JP3482207B2 - 増殖分化因子−９ - Google Patents
増殖分化因子−９Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、
特定的には形質転換増殖因子−β（transforming growt
h factor−β:TGF−β）スーパーファミリーの新メンバ
ーである増殖分化因子−９（growth differentiation f
actor−3:GDF−９）に係わるものである。
特定的には形質転換増殖因子−β（transforming growt
h factor−β:TGF−β）スーパーファミリーの新メンバ
ーである増殖分化因子−９（growth differentiation f
actor−3:GDF−９）に係わるものである。
2.関連技術分野の説明
形質転換増殖因子−β（TGF−β）スーパーファミリ
ーは、胚発生中の広範な分化過程に影響を及ぼす、構造
的に関連したタンパク質の一群を包含する。このファミ
リーには、正常な雄性発達に必要とされるミュラー管阻
害物質（MIS）（Behringerら,Nature,345:167,1990）；
背−腹軸の形成および成虫原基の形態形成に必要とされ
るショウジョウバエのデカペンタプレジック（DPP）遺
伝子産物（Padgettら,Nature,325:81−84,1987）；卵の
植物極に局在するツメガエルVg−１遺伝子産物（Weeks
ら,Cell,51:861−867,1987）；ツメガエル胚における中
胚葉および前方構造の形成を誘導し得る（Thomsenら,Ce
ll,63:485,1990）アクチビン類（Masonら,Biochem.Biop
hys.Res.Commun.,135:957−964,1986）；および新たな
軟骨および骨の形成を誘導し得る（Sampathら,J.Biol.C
hem.,265:13198,1990）骨形態形成タンパク質（BMP、オ
ステオゲニン、OP−１）が含まれる。TGF−βは、脂質
生成、筋発生、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含
めて、さまざまな分化過程に影響を与えることができる
（再検討のため、Massague,Cell,49:437,1987を参照の
こと）。
ーは、胚発生中の広範な分化過程に影響を及ぼす、構造
的に関連したタンパク質の一群を包含する。このファミ
リーには、正常な雄性発達に必要とされるミュラー管阻
害物質（MIS）（Behringerら,Nature,345:167,1990）；
背−腹軸の形成および成虫原基の形態形成に必要とされ
るショウジョウバエのデカペンタプレジック（DPP）遺
伝子産物（Padgettら,Nature,325:81−84,1987）；卵の
植物極に局在するツメガエルVg−１遺伝子産物（Weeks
ら,Cell,51:861−867,1987）；ツメガエル胚における中
胚葉および前方構造の形成を誘導し得る（Thomsenら,Ce
ll,63:485,1990）アクチビン類（Masonら,Biochem.Biop
hys.Res.Commun.,135:957−964,1986）；および新たな
軟骨および骨の形成を誘導し得る（Sampathら,J.Biol.C
hem.,265:13198,1990）骨形態形成タンパク質（BMP、オ
ステオゲニン、OP−１）が含まれる。TGF−βは、脂質
生成、筋発生、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含
めて、さまざまな分化過程に影響を与えることができる
（再検討のため、Massague,Cell,49:437,1987を参照の
こと）。
TGF−βファミリーのタンパク質は、最初に大きな前
駆体タンパク質として合成され、その後前駆体タンパク
質はＣ末端側の約110〜140個のアミノ酸から成る塩基性
残基のクラスターで加水分解切断を受ける。これらのタ
ンパク質のＣ末端領域はどれも構造的に関連しており、
その相同度に基づいて、それぞれのファミリーメンバー
を別個のサブグループに分類することができる。特定の
サブグループ内の相同性は70〜90％アミノ酸配列同一性
の範囲であるが、サブグループ間の相同性は著しく低
く、一般的にはせいぜい20〜50％の範囲である。いずれ
の場合も、活性種はＣ末端フラグメントのジスルフィド
架橋二量体であると考えられる。これまでに研究された
大半のファミリーメンバーでは、ホモ二量体種が生物学
的に活性であるとされているが、インヒビン（Lingら,N
ature,321:779,1986）やTGF−β（Cheifetzら,Cell,48:
409,1987）のような他のファミリーメンバーについては
ヘテロ二量体も検出されており、これらはそれぞれのホ
モ二量体とは異なる生物学的性質をもつようである。
駆体タンパク質として合成され、その後前駆体タンパク
質はＣ末端側の約110〜140個のアミノ酸から成る塩基性
残基のクラスターで加水分解切断を受ける。これらのタ
ンパク質のＣ末端領域はどれも構造的に関連しており、
その相同度に基づいて、それぞれのファミリーメンバー
を別個のサブグループに分類することができる。特定の
サブグループ内の相同性は70〜90％アミノ酸配列同一性
の範囲であるが、サブグループ間の相同性は著しく低
く、一般的にはせいぜい20〜50％の範囲である。いずれ
の場合も、活性種はＣ末端フラグメントのジスルフィド
架橋二量体であると考えられる。これまでに研究された
大半のファミリーメンバーでは、ホモ二量体種が生物学
的に活性であるとされているが、インヒビン（Lingら,N
ature,321:779,1986）やTGF−β（Cheifetzら,Cell,48:
409,1987）のような他のファミリーメンバーについては
ヘテロ二量体も検出されており、これらはそれぞれのホ
モ二量体とは異なる生物学的性質をもつようである。
インヒビン類およびアクチビン類は最初に卵胞液から
精製されたもので、下垂体からの卵胞刺激ホルモンの放
出に対して反対の作用を有することが分かっている。３
種類すべてのインヒビン／アクチビンサブユニット（α
ａ、βＡおよびβＢ）のmRNAが卵巣で検出されている
が、これらはどれも卵巣特異的ではないようである（Me
unierら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:247,1988）。MIS
も顆粒膜細胞によって発現されることが判明しており、
卵巣発達に及ぼすMISの効果がMISを異所的に発現するト
ランスジェニックマウスによりin vivoで（Behringer,
前掲）、さらに器官培養によりin vitroで（Vigierら,D
evelopment,100:43,1987）論じられている。
精製されたもので、下垂体からの卵胞刺激ホルモンの放
出に対して反対の作用を有することが分かっている。３
種類すべてのインヒビン／アクチビンサブユニット（α
ａ、βＡおよびβＢ）のmRNAが卵巣で検出されている
が、これらはどれも卵巣特異的ではないようである（Me
unierら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:247,1988）。MIS
も顆粒膜細胞によって発現されることが判明しており、
卵巣発達に及ぼすMISの効果がMISを異所的に発現するト
ランスジェニックマウスによりin vivoで（Behringer,
前掲）、さらに器官培養によりin vitroで（Vigierら,D
evelopment,100:43,1987）論じられている。
発現パターンが組織特異的である新規因子の同定は、
その組織の発達および機能のより一層の理解をもたらす
だろう。
その組織の発達および機能のより一層の理解をもたらす
だろう。
発明の概要
本発明は、細胞増殖分化因子GDF−９、該因子をコー
ドするポリヌクレオチド配列、および該因子と免疫反応
性である抗体を提供する。この因子は種々の細胞増殖性
疾患、特に顆粒膜細胞腫のような卵巣の腫瘍を伴う疾患
に関係があるようである。
ドするポリヌクレオチド配列、および該因子と免疫反応
性である抗体を提供する。この因子は種々の細胞増殖性
疾患、特に顆粒膜細胞腫のような卵巣の腫瘍を伴う疾患
に関係があるようである。
従って、１つの実施態様において、本発明は、GDF−
９と関係がある卵巣起源の細胞増殖性疾患を検出する方
法を提供する。他の実施態様において、本発明は、GDF
−９活性を抑制または増強することにより、GDF−９の
異常な発現レベルと関係がある細胞増殖性疾患を治療す
る方法を提供する。
９と関係がある卵巣起源の細胞増殖性疾患を検出する方
法を提供する。他の実施態様において、本発明は、GDF
−９活性を抑制または増強することにより、GDF−９の
異常な発現レベルと関係がある細胞増殖性疾患を治療す
る方法を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、成体組織におけるGDF−９ mRNAの発現を示
す。
す。
図２は、マウスGDF−９のヌクレオチド配列および推
定アミノ酸配列を示す。共通のＮ−グリコシル化シグナ
ルを無地のボックスで示す。推定上の四塩基プロセシン
グ部位を点刻ボックスで示す。推定上の開始ATGの上流
にある同じ読み枠の終止コドンおよび共通のポリアデニ
レーションシグナルには下線が引いてある。ポリＡ尾部
は示してない。数字は5'末端からのヌクレオチド位置を
示す。
定アミノ酸配列を示す。共通のＮ−グリコシル化シグナ
ルを無地のボックスで示す。推定上の四塩基プロセシン
グ部位を点刻ボックスで示す。推定上の開始ATGの上流
にある同じ読み枠の終止コドンおよび共通のポリアデニ
レーションシグナルには下線が引いてある。ポリＡ尾部
は示してない。数字は5'末端からのヌクレオチド位置を
示す。
図３は、GDF−９のＣ末端配列とTGF−βファミリーの
他のメンバーとの並列化を示す。保存されたシステイン
残基には陰影が付けてある。ダッシュ（−）は並列化を
最大とするために導入されたギャップを表す。
他のメンバーとの並列化を示す。保存されたシステイン
残基には陰影が付けてある。ダッシュ（−）は並列化を
最大とするために導入されたギャップを表す。
図４は、TGF−βスーパーファミリーの各メンバー間
のアミノ酸相同を示す。数字は最初の保存システインか
らＣ末端までで計算された各対間のアミノ酸同一性のパ
ーセントを表す。ボックスは特定サブグループ内の密接
に関連したメンバー間の相同性を表す。
のアミノ酸相同を示す。数字は最初の保存システインか
らＣ末端までで計算された各対間のアミノ酸同一性のパ
ーセントを表す。ボックスは特定サブグループ内の密接
に関連したメンバー間の相同性を表す。
図５は、GDF−９タンパク質の免疫組織化学的局在化
を示す。成体卵巣の隣接切片をヘマトキシリンとエオシ
ンで染色する（図5a）か、あるいは1:500の希釈率で免
疫血清（図5b）または前免疫血清（図5c）とともにイン
キュベートした。マウスGDF−９のＣ末端部分（残基308
−441）をバクテリア内で発現させ、分離用SDSゲルから
GDF−９タンパク質を切り出し、そしてウサギを免疫す
ることにより抗GDF−９抗血清を調製した。抗体結合部
位はVectastain ABCキット（VectorLabs）を使って可視
化した。
を示す。成体卵巣の隣接切片をヘマトキシリンとエオシ
ンで染色する（図5a）か、あるいは1:500の希釈率で免
疫血清（図5b）または前免疫血清（図5c）とともにイン
キュベートした。マウスGDF−９のＣ末端部分（残基308
−441）をバクテリア内で発現させ、分離用SDSゲルから
GDF−９タンパク質を切り出し、そしてウサギを免疫す
ることにより抗GDF−９抗血清を調製した。抗体結合部
位はVectastain ABCキット（VectorLabs）を使って可視
化した。
図６は、マウスGDF−９（上のライン）とヒトGDF−９
（下のライン）の推定アミノ酸配列の比較を示す。数字
はＮ末端からのアミノ酸位置を表す。垂線は配列同一性
を表す。点は並列化を最大とするために導入されたギャ
ップを表す。無地のボックスは推定上のタンパク質分解
プロセシング部位を示す。陰影を付けたボックスはこの
タンパク質の成熟領域にあるシステイン残基を示す。下
部の棒線はGDF−９のプレ（無地）および成熟（陰影）
領域の略図を示し、マウス配列とヒト配列間の配列同一
性のパーセントを示してある。
（下のライン）の推定アミノ酸配列の比較を示す。数字
はＮ末端からのアミノ酸位置を表す。垂線は配列同一性
を表す。点は並列化を最大とするために導入されたギャ
ップを表す。無地のボックスは推定上のタンパク質分解
プロセシング部位を示す。陰影を付けたボックスはこの
タンパク質の成熟領域にあるシステイン残基を示す。下
部の棒線はGDF−９のプレ（無地）および成熟（陰影）
領域の略図を示し、マウス配列とヒト配列間の配列同一
性のパーセントを示してある。
図７は、GDF−９ RNAプローブを用いた成体卵巣切片
に対するin situハイブリダイゼーションを示す。４％
パラホルムアルデヒドで固定した卵巣のパラフィン包埋
した隣接切片に〔35S〕標識したアンチセンス（図7aお
よび7c）またはセンス（図7bおよび7d）GDF−９ RNAプ
ローブをハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤中に浸
し、露光し、現像した後にヘマトキシリンとエオシンで
染色した。２つの代表的な視野像を示してある。
に対するin situハイブリダイゼーションを示す。４％
パラホルムアルデヒドで固定した卵巣のパラフィン包埋
した隣接切片に〔35S〕標識したアンチセンス（図7aお
よび7c）またはセンス（図7bおよび7d）GDF−９ RNAプ
ローブをハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤中に浸
し、露光し、現像した後にヘマトキシリンとエオシンで
染色した。２つの代表的な視野像を示してある。
図８は、アンチセンスGDF−９ RNAプローブを用いた
生後４日目の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼ
ーションを示す。切片は図７に記載したように調製し
た。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野
（図8a）または暗視野（図8b）照明の下で切片の写真を
撮った。
生後４日目の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼ
ーションを示す。切片は図７に記載したように調製し
た。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野
（図8a）または暗視野（図8b）照明の下で切片の写真を
撮った。
図９は、アンチセンス（図9a）またはセンス（図9b）
GDF−９ RNAプローブを用いた生後８日目の卵巣切片に
対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は
図７に記載したように調製した。
GDF−９ RNAプローブを用いた生後８日目の卵巣切片に
対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は
図７に記載したように調製した。
図10は、アンチセンス（図10a）またはセンス（図10
b）GDF−９ RNAプローブを用いた成体輸卵管切片に対
するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図
７に記載したように調製した。
b）GDF−９ RNAプローブを用いた成体輸卵管切片に対
するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図
７に記載したように調製した。
図11は、アンチセンスGDF−９ RNAプローブを用いた
成体輸卵管（受精後0.5日）切片に対するin situハイブ
リダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように
調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明
視野（図11a）または暗視野（図11b）照明の下で切片の
写真を撮った。
成体輸卵管（受精後0.5日）切片に対するin situハイブ
リダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように
調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明
視野（図11a）または暗視野（図11b）照明の下で切片の
写真を撮った。
発明の詳細な説明
本発明は、増殖分化因子GDF−９ならびにGDF−９をコ
ードするポリヌクレオチド配列を提供する。TFG−βス
ーパーファミリーの他のメンバーと違って、GDF−９の
発現は非常に組織特異的で、主に卵巣組織の細胞におい
て発現される。１つの実施態様において、本発明は、GD
F−９発現と関係がある卵巣の細胞増殖性疾患を検出す
る方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、
GDF−９活性を抑制または増強する薬剤を使用すること
により、GDF−９の異常な発現と関係がある細胞増殖性
疾患を治療する方法を提供する。
ードするポリヌクレオチド配列を提供する。TFG−βス
ーパーファミリーの他のメンバーと違って、GDF−９の
発現は非常に組織特異的で、主に卵巣組織の細胞におい
て発現される。１つの実施態様において、本発明は、GD
F−９発現と関係がある卵巣の細胞増殖性疾患を検出す
る方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、
GDF−９活性を抑制または増強する薬剤を使用すること
により、GDF−９の異常な発現と関係がある細胞増殖性
疾患を治療する方法を提供する。
TGF−βスーパーファミリーは多くの細胞型の増殖、
分化、その他の機能を制御する多機能性ポリペプチドか
ら成っている。かかるペプチドの多くは他のペプチド増
殖因子に対してポジティブおよびネガティブの両方の調
節作用を有する。本発明のGDF−９タンパク質とTGF−β
ファミリーのメンバー間の構造的相同性は、GDF−９が
増殖および分化因子のファミリーの新メンバーであるこ
とを示す。他の多くのメンバーのすでに知られた活性に
基づくと、GDF−９もまた診断薬や治療薬として有用で
あるような生物学的活性を有することが期待できる。
分化、その他の機能を制御する多機能性ポリペプチドか
ら成っている。かかるペプチドの多くは他のペプチド増
殖因子に対してポジティブおよびネガティブの両方の調
節作用を有する。本発明のGDF−９タンパク質とTGF−β
ファミリーのメンバー間の構造的相同性は、GDF−９が
増殖および分化因子のファミリーの新メンバーであるこ
とを示す。他の多くのメンバーのすでに知られた活性に
