JP2004091466A

JP2004091466A - 増殖分化因子−９

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Publication number: JP2004091466A
Application number: JP2003043088A
Authority: JP
Inventors: Se-Jin Lee; リー，セージン
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1993-01-12
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2004-03-25
Also published as: US20020127612A1; JP3482207B2; US20040152143A1; EP0678101A4; CA2153653C; WO1994015966A1; CA2153653A1; US6365402B1; JPH09508001A; EP0678101A1

Abstract

【課題】増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）の異常な発現レベルと関係する細胞増殖性疾患、特に卵巣癌及び避妊用治療剤及び診療薬の提供。
【解決手段】ＧＤＦ−９活性を抑制する薬剤が、抗ＧＤＦ−９ポリクローナル抗体、抗ＧＤＦ−９モノクローナル抗体、ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド配列、それらの薬剤をコロイド分散系のリボソームであるレトロウイルス組換え発現ベクターを使用して細胞に導入する医薬組成物。
【選択図】なし

Description

【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、特定的には形質転換増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの新メンバーである増殖分化因子−９　（ｇｒｏｗｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ−３　：ＧＤＦ−９）に係わるものである。
２．関連技術分野の説明
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発生中の広範な分化過程に影響を及ぼす、構造的に関連したタンパク質の一群を包含する。このファミリーには、正常な雄性発達に必要とされるミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ　ら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３４５：１６７，　１９９０）；背−腹軸の形成および成虫原基の形態形成に必要とされるショウジョウバエのデカペンタプレジック（ＤＰＰ）遺伝子産物（Ｐａｄｇｅｔｔ　ら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２５：８１−８４，　１９８７）；卵の植物極に局在するツメガエルＶｇ−１遺伝子産物（Ｗｅｅｋｓら，　Ｃｅｌｌ，　５１：８６１−８６７，　１９８７）；ツメガエル胚における中胚葉および前方構造の形成を誘導し得る（Ｔｈｏｍｓｅｎ　ら，　Ｃｅｌｌ，　６３：４８５，　１９９０）アクチビン類（Ｍａｓｏｎ　ら，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１３５：９５７−９６４，　１９８６）；および新たな軟骨および骨の形成を誘導し得る（Ｓａｍｐａｔｈ　ら，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６５：１３１９８，　１９９０　）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、オステオゲニン、ＯＰ−１）が含まれる。ＴＧＦ−βは、脂質生成、筋発生、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含めて、さまざまな分化過程に影響を与えることができる（再検討のため、Ｍａｓｓａｇｕｅ，　Ｃｅｌｌ，　４９：４３７，　１９８７を参照のこと）。
【０００２】
ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆体タンパク質として合成され、その後前駆体タンパク質はＣ末端側の約１１０〜１４０個のアミノ酸から成る塩基性残基のクラスターで加水分解切断を受ける。これらのタンパク質のＣ末端領域はどれも構造的に関連しており、その相同度に基づいて、それぞれのファミリーメンバーを別個のサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は７０〜９０％アミノ酸配列同一性の範囲であるが、サブグループ間の相同性は著しく低く、一般的にはせいぜい２０〜５０％の範囲である。いずれの場合も、活性種はＣ末端フラグメントのジスルフィド架橋二量体であると考えられる。これまでに研究された大半のファミリーメンバーでは、ホモ二量体種が生物学的に活性であるとされているが、インヒビン（Ｌｉｎｇら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２１：７７９，　１９８６　）やＴＧＦ−β（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら，　Ｃｅｌｌ，　４８：４０９，　１９８７）のような他のファミリーメンバーについてはヘテロ二量体も検出されており、これらはそれぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質をもつようである。
【０００３】
インヒビン類およびアクチビン類は最初に卵胞液から精製されたもので、下垂体からの卵胞刺激ホルモンの放出に対して反対の作用を有することが分かっている。３種類すべてのインヒビン／アクチビンサブユニット（αａ、βＡおよびβＢ）のｍＲＮＡが卵巣で検出されているが、これらはどれも卵巣特異的ではないようである（Ｍｅｕｎｉｅｒ　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５：２４７，　１９８８）。ＭＩＳも顆粒膜細胞によって発現されることが判明しており、卵巣発達に及ぼすＭＩＳの効果がＭＩＳを異所的に発現するトランスジェニックマウスによりｉｎ　ｖｉｖｏ　で（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，前掲）、さらに器官培養によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで（Ｖｉｇｉｅｒら，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１００：４３，　１９８７　）論じられている。
発現パターンが組織特異的である新規因子の同定は、その組織の発達および機能のより一層の理解をもたらすだろう。
【０００４】
発明の概要
本発明は、細胞増殖分化因子ＧＤＦ−９、該因子をコードするポリヌクレオチド配列、および該因子と免疫反応性である抗体を提供する。この因子は種々の細胞増殖性疾患、特に顆粒膜細胞腫のような卵巣の腫瘍を伴う疾患に関係があるようである。
従って、１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９と関係がある卵巣起源の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９活性を抑制または増強することにより、ＧＤＦ−９の異常な発現レベルと関係がある細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、増殖分化因子ＧＤＦ−９ならびにＧＤＦ−９をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと違って、ＧＤＦ−９の発現は非常に組織特異的で、主に卵巣組織の細胞において発現される。１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９発現と関係がある卵巣の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９活性を抑制または増強する薬剤を使用することにより、ＧＤＦ−９の異常な発現と関係がある細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【０００６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは多くの細胞型の増殖、分化、その他の機能を制御する多機能性ポリペプチドから成っている。かかるペプチドの多くは他のペプチド増殖因子に対してポジティブおよびネガティブの両方の調節作用を有する。本発明のＧＤＦ−９タンパク質とＴＧＦ−βファミリーのメンバー間の構造的相同性は、ＧＤＦ−９が増殖および分化因子のファミリーの新メンバーであることを示す。他の多くのメンバーのすでに知られた活性に基づくと、ＧＤＦ−９もまた診断薬や治療薬として有用であるような生物学的活性を有することが期待できる。
【０００７】
例えば、ＴＧＦ−βとの構造的相同を有することが見いだされた別の調節タンパク質はインヒビンであるが、これはＦＳＨの下垂体分泌の特異的かつ強力なポリペプチド阻害物質である。インヒビンは卵巣の卵胞液から単離されている。ＦＳＨを抑制するために、インヒビンは雌雄両性の避妊薬としての使用可能性を有する。ＧＤＦ−９は、卵巣特異的ペプチドであるから、同様の生物学的活性をもつかもしれない。また、インヒビンはある種の卵巣腫瘍のマーカーとして有用であることが分かっている　（Ｌａｐｐｏｈｎら，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２１：７９０，　１９８９）。ＧＤＦ−９も卵巣起源の原発性および転移性新生物を確認するマーカーとして有用でありうる。同様に、ＧＤＦ−９は出生前スクリーニング法における発生異常の指示物質として役立つかもしれない。
【０００８】
ＴＧＦ−βファミリーの他のペプチドには精巣で産生されるＭＩＳがあり、これは雄性胚においてミュラー管の退行現象に関与している。ＭＩＳはヌードマウスにおいてヒト卵巣癌の増殖を抑制することが分かった　（Ｄｏｎａｈｏｅ　ら，　Ａｎｎ．　Ｓｕｒｇ．，　１９４：４７２，　１９８１）。ＧＤＦ−９も同様に機能する可能性があり、それゆえ、抗癌剤として例えば卵巣癌の治療に有効であるかもしれない。
【０００９】
