MX2007004459A

MX2007004459A - Composiciones de factor de crecimiento derivados de plaquetas.

Info

Publication number: MX2007004459A
Application number: MX2007004459A
Authority: MX
Inventors: Samuel E Lynch
Original assignee: Biomimetic Therapeutics Inc
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2007-08-14
Also published as: US20170072107A1; ES2346457T3; NZ554511A; PT1812076E; US20170014545A1; US9545377B2; ZA200703515B; US11318230B2; AU2005295919A1; CN105561384A; US20170072108A1; CA2583823A1; EP1812076A2; JP5137577B2; CN101198343A; US20060084602A1; US20220072204A1; US20170014482A1; BRPI0516105A; KR20070095288A

Abstract

Un metodo para promover el crecimiento de hueso, periodontio, ligamento o cartilago en un mamifero mediante aplicar al hueso, periodontio, ligamento o cartilago una composicion que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta a una concentracion en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL en un portador liquido farmaceuticamente aceptable y un portador solido farmaceuticamente aceptable.

Description

COMPOSICIONES DE FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADOS DE PLAQUETAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al sanado de hueso y tejidos conectores .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los factores de crecimiento son proteínas que aglutinan a receptores sobre una superficie de celda, con el resultado primario de activar la proliferación celular y/o diferenciación celular. Muchos factores de crecimiento son muy versátiles, estimulando la división celular en numerosos tipos de células diferentes; mientras que otros son específicos a un tipo de célula particular. Los ejemplos de los factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , los factores de crecimiento de tipo- insulina IGF- 1 y II) , el factor de crecimiento de transformación beta (TGF-ß) , el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , y el factor de crecimiento fibroblasto (FGF) . El factor de crecimiento derivado de plaqueta es una proteína estable al calor y catiónica encontrada en una variedad de tipos de células, incluyendo los granulos de plaquetas circulantes, células de músculo suave vasculares, células endoteliales, macrófago, y queratinocitos, y se conoce porque estimula la síntesis de proteína in Vitro y la producción de colágeno por los fibroblastos. También se conoce porque actúa como un mitógeno in Vitro y un agente quemotáctico para los fibroblastos, las células de músculo suave, los osteoblastos y las células glial.

El PDGF-BB humano recombinante (rhPDGF-BB) ha mostrado el estimular el sanado de heridas y la regeneración de hueso en ambos los animales y los humanos . Este se aprobó en ambos los Estados Unidos de América y en Europa para el uso humano en las aplicaciones tópicas para acelerar el sanado de heridas de pie de diabético crónicas. El hPDGF-BB recombinante también se ha mostrado que se efectivo ya sea en forma singular o en combinación con otros factores de crecimiento para mejorar la regeneración periodontal, por ejemplo, el crecimiento de nuevo de hueso, cementum y ligamento alrededor de los dientes (por ejemplo, véase la patente de los Estados Unidos de América número 5,124,316, incorporada aquí por referencia) .

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN Nosotros hemos ahora demostrado que una dosis baja de rhPDGF (-0.1 a 1.0 mg/mL) promueve la reparación del hueso, periodontio, ligamento y cartílago. Una cantidad baja de factor de crecimiento derivado de plaqueta o mano recombinante puede ser absorbida por ß-TCP, el cual puede ser implantado en el sitio de reparación, de manera que el rhPDGF es liberado en vivo. La adición del rhPDGF al ß-TCP se ha mostrado que mejora la sujeción de célula de osteoblasto y la ploriferación en combinación al ß-TCP no tratado.

En un primer aspecto, la invención presenta un método para promover el crecimiento de hueso, periodontio, ligamento o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano mediante el administrar un material de implanto que contiene un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración de menos de alrededor de 1.0 mg/ml, de manera que el material de implanto promueve el crecimiento del hueso, periodontio, ligamente o cartílago. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es administrado en una cantidad de menos que o igual a 0.3 mg/ml. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es administrado en una cantidad en el rango de alrededor de 0.1 a alrededor de 1.0 mg/ml. En varias incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es administrado en una cantidad de entre alrededor de 0.2 a alrededor de 0.75 mg/ml, a alrededor de 0.25 a alrededor de 0.6 mg/ml, y a alrededor de 0.25 a alrededor de 0.5 mg/ml. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es administrado en una cantidad de alrededor de 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, ó 1.0 mg/ml, preferiblemente 0.3 mg/mL. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es ya sea parcial o esencialmente purificado. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está aislado o purificado de otras contaminantes. En una incorporación adicional, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de implanto con la administración a una tasa promedio de 0.3 mg/día. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de implanto con la administración a tasa promedio de 300 µg/día. En aún otras incorporaciones, el factor de crecimiento de plaqueta es liberado del material de implanto a una tasa promedio de menos de alrededor de 100 µg/día, menos de 50 µg/día, menos de 10 µg/día, o menos de 1 µg/día. Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es derivado sobre unos pocos días, por ejemplo 1, 2, 5, 10, 15, 20 ó 25 días, o hasta 28 días o más.

Un segundo aspecto de la invención presenta un método para promover el crecimiento de hueso, periodontio, ligamento, o cartílago en una mamífero, por ejemplo, un humano mediante el administrar un material de implanto que contiene una cantidad de factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) de menos de alrededor de 1.0 mg/ml y un portador farmacéuticamente aceptable de manera que el material de implanto promueve el crecimiento del hueso, del periodontio, del ligamento o cartílago y permite crecer el hueso, periodontio, ligamento o cartílago. Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es igual a o menor de alrededor de 0.3 mg/ml. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaquete es administrado en un rango de alrededor de 0.1 a 1.0 mg/ml. En otras incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.1 mg/ml, de 0.3 mg/ml, o de 1.0 mg/ml, preferiblemente 0.3 mg/mL. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está ya sea parcial o esencialmente purificado. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está aislado o purificado de otros contaminantes. Antes de administrar el material de implanto al mamífero, el método puede adicionalmente incluir el paso de producir una aleta quirúrgica de piel para exponer el hueso, periodontio, ligamento o cartílago, y después el paso de administración, reemplazando la aleta. En aún otra incorporación, después de producir la aleta quirúrgica, pero antes de administrar el material de implanto en el hueso, periodontio, el ligamento o cartílago, el método puede adicionalmente incluir el paso de planear que el hueso o peradontio remueve la materia orgánica del hueso o periodontio. En otra incorporación, el método promueve el crecimiento del hueso dañado o enfermo, periodontio, ligamento o cartílago. En aún otra incorporación, el método promueve el crecimiento del hueso en ubicaciones en donde es requerida una nueva formación de hueso como resultado de intervenciones quirúrgicas, tal como por ejemplo, la extracción de dientes, el aumento de estreado, el injerto estético y el levantamiento de seno.

Un tercer aspecto de la invención presenta un material de implanto para mover el crecimiento de hueso, perodontio, ligamento o cartílago en una mamífero, por ejemplo, un humano. El material de implanto incluye un portador f rmacéuticamente aceptable (por ejemplo un aglutinante biocompatible, un agente de sustitución de hueso, un líquido o un gel) y un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , el cual está presente a una concentración de menos de alrededor de 1.0 mg/mL. Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está presente en el material de implanto a una concentración igual a o menor d e?.3 mg/ml. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es administrado en un rango de alrededor de 0.1 a 1.0 mg/ml. En otras incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml ó 1.0 mg/ml, preferiblemente 0.3 mg/mL. En una incorporación el material farmacéuticamente aceptable del material de injerto incluye una matriz que consiste de un aglutinante biocompatible (por ejemplo carboximetilcelulosa) o un agente de sustitución de hueso (ß-TCP) que es capaz de absorber una solución que incluye el factor de crecimiento derivado de plaqueta (por ejemplo una solución que contiene factor de crecimiento derivado de plaqueta a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL) . En otra incorporación, el portador farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad de la solución de factor de crecimiento derivado de plaqueta que es igual a por lo menos de alrededor de 25% de su propio peso. En otras incorporaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad de la solución del factor de crecimiento derivado de plaqueta que es igual a o por lo menos de alrededor de 50%, 75%, 100%, 200%, 250%, ó 300% o su propio peso. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es absorbido por el portador farmacéuticamente aceptable del material de implanto mediante el empapar el portador farmacéuticamente aceptable en una solución que contiene factor de crecimiento derivado de plaqueta. Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está presente en la solución a una concentración de menos de alrededor de 1.0 mg/mL. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está presente en la solución a una concentración igual o menor de alrededor de 0.3 mg/ml. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está presente en la solución a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 a 1.0 mg/ml. En aún otras incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está presente en la solución en una cantidad de alrededor de 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, ó 1.0 mg/ml, preferiblemente 0.3 mg/mL. En otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está ya sea parcial o esencialmente purificado. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta está aislado o purificado de otros contaminantes.

Un cuarto aspecto de la invención presenta un método para preparar un material de injerto para promover el crecimiento de hueso, periodontio, ligamento o cartílago en un mamífero, por ejemplo, un humano. El método incluye el paso de combinar un factor de crecimiento derivado de plaqueta purificada o parcialmente purificada (PDGF) en una cantidad de menos de alrededor de 1.0 mg/mL, con una sustancia portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es combinado con una sustancia portador farmacéuticamente aceptable a una concentración igual o menor de alrededor de 0.3 mg/ml. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es combinado con una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable en una cantidad en el rango de alrededor de 0.1 a 1.0 mg/ml. En otras incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es mezclado en la cantidad de 0.1 mg/ml 0.3 mg/ml, ó 1.0 mg/ml. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es mezclado en la cantidad de 0.3 mg/ml. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es absorbido por el portador farmacéuticamente aceptable para producir el material de injerto.

Un quinto aspecto de la invención presenta un factor de crecimiento derivado de plaqueta teniendo un frasco (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL en un líquido farmacéuticamente aceptable. En una incorporación de este aspecto de la invención, el líquido es un amortiguador de acetato de sodio estéril, el recipiente contiene factor de crecimiento derivado de plaqueta a una concentración de alrededor de 0.3 mg/mL. En aún otra incorporación preferida, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es factor de crecimiento derivado de plaqueta-BB. En aún otra incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es estable en el amortiguador de acetato de sodio por lo menos por alrededor de 12 meses, preferiblemente por lo menos alrededor de 18 meses, más preferiblemente por lo menos alrededor de 24 meses, y más preferiblemente por lo menos alrededor de 36 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de alrededor de 2°C a 80°C.

En un sexto aspecto de la invención, ésta presenta un material de injerto que incluye un fosfato de calcio poroso que tiene adsorbido ahí un líquido que contiene un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL. En varias incorporaciones, la concentración del factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.3 mg/mL, el fosfato de calcio es seleccionado de fosfato tricalcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio y fosfato octacalcio, y el factor de crecimiento derivado de plaqueta es proporcionado en un líquido estéril, por ejemplo, amortiguador de acetato de sodio.

En un séptimo aspecto de la presente invención, ésta presenta un método para preparar un material de injerto mediante el saturar un material de fosfato de calcio en un líquido estéril que incluye un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL. En varias incorporaciones, la concentración del factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.3 mg/mL, el fosfato de calcio es seleccionado de fosfato tricalcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio y fosfato octacalcio.

En una incorporación de todos los aspectos de la invención, el factor de crecimiento derivado de plaqueta incluye homo- y heterodímeros de factor de crecimiento derivado de plaqueta, por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD, y combinaciones y derivados de los mismos.

En una incorporación de todos los aspectos de la invención, la sustancia portadora farmacéuticamente aceptable del material de injerto es o adicionalmente incluye una o más de los siguientes: un aglutinante biocompatible (por ejemplo, un polímero natural o sintético) , un agente de sustitución de hueso, un líquido y un gel. En otra incorporación preferida, el material de implante incluye un factor de crecimiento derivado de plaqueta presente en un portador líquido farmacéuticamente aceptable el cual es absorbido por un portador sólido farmacéuticamente aceptable.

En otra incorporación de todos los aspectos de la invención, el material de injerto es preparado mediante el combinar un factor de crecimiento derivado de plaqueta aislado, parcialmente purificado, esencialmente purificado, o purificado en una cantidad en el rango de 0.1 a 1.0 mg/ml, o más preferiblemente de 0.2 mg/ml, de 0.3 mg/ml, o de 1.0 mg/ml, más preferiblemente 0.3 mg/ml, o aún menos de 0.1 mg/ml, con una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un aglutinante biocompatible, tal como un polímero naturia o sintético (por ejemplo, colágeno, ácido poliglicólico, y ácido poliláctico) , un agente de sustitución de hueso (por ejemplo, fosfato de calcio (por ejemplo fosfato tricalcio ó hidroxiapatita) , sulfato de calcio, o hueso desmineralizado (por ejemplo, hueso canceloso o córtico secado y congelado) o un gel o líquido comercialmente disponible (por ejemplo, un gel o líquido viscoso o inerte) .

