KR970010758B1

KR970010758B1 - 올리고리보뉴클레오티드 화합물

Info

Publication number: KR970010758B1
Application number: KR1019890701528A
Authority: KR
Inventors: 필립 헤이스로프 제임스; 라일 게르라히 웨인; 안토니 제닝스 필립; 헬렌 카메론 피오나
Original assignee: 진 쉬어즈 피티와이. 리미티드; 패트릭 조셉 웰쉬
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 1997-06-30
Anticipated expiration: 2008-12-14
Also published as: DE3852539D1; EP0321201B1; DK175956B1; KR900700603A; FI104562B; NZ227332A; NO20000369L; NO308610B1; MC2115A1; CN1033838A; CN1102174C; DE3852539T2; EP0321201B2; NO20000369D0; NO902661D0; EP0321201A3; ES2065919T3; JP3046318B2; NO902661L; ES2065919T5

Abstract

내용없음

Description

올리고리보뉴클레오티드 화합물

제1도는 야생형과 변이된 RNA의 RNA 자가 절단 부위 및 자가 촉매된 RNA 절단 생성물을 나타내는 전기 영동의 프로파일을 나타내고 있다.

(a) ASBV, newt 위성 DNA 전사체 및 sTobRV, LTSV, VMOV(벨벳담배의 반점 비루스), SNMV(솔라늄 노디플로륨 반점 비루스) 및 SCMoV(서브데라닌 클로버 반전 비루스)의 위성 RNA의 자연 발생의 RNA 절단 부위에 연결된 보존 구조를 요약한 것이다. 이 구조들 사이의 뉴클레오티드 서열은 직접 나타내었으며, 그 이외는 X로 표시하였다. 염기쌍은 *로 나타내었고, RNA 절단 부위는 화살표 표시를 하였다.

(b) sTobRV RNA의 (+)가닥 절단 부위에 연결된 보존 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 절단 부위는 화살표 표시로 나타내었다.

(c) 3개의 뉴클레오티드(UGU 잔기 7 내지 9)의 인접 복제물과 함께 8개 뉴클레오티드의 삽입체(박스로 표시)를 함유나는 sTobRV의 시험관 내 돌연변이주를 나타내었다.

(d) sTobRV 야생주 및 시험관 내 돌연변이주 D-51의 서브클로닝된 HaeⅢ단편을 (+)와 (-)양 배향으로 각각 전사시키고 방사선 표지된 전사체를 폴리아크릴아미드 겔전기 영동으로 분리한다. 야생주(WT)와 변이주(D-51)의 서열로부터 절단되기 않은 159와 170염기의 위치가 전사된 것을 나타낸다.

제2도는 리보자임의 뉴클레오티드 서열과 겔 전기 영동에 의해 분리된 리보자임 절단 생성물을 나타내고 있다.

(a) D-51 변이주 내에 삽입된 뉴클레오티드(제1c도)는 BamHI 제한 엔도뉴클레오티드 부위를 포함한다. BamHI을 사용하여 변이주 DNA를 절단하고, 생성되는 두 서열을 서브클로닝하여 시험관 내에서 각각 전사시킨다. 그 RNA 전사체를 *로 표시된 RNA 간에 가능한 염기쌍과 함께 도식적으로 나타내었다. 화살표 표시된 절단 부위를 포함하는 단편은 S-RNA로 나타내고, 리보자임을 포함하는 단편은 Rz-RNA로 나타냈다.

(b) [³²P]-Pz-RNA(101 염기)를 단독으로 항온 처리(레인 1) 및 비표지된 S-RNA와 함께(레인 2)항온 처리하였다. 또한, [³²P]-S-RNA를 단독으로 항온처리하고(레인 3), 비표지된 Rz-RNA와 함께, 그리고 32p 표지된 Rz-RNA(각각 레인 4 및 5)와 함께 항온 처리했다.

제3도는 본 발명의 한 태양에 따른 리보자임의 도식적인 모델을 나타낸 것이다. A 영역은 타겟 RNA내에 절단 서열을 나타내고 있고 B영역은 촉매 영역을, C영역은 리보자임의 아암을 나타낸 것이다.