ＧＤＦ−９はまた増殖促進因子としても機能することができ、それゆえにｉｎ　ｖｉｔｒｏでの種々の細胞集団の生存に有用である可能性がある。特に、ＧＤＦ−９が卵成熟において何らかの役割を果たすのであれば、ＧＤＦ−９は試験管内受精法で、例えば成功率を上げるのに有用であるかもしれない。また、ＴＧＦ−βファミリーの他の多くのメンバーは組織修復の重要な媒介物質ともなる。ＴＧＦ−βはコラーゲンの形成に対して著しい影響を及ぼすことが知られており、新生マウスでは顕著な脈管形成応答を生じさせる　（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８３：４１６７，　１９８６）。ＧＤＦ−９も同様の活性を示して、例えば外傷や火傷による組織傷害の修復に有用であるかもしれない。
【００１０】
本明細書中で用いる「実質的に純粋な」という用語は、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然界でＧＤＦ−９と結合している他の物質を実質的に含まないＧＤＦ−９を指す。当業者はタンパク質精製の標準的な技法を用いてＧＤＦ−９を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。ＧＤＦ−９ポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によって決定することができる。ＧＤＦ−９ポリペプチドは、ＧＤＦ−９の活性が残っているという条件で、該ポリペプチドの機能性フラグメントを含むものである。ＧＤＦ−９の生物学的活性を有する比較的小さいペプチドも本発明に含まれる。
【００１１】
本発明はＧＤＦ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、ＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ−９の全部または一部をコードするポリヌクレオチドはすべて、それらがＧＤＦ−９活性を有するポリペプチドをコードするのであれば、本発明に含まれることが理解されよう。こうしたポリヌクレオチドとして、天然に存在するもの、合成されたもの、そして故意に操作されたものが挙げられる。例えば、ＧＤＦ−９ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。ＧＤＦ−９のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配列も含むものである。本発明のポリヌクレオチドは遺伝暗号の結果としての縮重配列を含む。２０種類の天然アミノ酸が存在し、その大部分は１種類より多いコドンによって規定されている。かくして、すべての縮重ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列によってコードされるＧＤＦ−９ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、本発明に含まれるものである。
【００１２】
特に、本明細書中では、鎖長が１７１２塩基対で、ヌクレオチド２９のメチオニンコドンから始まるオープンリーディングフレームを含むＧＤＦ−９のｃＤＮＡ配列が開示される。コードされるポリペプチドは４４１個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析で測定して約４９．６ｋＤの分子量を有する。ＧＤＦ−９配列は、Ｎ末端の近傍に、分泌のためのシグナル配列を暗示する疎水性アミノ酸のコアを含んでいる。ＧＤＦ−９はアスパラギン残基１６３、２２９、２５８および３２５に可能なＮ−グリコシル化部位と、アミノ酸３０３−３０６に推定上の四塩基タンパク質分解プロセシング部位（ＲＲＲＲ）を含む。ＧＤＦ−９の成熟Ｃ末端フラグメントは１３５個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析で測定して非グリコシル化分子量が約１５．６ｋＤであると想定される。当業者は標準的な技法を使ってグリコシル基を修飾したり、ＧＤＦ−９タンパク質からグリコシル基を部分的にまたは完全に除いたりできるだろう。それゆえ、本発明の機能性タンパク質またはそのフラグメントとして、ＧＤＦ−９のグリコシル化種、部分的グリコシル化種および非グリコシル化種が含まれる。
【００１３】
ＧＤＦ−９と既知のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの配列同一性の程度は、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）の場合の最低２１％から骨形態形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）の場合の最高３４％までの範囲である。本明細書に詳しく開示するＧＤＦ−９はＣ末端領域のシステイン残基のパターンが既知のファミリーメンバーと相違している。ＧＤＦ−９は他のファミリーメンバーに存在している７個のシステインのうち４番目のシステインを欠いている。すなわち、この位置のシステインの代わりに、ＧＤＦ−９配列はセリン残基を含んでいる。ＧＤＦ−９はＣ末端領域のどこにも７番目のシステイン残基を含んでいない。
【００１４】
組換えＧＤＦ−９の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾は、本明細書に記載のＧＤＦ−９ポリペプチドと比べて実質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらすかもしれない。かかる修飾は部位特異的突然変異誘発によるもののように故意であっても、自然に起こるものであってもよい。これらの修飾によって得られるポリペプチドのすべては、ＧＤＦ−９の生物学的活性が依然として存在するのであれば、本発明に包含される。さらに、１個以上のアミノ酸を欠失させることも、その生物学的活性を著しく変えることなく分子構造の修飾を可能とする。これはより広い有用性を有するより小さな活性分子の開発へと導く。例えば、ＧＤＦ−９の生物学的活性にとっては必要でないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸の除去が可能である。
【００１５】
本発明のＧＤＦ−９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示した配列およびその保存的変更を含むものである。ここで用いる「保存的変更」という用語は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似した残基で置き換えることを意味する。保存的変更の例として、ある疎水性アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなど）を別の疎水性アミノ酸と置き換えること、または、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸と置き換えることが含まれ、例えば、リシンとアルギニンとの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、アスパラギンとグルタミンとの置換などを挙げることができる。また、「保存的変更」という用語は、置換ポリペプチドに対して誘起された抗体が非置換ポリペプチドと免疫反応性であるという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも包含する。
【００１６】
本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは当技術分野で公知のハイブリダイゼーション技法を使って単離し得る。これらには、１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、および２）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングが含まれるが、これらに限らない。
【００１７】
好ましくは、本発明のＧＤＦ−９ポリヌクレオチドは哺乳動物に由来するものであり、マウス、ラットまたはヒト由来のものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法は、適当なプローブが利用可能であれば、どの動物からでも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。対象のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成可能である。そのためには、短いオリゴペプチドの範囲のアミノ酸配列が既知でなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列はアミノ酸配列から推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入れる必要がある。配列が縮重をもつときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性二本鎖ＤＮＡの不均質混合物を含む。こうしたスクリーニングでは、一本鎖ＤＮＡかまたは変性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、対象のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少ない量で存在する供給源から誘導されたｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を回避するようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡとその完全な相補体である混合物中の単一プローブとのハイブリダイゼーションにより、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフ可視化を可能にすることができる（Ｗａｌｌａｃｅ　ら，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　９：８７９，　１９８１）。
【００１８】
また、ＧＤＦ−９をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）対象のポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造、および３）真核供与細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成、により得ることができる。後者の場合は、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が最終的に形成される。
【００１９】
組換え法で用いる特定のＤＮＡ配列を得るための上記の３方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離物の単離が最も一般的でない方法である。イントロンの存在ゆえに哺乳動物ポリペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合は特にそうである。