基づくと、GDF−９もまた診断薬や治療薬として有用で
あるような生物学的活性を有することが期待できる。
例えば、TGF−βとの構造的相同を有することが見い
だされた別の調節タンパク質はインヒビンであるが、こ
れはFSHの下垂体分泌の特異的かつ強力なポリペプチド
阻害物質である。インヒビンは卵巣の卵胞液から単離さ
れている。FSHを抑制するために、インヒビンは雌雄両
性の避妊薬としての使用可能性を有する。GDF−９は、
卵巣特異的ペプチドであるから、同様の生物学的活性を
もつかもしれない。また、インヒビンはある種の卵巣腫
瘍のマーカーとして有用であることが分かっている（La
ppohnら,N.Engl.J.Med.,321:790,1989）。GDF−９も卵
巣起源の原発性および転移性新生物を確認するマーカー
として有用でありうる。同様に、GDF−９は出生前スク
リーニング法における発生異常の指示物質として役立つ
かもしれない。
だされた別の調節タンパク質はインヒビンであるが、こ
れはFSHの下垂体分泌の特異的かつ強力なポリペプチド
阻害物質である。インヒビンは卵巣の卵胞液から単離さ
れている。FSHを抑制するために、インヒビンは雌雄両
性の避妊薬としての使用可能性を有する。GDF−９は、
卵巣特異的ペプチドであるから、同様の生物学的活性を
もつかもしれない。また、インヒビンはある種の卵巣腫
瘍のマーカーとして有用であることが分かっている（La
ppohnら,N.Engl.J.Med.,321:790,1989）。GDF−９も卵
巣起源の原発性および転移性新生物を確認するマーカー
として有用でありうる。同様に、GDF−９は出生前スク
リーニング法における発生異常の指示物質として役立つ
かもしれない。
TGF−βファミリーの他のペプチドには精巣で産生さ
れるMISがあり、これは雄性胚においてミュラー管の退
行現象に関与している。MISはヌードマウスにおいてヒ
ト卵巣癌の増殖を抑制することが分かった（Donahoeら,
Ann.Surg.,194:472,1981）。GDF−９も同様に機能する
可能性があり、それゆえ、抗癌剤として例えば卵巣癌の
治療に有効であるかもしれない。
れるMISがあり、これは雄性胚においてミュラー管の退
行現象に関与している。MISはヌードマウスにおいてヒ
ト卵巣癌の増殖を抑制することが分かった（Donahoeら,
Ann.Surg.,194:472,1981）。GDF−９も同様に機能する
可能性があり、それゆえ、抗癌剤として例えば卵巣癌の
治療に有効であるかもしれない。
GDF−９はまた増殖促進因子としても機能することが
でき、それゆえにin vitroでの種々の細胞集団の生存に
有用である可能性がある。特に、GDF−９が卵成熟にお
いて何らかの役割を果たすのであれば、GDF−９は試験
管内受精法で、例えば成功率を上げるのに有用であるか
もしれない。また、TGF−βファミリーの他の多くのメ
ンバーは組織修復の重要な媒介物質ともなる。TGF−β
はコラーゲンの形成に対して著しい影響を及ぼすことが
知られており、新生マウスでは顕著な脈管形成応答を生
じさせる（Robertsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:416
7,1986）。GDF−９も同様の活性を示して、例えば外傷
や火傷による組織傷害の修復に有用であるかもしれな
い。
でき、それゆえにin vitroでの種々の細胞集団の生存に
有用である可能性がある。特に、GDF−９が卵成熟にお
いて何らかの役割を果たすのであれば、GDF−９は試験
管内受精法で、例えば成功率を上げるのに有用であるか
もしれない。また、TGF−βファミリーの他の多くのメ
ンバーは組織修復の重要な媒介物質ともなる。TGF−β
はコラーゲンの形成に対して著しい影響を及ぼすことが
知られており、新生マウスでは顕著な脈管形成応答を生
じさせる（Robertsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:416
7,1986）。GDF−９も同様の活性を示して、例えば外傷
や火傷による組織傷害の修復に有用であるかもしれな
い。
本明細書中で用いる「実質的に純粋な」という用語
は、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然界でGD
F−９と結合している他の物質を実質的に含まないGDF−
９を指す。当業者はタンパク質精製の標準的な技法を用
いてGDF−９を純化することが可能である。実質的に純
粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上で
単一の主要バンドをもたらすだろう。GDF−９ポリペプ
チドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によ
って決定することができる。GDF−９ポリペプチドは、G
DF−９の活性が残っているという条件で、該ポリペプチ
ドの機能性フラグメントを含むものである。GDF−９の
生物学的活性を有する比較的小さいペプチドも本発明に
含まれる。
は、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然界でGD
F−９と結合している他の物質を実質的に含まないGDF−
９を指す。当業者はタンパク質精製の標準的な技法を用
いてGDF−９を純化することが可能である。実質的に純
粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上で
単一の主要バンドをもたらすだろう。GDF−９ポリペプ
チドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によ
って決定することができる。GDF−９ポリペプチドは、G
DF−９の活性が残っているという条件で、該ポリペプチ
ドの機能性フラグメントを含むものである。GDF−９の
生物学的活性を有する比較的小さいペプチドも本発明に
含まれる。
本発明はGDF−９タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、
GDF−９をコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれ
る。GDF−９の全部または一部をコードするポリヌクレ
オチドはすべて、それらがGDF−９活性を有するポリペ
プチドをコードするのであれば、本発明に含まれること
が理解されよう。こうしたポリヌクレオチドとして、天
然に存在するもの、合成されたもの、そして故意に操作
されたものが挙げられる。例えば、GDF−９ポリヌクレ
オチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができ
る。GDF−９のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配
列も含むものである。本発明のポリヌクレオチドは遺伝
暗号の結果としての縮重配列を含む。20種類の天然アミ
ノ酸が存在し、その大部分は１種類より多いコドンによ
って規定されている。かくして、すべての縮重ヌクレオ
チド配列は、該ヌクレオチド配列によってコードされる
GDF−９ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化し
ない限り、本発明に含まれるものである。
オチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、
GDF−９をコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれ
る。GDF−９の全部または一部をコードするポリヌクレ
オチドはすべて、それらがGDF−９活性を有するポリペ
プチドをコードするのであれば、本発明に含まれること
が理解されよう。こうしたポリヌクレオチドとして、天
然に存在するもの、合成されたもの、そして故意に操作
されたものが挙げられる。例えば、GDF−９ポリヌクレ
オチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができ
る。GDF−９のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配
列も含むものである。本発明のポリヌクレオチドは遺伝
暗号の結果としての縮重配列を含む。20種類の天然アミ
ノ酸が存在し、その大部分は１種類より多いコドンによ
って規定されている。かくして、すべての縮重ヌクレオ
チド配列は、該ヌクレオチド配列によってコードされる
GDF−９ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化し
ない限り、本発明に含まれるものである。
特に、本明細書中では、鎖長が1712塩基対で、ヌクレ
オチド29のメチオニンコドンから始まるオープンリーデ
ィングフレームを含むGDF−９のcDNA配列が開示され
る。コードされるポリペプチドは441個のアミノ酸から
成り、ヌクレオチド配列解析で測定して約49.6kDの分子
量を有する。GDF−９配列は、Ｎ末端の近傍に、分泌の
ためのシグナル配列を暗示する疎水性アミノ酸のコアを
含んでいる。GDF−９はアスパラギン残基163、229、258
および325に可能なＮ−グリコシル化部位と、アミノ酸3
03−306に推定上の四塩基タンパク質分解プロセシング
部位（RRRR）を含む。GDF−９の成熟Ｃ末端フラグメン
トは135個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析
で測定して非グリコシル化分子量が約15.6kDであると想
定される。当業者は標準的な技法を使ってグリコシル基
を修飾したり、GDF−９のタンパク質からグリコシル基
を部分的にまたは完全に除いたりできるだろう。それゆ
え、本発明の機能性タンパク質またはそのフラグメント
として、GDF−９のグリコシル化種、部分的グリコシル
化種および非グリコシル化種が含まれる。
オチド29のメチオニンコドンから始まるオープンリーデ
ィングフレームを含むGDF−９のcDNA配列が開示され
る。コードされるポリペプチドは441個のアミノ酸から
成り、ヌクレオチド配列解析で測定して約49.6kDの分子
量を有する。GDF−９配列は、Ｎ末端の近傍に、分泌の
ためのシグナル配列を暗示する疎水性アミノ酸のコアを
含んでいる。GDF−９はアスパラギン残基163、229、258
および325に可能なＮ−グリコシル化部位と、アミノ酸3
03−306に推定上の四塩基タンパク質分解プロセシング
部位（RRRR）を含む。GDF−９の成熟Ｃ末端フラグメン
トは135個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析
で測定して非グリコシル化分子量が約15.6kDであると想
定される。当業者は標準的な技法を使ってグリコシル基
を修飾したり、GDF−９のタンパク質からグリコシル基
を部分的にまたは完全に除いたりできるだろう。それゆ
え、本発明の機能性タンパク質またはそのフラグメント
として、GDF−９のグリコシル化種、部分的グリコシル
化種および非グリコシル化種が含まれる。
GDF−９と既知のTGF−βファミリーメンバーとの配列
同一性の程度は、ミュラー管阻害物質（MIS）の場合の
最低21％から骨形態形成タンパク質−４（BMP−４）の
場合の最高34％までの範囲である。本明細書に詳しく開
示するGDF−９はＣ末端領域のシステイン残基のパター
ンが既知のファミリーメンバーと相違している。GDF−
９は他のファミリーメンバーに存在している７個のシス
テインのうち４番目のシステインを欠いている。すなわ
ち、この位置のシステインの代わりに、GDF−９配列は
セリン残基を含んでいる。GDF−９はＣ末端領域のどこ
にも７番目のシステイン残基を含んでいない。
同一性の程度は、ミュラー管阻害物質（MIS）の場合の
最低21％から骨形態形成タンパク質−４（BMP−４）の
場合の最高34％までの範囲である。本明細書に詳しく開
示するGDF−９はＣ末端領域のシステイン残基のパター
ンが既知のファミリーメンバーと相違している。GDF−
９は他のファミリーメンバーに存在している７個のシス
テインのうち４番目のシステインを欠いている。すなわ
ち、この位置のシステインの代わりに、GDF−９配列は
セリン残基を含んでいる。GDF−９はＣ末端領域のどこ
にも７番目のシステイン残基を含んでいない。
組換えGDF−９の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾
は、本明細書に記載のGDF−９ポリペプチドと比べて実
質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらすかもし
れない。かかる修飾は部位特異的突然変異誘発によるも
ののように故意であっても、自然に起こるものであって
もよい。これらの修飾によって得られるポリペプチドの
すべては、GDF−９の生物学的活性が依然として存在す
るのであれば、本発明に包含される。さらに、１個以上
のアミノ酸を欠失させることも、その生物学的活性を著
しく変えることなく分子構造の修飾を可能とする。これ
はより広い有用性を有するより小さな活性分子の開発へ
と導く。例えば、GDF−９の生物学的活性にとっては必
要でないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸の除去
が可能である。
は、本明細書に記載のGDF−９ポリペプチドと比べて実
質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらすかもし
れない。かかる修飾は部位特異的突然変異誘発によるも
ののように故意であっても、自然に起こるものであって
もよい。これらの修飾によって得られるポリペプチドの
すべては、GDF−９の生物学的活性が依然として存在す
るのであれば、本発明に包含される。さらに、１個以上
のアミノ酸を欠失させることも、その生物学的活性を著
しく変えることなく分子構造の修飾を可能とする。これ
はより広い有用性を有するより小さな活性分子の開発へ
と導く。例えば、GDF−９の生物学的活性にとっては必
要でないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸の除去
が可能である。
本発明のGDF−９のポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列は、開示した配列およびその保存的変更を含
むものである。ここで用いる「保存的変更」という用語
は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似した残基で置き
換えることを意味する。保存的変更の例として、ある疎
水性アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチ
オニンなど）を別の疎水性アミノ酸と置き換えること、
または、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸と置き換
えることが含まれ、例えば、リシンとアルギニンとの置
換、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、アスパラ
ギンとグルタミンとの置換などを挙げることができる。
また、「保存的変更」という用語は、置換ポリペプチド
に対して誘起された抗体が非置換ポリペプチドと免疫反
応性であるという条件で、非置換の親アミノ酸の代わり
に置換アミノ酸を使用することも包含する。
オチド配列は、開示した配列およびその保存的変更を含
むものである。ここで用いる「保存的変更」という用語
は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似した残基で置き
換えることを意味する。保存的変更の例として、ある疎
水性アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチ
オニンなど）を別の疎水性アミノ酸と置き換えること、
または、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸と置き換
えることが含まれ、例えば、リシンとアルギニンとの置
換、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、アスパラ
ギンとグルタミンとの置換などを挙げることができる。
また、「保存的変更」という用語は、置換ポリペプチド
に対して誘起された抗体が非置換ポリペプチドと免疫反
応性であるという条件で、非置換の親アミノ酸の代わり
に置換アミノ酸を使用することも包含する。
本発明のDNA配列はいくつかの方法によって得ること
ができる。例えば、DNAは当技術分野で公知のハイブリ
ダイゼーション技法を使って単離し得る。これらには、
１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブと
ゲノムまたはcDNAライブラリーとのハイブリダイゼーシ
ョン、および２）構造的特徴を共有するクローン化DNA
フラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体
スクリーニングが含まれるが、これらに限らない。
ができる。例えば、DNAは当技術分野で公知のハイブリ
ダイゼーション技法を使って単離し得る。これらには、
１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブと
ゲノムまたはcDNAライブラリーとのハイブリダイゼーシ
ョン、および２）構造的特徴を共有するクローン化DNA
フラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体
スクリーニングが含まれるが、これらに限らない。
好ましくは、本発明のGDF−９ポリヌクレオチドは哺
乳動物に由来するものであり、マウス、ラットまたはヒ
ト由来のものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーシ
ョンによるスクリーニング法は、適当なプローブが利用
可能であれば、どの動物からでも任意の遺伝子配列を単
離することを可能にする。対象のタンパク質をコードす
る配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは
化学的に合成可能である。そのためには、短いオリゴペ
プチドの範囲のアミノ酸配列が既知でなければならな
い。タンパク質をコードするDNA配列はアミノ酸配列か
ら推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入
れる必要がある。配列が縮重をもつときは混合付加反応
を行うことが可能である。これは変性二本鎖DNAの不均
質混合物を含む。こうしたスクリーニングでは、一本鎖
DNAかまたは変性二本鎖DNAに対してハイブリダイゼーシ
ョンを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーショ
ンは、対象のポリペプチドに関係するmRNA配列が極めて
少ない量で存在する供給源から誘導されたcDNAクローン
の検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合
を回避するようなストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件を用いることにより、例えば、標的DNAとその
完全な相補体である混合物中の単一プローブとのハイブ
リダイゼーションにより、特定のcDNAクローンのオート
ラジオグラフ可視化を可能にすることができる（Wallac
eら,Nucl.Acid Res.,9:879,1981）。
乳動物に由来するものであり、マウス、ラットまたはヒ
ト由来のものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーシ
ョンによるスクリーニング法は、適当なプローブが利用
可能であれば、どの動物からでも任意の遺伝子配列を単
離することを可能にする。対象のタンパク質をコードす
る配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは
化学的に合成可能である。そのためには、短いオリゴペ
プチドの範囲のアミノ酸配列が既知でなければならな
い。タンパク質をコードするDNA配列はアミノ酸配列か
ら推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入
れる必要がある。配列が縮重をもつときは混合付加反応
を行うことが可能である。これは変性二本鎖DNAの不均
質混合物を含む。こうしたスクリーニングでは、一本鎖
DNAかまたは変性二本鎖DNAに対してハイブリダイゼーシ
ョンを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーショ
ンは、対象のポリペプチドに関係するmRNA配列が極めて
少ない量で存在する供給源から誘導されたcDNAクローン
の検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合
を回避するようなストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件を用いることにより、例えば、標的DNAとその
完全な相補体である混合物中の単一プローブとのハイブ
リダイゼーションにより、特定のcDNAクローンのオート
ラジオグラフ可視化を可能にすることができる（Wallac
eら,Nucl.Acid Res.,9:879,1981）。
また、GDF−９をコードする特定のDNA配列は、１）ゲ
ノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離、２）対象のポリペ
プチドに必要なコドンを提供するためのDNA配列の化学
的製造、および３）真核供与細胞から単離されたmRNAの
逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合成、により得
ることができる。後者の場合は、一般にcDNAと呼ばれる
mRNAの二本鎖DNA相補体が最終的に形成される。
ノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離、２）対象のポリペ
プチドに必要なコドンを提供するためのDNA配列の化学
的製造、および３）真核供与細胞から単離されたmRNAの
逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合成、により得
ることができる。後者の場合は、一般にcDNAと呼ばれる
mRNAの二本鎖DNA相補体が最終的に形成される。
組換え法で用いる特定のDNA配列を得るための上記の
３方法のうち、ゲノムDNA単離物の単離が最も一般的で
ない方法である。イントロンの存在ゆえに哺乳動物ポリ
ペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合は特に
そうである。
３方法のうち、ゲノムDNA単離物の単離が最も一般的で
ない方法である。イントロンの存在ゆえに哺乳動物ポリ
ペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合は特に
そうである。
目的とするポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列
が既知であるときは、DNA配列の合成がしばしば好適な
方法となる。目的とするポリペプチドのアミノ酸残基の
全配列が不明であるときは、DNA配列の直接合成が不可
能で、cDNA配列の合成が好適な方法となる。対象のcDNA
配列を得るための標準的な方法として、高レベルの遺伝
子発現を有する供与細胞中に豊富にあるmRNAの逆転写に
より誘導されるプラスミド−またはファージ−担持cDNA
ライブラリーの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応の技
法とともに用いると、稀な発現産物でさえもクローニン
グすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のか
なりの部分が知られている場合には、標的cDNA中に存在
すると想定される配列を複写した一本鎖または二本鎖の
標識DNAまたはRNAプローブを作製し、該プローブを、一
本鎖形態に変性させたクローン化コピー数のcDNAに対し
て実施されるDNA/DNAハイブリダイゼーション法におい
て用いることができる（Jayら,Nucl.Acid Res.,11:232
5,1983）。
が既知であるときは、DNA配列の合成がしばしば好適な
方法となる。目的とするポリペプチドのアミノ酸残基の
全配列が不明であるときは、DNA配列の直接合成が不可
能で、cDNA配列の合成が好適な方法となる。対象のcDNA
配列を得るための標準的な方法として、高レベルの遺伝
子発現を有する供与細胞中に豊富にあるmRNAの逆転写に
より誘導されるプラスミド−またはファージ−担持cDNA
ライブラリーの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応の技
法とともに用いると、稀な発現産物でさえもクローニン
グすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のか
なりの部分が知られている場合には、標的cDNA中に存在
すると想定される配列を複写した一本鎖または二本鎖の
標識DNAまたはRNAプローブを作製し、該プローブを、一
本鎖形態に変性させたクローン化コピー数のcDNAに対し
て実施されるDNA/DNAハイブリダイゼーション法におい
て用いることができる（Jayら,Nucl.Acid Res.,11:232
5,1983）。
ラムダgt11のようなcDNA発現ライブラリーは、GDF−
９に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトー
プを有するGDF−９ペプチドについて間接的にスクリー
ニングし得る。こうした抗体はポリクローナルであって
もモノクローナルであってもよく、GDF−９ cDNAの存
在を示す発現産物の検出に用いられる。
９に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトー
プを有するGDF−９ペプチドについて間接的にスクリー
ニングし得る。こうした抗体はポリクローナルであって
もモノクローナルであってもよく、GDF−９ cDNAの存
在を示す発現産物の検出に用いられる。
GDF−９をコードするDNA配列は適当な宿主細胞へのDN
A導入によりin vitroで発現させることができる。「宿
主細胞」とは、ベクターを増幅しかつそのDNAを発現し
得る細胞のことである。また、この用語は被験宿主細胞
のあらゆる子孫をも含むものである。すべての子孫は、
複製中に突然変異を起こすことがあるから、その親細胞
と同一でなくてもよいことが理解されよう。しかし、
「宿主細胞」という用語を用いるときは、こうした子孫
も含むものとする。安定したDNA導入（外来DNAが宿主内
に連続的に維持されることを意味する）の手法は当技術
分野で公知である。
A導入によりin vitroで発現させることができる。「宿
主細胞」とは、ベクターを増幅しかつそのDNAを発現し
得る細胞のことである。また、この用語は被験宿主細胞
のあらゆる子孫をも含むものである。すべての子孫は、
複製中に突然変異を起こすことがあるから、その親細胞
と同一でなくてもよいことが理解されよう。しかし、
「宿主細胞」という用語を用いるときは、こうした子孫
も含むものとする。安定したDNA導入（外来DNAが宿主内
に連続的に維持されることを意味する）の手法は当技術
分野で公知である。
本発明では、GDF−９ポリヌクレオチド配列が組換え
発現ベクターに挿入される。「組換え発現ベクター」と
いう用語は、GDF−９遺伝子配列の挿入または組込みに
よって操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウ
イルスまたは他の運搬体を指す。かかる発現ベクターは
宿主内に挿入した遺伝子配列の効率のよい転写を促進す
るプロモーター配列を含む。発現ベクターは複製起点、
プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能
にする特殊な遺伝子を含むのが常である。本発明で使用
するのに適したベクターとしては、バクテリア発現用の
T7をベースとした発現ベクター（Rosenbergら,Gene,56:
125,1987）、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター
（LeeおよびNathans,J.Biol.Chem.,263:3521,1988）、
および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクタ
ーを挙げることができるが、これらに限らない。DNAセ
グメントはプロモーター（例:T7、メタロチオネイン
Ｉ、ポリヘドリンプロモーター）のような調節要素に機
能的に連結された状態でベクター中に存在する。
発現ベクターに挿入される。「組換え発現ベクター」と
いう用語は、GDF−９遺伝子配列の挿入または組込みに
よって操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウ
イルスまたは他の運搬体を指す。かかる発現ベクターは
宿主内に挿入した遺伝子配列の効率のよい転写を促進す
るプロモーター配列を含む。発現ベクターは複製起点、
プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能
にする特殊な遺伝子を含むのが常である。本発明で使用
するのに適したベクターとしては、バクテリア発現用の
T7をベースとした発現ベクター（Rosenbergら,Gene,56:
125,1987）、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター
（LeeおよびNathans,J.Biol.Chem.,263:3521,1988）、
および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクタ
ーを挙げることができるが、これらに限らない。DNAセ
グメントはプロモーター（例:T7、メタロチオネイン
Ｉ、ポリヘドリンプロモーター）のような調節要素に機
能的に連結された状態でベクター中に存在する。
GDF−９をコードするポリヌクレオチド配列は原核生
物または真核生物のいずれで発現させてもよい。宿主と
しては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が含まれ
る。原核生物内で真核生物配列またはウイルス配列を有
するDNA配列を発現させる方法は当技術分野で公知であ
る。宿主内で発現・複製しうる生物学的に機能的なウイ
ルスおよびプラスミドDNAベクターは当技術分野で知ら
れている。本発明のDNA配列を組み込む際には、こうし
たベクターが用いられる。
物または真核生物のいずれで発現させてもよい。宿主と
しては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が含まれ
る。原核生物内で真核生物配列またはウイルス配列を有
するDNA配列を発現させる方法は当技術分野で公知であ
る。宿主内で発現・複製しうる生物学的に機能的なウイ
ルスおよびプラスミドDNAベクターは当技術分野で知ら
れている。本発明のDNA配列を組み込む際には、こうし
たベクターが用いられる。
組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者によ
く知られているような慣用の技法を使って行われる。宿
主が大腸菌のような原核生物である場合は、指数増殖期
の後に回収した細胞からDNA取込み能を有するコンピテ
ント細胞を調製し、その後当技術分野で公知の手法を用
いてCaCl2法で処理する。また、MgCl2やRbClを用いても
よい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成さ
せた後で形質転換を行うこともできる。
く知られているような慣用の技法を使って行われる。宿
主が大腸菌のような原核生物である場合は、指数増殖期
の後に回収した細胞からDNA取込み能を有するコンピテ
ント細胞を調製し、その後当技術分野で公知の手法を用
いてCaCl2法で処理する。また、MgCl2やRbClを用いても
よい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成さ
せた後で形質転換を行うこともできる。
宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共
沈、マイクロインジェクションのような慣用の機械的方
法、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持され
たプラスミドの挿入、またはウイルスベクターといった
DNAトランスフェクション法が用いられる。真核細胞は
また、本発明のGDF−９をコードするDNA配列および選択
可能な表現型をコードする第２の外来DNA分子（例え
ば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて同
時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウ
イルス40（SV40）やウシパピローマウイルスのような真
核生物ウイルスベクターを使って真核細胞を一時的に感
染させるか形質転換することにより、タンパク質を発現
させる方法である（例えば、Eukaryotic Viral Vector
s,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman編集,1982を
参照のこと）。
沈、マイクロインジェクションのような慣用の機械的方
法、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持され
たプラスミドの挿入、またはウイルスベクターといった
DNAトランスフェクション法が用いられる。真核細胞は
また、本発明のGDF−９をコードするDNA配列および選択
可能な表現型をコードする第２の外来DNA分子（例え
ば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて同
時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウ
イルス40（SV40）やウシパピローマウイルスのような真
核生物ウイルスベクターを使って真核細胞を一時的に感
染させるか形質転換することにより、タンパク質を発現
させる方法である（例えば、Eukaryotic Viral Vector
s,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman編集,1982を
参照のこと）。
本発明により提供される、微生物内で発現させたポリ
ペプチドまたはそのフラグメントの単離・精製は、分離
用クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて、慣用の
手段により行うことができる。
ペプチドまたはそのフラグメントの単離・精製は、分離
用クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて、慣用の
手段により行うことができる。
本発明は、GDF−９ポリペプチドと免疫反応性の抗体
またはその機能性フラグメントを含むものである。様々
なエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプー
ルから本質的に成る抗体、ならびに明確に異なるモノク
ローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体
は当業者によく知られた方法を用いてタンパク質の抗原
含有フラグメントから作られる（Kohlerら,Nature,256:
495,1975）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完
全な抗体分子のほかに、GDF−９上のエピトープ決定基
と結合し得るFabおよびＦ（ab'）２のような抗体フラグ
メントを包含する。
またはその機能性フラグメントを含むものである。様々
なエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプー
ルから本質的に成る抗体、ならびに明確に異なるモノク
ローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体
は当業者によく知られた方法を用いてタンパク質の抗原
含有フラグメントから作られる（Kohlerら,Nature,256:
495,1975）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完
全な抗体分子のほかに、GDF−９上のエピトープ決定基
と結合し得るFabおよびＦ（ab'）２のような抗体フラグ
メントを包含する。
「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば周囲の組
織と形態学的にも遺伝子型的にも相違するように見える
悪性ならびに非悪性の細胞集団を表す。アンチセンス分
子からなるGDF−９ポリヌクレオチドは、さまざまな器
官系の悪性疾患、特に、例えば卵巣の悪性疾患を治療す
るのに有用である。本質的に、GDF−９発現の変化が病
因的に関係している疾患はどれも、GDF−９抑制剤によ
る治療に感受性であると考えられる。
織と形態学的にも遺伝子型的にも相違するように見える
