测定法对改变后的抗体测试保留的功能。优选的定点诱变或PCR介导的诱变位点位于可变区CDR1-CDR3之外的位点。

示例性的取代

氨基酸可以按照常见侧链的性质进行分组：

(1)疏水性:正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水性:Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性:Asp，Glu；

(4)碱性:His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基:Gly，Pro；

(6)芳族的:Trp，Tyr，Phe。

非保守性取代需要将这些类别中之一的成员交换为另一类。

在本发明中，优选对A47抗体的序列进行人源化。A47重链和轻链可变区序列分别与人类免疫球蛋白胚系序列库IMGT(Lefranc，2003)进行比对，选择同源度最高的germlineIGHV1-46*01和IGKV1-5*01为人源化设计模板，将A47的重链和轻链CDR区直接替换模板的6个CDR区，然后根据计算机模拟，选择几个可能对维持A47重链和轻链的可变区构象很重要的位点进行回复突变，得到重链可变区序列VH1-VH5，轻链可变区序列VL1-VL3(表4)。将VH1-VH5与VL1-VL3随机配对后得到10条人源化抗体与鼠源母本A47进行比较并筛选，它们是huVH1-huVL1、huVH2-huVL1、huVH2-huVL2、huVH2-huVL3、huVH3-huVL2、huVH3-huVL3、huVH4-huVL2、huVH4-huVL3、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3。

A47可变区的CDR序列

优化后的人源化变体基本与鼠源抗体A47的亲和力保持一致，其中优选人源化抗体的重链和轻链可变区序列为：

(1)重链可变区具有与SEQ ID NO：45所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：50所示序列一致的氨基酸序列；

(2)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：50所示序列一致的氨基酸序列；

(3)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(4)重链可变区具有与SEQ ID NO：46所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(5)重链可变区具有与SEQ ID NO：47所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(6)重链可变区具有与SEQ ID NO：47所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(7)重链可变区具有与SEQ ID NO：48所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；

(8)重链可变区具有与SEQ ID NO：48所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列；

(9)重链可变区具有与SEQ ID NO：49所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：51所示序列一致的氨基酸序列；或

(10)重链可变区具有与SEQ ID NO：49所示序列一致的氨基酸序列，轻链可变区具有与SEQ ID NO：52所示序列一致的氨基酸序列.

在另一实施方案中，所述抗体为含有人IgG恒定区的全长抗体。在另一些实施例中，所述抗体为含有小鼠IgG恒定区的全长抗体。可以通过将编码重链可变区的基因序列连接至编码人抗体重链恒定区(CH1、CH2和CH3)基因序列形成为全长重链基因，将编码轻链可变区的基因序列连接至编码人抗体轻链恒定区基因序列形成为全长轻链基因。人重链恒定区基因和轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242)。重链恒定区可以是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定区，在另一实施方案中，所述人恒定区Fc结构域是IgG1、IgG2或IgG4。在另一实施方案中，所述人恒定区Fc结构域是IgG1w或IgG1突变体(LALA)。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到不同的载体中，或者更通常的将两个基因插入到同一表达载体中，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中表达出全长抗体。

在另一实施方案中，本发明抗体为双抗体。

在另一实施方案中，本发明抗体由于具有诱导内吞效应，可进一步制备为ADC药物。

在另一优选实施方案中，本发明提供了靶向CD70的单克隆抗体，其包含：

(a)重链，其序列与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列一致；轻链，其序列与SEQ IDNO：54所示的氨基酸序列一致；或

在优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其重链(HC)与选自SEQID NO：53或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链(LC)与选自SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。与上述序列的重链和轻链具有高(即90％或更高)同源性的抗体可以通过诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码重链和轻链氨基酸的核酸分子，然后使用本文所述的功能测定法对所编码的改变后的抗体测试所保留的功能获得。优选的定点诱变或PCR介导的诱变位点位于重链可变区CDR1-CDR3和轻链可变区CDR1-CDR3之外的位点。

在本发明的一个具体实施方式中，使用的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分具有以下特性中的至少一种(特别是以下特性中的至少两种、特别是以下所有特性)：

--所述的CD70抗体或其抗原结合部分与CD70具有高亲和力，亲和力至少为10^-9M量级或更高(10^-12M量级)；

--所述的CD70抗体或其抗原结合部分能够高效阻断阻断CD70结合CD27；

--所述的CD70抗体或其抗原结合部分具有ADCC、ADCP和CDC效应，能诱导内吞效应；

--所述的CD70抗体或其抗原结合部分能结合人或猴CD70，但不结合鼠CD70；

--所述的CD70抗体或其抗原结合部分联合靶向CD47/SIRPα抗体能提高巨噬细胞的吞噬作用，显示相加效应。

编码本发明抗体的核酸分子

本发明还提供了编码所述靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的多核苷酸。本发明的核酸分子可以是DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。在一优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。

可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸分子。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码杂交瘤所制备的抗体轻链和重链的cDNAs。对于从免疫球蛋白基因库(例如使用噬菌体展示技术)中获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。

本发明优选的核酸分子是那些编码本发明中所示靶向CD70的单克隆抗体CDR区、可变区或者全长抗体的氨基酸序列的核酸分子。在获得编码本发明所述的靶向CD70的单克隆抗体的VH和VL区段的DNA片段后，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变为全长抗体基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时意图表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中。

通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定区，优选为IgG1或IgG4恒定区。为获得Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作的连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。

通过将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL另一DNA分子可以将编码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。

为创造scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作的连接至编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，从而使得VH和VL序列可以表达成相邻的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头连接，序列通式可以为为(G₄S)n、(SG₄)n、G₄(SG₄)n或(G₄S)nG等，其中n为1-6的整数，优选为3-5。

表达载体及宿主细胞

本发明提供了包含所述分离的多核苷酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

如本文所用，术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。载体包括质粒、病毒、粘粒和人工染色体。通常，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择标记。载体还可以包括除转基因插入物和骨架之外的其他特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体特异性地用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。

可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到不同的载体中，或者更通常的，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中。可以使用本文所述抗体的轻链和重链可变区来创造任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已编码期望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而使得VH区段与载体中的CH区段可操作的连接，VK区段与载体中的CL区段可操作的连接。或者，重组表达载体可以编码信号肽，其利于宿主细胞中抗体链的分泌。可将抗体链基因克隆到载体中以使信号肽与抗体链基因的氨基末端连接于同一读码框中。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。