【００２０】
目的とするポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知であるときは、ＤＮＡ配列の合成がしばしば好適な方法となる。目的とするポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明であるときは、ＤＮＡ配列の直接合成が不可能で、ｃＤＮＡ配列の合成が好適な方法となる。対象のｃＤＮＡ配列を得るための標準的な方法として、高レベルの遺伝子発現を有する供与細胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写により誘導されるプラスミド−　またはファージ−　担持ｃＤＮＡライブラリーの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応の技法とともに用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると想定される配列を複写した一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを作製し、該プローブを、一本鎖形態に変性させたクローン化コピー数のｃＤＮＡに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において用いることができる　（Ｊａｙ　ら，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　１１：２３２５，　１９８３）　。
【００２１】
ラムダｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＧＤＦ−９に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＧＤＦ−９ペプチドについて間接的にスクリーニングし得る。こうした抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、ＧＤＦ−９　ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に用いられる。
【００２２】
ＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ導入によりｉｎｖｉｔｒｏで発現させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターを増幅しかつそのＤＮＡを発現し得る細胞のことである。また、この用語は被験宿主細胞のあらゆる子孫をも含むものである。すべての子孫は、複製中に突然変異を起こすことがあるから、その親細胞と同一でなくてもよいことが理解されよう。しかし、「宿主細胞」という用語を用いるときは、こうした子孫も含むものとする。安定したＤＮＡ導入（外来ＤＮＡが宿主内に連続的に維持されることを意味する）の手法は当技術分野で公知である。
【００２３】
本発明では、ＧＤＦ−９ポリヌクレオチド配列が組換え発現ベクターに挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＧＤＦ−９遺伝子配列の挿入または組込みによって操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。かかる発現ベクターは宿主内に挿入した遺伝子配列の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含むのが常である。本発明で使用するのに適したベクターとしては、バクテリア発現用のＴ７をベースとした発現ベクター　（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ら，　Ｇｅｎｅ，　５６：１２５，　１９８７）　、哺乳動物細胞発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター　（Ｌｅｅ　および　Ｎａｔｈａｎｓ，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６３：３５２１，　１９８８）　、および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターを挙げることができるが、これらに限らない。ＤＮＡセグメントはプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩ、ポリヘドリンプロモーター）のような調節要素に機能的に連結された状態でベクター中に存在する。
【００２４】
ＧＤＦ−９をコードするポリヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のいずれで発現させてもよい。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が含まれる。原核生物内で真核生物配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現・複製しうる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で知られている。本発明のＤＮＡ配列を組み込む際には、こうしたベクターが用いられる。
【００２５】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られているような慣用の技法を使って行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合は、指数増殖期の後に回収した細胞からＤＮＡ取込み能を有するコンピテント細胞を調製し、その後当技術分野で公知の手法を用いてＣａＣｌ_２　法で処理する。また、ＭｇＣｌ_２　やＲｂＣｌを用いてもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後で形質転換を行うこともできる。
【００２６】
宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような慣用の機械的方法、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターといったＤＮＡトランスフェクション法が用いられる。真核細胞はまた、本発明のＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシパピローマウイルスのような真核生物ウイルスベクターを使って真核細胞を一時的に感染させるか形質転換することにより、タンパク質を発現させる方法である（例えば、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｇｌｕｚｍａｎ編集，　１９８２を参照のこと）。
【００２７】
本発明により提供される、微生物内で発現させたポリペプチドまたはそのフラグメントの単離・精製は、分離用クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて、慣用の手段により行うことができる。
【００２８】
本発明は、ＧＤＦ−９ポリペプチドと免疫反応性の抗体またはその機能性フラグメントを含むものである。様々なエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプールから本質的に成る抗体、ならびに明確に異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当業者によく知られた方法を用いてタンパク質の抗原含有フラグメントから作られる　（Ｋｏｈｌｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５，　１９７５）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な抗体分子のほかに、ＧＤＦ−９上のエピトープ決定基と結合し得るＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２のような抗体フラグメントを包含する。
【００２９】
「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば周囲の組織と形態学的にも遺伝子型的にも相違するように見える悪性ならびに非悪性の細胞集団を表す。アンチセンス分子からなるＧＤＦ−９ポリヌクレオチドは、さまざまな器官系の悪性疾患、特に、例えば卵巣の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＧＤＦ−９発現の変化が病因的に関係している疾患はどれも、ＧＤＦ−９抑制剤による治療に感受性であると考えられる。
【００３０】
本発明は、卵巣の細胞増殖性障害を検出する方法であって、抗ＧＤＦ−９抗体をＧＤＦ−９関連障害を有する疑いがある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出することを含む方法を提供する。ＧＤＦ−９と反応性のこの抗体は、ＧＤＦ−９への結合を検出できるようにする化合物で標識される。本発明の目的のために、ＧＤＦ−９ポリペプチドに特異的な抗体を用いて生物学的流体及び組織中のＧＤＦ−９のレベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができる。この発明の好ましいサンプルは、卵巣起源の組織、特に顆粒膜細胞又は卵胞液を含有する組織である。疑いのある細胞中のＧＤＦ−９のレベルを正常細胞中のレベルと比較して、被験体がＧＤＦ−９関連細胞増殖性障害を有するかどうかを確認することができる。好ましくは、被験体はヒトである。
【００３１】
本発明の抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　又は　ｉｎ　ｖｉｖｏ　免疫診断又は免疫療法を施すのが望ましいあらゆる被験体に用いることができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイに用いるのに適しており、その際それらを液相で用いても固相キャリヤーに結合させてもよい。加えて、これらイムノアッセイにおける抗体を検出できるように種々の方法で標識することができる。本発明の抗体を用いることができるタイプのイムノアッセイの例は、直接又は間接フォーマットのいずれかの競合及び非競合イムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、フォワード、リバース、又は同時モードのいずれで行われるイムノアッセイを用いても行うことができる。当業者は、過度な実験を重ねることなく他のイムノアッセイフォーマットを認知するか、又は容易に認識できるであろう。
【００３２】