En varias incorporaciones, la sustancia portadora del material de injerto es o adicionalmente incluye uno o más aglutinantes biocompatibles. Un aglutinante biocompatible es un agente que produce o promueve la cohesión entre las sustancias combinadas. Los ejemplos no limitantes de los aglutinantes biocompatibles adecuados incluyen los polímeros seleccionados de polisacaridos, ácidos nucleicos, carbohidratos, proteínas, polipéptidos, poli (a-hidroxi ácidos), poli (lactosas) , poli (amino ácidos), poli (anhídridos) , poli (orotoésteres) , poli (anhídrido-co-imidas) , poli (ortocarbonatos) , poli (a-hidroxi alcanoatos), poli (dioxanonas) , poli (fosfoésteres) , ácido poliláctico, poli (L-láctido) (PLLA) , poli (D, L-láctido) (PDLLA) , poliglilido (PGA) , poli (láctido-co-glicolido (PLGA), poli (L-láctido-co-D, L-láctido) , poli (D, L- láctido-co-trimetileno carbonato) , ácido poliglicólido, polihidroxibutirato (PHB) , poli (e -caprolactona) , poli (d-valerolactona) , poli (?-butirolactona) , poli (caprolactona) , ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli (hidrocloruro de alilamina) , poli (cloruro de dialildimetilamonio) , poli (etileneimina) , fumarato de polipropileno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbón, poli(etilen glicol9, poli(óxido de etileno), poli (alcohol de vinilo), poli (vinil pirrolidona), poli (etiloxazolina) , poli (óxido de etileno) -co-poli (óxido de propileno) copolímeros de bloque, poli (tereftalato de etileno) poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos. Los aglutinantes adicionales incluyen ácido algínico, goma arábica, goma guar, goma xantano, gelatina, quitina, quitosana, acetato de quitosana, lactato de quitosana, sulfato de condroitina, N,0-carboximetil quitosana, un dextran (por ejemplo, a- ciclodextrina, ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina, o sulfato dextran de sodio), pegamento de fibrina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, una celulosa (por ejemplo, metilcelulosa, carboxi metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, o hidroxietil celulosa) , una glucosalina, un proteoglican, un almidón (por ejemplo almidón de hidroxietilo o almidón soluble) , ácido láctico y plurónico, un glicerofosfato de sodio, colágeno, glicogen, una queratina, seda y derivados y mezclas de los mismos. En algunas incorporaciones, el aglutinante biocompatible es soluble en agua. Un aglutinante soluble en agua se disuelve desde el material de injerto poco después de la implantación en vivo, por tanto introduciendo la macroporosidad adentro del material de injerto. Esta macroporosidad aumenta la osteoconductividad del material de injerto mediante el mejorar el acceso, y consecuentemente, remodelar la actividad de los osteoclastos y osteoblastos en el sitio de injerto.

El aglutinante bicompatible puede ser agregado al material de injerto en cantidades variables y en una variedad de fases durante la preparación de la composición. Aquellos expertos en el arte serán capaces de determinar la cantidad de aglutinante y el método de inclusión requerido para una aplicación dada.

En una incorporación, la sustancia portadora es o incluye un líquido seleccionado de agua, un amortiguador y un medio de cultivo de célula. El líquido puede ser usado en cualquier rango de pH pero más frecuente será usado en el rango de pH de 5.0 a un pH de 8.0. En una incorporación, el pH será compatible con la estabilidad prolongada y la eficacia del factor de crecimiento derivado de plaqueta presente en el material de injerto, o con la estabilidad prolongada y la eficacia de otro agente biológicamente activo deseado. En la mayoría de las incorporaciones, el pH del líquido estará en el rango de un pH de 5.5 a un pH de 7.4. Los amortiguadores adecuados incluyen, pero no se limitan, a los carbonatos, fosfatos (por ejemplo, agua salada amortiguada con fosfato), y amortiguadores orgánicos tales como Tris, HEPES, y MOPS. Más frecuentemente, el amortiguador será seleccionado por su biocompatibilidad con los tejidos anfitriones y su compatibilidad con el agente biológicamente activo. Para la mayoría de las aplicaciones en las cuales están incluidos los ácidos nucleicos, péptidos o antibióticos en el material de injerto, será suficiente una simple agua salda amortiguada con fosfato .

En otra incorporación de todos los aspectos de la invención, la sustancia portadora del material de injerto es o adicionalmente incluye uno o más agentes de sustitución de hueso. Un agente de sustitución de hueso es uno que puede ser usado para reemplazar el hueso permanentemente o temporalmente .

Después del injerto, el agente de sustitución de hueso puede ser retenido por el cuerpo o este puede ser re-absorbido por el cuerpo y reemplazado con hueso. El agente de sustitución de hueso de ejemplo incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio (por ejemplo, fosfato tricalcio (por ejemplo, ß-TCP) , hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato de dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio y fosfato de octalcio) , sulfato de calcio o hueso desmineralizado (por ejemplo, hueso canceloso o cortical seco-congelado y desmineralizado) ) . En una incorporación, la sustancia portadora es bioreabsorbible . En otra incorporación, el agente de sustitución de hueso se proporciona como una matriz de partículas de tamaño de miera o de sub-micra, por ejemplo, partículas de tamaño nano. Las partículas pueden estar en el rango de alrededor de 100 µm, a alrededor de 5,000 µm en tamaño, más preferiblemente en el rango de alrededor de 200 µm a alrededor de 3,000 µm, y más preferiblemente en el rango de alrededor de 250 µm a alrededor de 2,000 µm, o las partículas pueden estar en el rango de alrededor de 1 nm a alrededor de 1,000 nm, preferiblemente de menos de alrededor de 500 nm, y más preferiblemente de menos de alrededor de 250 nm. En otra incorporación, el agente de sustitución del hueso tiene una composición porosa. La porosidad de la composición es una característica deseable ya que facilita la migración de célula y la infiltración adentro de la composición de manera que las células pueden segregar una matriz de hueso extracelular. También proporciona acceso para la vascularización. La porosidad también proporciona un área de superficie alta para una re-absorción mejorada y liberación de sustancias activas así como una interacción de célula-matriz incrementada. Preferiblemente, la composición tiene una porosidad de más de 40%, más preferiblemente de más de 65% y más preferiblemente de más de 90%. La composición puede ser proporcionada en una forma adecuada para la implantación (por ejemplo, una esfera, un cilindro, o un bloque), ó esta puede ser dimensionada y conformada antes del uso. En una incorporación preferida, el agente de sustitución de hueso es fosfato de calcio (por ejemplo, ß-TCP) .

El agente de sustitución de hueso también puede ser proporcionado como una pasta o masa fluible o moldeable. Preferiblemente, el agente de sustitución de hueso es una pasta de fosfato de calcio que se auto-endurece para formar un fosfato de calcio endurecido antes de o después de la implantación en vivo. El componente de fosfato de calcio de la invención puede ser cualquier material de fosfato de calcio biocompatible conocido en el arte. El material de fosfato de calcio puede ser producido por uno cualquiera de una variedad de métodos y usando cualquier componentes de inicio adecuados. Por ejemplo, el material de fosfato de calcio puede incluir fosfato de calcio apatítico amorfo. El material de fosfato de calcio puede ser producido por una reacción de base-ácido de estado sólido de reactivos de fosfato de calcio cristalino para formar sólidos de hidroxiapatita cristalina. Otros métodos para hacer los materiales de fosfato de calcio son conocidos en el arte, algunos de los cuales están descritos abajo.

El material de fosfato de calcio puede ser un fosfato de calcio apatítico pobremente cristalino (PCA) o hidroxiapatita (HA) . El material PCA está descrito en las patente de los Estados Unidos de América números 5,650,176; 5,783,217; 6,027,742; 6,214,368; 6,287,341; 6,331,312; y 6,541,037, todas las cuales son incorporadas aquí por referencia. La hidroxiapatita está descrita por ejemplo en las patentes de re-expedición números 33,221 y 33,161. Estas patentes muestran la preparación de las composiciones de remineralización de fosfato de calcio y de material portador de hidroxiapatita gradualmente re-abosrbible no cerámico finamente cristalino basado sobre la misma composición de fosfato de calcio. Un sistema de fosfato de calcio similar, el cual consiste de fosfato tetracalcio (TTCP) y fosfato monocalcio (MCP) o su forma de monohidrato (MCPM) , está descrito en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,053,212 y 5,129,905. Este material de fosfato de calcio es producido por una reacción de base-ácido de estado sólido de los reactivos de fosfato de calcio cristalino para formar los sólidos de hidroxiapatita cristalina.

Los materiales cristalinos (comúnmente mencionados como dahllita) , pueden ser preparados de manera que éstos sean fluibles, moldeables y capaces de endurecerse en el lugar (por ejemplo, vea la patente de los Estados Unidos de América número 5,962,028). Estos materiales de hidroxiapatita (comúnmente mencionados como hidroxiapatita carbonatada) pueden ser formados mediante el combinar los reactivos con el líquido no acuoso para proporcionar una mezcla esencialmente uniforme, conformando la mezcla como apropiada y permitiendo a la mezcla el endurecerse en la presencia de agua (por ejemplo, antes o después de la implantación) . Durante el endurecimiento, la mezcla se cristaliza en un sólido y en una estructura apatítica esencialmente monolítica.

Los reactivos generalmente consisten de una fuente de fosfato, por ejemplo, ácido fosfórico o sales de fosfato, esencialmente libres de agua, un metal alquilo terreo, particularmente calcio, fuente, opcionalmente núcleos cristalinos, particularmente hidroxiapatita o cristales de fosfato de calcio, carbonato de calcio y/o un lubricante fisiológicamente aceptables, tal como cualquiera de los líquidos no acuosos descritos ahí. Los ingredientes secos pueden ser preparados previamente como una mezcla y ser combinados subsecuentemente con los ingredientes líquidos no acuosos bajo condiciones en donde ocurre el mezclado en forma esencialmente uniforme.

El material de fosfato de calcio está caracterizado por su re-absorción biológica, su biocompatibilidad y su cristalinidad mínima. El carácter cristalino es esencialmente el mismo que el del hueso natural. Preferiblemente, el material de fosfato de calcio se endurece en menos de cinco horas, y esencialmente se endurece alrededor de uno a cinco horas, bajo condiciones fisiológicas. Preferiblemente, el material es endurecido esencialmente dentro de alrededor de 10-30 minutos. La tasa de endurecimiento bajo condiciones fisiológicas puede ser variada de acuerdo a 1 necesidad terapéutica mediante el modificar unos pocos parámetros simples como se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 6,027,742 la cual se incorpora aquí por referencia.

En una incorporación, el material de fosfato de calcio bioabsorbible resultante será un "deficiente de calcio" , con una proporción molar de calcio a fosfato de menos de alrededor de 1.6 en comparación al valor estoiquiométrico ideal de aproximadamente de 1.67 para la hidroxiapatita.

Los fosfatos de calcio deseables son capaces de endurecerse en un ambiente húmedo, a o alrededor de la temperatura del cuerpo en menos de 5 horas y preferiblemente dentro de 10-30 minutos. Los materiales deseables son aquellos que, cuando se implantaron como una pelotilla de 1-5 g son por lo menos 80% reabsorbidos dentro de un año. Preferiblemente el material puede ser completamente reabsorbido.

En varias incorporaciones de todos los aspectos de la invención, el material de injerto adicionalmente puede incluir uno o más agentes biológicamente activos. Los agentes biológicamente activos que pueden ser incorporados en los materiales de injerto de la invención incluyen, sin limitación, moléculas orgánicas, materiales inorgánicos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, genes, fragmentos de gen, secuencias reguladoras del gen y moléculas en contra del sentido) , nucleoproteínas, polisacaridos, glicoproteínas y lipproteínas . Las clases de compuestos biológicamente activos que pueden ser incorporadas en los amteriales de implanto de la invención incluyen, sin limitación, los agentes en contra del cáncer, antibióticos, analgésicos, agentes anti-inflamatorios, inhumosupresores, inhibidores de enzima, antiestaminas, anti-convulsantes, hormonas, relajantes de músculo, antiespasmódicos, agentes oftálmicos, prostaglandinas, anti-depresivos, sustancias anti-sicóticas, factores tróficos, proteínas osteoinductivas, factores de crecimiento y vacunas.

Los agentes en contra del cáncer incluyen los agentes alquilatantes, los agentes de platino, antimetabolitos, los inhibidores de topoisomerasa, los antibióticos en contra del tumor, los agentes antimicóticos, los inhibidores aromatasa, los inhibidores de trimidilato sintasa, los antagonistas de ADN, los inhibidores de farnesiltransferasa, los inhibidores de bomba, los inhibidores de acetiltransferasa histona, inhibidores de metalproteinasa, inhibidores de reductasa ribonucleótido, agonistas/antagonistas alfa TNF, antagonistas receptores de endotelina A, agonistas receptores de ácido retinoico, inmuno-moduladores, agentes hormonales y anti-hormonales, agentes fotodinámicos y los inhibidores de tirosina cinasa.

Cualquiera de los agentes biológicamente activos listados en la Tabla 1 pueden ser usados.

Tabla 1 Los antibióticos incluyen aminoglicosidos (por ejemplo, gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amikacina, neomicina), bacitracina, corbapenems (por ejemplo, imipenem/cislastatin) , cefalosporinas , colistina, metenamina, monobactams (por ejemplo, azteonam), penicilinas (por ejemplo penicilina G, penicilina V, meticilina, natcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina) , polimixin B, quinolonas, y vancomicin; y agentes bacteriostáticos tal como cloramfenicol, clindanian, macrolidas (por ejemplo, eritromicina, azitromicina, clarimitrocimina) , lincomian, nitrofurantoina, sulfonamidas, tetraciclinas (por ejemplo, tetraciclina, doxiclicina, minociclina, demeclocilina) y trimetoprim. También están incluidos metronidazo, fluoroquinolas y ritampin.

