JP2002510055A

JP2002510055A - 成長分化因子９のアッセイ

Info

Publication number: JP2002510055A
Application number: JP2000541529A
Authority: JP
Inventors: マツック，マーティン，エム．; エルビン，ジュリア，エイ．; ワン，ペイ
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-04-01
Publication date: 2002-04-02
Also published as: AU3377799A; MXPA00009653A; WO1999050672A1; NZ507484A; AU753793B2; CA2325019A1; EP1066528A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＧＤＦ−９の活性を変える（阻害する、増強する）薬剤の同定方法に関する。該方法は、ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤＦ−９の結合により遺伝子の発現が調節される遺伝子を有する細胞、ＧＤＦ−９；および評価対象の薬剤を合せる工程を含む。調製された合せ物は細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に維持される。次いで、細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度を測定する。その際、評価対象の薬剤の存在下、その非存在下におけるよりも、より低い程度またはより高い程度のレセプターへのＧＤＦ−９の結合がＧＤＦ−９活性を変える薬剤を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本願は、１９９８年４月１日に出願された仮出願番号第６０／０８０，３８５
号に対し優先権を主張するものである。その全教示は参照により本明細書に組み
込まれる。

【０００２】政府援助本発明は、ＮＩＨグラント（ＮＩＣＨＤ）ＲＯ１ＨＤ３３４３８、ＧＭ−０
７３３０およびＧＭ−０８３０７により、全部または一部が援助された。政府は
本発明において特定の権利を有する。

【０００３】発明の背景卵母細胞は哺乳動物の卵巣内での卵胞形成の調節において肝要な役割を果たし
ている。特に、卵母細胞は顆粒膜細胞に作用し、周産期的に卵胞形成を調節し、
顆粒膜細胞増殖を刺激し、顆粒膜細胞遺伝子発現を調節し、ならびにステロイド
合成に影響を与えることが示されている〔（Eppig,J.J.,Dev.Biol.,5:51-59(199
4)に概説されている〕。排卵前の卵胞における顆粒膜細胞は、卵母細胞に対する
それらの近接に関して２つの集団に分けられ得る；卵丘顆粒膜細胞（ｃｕｍｕｌ
ｕｓｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌ）は密に卵母細胞を取り囲んでおり、一方
、壁在性顆粒膜細胞（ｍｕｒａｌｇｒａｎｕｌｏｓａｃｅｌｌ）は卵胞腔に
より卵母細胞から分離された卵胞の周囲の回りに位置している。卵丘細胞（ｃｕ
ｍｕｌｕｓｃｅｌｌ）は卵丘拡張（ｃｕｍｕｌｕｓｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の
際にヒアルロン酸−リッチマトリックスを分泌し、また、排卵の際に卵母細胞と
共に排出される。この拡張マトリックス（ｅｘｐａｎｄｅｄｍａｔｒｉｘ）は
生殖保全（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に重要な因子であ
る。というのは、該マトリックスは卵母細胞および共に卵丘細胞を結合し、卵胞
排出（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）および卵管采補足（ｏｖｉ
ｄｕｃｔａｌｆｉｍｂｒｉａｃａｐｔｕｒｅ）を促進し、精子貫入および受
精を可能にするからである〔Salustri,A.,et al.,Zygote,4:313-315(1996)〕。一方、壁在性顆粒膜細胞は排卵における卵胞破裂に重要なプロテアーゼを合成し
、卵丘細胞−卵母細胞複合体が放出された後卵巣内に止まり、結局、最終の分化
を受けて、黄体を形成する。顆粒膜細胞集団におけるこれらの位置および機能の
違いは、卵母細胞により分泌される因子の勾配が遺伝子発現および結果として起
こる細胞分化を調節することを示唆する。インビトロでの研究では、卵母細胞に
より分泌される成長因子は、ヒアルロン酸、ウロキナーゼプラスミノーゲンアク
チベーター（ｕＰＡ）およびＬＨレセプターの顆粒膜細胞合成ならびにステロイ
ド合成および黄体形成を調節することを示す〔Salustri,A.,et al.,Zygote 4:31
3-315(1996);Vanderhyden,B.C.,et al.,Endocrinology,133:423-426(1993);Eppi
g,J.J.,et al.,Biol.Reprod.,56:976-984(1997);Eppig,J.J.,et al.,Human Repr
od.,12:127-132(1997);Nekola,M.V.およびNalbandov,A.V.,Biol.Reprod.,4:154-
160(1971);El-Fouly,M.A.,et al.,Endocrinology,87:288-293(1970)〕。しかしながら、これらの体細胞機能を調節する卵母細胞由来因子の性状についてはほと
んど知られていないままである。

【０００４】マウス成長分化因子（ｇｒｏｗｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａ
ｃｔｏｒ）９（ｍＧＤＦ−９）は卵巣で、特に卵母細胞で発現される（ＰＣＴ国
際公開第９４／１５９６６号パンフレット）。ＧＤＦ−９ノックアウトマウスは
、卵胞形成の初期のブロック（ｂｌｏｃｋ）により雌性不妊を示した〔Dong et
al.,Nature,383:531-535(1996)〕。しかしながら、ＧＤＦ−９レセプターおよび
ＧＤＦ−９レセプターを発現する細胞型は同定されていない。ＧＤＦ−９レセプ
ターを発現する細胞型の発見は生殖能力におけるＧＤＦ−９の役割を明らかにす
る際の助けとなるであろう。また、ＧＤＦ−９活性を標的とする薬剤を同定する
ためのアッセイシステムを提供するであろう。

【０００５】発明の概要本明細書には、ＧＤＦ−９は哺乳動物の卵巣に見出される顆粒膜細胞に結合す
るという発見に基づく、成長分化因子９（ＧＤＦ−９）のインビトロアッセイを
記載する。また、本明細書に記載のように、特定タンパク質の発現は顆粒膜細胞
上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に増強および／または阻害される。

【０００６】本発明は、ＧＤＦ−９の活性を変える（調節する）薬剤の同定方法に関する。
本明細書に使用される用語「変える（ａｌｔｅｒ）」は、一部のおよび／または
完全な、活性の阻害（活性の減少）または活性の増強（活性の増加）をいう。本
方法は、ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤＦ−９の結合により発
現が調節される遺伝子（１つまたはそれ以上）〔たとえば、ヒアルロナンシンタ
ーゼ、ステロイド産生早期調節タンパク質（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃａｃ
ｕｔｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳｔＡＲ）、黄体形成ホル
モン（ＬＨ）レセプター、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、ウロキナー
ゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、キットリガンド、アクチビン／
インヒビンβＢおよびフォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）〕を有する細
胞（たとえば、顆粒膜細胞）；ＧＤＦ−９；および評価対象の薬剤を合せる工程
（試験サンプル）を含む。試験サンプルにおいて調製された合せ物を細胞上のレ
セプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に維持する。遺伝子の発現が生ず
る程度を次いで測定する。その際、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプター
へのＧＤＦ−９の結合の際の遺伝子の発現の変化は、該薬剤がＧＤＦ−９活性を
変えることを示す。本方法はさらに対照工程を含み得る。その際、薬剤の存在下
において生ずる結合の程度を薬剤の非存在下において生ずる結合の程度と比較す
る。たとえば、試験サンプルにおいて生ずる遺伝子の発現の程度を対照サンプル
（たとえば、ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤＦ−９の結合によ
り発現が調節される遺伝子を有する細胞とＧＤＦ−９を含む合せ物）において生
ずる遺伝子の発現の程度と比較する。

【０００７】本発明はまた、ＧＤＦ−９活性のインヒビターである薬剤の同定方法に関する
。１つの態様において、顆粒膜細胞；ＧＤＦ−９；と評価対象の薬剤を合せる。
調製された合せ物を顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条
件下に維持する；そして、顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
に生ずるレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度
を測定する。評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合
の際の遺伝子の発現の阻害は、該薬剤がＧＤＦ−９活性を阻害することを示す。
他の１つの態様において、顆粒膜細胞；ＧＤＦ−９；と評価対象の薬剤を合せる
。調製された合せ物を顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する
条件下に維持する；そして、顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の
際に生ずるレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子であるｕＰ
Ａの発現の程度を測定する。評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧ
ＤＦ−９の結合の際のｕＰＡ遺伝子の発現の増加は、該薬剤がＧＤＦ−９活性を
阻害することを示す。

【０００８】本発明はまた、ＧＤＦ−９活性のエンハンサーである薬剤の同定方法に関する
。１つの態様において、顆粒膜細胞；ＧＤＦ−９；と評価対象の薬剤を合せる。
調製された合せ物を顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条
件下に維持し、顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレ
セプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する
。評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際の遺伝
子の発現の増強は、ＧＤＦ−９活性のエンハンサーである薬剤を示す。他の１つ
の態様において、顆粒膜細胞；ＧＤＦ−９；と評価対象の薬剤を合せる。調製さ
れた合せ物を顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に
維持する；そして、顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ず
るレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節されるｕＰＡ遺伝子の発現の程度
を測定する。評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合
の際のｕＰＡ遺伝子の発現の減少は、該薬剤がＧＤＦ−９活性を増強することを
示す。

【０００９】本発明の方法はまた、哺乳動物（たとえば、ヒト）において生殖能力を阻害す
る薬剤を同定するために使用することができる。他方、本発明の方法は哺乳動物
において生殖能力を増強する薬剤を同定するために使用することができる。

【００１０】本発明はまた、ＧＤＦ−９のアゴニストである薬剤の同定方法に関する。この
方法において、ＧＤＦ−９のレセプターと遺伝子を有する細胞、ここで、該遺伝
子の発現はレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される；ＧＤＦ−９；と
評価対象の薬剤を合せる。調製された合せ物を細胞上のレセプターへのＧＤＦ−
９の結合に適する条件下に維持し、そして、レセプターへのＧＤＦ−９の結合に
より調節される遺伝子の発現が生ずる程度を測定する。その際、評価対象の薬剤
の存在下における遺伝子の発現は、該薬剤がＧＤＦ−９のアゴニストであること
を示す。

【００１１】さらに、本発明はＧＤＦ−９のアゴニストまたはアンタゴニストである薬剤の
同定方法に関する。この方法において、ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプター
へのＧＤＦ−９の結合により発現が調節される遺伝子を有する細胞；ＧＤＦ−９
と評価対象の薬剤を合せる。調製された合せ物を細胞上のレセプターへの薬剤の
結合に適する条件下に維持する。細胞上のレセプターへの薬剤の結合が生ずる程
度を測定する。その際、ＧＤＦ−９レセプターへの薬剤の結合は、該薬剤がＧＤ
Ｆ−９のアゴニストまたはアンタゴニストであることを示す。

【００１２】細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度は種々の方法で測定す
ることができる。たとえば、結合が生ずる程度を、レセプターへのＧＤＦ−９の
結合により調節される遺伝子の遺伝子産物（たとえば、遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ
等の核酸；遺伝子によりコードされるタンパク質、ペプチド）を直接測定するこ
とにより測定する。１つの態様において、遺伝子はヒアルロン酸の合成に関与す
るタンパク質（たとえば、ヒアルロナンシンターゼ）をコードし、顆粒膜細胞上
のレセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度を、該遺伝子の産物（たとえば
、ヒアルロナンシンターゼをコードするＲＮＡ）の産生を測定することにより測
定する。その際、遺伝子産物の産生の増加は薬剤がＧＤＦ−９活性のエンハンサ
ーであることを示し、遺伝子産物の産生の減少は薬剤がＧＤＦ−９活性のインヒ
ビターであることを示す。他の１つの態様において、遺伝子はプロゲステロンの
合成に関与するタンパク質（たとえば、ＳｔＡＲ）をコードし、顆粒膜細胞上の
レセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度を、該遺伝子の産物（たとえば、
ＳｔＡＲをコードするＲＮＡ）の産生を測定することにより測定する。その際、
遺伝子産物の産生の増加は薬剤がＧＤＦ−９活性のエンハンサーであることを示
し、遺伝子産物の産生の減少は薬剤がＧＤＦ−９活性のインヒビターであること
を示す。さらに他の１つの態様において、遺伝子はプラスミンの産生に関与する
タンパク質（たとえば、ｕＰＡ）をコードし、レセプターへのＧＤＦ−９の結合
の際に生ずるレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の
程度を、遺伝子の産物（たとえば、ｕＰＡをコードするＲＮＡ）の産生を測定す
ることにより測定する。その際、遺伝子産物の発現の減少は薬剤がＧＤＦ−９活
性のエンハンサーであることを示し、遺伝子産物の発現の減少は薬剤がＧＤＦ−
９活性のインヒビターであることを示す。細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の
結合が生ずる程度はまた、細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合により発現
が調節される遺伝子によりコードされるタンパク質の活性に起因する産物または
機能（たとえば、ヒアルロン酸、プロゲステロンおよび／またはプラスミン）を
測定することにより測定することができる。

【００１３】顆粒膜細胞がＧＤＦ−９に応答する、およびこの応答は１つまたはそれ以上の
誘導可能な遺伝子により測定できるという知見は、ＧＤＦ−９のインビトロバイ
オアッセイを可能にする。かかるアッセイは、哺乳動物における生殖能力の問題
を診断するために、また、たとえば、哺乳動物における生殖能力の問題を診断お
よび／または治療するために用いることができる、ＧＤＦ−９のインヒビター、
エンハンサー、アンタゴニストおよびアナログを同定するために使用することが
できる。

【００１４】発明の詳細な説明本発明は、成長分化因子９（ＧＤＦ−９）の活性を変える（調節する）薬剤の
同定方法に関する。特に、本発明の方法は、初期の卵巣での卵胞形成の際に必要
とされる因子であるＧＤＦ−９の活性を阻害または増強する薬剤の能力を評価す
るためのアッセイである。ＧＤＦ−９活性を変える（阻害する、増強する）薬剤
を同定する本発明の方法において、以下の試薬を合せて試験サンプルを調製する
：ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤＦ−９の結合により発現が調
節される遺伝子を有する細胞；ＧＤＦ−９；と評価対象の薬剤。

【００１５】ＧＤＦ−９のレセプターと細胞上の該レセプターへのＧＤＦ−９の結合により
発現が調節される遺伝子を有する細胞には、たとえば、哺乳動物の卵巣の卵胞に
見出される顆粒膜細胞（たとえば、壁在性顆粒膜細胞、卵丘細胞）を含む。卵胞
形成のあらゆる段階におけるＧＤＦ−９のレセプターを有する細胞（たとえば、
顆粒膜細胞）により取り囲まれる卵母細胞を含む、哺乳動物の卵巣の卵胞も本発
明の方法において使用することができる。たとえば、始原、一次、二次、三次（
排卵前）または過剰排卵の卵巣の卵胞を本発明の方法において使用することがで
きる。この態様において、卵巣の卵胞は一般に、ＧＤＦ−９を発現する卵母細胞
および顆粒膜細胞を含むであろう。それゆえ、試験サンプルにおけるＧＤＦ−９
の添加はこの態様においては任意である。評価対象の薬剤がＧＤＦ−９活性を阻
害する、またはさらに卵巣の卵胞に存在するＧＤＦ−９の活性を増強する程度を
評価する。顆粒膜細胞および／または卵巣の卵胞は、本明細書に記載のようにあ
らゆる哺乳動物源から、当該分野で既知の技術を用いて得ることができる。たと
えば、顆粒膜細胞および／または卵巣の卵胞は、霊長類の動物（たとえば、サル
、ヒト）、ウシ、ブタ、ネコ、イヌおよびネズミ源から得ることができる。さら
に、顆粒膜細胞および／または卵巣の卵胞は、卵胞形成のあらゆる段階の哺乳動
物から、または過剰排卵の状態の哺乳動物から得ることができる。たとえば、哺
乳動物における過剰排卵の状態は哺乳動物にゴナドトロピン（たとえば、妊馬血
清ゴナドトロピン）を投与することにより得ることができ、かかる哺乳動物から
顆粒膜細胞および／または卵巣の卵胞が得られるだろう。本発明の方法における
使用に適する細胞の他の例には、ＧＤＦ−９レセプターおよび細胞上の該レセプ
ターへのＧＤＦ−９の結合により発現が調節される遺伝子を発現するように組換
え的に作製された細胞（たとえば、ＧＤＦ−９レセプターおよび、レセプターへ
のＧＤＦ−９の結合の際にさらにヒアルロナンシンターゼを発現する、組換え的
に作製されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含む。

【００１６】本明細書に記載のように、本発明の方法は、ＧＤＦ−９のレセプターと細胞上
の該レセプターへのＧＤＦ−９の結合により発現が調節される遺伝子を有する細
胞を利用する。本発明における使用のための遺伝子（１つまたはそれ以上）には
、たとえば、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期調節タンパク質、黄
体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、ウロキナーゼプラスミノ
ーゲンアクチベーター、アクチビン／インヒビンおよびフォリスタチンをコード
する遺伝子を含む。

【００１７】本明細書に使用の「ＧＤＦ−９」は、ＧＤＦ−９タンパク質、その個々のサブ
ユニット、その個々のサブユニットの多量体、ＧＤＦ−９の機能的フラグメント
もしくは一部、ならびにＧＤＦ−９の機能的均等物および／またはアナログをい
う。本明細書において定義されるように、ＧＤＦ−９の機能的フラグメントは、
たとえば、ヒアルロン酸の合成に関与する１つまたは複数のタンパク質（たとえ
ば、ヒアルロナンシンターゼ）、プロゲステロンの合成に関与する１つまたは複
数のタンパク質（たとえば、ＳｔＡＲ）および／またはプラスミンの合成に関与
するタンパク質（たとえば、ｕＰＡ）をコードする遺伝子を調節するフラグメン
トである。また、本明細書において定義されるように、「ＧＤＦ−９」の機能的
均等物またはフラグメントには、得られるＧＤＦ−９産物が本明細書に記載のＧ
ＤＦ−９と類似の活性を有する（たとえば、ヒアルロン酸の合成に関与するタン
パク質をコードする遺伝子を調節する）ように改変されたＧＤＦ−９タンパク質
を含む。

【００１８】本方法の使用に適するＧＤＦ−９および本発明の組成物は種々の供給源から得
ることができ、または当該分野で既知の技術を用いて合成することができる。た
とえば、卵巣の卵胞に生ずるようなＧＤＦ−９を本発明の方法において使用する
ことができる。さらに、ＧＤＦ−９は天然源（たとえば、霊長類の動物、ウシ、
ブタ、ネコ、イヌおよびネズミ源）から精製（単離、実質的に純粋）することが
でき、化学合成により製造することができ、組換えＤＮＡ技術により製造するこ
とができ、または市販源から得ることができる。

【００１９】本明細書に記載のように、本発明の方法において調製される合せ物（試験サン
プル）を細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に維持する。
本明細書に記載の方法を実施するのに好適な温度範囲は、約０℃から約４５℃で
ある。１つの態様において、本方法は約３７℃で実施でき、他の１つの態様にお
いて、本方法は約２５℃で実施できる。本方法を実施し得る好適なｐＨ範囲は約
ｐＨ５から約ｐＨ８であり、特に、約ｐＨ７から約ｐＨ７．４である。１つの態
様において、本方法は約ｐＨ７．４で実施することができる。さらに、本方法は
、１日で、または数日に渡って実施することができる。たとえば、本方法は約１
時間から約９６時間まで、約１時間から約４８時間まで、または約１時間から約
２４時間まで実施することができる。１つの態様において、本方法は約３時間か
ら約２４時間まで実施することができる。