제4도는 CAT(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제) 유전자 전사체를 표적으로 하는 리보자임을 디자인한 것이다. 리보자임, 일명 RzCAT-1, 2 및 3은 CAT 유전자의 시험관 내 835염기 전사체 내에 3부위를 표적으로 하고 있다. 전사체의 절단부위의 상대적인 위치는 번호를 매긴 인접 염기들로 도식적으로 나태내었다. (a). 3개의 리보자임 서열을 그것의 타겟 서열과 함께 나타내었다 ((b) 내지 (d)). CAT 유전자의 아미노산 서열에도 번호를 매기고, 예상되는 RNA 절단 부위는 화살표로 표시하였다.

RzCAT-1과 3은 sTobRV(+)가닥으로부터 유래된 24염기의 서열을 포함하며(영역 B, 제3도), 그 반면 RzCAT-2는 이 영역에서 하나의 U-A 변화를 포함한다.

제5도는 리보자임 RzCAT-1 내지 3을 사용하여 CAT RNA를 절단한 결과를 나타낸 것이다.

(a) [³²P]-CAT RNA는 단독으로 항온 처리하거나(-), 또는 3가지 리보자임, RzCAT-1 내지 3(각각, 레인 1, 2 및 3)중 하나와 함께 항온처리한 이후 겔 분리한 결과이다. 전사체 총 길이의 위치는 화살표로 나타내었다.

(b) 5'말단의 염기 분석. CAT mRNA를 리보자임으로 절단하여 생성된 3' 단편을 [5'-³²P]-키나아제화, 겔정제, 완전한 뉴클레아제 절단 처리한 후, pH3.5의 폴리아크릴아미드 겔전기영동으로 분리된 말단 잔기를 유리시켰다. 마커를 참고로 하여 결정한 5' 말단 뉴클레오티드는 RzCAT-1 내지 3으로 생성된 단편의 경우 A, U 및 G였다(각각 레인 1, 2 및 3).

제6도는 CAT RNA에 대한 리보자임(RzCAT-1) 촉매 활성의 시간 경과에 따른 결과를 나타낸 것이다. 139 뉴클레오티드 절단 생성물의 양을 정량하고 플롯팅하였다. 삽입 그림은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이후에 시간에 따른 139 염기 단편의 축적량을 나타낸 것이다.

제7도는 상이한 온도 조건 하에 상대적인 CAT RNA 절단율을 나타내고 있다. 기질 RNA는 실선으로 나타내었으며 각 경우에 있어서 절단 생성물은 파선으로 나타내었다.

제8도는 상이한 길이의 아암 또는 인접 서열을 갖는 3개의 리보자임(RzCAT-2에 상응함)을 나타낸다.

제9도는 각 절단 분역 RzCAT-1 내지 3을 포함하는 촉매성 안티센스 RNA로 구성된 리보자임의 생성방법을 나타낸 도면이다.

제10도는 CAT mRNA와 GUA(10a)와 GUU(10b)를 포함하는 타겟 서열에 하이브리드하는 리보자임을 나타내고 있다.

제11도는 CEV(citrus exocortis viroid) RNA와 그것의 상보물에 있어서 자가 촉매형 RNA 절단 부위를 나타낸 것이다.

제12도는 타겟 CEV RNA(a)에 하이브리드하는 리보자임 RzCEV 25x(+) 및 이 RzCEV 25x(+)와 함께 항온처리한 (+)CEV RNA 및 상보적인(-) CEV RNA의 겔 전기영동 프로파일(b, 각각 레인 1과 2)을 나타낸 것이다. 절단 생성물은 화살표로 표시하였다.

제13도는 타겟 서열(a) 및 리보자임 RzSCMoV(b)에 하이브리드하는 리보자임 RzCAT-2를 나타낸 것이다. 각 리보자임의 촉매 분역은 박스로 표시하였다. RzCAT-2와 비교했을 때 RzSCMoV의 촉매 영역내의 차리를 표시하였다.

제14도는 CEV RNA의 타겟 서열에 하이브리드하는 리보자임 RzCEV-2를 나타낸 것이다. 절단 부위는 CEV RNAA 서열 중 뉴클레오티드-336에 상응한다. sTobRV의 촉매 분역과 비교하였을 때, 촉매 분역의 뉴클레오티드 서열에 있어서 뉴클레오티드 서열의 변화는 원으로 표시했다(a). 제14(b)도는 대조군[CEV의 (-) 가닥] RNA(레인 7)과 CEV RNA의 (+) 가닥(레인 8)의 RzCEV2와 함께 항온처리한 이후 전기 영동 프로파일을 나타낸 것이다.