本発明の抗体は、多くの異なるキャリヤーに結合できるので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が含まれる。このキャリヤーの性質は、本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、抗体を結合させるのに適する他のキャリヤーを認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。
【００３３】
当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に用いることができるタイプの標識の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド状金属、化学発光性化合物、リン光性化合物、及び生物発光化合物が含まれる。当業者は、抗体に結合するのに適する他の標識を認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。
【００３４】
より大きな感度をもたらすこともできるもう１つの技術は、これら抗体を低分子量ハプテンにカップリングさせることからなる。次いで、第２反応によってこれらハプテンを特異的に検出することができる。例えば、特異的抗ハプテン抗体と反応するビオチン（アビジンと反応する）、ジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフルオレセインのようなハプテンを用いるのが普通である。
【００３５】
抗原の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　検出に本発明のモノクローナル抗体を用いるに際して、検出できるように標識された抗体を診断に有効な用量で投与する。「診断に有効」という用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明のポリペプチド（このポリペプチドに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有する部位の検出が可能になるのに十分な量で投与されることを意味している。
【００３６】
検出できるように標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに比較して検出可能になるのに十分な濃度であるべきである。更に、最良の標的対バックグラウンド信号比を得るために、検出できるように標識されたモノクローナル抗体が循環系から急速に浄化されることが望ましい。
【００３７】
一般に、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断のための用量は、個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであろう。かかる用量は、例えば、注射が多数回行われるかどうか、抗原負担、及び当業者に知られている他の要因に依存して変動してもよい。
【００３８】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断的画像化については、利用可能な検出装置のタイプが、所定の放射性同位元素を選択するにあたっての主因となる。選ばれる放射性同位元素は、所与のタイプの装置で検出可能なタイプの崩壊を起こさなければならない。ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断用の放射性同位元素を選択するに際して重要なもう１つ要因は、宿主に対する有害な放射線を最小限に抑えることである。理想的には、ｉｎ　ｖｉｖｏ　画像化に用いられる放射性同位元素は粒子放射を欠くが、慣用的なガンマカメラにより簡単に検出できる１４０〜２５０ｋｅＶの範囲の多数の光量子を生成するであろう。
【００３９】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断については、介在官能基を用いることにより放射性同位元素を直接又は間接にイムノグロブリンに結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば用いられる介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は、　^１１１Ｉｎ、^９７Ｒｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^８９Ｚｒ、及び　^２０１Ｔｌである。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又は電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断の目的のために常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用方法を用いることができる。通常、ガンマ及び陽電子放射性ラジオアイソトープが、ＭＲＩ用のカメラ画像化及び常磁性同位元素として用いられる。かかる技術に特に有用である元素には、　^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、　^１６２Ｄｙ、^５２Ｃｒ、及び^５６Ｆｅが含まれる。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　及び　ｉｎ　ｖｉｖｏ　で用いて被験体のＧＤＦ−９関連疾患の改善の経過を追跡することができる。かくして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減少、又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することにより、ＧＤＦ−９関連疾患の改善を狙った特定の療法が効果的であるかどうかを確認することが可能になろう。「改善」という用語は、治療を受けている被験体のＧＤＦ−９関連疾患の好ましくない作用が少なくなることを表す。
【００４２】
本発明は、正常細胞における発現に比較して変異した方法で発現され得るヌクレオチド配列を同定するものであり、従ってこの配列に向けられる適切な治療又は診断法を設計するのが可能となる。かくして、細胞増殖性障害がＧＤＦ−９の発現と関連している場合には、翻訳レベルでＧＤＦ−９発現を妨害する核酸配列を用いることができる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及びリボザイムを用いて特定のＧＤＦ−９ｍＲＮＡの翻訳を遮断するものであって、それはアンチセンス核酸でそのｍＲＮＡをマスクするか又はリボザイムでそれを開裂させるかのいずれかによりなされる。
【００４３】
アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，　２６２：４０，　１９９０）　。細胞内でアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、アンチセンス核酸はこのｍＲＮＡの翻訳を妨害することになる。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのは、それらは、より大きな分子よりも簡単に合成できかつ標的ＧＤＦ−９産生細胞内に導入したときにあまり問題を起こしそうにないからである。遺伝子の　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　翻訳を阻害するためにアンチセンス法を用いることは、当該技術分野で周知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ，　Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１７２：２８９，　１９８８）。
【００４４】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。これらＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが可能である（Ｃｈｅｎ，　Ｊ．　Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．　Ａｓｓｎ．，　２６０：３０３０，　１９８８）。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特異性であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけを不活性にする点である。
【００４５】
２つの基本的なタイプのリボザイム、即ち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３４：５８５，　１９８８）及び“ハンマーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種内に独占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、しかも１８塩基の認識配列がそれより短い認識配列よりも好ましい。
【００４６】
本発明は、ＧＤＦ−９タンパク質により媒介される細胞増殖性障害を治療するための遺伝子治療も提供する。かかる療法は、ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドをこの増殖性障害を有する細胞内に導入することによりその治療効果を奏することになる。アンチセンスＧＤＦ−９ポリヌクレオチドの運搬（デリバリー）は、キメラウイルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用いて行うことができる。
【００４７】
アンチセンス配列の治療的デリバリーに特に好ましいのは、標的設定（ターゲティング）されたリポソームを用いることである。
【００４８】
ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア又は、好ましくは、レトロウイルスの如きＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又は鳥類のレトロウイルスの誘導体である。単一の異種遺伝子を挿入することができるレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ　（Ｈａｒｖｅｙ）　マウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み込むことができる。導入細胞が同定されて世代形成できるように、これら全てのベクターは、選択マーカー用の遺伝子を移入するか又は取り込むことができる。興味の対象であるＧＤＦ−９配列を、例えば、特定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする別の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することにより、そのベクターはその時点で標的特異性となる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異性にしてもよい。好ましい標的設定（ターゲティング）は、抗体を用いることにより行われる。当業者は、過度な実験を重ねることなく、ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異性デリバリーを可能にするためにレトロウイルスゲノム内に挿入できる特定のポリヌクレオチド配列を認知するか、又は容易に探知できるであろう。