【００２０】本発明の方法において、細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程
度は直接的にまたは間接的に測定することができる。たとえば、細胞上のレセプ
ターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度は、アッセイに使用される細胞上に存在
するＧＤＦ−９レセプターへのＧＤＦ−９の結合に応答して生ずる特定の遺伝子
産物（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質）を直接
測定することにより測定することができる。かかる特定の遺伝子産物の例には、
限定されるものではないが、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期調節
タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、ウロキナ
ーゼプラスミノーゲンアクチベーター、キットリガンド、アクチビン／インヒビ
ンβＢおよびフォリスタチンを含む。

【００２１】他方、遺伝子産物の活性の結果として生ずる（たとえば、下流）産物または機
能も測定することができる。１つの態様において、遺伝子はヒアルロン酸の合成
に関与し（たとえば、ヒアルロナンシンターゼをコードする遺伝子）、ヒアルロ
ン酸等の、遺伝子の活性から生ずる産物を測定することができる。他の１つの態
様において、遺伝子はプロゲステロンの合成に関与し（たとえば、ＳｔＡＲをコ
ードする遺伝子）、プロゲステロン、リン酸化ＳｔＡＲおよび／またはプロゲス
テロン合成経路における他のステロイド等の、遺伝子の活性から生ずる産物を測
定することができる。さらなる態様において、遺伝子はプラスミンの合成に関与
し（たとえば、ｕＰＡ）、プラスミン等の遺伝子の活性から生ずる産物、および
／またはプラスミノーゲンの切断等の遺伝子の機能を測定することができる。他
の１つの態様において、遺伝子はプロスタグランジン（たとえば、ＣＯＸ−２）
の産生に関与し、プロスタグランジン等の遺伝子の活性から生ずる産物を測定す
ることができる。遺伝子はまた、アクチビンＢまたはインヒビンＢの産生に関与
し得、アクチビンβＢ：アクチビンおよび／またはβＢインヒビンα：アクチビ
ンβＢ等の、遺伝子の活性から生ずる産物を測定することができる。他の１つの
態様において、遺伝子はＬＨレセプターの産生に関与し、ＬＨレセプターの結合
の結果として産生される産物（たとえば、サイクリックＡＭＰ）等の、遺伝子の
活性から生ずる産物、および／またはＬＨレセプターへのリガンドの結合等の、
遺伝子の活性から生ずる機能を測定することができる。さらに、特に、ＧＤＦ−
９のアゴニストまたはアンタゴニストが同定されるであろう方法において、細胞
上のレセプターへの評価対象の薬剤の存在下におけるＧＤＦ−９の結合が生ずる
程度は、当該分野において既知の技術（たとえば、ラジオレセプターアッセイ）
を用いて、直接、細胞上のレセプターに結合されたＧＤＦ−９の量を測定するこ
とにより測定することができる。

【００２２】細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合が生ずる程度を測定するために使用
することができる方法は測定されるであろうそのパラメータに依存する。細胞上
のレセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子に関連する核酸（Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ）の存在を、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の視
覚化、放射性標識法、放射性標識ＰＣＲ産物の写真撮影検出、ＰＣＲ産物のサザ
ンブロット、ＲＮアーゼプロテクションアッセイおよび／またはノーザンブロッ
トを用いて測定することができる。他方、細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の
結合により調節される遺伝子に関連するタンパク質の存在を、高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫組織化学、ウエスタンブロット解析および免疫沈
降等の技術を用いて測定することができる。さらに、細胞上のレセプターへのＧ
ＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の活性に応答して生ずる下流産物（たと
えば、ヒアルロン酸、プロゲステロン、プラスミン）は、たとえば、ＨＰＬＣお
よび／またはラジオイムノアッセイを使用して測定することができる。

【００２３】本発明の方法はさらに、対照サンプルの使用を含み得る。たとえば、試験サン
プル中の細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の程度を、対照サンプル（す
なわち、評価対象の薬剤を除いて試験サンプルと同じ試薬の組み合わせを含み、
かつ試験サンプルと同じ様式で加工されているサンプル）中で生ずる細胞上のレ
セプターへのＧＤＦ−９の結合の程度と比較する。

【００２４】本明細書に記載の方法および該方法により同定される薬剤は種々の方法で使用
することができる。たとえば、本方法は、ＧＤＦ−９のインヒビター、エンハン
サー、アンタゴニスト、アゴニスト、および／またはアナログである薬剤および
生殖問題を診断および／または治療するために使用することができる薬剤を同定
するためのスクリーニング方法として、または、不妊等の生殖問題を検出するた
めの診断アッセイ（たとえば、ＧＤＦ−９活性を解析するための卵胞液のアッセ
イ）として使用することができる。本発明の方法により同定される薬剤は、ＧＤ
Ｆ−９活性が異常であるあらゆる疾患または症状において使用することができる
。たとえば、本発明の方法において同定される薬剤を使用して、生殖能力を阻害
（たとえば、避妊、避妊薬）または生殖能力を増強（たとえば、インビトロでの
受精の成功の増加）することができる。

【００２５】本明細書に記載のように、切断した、成熟マウスＧＤＦ−９タンパク質でなら
したＣＨＯ細胞培地（ＣＨＯ１９Ａ１２）を用いる初期卵胞培養実験において
、卵胞は顆粒状のようであり、顆粒膜細胞は寄り集まり、また、互いに離れ、培
養の２日後、粘膜分泌細胞化マトリックスを形成するようであることに言及した
。ＣＨＯ対照培地または骨形態形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）のみを含む
培地（ＣＨＯ２１Ａ５）は、卵胞に対しこの粘膜分泌細胞化効果を有さなかっ
た。ＧＤＦ−９およびＢＭＰ−１５の両方を発現する細胞由来であるが、ＧＤＦ
−９レベルがＣＨＯ１９Ａ１２におけるより５〜１０倍低いと推定される培地
（ＣＨＯ２７Ａ１１）では、結局、培養の５日後に粘膜分泌期事象が生じた。

【００２６】卵丘細胞として知られる、排卵前の卵胞において卵母細胞と直接接触する顆粒
膜細胞は、卵丘拡張と呼ばれる工程において、インビボおよびインビトロの両方
でヒアルロン酸を含むプロテオグリカンマトリックスを産生する。この拡張マト
リックスは卵母細胞および共に卵丘細胞を結合し、卵胞排出および卵管采捕捉を
促進し、精子貫入および受精を可能にする〔Salustri et al.,Zygote,4:313-315
(1996)〕。インビトロでの卵丘拡張は、卵胞刺激ホルモンおよび卵母細胞由来因
子に依存することが観察されている〔Buccione et al.,Dev.Biol.,138:16-25(19
90)〕。卵母細胞からはぎ取られた卵丘細胞は拡張せず、付着性の線維芽細胞の形態をとり、極僅かな量のヒアルロン酸を産生する。卵母細胞を培養物に戻して
添加した場合、または卵母細胞でならした培地（ＯＣＭ）（〜１卵母細胞／μｌ
培地）にて卵丘細胞を増殖させる場合、それらは５〜１０倍の高いレベルのヒア
ルロン酸を産生する。卵母細胞ならし培地および／またはＴＧＦ−βでの処理に
より、壁在性顆粒膜細胞（すなわち、卵母細胞と接触していない排卵前の卵胞の
顆粒膜細胞）を誘導し、インビトロでヒアルロン酸を作製することができること
も示された〔Salustri et al.,J.Biol.Chem.,265:19517-19523(1990)〕。ＯＣＭ
およびＴＧＦ−βの両方の影響は相加的であった。抗ＴＧＦ−β抗体はＴＧＦ−
βの影響をブロックすることができたが、卵母細胞ならし培地の影響をブロック
することはできなかった。このことは、ＴＧＦ−βそれ自体はヒアルロン酸産生
を刺激する卵母細胞由来シグナルではないことを示す。さらに、これらの実験を
転写ブロッキング剤であるアクチノマイシンＤを用いて繰り返した。ＴＧＦ−β
の影響の〜５０％はこれらの条件下でブロックされることが示された〔Tirone e
t al.,J.Biol.Chem.,272:4787-4794(1997)〕。

【００２７】最近、ヒアルロナンシンターゼ２型（ＨＡＳ２）がマウスで同定され、トラン
スフェクトされたＣＯＳ細胞においてヒアルロン酸産生を触媒することができる
ことが示された〔Spicer et al.,J.Biol.Chem.,271:23400-23406(1996)〕。他の
研究において、標準過剰排卵プロトコル〔妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）
−４８時間ｈＣＧ〕のヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）投与の１時間〜４
時間後、ＨＡＳ２は卵丘卵母細胞複合体において誘導されることが示されること
が示された〔Fulop et al.,Arch.Biochem.Biophysics,337:261-266(1997)〕。そ
の酵素活性およびその発現パターンにより、ＨＡＳ２は卵丘拡張に導くヒアルロ
ン酸産生を担うようであり、卵母細胞により産生されるまたは卵母細胞ならし培
地に存在する因子に応答する遺伝子であるかもしれない。

【００２８】さらに、研究により、第２遺伝子であるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｕＰＡ）が卵母細胞由来因子により阻害されることが示されている〔
Canipari et al.,Devel.Biol.,167:371-378(1995)〕。ｕＰＡは、プラスミノーゲンを切断して活性なプロテアーゼであるプラスミンを形成するセリンプロテア
ーゼであり、卵胞壁の排卵前のタンパク質分解による崩壊において役割を演ずる
ことが示唆されている。ｕＰＡは、顆粒膜細胞および卵胞膜細胞（ｔｈｅｃａ
ｃｅｌｌ）においてゴナドトロピンにより刺激される。卵丘卵母細胞複合体にお
ける卵丘細胞は、通常、ｕＰＡを産生しない。しかしながら、卵母細胞からはぎ
取られ、ＦＳＨにより刺激された卵丘細胞はｕＰＡを分泌する。ｕＰＡ分泌は、
卵丘細胞を卵母細胞とまたは卵母細胞ならし培地で培養することにより非常に減
少する。

【００２９】また、実施例において示すように、卵母細胞特異的ＴＧＦ−βファミリー成長
因子であるｍＧＤＦ−９の組み換え体は、顆粒膜細胞において、ＨＡＳ２および
／またはプロゲステロンの発現を誘導し、および／またはｕＰＡ発現を阻害する
ことができる。ＨＡＳ２発現に対するこの効果は卵胞培養実験により予想される
ようにＧＤＦ−９に特異的であり、他の卵母細胞特異的ＴＧＦ−βファミリーの
メンバー（すなわち、ＢＭＰ−１５およびＢＭＰ−６）により誘導されない。

【００３０】実施例３に記載のように、マウスＧＤＦ−９タンパク質は全ての卵母細胞にお
いて発現され、卵胞腔卵胞を含む３ａ型卵胞段階において開始される。卵丘拡張
を含む卵胞形成の後期段階におけるＧＤＦ−９の生物学的機能を調べるために、
成熟しグリコシル化された組換えマウスＧＤＦ−９をチャイニーズハムスター卵
巣細胞発現システムを用いて作製した。顆粒膜細胞培養システムを構築し、半定
量的ＲＴ−ＰＣＲを用いていくつかの重要な卵巣遺伝子産物の調節におけるＧＤ
Ｆ−９の役割を決定した。組換えＧＤＦ−９は、ヒアルロナンシンターゼ２（Ｈ
ＡＳ２）、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、およびステロイド産生早期
調節タンパク質（ＳｔＡＲ）ｍＲＮＡ合成を誘導するが、ウロキナーゼプラスミ
ノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）および黄体形成ホルモンレセプター（ＬＨＲ
）ｍＲＮＡ合成を抑制することが見出された。ＧＤＦ−９によるＳｔＡＲｍＲ
ＮＡの誘導と一致して、組換えＧＤＦ−９はＦＳＨの非存在下に顆粒膜細胞のプ
ロゲステロン合成を増加した。卵丘細胞におけるＨＡＳ２の誘導およびプロテア
ーゼｕＰＡの抑制は、卵丘拡張の際に産生されるヒアルロン酸−リッチ細胞外マ
トリックスの産生において重要な事象であるので、ＧＤＦ−９がこの工程を擬似
できるかどうか決定した。卵母細胞切除卵丘細胞−卵母細胞複合体を用いて、組
換えＧＤＦ−９はインビトロで卵丘拡張を誘導することが示された。これらの研
究は、ＧＤＦ−９は顆粒膜細胞上のレセプターに結合し、多くの遺伝子産物の発
現を調節することができることを示す。したがって、初期卵胞形成の際に成長お
よび分化因子として重要な機能を果たす他に、いくつかの重要な顆粒膜細胞酵素
を調節する、卵母細胞により分泌されるパラクリン因子としてのＧＤＦ−９機能
は、卵丘拡張、ならびに正常排卵、受精、および雌性生殖に必須である、最適な
卵母細胞微小環境、工程の維持に関与した。

【００３１】実施例４に記載のように、ＧＤＦ−９の非存在のために生ずる分子欠陥を解析
した。主要な知見は以下の通りであった：１）いくつかの卵胞膜細胞層マーカー
（すなわち、１７αヒドロキシラーゼ、黄体形成ホルモンレセプター（ＬＨＲ）
、およびキットリガンドのレセプターであるｃ−キット）について、ＧＤＦ−９
欠損卵胞の周りに検出可能なシグナルは存在しない。このことは、ＧＤＦ−９非
存在下に、卵胞は、卵胞を取り囲むために卵胞膜細胞前駆体を漸増するシグナル
を発することができないということを示す。２）ＧＤＦ−９欠損マウスの一次卵
胞はキットリガンドおよびインヒビンαのアップレギュレーションを示す。この
ことは、顆粒膜細胞において発現される、これらの２つの重要な分泌される成長
因子は、ＧＤＦ−９により、直接、パラクリン様式で調節されるようであること
を示す。また、卵母細胞上でのｃ−キットを通したシグナル伝達を介するキット
リガンドのアップレギュレーションは、直接、ＧＤＦ−９欠損卵母細胞のサイズ
の増加および卵母細胞の最後の消滅に関与するようである。３）卵母細胞の損失
後、ＧＤＦ−９欠損卵胞の細胞は、組織学的に小さな黄体に類似するステロイド
産生クラスターに残存する。しかしながら、分子レベルで、これらの細胞は、黄
体マーカー（たとえば、ＬＨＲおよびＰ−４５０側鎖切断）および非黄体マーカ
ー（たとえば、インヒビンαおよびＰ−４５０アロマターゼ）の両方に対し陽性
である。このことは、初期に、卵母細胞の存在は黄体形成マーカーの発現を防ぐ
が、初期の時点におけるＧＤＦ−９の非存在は顆粒膜細胞の分化プログラムを変
えることを示す。４）ＰＣＮＡまたはＫｉ−６７のいずれかとＴＵＮＥＬ標識に
よる染色により示されるように、ＧＤＦ−９欠損３ｂ型一次卵胞の顆粒膜細胞は
増殖しないが、また、細胞死に至らない。このことは、３ｂ型卵胞の顆粒膜細胞
は増殖の継続のために、また、たとえば、分化事象を通じてのアポトーシスを受
けるようになるためにＧＤＦ−９を必要とすることを示す。

【００３２】本発明を以下の実施例により説明する。かかる実施例は、いずれにも限定する
ことを意図するものではない

【００３３】
実施例実施例１ＧＤＦ−９機能についての顆粒膜細胞培養物インビトロアッセイプロトコル２１日齢のＣＤ−１マウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓまたはＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅの医学検問施設群（Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅｂａｒｒｉｅｒｆａｃｉｌｉｔｙｃｏｌｏｎｙ）のどちらかより得
た。各雌に、７．５ＩＵの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（我々のストッ
ク０．３ｃｃ）を注入した。最初、４８時間後（実施例１の最後の実験では４２
〜４６時間後）、マウスを頸の脱臼により屠殺し、可能なかぎり全ての脂肪およ
び嚢組織を除去しながら、卵巣を回収した。前もって温めておいた３０ｍｍディ
ッシュ中の回収培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ｗ／１ＸＧＰＳおよび．３％ＢＳ
Ａ）に、卵巣を置いた。解剖的視野に基づいて、２７１／２ゲージの針で刺す
ことを繰り返すことにより、大きな卵胞腔卵胞から顆粒膜細胞を放した。顆粒膜
細胞の凝集塊を、パスツールピペットで吸って、上下に口でピペッティングする
ことにより分散した。卵母細胞および卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、顆粒膜
細胞から手作業で分離した。一度、全ての明白な卵母細胞およびＣＯＣのものを
除去し、顆粒膜細胞をさらに前もって温められた回収培地を有するきれいなディ
ッシュに移し、残っている卵母細胞およびＣＯＣを除去した。２つめのディッシ
ュの中身を、２つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、３分間１５０
０ｒｐｍで回転した。新しい回収培地を使用して、プレートから残った細胞を洗
浄してはがし、エッペンドルフに移し、１５００ｒｐｍで再度回転した。

【００３４】回収された卵巣ごとに、１Ｘ卵胞培養培地（アルファＭＥＭ、１Ｘインシ
ュリン／トランスフェリン／亜セレン酸塩、１Ｘグルタミン／ペニシリン／スト
レプトマイシン、４ｎｇ／ｍｌのヒツジＦＳＨ、＋／−１０％ウシ胎仔血清）２
５０μｌ〜５００μｌで、穏やかにピペッティンッグすることにより、顆粒膜細
胞を再懸濁し、顆粒膜細胞２５０μｌを２４ウェルプレートのウェルごとに入れ
た。各ウェルに対して、研究対象の処理の２Ｘ量の１Ｘ卵胞培養培地２５０μ
ｌ以上。最終的な培養容積は、５００μｌであった。