Los inhibidores de enzimas son sustancias las cuales inhiben una reacción enzimática. Los ejemplos de los inhibidores de enzima incluyen cloruro de edrofonio, N-metilfisostigmina, bromuro de neostigmina, sulfato de fisostigmina, tacrina, 1-hidroxi maleato, iodotubercidina, p-bromotetramisol, 10- (alfa-dietilaminopropionil) -fenotiazina hidrocloruro, calmidazolin cloruro, hemicolinio-3 , 3 , 5-dinitrocatecol, inhibidor de diacilglicerol cinasa I, inhibidor de diaciglicerol cinasa II, 3-fenilpropargilamina, N6-monometilo-L-arginina acetato, carbidopa, 3-hidroxibencilhidrazina, hidralazina, clorgilina, deprenil, hidroxilamina, fosfato de iproniazid, 6-MeO-tetrahidro-9H-pirido- Índole, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbazida, tranilcipromina, N, N-dietilaminoetilo-2 , 2-difenilvalerato hidrocloruro, 3 -isobutilo-1-metilxantano, papaverina, indometacind, 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina hidrocloruro, 2 , 3-dicloro-a-metilbencilamina (DCMB) , 8 , 9-dicloro-2 , 3 , 4 , 5-tetrahidro-lH-2-benzapeina hidrocloruro, p-aminoglutetimida, p-aminoglutetimida tartrato, 3-iodotirosina, alfa-metiltirosina, acetazolamida, diclorofenamida, 6-hidroxi-2-benzotiazolesulfonamida, y alupurinol .

Los anti-estamínicos incluyen pirilamina, clorfeniramina, y tetrahidrazolina entre otros.

Los agentes anti-inflamatorios incluyen los corticosteroides, las drogas anti-inflamatorias no esferoidales (por ejemplo, aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetin, ibuprofeno, piroxicam, y fenamatos) , acetaminofen, fenacetina, sales de oro, cloroquina, D-Penicilamina, metotrexato colquicina, alopurinol, probenecid, y sulfinpirazona .

Los relajantes de músculo incluyen mefenesina, metocarbomal, ciclobenzaprina, hidrocloruro, hidrocloruro de triexilfenidil , levodopa/carbidopa, y biperiden.

Los anti-espasmódicos incluyen atropina, escopolamina, oxifenonio, y papaverina.

Los analgésicos incluyen aspirina, fenibutazona, idometacina, sulindac, tolmetico, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofen, fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina, nalorfina, opioides (por ejemplo sulfato de codeína, citrato de fentanil, bitartrato de hidrocodona, loperamida, sulfato de morfina, noscapina, norcodeina, normorfina, tebaina, nor-binaltorfimina, buprenorfina, clornatrexamina, funaltrexamiona, nalbufina, nalorfina, naloxeno, naloxonazina, naltrexona, y naltrindole) , procaina, lidocaina, tetracaina y dibucaina.

Los agentes oftálmicos incluyen fluoroesceína de sodio, bengal rosa, metacolina, adrenalina, cocaína, atropina, alfa-quimotripsina, hialuronidasa, betaxalol, pilocarpina, timilol, sales de timolol y combinaciones de los mismos.

Las prostanglandinas son reconocidas en el arte y son una clase de químicos que ocurren naturalmente relacionados, ácidos grasos de hidroxi de cadena larga que tienen una variedad de efectos biológicos.

Los anti-depresivos son sustancias capaces de evitar o de aliviar la depresión. Por ejemplo, de los antidepresivos incluyen imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tranilcipromina, fenelzina, e isocarboxazida.

Los factores de crecimiento son factores cuya presencia continuada mejora la viabilidad o la longevidad de una célula. Los factores tróficos incluyen, sin limitación, la proteína activadora de neutrofil, la proteína quimoatrayente de monolito, la proteína inflamatoria de macrofago, el factor de plaqueta, la proteína básica de plaqueta, y la actividad estimulante de crecimiento de melanoma; factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de transformación (alfa) , factor de crecimiento de fibroplasto, factor de crecimiento de célula endotelial derivado de plaqueta, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF, por ejemplo IGF-I ó IGF-II) , factor neurotrófico de crecimiento derivado glial, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento de nervio, factor de inducción de cartílago/crecimiento de hueso (alfa y beta) , proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs) , interleucins (por ejemplo, inhibidores de interleucina ó receptores de interleucina, incluyendo interleucin 1 a interleucin 10) , interferonas (por ejemplo, interferona alfa, beta y gama) , factoras hematopoiéticos, eritropoietina, factor estimulador de colonia de granulocito, factor de estimulación de colonia de macrofago y factor de estímulo de colonia de granulocito-macrofago; factores de necrosis de tumor, factores de crecimiento de transformación (beta), incluyendo beta-1, beta-2, beta-3, factores de crecimiento de transformación (alfa) , inhibina y activita; y proteínas morfogenéticas de hueso tal como OP-1, BMP-2 y BMP-7.

Las hormonas incluyen estrógenos (por ejemplo, estradiol, estrone, estriol, dietilestribestol, quinestrol, clorotrianisina, etinil estradiol, estranol) , anti-estrógenos (por ejemplo, clomifeno, tamoxifeno) , progestinas (por ejemplo, medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel) , antiprogestina (mifepristona) , andrógenos (por ejemplo, testosterona cipionato, fluximesterona, danazol, testolactona), anti-andrógenos (por ejemplo, ciproterona acetato, flutamida) , hormonas tiroide (por ejemplo, triiodotirona, tiroxina, propiltiouracil , metimazol, e iodixoda) , y hormonas pituitarias (por ejemplo corticotropina, sumutotropina, oxitocina, y vasopresina) . Las hormonas son comúnmente empleadas en la terapia de reemplazo de hormona y/o para los propósitos de control de nacimiento. Las hormonas esteroides, tal como prednisona, son también usadas como inmunosupresores y anti-inflamatorios.

El agente activo biológicamente también es deseablemente seleccionado de la familia de proteínas conocidas como la súper familia de proteínas beta- factores de crecimiento transformante (TGF-ß) , las cuales incluyen activitas, inhibinas, y proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs). En una incorporación, el agente activo incluye por lo menos una proteína seleccionada de la sub-clase de proteínas conocidas generalmente como proteínas morfogenéticas de hueso, las cuales se han descrito porque tienen actividad osteogénica, y otras actividades de tipo de diferenciación y crecimiento. Estas proteínas morfogenéticas de hueso incluyen las proteínas BMP-2, BMP- 3, BMP-4, BMP- 5, BMP- 6 y BMP- 7, descritas por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; y 5,141,905; BMP-8, descrita en la solicitud de PCT O91/18098; y BMP-9 descrita en la publicación PCT WO93/00432, BMP-10 descrita en la solicitud de PCT 094/26893; BMP-11 descrita en la solicitud PCT 094/26892, o BMP-12 ó BMP-13, descritas en la solicitud PCT O95/16035; BMP-14; BMP-15 descrita en la patente de los Estados Unidos de América números 5,635,372; ó BMP-16, descrita en la patente de los Estados Unidos de América número 5,966,403. Otras proteínas TGF-ß las cuales pueden ser útiles como el agente activo en las composiciones de fosfato de calcio de la invención incluyen Vgr-2, Jones y otros, Mol. Endocrinol. 6:1961 (1992), y cualquiera de los factores de crecimiento y diferenciación (GDFs) , incluyendo aquellos descritos en las solicitudes PCT W094/15965; W094/15949; WO95/01801; WO95/01802; W094/21681; W094/15966; WO95/10539; O96/01845; O96/02559; y otros. También útiles en la invención pueden ser BIP, descritas en O94/01557; HP00269, descrita en la publicación Japonesa número 7-250688; y MP52, descrita en la solicitud PCT WO93/16099. Las descripciones de todas las solicitudes anteriores se incorporan aquí por referencia. Un sub- juego de BMPs el cual puede ser usado en la invención incluye BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, BMP-14, y MP52. El agente activo es más preferiblemente BMP-2, la secuencia del cual está descrita en la patente de los Estados Unidos de América número 5,013,649, cuya descripción se incorpora aquí por referencia. Otros agentes osteogénicos conocidos en el arte también pueden ser usados tal como teriparatida (Forteo™), Crisalin®, prostaglandina E2 , proteína LIM, osteogenina, ó matriz de hueso desmineralizado (DBM) , entre otros .

El agente biológicamente activo puede ser sintetizado químicamente, producido recombinantemente, o purificado de una fuente la cual el agente biológicamente activo es naturalmente encontrado. El agente activo, si un TGF-ß, tal como BMP u otra proteína dimérica puede ser homodimérico, o puede ser heterodimérico con otro BMPs (por ejemplo una heterodímero compuesto de monómero cada uno de BMP- 2 y BMP- 6) o con otros miembros de la súper familia TGF-ß, tal como activins, inhibins y TGF-ßl (por ejemplo un heterodímero compuesto de un monómero cada uno de un BMP y un miembro relacionado del TGF-ß súper familia) . Los ejemplos de tales proteínas heterodiméricas están descritos por ejemplo en la solicitud de patente PCT publicada WO93/09229, cuya descripción se incorpora aquí por referencia.

Los agentes biológicamente activos adicionales incluyen las proteínas Hedgehog, Frazzled, Chrodin, Noggin, Cerberus y Follistatin. Estas familias de proteínas están generalmente descritas por Sasai y otros, Célula 79:779-790 (1994) (Chordin) ; Publicación de patente PCT WO94/05800 (Noggin); y Fukui y otros; Devel. Biol. 159:131 (1993) (Follistatin) . Las proteínas Hedgehog están descritas en W096/16668; W096/17924; y 095/18856: La familia Frazzled de proteínas es una familia recientemente descubierta de proteínas con una homología alta al dominio de aglutinamiento extracelular de la familia de proteína receptora conocida como Frizzled. La familia Frizzled de genes y proteínas está descrita en Wang y otros. J. Biol. Chem. 271:4468-4476 (1996) . El agente activo también puede incluir otros receptores solubles, tal como los receptores solubles truncados descritos en la publicación de patente PCT WO95/07982. De las enseñanzas de WO95/07982, un experto en el arte reconocerá que los receptores solubles truncados pueden ser preparados para numerosas otras proteínas receptoras. Las publicaciones anteriores son incorporadas aquí por referencia.

La cantidad de proteína biológicamente activa, por ejemplo, una proteína osteogénica que es efectiva para estimular una actividad deseada, por ejemplo, la actividad osteogénica incrementada de la presente progenitor o infiltración u otras células, dependerá del tamaño y naturaleza del defecto que está siendo tratado así como del portador que está siendo empleado. Generalmente, la cantidad de proteína que va a ser entregada está en un rango de desde alrededor de 0.1 a alrededor de 100 mg, preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 100 mg; más preferiblemente de alrededor de 10 a alrededor de 80 mg.

Los protocolos y regimenes estándar para la entrega de los agentes antes listados se conocen en el arte. Los agentes biológicamente activos son introducidos en el material de implante en cantidades que permiten la entrega de una dosis apropiada del agente al sitio de injerto. En la mayoría de los casos, las dosis son determinadas usando líneas de guía conocidas por los practicantes y aplicables al agente particular en cuestión. La cantidad de ejemplo de agente biológicamente activo que va a incluirse en el material de injerto de la invención es factiblemente que dependa de tales variables como el tipo y extensión de la condición, el estado de salud global del paciente particular, la formación del agente activo y la bioreservación del vehículo de entrega usado. Los ensayos clínicos estándar pueden ser usados para optimizar la dosis y la frecuencia de dosis para cualquier agente activo biológicamente particular.

En una incorporación de todos los aspectos de la invención, la composición puede adicionalmente contener extractos de plaqueta autólogo o de médula de hueso autólogo.

En otra incorporación de todos los aspectos anteriores, el factor de crecimiento derivado de plaqueta y/u otros factores de crecimiento pueden ser obtenido de fuentes naturales (por ejemplo plaquetas) , o más preferiblemente, ser producidos mediante tecnología ADN recombinante. Cuando se obtienen de fuentes naturales, el factor de crecimiento derivado de plaqueta y/u otros factores de crecimiento pueden ser obtenidos de un fluido biológico. Un fluido biológico incluye cualquier fluido tratado o no tratado (incluyendo una suspensión) asociada con organismos vivientes, particularmente sangre, incluyendo la sangre completa, la sangre caliente o fría, y la sangra almacenada o fresca; la sangre tratada, tal como la sangre diluida con por lo menos una solución fisiológica, incluyendo pero no limitándose al agua salada, nutriente y/o soluciones anticoagulantes; componentes de sangre, tal como concentrado de plaqueta (PC), plaquetas aferesadas, plasma rica en plaquetas (PRP) , plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma libre de plaquetas, plasma, suero, plasma congelado fresco (FFP) , componentes obtenidos de plasma, células rojas empacadas (PRC) , recubrimiento de cuajada (BC) ; productos derivados de sangre o de componentes de sangre o derivados de médulas de hueso; células rojas separadas de plasma y resuspendidas en fluido fisiológico; y plaquetas separadas de plasma y resuspendidas en fluido fisiológico. El fluido biológico puede haberse tratado para no mover algunos de los leucocitos antes de ser procesados de acuerdo a la invención. Como se usó aquí, el fluido biológico o producto de sangre se refiere a los componentes descritos arriba, y a productos de sangre similares o fluidos biológicos obtenidos por otros medios con propiedades similares. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaqueta es obtenido de la plasma rica en plaquetas (PRP) . La preparación del plasma rico en plaquetas está descrito en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de América Números 6,649,072, 6,641,552, 6,613,566, 6,593,507, 6,558,307, 6,398,972, y 5,599,558, las cuales se incorporan aquí por referencia.