为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图涵盖多种通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖苷转染等。虽然理论上在原核或真核宿主细胞中都有可能表达本发明的抗体，但是最优选在真核细胞中(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体。用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞等，优选CHO细胞。

当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以使宿主细胞中抗体表达的时间生产抗体，或者更优选的是，将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养物的培养液中回收抗体。

在另一实施方案中，本发明提供用于制备靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，其包括如下步骤：

(a)将携带编码靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞，在有助于产生抗体蛋白的条件下培养重组宿主细胞；和

(b)回收所述靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述蛋白的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。

若蛋白分泌到营养培养基中，该蛋白能够从所述培养基中使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，Protein A亲和柱、离子交换、疏水、层析聚焦和大小排阻)或其任意组合等方法。

药物组合物

本发明提供了药物组合物，包含所述靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段以及药学上可接受载体。

一方面，本发明提供了一种药用组合物，其包含一种或一组本发明的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载体配制在一起。药剂学可接受载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等生理学相容的载体。优选的是，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。

在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明所述的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，靶向CD47/SIRPα抗体以及药学上可接受载体，其可用于治疗肿瘤相关疾病，尤其是血液肿瘤疾病。

在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明所述的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，靶向CD47/SIRPα的JY47抗体以及药学上可接受载体，其可用于治疗肿瘤相关疾病，尤其是血液肿瘤疾病。

药物组合物在生产和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或冻干粉针等剂型。本发明药物组合物的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓/脊柱或其它胃肠外施用路径，例如通过注射或输注。

本发明的抗体的给药剂量的范围为大约0.01-100mg/kg，更加通常的为0.1mg/kg-100mg/kg，或0.5mg/kg-50mg/kg，或1mg/kg-25mg/kg，或2mg/kg-10mg/kg，或5mg/kg-10mg/kg的剂量。例示性的治疗方案要求每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。本发明药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗性应答而对患者是无毒的活性成分量。“治疗有效量”的本发明CD70单抗优选导致疾病症状严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间提高、或对患病所造成的损害或残疾的预防。例如，对于肿瘤的治疗而言，“治疗有效量”优选相对于未治疗受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少大约20％、更优选达至少大约40％、甚至更优选达至少大约60％、且仍更优选达至少大约80％。可以在动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力，所述动物模型系统可以预测在人肿瘤中的功效。本领域普通技术人员将会能够基于诸如受试者体型大小、受试者症状的严重性、及所选择的特定组合物或施用路径的因素来确定此类量。

用途

本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段给予需要治疗的肿瘤患者。

在另一实施方案中，本发明提供了将靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα抗体在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

本发明的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分与CD70具有高亲和力，通过阻断CD70-CD27信号通路，能抑制肿瘤细胞生长。特别是本发明还研究发现，所述的CD70抗体或其抗原结合部分联合靶向CD47/SIRPα抗体能提高巨噬细胞的吞噬作用，显示相加效应。特别是与靶向CD47/SIRPα的JY47抗体联用能明显促进Macrophage对肿瘤细胞的吞噬作用，具有协同抗肿瘤效应。

在另一实施方案中，本发明提供了将靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα抗体在制备用于在患者中抑制表达CD70之肿瘤细胞生长的药物中的用途。可使用本发明制备的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段抑制其生长的肿瘤或癌症选自肾癌、乳腺癌、脑肿瘤，慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤)、鼻咽癌、黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部的癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴茎癌、食管癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、类上皮癌、鳞状细胞癌或间皮瘤等。

在另一实施方案中，本发明提供了将靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα抗体在制备用于治疗患有致瘤性病症的药物中的用途，所述病症表征为存在表达CD70的肿瘤细胞，包括肾细胞癌(RCC)、胶质母细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、Burkitt淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞或中心细胞性滤泡性淋巴瘤癌、B系弥漫性大细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽的未分化癌、Castleman病、Kaposi肉瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤和其他的B细胞淋巴瘤。

一方面，本发明将所述的CD70抗体或其制剂施用至给予需要治疗的受试者。术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、羊、犬、小鼠、大鼠、猫、牛、马、鸡、两栖类和爬行类。优选的施用对象或个体是哺乳动物，例如小鼠、猴子、狗、牛、马或人，更优选是人。

本发明的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段的最优剂量将取决于治疗中的疾病、疾病的严重程度，和副作用的存在与否。最优剂量可通过常规实验确定。对于胃肠给予，给予0.1mg/kg-100mg/kg，或0.5mg/kg-50mg/kg，或1mg/kg-25mg/kg，或2mg/kg-10mg/kg，或5mg/kg-10mg/kg的剂量。例示性的治疗方案可以每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。

本发明提供了一种靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段及其医疗用途。兹将本发明的技术方案总结如下：

1、靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

2、根据技术方案1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含：

3、根据技术方案1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含重链和轻链可变区序列：

4、根据技术方案3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含重链和轻链可变区序列：

5、根据技术方案1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体为含有人IgG恒定区的全长抗体。

6、根据技术方案1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体为含有小鼠IgG恒定区的全长抗体。

7、根据技术方案5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的人IgG恒定区Fc结构域选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

8、根据技术方案7所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的人IgG恒定区Fc结构域是IgG1w或IgG1突变体(LALA)。

9、根据技术方案5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的人IgG轻链恒定区是κ或λ恒定区。

10、根据技术方案1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体为抗体片段。

11、根据技术方案10所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体ScFv或多特异性抗体。

12、根据技术方案11所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体为双抗体。

13、靶向CD70的单克隆抗体，其包含：

14、根据技术方案1-4任一项或技术方案13所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体进一步制备为ADC药物。

15、编码技术方案1-4任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子。

16、根据技术方案15所述的核酸分子，其为DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。

17、根据技术方案16所述的核酸分子，其为cDNA分子。

18、包含技术方案15-17任一项所述核酸分子的表达载体。

19、包含技术方案18所述表达载体的宿主细胞。

20、根据技术方案19所述的宿主细胞，其包括：中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞或SP2细胞。

21、药物组合物，其包含技术方案1-14任一项所述的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段以及药学上可接受载体。

22、药物组合物，其包含技术方案1-14任一项所述的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，靶向CD47/SIRPα的抗体以及药学上可接受载体。