【００３５】実験例１培地：１）ＣＨＯ対照（濃縮）＝ＣＨＯＡ２（発現ベクターを持たないＣＨＯ細胞
）由来の濃縮培地１００μｌ＋１Ｘ卵胞培養培地（Ｆ．Ｃ．Ｍ．）４００μｌ
。最終希釈＝１：１０。２）ｍＧＤＦ−９（濃縮）＝ｍＧＤＦ−９発現細胞由来の濃縮ＣＨＯ１９Ａ
１２培地５０μｌ＋１ＸＦ．Ｃ．Ｍ．４５０。最終希釈＝１：２０。見積もら
れた最終ｍＧＤＦ−９濃度＝５０ｎｇ／ｍｌ。３）ｍＢＭＰ−１５（濃縮）＝ｍＢＭＰ−１５発現細胞由来の濃縮ＣＨＯ２
１Ａ５培地１００μｌ＋１ＸＦ．Ｃ．Ｍ．４００μｌ。見積もられた最終ｍＢ
ＭＰ−１５濃度≧５０ｎｇ／ｍｌ。４）ｍＧＤＦ−９＋ｍＢＭＰ−１５（濃縮）＝濃縮ＣＨＯ１９Ａ１２培地５
０μｌ＋濃縮ＣＨＯ２１Ａ５培地１００μｌ＋Ｆ．Ｃ．Ｍ．３５０μｌ。見積
もられた最終ｍＧＤＦ−９濃度＝５０ｎｇ／ｍｌ。^* 残っている１ＸＦ．Ｃ．Ｍ．５００μｌ＋細胞を、１５００ｒｐｍで３分間
回転しておとし、２ＸＦ．Ｃ．Ｍ．で再懸濁し、２５０μｌを２つの残りのウ
ェルに入れた。５） ^*ｍＧＤＦ−９（濃縮なし）＝ＣＨＯ１９Ａ１２濃縮なしの２５０μ
ｌ＋顆粒膜細胞を有する２ＸＦ．Ｃ．Ｍ．２５０μｌ。見積もられた最終ｍＧ
ＤＦ−９濃度＝３００ｎｇ／ｍｌ。６） ^*ｍ二量体（濃縮なし）＝ＣＨＯ２７Ａ１１濃縮なしの２５０μｌ（ｍ
ＧＤＦ−９およびｍＢＭＰ−１５両方を発現するＣＨＯ細胞）。見積もられた最
終ｍＧＤＦ−９濃度＜１５０ｎｇ／ｍｌ。見積もられた最終ｍＢＭＰ−１５濃度
＞１５０ｎｇ／ｍｌ。全ての細胞を一晩（〜２０時間）３７℃で５％ＣＯ₂で培養した。

【００３６】培地を吸引し、ＲＮＡＳｔａｔ−６０（ＬｅｅｄｏＭｅｄｉｃａｌＳｕ
ｐｐｌｙ）５００μｌを各ウェルに単回で添加し、上下にピペッティングして細
胞を溶解した。全ての細胞を、解剖顕微鏡を使用して確かめながら溶解した。細
胞をホモジナイズするために、細胞をＰ２００ピペットマンを用いて上下にピペ
ッティングした。クロロホルム１００μｌを各チューブに添加し、ボルテックス
し、次いで氷上で１０分間インキュベートした。チューブを、４℃で、２０分間
、最高速度で回転した。水相を注意深く回収し、ＲＮＡを−２０℃で２時間イソ
プロパノール２５０μｌで沈澱させた。４℃で、３０分間、最高速度で回転した
後、非常に小さいＲＮＡペレットを観察した。ペレットを７０％エタノールで洗
浄し、風乾し、次いでＤＥＰＣ水１００μｌで再懸濁し、−８０℃で保存した。

【００３７】ＧＩＢＣＯＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II逆転写酵素キットおよびオリゴ−ｄ
Ｔプライマーを用いた逆転写（ＲＴ）によって、各ＲＮＡサンプル５μｌ（全回
収の１／２）から、ｃＤＮＡを合成した。全反応容積は、２０μｌであった。次
のプライマーを用いたＰＣＲによって、ＨＡＳ２を検出した：スプライスされた
ｍＲＮＡ由来の４３０ｂｐの予測される産物を与える、ＨＡＳ２−１Ｆ（５’）
＝ＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧ（配列番号：１）およびＨ
ＡＳ２−１Ｒ（３’）＝ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＴＡＴＴ（配
列番号：２）。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡ完全性についての対照として使用し、次の
プライマーで検出した：４８６ｂｐの産物を与える、ＧＡＰＤＨ−１Ｆ（５’）
＝ＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣ（配列番号：３）およびＧ
ＡＰＤＨ−１Ｒ（３’）＝ＴＧＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡ（
配列番号：４）。次の増幅条件での各プライマーセットに対する標準５０μｌＰ
ＣＲ反応で、各ＲＴ反応物２μｌを使用した：９４℃３分間、２８Ｘ（９４℃１
分間、６０℃３０秒間、７２℃１分間および７２℃７分間）。産物を１．５％ア
ガロースゲルで泳動し、視覚化した。

【００３８】結果：ＣＨＯ対照および試験された全ての他の成長因子と比較して、ｍＧＤＦ−９を
含むサンプルで、ＨＡＳ２の発現は有意に上昇した（〜１０倍）。

【００３９】実験例２および３：この実験例をさらに２回繰り返し、対照、ｍＧＤＦ−９およびｍＢＭＰ−１５
培地での５時間および＞２０時間の培養で、ＨＡＳ２誘導が見られ、ＨＡＳ２の
発現がｍＧＤＦ−９処理された壁在性顆粒膜細胞で上昇することが、一貫して見
られた。さらに、ｍＧＤＦ−９のこの効果は、培地での血清の存在またはインビ
ボでの卵胞成長のＰＭＳＧ刺激に依存しない。

【００４０】実験例４：濃縮なしおよび濃縮のならし培地両方における、ｍＧＤＦ−９およびｈＧＤＦ
−９を、ウエスタンブロットにより測定した。ＭＧＤＦ−９（濃縮）培地は、〜
１μｇ／ｍｌ含み、ｍＧＤＦ−９非濃縮培地は、〜０．６μｇ／ｍｌ含んだ。ｈ
ＧＤＦ−９ならし培地は、〜１μｇ／ｍｌ含んだ。最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、５
０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌに希釈した濃縮なしのｍＧＤＦ−９培地を
使用して、次の実験を行なった。ｈＧＤＦ−９ならし培地を、５０ｎｇ／ｍｌ、
１００ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌで試験した。本目的は、活性濃度範囲
および効果に対する初期のタイムコースを定義することであった。

【００４１】プロトコルこの実験例に対する次のプロトコルは、次の修飾を有し、前記のものと同一で
ある。

【００４２】１Ｘ卵胞培養培地はウシ胎仔血清を含まなかったので、見られた全ての効果は
血清非依存性である。

【００４３】沈澱したＲＮＡペレットのサイズを増加し、かつ沈殿工程の信頼性を高めるた
めに、ホモジナイズ工程の際に、酵母ｔＲＮＡ１０〜２０ｎｇを各サンプルに添
加した。

【００４４】ＲＮＡの完全性および定量についての内部対照を、次のプライマーを用いるＨ
ＰＲＴに変更した：ＨＰＲＴ−１Ｆ（５’）＝ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣＡＧＴＡ
ＣＡＧＣＣ（配列番号：５）およびＨＰＲＴ−２Ｒ（３’）＝ＴＡＣＴＡＧＧＣ
ＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧ（配列番号：６）。

【００４５】ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）レベルを、各サンプ
ルで試験し、ならびに次のプライマーを使用してＨＡＳ２を試験した：ｕＰＡ−
３Ｆ（５’）＝ＧＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号：７
）およびｕＰＡ−４Ｒ（３’）＝ＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧ
（配列番号：８）。

【００４６】産物検出の感度を増加するために、αＰ³²ーｄＣＴＰ０．１μｌを各ＰＣＲ反
応に追加した。ＲＴ反応物１μｌのみを鋳型として使用し、増幅を２０サイクル
行なった。各反応物５μｌを４％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ゲルを乾燥
し、ＫｏｄａｋＸ−ＯＭＡＴオートラジオグラフィーフィルムに暴露した。

【００４７】結果培養３時間までは、１００ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９は、ＣＨＯ対照と比較し
て、ＨＡＳ２産生を刺激しｕＰＡ産生を阻害する一方、１００ｎｇ／ｍｌのｈＧ
ＤＦ−９は、ＨＡＳ２を刺激できず、有意にｕＰＡを誘導する。５時間培養後、
１０ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９は、ＨＡＳ２を誘導する一方、５０ｎｇ／ｍｌお
よび１００ｎｇ／ｍｌの両方とも、約５〜１０倍高いレベルを誘導する。５時間
培養後、１００ｎｇ／ｍｌのｈＧＤＦ−９は、検出可能なＨＡＳ２シグナルを誘
導する一方、３００ｎｇ／ｍｌは、５０ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９のものに近づ
くレベルを誘導する。５時間で、１００ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９は、ｕＰＡ発
現を阻害する一方、全ての濃度のｈＧＤＦ−９は、刺激効果を有するように見え
る。これらの結果は、ＨＡＳ２を誘導するためのｍＧＤＦ−９の最大活性は、５
０ｎｇ／ｍｌ付近にあり、ｈＧＤＦ−９もまた、マウスＧＤＦ−９レセプターを
結合し、ＨＡＳ２発現を刺激できるが、このインビトロモデルシステムでは非常
に弱いかもしれないことを示唆する。ｕＰＡは、高濃度のｍＧＤＦ−９によって
阻害されるが（少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ）、低濃度により刺激されるかも
しれない（多くても約５０ｎｇ／ｍｌ）。これらの観察は、排卵のための卵胞壁
崩壊が起こるであろうと定義される、卵母細胞から最も遠い壁在性顆粒膜細胞が
到達する最も少ないレベルを有する、卵母細胞由来のＧＤＦ−９の拡散によって
生じる卵胞腔嵩（ａｎｔｒａｌｃａｖｉｔｙ）でのＧＤＦ−９濃度勾配に、ｕ
ＰＡのＧＤＦ−９調節が依存するかもしれないことを示唆する。

【００４８】結論これらの結果をあわせると、ｍＧＤＦ−９は、通常、卵丘細胞においてヒアル
ロン酸産生およびｕＰＡの阻害を生じる卵母細胞由来の成長因子であることが示
される。さらに、これらの結果は、顆粒膜細胞がＧＤＦ−９に応答し、ＧＤＦ−
９レセプターを発現できることを指示する。表を参照のこと。

【００４９】

【表１】

【００５０】実施例２インビトロ培養壁在性顆粒膜細胞によるプロゲステロン合成に対する
組換えｍＧＤＦ−９の刺激効果の同定プロトコル一次顆粒膜細胞を前記のように単離し、指示されたような１０％ウシ胎仔血清
があるまたはないＦＳＨ２〜５ｎｇ／ｍｌを含むαＭＥＭを基礎とする培地での
組換えｍＧＤＦ−９の様々な濃度で、５時間または２４時間培養した。培地を培
養後除去し、汚染となる非接着細胞を遠心分離によって除去した。培地を−２０
℃で凍らせた。培地のプロゲステロンレベルを、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）によって定量した。簡単には、標準量の放射性標識されたプロゲステロンが、
ＲＩＡチューブに含まれるａ−プロゲステロン抗体結合部位に対して実験サンプ
ルに含まれるプロゲステロンと競争する。所与の標準により、実験サンプルのプ
ロゲステロンレベルと結合するカウント数と相関する標準曲線の構築ができる。
プロゲステロンＲＩＡキットはＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られ、１００μｌ容のサンプルを用いて、０．１〜４
０ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンレベルを検出する。アッセイ前に所与の希釈液で
実験サンプルを希釈することにより、より高濃度を測定できる。

【００５１】結果組換えｍＧＤＦ−９は、インビトロで培養された一次顆粒膜細胞により、時間
および濃度依存型で、プロゲステロン合成を刺激した（Ｆｉｇｕｒｅ１、２お
よび３を参照のこと）。５時間で、６０ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９が、２．５倍
の増加を示し、３００ｎｇ／ｍｌが、４．５倍の増加を示した（Ｆｉｇｕｒｅ
２を参照のこと）。プロゲステロンのこの刺激がまた、２４時間で見られ、そこ
で、３．５〜４倍の刺激を観察した（Ｆｉｇｕｒｅ３を参照のこと）。

【００５２】考察プロゲステロン合成の律速段階は、酵素複合体シトクロムＰ４５０側鎖切断（
ｓｃｃ）によるコレステロールのプレグネノロンへの触媒作用である。非黄体形
成培養ラット顆粒膜細胞を刺激し、Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡレベルを増加させ
、ｃＡＭＰアゴニストであるフォルスコリンでインビトロでプロゲステロンを産
生させることができ（Ｏｏｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：２１９
３４〜２１９４２）、この段階でのプロゲステロン合成が、ｃＡＭＰ依存性であ
り、Ｐ４５０ｓｃｃ転写の増加と関連することを指示する。本明細書で記載され
た結果は、ＧＤＦ−９の他の１つの機能（すなわち、プロゲステロン合成の刺激
）およびＧＤＦ−９シグナル伝達の他の１つの下流標的遺伝子（すなわち、シト
クロムＰ４５０側鎖切断遺伝子）を示す。さらに、プロゲステロンの測定は、Ｇ
ＤＦ−９アナログおよびインヒビターの試験のためのＧＤＦ−９機能についての
速くかつ容易な機能アッセイを与える。

【００５３】実施例３哺乳類卵巣における成長分化因子−９のパラクリン作用材料及び方法免疫組織化学ＣＤ１（ＩＣＲ）マウス由来の卵巣（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（
Charles River Laboratories）所蔵品からベイロール医科大学（Baylor College
of Medicine）にて得た）を、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、処理し、
パラフィンに包埋した。４μｍの卵巣切片を脱ワックスした後、一連の段階的エ
タノール溶液にて再水和した。０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び０
．１％ＢＳＡにて希釈した１×広域ブロッキング緩衝液（バイオジェネックス(B
iogenex)、サンラモン（San Ramon)、カリフォルニア州）に３０分間、前インキ
ュベートすることにより、非特異的結合を低減させた。一次抗体であるマウス抗
ヒトＧＤＦ−９モノクローナル抗体はネイル・ウルフマン（Neil Wolfman) 博士
（ジェネティックス・インスティテュート(Genetics Institute)、ケンブリッジ
、マサチューセッツ州）より提供され、各切片に加え、最終濃度３０〜６０ｎｇ
／μｌで２時間インキュベートした。切片を、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで５分間
２回洗浄した後、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオジェネックス、サン
ラモン、カリフォルニア州）中で２０分間インキュベートした。上記の洗浄後、
切片を、アルカリホスファターゼと結合させたストレプトアビジン（バイオジェ
ネックス、サンラモン、カリフォルニア州）中で２０分間インキュベートし、Ｐ
ＢＳ中０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄し、ニュー・フクシン(New Fuchsin) アルカ
リホスファターゼ基質とともに、製造業者の指示書（バイオジェネックス）によ
りインキュベートした。陽性反応の検出後、切片をヘマトキシリンで対比染色し
、グリセロール中に入れた。

【００５４】組換えマウスＧＤＦ−９の産生全長マウスＧＤＦ−９ｃＤＮＡ（Incerti, B. et al., Biochim. Biophys.
Acta., 1222:125-128(1994) ）を、プロセッシング遺伝子ＰＡＣＥ（ジェネティ
ックス・インスティテュート、ケンブリッジ、マサチューセッツ州のモニーク・
デービス(Monique Davies)博士より贈与）を含む発現ベクターｐＨＴｏｐ内にサ
ブクローニングした。ＧＤＦ−９発現ベクターを、標準条件下（ギブコＢＲＬラ
イフ・テクノロジーズ(Gibco BRL Life Technologies) ）でＣＨＯ細胞にリポフ
ェクチン・トランスフェクトした。ＣＨＯ細胞におけるマウスＧＤＦ−９の発現
は、続いてtet-調節性プロモーターにより誘導されたが、ＳＶ４０プロモーター
はＰＡＣＥの発現を調節した。１０％熱不活性化透析ウシ胎仔血清、１００μｇ
／ｍｌＧ４１８−硫酸塩（ギブコＢＲＬライフ・テクノロジーズ）並びに抗生
物質のゲンタマイシン、ペニシリン及びスレプトマイシンを含むα−改変イーグ
ル培地（αＭＥＭ）中、０．０２μＭメトトレキセートの存在下で、安定で陽性
のクローンを選出した。クローン選出及び０．０２μＭメトトレキセート中での
拡張後、１００ｍｇ／ｍｌのヘパリン（シグマ（ＳＩＧＭＡ）、セントルイス、
ミズーリ州）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ低血清コレクション培地中で、ＧＤＦ−９
発現細胞を２４時間インキュベートした。培地を集め、ＧＤＦ−９タンパク質レ
ベルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、続くイムノブロ
ッティングにより測定した（次項参照のこと）。

【００５５】ウエスタンブロット解析ＧＤＦ−９含有培地のサンプルを、バイオラド・ミニサブセル(Biorad Mini-S
ubcell) 装置において５％濃縮用／１５％分離用ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上で、先に記載(Sambrook, J., et al.,"In: Molecular Cloning": A Laborator
y manual, (N. Ford and C. Nolan, eds) Vol. 3, 2nd Ed., 3 vol., Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA (1989)) のようにして
電気泳動させ、続いてＰＶＤＦ膜に移した。該膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中５％無脂肪ミルク中で一晩ブロックした
。マウス抗ヒトＧＤＦ−９モノクローナル抗体（上記）をブロッキング溶液中１
：１０００希釈で使用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた抗
マウス二次抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Southern Biotec
hnology Associates) 、バーミンガム、アラバマ州）をブロッキング溶液中１：
２５００希釈で使用した。ＥＣＬウエスタン検出試薬（ピアス(Pierce)、ロック
フォード、イリノイ州）を用いる化学発光及びオートラジオグラフィーのフィル
ムはシグナルを検出した。デンシトメーター（モレキュラー・ダイナミクス（Mo
lecular Dynamics））及びイメージクアント(Imagequant)ソフトウェアを用いて
バンドを定量し、ならし培地中のＧＤＦ−９のシグナル強度を、同時に測った既
知濃度のＧＤＦ−９標品のものと比較することにより、ならし培地中のＧＤＦ−
９の濃度を測定した。組換えマウスＧＤＦ−９のいくつかのバッチがこれの実験
過程中に生じ、それらはすべて、ウエスタンブロット定量に基づく類似の活性（
すなわち、対生物作用に相関する免疫反応性）を有するようであった。

【００５６】顆粒膜細胞の単離及び培養２１〜２４日齢の雌ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウス（ベイロール医科大学）に、７
．５ＩＵのＧｅｓｔｙｌ（ジオシンス(Diosynth)，Ｂ．Ｖ．、オランダ）を注射
し、４４〜４８時間後、卵巣を集め、脂肪及び周辺細胞のないように切り出し、
０．３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ
／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨー
ク）及び０．３％ＢＳＡ（シグマ）を加えた２５ｍＭＨＥＰＥＳを含む最少必
須培地中に入れた。

【００５７】壁在性顆粒膜細胞は、大卵胞腔卵胞を穿刺することにより放出された卵母細胞及び卵丘細胞−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を注意深く取り出し（下記
参照）、多数の卵巣由来の顆粒膜細胞をプールし、遠心分離し、２０％ウシ胎仔
血清（ハイクローン・ラボラトリーズ(Hyclone Laboratories)、ローガン、ユタ
州）の存在下又は非存在下、及びヒツジＦＳＨ（ナショナル・ホルモン・アンド
・ピチュイタリー・プログラム（National Hormone and Pituitary Program））
のパーロウ(Parlow)博士のご好意により提供されたＮＩＤＤＫ−ｏ−ＦＳＨ−２
０）の存在下又は非存在下で、２×顆粒膜細胞培養培地（ＧＣＭ）：０．６ｍｇ
／ｍｌのＬ−グルタミン、２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．２ｍｇ／ｍｌのス
トレプトマイシン及び２×インスリン輸送亜セレン酸塩（ギブコＢＲＬ）を含む
αＭＥＭ（ギブコＢＲＬ）中に再懸濁した。ＧＤＦ−９含有培地又は対照ならし
培地を、α−ＭＥＭ中２×最終濃度まで希釈した。等容量の２×ＧＤＦ−９含有
培地又は対照培地を、２×培養培地中の顆粒膜細胞と合わせ、５％ＣＯ₂を含む
加湿雰囲気下、３７℃で培養した。さまざまな期間での培養後、非接着細胞を培
地で小球形にし(pelleted)、培地を−２０℃で保存した。顆粒膜細胞を溶解させ
、全ＲＮＡをＲＮＡＳｔａｔ−６０（リード・メディカル・ラボラトリーズ（
Leedo Medical Laboratories）、ヒューストン、テキサス州）を用い、製造業者
のプロトコルに従って単離した。