【００４９】
組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性ベクター粒子を生成させるためにはそれらは助けを必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全ての構造遺伝子をそのＬＴＲ内の調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることにより提供することができる。これらプラスミドには、そのパッケージング機構がキャプシデーション（包膜）のためにＲＮＡ転写産物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列が存在しない。このパッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が含まれるが、これらに限定されない。これら細胞系は、ゲノムがパッケージされていないので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象である他の遺伝子により置換されている細胞内にレトロウイルスベクターを導入した場合には、そのベクターはパッケージされてベクタービリオンを産生することができる。
【００５０】
また、ＮＩＨ　３Ｔ３又は他の組織培養細胞は、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードするプラスミドで慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションにより直接トランスフェクトすることができる。次いで、これら細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られる細胞は、培地中にそのレトロウイルスベクターを放出する。
【００５１】
ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つの標的デリバリーシステムは、コロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、及び、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。この発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　及び　ｉｎ　ｖｉｖｏ　での運搬体として有用である人工膜小胞である。サイズが０．２〜４．０μｍの大きな単ラメラ小胞（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ，　ＬＵＶ）が巨大分子を含有する相当なパーセンテージの水性緩衝液を封入できることが分かった。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性形態で細胞へ運搬することができる（Ｆｒａｌｅｙら，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．，　６：７７，　１９８１）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、及び細菌細胞へのポリヌクレオチドの運搬に用いられてきた。リポソームが効率のよい遺伝子導入運搬体であるためには、次の特徴が示されるべきである：（１）　対象となる遺伝子を高い効率で封入するがそれらの生物活性を弱めないこと；（２）　非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること；（３）　標的細胞の細胞質へ該小胞の水性内容物を高い効率で運搬すること；及び　（４）　遺伝子情報を正確かつ効率的に発現すること（Ｍａｎｎｉｎｏ　ら，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　６：６８２，　１９８８）。
【００５２】
リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質とステロイド、特にコレステロールとを組み合わせたものである。他のリン脂質又は他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
【００５３】
リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスファチジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含有し飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００５４】
リポソームの標的設定（ターゲティング）は、解剖学的及び機械学的要因に基づいて分類される。解剖学的分類は、選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｓｙｓｔｅｍ，　ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を利用するものである。一方、能動的標的設定は、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより又はリポソームの組成若しくはサイズを変えることによりリポソームを改変して、天然に存在する局在部位以外の器官及び細胞型に標的設定することを包含する。
【００５５】
標的デリバリーシステムの表面をいろいろな方法で修飾することができる。リポソーム標的デリバリーシステムの場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取り込ませて、標的指向性リガンドをリポソーム二重層との安定な結合状態で維持するようにできる。脂質鎖を標的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用いることができる。
【００５６】
生殖路内でのＧＤＦ−９の発現のために、避妊、受精能及び妊娠に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体を用いる種々の応用がある。ＧＤＦ−９は月経周期の調節にある役割を果たすであろうから、種々の避妊法に有用であろう。
【００５７】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定を意図するものではない。それらは用いられるかも知れない実例を代表しているが、当業者にとって既知の他の手法を代わりに用いてもよい。
実施例１
新規なＴＧＦ− βファミリーメンバーの同定と単離
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新しいメンバーを同定するため、既知のファミリーメンバーにおける２つの保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。１つの領域は２つのトリプトファン残基の間にわたり、ＭＩＳ　を除いて全てのファミリーメンバーに保存されているものであり、もう１つの領域はＣ−末端に近い不変システイン残基の間にわたるものである。これらのプライマーをマウスゲノムＤＮＡ　上でのポリメラーゼ連鎖反応に使用し、その後プライマーの５’末端に配置された制限部位を利用してＰＣＲ　生成物をサブクローン化し、これらのサブクローン化された挿入物を含む大腸菌の個々のコロニーを採集し、そしてランダムな配列決定とハイブリダイゼーション分析を組み合わせて使用して、前記スーパーファミリーの公知のメンバーを除外した。
【００５８】
ＧＤＦ−９　は、プライマー：
ＳＪＬ１６０　（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＩＴＧＧ（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ａ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ｃ／Ａ）Ａ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）ＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＴＩ（Ａ／Ｇ）ＴＩ（Ｔ／Ｇ）ＣＩＣＣ−３’）　　（配列番号１）　及び　ＳＪＬ１５３　（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣ（Ａ／Ｇ）ＣＡＩ（Ｇ／Ｃ）Ｃ（Ａ／Ｇ）ＣＡＩＣ（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）（Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＩＧ（Ｔ／Ｃ）Ｉ（Ｇ／Ａ）（Ｔ／Ｃ）ＣＡＴ−３’）　　（配列番号２）
により得たＰＣＲ　生成物の混合物から同定した。これらのプライマーを使用したＰＣＲ　は、２　μｇ　マウスゲノムＤＮＡ　を使用して９４℃で１分間、５０℃で　２分間、７２℃で２分間、４０サイクル行った。
【００５９】
約２８０　ｂｐのＰＣＲ　生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩ　により消化し、再度ゲル精製し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡ）　中にサブクローン化した。個々のサブクローンを含む細菌コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートに採集し、ニトロセルロース上に細胞をプレーティングすることにより複数のレプリカを調製した。複写したフィルターを、ファミリーの公知のメンバーを示すプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしないコロニーから配列分析のためのＤＮＡ　を調製した。
【００６０】
ＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１５３のプライマーの組合せは、分析した１４５　のサブクローンから３種の公知の配列（インヒビンβＢ　、ＢＭＰ−２　及びＢＭＰ−４）及び１種の新規な配列（ＧＤＦ−９　と指称する）　を与えた。
【００６１】