23、根据技术方案21或22所述的药物组合物，其给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓/脊柱或其它胃肠外施用路径。

24、根据技术方案21或22所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体的给药剂量范围为0.01-100mg/kg。

25、根据技术方案24所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体的给药剂量范围为0.1mg/kg-100mg/kg，或0.5mg/kg-50mg/kg，或1mg/kg-25mg/kg，或2mg/kg-10mg/kg，或5mg/kg-10mg/kg的剂量。

26、根据技术方案21或22所述的药物组合物，其特征在于：所述抗体的治疗方案为每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。

27、技术方案1-4任一项所述的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα的抗体在制备治疗肿瘤疾病的药物中的用途。

28、根据技术方案27所述的用途，其特征在于：所述用途中的肿瘤疾病包括肾癌、乳腺癌、脑肿瘤，慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤)、鼻咽癌、黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部的癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴茎癌、食管癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、类上皮癌、鳞状细胞癌或间皮瘤等。

29、根据技术方案27所述的用途，其特征在于：所述肿瘤经表征为存在表达CD70的肿瘤细胞，包括肾细胞癌(RCC)、胶质母细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、Burkitt淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞或中心细胞性滤泡性淋巴瘤癌、B系弥漫性大细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽的未分化癌、Castleman病、Kaposi肉瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤和其他的B细胞淋巴瘤。

30、根据技术方案27所述的用途，其特征在于：将所述的CD70抗体或其制剂施用至给予需要治疗的受试者，所述的受试者包括人和非人动物。

31、根据技术方案30所述的用途，其特征在于：所述的非人动物包括非人灵长类、羊、犬、小鼠、大鼠、猫、牛、马、鸡、两栖类和爬行类。

32、制备权利要求1-13任一项所述的靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：

(a)、将携带编码靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞，在有助于产生抗体蛋白的条件下培养重组宿主细胞；

(b)、回收所述靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分。

33、根据权利要求32所述的方法，其特征在于：所述的回收方法包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

34、根据权利要求33所述的方法，其特征在于：所述的方法通过Protein A亲和柱、离子交换、疏水、层析聚焦、大小排阻或其任意组合纯化方法进行回收。

具体实施方式

提供以下实施例旨在完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在以任何方式限制本发明的范围，也不代表下述实验是所进行的所有或者仅有的实验。发明人力求实验数据的客观、准确，但应允许一定的实验误差和偏差。

实施例1：免疫小鼠制备抗体

制备针对人CD70的鼠源单克隆抗体，用纯化的CD70胞外区域重组蛋白His-CD70(ACRO，Cat#CDL-H52Da)和CD70阳性的Raji细胞作为抗原，分别于第0、14、35天对BALB/C小鼠进行3次免疫。通过眼窝放血制备血浆，用ELISA方法监测免疫应答。于第56天，对有最高的抗人CD70免疫球蛋白滴度值的小鼠进行静脉加强免疫，3天后处死小鼠并取出脾脏，提取RNA，RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体建库，以His-CD70(ACRO，Cat#CDL-H52Da)作为抗原、CD27(ACRO，Cat#TN7-H82F6)用于阻断实验，通过ELISA检测进行淘选，得到12条高亲和力、且有阻断CD70-CD27结合活性的抗体序列(表1)。

表1-1.噬菌体展示筛选到的候选抗体可变区序列

通过abYsis网站(http://www.abysis.org/)进行抗体CDR区标注(根据Kabat编号规则)，如下所示。

表1-2.噬菌体展示筛选到的候选抗体可变区的CDR序列

实施例2：候选抗体表达纯化

将筛选获得的12条CD70候选抗体的VH和VL区cDNA分别与人I gG1重链和κ轻链恒定区连接，分别将构建好的重链和轻链克隆到表达载体pCDNA3.1(+)。将表达载体质粒瞬转进入ExpiCHO-S细胞进行表达，培养基为(Gibco，Cat#A29100-01)，转染试剂盒为(Gibco，Cat#A29129)。具体方法如下：转染前一天将ExpiCHO-S细胞进行传代，在25mL体系内，将构建好的质粒25μg与转染试剂混合之后滴加入25mL ExpiCHO-S细胞培养物中，充分混匀，于37℃孵育18-22小时后，根据试剂盒内说明添加补料培养基，然后将细胞置于37℃培养。10-12天之后，将表达好的细胞混悬液高速离心取上清，所得上清经0.22μm过滤后采用ProteinA亲和纯化,用100mM甘氨酸盐(pH 3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和pH，得到目的抗体。

实施例3：BLI技术检测候选抗体与人CD70结合的亲和力

通过Octet RED 96(ForteBio)测定CD70候选抗体与CD70的亲和力。采用NTAsenor固化重组蛋白CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)，浓度为5μg/mL，固化高度1.5nm将12条CD70候选抗体(A7、A15、A24、A36、A39、A42、A47、A52、A57、P07415-A83、P07416-A9、P07417-A92；最后3条以下分别简称为A83、A92、A9)和参照品Cusat[采用Argenx公司的抗CD70抗体Cusatuzumab(又称ARGX-110)之VH、VL序列，分别与人IgG1重链和κ轻链恒定区连接而构建所得]进行2倍梯度稀释，起始浓度为100nM，共7个浓度点，结合时间200s，解离时间300s，数据拟合计算亲和力。

结果：如表2所示，本发明筛选到的CD70候选抗体与CD70具有高亲和力。

表2.候选抗体结合人CD70抗原的亲和、解离参数

抗体名称	亲和力KD(M)	结合ka(1/Ms)	解离kdis(1/s)
				A7	1.72E-09	2.88E+05	4.96E-04
A15	2.51E-10	2.91E+05	7.31E-05
				A24	5.50E-10	2.20E+05	1.21E-04
A36	1.35E-10	3.72E+05	5.04E-05
				A39	1.20E-09	3.14E+05	3.78E-04
A42	1.83E-12	2.14E+05	3.92E-07
				A47	1.41E-12	2.92E+05	4.13E-07
A52	2.53E-12	1.97E+05	4.99E-07
				A57	3.05E-12	1.65E+05	5.03E-07
A9	2.01E-10	2.17E+05	4.36E-05
				A83	1.17E-12	3.41E+05	3.99E-07
A92	2.77E-10	1.90E+05	5.26E-05
				Cusat	7.09E-10	1.48E+05	1.05E-04