【００５８】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析各ＲＮＡサンプル由来のオリゴ−ｄＴでプライミングしたｃＤＮＡを、Ｓｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ）を用い、製造業者のプロトコルに
従って合成した。１μｌの各ＲＴ反応物（全体の１／２０）を、遺伝子特異的オ
リゴヌクレオチドでプライミングされた各２５μｌのＰＣＲ反応物において使用
した。マウスＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現を、１．４ｋｂイントロンに広がる5'GCTT
GACCCTGCCTCATCTGTGG 3'（配列番号：１）（センス）プライマー及び5'CTGGTTCA
GCCATCTCAGATATT 3'（配列番号：２）（アンチセンス）プライマー（Fulop, C.,
et al., Arch. Biochem. Biophys., 337:261-266(1997))を用いて検出した。４
０３ｂｐのＰＣＲ産物は、ＲＮＡから増幅し、混入ＤＮＡの増幅から容易に識別
される。マウスｕＰＡｍＲＮＡ発現は、全長１．４ｋｂの２つのイントロンに
広がる5'GTTCAGACTGTGAGATCACTGG 3' （配列番号：７）（センス）プライマー及
び5'CAGAGAGGACGGTCAGCATGG 3'（配列番号：８）（アンチセンス）プライマーを
用いて検出した。４３４ｂｐのＰＣＲ産物は、ＲＮＡから増幅する。マウスヒポ
キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を、未知の大きさの
３つのイントロンに広がり、かつＲＮＡ由来の大きさ３０９ｂｐの推定ｍＲＮＡ
由来産物を与える5'CCTGGTTAAGCAGTACAGCC 3' （配列番号：５）（センス）プラ
イマー及び5'TACTAGGCAGATGGCCACAG 3' （配列番号：６）（アンチセンス）プラ
イマーを用いて検出した。マウスＳｔＡＲｍＲＮＡ発現は、多数の小イントロ
ンに広がり、かつｍＲＮＡ由来の５２２ｂｐ産物を与える5'TCGCTTGGAGGTGGTGGT
AGAC 3' （配列番号：９）（センス）プライマー及び5'GCAGGTCAATGTGGTGGACAGT
3' （配列番号：１０）（アンチセンス）プライマーを用いて検出した。マウス
コレステロール側鎖切断Ｐ−４５０ｍＲＮＡ発現は、5'GCCAACATTACCGAGATGC 3'
（配列番号：１１）（センス）プライマー及び5'CGAACACCCCAGCCAAAGCC 3' （配
列番号：１２）（アンチセンス）プライマーを用いて検出し、ｍＲＮＡ由来の４
２６ｂｐ産物を与える。マウスＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現は、5'CTCCTTTTCAACCA
GCAGTTCC 3' （配列番号：１３）（センス）プライマー及び5'TCTGCAGCCATTTCCT
TCTCTC 3' （配列番号：１４）（アンチセンス）プライマーを用いて検出し、３
７７ｂｐ産物を与える。マウスＬＨレセプターｍＲＮＡ発現は、多数のイントロ
ンに広がり、かつ５１６ｂｐ産物を与える5'CTTATACATAACCACCATACCAG 3'（配列
番号：１５）（センス）プライマー及び5'ATCCCAGCCACTGAGTTCATTC 3' （配列番
号：１６）（アンチセンス）プライマーを用いて検出した。顆粒膜細胞ｃＤＮＡ
から増幅したＰＣＲ産物を最初に単離し、サブクローニングし、配列決定し、そ
れらが公表された配列にマッチすることを確認した。後の実験で、［α³²Ｐ］−
ｄＣＴＰを各ＰＣＲ反応に加え、産物を４％ポリアクリルアミドゲル上での電気
泳動により分離した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーに供し、放射活性
バンドを、モレキュラー・ダイナミクス・ホスファーイメージャー（Molecular
Dynamics Phosphorimager ）（Ｓｔｏｒｍ８６０）上で定量した。

【００５９】ノーザンブロット解析全ＲＮＡを顆粒膜細胞から単離し、リボグリーン(Ribogreen) ＲＮＡ定量試薬
（モレキュラープローブス、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いる蛍光定量法により４
８５〜４９５ｎｍ励起フィルターと５１５〜５２５ｎｍ放射フィルターを用いた
VersaFluor蛍光計（ＢＩＯＲＡＤ、Hercules、ＣＡ）で定量した。各サンプルの
全ＲＮＡ１５μｇを１．２％アガロース／７．６％ホルムアルデヒドゲル上で電
気泳動し、ハイボンド(Hybond)Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、アーリントン
ハイツ、ＩＬ）に移した。ＳｔｒｉｐＥＺプローブ合成キット（Ａｍｂｉｏｎ
、オースチン、ＴＸ）を用いた〔α³²Ｐ〕−ｄＡＴＰでランダムプライミングに
よりＨＡＳ２用及びｕＰＡ用のプローブを前記のサブクローニングしたＰＣＲ産
物から生成した。膜をハイブリダイズし、洗浄して、記載したようにオートラジ
オグラフィーに供した（マーモウジ(Mahmoudi,M.) とリン(Lin, V.K.) 、Biotec
h.,7:331-332(1989)) 。製造業者のプロトコルに従い、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ除去試
薬（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて膜からプローブを除去した。次いで、負荷対照とし
てグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用
いて同じブロットをリプローブした。各プローブのシグナルをモレキュラー・ダ
イナミックス・ホスファーイメージャーで定量した。

【００６０】プロゲステロンラジオイムノアッセイ製造業者の使用説明書に従い、ダイアグノスチック・プロダクツ・コーポレー
ション(Diagnostic Products Corporation) （ロサンゼルス、ＣＡ）製のキット
を用いた特異的固層ラジオイムノアッセイで培地中のプロゲステロンを２回測定
した。このアッセイの感度は、０．０２ｎｇ／ｍｌであり、０．１〜４０ｎｇ／
ｍｌの較正標準を用いた。

【００６１】卵母細胞切除(oocytectomized)複合体の拡張前記のように卵丘（cumulus)細胞−卵母細胞複合体を回収した。前記のように
マイクロ注射器を用いて各複合体から卵母細胞を取り出した（バクシオン（Bucc
ione,R.)ら、Dev. Biol.,138:16-25(1990)) 。卵質の大部分と共に卵核胞を除去
することにより成功した卵母細胞切除を評価した。１００ｎｇ／ｍｌＧＤＦ−
９の存在下又は非存在下で１０％ウシ胎仔血清と１μｇ／ｍｌｏＬＨを有して
いるか有していない５ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌのｏＦＳＨを補足した顆
粒膜細胞培地２０μｌ液滴中で卵母細胞切除複合体を１８時間一まとめにしてイ
ンキュベートした。写真は、ニコン倒立顕微鏡でとった。

【００６２】結果マウス卵巣におけるＧＤＦ−９の免疫組織化学的検出ヒトＧＤＦ−９に対するモノクローナル抗体を用い、マウス卵巣においてＧＤ
Ｆ−９タンパク質を特異的に検出した。低倍率の免疫組織化学的染色した卵巣で
ＧＤＦ−９免疫反応性を卵母細胞のみで検出し、一方、ＧＤＦ−９欠損卵巣中の
卵母細胞は染まらなかった。始原（２型）卵母細胞は、ＧＤＦ−９ｍＲＮＡ発現
の非存在と一致して陰性であった（マクグラス（McGrath,S.A.) ら、Mol. Endoc
r.,9:131-136(1995)) 及びエルビン(Elvin) とマズック(Matzuk)、未公開のデー
タ）。始めに低い（及び様々な）レベルで３ａ型卵胞（卵母細胞の周囲に同心層
に配置された２０未満の立方顆粒膜細胞を有する卵胞）の卵母細胞においてＧＤ
Ｆ−９免疫反応性を観察し、３ｂ型及びその後の卵胞の卵母細胞においてはより
高いレベルで観察した。多層前卵胞腔卵胞の完全に成熟した卵母細胞は一貫して
より強くＧＤＦ−９について染色され、大卵胞腔卵胞及び排卵前卵胞の卵丘細胞
−卵母細胞複合体の卵母細胞においてＧＤＦ−９免疫反応性をはっきりと検出し
た。分泌されたペプチドについて予期したように、ＧＤＦ−９免疫反応性は卵核
胞（例えば、核）から排除された。興味深いことに、おそらく卵母細胞小胞体及
びゴルジ複合体の中の前駆体型のＧＤＦ−９の検出により、非対称の染色パター
ンが卵母細胞内で頻繁に観察された〔ワシャーマン（Wasserman,P.M.) 及びアル
バーチニ(Albertini,D.F.)、"The mammalian ovum", In: クノービル(E. Knobil
) とネイル(J. Neill)（編) The physiology of reproduction, Raven Press 、
ニューヨーク、79-122頁（1994) 〕。従って、全ての成熟卵胞の卵母細胞により
ＧＤＦ−９ｍＲＮＡ及びタンパク質が合成され、このことは、それが卵胞形成（
folliculogenesis) の全ての段階で作用しうることを示す。

【００６３】組換えマウスＧＤＦ−９の産生卵胞形成の後期段階でのＧＤＦ−９の作用を研究するため、組換えＧＤＦ−９
を産生することが必要であった。全長マウスＧＤＦ−９ｃＤＮＡと、プレプロペ
プチド配列開裂酵素であるＰＡＣＥ用ｃＤＮＡの両方を含む発現ベクターを用い
て、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を安定的にトランスフェクトし
た。マウスＧＤＦ−９発現ベクターを含むＣＨＯ細胞由来の培地のウエスタンブ
ロット解析は変性条件下で分析し、模擬（mock) ならし培地に存在していない、
分子量約２１ｋＤと６０ｋＤの２つの特有のバンドを示した。四塩基Ｒ−Ｒ−Ｒ
−Ｒ部位でのＧＤＦ−９のタンパク質分解プロセッシングは、予期される分子量
約１５．６ｋＤを有する１３５アミノ酸のカルボキシル末端成熟ペプチドを生じ
ることが予期されるだろう（マクフェロン（McPherron,A.C.) とリー(Lee, S.-J
.),J. Biol. Chem., 268:3444-3449(1993)) 。成熟ＧＤＦ−９配列は、一本鎖の
Ｎ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ³²⁵−Ｌｅｕ³²⁶−Ｓｅｒ³²⁷）を含む。優勢
な２１ｋＤ型は、１つのＮ結合オリゴ糖を有する、マウスＧＤＦ−９の開裂した
成熟単量体型に相当するだろう。このバンドは、ＣＨＯ細胞中で合成された組換
えヒトＧＤＦ−９と同一の位置に泳動した。６０ｋＤのバンドは、グリコシル化
された非プロセッシング（プロホルモン）型（４４１アミノ酸）に相当し、これ
はまた培地内に分泌されている。これら２つの型の分子量の増加はＮ結合グリコ
シル化によることを確認するため、ＧＤＦ−９含有培地をＮ−グリカナーゼで処
理し、Ｎ結合オリゴ糖を除去した。この処理は、２１ｋＤのバンドのサイズを１
６ｋｄ、即ち細菌により産生されたＧＤＦ−９成熟ペプチドと同じ分子量に減少
し、また６０ｋＤのバンドを５０ｋＤに減少した。２１ｋＤグリコシル化ＧＤＦ
−９型は常に最も豊富にある型であるので、ＰＡＣＥの存在下及び血清を含まな
い培地条件下で哺乳類細胞において組換えグリコシル化ＧＤＦ−９を産生すると
いうこのストラテジーは効率的である。

【００６４】組換えＧＤＦ−９によるヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）及びｕＰＡｍＲ
ＮＡ合成の調節卵母細胞は、ヒアルロン酸合成を刺激し、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性
化因子（ｕＰＡ）を阻害し、インビトロの卵丘拡張を引き起こすことが知られて
いる成長因子を分泌する（サルシトリ（Salustri, A.) ら、Zygote, 4:313-315(
1996))。ヒアルロナンシンターゼ２（ＨＡＳ２）は、ゴナドトロピンの急増後及
び効率的な卵丘拡張の直前のマウス卵丘細胞−卵母細胞複合体において発現され
（フロップ（Fuelop, C.) ら、Arch. Bioch. Bioph., 337:261266(1997))、卵丘
拡張に関与する主要なヒアルロン酸シンターゼとして包含される (スピサー(Spi
cer,A.P.) ら、J. Biol. Chem.,271-23400-23406(1996)) 。ＧＤＦ−９が、ヒア
ルロン酸マトリックス合成を増加し、かつヒアルロン酸マトリックス分解を低減
することを通して卵丘拡張を誘導する原因である卵母細胞分泌因子であるかを決
定するため、組換えマウスＧＤＦ−９で処理した、新たに単離された顆粒膜細胞
においてＨＡＳ２及びｕＰＡの発現レベルを調べた。特定産物への放射標識ヌク
レオチドのＲＴ−ＰＣＲ組み込みを用いて、対照とＧＤＦ−９処理した顆粒膜細
胞の培養物におけるＨＡＳ２とｕＰＡの発現レベルをモニターした。まず、３遺
伝子（即ち、ＨＡＳ２、ｕＰＡ及びＨＰＲＴ）の各オリゴヌクレオチド対につい
ての産物増幅の直線範囲を確立した。ＰＣＲ反応において放射標識〔α−³²Ｐ〕
−ｄＣＴＰを用い、同じサンプルを１６〜２２サイクルで増幅してオートラジオ
グラフィーのフィルムのフォトデンシトメトリー分析を用いて定量した。増幅産
物の直線的な増加をＨＰＲＴについては１６〜２０サイクル、ＨＡＳ２について
は１６〜２０サイクル、ｕＰＡについては１８〜２２サイクルで対照とＧＤＦ−
９処理したサンプルの両方から観察した。１８〜２０サイクルを最適のものと決
定し、全てのさらなる分析において全ての３遺伝子産物を研究するのに使用した
。同様のＰＣＲ条件をＣＯＸ−２、ＬＨレセプター、Ｐ−４５０ｓｃｃ、及びＳ
ｔＡＲ研究について行った（下記参照）。

【００６５】次いで、組換えＧＤＦ−９とＨＡＳ２ｍＲＮＡ合成との間の用量反応関係を調
べた。卵母細胞ならし培地にさらされた卵丘細胞又は壁在性顆粒膜細胞によるヒ
アルロン酸の合成速度は、培養中６〜１２時間でピークに達した（サルストリ（
Salustri, A.) ら、J. Biol. Chem.,264:13840-13847(1989)及びド・アレサンド
リス(D'Alessandris, T.E.) ら、J. Biol. Chem.,272:4787-4794(1997)) 。従っ
て、用量反応実験に関して、顆粒膜細胞を様々な濃度の組換えＧＤＦ−９の非存
在下又は存在下で５時間培養した。半定量的なＲＴ−ＰＣＲを用いて、１０ｎｇ
／ｍｌの組換えＧＤＦ−９によりＨＡＳ２発現においてわずかの増加を検出する
ことができる。３０〜３００ｎｇ／ｍｌの間の組換えＧＤＦ−９のレベルは、３
０〜１２０ｎｇ／ｍｌの間に生じる比較的直線的な用量／反応を伴う強いＨＡＳ
２誘導を与えた。プライミングしていない未成熟のマウス卵巣から回収した顆粒
膜細胞も組換えＧＤＦ−９に同様に応答した。対照的に、組換えマウスＢＭＰ−
１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又は組換えヒトＢＭＰ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）は、ど
の顆粒膜細胞アッセイで試験しても、ＨＡＳ２発現を刺激したり、又はｕＰＡ発
現を抑制することができなかった。これらの所見は、これらの活性がＧＤＦ−９
に特異的であり、他の卵母細胞分泌ＴＧＦ−βファミリーメンバーがこれらの活
性に応答することができないことを示している。

【００６６】１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９を用いたＨＡＳ２発現パターンのタイムコース
分析（０〜２４時間）は、２時間でＨＡＳ２ｍＲＮＡのわずかな誘導、培養３〜
５時間の間にピーク誘導、及び培養９時間までにＨＡＳ２発現レベルが低減する
ことを示した。ＧＤＦ−９の非存在下で０〜２４時間培養した顆粒膜細胞は、Ｇ
ＤＦ−９誘導ピークレベルに比べて１０倍を超える低いレベルのＨＡＳ２を発現
し、これらの細胞における非常に低いレベルの基礎的活性を示す。ＧＤＦ−９非
存在下で培養した対照顆粒膜細胞におけるｕＰＡ発現についてのタイムコースは
、ｕＰＡレベルが培養中の最初の９時間にわたって増加することを示した。しか
しながら、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＧＤＦ−９で処理された顆粒膜細胞は、検
出可能な、しかし、非常に低いレベルのｕＰＡ発現を維持した。５時間で、ＧＤ
Ｆ−９処理したサンプル由来のバンド強度は、対照の約１５％であり、９時間で
対照処理サンプルのバンド強度（各サンプルについてＨＰＲＴに標準化した）の
約９％であった。

【００６７】ＲＴ−ＰＣＲによって示されるようなＨＡＳ２及びｕＰＡ発現に対するＧＤＦ
−９の効果を確認するため、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在下又は非存在下
でのノーザンブロット解析により一次顆粒膜細胞におけるＨＡＳ２の発現を調べ
た。各サンプルからの全ＲＮＡ（５０ｎｇ／ｍｌＧＤＦ−９の存在下又は非存
在下での０又は５時間インキュベーション時点）を、ノーザンブロット解析に供
し、ＨＡＳ２又はｕＰＡプローブのいずれかと、次いでＧＡＰＤＨプローブとハ
イブリダイズさせた。シグナルをホスファーイメージャーでＨＡＳ２とｕＰＡレ
ベルについて定量し、ＧＡＰＤＨに標準化した。ＨＡＳ２は、対照サンプルにお
いて０時間で又は培養５時間後に壁在性顆粒膜細胞でかろうじて検出可能であっ
た。しかしながら、ＧＤＦ−９とのインキュベーションの５時間後、４．８ｋｂ
及び３．２ｋｂの両方のＨＡＳ２ｍＲＮＡ型（スピーサー（Spicer,A.P.)ら、J.
Biol. Chem.,271:23400-23406(1996)) が対照に比べて９．７倍に増加した。対
照的に、ｕＰＡのノーザンブロット解析は、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９がｕＰ
Ａ合成を対照培地の４０％に抑制したことを示した。従って、ノーザンブロット
のデータは我々のＲＴ−ＰＣＴ分析を確認した。