ＲＮＡ　単離とノーザン分析は以前に記載されているように行った（Ｌｅｅ，　Ｓ．Ｊ．，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　４：１０３４，　１９９０）　。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより与えられた指示書に従い、卵巣からポリＡ　選択したＲＮＡ　２．５−３　μｇ　から、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰ　ＩＩベクター中に調製した。卵巣ライブラリーはスクリーニングの前に増幅しなかった。フィルターを前記したようにハイブリダイズさせた（Ｌｅｅ，　Ｓ．Ｊ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　８８：４２５０−４２５４，　１９９１）。ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４：５４６３−５４６７，　１９７７）及びＳ１ヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ　の組合せによる方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｓ．，　Ｇｅｎｅ，　２８：３５１−３５９，　１９８４）及び合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、両鎖のＤＮＡ　配列決定を行った。
実施例２
ＧＤＦ−９　の発現パターン及び配列
ＧＤＦ−９　の発現パターンを調べるため、種々の成体組織から調製したＲＮＡ　試料をノーザン分析によりスクリーニングした。各組織から調製した、２回ポリＡ選択したＲＮＡ　の５　μｇ　をホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ、ブロットし、ＧＤＦ−９　により釣り上げた。図１に示すように、ＧＤＦ−９　プローブは、卵巣のみで発現された１．７　ｋｂのｍＲＮＡを検出した。
【００６２】
１．５　×　１０^６組換えファージのマウス卵巣ｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰ　ＩＩ中に構築し、ＧＤＦ−９　ＰＣＲ　生成物から得たプローブを使用してスクリーニングした。１９のハイブリダイズする最も長いクローンのヌクレオチド配列を図２に示す。共通のＮ−グリコシレーションシグナルを無地のボックスにより示す。推定上の４塩基プロセシング部位を点描ボックスにより示す。推定上の開始ＡＴＧ　の上流の読み枠内終結コドン及び共通のポリアデニレーションシグナルに下線を付した。ポリＡ　尾部は示していない。数字は５’末端からみたヌクレオチドの位置を示す。この１７１２　ｂｐ　配列は、ヌクレオチド２９のメチオニンコドンから始まり、４９．６　ｋＤ　の分子量を有する４４１　アミノ酸長のタンパク質をコードし得る長いオープンリーディングフレームを含んでいる。他のＴＧＦ−βファミリーメンバーと同様に、ＧＤＦ−９　配列はＮ−末端に近い疎水性アミノ酸のコアを含み、これは分泌のためのシグナル配列を示唆するものである。ＧＤＦ−９　はまたアスパラギン残基１６３　、２２９　、２５８　及び３２５　における４つの可能性のあるＮ−グリコシレーション部位並びにアミノ酸３０３−３０６　における推定の４塩基タンパク質分解プロセシング部位（ＲＲＲＲ）を含む。ＧＤＦ−９　の成熟Ｃ−末端フラグメントは、１３５　アミノ酸長で非グリコシル化分子量が１５．６　ｋＤ　と予測される。
【００６３】
ＧＤＦ−９　のＣ−末端領域は他のファミリーメンバーに対して明らかに相同性を示すが、ＧＤＦ−９　の配列は他のファミリーメンバーのものから有意に異なっている（図３及び４）。図３は、ＧＤＦ−９　のＣ−末端配列と、ヒトＧＤＦ−１　（Ｌｅｅ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８８：４２５０−４２５４，　１９９１）　、ツメガエル　Ｖｇ−１　（Ｗｅｅｋｓ　　ら，　Ｃｅｌｌ，　５１：８６１−８６７，　１９８７）　、ヒトＶｇｒ−１　（Ｃｅｌｅｓｔｅ　　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　　８７：９８４３−９８４７，　１９９０）、ヒトＯＰ−１　（Ｏｚｋａｙｎａｋ　　ら，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　９：２０８５−２０９３，　１９９０）　、ヒト　ＢＭＰ−５　（Ｃｅｌｅｓｔｅ　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７：９８４３−９８４７，　１９９０）　、ショウジョウバエ６０Ａ　（Ｗｈａｒｔｏｎ　　ら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８８：９２１４−９２１８，　１９９１）　、ヒトＢＭＰ−２　及び４　（Ｗｏｚｎｅｙ　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４２：　１５２８−１５３４，　１９８８）、ショウジョウバエ　ＤＰＰ　（Ｐａｄｇｅｔｔ　ら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３２５：８１−８４，　１９８７）、ヒト　ＢＭＰ−３　（Ｗｏｚｎｅｙ　　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４２：１５２８−１５３４，　１９８８）　、ヒトＭＩＳ　（Ｃａｔｅ　ら，　Ｃｅｌｌ，　４５：６８５−６９８，　１９８６），ヒトインヒビンα、βＡ　、及びβＢ　（Ｍａｓｏｎ　　ら，　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１３５：９５７−９６４，　１９８６）、ヒトＴＧＦ−β１　（Ｄｅｒｙｎｃｋら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３１６：７０１−７０５，　１９８５）、ヒトＴＧＦ−β２　（ｄｅＭａｒｔｉｎ　ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，　６：３６７３−３６７７，　１９８７）　、ヒトＴＧＦ−β３　（ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ　　ら，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５：４７１５−４７１９，　１９８８）　、ニワトリＴＧＦ−β４　（Ｊａｋｏｗｌｅｗ　ら，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　２：１１８６−１１９５，　１９８８）、並びにツメガエルＴＧＦ−β５　（Ｋｏｎｄａｉａｈ　ら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６５：１０８９−１０９３，　１９９０）の対応する領域との並列化を示す。保存システイン残基には影を付した。ダッシュは並列化を最大限とするために入れたギャップである。
【００６４】
図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー中の異なるメンバーの間のアミノ酸の相同性を示す。数字は、第１の保存システインからＣ−末端まで計算した各対の間のアミノ酸の同一性のパーセントを表す。ボックスは、特定のサブグループ内の高度に関連したメンバーにおける相同性を示す。
【００６５】
公知のファミリーメンバーとの配列同一性の程度は、最小のＭＩＳ　との２１％　から最大のＢＭＰ−４　との３４％　までの範囲である。従って、ＧＤＦ−９　はこのスーパーファミリーの他のメンバーからの配列相違の程度においてＭＩＳ　に匹敵する。さらにＧＤＦ−９　は分子のプロ領域において他のファミリーメンバーに対して有意な配列相同性を示さない。ＧＤＦ−９　はまた、Ｃ−末端領域におけるシステイン残基のパターンにおいても公知のファミリーメンバーと異なっている。ＧＤＦ−９　は他の全てのファミリーメンバーに存在する７つのシステインの４番目のシステインを欠いており、この位置のシステインの代わりにＧＤＦ−９　配列はセリン残基を含んでいる。さらに、ＧＤＦ−９　はＣ−末端領域の他のどこにも７番目のシステインを含んでいない。
実施例３
透明帯におけるＧＤＦ−９　の免疫化学的位置決定
ＧＤＦ−９　ｍＲＮＡが翻訳されたかどうかを調べるために、成体卵巣の切片を組換えＧＤＦ−９　タンパク質に対する抗体とインキュベートした。ＧＤＦ−９　に対する抗体を生成するためには、アミノ酸３０〜２９５（前領域）　またはアミノ酸３０８　〜４４１（成熟領域）　にわたるＧＤＦ−９　ｃＤＮＡの部分を、Ｔ７をベースとするｐＥＴ３発現ベクター（Ｆ．Ｗ．　Ｓｔｕｄｉｅｒ，　Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　により提供された）　中にクローン化し、得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）　細菌株中に形質転換した。イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトシド誘発細胞からの全細胞抽出物を、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、ＧＤＦ−９　タンパク質フラグメントを切り出し、フロイントアジュバントと混合し、当業者に公知の標準的方法によりウサギを免疫するのに使用した。全ての免疫化はＳｐｒｉｎｇ　Ｖａｌｌｅｙ　Ｌａｂ　（Ｓｙｋｅｓｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）により行われた。これらのウサギの血清中のＧＤＦ−９−反応性抗体の存在は、細菌により発現されたタンパク質フラグメントのウェスタン分析により調べた。得られた血清は、ウェスタン分析により細菌により発現されたタンパク質と反応することが示された。
【００６６】
免疫組織化学的研究のため、成体マウスから卵巣を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に埋包し、切片とした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキットを使用してＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより与えられた指示書に従い抗体結合の部位を検出した。図５は、ＧＤＦ−９　タンパク質の免疫組織化学的位置決定を示す。成体卵巣の隣接する切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色するか　（図５ａ）　、希釈率１：５００　の免疫血清　（図５ｂ）　または前免疫血清　（図５ｃ）　とともにインキュベートした。図５ｂに示されるように、抗血清は卵母細胞においてのみタンパク質を検出した。前免疫血清を使用すると染色は見られなかった　（図５ｃ）　。従って、ＧＤＦ−９　は卵母細胞によりｉｎ　ｖｉｖｏ　において翻訳されるものと思われる。