悪性ならびに非悪性の細胞集団を表す。アンチセンス分
子からなるGDF−９ポリヌクレオチドは、さまざまな器
官系の悪性疾患、特に、例えば卵巣の悪性疾患を治療す
るのに有用である。本質的に、GDF−９発現の変化が病
因的に関係している疾患はどれも、GDF−９抑制剤によ
る治療に感受性であると考えられる。
本発明は、卵巣の細胞増殖性障害を検出する方法であ
って、抗GDF−９抗体をGDF−９関連障害を有する疑いが
ある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出すること
を含む方法を提供する。GDF−９と反応性のこの抗体
は、GDF−９への結合を検出できるようにする化合物で
標識される。本発明の目的のために、GDF−９ポリペプ
チドに特異的な抗体を用いて生物学的流体及び組織中の
GDF−９のレベルを検出することができる。検出可能な
量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができ
る。この発明の好ましいサンプルは、卵巣起源の組織、
特に顆粒膜細胞又は卵胞液を含有する組織である。疑い
のある細胞中のGDF−９のレベルを正常細胞中のレベル
と比較して、被験体がGDF−９関連細胞増殖性障害を有
するかどうかを確認することができる。好ましくは、被
験体はヒトである。
って、抗GDF−９抗体をGDF−９関連障害を有する疑いが
ある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出すること
を含む方法を提供する。GDF−９と反応性のこの抗体
は、GDF−９への結合を検出できるようにする化合物で
標識される。本発明の目的のために、GDF−９ポリペプ
チドに特異的な抗体を用いて生物学的流体及び組織中の
GDF−９のレベルを検出することができる。検出可能な
量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができ
る。この発明の好ましいサンプルは、卵巣起源の組織、
特に顆粒膜細胞又は卵胞液を含有する組織である。疑い
のある細胞中のGDF−９のレベルを正常細胞中のレベル
と比較して、被験体がGDF−９関連細胞増殖性障害を有
するかどうかを確認することができる。好ましくは、被
験体はヒトである。
本発明の抗体は、in vitro又はin vivo免疫診断又は
免疫療法を施すのが望ましいあらゆる被験体に用いるこ
とができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイ
に用いるのに適しており、その際それらを液相で用いて
も固相キャリヤーに結合させてもよい。加えて、これら
イムノアッセイにおける抗体を検出できるように種々の
方法で標識することができる。本発明の抗体を用いるこ
とができるタイプのイムノアッセイの例は、直接又は間
接フォーマットのいずれかの競合及び非競合イムノアッ
セイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイム
ノアッセイ（RIA）及びサンドイッチ（免疫測定）アッ
セイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理
学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、フォ
ワード、リバース、又は同時モードのいずれで行われる
イムノアッセイを用いても行うことができる。当業者
は、過度な実験を重ねることなく他のイムノアッセイフ
ォーマットを認知するか、又は容易に認識できるであろ
う。
免疫療法を施すのが望ましいあらゆる被験体に用いるこ
とができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイ
に用いるのに適しており、その際それらを液相で用いて
も固相キャリヤーに結合させてもよい。加えて、これら
イムノアッセイにおける抗体を検出できるように種々の
方法で標識することができる。本発明の抗体を用いるこ
とができるタイプのイムノアッセイの例は、直接又は間
接フォーマットのいずれかの競合及び非競合イムノアッ
セイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイム
ノアッセイ（RIA）及びサンドイッチ（免疫測定）アッ
セイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理
学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、フォ
ワード、リバース、又は同時モードのいずれで行われる
イムノアッセイを用いても行うことができる。当業者
は、過度な実験を重ねることなく他のイムノアッセイフ
ォーマットを認知するか、又は容易に認識できるであろ
う。
本発明の抗体は、多くの異なるキャリヤーに結合でき
るので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出
するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例に
は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチ
レン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び
変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び
磁鉄鉱が含まれる。このキャリヤーの性質は、本発明の
目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよ
い。当業者は、抗体を結合させるのに適する他のキャリ
ヤーを認知するか、又は日常的な実験を用いてそうした
ものを探知できるであろう。
るので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出
するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例に
は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチ
レン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び
変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び
磁鉄鉱が含まれる。このキャリヤーの性質は、本発明の
目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよ
い。当業者は、抗体を結合させるのに適する他のキャリ
ヤーを認知するか、又は日常的な実験を用いてそうした
ものを探知できるであろう。
当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法
がある。本発明に用いることができるタイプの標識の例
には、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド
状金属、化学発光性化合物、リン光性化合物、及び生物
発光化合物が含まれる。当業者は、抗体に結合するのに
適する他の標識を認知するか、又は日常的な実験を用い
てそうしたものを探知できるであろう。
がある。本発明に用いることができるタイプの標識の例
には、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド
状金属、化学発光性化合物、リン光性化合物、及び生物
発光化合物が含まれる。当業者は、抗体に結合するのに
適する他の標識を認知するか、又は日常的な実験を用い
てそうしたものを探知できるであろう。
より大きな感度をもたらすこともできるもう１つの技
術は、これら抗体を低分子量ハプテンにカップリングさ
せることからなる。次いで、第２反応によってこれらハ
プテンを特異的に検出することができる。例えば、特異
的抗ハプテン抗体と反応するビオチン（アビジンと反応
する）、ジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフル
オレセインのようなハプテンを用いるのが普通である。
術は、これら抗体を低分子量ハプテンにカップリングさ
せることからなる。次いで、第２反応によってこれらハ
プテンを特異的に検出することができる。例えば、特異
的抗ハプテン抗体と反応するビオチン（アビジンと反応
する）、ジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフル
オレセインのようなハプテンを用いるのが普通である。
抗原のin vivo検出に本発明のモノクローナル抗体を
用いるに際して、検出できるように標識された抗体を診
断に有効な用量で投与する。「診断に有効」という用語
は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の
量が、本発明のポリペプチド（このポリペプチドに対し
てモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有
する部位の検出が可能になるのに十分な量で投与される
ことを意味している。
用いるに際して、検出できるように標識された抗体を診
断に有効な用量で投与する。「診断に有効」という用語
は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の
量が、本発明のポリペプチド（このポリペプチドに対し
てモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有
する部位の検出が可能になるのに十分な量で投与される
ことを意味している。
検出できるように標識されたモノクローナル抗体の投
与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバッ
クグラウンドに比較して検出可能になるのに十分な濃度
であるべきである。更に、最良の標的対バックグラウン
ド信号比を得るために、検出できるように標識されたモ
ノクローナル抗体が循環系から急速に浄化されることが
望ましい。
与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバッ
クグラウンドに比較して検出可能になるのに十分な濃度
であるべきである。更に、最良の標的対バックグラウン
ド信号比を得るために、検出できるように標識されたモ
ノクローナル抗体が循環系から急速に浄化されることが
望ましい。
一般に、検出できるように標識されたモノクローナル
抗体のin vivo診断のための用量は、個体の年齢、性
別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであ
ろう。かかる用量は、例えば、注射が多数回行われるか
どうか、抗原負担、及び当業者に知られている他の要因
に依存して変動してもよい。
抗体のin vivo診断のための用量は、個体の年齢、性
別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであ
ろう。かかる用量は、例えば、注射が多数回行われるか
どうか、抗原負担、及び当業者に知られている他の要因
に依存して変動してもよい。
in vivo診断的画像化については、利用可能な検出装
置のタイプが、所定の放射性同位元素を選択するにあた
っての主因となる。選ばれる放射性同位元素は、所与の
タイプの装置で検出可能なタイプの崩壊を起こさなけれ
ばならない。in vivo診断用の放射性同位元素を選択す
るに際して重要なもう１つ要因は、宿主に対する有害な
放射線を最小限に抑えることである。理想的には、in v
ivo画像化に用いられる放射性同位元素は粒子放射を欠
くが、慣用的なガンマカメラにより簡単に検出できる14
0〜250keVの範囲の多数の光量子を生成するであろう。
置のタイプが、所定の放射性同位元素を選択するにあた
っての主因となる。選ばれる放射性同位元素は、所与の
タイプの装置で検出可能なタイプの崩壊を起こさなけれ
ばならない。in vivo診断用の放射性同位元素を選択す
るに際して重要なもう１つ要因は、宿主に対する有害な
放射線を最小限に抑えることである。理想的には、in v
ivo画像化に用いられる放射性同位元素は粒子放射を欠
くが、慣用的なガンマカメラにより簡単に検出できる14
0〜250keVの範囲の多数の光量子を生成するであろう。
in vivo診断については、介在官能基を用いることに
より放射性同位元素を直接又は間接にイムノグロブリン
に結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射性
同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば
用いられる介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸
（DTPA）及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び類似
の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノ
クローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例
は、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、及び201Tl
である。
より放射性同位元素を直接又は間接にイムノグロブリン
に結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射性
同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば
用いられる介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸
（DTPA）及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び類似
の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノ
クローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例
は、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、及び201Tl
である。
本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（MR
I）又は電子スピン共鳴（ESR）におけるように、in viv
o診断の目的のために常磁性同位元素で標識することも
できる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用方
法を用いることができる。通常、ガンマ及び陽電子放射
性ラジオアイソトープが、MRI用のカメラ画像化及び常
磁性同位元素として用いられる。かかる技術に特に有用
である元素には、157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、及び56Fe
が含まれる。
I）又は電子スピン共鳴（ESR）におけるように、in viv
o診断の目的のために常磁性同位元素で標識することも
できる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用方
法を用いることができる。通常、ガンマ及び陽電子放射
性ラジオアイソトープが、MRI用のカメラ画像化及び常
磁性同位元素として用いられる。かかる技術に特に有用
である元素には、157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、及び56Fe
が含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、in vitro及びin viv
oで用いて被験体のGDF−９関連疾患の改善の経過を追跡
することができる。かくして、例えば、本発明のポリペ
プチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減
少、又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変
化を測定することにより、GDF−９関連疾患の改善を狙
った特定の療法が効果的であるかどうかを確認すること
が可能になろう。「改善」という用語は、治療を受けて
いる被験体のGDF−９関連疾患の好ましくない作用が少
なくなることを表す。
oで用いて被験体のGDF−９関連疾患の改善の経過を追跡
することができる。かくして、例えば、本発明のポリペ
プチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減
少、又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変
化を測定することにより、GDF−９関連疾患の改善を狙
った特定の療法が効果的であるかどうかを確認すること
が可能になろう。「改善」という用語は、治療を受けて
いる被験体のGDF−９関連疾患の好ましくない作用が少
なくなることを表す。
本発明は、正常細胞における発現に比較して変異した
方法で発現され得るヌクレオチド配列を同定するもので
あり、従ってこの配列に向けられる適切な治療又は診断
法を設計するのが可能となる。かくして、細胞増殖性障
害がGDF−９の発現と関連している場合には、翻訳レベ
ルでGDF−９発現を妨害する核酸配列を用いることがで
きる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及
びリボザイムを用いて特定のGDF−9mRNAの翻訳を遮断す
るものであって、それはアンチセンス核酸でそのmRNAを
マスクするか又はリボザイムでそれを開裂させるかのい
ずれかによりなされる。
方法で発現され得るヌクレオチド配列を同定するもので
あり、従ってこの配列に向けられる適切な治療又は診断
法を設計するのが可能となる。かくして、細胞増殖性障
害がGDF−９の発現と関連している場合には、翻訳レベ
ルでGDF−９発現を妨害する核酸配列を用いることがで
きる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及
びリボザイムを用いて特定のGDF−9mRNAの翻訳を遮断す
るものであって、それはアンチセンス核酸でそのmRNAを
マスクするか又はリボザイムでそれを開裂させるかのい
ずれかによりなされる。
アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一
部に相補的であるDNA又はRNA分子である（Weintraub,Sc
ientific American,262:40,1990）。細胞内でアンチセ
ンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分
子を形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないで
あろうから、アンチセンス核酸はこのmRNAの翻訳を妨害
することになる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリ
ゴマーが好ましい。というのは、それらは、より大きな
分子よりも簡単に合成できかつ標的GDF−９産生細胞内
に導入したときにあまり問題を起こしそうにないからで
ある。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセ
ンス法を用いることは、当該技術分野で周知である（Ma
rcus−Sakura,Anal.Biochem.,172:289,1988）。
部に相補的であるDNA又はRNA分子である（Weintraub,Sc
ientific American,262:40,1990）。細胞内でアンチセ
ンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分
子を形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないで
あろうから、アンチセンス核酸はこのmRNAの翻訳を妨害
することになる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリ
ゴマーが好ましい。というのは、それらは、より大きな
分子よりも簡単に合成できかつ標的GDF−９産生細胞内
に導入したときにあまり問題を起こしそうにないからで
ある。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセ
ンス法を用いることは、当該技術分野で周知である（Ma
rcus−Sakura,Anal.Biochem.,172:289,1988）。
リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似の
やり方で他の一本鎖RNAを特異的に開裂する能力を有す
るRNA分子である。これらRNAをコードするヌクレオチド
配列の修飾により、RNA分子内の特定のヌクレオチド配
列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが
可能である（Chen,J.Amer.Med.Assn.,260:3030,198
8）。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特
異性であるので、特定の配列を有するmRNAだけを不活性
にする点である。
やり方で他の一本鎖RNAを特異的に開裂する能力を有す
るRNA分子である。これらRNAをコードするヌクレオチド
配列の修飾により、RNA分子内の特定のヌクレオチド配
列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが
可能である（Chen,J.Amer.Med.Assn.,260:3030,198
8）。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特
異性であるので、特定の配列を有するmRNAだけを不活性
にする点である。
２つの基本的なタイプのリボザイム、即ち、テトラヒ
メナ型（Hasselhoff,Nature,334:585,1988）及び“ハン
マーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長
さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボ
ザイムは長さが11〜18塩基の塩基配列を認識する。認識
配列が長ければ長いほど、その配列が標的mRNA種内に独
占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のmR
NA種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイム
がテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、しかも18
塩基の認識配列がそれより短い認識配列よりも好まし
い。
メナ型（Hasselhoff,Nature,334:585,1988）及び“ハン
マーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長
さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボ
ザイムは長さが11〜18塩基の塩基配列を認識する。認識
配列が長ければ長いほど、その配列が標的mRNA種内に独
占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のmR
NA種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイム
がテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、しかも18
塩基の認識配列がそれより短い認識配列よりも好まし
い。
本発明は、GDF−９タンパク質により媒介される細胞
増殖性障害を治療するための遺伝子治療も提供する。か
かる療法は、GDF−９アンチセンスポリヌクレオチドを
この増殖性障害を有する細胞内に導入することによりそ
の治療効果を奏することになる。アンチセンスGDF−９
ポリヌクレオチドの運搬（デリバリー）は、キメラウイ
ルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用
いて行うことができる。
増殖性障害を治療するための遺伝子治療も提供する。か
かる療法は、GDF−９アンチセンスポリヌクレオチドを
この増殖性障害を有する細胞内に導入することによりそ
の治療効果を奏することになる。アンチセンスGDF−９
ポリヌクレオチドの運搬（デリバリー）は、キメラウイ
ルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用
いて行うことができる。
アンチセンス配列の治療的デリバリーに特に好ましい
のは、標的設定（ターゲティング）されたリポソームを
用いることである。
のは、標的設定（ターゲティング）されたリポソームを
用いることである。
ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々
のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウ
イルス、ワクシニア又は、好ましくは、レトロウイルス
の如きRNAウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウ
イルスベクターは、マウス又は鳥類のレトロウイルスの
誘導体である。単一の異種遺伝子を挿入することができ
るレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイ
ルス（MoMuLV）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウイル
ス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、及びラ
ウス肉腫ウイルス（RSV）が含まれるが、これらに限定
されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数
の遺伝子を組み込むことができる。導入細胞が同定され
て世代形成できるように、これら全てのベクターは、選
択マーカー用の遺伝子を移入するか又は取り込むことが
できる。興味の対象であるGDF−９配列を、例えば、特
定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする別
の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することによ
り、そのベクターはその時点で標的特異性となる。レト
ロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質又はタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによ
って標的特異性にしてもよい。好ましい標的設定（ター
ゲティング）は、抗体を用いることにより行われる。当
業者は、過度な実験を重ねることなく、GDF−９アンチ
センスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベク
ターの標的特異性デリバリーを可能にするためにレトロ
ウイルスゲノム内に挿入できる特定のポリヌクレオチド
配列を認知するか、又は容易に探知できるであろう。
のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウ
イルス、ワクシニア又は、好ましくは、レトロウイルス
の如きRNAウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウ
イルスベクターは、マウス又は鳥類のレトロウイルスの
誘導体である。単一の異種遺伝子を挿入することができ
るレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイ
ルス（MoMuLV）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウイル
ス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、及びラ
ウス肉腫ウイルス（RSV）が含まれるが、これらに限定
されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数
の遺伝子を組み込むことができる。導入細胞が同定され
て世代形成できるように、これら全てのベクターは、選
択マーカー用の遺伝子を移入するか又は取り込むことが
できる。興味の対象であるGDF−９配列を、例えば、特
定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする別
の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することによ
り、そのベクターはその時点で標的特異性となる。レト
ロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質又はタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによ
って標的特異性にしてもよい。好ましい標的設定（ター
ゲティング）は、抗体を用いることにより行われる。当
業者は、過度な実験を重ねることなく、GDF−９アンチ
センスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベク
ターの標的特異性デリバリーを可能にするためにレトロ
ウイルスゲノム内に挿入できる特定のポリヌクレオチド
配列を認知するか、又は容易に探知できるであろう。
組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感
染性ベクター粒子を生成させるためにはそれらは助けを
必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全
ての構造遺伝子をそのLTR内の調節配列の制御下でコー
ドするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いるこ
とにより提供することができる。これらプラスミドに
は、そのパッケージング機構がキャプシデーション（包
膜）のためにRNA転写産物を認識するのを可能にするヌ
クレオチド配列が存在しない。このパッケージングシグ
ナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ
２、PA317及びPA12が含まれるが、これらに限定されな
い。これら細胞系は、ゲノムがパッケージされていない
ので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナ
ルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象である他の遺
伝子により置換されている細胞内にレトロウイルスベク
ターを導入した場合には、そのベクターはパッケージさ
れてベクタービリオンを産生することができる。
染性ベクター粒子を生成させるためにはそれらは助けを
必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全
ての構造遺伝子をそのLTR内の調節配列の制御下でコー
ドするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いるこ
とにより提供することができる。これらプラスミドに
は、そのパッケージング機構がキャプシデーション（包
膜）のためにRNA転写産物を認識するのを可能にするヌ
クレオチド配列が存在しない。このパッケージングシグ
ナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ
２、PA317及びPA12が含まれるが、これらに限定されな
い。これら細胞系は、ゲノムがパッケージされていない
ので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナ
ルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象である他の遺
伝子により置換されている細胞内にレトロウイルスベク
ターを導入した場合には、そのベクターはパッケージさ
れてベクタービリオンを産生することができる。
また、NIH 3T3又は他の組織培養細胞は、レトロウイ
ルス構造遺伝子gag、pol及びenvをコードするプラスミ
ドで慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションに
より直接トランスフェクトすることができる。次いで、
これら細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミ
ドでトランスフェクトする。得られる細胞は、培地中に
そのレトロウイルスベクターを放出する。
ルス構造遺伝子gag、pol及びenvをコードするプラスミ
ドで慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションに
より直接トランスフェクトすることができる。次いで、
これら細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミ
ドでトランスフェクトする。得られる細胞は、培地中に
そのレトロウイルスベクターを放出する。
GDF−９アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つの
標的デリバリーシステムは、コロイド分散系である。コ
ロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微
小球、ビーズ、及び、水中油エマルジョン、ミセル、混
合ミセル及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれ
る。この発明の好ましいコロイド系はリポソームであ
る。リポソームは、in vitro及びin vivoでの運搬体と
して有用である人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0μ
ｍの大きな単ラメラ小胞（large unilamellar vesicle,
LUV）が巨大分子を含有する相当なパーセンテージの水
性緩衝液を封入できることが分かった。RNA、DNA及び無
傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性形態で
細胞へ運搬することができる（Fraleyら,Trends Bioche
m.Sci.,6:77,1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソー
ムは、植物、酵母、及び細菌細胞へのポリヌクレオチド
の運搬に用いられてきた。リポソームが効率のよい遺伝
子導入運搬体であるためには、次の特徴が示されるべき
である：（１）対象となる遺伝子を高い効率で封入する
がそれらの生物活性を弱めないこと；（２）非標的細胞
に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること；
（３）標的細胞の細胞質へ該小胞の水性内容物を高い効
率で運搬すること；及び（４）遺伝子情報を正確かつ効
率的に発現すること（Manninoら,Biotechniques,6:682,
1988）。
標的デリバリーシステムは、コロイド分散系である。コ
ロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微
小球、ビーズ、及び、水中油エマルジョン、ミセル、混
合ミセル及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれ
る。この発明の好ましいコロイド系はリポソームであ
る。リポソームは、in vitro及びin vivoでの運搬体と
して有用である人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0μ
ｍの大きな単ラメラ小胞（large unilamellar vesicle,
LUV）が巨大分子を含有する相当なパーセンテージの水
性緩衝液を封入できることが分かった。RNA、DNA及び無
傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性形態で
細胞へ運搬することができる（Fraleyら,Trends Bioche
m.Sci.,6:77,1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソー
ムは、植物、酵母、及び細菌細胞へのポリヌクレオチド
の運搬に用いられてきた。リポソームが効率のよい遺伝
子導入運搬体であるためには、次の特徴が示されるべき
である：（１）対象となる遺伝子を高い効率で封入する
がそれらの生物活性を弱めないこと；（２）非標的細胞
に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること；
（３）標的細胞の細胞質へ該小胞の水性内容物を高い効
率で運搬すること；及び（４）遺伝子情報を正確かつ効
率的に発現すること（Manninoら,Biotechniques,6:682,
1988）。
リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転