【００６８】組換えＧＤＦ−９は卵母細胞切除卵丘細胞−卵母細胞複合体の卵丘拡張を引き起
こす未処置の卵丘細胞−卵母細胞複合体をＰＭＳＧ処理した未成熟の雌マウスから
単離した。セットしたトランスジェニックマイクロマニピュレーターを用いて、
これらの複合体由来の卵母細胞に穴をあけ、卵母細胞の内容物を吸い出した。培
養前に、これらの卵母細胞切除卵丘複合体は、空の透明帯を取り巻いている顆粒
膜細胞のいくつかの層からなる直径約１００μｍの球状物であった。培養１８時
間後、対照培地（即ち、ＧＤＦ−９が欠乏しているが、１０％ウシ胎仔血清と５
ｎｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌのＦＳＨを含有する）で培養した卵母細胞切除
複合体２５個のうちの２５個由来の卵丘細胞は、組織培養プレートに付着し、線
維芽細胞の外観を呈する。卵丘細胞が低い又は検出不可能なレベルのＬＨレセプ
ターｍＲＮＡを有するという以前の報告と一致して、ＬＨ（１μｇ／ｍｌ）と共
のこれらの卵母細胞切除複合体（９個のうち９個）のインキュベーションは、そ
の線維芽細胞の外観を変えられなかった。対照的に、同一条件下で単離され、１
００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在下で培養された４４個の卵母細胞切除複合体
のうち４０個は、球状の外観を維持し、三次元のゼラチン状の球体に拡張した。
これらの結果は、ＦＳＨ含有培地で培養した未処置の卵母細胞を有する卵丘細胞
−卵母細胞複合体と類似している。これらの細胞は、大多数の細胞が生体染料で
あるトリパンブルーを除外し続けたので、細胞死によりプレートから分離しなか
った。対照的に、組換えヒトＢＭＰ−６又はＢＭＰ−１５と共の複合体のインキ
ュベーションは、卵丘拡張を生じなかった。これらの観察は、ＧＤＦ−９が特異
的に卵丘拡張を刺激し、このプロセスを通常媒介する卵母細胞由来の因子である
ことを示す。

【００６９】ＧＤＦ−９によるＬＨレセプター及びシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の
調節上記の所見に基づいて、顆粒膜細胞培地におけるＬＨレセプター及びＣＯＸ２
発現に対する組換えマウスＧＤＦ−９の効果を半定量的なＲＴ−ＰＣＲを用いて
決定した。顆粒膜細胞の回収後（Ｔ＝０）、低レベルのＬＨレセプターを検出し
た。ＧＤＦ−９の非存在下で、ＬＨレセプターのレベルはさらに低減したが、発
現は、５時間〜２４時間で増加した。対照的に、ＧＤＦ−９（１００ｎｇ／ｍｌ
）を用いた顆粒膜細胞のインキュベーションは、全ての時点でＬＨレセプターｍ
ＲＮＡ合成を抑制した。１０ｎｇ／ｍｌＦＳＨの存在下でさえ、ＬＨレセプタ
ーｍＲＮＡを１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在下で抑制した。１０ｎｇ／ｍ
ｌのＦＳＨを用いて示された実験において、対照処理した顆粒膜細胞は、ＧＤＦ
−９処理した顆粒膜細胞より約３０倍のＬＨレセプターを発現した（ｐ＜０．０
５、ｎ＝３）。対照的に、ＣＯＸ−２発現は、ＧＤＦ−９の非存在下で低かった
が、１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在下のインキュベーションの２４時間後
、劇的な上昇レベルを示した。ＦＳＨは、対照又はＧＤＦ−９処理した顆粒膜細
胞のいずれかで有意な効果を有しなかったが、ＧＤＦ−９はＣＯＸ−２発現にお
ける５０倍を超える増加を引き起こした。これらのサンプルにおけるＨＡＳ２発
現の分析は、以前の結果と一致した。

【００７０】プロゲステロン合成のＧＤＦ−９調節プロゲステロン合成の調節に対するＧＤＦ−９及びＦＳＨの効果を研究するた
め、用量反応及びタイムコース実験を行った。半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｐ
−４５０ｓｃｃｍＲＮＡ合成及びＳｔＡＲｍＲＮＡ合成を分析し、ラジオイ
ムノアッセイを用いて、培地中に分泌されたプロゲステロンを分析した。５０ｎ
ｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在下又は非存在下で様々な量のＦＳＨを含む３つ組の
ウェルで４時間培養した顆粒膜細胞から培地を回収し、ラジオイムノアッセイで
プロゲステロンについてアッセイした。これらの条件下、ＦＳＨの非存在下又は
低レベルのＦＳＨで４時間培養した顆粒膜細胞は、非常にわずかなプロゲステロ
ンを産生した。一方、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９と共に培養した顆粒膜細胞は
５〜７倍高い量のプロゲステロンを産生した（Figure４Ａ）。ＧＤＦ−９の存在
下又は非存在下で０又は１０ｎｇ／ｍｌのＦＳＨを有する１０％ＦＣＳを含有す
る培地で顆粒膜細胞を２４時間インキュベートした。しかしながら、５ｎｇ／ｍ
ｌのＦＳＨの存在下で産生されたプロゲステロンの量は、ＧＤＦ−９の存在又は
非存在により有意に影響を受けず、ＧＤＦ−９のみの存在下又は低レベルのＦＳ
Ｈで産生されたものより約２〜３倍多かった。２４時間のインキュベーション後
、ＧＤＦ−９のみが有意に高い量のプロゲステロンを誘導したが、高濃度のＦＳ
Ｈ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下では、ＧＤＦ−９の効果はごくわずかであった（
Figure４Ｂ）。これらのデータは、プロゲステロンのＦＳＨとＧＤＦ−９の刺激
が相加的なものでないことを示している。

【００７１】ＦＳＨとＧＤＦ−９が顆粒膜細胞培養物においてプロゲステロン合成をどのよ
うに調節するかを決定するために、ＦＳＨの存在下又は非存在下、或いはＧＤＦ
−９の存在下又は非存在下での２４時間インキュベーション後の半定量的ＲＴ−
ＰＣＲによりＰ−４５０ｓｃｃ及びＳｔＡＲｍＲＮＡのレベルを分析した（Fi
gure４Ｃ−４Ｄ）。一方、１０ｎｇ／ｍｌのＦＳＨは、Ｐ−４５０ｓｃｃのわず
かな増加を引き起こし、ＧＤＦ−９の存在は何ら効果を有していなかった。対照
的に、ＧＤＦ−９は、ＳｔＡＲｍＲＮＡレベルの２〜５倍誘導を生じた（ｐ＜
０．０５）。これらの結果は、ＦＳＨとＧＤＦ−９が異なる機構を経て重要なプ
ロゲステロン合成を調節するように作用していることを示している。

【００７２】考察免疫組織化学的分析を用いて、ＧＤＦ−９タンパク質はまず一次卵胞（３ａ型
卵胞）の成熟している卵母細胞内で低レベルで検出され、３ｂ型の卵胞完全成熟
卵母細胞においてより高いレベルで存在し、そして続く各発生段階の卵母細胞に
おいて検出されることが本明細書に示される。さらに、卵母細胞が密接に顆粒膜
細胞と結合している大卵胞腔卵胞及び排卵前卵胞の卵母細胞によってもＧＤＦ−
９タンパク質は合成されていることが示されている。ＧＤＦ−９タンパク質は３
ａ型卵胞の卵母細胞で検出されるが、それは３ｂ型〜４型の卵胞移行での卵胞形
成にのみ必須となる。このことは、ＧＤＦ−９シグナル伝達カスケードが３ｂ型
卵胞段階の前には活性でないことを示す。

【００７３】本明細書に示すように、ＧＤＦ−９は、排卵前卵胞において生じるプロセスに
典型的なＨＡＳ２誘導とｕＰＡ抑制を分析したアッセイにおいて、卵母細胞と卵
母細胞ならし培地のかわりとなり得た。本明細書でも示すように、他の卵母細胞
発現ＴＧＦ−βファミリーメンバーであるＢＭＰ−１５とＢＭＰ−６は、これら
の顆粒膜細胞アッセイにおいてＧＤＦ−９の代用とすることができなかった。組
換えＧＤＦ−９で処理した卵胞腔卵胞から単離した壁在性顆粒膜細胞を誘導して
、用量依存方式及び時間依存方式でＨＡＳ２を発現した。ＧＤＦ−９は、ＨＡ合
成に対する卵母細胞の最大の効果に十分相当する壁在性顆粒膜細胞において、約
１０倍以上高いレベルのＨＡＳ２ｍＲＮＡを誘導した。さらに、ＧＤＦ−９に関
する用量反応曲線は、卵母細胞ならし培地のものと非常に似ていた。非常に低い
投与量（例えば、０．５卵母細胞／μｌ又は１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９）はヒ
アルロン酸合成又はＨＡＳ２発現の非常に低いが検出可能な増加を誘導し、一方
、１卵母細胞／μｌ又は３０〜５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９は、２〜４卵母細胞
／μｌ又は１２０〜３００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９で安定状態に達するより大き
く劇的な誘導を引き起こした（サルストリ（Salustri, A.) ら、Dev. Biol.,138
:26-32(1990)) 。ＧＤＦ−９作用のタイムコースも、卵母細胞産生因子に関する
以前のデータと一致した。一方、ＨＡＳ２ｍＲＮＡは、ＧＤＦ−９を用いた培養
２時間までに誘導され、卵母細胞誘導されたヒアルロン酸は、２．５時間後に低
レベルで検出可能となった（サルストリら、J. Biol. Chem.,264:13840-13847(1
989)) 。ＧＤＦ−９は、ピークのＨＡＳ２ｍＲＮＡレベルは３〜５時間の間に誘
導され、一方、卵母細胞誘導ヒアルロン酸合成の速度は６〜１２時間の間に最大
になった（サルストリら、J. Biol. Chem.,264:13840-13847(1989)) 。同様に、
卵母細胞誘導ヒアルロン酸合成は、１２時間後に低下し、１８時間後にヒアルロ
ン酸それ以上生成されなかった（ド・アレッサンドリス(D'Alessandris, T.E.)
ら、J. Biol. Chem.,272:4787-4794(1997)) ；ＧＤＦ−９誘導ＨＡＳ２発現は、
２４時間までに低下し、ｕＰＡ合成は２４時間までに増加した。この期間の間の
ＨＡＳ２発現及びヒアルロン酸合成の活性化並びにｕＰＡ合成の増加という「一
過性の」性質は、培地中のＧＤＦ−９の不安定性、ＧＤＦ−９レセプターのダウ
ンレギュレーション、顆粒膜細胞のＧＤＦ−９誘導性分化、及び／又はＧＤＦ−
９シグナル伝達カスケード内の負のフィードバック機構の刺激によるものであろ
うと思われる。これらのプロセスのいくつかを調節する卵母細胞分泌因子は不安
定であると認められていること、及び顆粒膜細胞を含む様々な同時培養物(co-cu
ltures) における卵母細胞の継続的な存在が継続的な活性に必要とされることが
認められることは興味深い（エッピッグ（Eppig, J.J.)ら、Biol. Reprod.,56:9
76-984(1997)) 。最後に、本明細書に記載されたデータは、壁在性顆粒膜細胞と
拡張している卵丘顆粒膜細胞とのインビボ表現型での違いが細胞自身に固有のも
のでないが、それらの卵母細胞への近接と、卵母細胞産生ＧＤＦ−９の濃度勾配
によることを示している。

【００７４】コレステロールのプレグネノロンへの変換は、顆粒膜細胞ステロイド産生にお
ける速度測定段階である。プレグネノロン合成の速度は、反応を触媒する酵素シ
トクロムＰ−４５０側鎖切断（Ｐ−４５０ｓｃｃ）のレベルと活性、及びステロ
イド産生早期調節タンパク質（ＳｔＡＲ）の刺激を介する基質コレステロールと
の接近に依存している（レンナート（Rennert, H.)ら、"Intracellular cholest
erol dynamics in steroidogenic cells" 、In: アダシ(L.C. Adashi,E.Y.)ら（
編）The Ovary 、ラベンプレス社(Raven Press, Ltd.) 、ニューヨーク、147016
4 頁(1993)) 。ＦＳＨ誘導された及びＬＨ誘導された細胞内ｃＡＭＰの増加は、
続くＰ−４５０ｓｃｃの刺激、ＳｔＡＲｍＲＮＡ合成及びＳｔＡＲタンパク質リ
ン酸化を導き、インビトロのプロゲステロン合成を刺激することが十分確立され
ている（リチャーズ（Richards, J.S.) とヘジン(Hedin, L.) 、Annu. Rev. Phy
siol.,50:441-463(1988); クラーク(Clark, B.J.) ら、Mol. Endocr.,9:1346-55
(1995)及びアラカン(Arakane, F.) ら、J. Biol. Chem.,272:32656-62(1997))。
ＧＤＦ−９処理で見られる効果に対比して、アクチビンＡは、基底及びＦＳＨ刺
激Ｐ−４５０ｓｃｃ、３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ
）及びブロゲスロン合成をジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）刺激ラット由
来の培養した顆粒膜細胞により低減した。本明細書で記載されたデータは、ＦＳ
Ｈがマウス顆粒膜細胞においてＰ−４５０ｓｃｃｍＲＮＡ合成を刺激すること
を確認しているが、ＧＤＦ−９がＰ−４５０ｓｃｃｍＲＮＡ合成に有意に作用
しなかったことを示している。対照的に、ＦＳＨは、ＳｔＡＲｍＲＮＡに対す
る誘導的な効果をわずかしか有していないが、ＦＳＨを有している又は有してい
ないＧＤＦ−９は、ＳｔＡＲ発現を有意に誘導する。結果として、ＧＤＦ−９と
ＦＳＨは共に、顆粒膜細胞によるプロゲステロン産生を非依存的に増加すること
ができ、同じ経路であるが、異なる機構を通して作用するようである。卵丘細胞
によるプロゲステロンのこの局所的な産生は、排卵後及び受精前の卵母細胞のた
めの完全な微環境を達成するのに不可欠でありうるようである。これの証拠だて
として、排卵されたラット卵丘細胞−卵母細胞複合体は測定可能なレベルのプロ
ゲステロンとプロスタグランジン（主にＰＧＥ２）の両方を分泌している（シュ
ーツ(Schuetz, A.W.) とデュビン(Dubin, N.H.) 、Endocr.,108:457-463(1981))
、及びアミノグルテチミド、これはコレステロールのプレグネノロンへの変換を
阻害する、の使用は、インビトロの卵胞成熟後に回復した正常なヒツジ卵母細胞
の数を低減する。

【００７５】本明細書に記載したように、排卵前卵胞におけるＬＨレセプターのインサイチ
ューハイブリダイゼーション分析は、インビボのＬＨ処理後、ＣＯＸ２発現が卵
丘細胞において最高になるのに対し、ＬＨレセプターが卵丘細胞において抑制さ
れるが、壁在性顆粒膜細胞では抑制されないことを示している。本明細書でも記
載しているように、組換えＧＤＦ−９は、ＬＨレセプターｍＲＮＡを抑制するが
、ＣＯＸ−２発現を誘導し、卵丘細胞においてこれらの遺伝子の正常な発現によ
く似ている。しかしながら、エッピッグとその同僚（エッピッグ（Eppig, J.J）
ら、Biol. Reprod.,56:976-984(1997)及びエッピッグら、Mol. Reprod. Dev.,49
:327-332(1998)) は、完全成熟卵母細胞がＬＨレセプターｍＲＮＡ発現を抑制す
るが、前卵胞腔卵胞由来の卵母細胞、中期IIで停止された卵母細胞、又は２細胞
胚が有効なものでないことを簡潔に示した。ノックアウト研究（ドング(Dong, J
.)ら、Nature, 383:531-535(1996) 及びエルビン(Elvin, J.A.) ら、Mol. Endoc
r.（提出された）(1999)) 並びに本明細書で述べられているように、ＧＤＦ−９
は、細胞形態学、遺伝子発現、及びステロイド産生における変化を刺激すること
ができ、少なくとも一次卵胞由来及び卵胞腔卵胞由来の顆粒膜細胞が、ＧＤＦ−
９を結合するレセプターを有していることを示している（本明細書に記載された
所見の概要についてはFigure５を参照のこと）。ＧＤＦ−９は、ＣＯＸ−２発現
のレベルを劇的に増加するため、ＣＯＸ−２発現が卵胞形成のより早い段階で発
現されない理由又はより早い段階の卵母細胞（エッピッグ（Eppig, J.J.)ら、19
97 Biol. Reprod.,56:976-984(1997) 及びエッピッグら、Human Reprod.,12:127
-132(1997)及びエッピッグら、Mol. Reprod. Dev.,49:327-332(1998)）がＬＨレ
セプターを抑制するのに効果が低い理由について明らかでない。ＧＤＦ−９タン
パク質は、卵胞形成の全ての段階で免疫組織化学的なレベルで検出されるが、こ
れはＧＤＦ−９がこれら全ての段階で活性であることを必ずしも証明していない
。一つの可能性として、ＧＤＦ−９前駆体が３ｂ型段階と卵胞腔卵胞段階で活性
な成熟二量体に処理されるだけであることが挙げられる。ＧＤＦ−９処理酵素の
調節は、翻訳後にＧＤＦ−９の活性を調節する一つの方法であろう。他の説明と
して、ＧＤＦ−９調節性及びＧＤＦ−９非依存性の転写因子の両方がＣＯＸ−２
の合成を調節するのに共に作用していることが挙げられる。ＣＯＸ−２の少なく
とも１つのレギュレーターは、転写因子エンハンサー結合タンパク質Ｐ（Ｃ／Ｅ
ＢＰβ）である。Ｃ／ＥＢＰβ、これはｈＣＧ処理後４〜７時間の間誘導される
、は、ＣＯＸ−２プロモーターに結合してＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現をダウンレ
ギュレートする。卵巣におけるＣＯＸ−２発現は、通常ｈＣＧ処理後４時間でピ
ークに達し、一方、ＣＯＸ−２タンパク質は、排卵後、卵丘細胞に存在し続ける
（リム(Lim,H.)ら、Cell,91:197-208(1997))。しかしながら、Ｃ／ＥＢＰβノッ
クアウトマウス〔これは生殖力がない〔ステーネック（Sterneck),1997#279〕〕
において、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡのレベルは増加したままである。また、ＣＯＸ−
２ノックアウトマウスは、排卵欠陥かつ卵母細胞成熟障害により、生殖力がない
（リム(Lim,H.)ら、Cell,91:197-208(1997))。Ｃ／ＥＢＰβ及びＣＯＸ−２ノッ
クアウトモデルからのこれらの研究は、卵丘細胞におけるＣＯＸ−２の適当な調
節が卵母細胞周辺のプロスタグランジンの最適な微環境を維持するのに必要であ
ることを示している。ＧＤＦ−９はＣＯＸ−２誘導の際に関与する因子の１つで
あると思われ、Ｃ／ＥＢＰβはＣＯＸ−２のダウンレギュレーションにある役割
を果たす。本明細書に記載した研究及び他の研究（ロウレンス(Lawrence, T.)ら
、Endocr.,106:1114-1118(1980) 及びメジュリ(Meduri, G.)ら、Endocr.,131:36
6-373(1992))もＬＨが卵丘細胞におけるＣＯＸ−２とＣ／ＥＢＰβの両方の発現
を、ＬＨレセプターがこれらの細胞上に存在しないため、間接的に調節している
ことを示している。しかしながら、いかにしてこれが達成されるのか又はいかに
してＣＯＸ−２が急速に現れ、Ｃ／ＥＢＰβがよりゆっくりと現れるのかは明ら
かでない。