En una incorporación de todos los aspectos de la invención, el material de injerto entrega el factor de crecimiento derivado de plaquetas en el sitio de injerto por una duración de un tiempo mayor de por lo menos 1 día. En varias incorporaciones, el material de injerto entrega el factor de crecimiento derivado de plaqueta en el sitio de injerto por lo menos por 7, 14, 21, o 28 días. Preferiblemente, el material de injerto entrega el factor de crecimiento derivado de plaquetas en el sitio de injerto por un tiempo de entre alrededor de 1 día y 7, 14, 21, o 28 días. En otra incorporación, el material de injerto entrega el factor de crecimiento derivado de plaquetas en el sitio de injerto por un tiempo mayor de alrededor de 1 día, pero menos de alrededor de 14 días.

Por "bioabsorbible" se quiere decir la capacidad del material de injerto de ser reabsorbido o remodelado en vivo. El proceso de reabsorción involucra la degradación y eliminación del material de implante original a través de la acción de los fluidos del cuerpo, enzimas o células. El material o materiales reabsorbidos pueden ser usados por el anfitrión en la formación de nuevo tejido o éstos pueden ser de otra manera utilizados de nuevo por el anfitrión o pueden ser expulsados.

Por "factor de diferenciación" se quiere decir un polipéptido que incluye una cadena de por lo menos 6 amino ácidos, la cual estimula la diferenciación de una o más células de objetivo en las células con cartílago o el potencial de formación de hueso.

Por "partícula de tamaño de nanómetro" se quiere decir una partícula de tamaño de sub-micrón, generalmente definida como una partícula de abajo de 1000 nanómetros. Una partícula de tamaño de nanómetro es un material de partícula sólido que está en un estado intermedio entre substancia molecular y macrón. Una nanómetro se define como una billonésima de un metro (1 nanómetro = 109 m) . El material de nanómetro se conoce como polvo, fibra, película o bloque teniendo el tamaño nanoescala.

Por "periodontio" se quiere decir los tejidos que rodean y soportan los dientes. El periodontio soporta, protege, y proporciona nutrimento a los dientes. El periodontio consiste de hueso, cemento, proceso alveolar de maxilas y mandíbulas, ligamento periodontal y encía. El cemento es una capa calcificada delgada del tejido que cubre completamente la dentina de la raíz del diente. El cemento está formado durante el desarrollo de la raíz y a través de la vida del diente y funciona como un área de sujeción para las fibras de ligamento periodontal. El proceso alveolar es la parte de hueso del maxilar y la mandíbula en donde los dientes están embebidos y en el cual están soportadas las raíces de los dientes. El socket alveolar es la cavidad dentro del proceso alveolar en la cual la raíz de los dientes se mantiene por el ligamento periodontal. El hueso que divide un socket de otro es llamado el septo interdental. Cuando están presentes dientes de raíces múltiples, el hueso es llamado el septo interradicular. El proceso alveolar incluye la placa cortical, la cresta alveolar, el hueso trabecular, y el hueso alveolar propio.

Por "promover el crecimiento" se quiere decir el sanamiento del hueso, del periodontio, del ligamento, o cartílago, y la regeneración de tales tejidos y estructuras. Preferiblemente, el hueso, el periodontio, el ligamento, o cartílago es dañado o herido y requiere la regeneración o sanamiento.

Por "promover el crecimiento del periodontio" se quiere decir la regeneración o sanamiento de los tejidos de soporte de un diente incluyendo el hueso alveolar, cemento y el ligamento periodontal interpuesto, el cual se ha dañado por enfermedad o trauma.

Por "purificado" se quiere decir un crecimiento o factor de diferenciación, por ejemplo, PDGF, el cual, antes del mezclado con la substancia portadora es 95% mayor por peso, por ejemplo, el factor está esencialmente libre de otras proteínas, lípidos, y carbohidratos con los cuales está naturalmente asociado. El término "esencialmente purificado" se refiere a una pureza menor del factor, teniendo, por ejemplo, solamente 5%-95% por peso del factor, preferiblemente 65-95%. Una preparación de proteína purificada generalmente dará una banda principal única sobre un gel de poliacrilamida. Más preferiblemente, el factor purificado usado en los materiales de implante de la invención es puro como se juzgó por el análisis de secuencia de amino ácido terminal-amino. El término "parcialmente purificado" se refiere al factor de crecimiento derivado de plaqueta que se proporciona en el contexto de PRP, PPP, FFP, o cualquier otro producto de sangre que requiera recolección y separación, por ejemplo, por centrifugación para producir.

Por vía de ejemplo, una solución teniendo ~1.0 mg/mL de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta, cuando ~50% puro, constituye -2.0 mg/mL de proteína total.

Los materiales de injerto de ésta invención ayudan en la regeneración del periodontio, por lo menos en parte, mediante el promover el crecimiento del tejido de conexión, hueso y cemento. Los materiales de injerto pueden ser preparados de manera que éstos promuevan directamente el crecimiento y la diferenciación de células que producen el tejido de conexión, hueso, y cemento. Alternativamente, los materiales de injerto pueden ser preparados de manera que éstos actúan indirectamente mediante, por ejemplo, atraer las células que son necesarias para promover el crecimiento del tejido de conexión, hueso, y cemento. La regeneración usando una composición de ésta invención es un tratamiento más efectivo de enfermedades periodontales o de heridas de hueso que aquélla lograda usando antibióticos sistémicos o un descombrado quirúrgico solo.

El Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas, los factores de crecimiento de polipéptido, y los factores de diferenciación pueden ser obtenidos de células o tejidos humanos, por ejemplo, plaquetas, mediante síntesis de péptido de fase sólida o mediante tecnología ADN recombinante. Por tanto, por el término "factor de crecimiento de polipéptido" o "factor de diferenciación", nosotros queremos decir un tejido o materiales sintetizados recombinantes o derivados de célula. Si el factor es un dímero, por ejemplo, Factor de Crecimiento de Derivación de Plaqueta, el factor recombinante puede ser un heterodímero recombinante, hecho mediante el insertar dentro secuencias ADN de células procarióticas o eucarióticas cultivadas codificando ambas sub-unidades del factor, y después permitiendo a las sub-unidades trasladadas el ser procesadas por las células para formar un heterodímero (por ejemplo, PDGF-AB) . Alternativamente, el ADN codificando sólo una de las subunidades (por ejemplo, Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta, cadena-B o cadena-A) puede ser insertado en las células, las cuales entonces son cultivadas para producir el factor homodimérico (por ejemplo, homodímeros PDGF-BB o PDGF-AA) . El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta para usarse en los métodos de la invención incluye los homo- y heterodímeros de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta, por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD, y combinaciones y derivados de los mismos.

La concentración del Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta u otros factores de crecimiento de la invención puede ser determinada mediante el uso de, por ejemplo, un inmunoensayo enlazado-enzima, como se describió en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de América Números 6,221,625, 5,747,273, y 5,290,708, incorporadas aquí por referencia o cualquier otro ensayo conocido en el arte para determinar la concentración de proteína. Cuando se proporcionó aquí, la concentración molar del Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta se determinó con base en el peso molecular del dímero de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (por ejemplo, PDGF-BB; Peso Molecular = aproximadamente 25 kDa) .

Los métodos y materiales de injerto de la invención pueden ser usados para sanar las heridas de hueso de mamíferos, por ejemplo, fracturas, los sitios receptores de injerto, y los sitios de enfermedad periodontal. Los materiales de implante promueven el crecimiento de tejido conector y la reparación y mejoración de formación de hueso en comparación al sanado natural (por ejemplo, sin agentes exógenos agregados) o el sanamiento suplementado por la adición de antibióticos sistémicos. A diferencia del sanamiento natural, la terapia quirúrgica convencional, o los antibióticos, los materiales de implante de la invención promueven el crecimiento de hueso, el del tejido conector (cartílago y ligamento), y la formación de cemento cuando se aplican a los tejidos dañados o enfermos o a los sitios afectados por enfermedad periodontal. La restauración de éstos tejidos lleva a una prognosis mejorada para las áreas afectadas. La capacidad de éstos factores para estimular la nueva formación de hueso también hace aplicable para el tratamiento de defectos de hueso causados por otros tipos de infección o quirúrgicas o por traumas accidentales.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción de las incorporaciones de la misma, y de las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos Las Figuras 1A-1G son fotomicrografías que muestran el efecto de 8 semanas de formación de hueso después del tratamiento. La Figura ÍA es una fotomicrografía que muestra el efecto de la cirugía sola en la formación de hueso. La Figura IB es una fotomicrografía que muestra el efecto de /7-TCP sola sobre la formación de hueso. La Figura 1C es una fotomicrografía que muestra el efecto de ß-?CP + 0.3 mg/mL de PDGF sobre la formación de hueso. La Figura ID es una fotomicrografía que muestra el efecto de /3-TCP + 1.0 mg/mL de PDGF sobre la formación de hueso. La Figura 1E es una fotomicrografía que muestra el efecto del aloinjerto de hueso secado congelado desmineralizado (DFDBA) sólo sobre la formación de hueso. La Figura 1F es una fotomicrografía que muestra el efecto del aloinjerto de huesos secado congelado desmineralizado (DFDBA) + 0.3 mg/mL del Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta sobre la formación de hueso. La Figura 1G es una fotomicrografía mostrando el efecto de la alografía de hueso secada de congelamiento desmineralizada (DFDBA) + 1.0 mg/mL sobre la formación de hueso.

Las Figuras 2A-2C son fotomicrografías que muestran el efecto sobre la formación de hueso 16 semanas después del tratamiento. La Figura A es una fotomicrografía que muestra el efecto de /?-TCP sólo sobre la formación de hueso. La Figura 2B es una fotomicrografía que muestra el efecto de /3-TCP + 0.3 mg/mL de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta sobre la formación de hueso. La Figura 2C es una fotomicrografía mostrando el efecto de /?-TCP + 1.0 mg/mL de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta sobre la formación de hueso.

Descripción Detallada Se describirán ahora varias incorporaciones de la invención. Dos ejemplos demuestran el uso del Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta como un agente de sanamiento de periodontio y hueso que se presentan abajo.

EJEMPLOS Ejemplo I : Preparación de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta Las heridas óseas, por ejemplo, después de un trauma o enfermedad periodontal, son tratadas y el periodontio, incluyendo el hueso, cemento, y tejido de conexión, son regenerados, de acuerdo a la invención mediante el combinar el Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta purificado o parcialmente purificado con cualquiera otra de las substancias portadoras farmacéuticamente aceptables descritas arriba. El Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas purificado obtenido de una fuente recombinante o de plaquetas humanas . El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta recombinante comercialmente disponible puede ser obtenido de R&D Systems Inc. (de Minneapolis, Minnesota) , BD Biosciences (San José, California) , y Chemicon, Internacional (Temecula, California) . El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta purificado y parcialmente purificado también puede ser preparado como sigue: Quinientas a 1000 unidades de pelotillas de plaquetas humanas lavadas son suspendidas en ÍM NaCl (2 mililitros por unidad de plaqueta) y se calientan a 100° Centígrados por 15 minutos. El súper nadante es entonces separado por centrifugación y el precipitador es extraído dos veces con 1 m de NaCl .

Los extractos son combinados y dializados en contra de 0.08M de NaCl/O.OlM de amortiguador de fosfato de sodio (pH 7.4) y se mezcló durante la noche a 4o Centígrados con CM-Sephadex C-50 equilibrado con el amortiguador. La mezcla es entonces purificada en una columna (5 x 100 cm) , se lava extensamente con 0.08M de NaCl/O.OlM de amortiguador de fosfato de sodio (pH de 7.4) , y se extrae con solvente con ÍM de NaCl mientras que son recolectadas 10 ml de fracciones.

Las fracciones activas son estancadas y dializadas en contra de 0.3M de NaCl/O.OlM de amortiguador de fosfato de sodio (pH de 7.4), son centrifugadas, y pasadas a 4o Centígrados a través de una columna de 2.5 x 25 centímetros de sefarosa azul (Pharmacia) equilibrado con 0.3M de NaCl/O.OlM de amortiguador de fosfato de sodio (pH de 7.4) . La columna es entonces lavada con el amortiguador y el Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta purificada parcialmente es extraído con una solución de 1:1 de ÍM de NaCl y etilen glicol.

La fracciones de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas parcialmente purificadas son diluidas (1:1) con ÍM de NaCl, dializado en contra de ÍM de ácido acético, y liofilizadas. Las muestras liofilizadas son disueltas en 0.8M de NaCl/O.OlM de amortiguador de fosfato de sodio (ph de 7.4) y se pasaron a través de una columna de 1.2 x 40 centímetros de CM-Sephadex C-50 equilibrado con el amortiguador. El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta es entonces extraído con un gradiente de NaCl (0.08 a ÍM) .

Las fracciones activas son combinadas, dializadas en contra de ÍM de ácido acético, liofilizadas, y disueltas en un volumen pequeño de ÍM de ácido acético. Las porciones de 0.5 ml son aplicadas a una columna de 1.2 x 100 cm de Biogel P-150 (100 a 200 mallas) equilibrado con ÍM de ácido acético. El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta es entonces extraído con ÍM de ácido acético mientras que son recolectadas las fracciones de 2 mL.

Cada fracción activa conteniendo 100 a 200 mg de proteína es liofilizada, disuelta en 100 mL de 0.4% de ácido trifluoroacético, y se somete a una cromatografía de líquido de desempeño alto de fase inversa sobre una columna Bondapak de fenilo (Waters) . La elusión con un gradiente de acetonitrilo lineal (0 a 60%) de PDGF puro.

Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta Hecho Mediante Tecnología de ADN Recombinante Puede Prepararse Como Sigue : El Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta (PDGF) derivado de plaquetas humanas contiene dos secuencias de polipéptido (polipéptidos PDGF-B y PDGF-A; Antoniades, H.N. y Hunkapiller, M. , Science 220:963-965, 1983). El PDGF-B está codificado por un gen localizado sobre el cromosoma 7 (Betsholtz, C. y otros, Naturaleza 320:695-699), y el PDGF-A está codificado por el sis oncogéno (Doolittle, R. y otros, Ciencia 221:275-277 , 1983) localizado sobre el cromosoma 22 (Dalla-Favera, R. , Ciencia 218:686-688, 1982). El gen sis codifica la proteína de transformación del virus de sarcoma de simio (SSV) el cual está relacionado cercanamente al polipéptido PDGF-2. El c-sis celular humano también codifica la cadena PDGF-A (Rao, C. D. y otros, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 83:2392-2396, 1986) . Debido a que las dos cadenas de polipéptido de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta están codificados por dos genes diferentes localizados en cromosomas separados, existe la posibilidad de que el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas humanas consista de un heterodímero enlazado con disulfuro de PDGF-B y PDGF-A, o una mezcla de los dos homodímeros (homodímero PDGF-BB y homodímero PDGF-AA) , o una mezcla del heterodímero y los dos homodímeros.

Las células de mamífero en cultivo infectadas con el Virus de Sarcoma de Simio, el cual contiene el gen codificando la cadena PDGF-A, fueron mostradas para sintetizar el polipéptido PDGF-A y para procesarlo en un homodímero enlazado de disulfuro (Robbins y otros, Naturaleza 305:605-608, 1983) . Además, el homodímero PDGF-A reacciona con el antisuero elevado en contra del Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta humano. Además, las propiedades funcionales del homodímero PDGF-A segregados son similares a aquéllas del PDGF derivado de plaqueta en que éste estimula la síntesis ADN en fibroblastos cultivados, éste induce la fosforilación en el residuo de tirosina de proteína de membrana de célula de 185 kD, y es capaz de competir con el (125I) -PDGF humano para el aglutinamiento a receptores de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta de superficie de célula específica (Owen, A. y otros, Ciencia 225:54-56, 1984). Las propiedades similares fueron mostradas para el producto de gen sis/PDGF-A derivado de células humanas normales cultivadas (por ejemplo, células endoteliales arteriales humanas) , o de células malignas humanas expresando el gen sis/PDGF-2 (Antoniades, H. y otros, Células de Cáncer 3:145-151, 1985) .

El homodímero PDGF-B recombinante es obtenido por la introducción de los clones cADN del gen c-sis/PDGF-B en las células de ratón usando un vector de expresión. El clon c-sis/PDGF-B usado para la expresión fue obtenido de células endoteliales cultivadas humanas normales (Collins, T. , y otros, Naturaleza 216:748-750, 1985).

Uso del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas El Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas solo o en combinación con otros factores de crecimiento es útil para promover el sanado del hueso, el crecimiento del hueso y la regeneración o el sanamiento de las estructuras de soporte de los huesos lesionados por traumas o enfermedades. También es útil para promover el sanamiento de un sitio de extracción de un diente, para el aumento del reborde mandibular o los sitios de injerto de dientes. El sanamiento de hueso también será mejorado en sitios de fractura de hueso o en áreas infectadas, por ejemplo, osteomielitis, o sitios de tumor. El Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas también es útil para promover el crecimiento y el sanamiento de un ligamento, por ejemplo, el ligamento periodontal y el cemento.

En el uso, el Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta u otro factor de crecimiento o diferenciación es aplicado directamente al área que requiere sanamiento o regeneración. Generalmente, éste se aplica en un portador reabsorbible o no reabsorbible como un líquido sólido, y el sitio entonces es cubierto con un vendaje o un tejido cercano. Una cantidad suficiente para promover el crecimiento de huesos generalmente de entre 500 ng y 5 mg para un área de un centímetro cuadrado, pero el límite superior es realmente de 1 mg para un área de 1 centímetro cuadrado con una cantidad preferida de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta aplicado siendo de 0.3/mL.

Ejemplo II: Regeneración Periodontal Con Plataformas Osteoconductivas Tratadas con rhPDGF-BB La efectividad del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas para promover el periodontio y el crecimiento de hueso se demuestra por el siguiente estudio.

Estudio de Perro En Vivo El perro beagle es el modelo de animal más ampliamente usado para probar los procedimientos y materiales de regeneración periodontal putativos (Wikesjo y otros, J". Clin . Periodontol . 15:73-78, 1988; Wikesjo y otros, J. Clin . Periodontol . 16:116-119, 1999; Cho y otros, J. Periodontol . 66:522-530, 1995; Giannobile y otros, J. Periodontol . 69:129-137, 1998; y Clergeau y otros, J. Periodontol . 67:140-149, 1996) . La acumulación de cálculo y placa puede inducir la inflamación gingival que puede llevar a la pérdida de hueso marginal y la etiología de periodontitis en perros y humanos puede ser comparada. En la enfermedad que ocurre naturalmente, sin embargo, hay una falta de uniformidad entre los defectos. Adicionalmente, como más atención se da a la salud oral en las colonias de criadores caninos, se han hecho impractico el obtener animales con enfermedad peridontal natural. Por tanto, el modelo de bifurcación de Clase III horizontal inducido quirúrgicamente se ha hecho uno de los modelos más comúnmente usados para investigar la regeneración y sanamiento periodontal .

Los perros Beagle con los defectos de bifurcación Clase III horizontal fueron tratados usando las composiciones de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta de la invención.

Quince perros beagle adultos contribuyeron 60 defectos tratados.

Cuarenta y dos defectos fueron objetos de biopsia dos meses después del tratamiento y quince defectos fueron objetos de biopsia cuatro meses después del tratamiento.

Preparación de Defecto El modelo de defecto periodontal "de tamaño crítico" como se describió por numerosos investigadores fue utilizado (vea, por ejemplo, Wikesjo, 1988 y 1999, supra ; Giannobile, supra, Cho, supra, y Park y otros, J. Periodontol . 66:462-477, 1995). Ambos cuadrantes mandibulares en 16 perros beagle macho (2-3 años de edad) sin problemas generales de salud oral fueron usados. Un mes antes de la dosis, los animales fueron sedados con una inyección subcutánea de atropina (0.02 mg/kg) y acepromacina (0.2 mg/kg) aproximadamente 30 minutos antes de ser anestesiados con una inyección IV de pentobarbital sódico (25 mg/kg) . Después de la infiltración local del área quirúrgica con Lidocaína HCl más epinefrina 1:100,000, las aletas mucoperioestales de grosor completo fueron reflejadas y los premolares primero y tercero (Pl y P3) fueron extraídos. Adicionalmente, la parte de la mitad de la corona del primer molar fue reseccionada.

El hueso alveolar fue entonces removido alrededor de la circunferencia completa de P2 y P4 , incluyendo las áreas de bifurcación usando cinceles y fresas de diamante y de carburo enfriadas con agua. Los defectos de huesos horizontales fueron creados de manera que hubo una distancia de 5 milímetros desde la bóveda de la bifurcación a la cresta del hueso. Los defectos fueron de aproximadamente de 1 centímetro de ancho, dependiendo del ancho del diente. Las raíces de todos los dientes experimentales fueron planeadas con raspadores e instrumentos ultrasónicos e instrumentados con una fresa de diamante ahusada para remover el cemento. Después de que fueron creados los defectos de hueso estandarizados las aletas gingivales fueron saturadas para lograr el cierre primario. A los animales se les alimentó una dieta suave y recibieron diariamente enjuagues de clorohexidina por la duración del estudio.

Aplicación del Material de Injerto Los defectos periodontales de P2 y P4 en cada cuadrante mandibular de los 15 animales se pusieron al azar antes del tratamiento usando sobre sellados. Alrededor de cuatro semanas después de la preparación del defecto, los animales fueron anestesiados nuevamente como se describió arriba y las aletas de grosor completo fueron reflejadas en ambos cuadrantes mandibulares. Una muesca fue colocada en las superficies de raíz de diente en la cresta ósea residual usando una fresa redonda de 1/2 para servir como un punto de referencia histológico futuro.

Los sitios fueron irrigados con agua salada estéril y las raíces fueron tratadas con ácido cítrico como se describió previamente para el propósito de la descontaminación y remoción de la capa de untado (Vea, por ejemplo, Cho, supra, y Park, supra) . Durante éste período una cantidad de ?-TCP o DFDBA suficiente para llenar el defecto periodontal fue saturada con una solución de la solución rhPDGF-BB (0.3 o 1.0 mg/ml) y la mezcla de injerto de rhPDGF-BB se dejó asentar sobre el pedestal quirúrgico estéril por alrededor de diez minutos. El injerto saturado de rhPDGF-BB fue entonces empacado en el defecto con presión suave al nivel ideal de la regeneración ósea.

Después del injerto del material de injerto, las aletas mucoperioestales fueron saturadas aproximadamente al nivel de la junta cementoenamel (CEJ) usando suturas de politetrafluoroetileno (ePTFE) expandidas de 4.0 interrumpidas interproximales . Después de suturar las aletas el gel de gluconato de clorohexidina fue suavemente colocado alrededor de los dientes y de las encías.

Grupos de Tratamiento y Control Defectos recibidos ya sea: 2 . /?-TCP más rhPDGF -BB ( 0 . 3 mg/ml rhPDGF -BB ) 3 . /7-TCP más rhPDGF -BB ( 1 . 0 mg/ml rhPDGF -BB) 4 . Perro DFDBA 5. Perro DFDBA más rhPDGF-BB (0.3 mg/ml rhPDGF- BB) 6. Perro DFDBA más rhPDGF-BB (1.0 mg/ml rhPDGF-BB) 7. Cirugía fingida (tratada mediante el descombrado de aleta abierta solamente, sin injerto) Seis defectos por grupo de tratamiento fueron objeto de biopsia en dos meses (42 sitios totales) . Además, cinco defectos en los grupos de tratamiento, 1, 2, y 3 fueron objeto de biopsia en cuatro meses (15 sitios totales) .

Tabla 2. Diseño Experimental Por tanto, a 8 semanas hubo 7 grupos divididos entre 42 sitios en 11 perros. A 16 semanas hubo 3 grupos divididos entre 15 sitios en 4 perros (un perro recibió dos tratamientos quirúrgicos escalonados con ocho semanas de separación y por tanto contribuyó dos sitios a cada uno de los puntos de tiempo de 8 y 16 semanas) .

Tratamiento Post -Quirúrgico Los sitios de cirugía fueron protegidos mediante alimentar a los perros una dieta suave durante las primeras 4 semanas post-operativas . Para asegurar el sanamiento óptimo, el tratamiento antibiótico sistémico con penicilina G benzatina fue proporcionado para las dos primeras semanas y el control de placa fue mantenido mediante irrigación diaria con 2% de gluconato de clorohexidina a través del experimento. Las suturas fueron removidas después de 3 semanas.

Recolección de Datos Relación de Puntos de Recolección de Datos El punto de tiempo de ocho semanas fue escogido debido a que éste es el tiempo más común reportado para éste modelo en la literatura y por tanto son datos históricos substanciales. Por ejemplo, Wikesjo y otros, supra, y Giannobile y otros, supra , también escogieron 8 semanas para evaluar los efectos regeneradores de BMP-2 y OP-1, respectivamente, en el mismo modelo. Adicionalmente, Park y otros, supra, evaluaron el efecto de rhPDGF-BB aplicado directamente a la superficie de raíz acondicionada con y sin membranas GTR en el modelo de perro beagle a 8 semanas . Estos estudios sugieren fuertemente que el período de 8 semanas debe ser óptimo para ilustrar los efectos significantes potenciales entre las varias modalidades de tratamiento .

El punto de tiempo de dieciséis semanas fue escogido para evaluar los efectos a largo plazo del tratamiento de factor de crecimiento. Los estudios previos (Park y otros, supra) sugieren que para éste tiempo no hay un sanado espontáneo substancial de los defectos óseos. No obstante esto, es posible el evaluar si el tratamiento de rhPDGF-BB lleva a cualquier respuesta de tejido no usual o anormal, tal como la remodelación de hueso alterada, la tumogenésis o reabsorción de raíz.

Evaluaciones de Biopsias y Tratamiento En el momento de la biopsia, los animales fueron inundados con 4% de paraformaldehído y se sacrificaron. Las mandíbulas fueron entonces removidas y colocadas en un fijador. Las radiografías periapicales fueron tomadas y los sitios tratados fueron cortados en bloques individuales usando una sierra de diamante. Los bloques codificados (blindados) fueron envueltos en gasa, sumergidos en una solución de 4% de formaldehído, se procesaron, y analizaron.

Durante el procesamiento las biopsias fueron dehidratadas en etanol y se infiltraron y se embebieron en metilmetacrilato. Las secciones no descalsificadas de aproximadamente 300 µm en grosor fueron obtenidas usando una sierra de diamante de velocidad baja con enfriador. Las secciones fueron pegadas sobre vidrio acrílico opalescente, se molieron a un grosor final de aproximadamente 80 µm y se mancharon con azul de toludina y fucsina básica. Fueron obtenidas secciones en serie de paso en un plano mesiodistante .