제15도는 리보자임 RzCAT-2B(b)와 비교한 리보자임 RzCAT-2(a)를 나타낸 것이다. 촉매 분역은 박스로 나타내었다. RzCAT-2와 비교하여 RzCAT-2B 촉매 분역의 변화도 나타내었다.

제16도는 플라즈미드 pJ 35SN의 지도를 나타낸 것이다.

제17도는 식물(담배 원형질체)의 CAT 형질 발현 억제성에 대한 4가지 실험 평균치를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 고 특이성을 갖는 엔도리보뉴클레아제(endoribonuclease) 활성을 지닌 합성 RNA 분자류 및 그것의 유도체(이하, 리보자임이라 명명함)에 관한 것이다.

ASBV(avocardo sunblotch viroid), sTobRV(satellite RNA of tobacco ringspot virus ; 담배의 윤반병 비루스의 위성 RNA) 및 sLTSV(satellite RNA lucerne transient streak virus ; 자주개자리 일시적인선 비루스의 위성 RNA) 등의 수많은 자연발생적인 RNA 분자들은 자가 촉매 절단을 수행한다. 이러한 절단은 상기의 RNA 및 기타 다른 RNA 생활 주기에 필수적이며 고유한 역할로 나타낸다.

자가 촉매화된 RNA 절단 반응에는 이가의 금속이온과 중성 또는 그 이상의 pH가 일반적으로 요구되며, 그 결과 말단에 5'히드록실과 2', 3 시클릭 포스페이트기를 지닌 RNA를 생성한다(Prody et al., Science 231 : 1577-1580(1986) and Buzayan et al., Viroloy 151 : 186-199(1986)). 절단 반응은 RNA 자체에 의해 촉매되며, 이것은 아마도 반응기들을 매우 인접시키는 입체 배좌의 결과로서 나타나는 것으로 추정된다. 자연 발생의 RNA에 있어서 자가-촉매 절단 부위는 고도로 보존성인 RNA 2차 구조의 영역 내에 위치한다(Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8859-8862(1986) and Forster, A.C. and Symons, R.H. Cell 50 : 9-16(1987)).

본 발명들은 sTobRV(담배 윤반병 비루스의 위성 RNA)로 실험을 수행하여 신규의 엔도리보뉴클레아제(이하 리보자임으로 지정함), 즉 RNA 타겟 분자의 특이적인 절단을 촉매하는 RNA를 포함하는 효소를 디자인하였다.

본 명세서에 사용되는 리보자임이란 용어는 RNA 전체 또는 그것의 유도체를 포함하는 분자를 언급한다.

본 발명의 리보자임은 테트라히메나 써모필라에서 자연적으로 발생하여 토마스 체흐 및 그 동료에 의해 충분히 조사되었던 RNA 엔도리보뉴클레아제(IVS 또는 L-19 IVS RNA로 공지되어 있음)와는 상이한 것이다(Zaug, A.J. et al, Science(1984) 224 : 574-578 ; Zaug, A.J. and Cech, T.R., Science(1986) 231 : 470-475 ; Azug, A. J., et a1, Nature(1986) 324 : 429-433 ; 미합중국 특허청에 의해 공개된 국제 특허 출원 제WO 88/04300호. 체흐(Cech)에 의한 엔도리보뉴클레아제는 필요조건으로서 유리 구아노신 또는 구아노신 유도체의 존재하에 타겟 RNA 서열에 하이브리드 한 후 타겟 RNA를 절단시키는 8개 염기쌍 활성부위를 갖는다. 절단 후 생성되는 단편은 말단의 5' 포스페이트기와 3'히드록실기를 포함한다. RNA 기질에하이브리드하는데 유용한 한정된 수의 뉴클레오티드는 일반적으로 체흐 엔도리보뉴클레아제의 효능 또는 효율성을 제한하며, 12개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 타겟서열에 약하게 하이브리드한다. 또한, 체흐 엔도리보뉴클레아제의 활성 부위에 있는 많은 뉴클레오티드들은 효율적인 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖기 위해 보존되어야 할 필요가 있을 것이다. 이것은 타겟 서열에 하이브리드하도록 유전자조작될 수 있는 활성 부위 서열의 과돌연변이(permutation)의 수를 제한하며, 따라서 체흐 엔도리보뉴클레아제가 절단할 수 있는 RNA 타겟서열의 범위를 제한한다. 또한, 체흐 엔도리보뉴클레아제는 절단된 RNA의 5'말단에 유리 구아노신 뉴클레오티드를 첨가시킴으로써 RNA를 변형시킨다.