实施例4：ELISA检测候选抗体与人CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的CD70候选抗体和参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:5000稀释的Goat anti human IgG Fc HRP(Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(MoularDevices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图1所示，12条候选抗体与人CD70都有良好的结合，相互间差异不大，大部分抗体接近参照品Cusat的结合活性。

实施例5：ELISA检测候选抗体阻断CD70-CD27结合的活性

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的CD70候选抗体和参照品Cusat分别与0.2μg的重组人biotin-CD27(ACRO，Cat#TN7-H82F6)混合，加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:2500稀释的Streptavidin-HRP(Invitrogen，Cat#434323)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图2所示，A15、A36、A47、A83、A9、A92、A24能够比其它候选抗体更好地阻断CD70结合CD27。

实施例6：FACS方法筛选CD70阳性细胞

采用流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)方法以商业化CD70抗体(Invitrogen，Cat#MA5-17728)对我们已有细胞库中的淋巴瘤、白血病、肾癌细胞株检测是否有CD70表达。分别取对数生长期的Raji、Daudi、U937、THP1、786-0、Caki-1和ACHN细胞，在96孔培养板每孔加入5×10⁴细胞，将human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564219)配制于终浓度为1mg/mL的mouse IgG(Invitrogen，Cat#31903)中作为封闭液进行封闭后，每孔分别加入1μg PE标记的商业化CD70抗体(Invitrogen，Cat#MA5-17728)，4℃孵育30min；洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS，流式细胞仪上样检测PE荧光强度(MFI)。

结果：如图3所示，所有检测细胞均有不同程度的CD70表达，以Raji细胞的CD70表达水平最高。

实施例7：FACS检测候选抗体对于CD70阳性细胞的结合

分别取对数生长期的Raji和Daudi细胞，在96孔培养板每孔加入1.5×10⁴细胞，经human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564220)封闭后，每孔分别加入梯度稀释的CD70候选抗体和参照品Cusat，4℃孵育30min；洗涤细胞后，每孔加入0.1μg AF488标记的羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-546-170)，4℃孵育30min；洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS，流式细胞仪上样检测AF488荧光强度(MFI)。

结果：如图4所示，整体上候选抗体与Raji细胞的结合强度高于与Daudi细胞的结合，与筛选细胞株时所得到CD70在这两个细胞株的表达水平相吻合。比较各候选抗体在这2个细胞株的结合强度，A9、A15、A36、A47、A83这5条抗体优于其它，在两个细胞株之间具有可重复性。

实施例8：FACS检测候选抗体阻断CD70-CD27结合

在96孔培养板每孔加入1.5×10⁴对数生长期的Raji细胞，经human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564220)封闭后，将实施例5的ELISA结果显示有阻断活性的7条候选抗体(在细胞水平结合更优的5条抗体也都在其中)和参照品Cusat梯度稀释，分别与0.5μg的biotin-CD27(ACRO，Cat#TN7-H82F6)混合，加入96孔培养板中，4℃孵育30min。洗涤后各孔加入0.2μg Streptavidin-PE(BD Pharmingen，Cat#554061)，洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS重悬细胞，流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)上样检测PE荧光强度(MFI)。

结果：如图5所示，这7条候选抗体能够阻断CD27结合Raji细胞，但阻断活性弱于参照品Cusat，A24和A92又弱于其它5条候选抗体。图5A为Raji胞膜上biotin-CD27结合Streptavidin-PE所检测的MFI；图5B为根据MFI按照所附公式换算为阻断率。

实施例9：报告基因法检测候选抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(ADCC)

(1)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，洗涤后加入适量测活培养基(RPMI1640+0.5％BSA)重悬细胞并调整至120w/mL，以25μL/孔铺96孔板(3w/孔)。

(2)抗体稀释和加样：取Cusat、A9、A15、A36、A47、A83、hIgG1，分别用测活培养基稀释至初始浓度为200nM(29μg/mL)，6倍稀释，12个浓度点，以25μL/孔加样。

(3)效应细胞准备和孵育：取构建的高表达CD16a且导入NFAT-Luciferase荧光报告基因的Jurkat细胞悬液，用DPBS漂洗2遍后，加入适量测活培养基将细胞重悬至密度600w/mL，以25μL/孔(15w)加至已铺靶细胞和抗体样品的96孔板，效靶比为5:1，放入37℃，5％CO₂培养箱内静置培养18小时。

(4)检测：从培养箱中取出细胞培养板，放置15min使其温度恢复至室温。取适量分装好的Bio-Glo^TM Luciferase检测体系(Promega，Cat#G7940)所用底物5′-氟-荧光素，室温平衡15min，以75μL/孔加样，混匀后室温避光放置10min，用酶标仪(Moular Devices，M5e)超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果：如图6所示，5条候选抗体的ADCC效应很接近，均高于参照品Cusat。

实施例10：PBMC法检测候选抗体的ADCC活性

(1)效应细胞准备：正常供者PBMC(妙顺(上海)生物科技有限公司，Lot#P121110606F)加入含终浓度为0.5μg/mL IL-2(Gibco，Cat#PHC0026)的RPMI 1640+10％FBS完全培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中孵育5天。收获悬浮细胞，洗涤、计数、用完全培养基调整细胞密度到500w/mL。

(2)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，洗涤后加入完全培养基重悬，加入Calcein AM(Beyotime，Cat#C2013M)，染色比例按每100w细胞加20μL Calcein AM；37℃孵育30分钟，洗涤后用完全培养基重悬细胞，以每孔100μL含1×10⁴细胞铺于96孔U型培养板。

(3)抗体稀释、加样和孵育：将hIgG1、Cusat、A9、A15、A36、A47、A83稀释至345nM(终浓度69nM)，6倍梯度稀释，10个浓度点，以50μL/孔加入含靶细胞的96孔板中。每孔加入上述效应细胞100μL，即5×10⁵细胞/孔(效靶比＝50:1)，终体积为250μL，放入37℃，5％CO₂培养箱中，孵育2h。