El análisis histomorfométrico se llevó a cabo sobre las placas. Los siguientes parámetros fueron evaluados: 1. Longitud del Aparato de Sujeción Nuevo Completo (CNAA) : Degeneración periodontal medida como la distancia entre el nivel corona del hueso viejo y el nivel de corona del hueso nuevo, incluyendo sólo el hueso nuevo adyacente al cemento nuevo con el ligamento periodontal o dentado funcionalmente entre el hueso nuevo y el nuevo cemento. 2. Llenado de Hueso Nuevo (NB) : Medido como el área en sección transversal del hueso nuevo formado dentro de la bifurcación. 3. Llenado de Tejido Conector (CT) : Medido como el área dentro de la bifurcación ocupada por el tejido de conexión gingival. 4. Hueco (VO) : El área de recesión donde hay una ausencia de tejido.

Resultados A. Observaciones Clínicas Clínicamente, todos los sitios sanaron bien. Hubo una impresión de que los sitios tratados con rhPDGF-BB sanaron más rápidamente, como se indicó por la presencia de encías rosadas firmes dentro de una semana después de la operación. No hubo eventos adversos experimentados en cualquier grupo de tratamiento como se evalúa por la inspección visual de los sitios tratados. Parece haber una recesión gingival incrementada en los grupos que recibieron sólo /?-TCP o DFDBA.

B. Observaciones Radiográficas Radiográficamente, hubo evidencia de una formación de hueso incrementada a dos meses como se juzgó por la radiopacidad incrementada en los Grupos 2, 3 (/5-TCP + rhPDGF-BB 0.3 y 1.0 mg/ml, respectivamente) y 6 (DFDBA + rhPDGF-BB 1.0 mg/ml) en comparación a los otros grupos (Figuras 1A-G) . A cuatro meses, hubo evidencia de una formación de hueso incrementada en todos los grupos en comparación al punto de tiempo de dos meses. No hubo una evidencia radiográfica de cualquier remodelación de hueso anormal, reabsorción de raíz, o anquilosis en cualquier grupo.

Tabla 3. Resultados Radiográficos. Orden de Rango. l=más llenado; 7=menos llenado C. Análisis Histomorfométrico: La evaluación histomorfométrica de la longitud del nuevo cemento, del nuevo hueso, y del nuevo ligamento periodontal (CNAA) así como el llenado de hueso nuevo, llenado de tejido de conexión, y espacio hueco se evaluaron y son expresados como porcentajes. En el caso de los valores CNAA para cada grupo de prueba representó la medición CNAA (longitud en milímetro) /total disponible de longitud CNAA (en milímetros) x 100%. El llenado de hueso, el llenado de tejido conector y el espacio hueco fueron evaluados y son expresados como porcentajes del área de defecto de bifurcación total.

Un análisis de una vía de variación (ANOVA) fue usado para probar las diferencias globales entre los grupos de tratamiento y de forma similar las comparaciones se hicieron usando la prueba t de estudiante. Las diferencias significantes entre los grupos fueron encontradas con el análisis de las platinas codificadas. La Tabla 4 muestra los resultados a dos meses .

Tabla 4. Análisis histométrico de dos meses fi Los Grupos 2 y 3 significativamente mayores de (p<0.05) que los Grupos 4 y 7. ;J< El Grupo 1 significativamente mayor (p<0.05) que el Grupo 4.

T El Grupo 2 significativamente mayor de (p<0.05) que el Grupo 5. T Los Grupos 2 y 3 significativamente mayores que los Grupos 1 , 4 y 7. " j¿ El Grupo 6 significativamente mayor que el Grupo 4. periodontal de porciento medio (CNAA) en las cirugías sin injertos y los grupos de /3-TCP más cirugías solos fueron de 27% y 37%, respectivamente. En contraste, los grupos /3-TCP conteniendo rhPDGF-BB exhibieron una regeneración periodontal significativamente mayor (p<0.05) que la cirugías sin injerto o DFDBA solo (59% y 46% respectivamente para las concentraciones de 0.3 y 1.0 mg/ml en contra de 27% para el de cirugía sola y 13% para DFDBA solo). Finalmente, el grupo /5-TCP conteniendo 0.3 mg/ml rhPDGF-BB demostró una regeneración periodontal significativamente mayor (p<0.05) que la misma concentración de rhPDGF-BB combinada con el aloinjerto (59% en contra de 21%) .

El llenado de hueso fue significativamente mayor (p<0.05) en /3-TCP + 0.3 mg/ml rhPDGF-BB (84.0%) y el ß-T P + 1.0 mg/ml rhPDGF-BB (74.2%) grupos que en el ß-TCP solo (28%), cirugía sola (34%) o DFDBA solo (6%) grupos de tratamiento. También hubo un llenado de hueso mayor significativamente (p<0.05) para el grupo ß-TCP + 0.3 mg/ml de rhPDGF-BB comparado al grupo DFDBA + 0.3 mg/ml de rhPDGF-BB (84% y 20% respectivamente) .

El grupo de análisis examinó los datos de 8 semanas de los grupos DFDBA y del grupo de solo cirugía (Grupos 4, 5, 6, y 7) demostrando no diferencias estadísticamente significativas entre los grupos DFDBA y de cirugía sola para regeneración periodontal (CNAA) . Hubo una tendencia a una mayor regeneración para aquéllos sitios tratados con 1.0 mg/ml de rhPDGF-BB mejorado DFDBA en contra de solo DFDBA. Hubo un llenado de huesos significativamente mayor (p<0.05) para sitios tratados con DFDBA + 1.0 mg/ml rhPDGF-BB que DFDBA solo (46 y 6% respectivamente) . Hubo una tendencia hacia un llenado de hueso para sitios tratados con DFDBA conteniendo 0.3 mg/ml de rhPDGF-BB comparado con DFDBA solo o cirugía sola. Sin embargo, los sitios tratados con DFDBA solo demostraron menos llenado de hueso en el defecto que la cirugía sola (6 y 34%, respectivamente) , con la mayoría del defecto estando desprovisto de cualquier llenado o llenado consistiendo de tejido de conexión gingival (suave) .

A cuatro meses después del tratamiento, hubo diferencias significantes en la regeneración periodontal. El ß- TCP solo, como un resultado de anquilosis extensiva resultó en 36% de regeneración, mientras que los sitios tratados con /3-TCP conteniendo rhPDGF-BB tuvieron una regeneración media de 58% y 49% en las concentraciones de 0.3 y 1.0 mg/ml de rhPDGF-BB.

El llenado de hueso sustancial estuvo presente en todos los tres grupos de tratamiento. El ß-TCP sólo resultó en 70% de llenado de hueso, el ß-TCP + 0.3 mg/ml de rhPDGF dio 100% de llenado mientras que el 1.0 mg/ml del grupo rhPDGF llenó hasta 75%.

D. Evaluación Histológica La evaluación histológica se llevó a cabo para todas las biopsias excepto una, en la cual la evaluación no fue posible debido a dificultades encontradas durante el procesamiento.

Las fotomicrografías representativas están mostradas en las figuras 1A-G y 2A-C. La figura ÍA muestra los resultados desde un sitio tratado con sólo cirugía (sin injerto) . Este espécimen demostró la regeneración periodontal limitada (hueso nuevo (NB) , nuevos cemento (NC) , y ligamento periodontal (PDL) ) como se evidenció en el área de las muescas y se extendió sólo por una distancia coronalmente . El área de la bifurcación está ocupada primariamente por un tejido conector suave denso (CT) con una formación de hueso nuevo mínima (NB) .

Para los sitios tratados con sólo ß-TCP (figura IB) hay una regeneración periodontal similar a aquella observada para la cirugía de espécimen sólo, que se extiende desde la base de las muescas por una distancia de corona corta. Como puede verse en los especímenes de sólo cirugía, hubo muy poca formación de hueso nuevo con el área más grande de la bifurcación estando ocupada por un tejido conector suave.

En contraste, la figura 1C ilustra los resultados obtenidos para sitios tratados con ß-TCP + 0.3 mg/ml rhPDGF-BB. La regeneración periodontal significante está mostrada con nuevo hueso, nuevo cemento y ligamento periodontal que se extiende a lo largo de la superficie completa de la bifurcación. Adicionalmente, el área de la bifurcación está llenada con nuevo hueso que se extiende a la altura completa de la bifurcación hasta la bóveda.

Los resultados representativos para los sitios tratados con ß-TCP + 1.0 mg/ml rhPDGF-BB están mostrados en la figura ID. Aún cuando hay una regeneración periodontal significante en la bifurcación, ésta no se extiende a lo largo de la superficie completa de la bifurcación. Hay una nueva formación de hueso presente a lo largo del tejido conector suave que es observado en la porción de corona del defecto junto con un espacio pequeño el cual está desprovisto de cualquier tejido (VO) en la bóveda de la bifurcación.

Las figuras 2A, 2B y 2C ilustran los resultados obtenidos por los grupos de tratamiento de aloinjerto. Los resultados representativos para el grupo de DFDBA sólo (figura 2A) muestra una regeneración periodontal muy pobre que está limitada al área de las muescas extendiéndose sólo ligeramente en la dirección de la corona. La nueva formación de huesos está limitada y consiste de cantidades pequeñas de formación de hueso a lo largo de la superficie del material de injerto DFDBA residual (mancha roja oscura a lo largo de las islas rosas más claras) . Adicionalmente, el nuevo hueso está rodeado por un tejido conector suave extensivo que se extiende por corona para llenar un área significante dentro de la bifurcación. Finalmente, un espacio hueco grande se extiende desde la extensión de corona del tejido conector suave a la bóveda de la bifurcación.

Los resultados histológicos para el DFDBA + 0.3 y 1.0 mg/ml rhPDGF-BB están mostrados en las figuras 2B y 2C, respectivamente. Ambos grupos demuestran una regeneración periodontal mayor en comparación al DFDBA sólo con un nuevo aparato de sujeción (nuevo hueso, nuevo cemento y ligamento periodontal) extendiéndose desde la base de las muescas en las raíces por una distancia de corona corta (flecha) . Esto también tuvo un llenado de hueso mayor dentro del área de bifurcación, aún cuando hubo un llenado significante de la bifurcación con el tejido conector suave.

Conclusiones Basado sobre los resultados del estudio, el tratamiento de un defecto periodontal usando rhPDGF-BB a ya sea 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL en combinación con un material portador adecuado (por ejemplo ß-TCP resulta en una regeneración periodontal mayor que los procedimientos o productos actuales, tal como los injertos, ß-TCP o sólo aloinjerto de hueso, o cirugía periodontal sin injertos.

El tratamiento con 0.3 mg/mL y 1.0 mg/mL de concentración de rhPDGF resulto en una regeneración periodontal. La concentración de 0.3 mg/ml del rhPDGF demostró una regeneración periodontal mayor y un por ciento de llenado de hueso en comparación a la concentración de 1.0 mg/ml de rhPDGF cuando se mezcló con ß-TCP.

El ß-TCP fue más efectivo que el aloinjerto cuando se mezcló con rhPDGF-BB a cualquier concentración. El nuevo hueso madurado (remodelado) normalmente sobre el tiempo (0, 8, y 16 semanas) en todos los grupos. No hubo un aumento en la anquilosis o reabsorción de raíz en los grupos rhPDGF. De hecho, los sitios que reciben rhPDGF-BB tendieron a tener menos anquilosis de los sitios de control. Este hallazgo puede resultar del hecho de que el rhPDGF-BB es mitogénico y quemotáctico para las células de ligamento periodontal.

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Utilizados : Artículos de Prueba y Control El ß-TCP utilizado tuvo un tamaño de partícula (0.25 mm - 1.0 mm) que fue optimizado para el uso periodontal. Basado sobre los estudios usando un modelo canino, el ß-TCP administrado es -80% reabsorbido dentro de tres meses y es reemplazado por hueso antologo durante el proceso de saneamiento.

El DFDBA fue suministrado por la fundación de transplante músculo esqueleto (MTF) . El material fue un aloinjerto de perro, hecho de huesos de un perro que fue sacrificado después de completar otro estudio que probó un procedimiento quirúrgico que fue considerado que no tuvo efecto sobre los tejidos esqueletales.

El hPDGF-BB recombinante fue suministrado por BioMimetic Pharmaceuticals y fue fabricado por Chiron, Inc., el único proveedor de rhPDGF-BB aproximado por la administración de drogas y alimentos para uso humano. Este rhPDGF-BB fue aprobado por la administración de drogas y alimentos como un producto para saneamiento de herida bajo el nombre de comercio Regranex®.

Las jeringas de un mililitro conteniendo 0.5 ml de rhPDGF-BB estéril a dos concentraciones separadas preparadas de conformación con los estándares FDA para materiales humanos y de acuerdo al proceso de buena fabricación aplicable actualmente (cGMP) . Las concentraciones probadas incluyeron 0.3 mg/ml y 1.0 mg/ml .

El ß-TCP fue proporcionado en recipientes conteniendo 0.5 centímetros cúbicos de partículas estériles.

El DFDBA fue proporcionado en jeringas de 2.0 mililitros conteniendo 1.0 centímetros cúbicos de aloinjerto de hueso de perro secado-congelado desmineralizado y estéril.

Preparación de Material En el momento del procedimiento quirúrgico, los injertos implantados finales fueron preparados mediante el mezclar la solución de rhPDGF-BB con materiales de matriz. Brevemente, una cantidad de TCP o de aloinjerto suficiente para llenar completamente el defecto óseo se colocó en un plato estéril. La solución de rhPDGF-BB suficiente para completamente saturar la matriz fue entonces agregada, los materiales fueron mezclados y se dejaron asentar sobre la charola quirúrgica por alrededor de 10 minutos a la temperatura ambiente antes de colocarse en el defecto óseo.