移温度のリン脂質とステロイド、特にコレステロールと
を組み合わせたものである。他のリン脂質又は他の脂質
を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、p
H、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
移温度のリン脂質とステロイド、特にコレステロールと
を組み合わせたものである。他のリン脂質又は他の脂質
を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、p
H、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジ
ルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィン
ゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスフ
ァチジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分
が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含有
し飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールであ
る。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリ
ン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステア
ロイルホスファチジルコリンが含まれる。
ルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィン
ゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスフ
ァチジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分
が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含有
し飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールであ
る。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリ
ン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステア
ロイルホスファチジルコリンが含まれる。
リポソームの標的設定（ターゲティング）は、解剖学
的及び機械学的要因に基づいて分類される。解剖学的分
類は、選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオ
ルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定
は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区
別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管
を含む器官内の細網内皮系（reticulo−endothelialsys
tem,RES）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を
利用するものである。一方、能動的標的設定は、リポソ
ームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質
の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより
又はリポソームの組成若しくはサイズを変えることによ
りリポソームを改変して、天然に存在する局在部位以外
の器官及び細胞型に標的設定することを包含する。
的及び機械学的要因に基づいて分類される。解剖学的分
類は、選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオ
ルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定
は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区
別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管
を含む器官内の細網内皮系（reticulo−endothelialsys
tem,RES）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を
利用するものである。一方、能動的標的設定は、リポソ
ームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質
の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより
又はリポソームの組成若しくはサイズを変えることによ
りリポソームを改変して、天然に存在する局在部位以外
の器官及び細胞型に標的設定することを包含する。
標的デリバリーシステムの表面をいろいろな方法で修
飾することができる。リポソーム標的デリバリーシステ
ムの場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取
り込ませて、標的指向性リガンドをリポソーム二重層と
の安定な結合状態で維持するようにできる。脂質鎖を標
的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用い
ることができる。
飾することができる。リポソーム標的デリバリーシステ
ムの場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取
り込ませて、標的指向性リガンドをリポソーム二重層と
の安定な結合状態で維持するようにできる。脂質鎖を標
的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用い
ることができる。
生殖路内でのGDF−９の発現のために、避妊、受精能
及び妊娠に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレ
オチド及び抗体を用いる種々の応用がある。GDF−９は
月経周期の調節にある役割を果たすであろうから、種々
の避妊法に有用であろう。
及び妊娠に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレ
オチド及び抗体を用いる種々の応用がある。GDF−９は
月経周期の調節にある役割を果たすであろうから、種々
の避妊法に有用であろう。
以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定
を意図するものではない。それらは用いられるかも知れ
ない実例を代表しているが、当業者にとって既知の他の
手法を代わりに用いてもよい。
を意図するものではない。それらは用いられるかも知れ
ない実例を代表しているが、当業者にとって既知の他の
手法を代わりに用いてもよい。
実施例１
新規なTGF−βファミリーメンバーの同定と単離
TGF−βスーパーファミリーの新しいメンバーを同定
するため、既知のファミリーメンバーにおける２つの保
存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。
１つの領域は２つのトリプトファン残基の間にわたり、
MISを除いて全てのファミリーメンバーに保存されてい
るものであり、もう１つの領域はＣ−末端に近い不変シ
ステイン残基の間にわたるものである。これらのプライ
マーをマウスゲノムDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応に
使用し、その後プライマーの5'末端に配置された制限部
位を利用してPCR生成物をサブクローン化し、これらの
サブクローン化された挿入物を含む大腸菌の個々のコロ
ニーを採集し、そしてランダムな配列決定とハイブリダ
イゼーション分析を組み合わせて使用して、前記スーパ
ーファミリーの公知のメンバーを除外した。
するため、既知のファミリーメンバーにおける２つの保
存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。
１つの領域は２つのトリプトファン残基の間にわたり、
MISを除いて全てのファミリーメンバーに保存されてい
るものであり、もう１つの領域はＣ−末端に近い不変シ
ステイン残基の間にわたるものである。これらのプライ
マーをマウスゲノムDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応に
使用し、その後プライマーの5'末端に配置された制限部
位を利用してPCR生成物をサブクローン化し、これらの
サブクローン化された挿入物を含む大腸菌の個々のコロ
ニーを採集し、そしてランダムな配列決定とハイブリダ
イゼーション分析を組み合わせて使用して、前記スーパ
ーファミリーの公知のメンバーを除外した。
GDF−９は、プライマー
により得たPCR生成物の混合物から同定した。これらの
プライマーを使用したPCRは、２μｇマウスゲノムDNAを
使用して94℃で１分間、50℃で２分間、72℃で２分間、
40サイクル行った。
プライマーを使用したPCRは、２μｇマウスゲノムDNAを
使用して94℃で１分間、50℃で２分間、72℃で２分間、
40サイクル行った。
約280bpのPCR生成物をゲル精製し、EcoR Iにより消化
し、再度ゲル精製し、Bluescriptベクター（Stratagen
e,San Diego,CA）中にサブクローン化した。個々のサブ
クローンを含む細菌コロニーを96ウェルマイクロタイタ
ープレートに採集し、ニトロセルロース上に細胞をプレ
ーティングすることにより複数のレプリカを調製した。
複写したフィルターを、ファミリーの公知のメンバーを
示すプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズし
ないコロニーから配列分析のためのDNAを調製した。
し、再度ゲル精製し、Bluescriptベクター（Stratagen
e,San Diego,CA）中にサブクローン化した。個々のサブ
クローンを含む細菌コロニーを96ウェルマイクロタイタ
ープレートに採集し、ニトロセルロース上に細胞をプレ
ーティングすることにより複数のレプリカを調製した。
複写したフィルターを、ファミリーの公知のメンバーを
示すプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズし
ないコロニーから配列分析のためのDNAを調製した。
SJL160及びSJL153のプライマーの組合せは、分析した
145のサブクローンから３種の公知の配列（インヒビン
βＢ、BMP−２及びBMP−４）及び１種の新規な配列（GD
F−９と指称する）を与えた。
145のサブクローンから３種の公知の配列（インヒビン
βＢ、BMP−２及びBMP−４）及び１種の新規な配列（GD
F−９と指称する）を与えた。
RNA単離とノーザン分析は以前に記載されているよう
に行ったる（Lee,S.J.,Mol.Endocrinol.,4:1034,199
0）。Stratageneにより与えられた指示書に従い、卵巣
からポリＡ選択したRNA2.5−３μｇから、オリゴdTプラ
イマーを用いてcDNAライブラリーをλZAP IIベクター中
に調製した。卵巣ライブラリーはスクリーニングの前に
増幅しなかった。フィルターを前記したようにハイブリ
ダイズさせた（Lee,S.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88:
4250−4254,1991）。ジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法（Sangerら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74:5463−
5467,1977）及びS1ヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼI
IIの組合せによる方法（Henikoff,S.,Gene,28:351−35
9,1984）及び合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用
して、両鎖のDNA配列決定を行った。
に行ったる（Lee,S.J.,Mol.Endocrinol.,4:1034,199
0）。Stratageneにより与えられた指示書に従い、卵巣
からポリＡ選択したRNA2.5−３μｇから、オリゴdTプラ
イマーを用いてcDNAライブラリーをλZAP IIベクター中
に調製した。卵巣ライブラリーはスクリーニングの前に
増幅しなかった。フィルターを前記したようにハイブリ
ダイズさせた（Lee,S.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88:
4250−4254,1991）。ジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法（Sangerら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74:5463−
5467,1977）及びS1ヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼI
IIの組合せによる方法（Henikoff,S.,Gene,28:351−35
9,1984）及び合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用
して、両鎖のDNA配列決定を行った。
実施例２
GDF−９の発現パターン及び配列
GDF−９の発現パターンを調べるため、種々の成体組
織から調製したRNA試料をノーザン分析によりスクリー
ニングした。各組織から調製した、２回ポリＡ選択した
RNAの５μｇをホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にか
け、ブロットし、GDF−９により釣り上げた。図１に示
すように、GDF−９プローブは、卵巣のみで発現された
1.7kbのmRNAを検出した。
織から調製したRNA試料をノーザン分析によりスクリー
ニングした。各組織から調製した、２回ポリＡ選択した
RNAの５μｇをホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にか
け、ブロットし、GDF−９により釣り上げた。図１に示
すように、GDF−９プローブは、卵巣のみで発現された
1.7kbのmRNAを検出した。
1.5×106組換えファージのマウス卵巣cDNAライブラリ
ーをλZAP II中に構築し、GDF−9 PCR生成物から得たプ
ローブを使用してスクリーニングした。19のハイブリダ
イズする最も長いクローンのヌクレオチド配列を図２に
示す。共通のＮ−グリコシレーションシグナルを無地の
ボックスにより示す。推定上の４塩基プロセシング部位
を点描ボックスにより示す。推定上の開始ATGの上流の
読み枠内終結コドン及び共通のポリアデニレーションシ
グナルに下線を付した。ポリＡ尾部は示していない。数
字は5'末端からみたヌクレオチドの位置を示す。この17
12bp配列は、ヌクレオチド29のメチオニンコドンから始
まり、49.6kDの分子量を有する441アミノ酸長のタンパ
ク質をコードし得る長いオープンリーディングフレーム
を含んでいる。他のTGF−βファミリーメンバーと同様
に、GDF−９配列はＮ−末端に近い疎水性アミノ酸のコ
アを含み、これは分泌のためのシグナル配列を示唆する
ものである。GDF−９はまたアスパラギン残基163、22
9、258及び325における４つの可能性のあるＮ−グリコ
シレーション部位並びにアミノ酸303−306における推定
の４塩基タンパク質分解プロセシング部位（RRRR）を含
む。GDF−９の成熟Ｃ−末端フラグメントは、135アミノ
酸長で非グリコシル化分子量が15.6kDと予測される。
ーをλZAP II中に構築し、GDF−9 PCR生成物から得たプ
ローブを使用してスクリーニングした。19のハイブリダ
イズする最も長いクローンのヌクレオチド配列を図２に
示す。共通のＮ−グリコシレーションシグナルを無地の
ボックスにより示す。推定上の４塩基プロセシング部位
を点描ボックスにより示す。推定上の開始ATGの上流の
読み枠内終結コドン及び共通のポリアデニレーションシ
グナルに下線を付した。ポリＡ尾部は示していない。数
字は5'末端からみたヌクレオチドの位置を示す。この17
12bp配列は、ヌクレオチド29のメチオニンコドンから始
まり、49.6kDの分子量を有する441アミノ酸長のタンパ
ク質をコードし得る長いオープンリーディングフレーム
を含んでいる。他のTGF−βファミリーメンバーと同様
に、GDF−９配列はＮ−末端に近い疎水性アミノ酸のコ
アを含み、これは分泌のためのシグナル配列を示唆する
ものである。GDF−９はまたアスパラギン残基163、22
9、258及び325における４つの可能性のあるＮ−グリコ
シレーション部位並びにアミノ酸303−306における推定
の４塩基タンパク質分解プロセシング部位（RRRR）を含
む。GDF−９の成熟Ｃ−末端フラグメントは、135アミノ
酸長で非グリコシル化分子量が15.6kDと予測される。
GDF−９のＣ−末端領域は他のファミリーメンバーに
対して明らかに相同性を示すが、GDF−９の配列は他の
ファミリーメンバーのものから有意に異なっている（図
３及び４）。図３は、GDF−９のＣ−末端配列と、ヒトG
DF−１（Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4250−4254,1
991）、ツメガエルVg−１（Weeksら,Cell,51:861−867,
1987）、ヒトVgr−１（Celesteら,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,87:9843−9847,1990）、ヒトOP−１（Ozkaynakら,E
MBO J.,9:2085−2093,1990）、ヒトBMP−５（Celeste
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:9843−9847,1990）、シ
ョウジョウバエ60A（Whartonら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,88:9214−9218,1991）、ヒトBMP−２及び４（Wozney
ら,Science,242:1528−1534,1988）、ショウジョウバエ