이와는 대조적으로, 본 발명의 리보자임은 광범위한 타겟 RNA 서열에 효율적으로 하이브리드하며, 절단된 타겟 RNA를 변형시키지 않는다.

본 발명의 리보자임은 뉴클레오티드 서열 중 타겟 RNA의 일부분 이상에 상보적인 하이브리드화 영역과 타겟 RNA를 절단하도록 개작된 촉매 영역을 포함한다. 하이브리드화 영역은 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 리보자임은 일본쇄 RNA로 구성된 하나 이상의 아암(arms)을 포함하고 타겟 RNA의 일부분 이상에 상보적인 서열을 갖는 하이브리드화 영역을 갖고 있고, 상기 하나 아암은 상기 타겟 RNA를 절단할 수 있는 촉매 영역에 연결되어 있고; 하이브리드화 영역이 단 하나의 RNA 아암을 포함하는 경우, 그 아암은 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며, 2개 이상의 RNA 아암을 포함하는 경우에, 그 아암들 중의 총 뉴클레오티드 수가 9개 보다 많아야 한다.

본 발명의 한 태양으로서, 하기 식(I)의 리보자임을 제공한다.

상기 식에서, X는 임의의 리보뉴클레오티드를 나타내며 각 X잔기는 동일하거나 상이하며; n과 n'의 합은 6개 초과이고, n과 n'은 동일하거나 상이할 수 있으며 ; (*)는 상보적인 리보뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 나타내며 ; X' 및 X''는 올리고리보뉴클레오티드 사이에 염기쌍을 형성할 수 있도록 일부분 이상의 길이를 따라 상보적인 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내거나, X' 및 X가 함께 단일의 RNA 서열을 형성하며, 이 때, 상기 서열의 일부분 이상은 상보적인 뉴클레오티드간 염기쌍에 의해 형성된 줄기를 포함하며 ; 임의로 A.G.C. 또는 U 중의 하나로부터 선택된 부가의 뉴클레오티드가 식(1)의¹A 이후에 삽입될 수 있다.

식(1)의 영역(I)은 타겟 RNA 서열의 상대 부위에 하이브리드하는 리보자임의 아암 또는 인접 서열을 나타낸다. 아암은 타겟 RNA의 전체 길이 또는 그 일부분에 하이브리드 할 수 있다. RNA 촉매 영역은 식(1)의 영역(Ⅱ)에 도식하였다. 촉매 영역은 촉매 활성에 역영향을 미치지 않는 하나 이상의 부가 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 부가에 따른 영향은 본 명세서에 교시된 내용에 따라 지나친 실험 없이도 리보자임 활성으로 용이하게 시험할 수 있다. 또한, 촉매 영역은 하이브리드 영역의 일부를 형성하기도 한다.

올리고리보뉴클레오티드 X'와 X''는 최고 5,000정도 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

본 발명의 부가의 특정한 태양에 따라, 하기 식(2)의 리보자임이 제공된다:

상기 식에서 ; X는 임의의 리보뉴클레오티드이며 각 X잔기는 동일하거나 상이하고; (*)는 상보적인 리보뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 나타내며 ; n과 n'는 상기 규정한 바와 같으며 ; m과 m'는 1 이상이며 ; 동일하거나 상이하고 ; B는 결합이거나, 염기쌍, 리보뉴클레오티드 또는 2개 이상의 리보뉴클레오티드를 포함한 올리고리보뉴클레오티드이며 ; 임의로 A, G, C 또는 U 중 어느 하나로부터 선택된 부가의 뉴클레오티드를 식(2)의¹A 이후에 삽입할 수도 있다.