(4)对照设置：

spontaneous release：只有Raji细胞；

maximum release：Raji细胞中加入10μL TritonX-100(VWR，Cat#0694-1L)；

Antibody-independent cell-mediated cytotoxicity(AICC)：效应细胞和Raji细胞按照效靶比＝50:1混合(细胞数同上)，不加任何抗体。所有对照组设置复孔，每孔终体积为250μL，孵育条件同上。

(5)检测：从培养箱中取出细胞培养板，300×g离心5min,取上清液100μL，置于黑孔平底孔板中，用酶标仪(Moular Devices，M5e)读取荧光强度，设置激发光波长为494nm，发射光波长为517nm。根据荧光强度按照图中所附公司计算ADCC介导溶解细胞百分比。

结果：如图7所示，候选的CD70抗体的ADCC效应均强于参照品Cusat，结果与报告基因法吻合。

实施例11：报告基因法检测候选抗体的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)

(1)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，洗涤后加入适量测活培养基(RPMI1640+0.5％BSA)将细胞重悬至120w/ml，25μL/孔(即3w/孔)铺96孔板。

(2)抗体稀释和加样：用测活培养基稀释hIgG1、Cusat、A9、A15、A36、A47、A83至初始浓度为200nM(29μg/mL)，6倍梯度稀释，12个浓度点，以25μL/孔加样至靶细胞孔板。

(3)效应细胞准备和孵育：取构建的高表达CD32a且导入NFAT-Luciferase荧光报告基因的Jurkat细胞悬液，用DPBS漂洗2次，将细胞密度调整为120w/mL，以25μL/孔加入上述靶细胞孔板，效靶比为1:1。将加好靶细胞、抗体样品和效应细胞的96孔板放入37℃，5％CO₂培养箱内静置培养18小时。

(4)检测：从培养箱中取出细胞培养板，放置15min使其温度恢复至室温。取适量分装好的Bio-Glo^TM Luciferase检测体系(Promega，Cat#G7940)所用底物5′-氟-荧光素，室温平衡15min，以75μL/孔加入各样品孔，混匀后室温避光放置10min，用酶标仪(MoularDevices，M5e)超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果如图8所示，5条候选抗体的ADCP效应均强于参照品Cusat；ADCP效应强度排序：A15、A9>A47>A83>A36>Cusat。

实施例12：巨噬细胞的诱导分化和鉴定

取人外周血单个核细胞(上海儒百生物科技有限公司，Lot#2206208127)，用配制好的1×BD IMag^TM缓冲液(BD Pharmingen，Cat#552362)洗涤，每1×10⁷细胞加入50μLBDIMag^TMAnti-human CD14 Magnetic Particles–DM(BD Pharmingen，Cat#557769)，室温孵育30min。洗涤后的细胞用Cell Separation Magnet分离得到CD14⁺单核细胞，重悬于IMDM培养基(含10％FBS+50μMβ-巯基乙醇+70ng/mL M-CSF)，以每孔1.5×10⁵细胞铺于48孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱，3天后同样培养基补液，继续培养至7天。以0.25％Trpsin-EDTA消化收集1-2孔细胞，计数得到8×10⁴细胞/孔，流式细胞仪鉴定诱导分化的巨噬细胞表型。将human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564219)配制于终浓度为1mg/mL的mouse IgG(Invitrogen，Cat#31903)中作为封闭液，4℃孵育15分钟，分别加荧光素标记的CD11b抗体(Biolegend，Cat#301310)和CD14抗体(eBioscience，Cat#17-0149-42)染色，流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)上样分析。

结果：如图9所示，诱导分化的巨噬细胞都有CD11b和CD14表达，表明诱导分化成功。

实施例13：巨噬细胞法检测候选抗体的ADCP活性

(1)靶细胞准备：取对数生长期Raji细胞，计数并调节细胞密度到8×10⁶/mL。取0.15mM CFSE(BD Pharmingen，Cat#565082)工作液2μL与1mL的DPBS混匀，再加入到1mL上述细胞悬液中混匀，置于37℃培养箱15min后加入等体积即2mL的血清终止反应。细胞洗涤后加入IMDM培养基重悬，调整细胞密度到2×10⁶/mL。

(2)巨噬细胞与靶细胞共孵育：在预先分化巨噬细胞的48孔板(见实施例12)，每孔加入终浓度10μg/mL的候选抗体和参照品Cusat，按照1:5效靶比例加入CFSE标记的Raji细胞，即巨噬细胞细胞量8×10⁴/孔，Raji细胞量4×10⁵/孔，于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h。

(3)流式细胞仪检测：吸取并弃去48孔细胞培养板中上清和悬浮细胞，加入250μL的0.25％Trpsin-EDTA消化液使巨噬细胞从48孔细胞培养板脱离，洗涤，每孔加入0.5μghuman Fc blocker配制于终浓度为1mg/mL的mouse IgG(Invitrogen，Cat#31903)溶液中封闭，然后每孔加入0.2μg的CD11b-APC(Biolegend，Cat#301310)，4℃染色30min；洗涤后每孔加入含0.5μg的7-ADD(BD Pharmingen，Cat#559925)的DPBS/1％FBS孵育5分钟以分辨死活细胞。流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)上样分析，比较去除死细胞和粘连细胞后的CD11b阳性群体中CFSE着色比例。

结果：如图10所示，5条候选抗体都有一定的ADCP活性，但略低于参照品Cusat。

实施例14：候选抗体与SIRPα抗体联用的促吞噬活性

巨噬细胞与CFSE染色的Raji细胞按照1:5效靶比例混合同上(实施例13)。每孔加入终浓度10μg/mL的候选抗体、参照品Cusat和/或终浓度10μg/mL的SIRPα单抗JY47(参考WO2023020459)，于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h。细胞染色和流式细胞仪检测吞噬活性同上(实施例13)。

结果：如图11所示，5条候选抗体单用的ADCP结果同上(图10)；JY47单用无ADCP活性，但候选抗体或参照品Cusat与JY47共同孵育均能提高巨噬细胞的吞噬作用，显示相加效应。

实施例15：候选抗体的补体依赖性细胞毒作用(CDC)

取对数生长期的Raji细胞，洗涤后用测活培养基(RPMI 1640+0.5％BSA)重悬，5w/孔加到96孔板。取候选抗体和参照品Cusat，以测活培养基配制起始浓度为690nM(100μg/mL)，然后进行5倍系列稀释，共9个浓度点，以40μL/孔加到铺有靶细胞的96孔细胞板中，置于4℃孵育1h。用测活培养基将正常人血清2倍稀释，以40μL/孔加入上述靶细胞和抗体孵育的96孔细胞板中，置于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h。