A 10 minutos de tiempo de incubación con el material ß-TCP es suficiente el obtener una adsorción máxima del factor de crecimiento (vea el apéndice A) . Esta es también una cantidad apropiada de tiempo para los cirujanos en un ambiente clínico para tener antes de la colocación del producto en el defecto periodontal. En forma similar, en un mercado comercial, el rhPDGF-BB y el material de matriz pueden ser suministrados en recipientes separados en un estuche y que los materiales pueden ser mezclados directamente antes de la colocación. Este concepto de estuche simplificará grandemente las consideraciones de vida/estabilidad en el anaquel del producto.

Ejemplo III: Uso de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas para el Tratamiento de Defectos de Hueso Periodontal en Humanos El PDGF-BB humano recombinante (rhPDFG-BB) fue probado para su efecto sobre la regeneración del hueso periodontal en los sujetos humanos. Dos grupos de prueba fueron administrados con el rhPDGF-BB a cualquiera 0.3 mg/ml (grupo I) o 1.0 mg/ml (grupo II). El rhPDGF-BB fue preparado en amortiguador de acetato de sodio y se administró en un vehículo de fosfato beta-tricalcio (ß-TCP) . El grupo de control, el grupo III, fue administrado con el ß-TCP en sólo amortiguador de acetato de sodio.

El objetivo del estudio clínico fue de evaluar la seguridad y efectividad del material de injerto, comprendiendo ß-TCP y rhPDGF-BB a ya sea 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL en el manejo de uno (1) a tres (3) defectos periodontales de pared interior ósea y para tener acceso a su capacidad regenerativa en el tejido de hueso y suave.

Diseño de Estudio y Duración del Tratamiento: El estudio fue un estudio ciego doble, controlado, prospectivo, al azar, diseñado en forma paralela, de multicentro clínico en sujetos quienes requirieron intervención quirúrgica para tratar un defecto de hueso a un lado de la dentición natural. Los sujetos fueron dotados al azar de proporciones iguales para resultar en tres grupos de tratamiento de aproximadamente de 60 sujetos cada uno (180 total) . La duración del estudio fue de seis (6) meses después de la implantación del dispositivo de estudio. El estudio enroló 180 sujetos.

Diagnosis y Cri terio de Entrada Principal Los sujetos varones y mujeres, de 25-75 años de edad, con enfermedad periodontal avanzada en por lo menos un sitio requirieron tratamiento quirúrgico para corregir un defecto de hueso y fueron admitidos a este estudio. Otros criterios de inclusión incluyeron: 1) una bolsa de sonda de profundidad midiendo 7 milímetros o más en la visita de línea de base; 2) después del escombrado quirúrgico, un defecto de hueso vertical de 4 milímetros o mayor (BB) con por lo menos una pared de hueso; 3) tejido querapinzado suficiente para permitir la curvatura de tejido completa del defecto; y 4) base radiográfica del defecto de por lo menos de 3 milímetros de corona a vértice del diente. Los sujetos quienes fumaron hasta un paquete al día y quienes tuvieron los dientes en la bifurcación de clase I y II fueron específicamente permitidos.

Dosis y Modo de Administración Todos los estuches de tratamiento contuvieron 0.25 gramos de ß-TCP (un control activo) y cualquiera 0.5 ml de solución amortiguadora de acetato de sodio sola (grupo III), 0.3 mg/mL de rhPDGF-BB (grupo I), o 1.0 mg/mL de rhPDGF (grupo II).

Después de un descombrado completo y planeación de raíz, la solución de prueba fue mezclada con ß-TCP en un recipiente estéril, de manera que el ß-TCP fue saturado completamente. Las superficies de raíz fueron acondicionadas usando ya sea tetraciclina, EDTA, o ácido cítrico. El injerto hidratado fue entonces empacado en el defecto óseo y las aletas de tejido fueron aseguradas con suturas interdentales para lograr una cobertura completa del sitio quirúrgico.

Medición de Efectividad La medición de efectividad primaria incluyó el cambio en nivel de sujeción clínica (CAL) entre la línea de base y la pos-cirugía después de seis meses (grupo I contra grupo III) . Las mediciones de efectividad secundaria consistieron de los siguientes resultados: 1) crecimiento de hueso lineal (LBG) y % de llenado de hueso (%BF) desde la línea de base a seis meses después de la cirugía con base en evaluaciones radiográficas (grupo I y grupo II contra grupo III) ; 2) cambio en el nivel de sujeción clínica entre la línea de base y seis meses después de la cirugía (grupo II contra grupo III); 3) la reducción de profundidad de bolsa de sonda (PDR) entre la línea de base y seis meses después de la cirugía (grupo I y grupo II contra grupo III) ; 4) recesión gingival (GR) entre línea de base y seis meses después de la cirugía (grupo I y grupo II en contra de grupo III) ; 5) sanado de herida (WH) del sitio quirúrgico durante las primeas tres semanas después de la cirugía (grupo I y grupo II en contra de grupo III) ; 6) área debajo de la curva para el cambio en nivel de sujeción clínico entre línea de base y tres y seis meses (grupo I y grupo II en contra de grupo III) ; 7) el 95% de unión de confianza inferior (LCB) para %BF a seis meses después de la cirugía (grupos I, II y III, contra aloinjerto de hueso congelado-secado desmineralizado (DFDBA) co o se publicó en la literatura; paraseis y otros, J.

Periodontal. 69:751-758, 1998); 8) el 95% de LCB para crecimiento de hueso lineal a seis meses después de la cirugía (grupos I, II y III contra aloinjerto de hueso secado-congelado desmineralizado (DFDBA) como se publicó en la literatura; Persson y otros, J. Clin. Periodontal. 27:104-108, 2000); 9) el 95% de LCB para el cambio en CAL entre la línea de base y seis meses (grupos I, II y III contra EMDOGAIN® - PMA P930021, 1996); y 10) el 95% de LCB para el cambio en nivel de sujeción clínico entre línea de base y seis meses (grupos I, II y III contra PEPGEN p-i5marca _ PMA P990033, 1999).

Métodos Estadísticos Los datos de seguridad y efectividad fueron examinados y resumidos por las estadísticas descriptivas. Las mediciones categóricas fueron exhibidas como cuentas y por cientos y continuos variables fueron exhibidos como medios, medianos, desviaciones estándar y rangos. Las comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento de producto de prueba (grupos I y II) y el de control (grupo III) se hicieron usando las pruebas Chi-Square y Fisher' s Exact para variables categóricos y t-pruebas o análisis de métodos de variación (ANOVA) para variables continuas. Las comparaciones entre los grupos de tratamiento para variables ordinarias fueron hechas usando los métodos Cochran-Mantel-Hsenszel . Un p<0.05 (un lado) fue considerado como significativamente estadístico para CAL, LBG y %BF.

Los datos de seguridad fueron evaluados por la frecuencia y severidad de eventos adversos como se evalúo clínicamente y radiográficamente. No hubo diferencias significantes entre los tres grupos de tratamiento en la línea a de base. No hubo diferencias significantes estadísticamente observadas en la incidencia de eventos adversos (AEs; todas las causas) entre los tres grupos de tratamiento. El análisis de seguridad no identificó ningún riesgo incrementado para el sujeto debido a la implantación del material de injerto.

Síntesis de Resultados de Efectividad Los resultados del análisis estadístico revelaron ambos beneficios significantes clínicamente y estadísticamente para los dos grupos de tratamiento (grupos I y II) , en comparación al control activo de ß-TCP sólo (grupo III) y los controles históricos incluyendo DFDBA, EMDOGAIN®, y PEPGEN P- -i ,-marca A tres meses después de la cirugía, una ganancia de nivel de sujeción clínica estadísticamente' significante desde la línea de base fue observada a favor del grupo I en contra del grupo III (p = 0.041), indicando que hubo beneficios tempranos significantes de factor de crecimiento derivado de plaqueta en la ganancia en el nivel de sujeción clínico. A seis meses después de la cirugía, ésta tendencia continuó a favor del grupo I sobre el grupo III, aún cuando ésta diferencia no fue estadísticamente significante (p = 0.200). El área debajo del análisis de curva (AUC) que representó el defecto acumulativo (por ejemplo velocidad) para la ganancia de nivel de sujeción clínica entre la línea de base y seis meses se acercó a la significancia estadística favoreciendo el grupo I en comparación al grupo III (p = 0.054) . Además, el 95% de los análisis de unión de confianza inferior (LCB) para todos los grupos de tratamiento sustanciaron la efectividad de los grupos I y II en comparación a las ganancias de nivel de sujeción con clínica a seis meses para ENDOGAIN® y PEPGEN P-15marca.

En adición a los beneficios clínicos observados del nivel de sujeción clínico, los análisis radiográficos incluyendo el crecimiento de hueso lineal (LBG) y el por ciento de llenado de hueso (%BF) , revelaron una mejora estadísticamente significante en la ganancia de hueso para los grupos I y II en contra del grupo III. El %BF fue definido como el por ciento del defecto óseo original llenado con nuevo hueso como se midió radiográficamente. El LBG mostró una mejora significante en el grupo I (2.5 milímetros) cuando se comparó el grupo III (0.9 mm, p<0.001). El LBG también fue significante para el grupo II (1.5 milímetros) cuando se comparó con el grupo III (p = 0.021).

El por ciento de llenado de hueso (%BF) fue aumentado significativamente a seis meses después de la cirugía en el grupo I (56%) y grupo II (34%) cuando se comparó el grupo III (18%), para un p<0.001 y p = 0.019, respectivamente. El 95% del límite inferior del intervalo de confianza a seis meses después de la cirugía, para ambos el crecimiento de hueso lineal y el por ciento de llenado de hueso sustanció la efectividad de los grupos I y II en comparación a los resultados radiográficos publicados para DFDBA, el material más ampliamente usado para procedimientos de injerto periodontal.

A tres meses, hubo una recesión gingival significativamente menor (GR) (p = 0.041) para el grupo I en comparación al grupo III consistente con el efecto benéfico observado con el nivel de sujeción clínico. No fueron observadas diferencias estadísticamente significantes en el PDR y GR a seis meses. El análisis descriptivo del número de sitios exhibiendo el sanado de herida completo (WH) a tres semanas reveló mejoras en el grupo I (72%) contra el grupo II (60%) y el grupo III (55%) , indicando una corriente hacia el sanado mejorado.

Para evaluar el efecto benéfico acumulativo para los resultados clínicos y radiográficos, se llevó a cabo un análisis de efectividad compuesto para determinar el por ciento de pacientes con un resultado exitoso como se definió por CAL > 2.7 mm y LBG > 1.1 mm a seis meses. Los estándares de éxito de CAL y LBG fueron establecidos por los niveles medios logrados, para éstos parámetros por los injertos implantados, como se identificó en la sección de "medidas de efectividad" dada arriba. Los resultados mostraron que 61.7% del grupo I de pacientes y 37.9% de los pacientes del grupo II alcanzaron o excedieron el estándar compuesto para el éxito en comparación a 30.4% del grupo de pacientes III, resultando en un beneficio estadísticamente significante del grupo I contra el grupo III (p < 0.001). El %BF reveló beneficios similares para el grupo I (70%) contra el grupo III (44.6%) para el valor-p de 0.003.

En resumen, el grupo I logró beneficios estadísticos para CAL y GR a tres meses así como LBG y %BF a seis meses, en comparación al grupo de control activo sólo de ß- TCP (grupo III) . El significado clínico de éstos resultados está además confirmado por la comparación con controles históricos. Se concluyó que el material de injerto conteniendo PDGF fue mostrado para lograr una efectividad clínica radiográfica por seis meses para el tratamiento de efectos óseos periodontales .

Tabla 5: Resumen de Efectividad de Injerto de Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta Material de injerto (por ejemplo, ß-TCP) conteniendo factor de crecimiento derivado de plaqueta a 0.3 mg/mL y a 1.0 mg/mL mostró ser seguro y efectivo en la restauración de hueso alveolar y la sujeción clínica alrededor del diente con una periodontítis moderada avanzada en el ensayo clínico al azar grande involucrando 180 sujetos estudiados por hasta 6 meses. Estas conclusiones están basadas sobre mediciones radiográficas y clínicas validadas como se resume aba o .

Consistente con los datos de biocompatibilidad del material de injerto conteniendo PDGF, discutido arriba, y el uso seguro histórico de cada componente individual (por ejemplo, ß- TCP sólo o PDGF sólo) , el estudio reveló que no hay evidencia ya sea de efectos adversos locales o sistémicos. No hubo resultados adversos atribuibles al material de injerto el cual fue seguro de usar.

Conclusión La implantación de ß-TCP conteniendo PDGF a cualquiera 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL se encontró que fue un tratamiento efectivo para la restauración del nivel de sujeción de tejido suave y del hueso como se mostró por un nivel de sujeción clínico mejorado significativamente a tres meses en comparación al control activo. Nuestros hallazgos también son consistentes con el análisis AUC que mostraron una mejora en la ganancia de nivel de sujeción clínica entre la línea de base y seis meses. La implantación de ß-TCP conteniendo PDGF a cualquiera 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL también se encontró que fue un tratamiento efectivo basado sobre un LBG y %BF significativamente mejorado en comparación al control activo. Los resultados clínicos mejorados significativamente como se mostraron por el análisis compuesto de ambas mediciones de tisú suave y duro en comparación al control activo sólo de ß-TCP también demostraron la efectividad del protocolo de tratamiento descrito arriba. Finalmente, los resultados de administrar ß-TCP conteniendo PDGF a cualquiera 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL se encontraron que excedieron los estándares establecidos de efectividad tanto clínicamente como radiográficamente.