【００７６】実施例４成長分化因子９−欠損卵巣における卵胞欠陥の分子キャラクタリーゼ
ーション材料及び方法実験動物すべての実験マウスは、実験動物の世話及び使用（Care and Use of Laborato
ry Animals）のためのＮＩＨガイドに従って維持した。特に記載のない限り、６
〜１２週齢の成体Ｃ５７Ｂ１／６／１２９ＳｖＥｖハイブリッドマウス由来の卵
巣を、ＲＮＡ単離、並びにインサイチューハイブリダイゼーション及び免疫組織
化学のための標本の両方に使用した。ＣＯＸ−２の実験のため、３週齢マウスに
７．５ＩＵのＧｅｓｔｙｌ（ジオシンス，Ｂ．Ｖ．、オランダ）、次いで、４８
時間後５ＩＵのｈＣＧ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）を腹腔内注射した
。ｈＣＧｕ注射の５時間後、卵巣を回収した。

【００７７】ＲＮＡ単離及びノーザンブロット解析全ＲＮＡを、野生型及びＧＤＦ−９欠損Ｃ５７Ｂ１／６／１２９ＳｖＥｖハイ
ブリッドマウスの種々の組織から、ＲＮＡＳＴＡＴ−６０（リード・メディカ
ル・ラボラトリーズ、ヒューストン、テキサス州）を用い、製造業者の記載のよ
うにして抽出し、分光光度計で定量した。各サンプルの１５μｇの全ＲＮＡを、
１．２％アガロース／７．６％ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させ、Ｈｙｂ
ｏｎｄＮナイロン膜（アマシャム（Amersham) 、アーリントンハイツ、イリノ
イ州）に移した。表２に、これらの実験でプローブを作製するのに使用したすべ
ての特異的ｃＤＮＡ断片の概要を示す。Ｓｔｒｉｐ−ＥＺプローブ合成キット（
アンビオン（Ambion) 、オースチン、テキサス州）を用い、｛α−³²Ｐ｝ｄＡＴ
Ｐでランダムプライミングすることにより、プローブを作製した。膜をハイブリ
ダイズし、洗浄し、記載(Mahmoudi, M. and Lin, V.K., Biotech., 7:331-332(1
989)) のようにオートラジオグラフィーに供した。Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ除去試薬（
アンビオン）を用い、製造業者のプロトコルに従ってプローブを膜から除いた。
次いで、同じブロットを、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰＤＨ）、又は負荷対照として１８ＳリボソームＲＮＡをリプローブ
(reprobe) した。各プローブのシグナルをモレキュラー・ダイナミクス光濃度計
で定量した。

【００７８】

【表２】

【００７９】インサイチューハイブリダイゼーション以下の変更を伴うが本質的に先に記載(Albrecht, U., et al.,"Visualization
of gene expression patterns by in situ hybridization", In: G. P. Daston
(ed) Mol. Cell. Meth. Dev. Toxic., CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 23-48
,(1997))のようにしてインサイチューハイブリダイゼーションを行った。野生型
又はＧＤＦ−９欠損Ｃ５７Ｂ１／６／１２９ＳｖＥｖハイブリッドマウス由来の
新しく切り出した卵巣を、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で一晩固定し、
処理し、パラフィンに包埋した。５μｍ厚の切片を切り取り、記載のようにして
前処理した。表２は、特異的プローブの情報の概要を含む。｛α−³⁵Ｓ｝ＵＴＰ
−標識アンチセンス及びセンスプローブを、リボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ
）Ｔ７／Ｔ３又はリボプローブＴ７／ＳＰ６コンビネーション・システム（プロ
メガ (Promega)、マディソン、ウィスコンシン州) を用いて作製した。スライド
１個あたり５×１０⁶ｃｐｍの各リボプローブを用い、５０％脱イオンホルムア
ルデヒド／０．３ＭＮａＣｌ／２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）／５
ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ８．０）／１０％デキストラン硫
酸／１×デンハート溶液／０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ中で、ハイブリダイゼー
ションを５５℃で１６〜１８時間行なった。６５℃の２×ＳＳＣ／５０％ホルム
アミド及び０．１×ＳＳＳＣの高ストリンジェンシー洗浄を行なった。脱水切片
をＮＴＢ−２エマルジョン（イーストマン・コダック(Eastman Kodak) 、ロチェ
スター、ニューヨーク州）に浸漬し、プローブに応じて２〜１４日間４℃で曝し
た。現像後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、写真撮影のために載置し
た。

【００８０】免疫組織化学卵巣を、２０％中性緩衝ホルマリン中で３時間固定し、処理し、パラフィンに
包埋し、４μｍ厚に細分した。先に記載(Robker,R.L., and Richards,J.S.,Mol.
Endocr.,12:924-940(1998)) のようにして、マウス抗ＰＣＮＡモノクローナル抗
体（ノボカストラ・ラボラトリーズ(Novocastra Laboratories) 、ニューカース
ル(Newcastle upon Tyne) 、英国）を用い、ＰＣＮＡの検出を行なった。ウサギ
抗マウスＰ−４５０ｓｃｃポリクローナル抗血清は、カンザス・メディカル・セ
ンター大学（University of Kansas Medical Center ）のマイケルＪ．ソアレ
ス（Michael J. Soares)氏のご好意による進物であり、２％正常マウス血清（シ
グマ）及び２％正常ヤギ血清（ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories
) 、バーリンゲーム (Burlingame) 、ジョージア州）を含む１×ＰＢＳ、０．０
５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）中１：６２５希釈で使用した。２％正常マウス血
清及び２％正常ヤギ血清を含む１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．１％ＮａＮ₃中におい
て、ウサギ抗−Ｋｉ−６７ポリクローナル抗血清（ノボカストラ）を１：３００
に希釈、ウサギ抗−ｐ２７ポリクローナル抗血清（サンタクルス・バイオテクノ
ロジー社(Santa Cruz Biotechnology,Inc.) 、サンタクルス、カリフォルニア州
）を１：１２５に希釈した。Ｋｉ６７及びｐ２７の両方に対する良好な染色は、
抗原回復（antigen retrieval ）法を必要とした。Ｋｉ−６７染色のために、切
片を、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で３５分間蒸煮した。ｐ２７染色の
ために、切片を、ｐＨ８．０Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ抗原回復溶液中で３５分間蒸煮
した。Ｋｉ−６７、ｐ２７及びＰ−４５０ｓｃｃのために、すべての切片を、０
．０５％ツイーン２０、２％正常マウス血清（シグマ）及び２％正常ヤギ血清を
含む１×ＰＢＳ中で３０分間ブロックし、一次抗体中で１時間室温でインキュベ
ートした。ラット組織で前吸収させた抗マウスＩｇＧビオチニル化二次抗体を含
むスーパー・センシティブ・マウス・アンチボディ・アニマル・ディテクション
（Super Sensitive Mouse Antibody Animal Detection ）キット（バイオジェネ
クス、サンラモン、カリフォルニア州）を用い、ＰＣＮＡ検出を行なった。マウ
ス組織で前吸収させた抗ウサギＩｇＧビオチニル化二次抗体を含むスーパー・セ
ンシティブ・ラビット・アンチボディ・ディテクションキット（バイオジェネク
ス）を用い、Ｐ−４５０ｓｃｃ、ｐ２７及びＫｉ−６７抗体を検出した。ＰＣＮ
Ａ及びＰ−４５０ｓｃｃは、ストレプトアビジンと結合させたアルカリホスファ
ターゼ標識及びニュー・フクシン基質（バイオジェネクス）を用いて検出し、一
方、ｐ２７は、ストレプトアビジンと結合したホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ標識（バイオジェネクス）及びＤＡＢ基質（ベクター・ラボラトリーズ）を
用いて検出した。

【００８１】ＴＵＮＥＬアッセイアポプタグ・プラス・コンプリート・アポトーシス・ディテクション（Apopta
g Plus Complete Apoptosis Detection)キット（オンコル・ラボラトリーズ(Onc
or Laboratories)、ガイサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を用
いる改変ＴＵＮＥＬ法により、製造業者の使用説明書に従って、卵巣をアポトー
シス細胞について染色した。核を、ヨウ化プロピジウム(Propidium iodide)／退
色防止剤(Antifade)を含む培地（オンコル・ラボラトリーズ）で対比染色した。

【００８２】ＲＴ−ＰＣＲ解析対照又はＧＤＦ−９欠損卵巣のいずれかのＲＮＡ１μｇ由来のオリゴ−ｄＴで
プライミングしたｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ギブコＢＲ
Ｌ）を用い、製造業者の使用説明書に従って合成した。１μｌの各ＲＴ反応物（
全体の１／２０）を、イントロン及び８４ｂｐの選択的スプライシングされたエ
キソンに広がるキットリガンド特異的オリゴヌクレオチド：5'CCAGAAACTAGATCCT
TTACTCCT 3' （配列番号：１７）（センス−Ｓ４０３６４のｎｔｓ４９３−５１
７）プライマー及び5'CTGTTGCAGCCAGCTCCCTTAG 3' （配列番号：１８）（アンチ
センスＳ４０３６４の９４３─９１９）プライマーでプライミングされる各２５
μｌＰＣＲ反応において使用した。ＫＬ−１型の増幅により４５０ｂｐの産物が
生じ、ＫＬ−２型の増幅により３６６ｂｐの産物が生じる。生成物を２％アガロ
ースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。

【００８３】結果細胞周期進行未処置の卵母細胞を有するＧＤＦ−９欠損卵胞は、一層のみの顆粒膜細胞を含
み、多層の顆粒膜細胞からなる卵胞を形成しない。ＤＮＡポリメラーゼδ及びサ
イクリン−ｃｄｋ複合体の補因子である増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、Ｇ１中
に発現し、Ｇ１／Ｓ移行を通して増加し、Ｇ２において高く、細胞周期のＭ期で
急激に低下する(Oktay, K. et al., Biol. Reprod., 53: 295-301(1995))。同様
に、顆粒膜核小体の成分であるＫｉ−６７は、Ｇ０を除く細胞周期のすべての期
において発現される(Gerdes, J., et al., J. Immunol., 133:1710-1715 (1984)
) 。最も高い増殖性の顆粒膜細胞は、顆粒膜細胞の大部分がＰＣＮＡ及びＫｉ−
６７陽性である野生型卵胞腔においてみられる。野生型卵巣の３ｂ型（大きな１
層）及び４型（２層）卵胞において、ＰＣＮＡ又はＫｉ６７の免疫組織化学的解
析は、切断面における顆粒膜細胞の＞５０％が陽性（すなわち、陽性は核の強い
赤色染色として定義され、陰性は核及び細胞質の薄い又は散在性の染色として定
義される）であることを示した。これに対し、ＧＤＦ−９欠損卵巣に未処置の卵
母細胞を有する３ｂ型卵胞は、＜１０％陽性染色顆粒膜細胞／切断面を示し、こ
れは、ほぼすべての顆粒膜細胞がＧ０でブロックされることを示した。しかしな
がら、卵母細胞変性のすぐ後、ＧＤＦ−９欠損卵巣の卵胞において顆粒膜細胞分
化が起こり始め、より多くの細胞核がＰＣＮＡ及びＫｉ−６７の両方について陽
性に染色された。ＰＣＮＡ抗体を用いる卵母細胞核染色が、ＧＤＦ−９欠損３ａ
及び３ｂ型の卵胞の成熟中の及び完全に成熟した卵母細胞において検出され、こ
れは、野生型卵巣における一次卵胞から卵胞腔卵胞までの卵母細胞の核における
ＰＣＮＡの存在を示す先の研究(Oktay, K. et al., Biol. Reprod., 53:295-301
(1995)) に一致する。

【００８４】ＴＵＮＥＬ標識ＧＤＦ−９欠損卵巣における正常卵胞発生は、３ｂ型段階で止まり、かつ卵母
細胞消失は、最終的に顆粒膜細胞「分化」をもたらすが、ＧＤＦ−９欠損卵巣の
組織学的検査では、驚いたことにいずれのアポトーシス提示（ａｐｐｅａｒｉｎ
ｇ）細胞も検出されなかった。ＧＤＦ−９欠損卵巣におけるアポトーシス細胞の
相対的な非存在を確認するため、ＤＮＡ末端を蛍光標識するのにＴＵＮＥＬアッ
セイを使用した。野生型退縮卵胞腔卵胞の顆粒膜細胞及び黄体は、多数の陽性標
識細胞を含んだ。これに対し、ＧＤＦ−９欠損卵巣の切片は、卵巣切片あたり２
〜１０個の陽性標識細胞を含んだ。単層卵胞においては陽性染色細胞は認められ
なかったが、変性しつつある卵母細胞を有する卵胞においては、ステロイド合成
性卵胞巣内、又は間質組織内に時折アポトーシス細胞が見られた。したがって、
ＧＤＦ−９の非存在下では、いったん３ｂ型卵胞段階に達すると、顆粒膜細胞の
大部分が休眠状態にとどまり、増殖または死滅しない。

【００８５】細胞周期インヒビターの解析ｐ２１及びｐ２７は、文書による十分な裏付けのある細胞周期インヒビターで
あり、卵巣での黄体形成時の細胞周期停止に関連する(Robker, R. L. and Richa
rds, J. S., Biol. Reprod., 59:476-482 (1998)) 。ＧＤＦ−９ノックアウト卵
巣における顆粒膜細胞の増殖の相対的欠乏に基づき、ｐ２１及びｐ２７の両方の
ｍＲＮＡの発現を、インサイチューハイブリダイゼーション及び免疫組織化学に
よるｐ２７タンパク質により検査した。ｐ２１ｍＲＮＡは、野生型及びＧＤＦ
−９欠損の両方の卵巣において低レベルで遍在的に検出され、野生型退縮卵胞及
び黄体内の分散された(scattered) 細胞並びにＧＤＦ−９欠損卵巣の黄体形成卵
胞巣においては高レベルで検出された。また、野生型卵巣において、ｐ２７ｍ
ＲＮＡは、卵巣全体に低レベルで遍在的に発現したが、野生型卵巣の黄体におい
てより豊富であった。ＧＤＦ−９欠損卵巣においては、単層卵胞の顆粒膜細胞は
検出可能なレベルのｐ２７メッセージを発現し、ＧＤＦ−９欠損卵巣の中央の小
群の細胞はより高レベルを発現した。同様に、核ｐ２７免疫反応性は、野生型黄
体内の黄体形成顆粒膜細胞の大部分、並びにＧＤＦ−９欠損卵巣の黄体形成卵胞
巣内において明らかに検出可能であった。また、ｐ２７核染色の低下は、野生型
及びＧＤＦ−９欠損の両方の単層卵胞の顆粒膜細胞にあり、それは、陰性対照又
は間質細胞における染色よりも明らかに強かった。免疫組織化学によりタンパク
質レベルを推定することは不可能であるが、ＧＤＦ−９ノックアウト卵巣の単層
卵胞と野生型卵巣の単層卵胞との間でｐ２７免疫反応性における劇的な差はない
ようである。これは、ｐ２７タンパク質過剰発が、ＧＤＦ−９欠損卵巣における
一次卵胞段階での卵胞形成のブロックの理由でないことを示す。

【００８６】卵胞膜層発生形態学的に異なる卵胞膜層は、ＧＤＦ−９欠損卵巣において光及び電子顕微鏡
解析により検出することができなかったということが以前に報告されている（Do
ng,J.,et al.,Nature 383:531-535(1996))。しかしながら、顆粒膜細胞基底膜の
外側の線維芽細胞の平板化（ｆｌａｔｔｅｎｅｄ）層は、ＧＤＦ−９欠損卵巣に
おいて３ｂ型卵胞を円形に取り囲む。アンドロゲン産生に必要な卵胞膜細胞特異
的酵素である１７α−ヒドロキシラーゼシトクロムＰ−４５０（１７α−ＯＨ）
のためのプローブで、インサイチューハイブリダイゼーションを行ない、本当に
卵胞膜層が存在することを確認した。野生型卵巣では、１７α−ＯＨを発現する
細胞は、３ｂ型及び４型卵胞に集合し（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）、多層前卵胞腔卵
胞段階までに、ちょうど顆粒膜細胞基底膜の外側に完全な環を形成し始めた。こ
れに対し、ＧＤＦ−９欠損卵巣では、わずか数個の１７α−ＯＨを発現する細胞
が間質細胞に存在、散在し、卵胞には集まらない。これらの１７α−ＯＨ陽性細
胞は、血清ＬＨの上昇に応答している卵胞膜細胞前駆体群であるようである（Do
ng,J.,et al.,Nature 383:531-535(1996))。同様に、卵胞周辺におけるＬＨレセ
プター及びｃ−キットｍＲＮＡの非存在（下記参照）により、卵胞膜細胞層が
形成されないことが確認される。これらのデータは、初期前卵胞腔卵胞に卵胞膜
細胞前駆体を漸増するために、ＧＤＦ−９シグナリングが直接または間接的に必
要とされることを示す。

【００８７】ｃ−キット及びキットリガンド発現の解析ｃ−キット／キットリガンドシグナリング経路が生殖細胞増殖及び卵胞形成に
重要であることが示されている(Besmer,P.,et al., Dev. Suppl.,125-137(1993)
;Huang,E.J.et al.,Dev.Biol.,157:100-109(1993) and Kuroda,H.,et al.,Dev.B
iol.,126:71-79(1988)) 。ノーザンブロット解析により、ｃ−キットｍＲＮＡ
がＧＤＦ−９欠損卵巣において発現されること、及びレベルは野生型卵巣と同等
かわずかに高いことが示された。インサイチューハイブリダイゼーションにより
、ｃ−キットｍＲＮＡは、野生型卵巣の卵母細胞及び卵胞膜−間質細胞に局在
するが、以前に示された（Manova,K.,et al.,Devel.,110:1057-1069(1990) ）よ
うに顆粒膜細胞からは排除された。ＧＤＦ−９欠損卵巣において、ｃ−キット
ｍＲＮＡは卵母細胞のみに局在し、わずかにバックグラウンドレベルの銀粒が他
の細胞株に存在した。