从培养箱中取出细胞培养板待其温度降至室温，取适量分装好的荧光素底物(Promega，Cat#G7572)放置室温平衡，以40μL/孔加入各样品孔，混匀后室温避光放置10min；用酶标仪(Moular Devices，M5e)的超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果：如图12所示，5条CD70候选抗体都有显著的CDC效应，但均弱于参照品Cusat，而A9、A15又弱于A36、A47、A83。

实施例16：候选抗体结合CD70的特异性验证

取对数生长期的Raji细胞，DPBS/1％FBS漂洗两次，在96孔培养板每孔加入5×10⁴细胞，用human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564220)进行封闭。将重组CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)分别与候选抗体(A9、A15、A47)以及参照品Cusat按照终浓度150nM:50nM的比例混合，终体积为100μL，置于37℃孵育15min。将该抗原-抗体混合物或50nM的相应抗体自身分别加入含有Raji细胞的96孔板中，放入37℃，5％CO₂培养箱，孵育15min；DPBS/1％FBS漂洗2次后，每孔分别加入50μL 1:500稀释的AF488标记的羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-546-170)，4℃孵育30min；洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS，流式细胞仪上样检测AF488荧光强度(MFI)。

结果：如图13所示，候选抗体A9、A15、A47及参照品Cusat自身都能结合Raji细胞(左)，这些抗体与CD70-his孵育后便不再结合Raji细胞(右)，说明这些抗体对Raji细胞的结合是CD70特异性的。

实施例17：候选抗体A47体内抗肿瘤活性

Raji细胞在RPMI-1640完全培养基培养(RPMI 1640+10％FBS+1％丙酮酸钠)扩增至P4；于接种前1天更换新鲜培养基，接种当天收获细胞，无添加物RPMI 1640洗涤一遍后制成细胞悬液，密度2×10⁷细胞/mL。CB17.SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号：SCXK(沪)2017-0011，动物检疫合格证编号：20170011008451)皮下接种该细胞悬液100μL，即2×10⁶细胞/Mouse。

将小鼠分成3组，每组5只，在肿瘤接种后第5、8、11、14、17、21天(共计6次)分别给予腹腔注射200μg的A47单抗或参照品Cusat，对照组注射等体积PBS。每周两次测量肿瘤体积。

结果：受试小鼠的肿瘤体积变化如图14所示，接受A47与参照品Cusat的小鼠肿瘤生长曲线无差异，但该两组的肿瘤体积都小于对照组(p<0.05)，表明A47具有一定的肿瘤抑制效果，且与参照品Cusat药效一致。

实施例18：ELISA检测候选抗体与猴CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组猴CD70-his(ACRO，Cat#CDL-C5254)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的4条候选抗体(A15、A24、A36、A47)和参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL1:5000稀释的Goatanti human IgG Fc HRP(Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图15所示，这4条候选抗体都能够与猴CD70很好结合，并且结合活性与参照品Cusat相当。

实施例19：ELISA检测候选抗体与鼠CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组鼠CD70-mFc(SinoBiological Inc.，Cat#51129-M04H)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的4条候选抗体(A15、A24、A36、A47)以及参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:5000稀释的Goat anti human IgG Fc HRP((Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图16所示，所有检测的CD70抗体均不结合鼠CD70。

实施例20：候选抗体A47人源化

A47抗体的序列人源化交由外包服务公司三优生物完成。A47重链和轻链可变区序列分别与人类免疫球蛋白胚系序列库IMGT(Lefranc，2003)进行比对(图17和18)，选择同源度最高的germline IGHV1-46*01和IGKV1-5*01为人源化设计模板，将A47的重链和轻链CDR区(表3)直接替换模板的6个CDR区，然后根据计算机模拟，选择几个可能对维持A47重链和轻链的可变区构象很重要的位点进行回复突变，得到重链可变区序列VH1-VH5，轻链可变区序列VL1-VL3(表4)。将VH1-VH5与VL1-VL3随机配对后得到10条人源化抗体与鼠源母本A47进行比较并筛选，它们是huVH1-huVL1、huVH2-huVL1、huVH2-huVL2、huVH2-huVL3、huVH3-huVL2、huVH3-huVL3、huVH4-huVL2、huVH4-huVL3、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3。

表3.A47可变区的CDR序列

表4.A47人源化序列及回复突变

实施例21：ELISA检测人源化抗体与人CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的10条人源化候选抗体、鼠源母本抗体A47和参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:5000稀释的Goat anti human IgG Fc HRP(Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图19所示，人源化抗体与CD70有非常好的结合活性，与鼠源母本A47和参照品Cusat很接近。

实施例22：ELISA检测人源化抗体与猴CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组猴CD70-his(ACRO，Cat#CDL-C5254)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的10条人源化候选抗体、鼠源母本抗体A47和参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:5000稀释的Goat anti human IgG Fc HRP(Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图20所示，所有人源化抗体都能够与猴CD70很好结合，并且结合活性与参照品Cusat相当。

实施例23：ELISA检测人源化抗体与鼠CD70的结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组鼠CD70-mFc(SinoBiological Inc.，Cat#51129-M04H)，4℃包被过夜。封闭后，将梯度稀释的10条人源化候选抗体、鼠源母本抗体A47和参照品Cusat加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL 1:5000稀释的Goat anti human IgG Fc HRP(Invitrogen，Cat#A18823)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪(Moular Devices，M5e)读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图21所示，所有检测的CD70抗体均不结合鼠CD70。

实施例24：ELISA检测人源化抗体阻断CD70-CD27结合

取Maxisorp ELISA 96孔板，加入100μL的1μg/mL的重组CD70-his(ACRO，Cat#CDL-H52Da)，4℃包被过夜。封闭后，将等摩尔浓度梯度稀释的10条人源化抗体、鼠源母本抗体A47和参照品Cusat分别与0.2μg的重组人biotin-CD27(ACRO，Cat#TN7-H82F6)混合，加入到包被的微孔板中，室温孵育1h。洗板后，各孔加入100μL1:2500稀释的Streptavdin-HRP(Invitrogen，Cat#434323)，孵育1h后，TMB(Beyotime，Cat#P0209)显色，酶标仪读取波长450的OD值(OD₄₅₀)。