Los resultados de peste ensayo junto con los datos extensivos y de confirmación invitro, de estudios animales y humanos demostraron que el material de injerto conteniendo PDGF simula la regeneración de tejido suave y duro en defectos periodontales, aún cuando los defectos fueron más significantes cuando el factor de crecimiento derivado de plaqueta en el rango de 0.1 a 1.0 mg/mL (por ejemplo 0.1 mg/mL, 0.3 mg/mL o 1.0 mg/mL) fueron administrados en el material de injerto. Además, el factor de crecimiento derivado de plaqueta administrado en el material de injerto en la cantidad de 0.3 mg/mL efectivamente regeneró el tejido suave y el hueso.

Otras incorporaciones están dentro de las cláusulas que se dan a continuación.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un método para promover el crecimiento del hueso, periodontio, ligamento o cartílago de un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero un material de injerto que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL en un portador líquido farmacéuticamente aceptable y un portador sólido farmacéuticamente aceptable, en donde dicho material de injerto promueve el crecimiento de dicho hueso, periodontio, ligamento o cartílago.

2. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta tiene una concentración de alrededor de 0.3 mg/mL.

3. El método tal y como se reivindica en la cláusula 2, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta tiene una concentración de 0.3 mg/mL.

4. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el portador sólido farmacéuticamente aceptable comprende uno o más de los siguientes: un aglutinante biocompatible, un agente de sustitución de hueso o un gel.

5. El método tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque el aglutinante biocompatible es un polímero natural o sintético.

6. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque dicho polímero natural o sintético es seleccionado de polisacaridos, ácidos nucleicos, carbohidratos, proteínas, polipéptidos, colágeno, poli (a-hidroxi ácidos), poli (lactona) , poli (amino ácidos), poli (anhídridos) , poli (ortoésteres) , poli (anhídrido-co-imidas) , poli (ortocarbonatos) , poli (a-hidroxi alcanoatos), poli (dioxanonas) , poli (fosfoésteres) , ácido poliláctico), poli (L-láctido) (PLLA) , poli (D, L-láctido) (PDLLA) , ácido poliglicólico, poliglicolido (PGA) , poli (láctido-co-glicolido (PLGA), poli (L-láctido-co-D, L-láctido), poli (D, L-láctido-co-trimetileno carbonato), polihidroxibutileno (PHB) , poli (e-caprolactona) , poli (d-valerolactona) , poli (?-butirolactona) , poli (caprolactona) , ácido poliacrílico, ácido policarboxílico, poli (hidrocloruro de alilamina) , poli (cloruro de dialildimetilamonio) , poli (etilenimina) , fumarato de polipropileno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, polietileno, polimetilmetacrilato, fibras de carbón, poli (etilen glicol), poli (óxido de etileno), poli (alcohol de vinilo), poli (vinilpirrolidona) , poli (etiloxazolina) , poli (óxido de etileno) -co-poli (óxido de propileno) copolímeros de bloque, poli (tereftalato de etileno) poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos .

7. El método tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque dicho polímero natural o sintético es seleccionado de colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico y polimetilmetacrilato.

8. El método tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque dicho aglutinante biocompatible es seleccionado de ácido algínico, goma arábiga, goma guar, goma de xantano, gelatina, quitina, quitosana, acetato de quitosana, lactato de quitosana, sulfato de condroitina, N, O-carboximetil quitosana, un dextran, goma fibrin, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, una celulosa, una glucosalina, una proteoglican, un almidón, ácido láctico, un plurónico, un glicerofosfato de sodio, colágeno, glicogen, una queratina, seda, y derivados y mezclas de los mismos.

9. El método tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque el aglutinante biocompatible es hialuronato de sodio o derivados de los mismos.

10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque el aglutinante biocompatible es ácido hialurónico.

11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque el aglutinante biocompatible es seleccionado de metil celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, o hidroxietil celulosa.

12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque dicho aglutinante biocompatible es carboximetilcelulosa.

13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 8, caracterizado porque dicho dextran es a-ciclodextrina, ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina, o sulfato dextran de sodio .

14. El método tal y como se reivindica en la cláusula 8, caracterizado porque dicho almidón es almidón de hidroxietilo o almidón soluble.

15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 4, caracterizado porque dicho agente de sustitución de hueso es seleccionado de fosfato de calcio, sulfato de calcio o hueso desmineralizado.

16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque dicho fosfato de calcio es seleccionado de fosfato tricalcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio, y fosfato octacalcio.

17. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque dicho fosfato de calcio está proporcionado como una pasta o masa que forma un fosfato de calcio endurecido con la administración en vivo.

18. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque el fosfato de calcio se proporciona como un fosfato de calcio endurecido.

19. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque el fosfato de calcio es bioabsorbible .

20. El método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicho fosfato de tricalcio es ß-fosfato tricalcio (ß-TCP) .

21. El método tal y como se reivindica en la cláusula 20, caracterizado porque el ß-TCP comprende una matriz de partículas de tamaño de miera o de submicra.

22. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21, caracterizado porque las partículas de ß-TCP tienen un tamaño de menos de alrededor de 5,000 µm.

23. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21, caracterizado porque las partículas de ß-TCP tienen un tamaño en el rango de alrededor de 100 a alrededor de 5,000 µim.

24. El método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dichas partículas de ß-TCP tienen un tamaño en el rango de alrededor de 100 a alrededor de 3,000 µm.

25. El método tal y como se reivindica en la cláusula 24, caracterizado porque las partículas de ß-TCP tienen un tamaño en el rango de alrededor de 250 a alrededor de 2,000 µm.

26. El método tal y como se reivindica en la cláusula 21, caracterizado porque las partículas de ß-TCP son porosas .

27. El método tal y como se reivindica en la cláusula 26, caracterizado porque las partículas de ß-TCP son mayores de 40% porosas.

28. El método tal y como se reivindica en la cláusula 27, caracterizado porque las partículas de ß-TCP son mayores de 65% porosas.

29. El método tal y como se reivindica en la cláusula 28, caracterizado porque las partículas de ß-TCP son mayores de 90% porosas.

30. El método tal y como se reivindica en la cláusula 20, caracterizado porque el ß-TCP es proporcionado en una forma adecuada para la implantación.

31. El método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque dicha forma es seleccionada de una esfera, un cilindro y un bloque.

32. El método tal y como se reivindica en la cláusula 15, caracterizado porque el hueso desmineralizado es hueso cortical o poroso.

33. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho portador líquido farmacéuticamente aceptable es seleccionado de agua, un amortiguador fisiológicamente aceptable o un medio de cultivo de célula.

34. El método tal y como se reivindica en la cláusula 33, caracterizado porque el amortiguador fisiológicamente aceptable es un amortiguador de acetato de sodio.

35. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha composición además comprende un agente biológicamente activo.

36. El método tal y como se reivindica en la cláusula 35, caracterizado porque dicho agente biológicamente activo es seleccionado de un anticuerpo, un antibiótico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, un agente en contra del cáncer, un factor de crecimiento, un agente en contra de la inflamación y una vacuna.

37. El método tal y como se reivindica en la cláusula 36, caracterizado porque dicha proteína es una proteína osteogénica .

38. El método tal y como se reivindica en la cláusula 37, caracterizado porque dicha proteína osteogénica es seleccionada de un factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF- I) , un factor de crecimiento de tipo insulina II (IGF- II) , un factor de crecimiento de transformación-ßl (TGF-ßl) , un factor de crecimiento de transformación-ß2 (TGF-ß2) , un factor de crecimiento de transformación-a (TGF-a) , un proteína morfogenética de hueso (BMP), u osteogenina.

39. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el material de injerto además comprende extractos de plaqueta antólogos o médula de hueso autóloga.

40. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta está parcial o esencialmente purificado.

41. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es obtenido de una fuente natural o de una fuente recombinante.

42. El método tal y como se reivindica en la cláusula 41, caracterizado porque dicha fuente natural comprende sangre, plaquetas, suero, concentrado de plaqueta, plasma rico en plaqueta (PRP) , o médula de hueso.

43. El método tal y como se reivindica en la cláusula 41, caracterizado porque dicha fuente natural es plasma rico en plaqueta (PRP) .

44. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el material de injerto entrega dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta a dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago por lo menos 1 día después de la administración.

45. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho material de injerto entrega dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta a dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago por menos de alrededor de 28 días día después de la administración.

46. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el material de injerto entrega dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta a dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago por menos de alrededor de 21 días día después de la administración.

47. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho material de injerto entrega dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta a dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago por menos de alrededor de 14 días día después de la administración.

48. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho material de injerto entrega dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta a dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago de desde alrededor de 1 día a alrededor de 14 días día después de la administración.

49. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago está dañado.

50. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado además porque comprende el paso de permitir a dicho hueso, periodontio, ligamento o cartílago el crecer.

51. El método tal y como se reivindica en la cláusula 50, caracterizado además porque comprende los pasos de exponer dicho hueso, periodontio, ligamento o cartílago mediante el producir una aleta quirúrgica de piel antes de administrar dicho material de injerto, y remplazar dicha aleta después de administrar dicho material de injerto.

52. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado además porque comprende después del paso de producir una aleta quirúrgica de piel para exponer dicho hueso, periodontio o ligamento, pero antes del paso (a) , el paso de planear dicho hueso o periodontio para remover materia orgánica de dicho hueso o periodontio.

53. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de injerto con la administración a una tasa promedio de menos de o igual a 300 µg/día.

54. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de injerto con la administración a una tasa promedio de menos de o igual a 100 µg/día.

55. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de injerto con la administración a una tasa promedio de menos de o igual a 50 µg/día.

56. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de injerto con la administración a una tasa promedio de menos de o igual a 10 µg/día.

57. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es liberado del material de injerto con la administración a una tasa promedio de menos de o igual a 1 µg/día.

58. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho portador líquido farmacéuticamente aceptable es estéril.

59. El método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es PDGF AA, PDGF BB, PDGF CC, o PDGF DD, o combinaciones o derivados de los mismos.

60. El método tal y como se reivindica en la cláusula 59, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es PDGF-BB.

61. El método tal y como se reivindica en la cláusula 59, caracterizado porque dicho factor de crecimiento derivado de plaqueta es PDGF-AB.

62. Un método para promover el crecimiento del hueso, perodontio, ligamento o cartílago de un mamífero que comprende (a) administrar a dicho mamífero un material de injerto que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de menos de o igual a 0.3 mg/mL en un portador líquido farmacéuticamente aceptable y un portador sólido farnmacéuticamente aceptable, en donde dicho material de implanto promueve el crecimiento de dicho hueso, periodontio, ligamento, o cartílago.

63. Un recipiente que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL alrededor de 1.0 mg/mL en un líquido farmacéuticamente aceptable.

64. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 63, caracterizado porque el líquido es un amortiguador de acetato de sodio estéril .

65. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 63, caracterizado porque comprende factor de crecimiento derivado de plaqueta a una concentración de alrededor de 0.3 mg/mL.

66. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 63, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es PDGF-BB.

67. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 64, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es estable en dicho amortiguador por lo menos por 36 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2o C a 80° C.

68. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 64, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es estable por lo menos 24 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ° C a 80° C.

69. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 64, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es estable por lo menos 18 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2o C a 80° C.

70. El frasco recipiente tal y como se reivindica en la cláusula 64, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es estable por lo menos 12 meses cuando se almacena a una temperatura en el rango de 2 ° C a 80° C.

71. Un material de injerto que comprende un fosfato de calcio poroso teniendo adsorbido ahí un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL.

72. El material de injerto tal y como se reivindica en la cláusula 71, caracterizado porque la concentración de factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.3 mg/mL.

73. El material de injerto tal y como se reivindica en la cláusula 71, caracterizado porque el fosfato de calcio es seleccionado de fosfato tricalcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio, y fosfato octacalcio.

74. El material de injerto tal y como se reivindica en la cláusula 71, caracterizado porque el factor de crecimiento derivado de plaqueta es proporcionado en un líquido estéril.

75. El material de injerto tal y como se reivindica en la cláusula 74, caracterizado porque dicho líquido es un amortiguador de acetato de sodio.

76. Un método para preparar un material de injerto que comprende saturar un material de fosfato de calcio en un líquido estéril que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) a una concentración en el rango de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL.

77. El método tal y como se reivindica en la cláusula 76, caracterizado porque la concentración de factor de crecimiento derivado de plaqueta es de alrededor de 0.3 mg/mL.

78. El método tal y como se reivindica en la cláusula 76, caracterizado porque el fosfato de calcio es seleccionado de fosfato tricalcio, hidroxiapatita, hidroxiapatita pobremente cristalina, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, dihidrato de fosfato dicalcio, fosfato heptacalcio, dihidrato de pirofosfato de calcio, pirofosfato de calcio, y fosfato octacalcio. R U M E N Un método para promover el crecimiento de hueso, periodontio, ligamento o cartílago en un mamífero mediante aplicar al hueso, periodontio, ligamento o cartílago una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta a una concentración en el rango de alrededor de 0.1 mg/mL a alrededor de 1.0 mg/mL en un portador líquido farmacéuticamente aceptable y un portador sólido farmacéuticamente aceptable.