【００８８】ｃ−キット発現の結果とは対照的に、ＧＤＦ−９欠損卵巣におけるキットリガ
ンド発現は、野生型卵巣における発現と比べて３２倍増加した。ＩＧＦ−Ｉは、
初期の前卵胞腔卵胞（ｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅ）の顆粒膜細胞に
おいても発現されるが、ＧＤＦ−９欠損卵巣における発現で同様な増加は示され
ず、これは、キットリガンドの増加が、組織構成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）効
果よりもむしろ特異的な調節性相互作用を呈したことを示す。インサイチューハ
イブリダイゼーションはｍＲＮＡ発現の定量に対して信頼性のある方法ではない
が、野生型卵巣とＧＤＦ−９欠損卵巣との間の相対的な発現レベルは、ハイブリ
ダイゼーション効率及びエマルジョン濃度におけるスライド間の変動性を最少限
にするために、同じスライド上で互いに近接する卵巣の両方の型由来の切片のポ
ジショニングにより比較しうる。これらの条件下では、キットリガンド発現は、
野生型卵巣においてかろうじて検出され、バックグラウンドを超えるかすかなシ
グナルが前卵胞腔卵胞の顆粒膜細胞において現れた。これに対し、ＧＤＦ−９欠
損卵巣においては、キットリガンドの顆粒膜細胞発現は豊富であった。３ａ型及
び初期３ｂ型の卵胞は、検出可能なレベルのキットリガンドを有し、一方で、最
も大きな単層卵胞は、より強い染色を示した。成体卵巣の多層卵胞により産生さ
れるパラクリン因子がキットリガンド発現を抑制する場合には、１０、１７及び
２８日齢の野生型マウス由来の卵巣を検査した。キットリガンドは、前卵胞腔卵
胞の数の増加によりこれらの未成熟卵巣において検出されるのがいくぶん安易で
あったが、卵胞あたりの相対的な発現レベルは、同様の齢でのＧＤＦ−９欠損卵
巣においてみられるレベルと同等ではなかった。キットリガンド発現は、おそら
く卵母細胞変性を行なう運命である非対称性卵胞内の顆粒膜細胞においてさらに
増加した。しかしながら、卵母細胞が変性したすぐ後で、キットリガンド発現は
消失し、また、卵胞巣にも存在しなかった。

【００８９】ＫＬ、ＫＬ−１及びＫＬ−２の選択的スプライシングされる形態には２つあり
、それらは８４ｂｐ異なる。この交互のスプライシングは、タンパク質分解部位
を含むＫＬ−１において、２８個のアミノ酸の付加をもたらす。膜結合ＫＬは、
遊離したＫＬ、ＫＬ−２よりもより活性で、より安定であるので、細胞結合形は
、結果的により有効である(Besmer,P.,et al., Dev. Suppl.,125-137(1993)) 。
ＫＬ−１をＫＬ−２と区別しうるプライマーを用いる非定量的ＲＴ−ＰＣＲによ
り、ＫＬの両方の形態が、野生型及びＧＤＦ−９欠損の両方の卵巣において検出
された。ＧＤＦ−９欠損卵巣におけるＫＬタンパク質の免疫組織化学的解析によ
り、ＫＬｍＲＮＡと同じ発現パターンが示され、非対称性卵胞において最も強
い染色が生じた。総合すると、これらの結果は、ＧＤＦ−９が、顆粒膜細胞にお
けるキットリガンド発現をパラクリン様式にて負に調節すること、及び活性なＫ
Ｌタンパク質が合成されることを示す。

【００９０】ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー（アクチビン、インヒビン、フォリスタ
チン）アクチビン及びインヒビンは、インビボ及びインビトロの両方における顆粒膜
細胞増殖及び卵胞成熟の調節に関係している(Mather,J.P.,et al.,Proc.Soc.Exp
.Biol.Med,215:209-222(1997) and Matzuk,M.M.,et al.,Rec.Prog.Horm.Res.,51
:123-157(1996)) 。インヒビンα、アクチビンβＡ、アクチビンβＢ及びアクチ
ビン結合タンパク質であるフォリスタチンの発現レベル及び発現パターンを、野
生型及びＧＤＦ−９欠損卵巣において検査した。ノーザンブロット解析では、驚
いたことに、ＧＤＦ−９欠損卵巣と野生型卵巣とで、インヒビンαが類似のレベ
ルで発現された。野生型卵巣では、インヒビンαは、すべての成熟している卵胞
（３ａ型から排卵前段階まで）の顆粒膜細胞において発現されたが、黄体からは
排除された。ＧＤＦ−９欠損卵巣では、インヒビンαは単層卵胞、変性している
卵母細胞を有する卵胞、及び中央のステロイド産生卵胞巣において高く発現され
た。これは、卵胞巣の細胞は、多くの点で黄体に類似するが、増殖し、多層卵胞
に形成され、かつ黄体形成前の活性な卵胞膜層に集合する、野生型卵巣における
顆粒膜細胞と発生的には異なることを示す。

【００９１】２つのインヒビン／アクチビンβサブユニットであるβＡ及びβＢ，並びにア
クチビン結合タンパク質であるフォリスチンは、野生型卵巣において重複するパ
ターンで発現された。すべての３つの遺伝子は、多層前卵胞腔卵胞及び卵胞腔の
顆粒膜細胞において発現された。興味深いことには、退縮卵胞におけるβＢの発
現は、低く、卵母細胞周辺に特異的に局在したが、健常な卵胞においてはすべて
の顆粒膜細胞が高レベルで発現した。ＧＤＦ−９欠損卵巣は、ノーザンブロット
解析ではほとんど検出不可能なβＢメッセージ、及びフォリスタチンを非常に低
レベルで有し、これらは、単層卵胞の顆粒膜細胞に弱く局在し；変性している卵
母細胞を有する卵胞でより強く（ｒｏｂｕｓｔｌｙ）局在し；かつ卵母細胞欠損
卵胞巣において最も高いレベルであった。βＡメッセージは、単層卵胞において
検出可能ではなかったが、変性している卵母細胞を有する卵胞の顆粒膜細胞に弱
く局在し、卵母細胞欠損卵胞巣において高いレベルで発現した。しかしながら、
ノーザンブロット解析により、ＧＤＦ−９欠損卵巣と野生型卵巣との間でβＡ発
現レベルは同等であった。これらの結果は、ＧＤＦ−９欠損卵巣が、アクチビン
ーβサブユニット及びインヒビンαサブユニットの両方を作製する能力を維持し
たことを示す。

【００９２】卵胞腔卵胞マーカー（ＥＲβ、ＦＳＨＲ、アロマターゼシトクロムＰ４５０）の
キャラクタリーゼーションＧＤＦ−９欠損卵巣の卵胞をさらにキャラクタライズするために、顆粒膜細胞
腔機能性分化に関連する他のマーカー：ＦＳＨレセプター（ＦＳＨＲ）、アロマ
ターゼシトクロムＰ−４５０（アロマターゼ）及びエストロゲンレセプターβ（
ＥＲβ）の発現を解析した。以前に、ＦＳＨＲがＧＤＦ−９欠損及び野生型の両
方の卵巣において同様に発現されること、及びアロマターゼ発現は、野生型レベ
ルの５０％であることがノーザンブロット解析により示されている（Dong,J.,et
al.,Nature,383:531-535(1996) ）。また、ノックアウト卵巣と野生型卵巣とで
は、低いが類似のレベルでＥＲβが発現された。野生型卵巣におけるインサイチ
ューハイブリダイゼーションによって、以前に報告(Richards,J.S.,Endocrine R
eviews,15:725-751(1994);Byers,M.,et al., Mol.Endocr.,11:172-182(1997) an
d Camp T.,et al.,Mol.Endocr.,5:1405-1417(1991)) されたように、ＦＳＨＲ、
ＥＲβ及びシトクロムアロマターゼが顆粒膜細胞において特異的に検出された。
ＥＲβは、単層卵胞においては低レベルで、多層卵胞においてより高いレベルで
発現された。ＦＳＨＲは、多層前卵胞腔卵胞及び卵胞腔卵胞で発現された。アロ
マターゼは、通常、顆粒膜細胞のＦＳＨ刺激により誘導されるが、排卵前卵胞に
おいて特異的に高いレベルで発現された。ＧＤＦ−９欠損卵巣において、ＥＲβ
は、単層卵胞において低レベルで、変性しつつある卵母細胞を有する卵胞におい
てはいくぶん高いレベルで発現された。また、ＦＳＨＲは、変性しつつある卵母
細胞を有する卵胞において発現されたが、アロマターゼは、完全に変性した卵母
細胞を有する卵胞巣のみにおいて高レベルで発現された。ＧＤＦ−９欠損卵巣内
のこれらの卵胞巣におけるアロマターゼ発現は、野生型卵巣の排卵前卵胞の顆粒
膜細胞と同様の機能性ＦＳＨシグナル伝達経路が存在することを示す。

【００９３】排卵前マーカー及び黄体マーカー（ＣＯＸ−２、ＬＨＲ、コレステロール側鎖切
断シトクロムＰ−４５０）のキャラクタリーゼーション先に記載したように、黄体形成顆粒膜細胞の外観を有する、ＧＤＦ−９欠損卵
巣は多層で中央に局在した細胞巣を含む。電子顕微鏡解析により、これらの巣は
、多数の脂質滴、及び高度にステロイド産生細胞に典型的な管状クリスタを有す
るミトコンドリアを含む（Dong,J.,et al.,Nature,383:531-535(1996) ）。その
ステロイド産生及び黄体細胞との類似性を確認するために、シクロオキシゲナー
ゼ２（ＣＯＸ−２）及びＬＨレセプター（ＬＨＲ）メッセージ、並びにコレステ
ロール側鎖切断シトクロムＰ−４５０タンパク質（Ｐ−４５０ｓｃｃ）の発現を
解析した。ＣＯＸ−２は、ＬＨ急増後の期間の不連続な時間帯でのみ野生型卵巣
において発現されるので（Sirois,J.,et al.,J. Biol. Chem.,267:11586-11592(
1992) and Sterrieck,E.,et al.,Genes Dev.,11:2153-2162(1997) ）、ＰＭＳＧ
で４８時間、次いでｈＣＧで５時間刺激した３週齢マウス由来の卵巣を、ノーザ
ンブロット解析及びインサイチューハイブリダイゼーションの両方に使用した。
ノーザンブロット解析により、過剰排卵した卵巣由来のＲＮＡは、３個の明白な
バンドを示したが、非刺激の野生型又はＧＤＦ−９欠損卵巣のレーンではバンド
を検出することができなかった。ノーザンブロットデータと一致して、インサイ
チューハイブリダイゼーションは、ＰＭＳＧ及びｈＣＧで刺激した野生型卵巣に
おいて、ＣＯＸ−２が排卵前卵胞の顆粒膜細胞により発現されることを示した（
Sterrieck,E.,et al.,Genes Dev.,11:2153-2162(1997) ）。野生型卵胞の卵丘細
胞では５時間で最も高い発現が生じたが、ＣＯＸ−２発現は、ＧＤＦ−９欠損卵
巣において完全に検出不可能であった。

【００９４】上述のＣＯＸ−２発現データとは対照的に、ＬＨＲはＧＤＦ−９欠損卵巣にお
いて、野生型卵巣に匹敵するレベルで発現されることがノーザンブロット解析に
より以前に示されている（Dong,J.,et al.,Nature,383:531-535(1996) ）。ＬＨ
Ｒは、卵胞膜細胞、排卵前卵胞の顆粒膜細胞及び黄体の黄体形成顆粒膜細胞によ
り発現された（Sirois,J.,et al.,J. Biol. Chem.,267:11586-11592(1992) ）。
ＧＤＦ−９欠損卵巣において、非黄体形成卵胞巣及び黄体形成卵胞巣の顆粒膜細
胞は、非常に高いレベルでＬＨＲを発現した。ＬＨによる卵胞膜及び黄体形成顆
粒膜細胞の刺激は、ステロイド産生酵素Ｐ−４５０ｓｃｃの産生、続いてプロゲ
ステロンの合成を刺激する(Richards,J.S.,Endocrine Reviews,15:725-751(1994
) ）。野生型卵巣においてＰ−４５０ｓｃｃタンパク質は、卵胞膜細胞、黄体及
び二次間質組織に存在した。ＧＤＦ−９欠損卵巣において、Ｐ−４５０ｓｃｃタ
ンパク質は、非黄体形成卵胞巣において低レベルで、かつステロイド産生の「黄
体形成」卵胞巣においてずっと高いレベルで検出された。雌６週齢のＧＤＦ−９
欠損マウスは、３．４ｎｇ／ｍｌの平均血清プロゲステロンレベルを有し、野生
型マウスにおいて２．６ｎｇ／ｍｌであることと比べると、これらの巣は、マー
カーを発現するだけでなく、「ミニチュア」黄体様に機能する能力もあることを
示す。しかしながら、先に記載したように、これらの卵胞巣は、通常、黄体にお
いて有意なレベルで決して観察されないマーカーであるインヒビンαも発現する
。

【００９５】考察哺乳類卵母細胞におけるＧＤＦ−９の非存在が、卵胞発生におけるブロックに
よる不妊を導くことが以前に示されている。Ｆｉｇｕｒｅ６にまとめているよ
うに、分子レベルでの欠陥がさらにキャラクタライズされている。ＧＤＦ−９
ｍＲＮＡ（McGrath,S.A.,et al.,Mol.Endocr.,9:131-136(1995) ）及びタンパク
質（Elvin,J.A.et al.,Mol.Endocr.,(Submitted)(1999)）は、始原卵胞にはなく
、３ａ型一次卵胞において最初に観察される。ＧＤＦ−９ノックアウトマウス由
来の卵巣は、３ｂ型一次卵胞段階でのブロックを示す。本明細書において示すよ
うに、３ｂ型卵胞の顆粒膜細胞は、本質的に休眠状態であり：卵母細胞が消失す
るまで、卵胞の顆粒膜細胞においては細胞分裂もアポトーシスも観察されない。
したがって、ＧＤＦ−９タンパク質は３ａ型段階で合成されるが、ＧＤＦ−９シ
グナル伝達カスケードは、さらなる卵胞成熟のために３ｂ型段階でのみ必須とな
るはずである。明らかに、これらの実験は、始原卵胞の漸増、及び始原卵胞段階
（＜２０顆粒膜細胞）から３ｂ型段階（９０顆粒膜細胞）までの顆粒膜細胞の発
生（Pedersen,T.,"Follicle Growth in the Mouse Ovary", In:S.A.Bigger JD(e
d) Oogenesis,University Park Press,Baltimore,pp.361-376(1972) ）がＧＤＦ
−９に依存しないことを示す。

【００９６】野生型卵巣の退縮卵胞において観察された劇的なアポトーシスとは異なり、Ｇ
ＤＦ−９ノックアウト卵巣では最少限のアポトーシスが観察される。通常、アポ
トーシスは、ＦＳＨに対して応答性及び依存性になった後の時点で卵胞腔卵胞に
おいて起こる。たとえＧＤＦ−９欠損卵巣の顆粒膜細胞が腔マーカーを発現する
としても、アポトーシス細胞はほとんど見られなかった。これらの観察は、いく
つかの択一的な説明を導く。ＧＤＦ−９は、アポトーシス前（ｐｒｏ−ａｐｏｐ
ｔｏｔｉｃ）刺激に応答するための反応能を誘導するのに必要とされうる。また
、血清ＦＳＨの上昇（Dong,J.,et al.,Nature,383:531-535(1996) ）は、３ｂ型
ブロックを克服することはできないが、顆粒膜細胞の生存を促進しうる。最終的
にＧＤＦ−９欠損卵巣内の顆粒膜細胞は、卵母細胞が変性してステロイド産生卵
胞巣を形成した後に分化することにより、この「アポトーシス反応能を持つ」状
態を回避しうる。したがって、ＧＤＦ−９は、顆粒膜細胞の「分化」のための重
要な因子であり、３ｂ型後の（ｐｏｓｔ−ｔｙｐｅ３ｂ）顆粒膜細胞が、アポト
ーシスを行なう能力等の特異的性質を獲得することが可能になる。

【００９７】卵母細胞由来因子は、パラクリン機構によりキットリガンド発現を調節すると
いう仮説が以前にたてられている（Packer,A.I. et al.,Dev.Biol.,161:194-205
(1994)）。ゴナドトロピンで刺激したマウスにおいて、キットリガンド発現の勾
配があり、それにより卵母細胞から最も遠い顆粒膜細胞（すなわち、壁在性顆粒
膜細胞）が最も高いレベルで発現するが、卵母細胞に最も近い顆粒膜細胞（すな
わち、卵丘細胞）は非常に低いか検出不可能なレベルで発現する（Motro,B. and
Bernstein,A.,Dev.Dyn.,197:69-79(1993)）。本明細書において示したＧＤＦ−
９欠損卵胞における劇的に上昇したキットリガンドは、ＧＤＦ−９が、キットリ
ガンド発現を負に調節する卵母細胞分泌パラクリン因子の１つであることを示す
。この仮説は、本明細書に示した我々のＧＤＦ−９作用のインビボ実験からの証
拠により裏付けられ、ＧＤＦ−９が、卵胞腔卵胞の卵母細胞に対して特異的に発
現される他の遺伝子（すなわち、ヒアルロナンシンターゼ２、シクロオキシゲナ
ーゼ２、ステロイド産生早期調節タンパク質、ウロキナーゼプラスミノーゲンア
クチベーター及び黄体形成ホルモンレセプター）を調節しうることを示す。した
がって、ＧＤＦ−９により競合されない（ｕｎｏｐｐｏｓｅｄ）他の卵母細胞産
生性で卵胞外の因子の作用は、ここで観察されたキットリガンド発現の増加に貢
献するようである。ＧＤＦ−９欠損卵巣において産生されるキットリガンドも活
性であるようである。他のシステムにおいて以前に報告されているように、おそ
らく漸増及び増殖の増大を刺激したキットリガンドにより、ＧＤＦ−９欠損卵巣
は、切片１個あたり有意により多くのマスト細胞を含む。また、キットリガンド
もインビトロで卵母細胞発生を刺激することが示されている（Packer,A.I. et a
l.,Dev.Biol.,161:194-205(1994)）。ＧＤＦ−９ノックアウト卵巣における卵母
細胞は、最終的に変性する前に、対照と比べてより急速に、かつ最大サイズが１
５％大きくなるまで成熟し（Carabatsos, M., et al., Dev.Biol.,203:373-384(
1998) ）、卵母細胞上のｃ−キットを介してシグナル伝達する機能性顆粒膜細胞
誘導性のキットリガンドのさらなる証拠を提供する。ノーザンブロット解析によ
って本明細書に示したように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーは
、ＧＤＦ−９欠損卵巣において発現され続ける。ノーザンブロット解析により、
インヒビンα及びアクチビンβＡサブユニットは、ＧＤＦ−９欠損卵巣において
対照と類似のレベルで発現されるが、アクチビンβＢ及びフォリスタチンは劇的
に低下する。インビトロでアクチビンＡは、卵胞成熟を刺激すること（Mather e
t al., 1997 ）及び顆粒膜細胞ＤＮＡ合成のＦＳＨ刺激を可能にすること（Miro
, F. and Hillier, S., Endocr., 137:464-468(1996)）が示されている。さらに
また、アクチビンＡ＋ＦＳＨは、未成熟卵胞由来の顆粒膜細胞を刺激してプロゲ
ステロンを産生するが、ＦＳＨを含むか又は含まない分化培養物由来の顆粒膜細
胞によってプロゲステロン合成は低下された（Miro, F., et al., Endocr., 129
:3388-3394(1991)）。ＧＤＦ−９欠損卵巣において、卵胞巣で局所的に産生され
たアクチビンＡは、制限された顆粒膜細胞の増殖を刺激し、これらの細胞の血清
ゴナドトロピンの上昇に対する応答を増強してＰ４５０アロマターゼ及びＰ−４
５０ｓｃｃを発現するようである。また、ＧＤＦ−９欠損卵巣におけるアクチビ
ン効果は、アクチビン結合タンパク質及びアンタゴニストであるフォリスタチン
レベルの低下により増強されるようである。