実施例４
ヒトＧＤＦ−９　の単離
ヒトＧＤＦ−９　をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、成人ヒト卵巣から調製した、ポリＡ　で選択したＲＮＡ　を使用してλＺＡＰＩＩ中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。実施例１のように標準的なスクリーニング法を使用し、そしてマウスＧＤＦ−９　クローンをプローブとして使用して、このライブラリーから完全なヒトＧＤＦ−９　コード配列を含むｃＤＮＡクローンを同定した。マウスの予測されたアミノ酸配列　（最上段）　及びヒト　（下段）　ＧＤＦ−９　配列の比較を図６に示す。数字はＮ−末端に対するアミノ酸位置を示す。垂直な線は配列の同一性を示す。ドットは並列を最大限とするために導入したギャップを示す。何も付していないボックスは予測タンパク質分解プロセシング部位を示す。影を付したボックスはタンパク質の成熟領域中のシステイン残基を示す。下部の線は、ＧＤＦ−９　の前領域　（なにも付していない）　及び成熟領域　（影を付した）　の概略を示し、下にマウス及びヒト配列の間の配列同一性パーセントを示す。
【００６７】
マウスＧＤＦ−９　と同様に、ヒトＧＤＦ−９　は疎水性リーダー配列、推定ＲＸＸＲタンパク質分解切断部位、及び他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーの前記の顕著な特徴を含むＣ−末端を含む。マウス及びヒトＧＤＦ−９　は分子のプロ領域において６４％　同一であり、予測される分子の成熟領域において９０％　同一である。この２つの配列の相同性の高い程度は、ヒトＧＤＦ−９　が胎児発生及び／または成人卵巣において重要な役割を果たしていることを示唆するものである。
実施例５
卵母細胞におけるＧＤＦ−９　の発現の核酸検出
卵巣におけるＧＤＦ−９　の発現の位置を決定するために、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブを使用してマウス卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを行った。図７は、ＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブを使用した、成体卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。［^３５Ｓ］−標識アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ（図７ａ及び７ｃ）　またはセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ　（図７ｂ及び７ｄ）　を、４％パラホルムアルデヒド中に固定した卵巣の隣接するパラフィン埋包切片にハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤に浸し、露出し、現像し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。２種の代表的な領域を示す。
【００６８】
図７ａ及び７ｃに示すように、ＧＤＦ−９　ｍＲＮＡは主として成体卵巣の卵母細胞中に検出された。調べた全ての卵母細胞は　（卵胞発生の段階にかかわらず）　ＧＤＦ−９　発現を示し、その他の細胞種では発現は検出されなかった。対照のＧＤＦ−９　センスＲＮＡ　プローブを使用した場合、ハイブリダイゼーションは見られなかった　（図７ｂ及び７ｄ）。従って、ＧＤＦ−９　発現は、成体卵巣中の卵母細胞に特異的なもののようである。
【００６９】
卵巣発生の間のＧＤＦ−９　ｍＲＮＡの発現のパターンを調べるために、新生児卵巣の切片をＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブで釣り上げた。図８は、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブを使用した、出生後第４日の卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視野（図８ａ）　及び暗視野　（図８ｂ）　照明下において切片の写真をとった。
【００７０】
図９は、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ（図９ａ）　またはセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ（図９ｂ）　を使用した、出生後第８日の卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。
【００７１】
ＧＤＦ−９　ｍＲＮＡ発現は最初、卵胞発生の開始において検出された。これは出生第４日において最も明確に明らかとなり、この場合卵胞に存在する卵母細胞のみがＧＤＦ−９　発現を示し　（図８）、顆粒膜細胞に囲まれていない卵母細胞においては発現は見られなかった。出生後第８日までに、全ての卵母細胞は卵胞発生を経たようであり、全ての卵母細胞はＧＤＦ−９　発現を示した　（図９）。
【００７２】
排卵の後にもＧＤＦ−９　が発現されたかどうかを調べるために、マウス輸卵管をｉｎｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションにより調べた。図１０は、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ（図１０ａ）またはセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブ（図１０ｂ）を使用した、成体輸卵管切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。
【００７３】
図１１は、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡ　プローブを使用した、成体輸卵管　（受精後０．５　日）　切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視野（図１１ａ）及び暗視野　（図１１ｂ）照明下において切片の写真をとった。
【００７４】
図１０に示されるように、ＧＤＦ−９　は輸卵管に放出された卵母細胞により発現された。しかし、ＧＤＦ−９　ｍＲＮＡの発現は、卵母細胞の受精の後に受精後０．５　日までに急速に消失し、いくつかの胚　（例えば図１１に示したようなもの）　のみがＧＤＦ−９　ｍＲＮＡを発現し、１．５　日までに全ての胚はＧＤＦ−９　発現について陰性であった。
【００７５】
本発明を現時点で好ましい態様を引用して説明したが、本発明の概念を逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
配列の要約
配列番号１は、ＧＤＦ−９　のプライマー、ＳＪＬ　１６０　についてのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ＧＤＦ−９　のプライマー、ＳＪＬ　１５３　についてのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ＧＤＦ−９　についてのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列である（図２）。
配列番号４は、ＧＤＦ−９　についての推定アミノ酸配列である（図２）。
配列番号５は、ＧＤＦ−３　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号６は、ＧＤＦ−９　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号７は、ＧＤＦ−１　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号８は、Ｖｇ−１のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号９は、Ｖｇｒ−１　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１０は、ＯＰ−１のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
【００７６】
配列番号１１は、ＢＭＰ−５　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１２は、６０Ａ　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１３は、ＢＭＰ−２　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１４は、ＢＭＰ−４　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１５は、ＤＰＰ　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１６は、ＢＭＰ−３　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１７は、ＭＩＳ　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１８は、インヒビン−αのＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号１９は、インヒビン−βＡ　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２０は、インヒビン−βＢ　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
【００７７】
配列番号２１は、ＴＧＦ−β１　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２２は、ＴＧＦ−β２　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２３は、ＴＧＦ−β３　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２４は、ＴＧＦ−β４　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２５は、ＴＧＦ−β５　のＣ−末端のアミノ酸配列である（図３）。
配列番号２６は、ヒトＧＤＦ−９　のアミノ酸配列である（図６）。
【００７８】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）
直接の起源
クローン：ＳＪＬ１６０
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．３５
他の情報：Ｂ　が存在する場合、Ｂ　＝イノシン
配列