结果：如图22所示，所有人源化抗体均能够阻断CD70和CD27结合。

实施例25：FACS检测人源化抗体结合Raj i细胞

取对数生长期的Raji细胞，DPBS/1％FBS漂洗2次，计数后以每孔1.5×10⁴(30μL)细胞加入96孔板，经human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564220)封闭后，每孔分别加入50μL梯度稀释的10条人源化候选抗体、鼠源母本抗体A47和参照品Cusat，4℃孵育30min。洗涤细胞后，每孔加入0.1μg AF488标记的羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-546-170)，4℃孵育30min；洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS，流式细胞仪上样检测AF488荧光强度(MFI)。

结果：如图23所示，人源化抗体与Raji细胞结合活性与鼠源母本抗体A47或参照品Cusat相似。

实施例26：FACS检测人源化抗体阻断CD70-CD27结合的能力

取对数生长期的Raji细胞，DPBS/1％FBS漂洗两次，计数后以每孔1.5×10⁴(30μL)细胞加入96孔U型培养板，经human Fc blocker(BD Pharmingen，Cat#564220)封闭后，加0.5μg/孔biotin-CD27(ACRO，Cat#TN7-H82F6)和梯度稀释的10条人源化抗体或参照品Cusat，于4℃孵育30min。洗涤后各孔加入0.2μg Streptavidin-PE(BD Pharmingen，Cat#554061)，洗涤后加入50μL的DPBS/1％FBS重悬细胞，流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)上样检测PE荧光强度(MFI)。

结果：如图24所示，人源化抗体能够阻断CD27结合Raji细胞，其中huVH5-huVL2、huVH4-huVL2、huVH5-huVL3阻断效果较好，且huVH5-huVH2略优于鼠源母本抗体A47和参照品Cusat。图24A为Raji胞膜上biotin-CD27结合Streptavidin-PE所检测的MFI；图24B为根据MFI按照所附公式换算的阻断率。

实施例27：报告基因法检测人源化抗体的ADCC活性

基于上述结合和阻断活性检测结果，挑选出3条A47人源化抗体(huVH4-huVL2、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3)继续进行功能活性的比较。首先利用报告基因法检测抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。具体实验操作过程如下：

(1)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，洗涤后加入适量测活培养基(RPMI1640+0.5％BSA)将细胞重悬至120w/mL，25μL/孔铺96孔板(3w/孔)。

(2)抗体稀释和加样：取Cusat、A47、huVH4-huVL2、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3以及hIgG1，分别用测活培养基稀释至初始浓度为200nM(29μg/mL)，6倍稀释，12个浓度点，25μL/孔加样。

(4)检测：从培养箱中取出细胞培养板，放置15min使其温度恢复至室温。取适量分装好的Bio-Glo^TM Luciferase底物5′-氟-荧光素(Promega，Cat#G7940)室温平衡15min，以75μL/孔加样，混匀后室温避光放置10min，用酶标仪(Moular Devices，M5e)超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果：如图25所示，3条人源化抗体与鼠源母本A47的ADCC效应都很接近，略高于参照品Cusat。

实施例28：PBMC法检测人源化抗体的ADCC活性

(1)效应细胞准备：正常供者PBMC(上海儒百生物科技有限公司，Lot#2206208127)加入含终浓度为0.5μg/mL IL-2(Gibco，Cat#PHC0026)的RPMI 1640+10％FBS完全培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中孵育5天。收获悬浮细胞，洗涤、计数、用完全培养基调整细胞密度到500w/mL。

(2)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，细胞洗涤后加入完全培养基重悬，加入Calcein AM(Beyotime，Cat#C2013M)，染色比例按每100w细胞加20μL Calcein AM；37℃孵育30分钟，细胞洗涤后用完全培养基重悬细胞，以每孔100μL含1×10⁴细胞铺于96孔U型培养板；

(3)抗体稀释、加样和孵育：将Cusat、A47、huVH4-huVL2、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3以及hIgG1稀释至345nM(终浓度69nM)，6倍梯度稀释，7个浓度点，以50μL/孔加入含靶细胞的96孔板中。每孔加入上述效应细胞100μL，即2×10⁵细胞/孔(效靶比＝20:1)，放入37℃，5％CO₂培养箱中，孵育2h。

(4)对照设置：

spontaneous release：只有靶细胞Raji；

maximum release：靶细胞Raji与10μL TritonX-100(VWR，Cat#0694-1L)；

Antibody-independent cell-mediated cytotoxicity(AICC)：靶细胞Raji和效应细胞按照效靶比＝50:1混合(细胞数同上)，不加任何抗体。

所有对照组设置复孔，每孔终体积为250μL，孵育条件同上。

(5)检测：从培养箱中取出细胞培养板，300×g离心5min,取上清液100μL，置于黑孔平底孔板中，用酶标仪(Moular Devices，M5e)检测荧光强度，设置激发光波长为494nm，发射光波长为517nm；按所附公式计算ADCC。

结果：如图26所示，人源化抗体的ADCC效应均强于参照品Cusat，其中，huVH4-huVL2的ADCC效应最强，huVH5-huVL2和huVH5-huVL3与鼠源母本A47的ADCC效应接近。

实施例29：报告基因法检测人源化抗体ADCP活性

(1)靶细胞准备：取对数生长期的Raji细胞，细胞洗涤后加入适量测活培养基(RPMI 1640+0.5％BSA)将细胞重悬至120w/mL，25μL/孔(即3w/孔)铺96孔板。

(2)抗体稀释和加样：用测活培养基稀释Cusat、A47、huVH4-huVL2、huVH5-huVL2、huVH5-huVL3以及hIgG1至初始浓度为200nM(29μg/mL)，6倍稀释，12个浓度点，以25μL/孔加样至靶细胞孔板。

(4)检测：从CO₂培养箱中取出细胞培养板，放置15min使其温度恢复至室温。取适量分装好的Bio-Glo^TM Luciferase底物5′-氟-荧光素(Promega，Cat#G7940)室温平衡15min，以75μL/孔加入各样品孔，混匀后室温避光放置10min，用酶标仪(Moular Devices，M5e)超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果如图27所示，人源化抗体的ADCP效应均强于参照品Cusat，但略低于鼠源母本A47。