본 발명의 리보자임은 RNA 분자 합성기술 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다(예, 미합중국, 위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가의 프로토콜 참고). 특히, 본 발명의 리보자임은 T7 RNA 폴리머라제나 SP6 RNA 폴리머라제의 프로모터 등과 같은 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동 가능하게 결합된 상응하는 DNA서열(전사하여 리보자임을 산출하며, DNA 합성 기술 분야에 공지된 방법으로 합성할 수 있는 DNA)로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 리보자임에 상응하는 DNA 서열은 DNA 전이 벡터(예, 플라즈미드나 박테리오파지 DNA)에 결찰시킬 수 있다. 전이 벡터가 리보자임에 상응하는 DNA에 작동 가능하게 결합된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 경우, 리보자임은 RNA 폴리머라제와 함께 항온처리하면 용이하게 생성될 수 있다. 즉, 리보자임은 리보뉴클레오티드의 존재하에 리보자임에 상응하는 DNA에 작동 가능하게 결합된 RNA 폴리머라제 프로모터와 RNA 폴리머라제를 항온처리함으로써 시험관 내에서 생산할 수 있다. 생체내 실험으로 원핵 또는 진핵 세포(포유류와 식물 세포 포함)는, 리보자임이 숙주 세포 내에서 전사되도록 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동 가능하게 결합된 본 발명에 따른 리보자임 상응하는 유전자 물질을 포함하는 적당한 전이 벡터로 형질 감염시킬 수 있다. 전이 벡터는 박테리아 플라즈미드 또는 비루스 RNA나 DNA일 수 있다. 리보자임에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 1ac, 후기 SV40, 전기 SV40, 메탈로티오닌 또는 λ 프로모터 같은 강력한 프로모터의 조절하에 놓여있다. 리보자임은 생체 내에서, 전이벡터로부터 직접 전사되거나, 또는 보다 큰 RNA 분자의 일부분으로서 전사될 수 있다. 예를 들면, 리보자임 서열에 상응하는 RNA를 캐리어 유전자의 3' 말단, 예컨대, 해독 종지 신호 이후에 결찰시킬 수 있다. 이와 같이 보다큰 RNA 분자는 세포 내의 뉴클레아제 절단에 대하여 리보자임 분자를 안정화시키는데 도움을 준다. 해독시 캐리어 유전자는 단백질을 산출할 수 있으며, 그것의 존재는 예를 들어, 효소 반응으로 직접 분석할 수 있다. 예를 들면, 캐리어 유전자는 효소를 암호할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 리보자임을 전사시키는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 리보자임에 상응하는 RNA 서열을 포함하는 RNA 전이 벡터를 제공한다.

리보자임을 생성하는 바람직한 방법 중 하나는 상보적인 서열을 지닌 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 표준 방법(예, Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer(Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404)사용)으로 제조하여 하이브리드화한다. 이 올리고뉴클레오티드 중 하나는 바람직한 리보자임을 암호한다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드의 각 말단은 상이한 제한 효소 부위, 즉 한 말단에 EcoR1 부위, 다른 말단에 Pst1 부위를 갖는다. 적당한 제한 효소(상기 예에서의 EcoR1과 Pst1)로 절단한 후, 이본쇄 DNA 단편을 전이 벡터에 클로닝할 수 있다. 플라즈미드 벡터가 본 발명의 리보자임에 상응하는 DNA 서열 상부 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 경우, 리보자임에 상응하는 RNA 전사물은 생체내 또는 시험관 내에서 용이하게 제조할 수 있다. 리보자임이 상보적인 뉴클레오티드 사이의 염기쌍에 의해 함께 유지되는 2개의 반쪽으로 이루어지는 경우, 이 리보자임의 각 반쪽은 상기 방법에 따라 제조할 수 있고, 이 반쪽들을 함께 항온처리하여 리보자임을 형성시킨다.