DPP（Padgettら,Nature,325:81−84,1987）、ヒトBMP−
３（Wozneyら,Science,242:1528−1534,1988）、ヒトMI
S（Cateら,Cell,45:685−698,1986），ヒトインヒビン
α、βＡ、及びβＢ（Masonら,Biochem,Biophys.Res.Co
mmun.,135:957−964,1986）、ヒトTGF−β１（Derynck
ら,Nature,316:701−705,1985）、ヒトTGF−β２（deMa
rtinら,EMBO J.,6:3673−3677,1987）、ヒトTGF−β３
（ten Dijkeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4715−471
9,1988）、ニワトリTGF−β４（Jakowlewら,Mol.Endocr
inol.,2:1186−1195,1988）、並びにツメガエルTGF−β
５（Kondaiahら,J.Biol.Chem.,265:1089−1093,1990）
の対応する領域との並列化を示す。保存システイン残基
には影を付した。ダッシュは並列化を最大限とするため
に入れたギャップである。
対して明らかに相同性を示すが、GDF−９の配列は他の
ファミリーメンバーのものから有意に異なっている（図
３及び４）。図３は、GDF−９のＣ−末端配列と、ヒトG
DF−１（Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4250−4254,1
991）、ツメガエルVg−１（Weeksら,Cell,51:861−867,
1987）、ヒトVgr−１（Celesteら,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,87:9843−9847,1990）、ヒトOP−１（Ozkaynakら,E
MBO J.,9:2085−2093,1990）、ヒトBMP−５（Celeste
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:9843−9847,1990）、シ
ョウジョウバエ60A（Whartonら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,88:9214−9218,1991）、ヒトBMP−２及び４（Wozney
ら,Science,242:1528−1534,1988）、ショウジョウバエ
DPP（Padgettら,Nature,325:81−84,1987）、ヒトBMP−
３（Wozneyら,Science,242:1528−1534,1988）、ヒトMI
S（Cateら,Cell,45:685−698,1986），ヒトインヒビン
α、βＡ、及びβＢ（Masonら,Biochem,Biophys.Res.Co
mmun.,135:957−964,1986）、ヒトTGF−β１（Derynck
ら,Nature,316:701−705,1985）、ヒトTGF−β２（deMa
rtinら,EMBO J.,6:3673−3677,1987）、ヒトTGF−β３
（ten Dijkeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4715−471
9,1988）、ニワトリTGF−β４（Jakowlewら,Mol.Endocr
inol.,2:1186−1195,1988）、並びにツメガエルTGF−β
５（Kondaiahら,J.Biol.Chem.,265:1089−1093,1990）
の対応する領域との並列化を示す。保存システイン残基
には影を付した。ダッシュは並列化を最大限とするため
に入れたギャップである。
図４は、TGF−βスーパーファミリー中の異なるメン
バーの間のアミノ酸の相同性を示す。数字は、第１の保
存システインからＣ−末端まで計算した各対の間のアミ
ノ酸の同一性のパーセントを表す。ボックスは、特定の
サブグループ内の高度に関連したメンバーにおける相同
性を示す。
バーの間のアミノ酸の相同性を示す。数字は、第１の保
存システインからＣ−末端まで計算した各対の間のアミ
ノ酸の同一性のパーセントを表す。ボックスは、特定の
サブグループ内の高度に関連したメンバーにおける相同
性を示す。
公知のファミリーメンバーとの配列同一性の程度は、
最小のMISとの21％から最大のBMP−４との34％までの範
囲である。従って、GDF−９はこのスーパーファミリー
の他のメンバーからの配列相違の程度においてMISに匹
敵する。さらにGDF−９は分子のプロ領域において他の
ファミリーメンバーに対して有意な配列相同性を示さな
い。GDF−９はまた、Ｃ−末端領域におけるシステイン
残基のパターンにおいても公知のファミリーメンバーと
異なっている。GDF−９は他の全てのファミリーメンバ
ーに存在する７つのシステインの４番目のシステインを
欠いており、この位置のシステインの代わりにGDF−９
配列はセリン残基を含んでいる。さらに、GDF−９はＣ
−末端領域の他のどこにも７番目のシステインを含んで
いない。
最小のMISとの21％から最大のBMP−４との34％までの範
囲である。従って、GDF−９はこのスーパーファミリー
の他のメンバーからの配列相違の程度においてMISに匹
敵する。さらにGDF−９は分子のプロ領域において他の
ファミリーメンバーに対して有意な配列相同性を示さな
い。GDF−９はまた、Ｃ−末端領域におけるシステイン
残基のパターンにおいても公知のファミリーメンバーと
異なっている。GDF−９は他の全てのファミリーメンバ
ーに存在する７つのシステインの４番目のシステインを
欠いており、この位置のシステインの代わりにGDF−９
配列はセリン残基を含んでいる。さらに、GDF−９はＣ
−末端領域の他のどこにも７番目のシステインを含んで
いない。
実施例３
透明帯におけるGDF−９の免疫化学的位置決定
GDF−9 mRNAが翻訳されたかどうかを調べるために、
成体卵巣の切片を組換えGDF−９タンパク質に対する抗
体とインキュベートした。GDF−９に対する抗体を生成
するためには、アミノ酸30〜295（前領域）またはアミ
ノ酸308〜441（成熟領域）にわたるGDF−9cDNAの部分
を、T7をベースとするpET3発現ベクター（F.W.Studier,
Brookhaven National Laboratoryにより提供された）中
にクローン化し、得られたプラスミドをBL21（DE3）細
菌株中に形質転換した。イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラ
クトシド誘発細胞からの全細胞抽出物を、SDS/ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動にかけ、GDF−９タンパク
質フラグメントを切り出し、フロイントアジュバントと
混合し、当業者に公知の標準的方法によりウサギを免疫
するのに使用した。全ての免疫化はSpring Valley Lab
（Sykesville,MD）により行われた。これらのウサギの
血清中のGDF−９−反応性抗体の存在は、細菌により発
現されたタンパク質フラグメントのウェスタン分析によ
り調べた。得られた血清は、ウェスタン分析により細菌
により発現されたタンパク質と反応することが示され
た。
成体卵巣の切片を組換えGDF−９タンパク質に対する抗
体とインキュベートした。GDF−９に対する抗体を生成
するためには、アミノ酸30〜295（前領域）またはアミ
ノ酸308〜441（成熟領域）にわたるGDF−9cDNAの部分
を、T7をベースとするpET3発現ベクター（F.W.Studier,
Brookhaven National Laboratoryにより提供された）中
にクローン化し、得られたプラスミドをBL21（DE3）細
菌株中に形質転換した。イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラ
クトシド誘発細胞からの全細胞抽出物を、SDS/ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動にかけ、GDF−９タンパク
質フラグメントを切り出し、フロイントアジュバントと
混合し、当業者に公知の標準的方法によりウサギを免疫
するのに使用した。全ての免疫化はSpring Valley Lab
（Sykesville,MD）により行われた。これらのウサギの
血清中のGDF−９−反応性抗体の存在は、細菌により発
現されたタンパク質フラグメントのウェスタン分析によ
り調べた。得られた血清は、ウェスタン分析により細菌
により発現されたタンパク質と反応することが示され
た。
免疫組織化学的研究のため、成体マウスから卵巣を摘
出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィ
ン中に埋包し、切片とした。Vectastain ABCキットを使
用してVector Laboratoriesにより与えられた指示書に
従い抗体結合の部位を検出した。図５は、GDF−９タン
パク質の免疫組織化学的位置決定を示す。成体卵巣の隣
接する切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色するか
（図5a）、希釈率1:500の免疫血清（図5b）または前免
疫血清（図5c）とともにインキュベートした。図5bに示
されるように、抗血清は卵母細胞においてのみタンパク
質を検出した。前免疫血清を使用すると染色は見られな
かった（図5c）。従って、GDF−９は卵母細胞によりin
vivoにおいて翻訳されるものと思われる。
出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィ
ン中に埋包し、切片とした。Vectastain ABCキットを使
用してVector Laboratoriesにより与えられた指示書に
従い抗体結合の部位を検出した。図５は、GDF−９タン
パク質の免疫組織化学的位置決定を示す。成体卵巣の隣
接する切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色するか
（図5a）、希釈率1:500の免疫血清（図5b）または前免
疫血清（図5c）とともにインキュベートした。図5bに示
されるように、抗血清は卵母細胞においてのみタンパク
質を検出した。前免疫血清を使用すると染色は見られな
かった（図5c）。従って、GDF−９は卵母細胞によりin
vivoにおいて翻訳されるものと思われる。
実施例４
ヒトGDF−９の単離
ヒトGDF−９をコードするcDNAクローンを単離するた
めに、成人ヒト卵巣から調製した、ポリＡで選択したRN
Aを使用してλZAP II中にcDNAライブラリーを構築し
た。実施例１のように標準的なスクリーニング法を使用
し、そしてマウスGDF−９クローンをプローブとして使
用して、このライブラリーから完全なヒトGDF−９コー
ド配列を含むcDNAクローンを同定した。マウスの予測さ
れたアミノ酸配列（最上段）及びヒト（下段）GDF−９
配列の比較を図６に示す。数字はＮ−末端に対するアミ
ノ酸位置を示す。垂直な線は配列の同一性を示す。ドッ
トは並列を最大限とするために導入したギャップを示
す。何も付していないボックスは予測タンパク質分解プ
ロセシング部位を示す。影を付したボックスはタンパク
質の成熟領域中のシステイン残基を示す。下部の線は、
GDF−９の前領域（なにも付していない）及び成熟領域
（影を付した）の概略を示し、下にマウス及びヒト配列
の間の配列同一性パーセントを示す。
めに、成人ヒト卵巣から調製した、ポリＡで選択したRN
Aを使用してλZAP II中にcDNAライブラリーを構築し
た。実施例１のように標準的なスクリーニング法を使用
し、そしてマウスGDF−９クローンをプローブとして使
用して、このライブラリーから完全なヒトGDF−９コー
ド配列を含むcDNAクローンを同定した。マウスの予測さ
れたアミノ酸配列（最上段）及びヒト（下段）GDF−９
配列の比較を図６に示す。数字はＮ−末端に対するアミ
ノ酸位置を示す。垂直な線は配列の同一性を示す。ドッ
トは並列を最大限とするために導入したギャップを示
す。何も付していないボックスは予測タンパク質分解プ
ロセシング部位を示す。影を付したボックスはタンパク
質の成熟領域中のシステイン残基を示す。下部の線は、
GDF−９の前領域（なにも付していない）及び成熟領域
（影を付した）の概略を示し、下にマウス及びヒト配列
の間の配列同一性パーセントを示す。
マウスGDF−９と同様に、ヒトGDF−９は疎水性リーダ
ー配列、推定RXXRタンパク質分解切断部位、及び他のTG
F−βファミリーのメンバーの前記の顕著な特徴を含む
Ｃ−末端を含む。マウス及びヒトGDF−９は分子のプロ
領域において64％同一であり、予測される分子の成熟領
域において90％同一である。この２つの配列の相同性の
高い程度は、ヒトGDF−９が胎児発生及び／または成人
卵巣において重要な役割を果たしていることを示唆する
ものである。
ー配列、推定RXXRタンパク質分解切断部位、及び他のTG
F−βファミリーのメンバーの前記の顕著な特徴を含む
Ｃ−末端を含む。マウス及びヒトGDF−９は分子のプロ
領域において64％同一であり、予測される分子の成熟領
域において90％同一である。この２つの配列の相同性の
高い程度は、ヒトGDF−９が胎児発生及び／または成人
卵巣において重要な役割を果たしていることを示唆する
ものである。
実施例５
卵母細胞におけるGDF−９の発現の核酸検出
卵巣におけるGDF−９の発現の位置を決定するため
に、アンチセンスGDF−9 RNAプローブを使用してマウス
卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを行
った。図７は、GDF−9 RNAプローブを使用した、成体卵
巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示
す。［35S］−標識アンチセンスGDF−9 RNAプローブ
（図7a及び7c）またはセンスGDF−9 RNAプローブ（図7b
及び7d）を、４％パラホルムアルデヒド中に固定した卵
巣の隣接するパラフィン埋包切片にハイブリダイズさせ
た。切片を写真乳剤に浸し、露出し、現像し、そしてヘ
マトキシリン及びエオシンで染色した。２種の代表的な
領域を示す。
に、アンチセンスGDF−9 RNAプローブを使用してマウス
卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを行
った。図７は、GDF−9 RNAプローブを使用した、成体卵
巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示
す。［35S］−標識アンチセンスGDF−9 RNAプローブ
（図7a及び7c）またはセンスGDF−9 RNAプローブ（図7b
及び7d）を、４％パラホルムアルデヒド中に固定した卵
巣の隣接するパラフィン埋包切片にハイブリダイズさせ
た。切片を写真乳剤に浸し、露出し、現像し、そしてヘ
マトキシリン及びエオシンで染色した。２種の代表的な
領域を示す。
図7a及び7cに示すように、GDF−9 mRNAは主として成
体卵巣の卵母細胞中に検出された。調べた全ての卵母細
胞は（卵胞発生の段階にかかわらず）GDF−９発現を示
し、その他の細胞種では発現は検出されなかった。対照
のGDF−９センスRNAプローブを使用した場合、ハイブリ
ダイゼーションは見られなかった（図7b及び7d）。従っ
て、GDF−９発現は、成体卵巣中の卵母細胞の特異的な
もののようである。
体卵巣の卵母細胞中に検出された。調べた全ての卵母細
胞は（卵胞発生の段階にかかわらず）GDF−９発現を示
し、その他の細胞種では発現は検出されなかった。対照
のGDF−９センスRNAプローブを使用した場合、ハイブリ
ダイゼーションは見られなかった（図7b及び7d）。従っ
て、GDF−９発現は、成体卵巣中の卵母細胞の特異的な
もののようである。
卵巣発生の間のGDF−9 mRNAの発現のパターンを調べ
るために、新生児卵巣の切片をGDF−9 RNAプローブで釣
り上げた。図８は、アンチセンスGDF−9 RNAプローブを
使用した、出生後第４日の卵巣切片に対するin situハ
イブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したよう
に調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視
野（図8a）及び暗視野（図8b）照明下において切片の写
真をとった。
るために、新生児卵巣の切片をGDF−9 RNAプローブで釣
り上げた。図８は、アンチセンスGDF−9 RNAプローブを
使用した、出生後第４日の卵巣切片に対するin situハ
イブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したよう
に調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視
野（図8a）及び暗視野（図8b）照明下において切片の写
真をとった。
図９は、アンチセンスGDF−9 RNAプローブ（図9a）ま
たはセンスGDF−9 RNAプローブ（図9b）を使用した、出
生後第８日の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼ
ーションを示す。切片は図７に示したように調製した。
たはセンスGDF−9 RNAプローブ（図9b）を使用した、出
生後第８日の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼ
ーションを示す。切片は図７に示したように調製した。
GDF−9 mRNA発現は最初、卵胞発生の開始において検
出された。これは出生第４日において最も明確に明らか
となり、この場合卵胞に存在する卵母細胞のみがGDF−
９発現を示し（図８）、顆粒膜細胞に囲まれていない卵
母細胞においては発現は見られなかった。出生後第８日
までに、全ての卵母細胞は卵胞発生を経たようであり、
全ての卵母細胞はGDF−９発現を示した（図９）。
出された。これは出生第４日において最も明確に明らか
となり、この場合卵胞に存在する卵母細胞のみがGDF−
９発現を示し（図８）、顆粒膜細胞に囲まれていない卵
母細胞においては発現は見られなかった。出生後第８日
までに、全ての卵母細胞は卵胞発生を経たようであり、
全ての卵母細胞はGDF−９発現を示した（図９）。
排卵の後にもGDF−９が発現されたかどうかを調べる
ために、マウス輸卵管をin situハイブリダイゼーショ
ンにより調べた。図10は、アンチセンスGDF−9 RNAプロ
ーブ（図10a）またはセンスGDF−9 RNAプローブ（図10
b）を使用した、成体輸卵管切片に対するin situハイブ
リダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調
製した。
ために、マウス輸卵管をin situハイブリダイゼーショ