【００９８】実施例５インビトロ培養した壁在性顆粒膜細胞によるプロゲステロン合成に対する組換えｍＧＤＦ−９の刺激性効果の同定プロゲステロン産生に対するｍＧＤＦ−９の効果は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）の非存在下、又は低用量（０．５又は１ｎｇ／ｍｌ）下でのみ生じる。より
高用量（５ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌ）のＦＳＨでは、ＦＳＨのみ又はＦＳＨ
＋ｍＧＤＦ−９との間でプロゲステロン産生に有意な差はない。ＦＳＨは、以前
に示されている（Oonk, et al.）ように、コレステロール生合成経路における速
度制限段階を触媒する酵素であるＰ４５０コレステロール側鎖切断発現を刺激す
るようである。ごく最近のデータに基づき、ＧＤＦ−９によるプロゲステロン刺
激は、Ｐ４５０ｓｃｃでなく、コレステロールに移動性をもたせたり又は細胞内
に輸送するのに関与することが示されている酵素であるステロイド産生早期調節
タンパク質（ＳＴＡＲ）の刺激によるようである。

【００９９】実施例６インビトロ培養した壁在性顆粒膜細胞によるフォリスタチン及びアクチビンβＢ発現に対する組換えｍＧＤＦ−９の刺激性効果の同定プロトコル一次顆粒膜細胞を上述の８対の卵巣から単離し、４ｎｇ／ｍｌのＦＳＨを含み
、ウシ胎仔血清を含まないα−ＭＥＭベースの培地中で、５０〜６０ｎｇ／ｍｌ
組換えｍＧＤＦ−９とともに又はなしで５時間培養した。培養後、培地を除き、
非接着細胞を遠心分離により回収した。ＱｉａｇｅｎＲＮＥａｓｙ全ＲＮＡ単
離キットを用いてＲＮＡを単離した。このＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発生
生物学２５０遺伝子チップへのハイブリダイゼーション用のプローブを作製する
のに使用するｃＤＮＡに逆転写した。この最初のスクリーング法の結果に基づき
、顆粒膜細胞培養実験を繰り返し、ＲＮＡを調製してノーザンブロット解析に使
用した。

【０１００】結果発生チップ解析によると、組換えｍＧＤＦ−９は、インビトロ培養した一次顆
粒膜細胞によりフォリスタチン発現では４．９倍の増加｛１９１（ｍＧＤＦ−９
処理）：３９（対照）｝、及びアクチビンβＢ発現では３．３倍の増加｛６５（
ｍＧＤＦ−９処理）：２０（対照）｝を刺激した（Ｆｉｇｕｒｅ３／１５−１
）。この結果は、ノーザンブロット解析により確認された（Ｆｉｇｕｒｅ３／
１５−２）。これらのノーザンブロットのデンシトメーターによる解析は、ｍＧ
ＤＦ−９処理がフォリスチン発現を３．１倍増加及びアクチビンβＢ発現を３．
３倍増加に刺激したことを示した。さらに、フォリスタチン発現は、ｍＧＤＦ−
９に対して用量依存的に応答した（Ｆｉｇｕｒｅ３／１５−３）。これらの結
果は、ＧＤＦ−９の非存在下インビボで、フォリスチン発現では３倍の減少及び
アクチビンβＢ発現では約６倍の減少を示す、我々のＧＤＦ−9 欠損マウス卵巣
から単離した全ＲＮＡのノーザンブロット解析によりさらに裏付けられる。

【０１０１】有意性ｍＧＤＦ−９によるフォリスタチン及びアクチビンβＢの調節を示す現在のデ
ータにより、我々が作製している組換えｍＧＤＦ−９タンパク質が生物学的に活
性である、という我々の先の結果が確認される。ラジオイムノアッセイは、フォ
リスタチン及びアクチビンβＢの両方についてタンパク質産生を解析するのに利
用可能であり、ＧＤＦ−９アゴニスト及びアンタゴニストのさらに２つのアッセ
イを提供する。さらに、これらの結果は、転写調節のためのＧＤＦ−９応答エレ
メントを同定するため、及びＧＤＦ−９シグナル伝達を理解するために使用し得
るさらに２つの下流標的を提供する。

【０１０２】実施例７インビトロ培養された壁在性顆粒膜細胞による黄体形成ホルモンレセプター（ＬＨＲ）発現に対する組換えｍＧＤＦ−９の阻害効果の同定
プロトコル顆粒膜細胞を単離し、先に記載のようにして様々な期間でウシ胎仔血清と、＋
／−ＦＳＨで培養した。ＲＮＡを記載のようにして単離し、ＬＨＲメッセージに
ついてＲＴ−ＰＣＲを、イントロンに広がるプライマーを用い、記載のようにし
て行った。

【０１０３】結果ＬＨＲ発現は、対照培地において培養時間の増加とともに増加する（Ｆｉｇｕ
ｒｅ３／１５−４）。しかしながら、５０ｎｇ／ｍｌのｍＧＤＦ−９で処理し
た培地では、ＬＨＲ発現は抑制される。

【０１０４】有意性インビボでのＬＨＲ発現は、顆粒膜卵丘細胞（卵母細胞に直接接触しているも
の）上において、たとえ検出されても稀であり、卵母細胞からの距離が増加する
ほど増加することが以前に示されている。最近の研究（Eppig, et al.,1997）に
おいて、卵母細胞分泌因子は、ＬＨＲ発現を阻害する能力を有することが示され
た。本明細書に記載の結果は、ＧＤＦ−９が、通常ＬＨＲ発現を阻害する卵母細
胞分泌因子であることを示す。

【０１０５】均等物本発明は、その好ましい態様に関して、具体的に示され記載されているが、添
付の請求の範囲によって規定されている本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに、本
発明において形態及び詳細において種々の変更が行われ得ることが当業者によっ
て理解されるであろう。当業者であれば、単なる日常的な実験手法を用いて、本
明細書に詳細に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、
かつ確認することができるであろう。かかる均等物は請求の範囲に包含されるも
のとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１は、組換えマウスＧＤＦ−９（ｍＧＤＦ−９）または組換えヒ
トＧＤＦ−９（ｈＧＤＦ−９）を含むならし培地が、時間および濃度依存的様式
で、インビトロで培養された一次顆粒膜細胞によるプロゲステロン合成を刺激し
たことを示す、プロゲステロンラジオイムノアッセイの結果の棒グラフである
。

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２は、組換えｍＧＤＦ−９がインビトロで一次顆粒膜細胞による
プロゲステロン合成を刺激したことを示す、プロゲステロンラジオイムノアッ
セイの結果の棒グラフである。

【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）有りおよび無しの組換えｍＧＤＦ
−９が、２４時間のインビトロでの一次顆粒膜細胞によるプロゲステロン合成を
刺激したことを示す、プロゲステロンラジオイムノアッセイの結果の棒グラフ
である。

【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４Ａは、０、０．５、または１ｎｇ／ｍｌの種々の濃度のＦＳＨ
の存在下、５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９の存在または非存在下に無血清培地にお
いて１４時間培養された顆粒膜細胞の培地におけるプロゲステロンのレベルを示
す棒グラフである；エラーバーは平均（ＳＥＭ）の標準誤差を示す。^*、対照対
ＦＳＨ＝０ｎｇ／ｍｌ、ＦＳＨ＝０．５ｎｇ／ｍｌ、またはＦＳＨ＝１ｎｇ／ｍ
ｌでの５０ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ−９についてｐ＜０．０５。

【図５】Ｆｉｇｕｒｅ４Ｂは、１０％のＦＣＳを含む培地の３つの別のサンプルについ
ての、細胞＋／−ＧＤＦ−９（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＦＳＨの２４時間の処
理後の培地におけるプロゲステロンのレベルを示す棒グラフである。^*、対照対
ＦＳＨ無しで培養されたＧＤＦ−９処理細胞についてｐ＜０．０５。

【図６】Ｆｉｇｕｒｅ４Ｃ〜４Ｄは、ＨＰＲＴレベルに対し標準化されたＦｉｇｕｒｅ
４Ａおよび４Ｂの実験からのＰ−４５０ｓｃｃおよびＳｔＡＲｍＲＮＡレベル
の定量を示す棒グラフである；各値は２つまたは３つの別のウェルの平均＋／−
ＳＥＭである；ＳｔＡＲｍＲＮＡ解析におけるＦＳＨ＝０または１０ｎｇ／ｍ
ｌでの対照処理サンプル（ｎ＝４）。

【図７】Ｆｉｇｕｒｅ５は、哺乳動物の卵巣でのＧＤＦ−９の役割を示すモデルである
。

【図８】Ｆｉｇｕｒｅ６は、ＧＤＦ−９ノックアウト卵巣研究の概要である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エルビン，ジュリア，エイ．アメリカ合衆国テキサス 77025 ヒューストン，スタントンストリート 3114 (72)発明者ワン，ペイアメリカ合衆国テキサス 77025 ヒューストン，ナンバーナイン，グレンアーバー 3822 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB26 CB30 DA20 DA30 DA36 DA54 DA59 DA69 DA80 FA14 FB02 FB03 FB04 FB05 FB06 FB07 FB08 FB11 FB15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）ｉ）ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤＦ
−９の結合により発現が調節される遺伝子を有する細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）において
調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）レセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへのＧＤＦ−９の
結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の変化が、該薬剤がＧＤＦ−９活性を変えることを示す、成長分
化因子９（ＧＤＦ−９）の活性を変える薬剤の同定方法。
【請求項２】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定することに
より決定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期調
節タンパク質（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃａｃｕｔｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｙｐｒｏｔｅｉｎ）、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２
、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、キットリガンド、アクチビン
／インヒビンβＢおよびフォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）からなる群
より選ばれたタンパク質をコードする、請求項２記載の方法。
【請求項４】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性から
生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項１記載の方法。
【請求項５】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産生
早期調節タンパク質、プロゲステロン、プラスミン、プロスタグランジン、アク
チビンβＢ：アクチビンβＢ、インヒビンα：アクチビンβＢ、黄体形成ホルモ
ンレセプターの結合の結果として産生される産物、黄体形成ホルモンレセプター
へのリガンドの結合の結果として産生される産物およびプラスミノーゲンの切断
の結果として産生される産物からなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項６】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）に
おける発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】ａ）ｉ）の細胞が、壁在性顆粒膜細胞（ｍｕｒａｌｇｒａ
ｎｕｌｏｓａｃｅｌｌｓ）および卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓｃｅｌｌｓ）か
らなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項８】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の変化が、該薬剤がＧＤＦ−９活性を変えることを示す、ＧＤＦ
−９の活性を変える薬剤の同定方法。
【請求項９】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定することに
より測定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期
調節タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、ウロ
キナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、キットリガンド、アクチビン／イン
ヒビンβＢおよびフォリスタチンからなる群より選ばれたタンパク質をコードす
る、請求項９記載の方法。
【請求項１１】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性か
ら生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項８記載の方法
。
【請求項１２】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産
生早期調節タンパク質、プロゲステロン、プラスミン、プロスタグランジン、ア
クチビンβＢ：アクチビンβＢ、インヒビンα：アクチビンβＢ、黄体形成ホル
モンレセプターの結合の結果として産生される産物、黄体形成ホルモンレセプタ
ーへのリガンドの結合の結果として産生される産物およびプラスミノーゲンの切
断の結果として産生される産物からなる群より選ばれる、請求項１１記載の方法
。
【請求項１３】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）
における発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１４】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の阻害が、該薬剤がＧＤＦ−９活性を阻害することを示す、ＧＤ
Ｆ−９活性のインヒビターである薬剤の同定方法。
【請求項１５】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定すること
により測定される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期
調節タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、アク
チビン／インヒビンβＢおよびフォリスタチンからなる群より選ばれたタンパク
質をコードする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性か
ら生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項１４記載の方
法。
【請求項１８】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産
生早期調節タンパク質、プロゲステロン、プロスタグランジン、アクチビンβＢ
：アクチビンβＢ、インヒビンα：アクチビンβＢ、黄体形成ホルモンレセプタ
ーの結合の結果として産生される産物および黄体形成ホルモンレセプターへのリ
ガンドの結合の結果として産生される産物からなる群より選ばれる、請求項１７
記載の方法。
【請求項１９】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）
における発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節されるｕＰＡ遺伝子の発現の程度を測定する工程
、を含み、ＧＤＦ−９の存在下におけるｕＰＡの産生の増加が、該薬剤がＧＤＦ
−９活性のインヒビターであることを示す、ＧＤＦ−９活性のインヒビターであ
る薬剤の同定方法。
【請求項２１】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の増強が、該薬剤がＧＤＦ−９活性のエンハンサーであることを
示す、エンハンサーＧＤＦ−９活性である薬剤の同定方法。
【請求項２２】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定すること
により測定される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期
調節タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、アク
チビン／インヒビンβＢおよびフォリスタチンからなる群より選ばれたタンパク
質をコードする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性か
ら生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項２１記載の方
法。
【請求項２５】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産
生早期調節タンパク質、プロゲステロン、プロスタグランジン、アクチビンβＢ
：アクチビンβＢ、黄体形成ホルモンレセプターの結合の結果として産生される
産物および黄体形成ホルモンレセプターへのリガンドの結合の結果として産生さ
れる産物からなる群より選ばれる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）
における発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節されるｕＰＡ遺伝子の発現の程度を測定する工程
、を含み、ＧＤＦ−９の存在下におけるｕＰＡの産生の減少が、該薬剤がＧＤＦ
−９活性のエンハンサーであることを示す、ＧＤＦ−９活性のエンハンサーであ
る薬剤の同定方法。
【請求項２８】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の阻害が、該薬剤が生殖能力を阻害することを示す、生殖能力を
阻害する薬剤の同定方法。
【請求項２９】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定すること
により測定される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期
調節タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、アク
チビン／インヒビンβＢおよびフォリスタチンからなる群より選ばれたタンパク
質をコードする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性か
ら生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項２８記載の方
法。
【請求項３２】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産
生早期調節タンパク質、プロゲステロン、プロスタグランジン、アクチビンβＢ
：アクチビンβＢ、インヒビンα：アクチビンβＢ、黄体形成ホルモンレセプタ
ーの結合の結果として産生される産物および黄体形成ホルモンレセプターへのリ
ガンドの結合の結果として産生される産物からなる群より選ばれる、請求項３１
記載の方法。
【請求項３３】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）
における発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずる、レセプター
へのＧＤＦ−９の結合により調節されるｕＰＡ遺伝子の発現の程度を測定する工
程、を含み、高濃度のＧＤＦ−９の存在下におけるｕＰＡの産生の増加が、該薬
剤が生殖能力を阻害することを示す、生殖能力を阻害する薬剤の同定方法。
【請求項３５】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；ｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現の程度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下におけるレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際
の遺伝子の発現の増強が、該薬剤が生殖能力を増強することを示す、生殖能力を
増強する薬剤の同定方法。
【請求項３６】遺伝子の発現が生ずる程度が、遺伝子産物を測定すること
により測定される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ、ステロイド産生早期
調節タンパク質、黄体形成ホルモンレセプター、シクロオキシゲナーゼ２、アク
チビン／インヒビンβＢおよびフォリスタチンからなる群より選ばれたタンパク
質をコードする、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】遺伝子の発現が生ずる程度が、ａ）ｉ）の遺伝子の活性か
ら生ずる産物または機能を測定することにより測定される、請求項３５記載の方
法。
【請求項３９】産物または機能が、ヒアルロン酸、リン酸化ステロイド産
生早期調節タンパク質、プロゲステロン、プロスタグランジン、アクチビンβＢ
：アクチビンβＢ、インヒビンα：アクチビンβＢ、黄体形成ホルモンレセプタ
ーの結合の結果として産生される産物および黄体形成ホルモンレセプターへのリ
ガンドの結合の結果として産生される産物からなる群より選ばれる、請求項３８
記載の方法。
【請求項４０】さらに、対照サンプルにおいて発現が生ずる程度と（ｃ）
における発現の程度を比較する工程（ｄ）を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】ａ）ｉ）顆粒膜細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）に
おいて調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）顆粒膜細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合の際に生ずるレセプターへ
のＧＤＦ−９の結合により調節されるｕＰＡ遺伝子の発現の程度を測定する工程
、を含み、高濃度のＧＤＦ−９の存在下におけるｕＰＡの産生の減少が、該薬剤
が生殖能力を増強することを示す、生殖能力を増強する薬剤の同定方法。
【請求項４２】ａ）ｉ）ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤ
Ｆ−９の結合により遺伝子の発現が調節される遺伝子を有する細胞；およびｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）細胞上のレセプターへのＧＤＦ−９の結合に適する条件下に（ａ）において
調製された合せ物を維持する工程；ならびにｃ）レセプターへのＧＤＦ−９の結合により調節される遺伝子の発現が生ずる程
度を測定する工程、を含み、評価対象の薬剤の存在下における遺伝子の発現が、該薬剤がＧＤＦ−９
のアゴニストであることを示す、ＧＤＦ−９のアゴニストである薬剤の同定方法
。
【請求項４３】アゴニストが生殖能力を増強する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】ａ）ｉ）ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤ
Ｆ−９の結合により遺伝子の発現が調節される遺伝子を有する細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）細胞上のレセプターへの薬剤の結合に適する条件下にａ）において調製され
た合せ物を維持する工程；ならびにｃ）細胞上のレセプターへの薬剤の結合が生ずる程度を測定する工程、を含み、ＧＤＦ−９レセプターへの薬剤の結合が、該薬剤がＧＤＦ−９のアゴニ
ストであることを示す、ＧＤＦ−９のアゴニストである薬剤の同定方法。
【請求項４５】ａ）ｉ）ＧＤＦ−９のレセプターと該レセプターへのＧＤ
Ｆ−９の結合により遺伝子の発現が調節される遺伝子を有する細胞；ｉｉ）ＧＤＦ−９；およびｉｉｉ）評価対象の薬剤、を合せる工程；ｂ）細胞上のレセプターへの薬剤の結合に適する条件下にａ）において調製され
た合せ物を維持する工程；ならびにｃ）細胞上のレセプターへの薬剤の結合が生ずる程度を測定する工程、を含み、ＧＤＦ−９レセプターへの薬剤の結合が、該薬剤がＧＤＦ−９のアンタ
ゴニストであることを示す、ＧＤＦ−９のアンタゴニストである薬剤の同定方法
。
【請求項４６】アンタゴニストが生殖能力を阻害する請求項４６記載の方
法。