본 발명의 바람직한 리보자임은 서열 X°UY를 포함하는 타겟 RNA를 절단하며, 여기에서 X°는 임의의 리보뉴클레오티드, U는 우라실이고 Y는 아데닌, 시토신 또는 우라실이다. X°U는 염기쌍 인접(flanking)영역의 일부를 형서하며 Y는 염기쌍을 이루지 못한다. X°은 구아니딘이고 X°UY는 GUC 또는 GUA인것이 바람직하나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이러한 서열을 포함한 임의의 RNA 분자는 본 발명의 리보자임으로 절단될 수 있다. X°UY 서열을 포함한 RNA 전사체의 서열이 결정되면, 리보자임 서열의 아암은 X°UY 서열에 인접한 타겟 서열상의 RNA에 상보적이도록 합성하여 하이브리드화시킬 수 있다. X°UY 서열에 인접한 타겟 RNA 서열에 리보자임의 아암이 하이브리드하면, 리보자임의 촉매 영역은 X°UY 서열 내의 타겟 RNA를 절단한다.

RNA 절단은 약 8.0의 pH에서 마그네슘이나 기타 2가 양이온의 존재 하에 용이하게 수행된다.

따라서, 본 발명의 바람직한 리보자임은 유전자 조작하여 서열이 공지된 임의의 RNA를 절단할 수 있다. RNA 중 리보자임에 의해 절단되는 빈도수가 높다는 것(염기분포가 불규칙적이며 균등한 균등한 RNA 중에서 GUC의 빈도수 1:64)은 리보자임 절단의 가능성이 높은 많은 부위를 임의 제공된 타겟 RNA에서 확실히 예견할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 타겟 RNA 서열의 불활성화 방법을 제공하는데, 이것은 상기 타겟 RNA 서열을 본 발명의 리보자임과 반응시키는 것을 포함한다.

생체 내에서 즉, 유기체의 세포 또는 세포들 내에서 박테리아 플라즈미드나 비루스 RNA 또는 DNA와 같이 하나 이상의 리보자임을 암호하는 전이벡터로 세포를 형질감염시킬 수 있다(예, Llewellyn et al., J. Mol. Biol.(1987) 195 : 115-123 ; Hanahan et al. J. Mol. Biol(1983)166). 일단 세포 내에서 전이 벡터는 복제할 수 있고 세포 폴리머라제에 의해 전사되어, 바람직한 타겟 RNA를 불활성화시키는 리보자임 RNA를 생성할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 리보자임 서열을 포함한 전이 벡터로 세포를 형질 감염시키거나 상기 전이 벡터를 미량 주입법과 같은 미세조작 방법으로 세포에 유입시켜 그 전이 벡터나 그 일부분이 숙주세포의 게놈 내로 통합되게 할 수 있다. 통합된 유전자 물질은 전사하여 리보자임을 산출하며, 이것은 바람직한 타겟 RNA를 불활성화시키는 작용을 한다.

본 발명의 리보자임은 광범위한 치료 용도 및 생물학적 용도를 갖는다. 예를 들면, 인체 및 동물에 있어서 비루스에 의해 야기된 질병은 비루스에 감염된 환자에게, 비루스의 RNA 전사체에 하이브리드하여 그 RNA 전사체를 절단할 수 있도록 개조된 본 발명의 리보자임을 투여함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 리보자임은 비경구적 투여 또는 기타 투여 방법으로 전달할 수 있다. 대안적으로, 비루스로 인한 질병에 걸린 환자는 RNA 프로모터에 작동 가능하게 결합된 리보자임에 상응하는 DNA를 포함하도록 유전자 조작된 종두 비루스나 아데노비루스 등의 비-독성 비루스를 투여받아, 리보자임이 숙주 동물의 세포 내에서 전사되고 유전자 조작된 비루스로 형질 감염되어 비루스로 야기된 질병의 타겟 RNA 전사체를 절단 및/또는 불활성화시킬 수 있게 된다. 본 발명의 리보자임은 특히 예를 들면, HSV(단순 포진 비루스) 또는 HIV(AIDS 비루스식)에 야기된 비루스 질병에 적용할 수 있다.

또한 본 발명의 리보자임은 특히 박테리아 및 기타 원핵 세포, 식물과 동물의 RNA 전사체를 불활성화시키는 용도를 갖는다. 박테리아의 경우, 예를 를어 박테리아 세포를 죽일 수 있는 박테리오파지의 RNA 전사체는 파지 DNA를 불활성화시키는 본 발명의 리보자임을 생성할 수 있는 DNA 전이 벡터로 세포를 형질감염시킴으로써 불활성화시킬 수 있다. 대안적으로, 리보자임 자체를 박테리아 세포에 첨가하여 흡수시키면 파지 RNA가 절단될 수 있다.