ンにより調べた。図10は、アンチセンスGDF−9 RNAプロ
ーブ（図10a）またはセンスGDF−9 RNAプローブ（図10
b）を使用した、成体輸卵管切片に対するin situハイブ
リダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調
製した。
図11は、アンチセンスGDF−9 RNAプローブを使用し
た、成体輸卵管（受精後0.5日）切片に対するin situハ
イブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したよう
に調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視
野（図11a）及び暗視野（図11b）照明下において切片の
写真をとった。
た、成体輸卵管（受精後0.5日）切片に対するin situハ
イブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したよう
に調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視
野（図11a）及び暗視野（図11b）照明下において切片の
写真をとった。
図10に示されるように、GDF−９は輸卵管に放出され
た卵母細胞により発現された。しかし、GDF−9 mRNAの
発現は、卵母細胞の受精の後に受精後0.5日までに急速
に消失し、いくつかの胚（例えば図11に示したようなも
の）のみがGDF−9 mRNAを発現し、1.5日までに全ての胚
はGDF−９発現について陰性であった。
た卵母細胞により発現された。しかし、GDF−9 mRNAの
発現は、卵母細胞の受精の後に受精後0.5日までに急速
に消失し、いくつかの胚（例えば図11に示したようなも
の）のみがGDF−9 mRNAを発現し、1.5日までに全ての胚
はGDF−９発現について陰性であった。
本発明を現時点で好ましい態様を引用して説明した
が、本発明の概念を逸脱することなく種々の改変を行う
ことができることが理解されるべきである。従って、本
発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるもので
ある。
が、本発明の概念を逸脱することなく種々の改変を行う
ことができることが理解されるべきである。従って、本
発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるもので
ある。
配列の要約
配列番号１は、GDF−９のプライマー、SJL 160につい
てのヌクレオチド配列である。
てのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、GDF−９のプライマー、SJL 153につい
てのヌクレオチド配列である。
てのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、GDF−９についてのヌクレオチド及び
推定アミノ酸配列である（図２）。
推定アミノ酸配列である（図２）。
配列番号４は、GDF−９についての推定アミノ酸配列
である（図２）。
である（図２）。
配列番号５は、GDF−３のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号６は、GDF−９のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号７は、GDF−１のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号８は、Vg−１のＣ−末端のアミノ酸配列であ
る（図３）。
る（図３）。
配列番号９は、Vgr−１のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号10は、OP−１のＣ−末端のアミノ酸配列であ
る（図３）。
る（図３）。
配列番号11は、BMP−５のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号12は、60AのＣ−末端のアミノ酸配列である
（図３）。
（図３）。
配列番号13は、BMP−２のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号14は、BMP−４のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号15は、DPPのＣ−末端のアミノ酸配列である
（図３）。
（図３）。
配列番号16は、BMP−３のＣ−末端のアミノ酸配列で
ある（図３）。
ある（図３）。
配列番号17は、MISのＣ−末端のアミノ酸配列である
（図３）。
（図３）。
配列番号18は、インヒビン−αのＣ−末端のアミノ酸
配列である（図３）。
配列である（図３）。
配列番号19は、インヒビン−βＡのＣ−末端のアミノ
酸配列である（図３）。
酸配列である（図３）。
配列番号20は、インヒビン−βＢのＣ−末端のアミノ
酸配列である（図３）。
酸配列である（図３）。
配列番号21は、TGF−β１のＣ−末端のアミノ酸配列
である（図３）。
である（図３）。
配列番号22は、TGF−β２のＣ−末端のアミノ酸配列
である（図３）。
である（図３）。
配列番号23は、TGF−β３のＣ−末端のアミノ酸配列
である（図３）。
である（図３）。
配列番号24は、TGF−β４のＣ−末端のアミノ酸配列
である（図３）。
である（図３）。
配列番号25は、TGF−β５のＣ−末端のアミノ酸配列
である（図３）。
である（図３）。
配列番号26は、ヒトGDF−９のアミノ酸配列である
（図６）。
（図６）。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:35塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
直接の起源
クローン:SJL160
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..35
他の情報:Bが存在する場合、Ｂ＝イノシン
配列
配列番号:2
配列の長さ:33塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
直接の起源
クローン:SJL153
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:1..33
配列
配列番号:3
配列の長さ:1712塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
直接の起源
クローン:GDF−９
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:29..1351
配列
配列番号:4
配列の長さ:441アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列番号:5
配列の長さ:117アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:GDF−３
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..117
配列
配列番号:6
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:GDF−９
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:7
配列の長さ:122アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:GDF−１
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..122
配列
配列番号:8
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:Vg−１
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:9
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:Vgr−１
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:10
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:OP−１
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:11
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:BMP−５
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:12
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:60A
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:13
配列の長さ:117アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:BMP−２
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..117
配列
配列番号:14
配列の長さ:117アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:BMP−４
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..117
配列
配列番号:15
配列の長さ:118アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:DPP
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..118
配列
配列番号:16
配列の長さ:119アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:BMP−３
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..119
配列
配列番号:17
配列の長さ:115アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:MIS
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..115
配列
配列番号:18
配列の長さ:121アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:Inhibin α
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..121
配列
配列番号:19
配列の長さ:121アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:Inhibin βＡ
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..121
配列
配列番号:20
配列の長さ:120アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:Inhibin βＢ
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..120
配列
配列番号:21
配列の長さ:114アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:TGF−β１
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..114
配列
配列番号:22
配列の長さ:114アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:TGF−β２
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..114
配列
配列番号:23
配列の長さ:114アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:TGF−β３
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..114
配列
配列番号:24
配列の長さ:116アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:TGF−β４
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..116
配列
配列番号:25
配列の長さ:114アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン:TGF−β５
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..114
配列
配列番号:26
配列の長さ:454アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ヒトGDF−９
配列の特徴
特徴を表す記号:protein
存在位置:1..454
配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 49/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ
Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/495 ＺＮＡ
Ｃ０７Ｋ 14/495 ＺＮＡ 16/22
16/22 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ
Ｃ１２Ｒ 1:19
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/09
C07K 14/47 - 14/495
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (16)
- 【請求項１】配列番号４または配列番号26で示されるア
ミノ酸配列からなる単離された増殖分化因子−９（GDF
−９）ポリペプチド。 - 【請求項２】下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列か
らなる、請求項１に記載のポリペプチドのフラグメン
ト。 （ａ）配列番号４で示される配列上のアミノ酸番号30〜
295のアミノ酸配列 （ｂ）配列番号４で示される配列上のアミノ酸番号308
〜441のアミノ酸配列 - 【請求項３】請求項１に記載のポリペプチドをコードす
る、単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項４】哺乳動物細胞から単離されるものである、
請求項３に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】哺乳動物細胞がマウス、ラットおよびヒト
の細胞よりなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項６】請求項２に記載のフラグメントをコードす
るポリヌクレオチド。 - 【請求項７】配列番号３で示される塩基配列からなるポ
リヌクレオチド。 - 【請求項８】請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクター。 - 【請求項９】請求項８に記載のベクターで安定に形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項１０】真核細胞である、請求項９に記載の宿主
細胞。 - 【請求項１１】請求項１に記載のポリペプチドと反応性
の抗体、または該抗体の免疫反応性のフラグメント。 - 【請求項１２】請求項２に記載のフラグメントと反応性
の抗体、または該抗体の免疫反応性のフラグメント。 - 【請求項１３】前記抗体がモノクローナル抗体である、
請求項11または12に記載の抗体または該抗体の免疫反応
性のフラグメント。 - 【請求項１４】請求項11〜13のいずれか１項に記載の抗
体または該抗体の免疫反応性のフラグメントを含む、卵
巣の細胞増殖性疾患を検出するための検出用試薬であっ
て、但し、卵巣の細胞増殖性疾患の検出は、該検出用試
薬を被験体由来の細胞と接触させた後、前記抗体または
該抗体の免疫反応性のフラグメントのGDF−９への結合
を検出することによって行われる、前記試薬。 - 【請求項１５】卵巣の細胞増殖性疾患が卵巣の腫瘍であ
る、請求項14に記載の試薬。 - 【請求項１６】卵巣の細胞増殖性疾患を検出する検出用
試薬を製造するための、請求項11〜13のいずれか１項に
記載の抗体または該抗体の免疫反応性のフラグメントの
使用方法であって、但し、卵巣の細胞増殖性疾患の検出
は、該検出用試薬を被験体由来の細胞と接触させた後
に、前記抗体または該抗体の免疫反応性のフラグメント
のGDF−９への結合を検出することによって行われる、
前記方法。
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|---|---|---|---|
| US330393A | 1993-01-12 | 1993-01-12 | |
| US08/003,303 | 1993-01-12 | ||
| PCT/US1994/000685 WO1994015966A1 (en) | 1993-01-12 | 1994-01-12 | Growth differentiation factor-9 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51638494A Expired - Lifetime JP3482207B2 (ja) | 1993-01-12 | 1994-01-12 | 増殖分化因子−９ |
| JP2003043088A Pending JP2004091466A (ja) | 1993-01-12 | 2003-02-20 | 増殖分化因子−９ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003043088A Pending JP2004091466A (ja) | 1993-01-12 | 2003-02-20 | 増殖分化因子−９ |
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| JP (2) | JP3482207B2 (ja) |
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