配列番号：２
配列の長さ：３３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）
直接の起源
クローン：ＳＪＬ１５３
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．３３
配列

配列番号：３
配列の長さ：１７１２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）
直接の起源
クローン：ＧＤＦ−９
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２９．．１３５１
配列

配列番号：４
配列の長さ：４４１　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：５
配列の長さ：１１７　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＧＤＦ−３
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１７
配列

配列番号：６
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＧＤＦ−９
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：７
配列の長さ：１２２　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＧＤＦ−１
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１２２
配列

配列番号：８
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：Ｖｇ−１
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：９
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：Ｖｇｒ−１
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：１０
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＯＰ−１
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：１１
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＢＭＰ−５
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：１２
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：６０Ａ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：１３
配列の長さ：１１７　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＢＭＰ−２
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１７
配列

配列番号：１４
配列の長さ：１１７　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＢＭＰ−４
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１７
配列

配列番号：１５
配列の長さ：１１８　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＤＰＰ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１８
配列

配列番号：１６
配列の長さ：１１９　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＢＭＰ−３
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１９
配列

配列番号：１７
配列の長さ：１１５　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＭＩＳ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１５
配列

配列番号：１８
配列の長さ：１２１　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：Ｉｎｈｉｂｉｎ　α
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１２１
配列

配列番号：１９
配列の長さ：１２１　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：Ｉｎｈｉｂｉｎ　βＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１２１
配列

配列番号：２０
配列の長さ：１２０　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：Ｉｎｈｉｂｉｎ　βＢ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１２０
配列

配列番号：２１
配列の長さ：１１４　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＴＧＦ−β１
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１４
配列

配列番号：２２
配列の長さ：１１４　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＴＧＦ−β２
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１４
配列

配列番号：２３
配列の長さ：１１４　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＴＧＦ−β３
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１４
配列

配列番号：２４
配列の長さ：１１６　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＴＧＦ−β４
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１６
配列

配列番号：２５
配列の長さ：１１４　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ＴＧＦ−β５
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．１１４
配列

配列番号：２６
配列の長さ：４５４　アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
直接の起源
クローン：ヒト　ＧＤＦ−９
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１．．４５４
配列

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、成体組織におけるＧＤＦ−９　ｍＲＮＡの発現を示す。
【図２】図２は、マウスＧＤＦ−９のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。共通のＮ−グリコシル化シグナルを無地のボックスで示す。推定上の四塩基プロセシング部位を点刻ボックスで示す。推定上の開始ＡＴＧの上流にある同じ読み枠の終止コドンおよび共通のポリアデニレーションシグナルには下線が引いてある。ポリＡ尾部は示してない。数字は５’末端からのヌクレオチド位置を示す。
【図３】図３は、ＧＤＦ−９のＣ末端配列とＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーとの並列化を示す。保存されたシステイン残基には陰影が付けてある。ダッシュ（−）は並列化を最大とするために導入されたギャップを表す。
【図４】図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの各メンバー間のアミノ酸相同を示す。数字は最初の保存システインからＣ末端までで計算された各対間のアミノ酸同一性のパーセントを表す。ボックスは特定サブグループ内の密接に関連したメンバー間の相同性を表す。
【図５】図５は、ＧＤＦ−９タンパク質の免疫組織化学的局在化を示す。成体卵巣の隣接切片をヘマトキシリンとエオシンで染色する（図５ａ）か、あるいは１：５００の希釈率で免疫血清（図５ｂ）または前免疫血清（図５ｃ）とともにインキュベートした。マウスＧＤＦ−９のＣ末端部分（残基３０８−４４１）をバクテリア内で発現させ、分離用ＳＤＳゲルからＧＤＦ−９タンパク質を切り出し、そしてウサギを免疫することにより抗ＧＤＦ−９抗血清を調製した。抗体結合部位はＶｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣ　キット　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ）を使って可視化した。
【図６】図６は、マウスＧＤＦ−９（上のライン）とヒトＧＤＦ−９（下のライン）の推定アミノ酸配列の比較を示す。数字はＮ末端からのアミノ酸位置を表す。垂線は配列同一性を表す。点は並列化を最大とするために導入されたギャップを表す。無地のボックスは推定上のタンパク質分解プロセシング部位を示す。陰影を付けたボックスはこのタンパク質の成熟領域にあるシステイン残基を示す。下部の棒線はＧＤＦ−９のプレ（無地）および成熟（陰影）領域の略図を示し、マウス配列とヒト配列間の配列同一性のパーセントを示してある。
【図７】図７は、ＧＤＦ−９　ＲＮＡプローブを用いた成体卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。４％パラホルムアルデヒドで固定した卵巣のパラフィン包埋した隣接切片に〔^３５Ｓ〕標識したアンチセンス（図７ａおよび７ｃ）またはセンス（図７ｂおよび７ｄ）ＧＤＦ−９　ＲＮＡプローブをハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤中に浸し、露光し、現像した後にヘマトキシリンとエオシンで染色した。２つの代表的な視野像を示してある。
【図８】図８は、アンチセンスＧＤＦ−９　ＲＮＡプローブを用いた生後４日目の卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野（図８ａ）または暗視野（図８ｂ）照明の下で切片の写真を撮った。
【図９】図９は、アンチセンス（図９ａ）またはセンス（図９ｂ）ＧＤＦ−９　ＲＮＡプローブを用いた生後８日目の卵巣切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。
【図１０】図１０は、アンチセンス（図１０ａ）またはセンス（図１０ｂ）ＧＤＦ−９　ＲＮＡプローブを用いた成体輸卵管切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。
【図１１】図１１は、アンチセンスＧＤＦ−９　　ＲＮＡプローブを用いた成体輸卵管（受精後０．５日）切片に対するｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野（図１１ａ）または暗視野（図１１ｂ）照明の下で切片の写真を撮った。

Claims

ＧＤＦ−９活性を抑制する薬剤を含有する、卵巣の細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物。
前記薬剤が抗ＧＤＦ−９抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記薬剤がＧＤＦ−９アンチセンス配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
卵巣の細胞増殖性疾患が卵巣の腫瘍である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記薬剤がベクターを使って細胞に導入されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ベクターがコロイド分散系である、請求項５に記載の医薬組成物。
コロイド分散系がリポソームである、請求項６に記載の医薬組成物。
リポソームが本質的にターゲット特異的である、請求項７に記載の医薬組成物。
ベクターがウイルスである、請求項５に記載の医薬組成物。
ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項９に記載の医薬組成物。
ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項１０に記載の医薬組成物。
レトロウイルスが本質的にターゲット特異的である、請求項１１に記載の医薬組成物。
下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる単離された増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）ポリペプチドに、特異的に反応する抗体を含む、避妊用の医薬組成物。
（ａ）　配列番号４もしくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列
（ｂ）　配列番号４もしくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列のＧＤＦ−９前領域に対して少なくとも６４％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＧＤＦ−９前領域、および配列番号４もしくは配列番号２６で示されるアミノ酸配列のＧＤＦ−９成熟Ｃ末端領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＧＤＦ−９成熟Ｃ末端領域を含む、アミノ酸配列