식물 중의 RNA 전사체는 아그로박테륨 투머페이션스의 Ti 플라즈미드 같은 전이 벡터에 의해 암호된 리보자임을 사용하여 불활성화시킬 수 있다. 상기 벡터에 의해 식물 세포가 형질감염된 경우, RNA 폴리머라제의 작용하에서 리보자임의 생성되어 특이적인 타겟 RNA 서열의 절단에 효과적으로 사용될 것이다. 따라서 그 RNA 서열이 공지된 식물 비루스나 식물 유전자의 RNA 전사체는 리보자임을 사용하여 불활성화시킬 수 있다.

식물, 동물 또는 기타 세포 유형에 있어서의 내인성 유전자 전사체는 본 발명의 리보자임을 사용하여 불활성화시킬 수 있다. 따라서, 바람직하지 않은 표현형 또는 특성이 조절될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 리보자임을 사용하여 과실의 핵을 제거하거나, 유해 단백질의 생성 또는 특정 단백질의 과잉 생산으로 인해 야기되는 인체의 유전 질병을 치료하는 것이 가능할 것이다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예와 도면을 참고로 설명하고자 한다.

하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제시한 것으로 본 발명을 제한하지는 않는다.

DNA와 관련된 반응 및 조작(예, 결찰, 제한 효소 절단, 박테리아의 형질전환, DNA 서열 결정 등)은 매니아티스등에 의해 기술된 기본 기술에 따라 수행한다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982), RNA와 관련된 조작도 우렌벡(Nature 328, 595-600(1987))과 하세로프 및 게르라크(Nature 334 585-591(1988))에 의해 기술된 기본 기술로 수행한다.

변이된 sTobRV RNA의 자가-촉매형 절단

ASBV, sTobRV의 newt 위성 DNA 전사체 및 위성 RNA, LTSV, VMoV(벨벳 담배 반점 비루스), SNMV(Solanum nodiflorum 반점 비루스) 및 SCMoV(Subterranean Clover 반점 비루스) 내 자연 발생적인 RNA 절단 부위와 관련된 도메인들의 콘센서스는 제1a도에 제시된 바와 같다. 이 구조간에 보존되는 뉴클레오티드 서열은 직접 나타내고 있는 반면 비-보존 서열은 X로 나타내었다. 그 이외의 U는 LTSV(+) 가닥에 잔기¹A 뒤에 위치한다. 또한, sTobRV(+)가닥의 자가 촉매형 절단 부위에 연결된 분역을 연구하여 본 분역 내의 효소 기질 활성을 확인하였다. 먼저, 클로닝된 sTobRV cDNA를 올리고뉴클레오티드링커(Bam HI) 삽입 방법을 사용하여 돌연변이 유발시켰다.

sTobRV의 시험관 내 형질발현을 위한 벡터의 작제

sTobRV cDNA의 Taq1-Spe1 단편 160bp를 pSP 653(Gerlach et al. 1985, Virology 151:172-185)으로부터 분리하고 Acc1-Spe1 절단물에 결찰시킨 후, pGEM4를 포스파타제 처리하여 Acc1 부위를 재생시킨다. 산출되는 클론을 Acc1으로 선형화시키고 포스파타제 처리한 후, 359bp의 sTobRV cDNA/Taq1 단편을 삽입하다. 산출되는 클론을 말단 여분 잔기 227 내지 81을 포함하는 520bp의 환형 치환성 sTobRV cDNA 서열(pTTS)의 존재 하에 대해 분석한다. sTobRV 서열은 T7과 SP6 RNA 폴리머라제의 프로모터에 인접해 있고, 시험관 내 전사 반응으로 자가-절단성 부위 2개를 포함하는 (+) 또는 (-) 배향의 RNA를 생성한다.