实施例30：巨噬细胞法检测人源化抗体的ADCP活性

靶细胞的CFSE染色、巨噬细胞制备以及效靶比例(1:5)同上(实施例13)。每孔加入终浓度10μg/mL的人源化抗体、鼠源母本A47、参照品Cusat和/或终浓度10μg/mL的SIRPα单抗JY47，于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h。细胞染色和流式细胞仪检测吞噬活性同上(实施例13)。

结果：如图28所示，人源化抗体单用有明显的促吞噬作用，但促吞噬效果略低于鼠源母本抗体A47和参照品Cusat。JY47单用无ADCP活性，但能提高所有检测的CD70抗体包括参照品Cusat的促进巨噬细胞吞噬作用，显示相加效应。

实施例31：人源化抗体的CDC活性检测

取对数生长期的Raji细胞，洗涤后用测活培养基(RPMI 1640+0.5％BSA)重悬，5w/孔加到96孔板。取候选抗体和参照品Cusat，以测活培养基配制起始浓度为690nM(100μg/mL)，然后进行3倍系列稀释，9个浓度点，以40μL/孔加到铺有靶细胞的96孔细胞板中，置于4℃孵育1h。用测活培养基将正常人血清2倍稀释，以40μL/孔加入上述靶细胞和抗体孵育的96孔细胞板中，置于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h。

从培养箱中取出细胞培养板待其温度降至室温，取适量分装好的荧光素底物(Promega，Cat:#G7572)放置室温平衡，以40μL/孔加入各样品孔，混匀后室温避光放置10min；用酶标仪(Moular Devices，M5e)的超灵敏化学发光(Luminescence)检测模块读取化学发光强度。

结果：如图29所示，人源化候选抗体都有显著的CDC效应，虽然稍弱于参照品Cusat。

实施例32：CD70抗体的诱导内吞效应分析

(1)抗体标记：利用pHrodo(Invitrogen，Cat#Z25611)染料在进入细胞内pH值低的溶酶体内才显示荧光的特点，将待检抗体标记该染料可在流式细胞仪上检测其内吞情况。使用RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)稀释待检抗体huVH4-huVL2、huVH5-huVL2以及鼠源母本A47、参照品Cusat或IgG1至终浓度160nM、稀释pHrodo母液12.5倍，将稀释的抗体与稀释后pHrodo按照1:1混匀，37℃培养箱孵育10min。

(2)抗体内吞检测：取对数生长期Raji细胞以RPMI 1640完全培养基悬浮并调整细胞密度，以每孔1×10⁵铺于96孔板，置于4℃降温后，加入50μL抗体-pHrodo标记复合物，4℃孵育30分钟，此时收集细胞为0小时样品，洗涤后存放于冰上待测。其余细胞孔板移入37℃5％CO₂培养箱孵育，分别于3、6、24和48h收集细胞，洗涤后存放于冰上待测。集中全部样品流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX)上样分析。

结果：如图30所示，相较于IgG1对照，随着37℃孵育时间延长，所有检测的CD70抗体都有一定内吞作用。

实施例33：CD70抗体的体内抗肿瘤活性

Raji细胞在RPMI 1640完全培养基培养(RPMI 1640+10％FBS+1％丙酮酸钠)扩增至P4；于接种前1天更换新鲜培养基，接种当天收获细胞，无添加物RPMI 1640洗涤一遍后制成细胞悬液，密度1×10⁷细胞/mL。CB17.SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号：SCXK(沪)2017-0011，动物检疫合格证编号：20170011008451)皮下接种该细胞悬液100μL，即1×10⁶细胞/Mouse。

将小鼠分成5组，每组6只，在肿瘤接种后第5、8、12、15、19、22天(共计6次)分别给予腹腔注射200μg的huVH4-huVL2(H4L2)、huVH5-huVL2(H5L2)以及鼠源母本A47、参照品Cusat，对照组注射等体积PBS。每周两次测量肿瘤体积。

结果：受试小鼠的肿瘤体积变化如图31A所示，PBS对照组小鼠的肿瘤体积到61天全部达到安乐死界限(3000mm³)，而接受H4L2抗体的小鼠的肿瘤生长明显减慢。图31B为小鼠生存曲线，接受H4L2、A47与参照品Cusat的小鼠的生存期比对照组显著延长(**p<0.01)，表明H4L2、A47与参照品Cusat都具有一定的肿瘤抑制效果，而H4L2药效最佳。

表5.优选抗体全长序列

Claims

1.靶向CD70的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：43所示一致的氨基酸序列；

(c)重链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：39、SEQID NO：41或SEQ ID NO：44所示一致的氨基酸序列；

(f)轻链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37或SEQID NO：42所示一致的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含：

(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQID NO：29和SEQ ID NO：30所示一致的氨基酸序列；

(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(c)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQID NO：29和SEQ ID NO：37所示一致的氨基酸序列；

(d)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38和SEQ IDNO：39所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(e)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：41所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(f)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQID NO：29和SEQ ID NO：42所示一致的氨基酸序列；

(g)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQID NO：29和SEQ ID NO：37所示一致的氨基酸序列；

(h)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：27所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：28、SEQID NO：29和SEQ ID NO：30所示一致的氨基酸序列；

(i)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43和SEQ IDNO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(j)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38和SEQ IDNO：39所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；

(k)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：43和SEQ IDNO：32所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列；或

(l)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：44所示一致的氨基酸序列，轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3具有分别与SEQ ID NO：33、SEQID NO：34和SEQ ID NO：35所示一致的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含重链和轻链可变区序列：

(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48或SEQ ID NO：49所示一致的氨基酸序列；

(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52所示一致的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，其包含重链和轻链可变区序列：

5.靶向CD70的单克隆抗体，其包含：

(a)重链，其序列与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列一致；轻链，其序列与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列一致；或

(b)重链，其序列与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列一致；轻链，其序列与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列一致。

6.根据权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体进一步制备为ADC药物。

7.编码权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子。

8.包含权利要求7所述核酸分子的表达载体。

9.包含权利要求8所述表达载体的宿主细胞。

10.权利要求1-5任一项所述的靶向CD70的单克隆抗体或抗体片段单独或联合靶向CD47/SIRPα的抗体在制备治疗肿瘤疾病的药物中的用途。