시험관내 돌연변이 유발 반응

플라즈미드 pTTS(50μg)를 BamH1으로 선형화시키고S1 뉴클레오티드로 처리한 후 재결찰시켜서 고유한 BamH1 부위를 제거한다. 수득되는 구조물 pTTS-B를 37℃에서 10분 동안 20mM Tris-HC1 pH7.0, 15mM MnCL₂중에서 2×10^-4유니트의 DNase1로 처리한다. 수득되는 선형 DNA의 말단을 다듬고(또는)T₄DNA 폴리머라제를 사용하여 말단을 채운 뒤, 0.7% LGT 아가로즈 겔전기 영동으로 정제 및 추출한다. 키나아제 처리한 BamH1 링커 서열(CGGATCCG)를 5% 폴리에틸렌글리콜의 존재 하에 실온에서 하룻밤동안 선형화된 플라즈미드에 결찰시킨다. 그후, 반응물을 BamH1으로 절단하고 선형 플라즈미드 DNA를 0.7% LGT 아가로즈 겔 전기 영동으로 재정제했다(이것은 미결찰된 링커와 함께 원형 플라즈미드의 최종 추적물을 제거하는데 필요한 것으로 알려졌다). 플라즈미드를 T₄DNA 리가아제를 사용하여 재원형화하고 E.Coli DH-1으로 형질 전환시킨다. 콜로니(1000개 이상)를 아가평판 배지로부터 긁어내어 액체 배지 중에서 포화상태로 증식시키고 플라즈미드 DNA의 혼합 집단을 제조한다. 혼합 sTobRV cDNA 삽입체를 인접EcoR1과 Pst1 부위에서 제한 효소로 절단하고 1% LGT 아가로즈 겔 전기 영동으로 정제한 뒤 EcoR1-Pst1 절단되고 포스파타제-처리된 pGEM4에 서브클로닝하였다. 산출한 형질 전환체를 다시 모아서 액체배지 중에서 증식시킨 뒤, 플라즈미드 DNA를 제조했다. 플라즈미드 DNA를 BamH1으로 처리하여 BamH1 링커 서열을 포함하는 플라즈미드만을 절단하고, 이 선형체를 다시 0.7% LGT 아가로즈 겔 전기 영동으로 2회 정제하고 T4 DNA 리가아제로 재원형화시켜서 E.coli DH-1을 형질 전환시킨다. 각각의 형질 전환체를 제한 효소 절단법으로 sTobRV 서열 내에 삽입된 BamH1 링커의 대략적인 위치를 분석하고 M13mp19로 서브 클로닝한 뒤 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종지 기법을 통해 서열 결정한다.

sTobRV 변이주의 라이브러리(library)를 수득하였고, 뉴클레오티드 서열분석은 각 변이주가 인접하게 복제되거나 결실된 sTobRV 서열과 함께 삽입된 BamH1 링커 서열(CGGATCCG)을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이 변이주를 시험관 내에서 전사시키고 RNA를 사용하여 절단 능력에 대해 분석했다. 이러한 실험으로부터, 52-뉴클레오티드 서열이 sTobRV RNA의 절단 부위와 기질 둘 다를 포함한다는 것이 확인되었다. 제1b도에 도시된 52-뉴클레오티드 서열은 다른 RNA의 자가-절단에 요구되는 보존 서열의 분역을 포함하고 있다(제1a도). 한변이주, D-51은 제7 내지 9번에 위한 3개의 복제된 sTobRV 뉴클레오티드 사이에 삽입된 8개의 뉴클레오티드 BamH1 링커 서열을 포함한다. 이 변이주는 자가-촉매성 RNA 절단을 나타냈다.

야생주 RNA와 D-51 RNA의 52-뉴클레오티드 절단 서열을 포함하는 97 및 108 염기쌍의 HaeⅢ 단편(제1b도 및 제1c도 참조)을 서열 결정된 플라즈미드 클론으로부터 절단해냈다. 이 단편을 pGEM4의 Sma1부위에 결찰시키고 선별하여 양방향으로 배향된 삽입체를 수득했다. 플라즈미드를 EcoR1을 사용하여 선형화하고 길이 159 및 170염기의 (+)와 (-) RNA 가닥을 50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM NaCl, 6mM MgCl₂, 2mM 스페르미딘, 1000유니트/ml RNasin, 500μM ATP, CTP 및 GTP와 함께 200μM[α³²P]UTP중에서 200유니트/ml의 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사시켰다. RNA를 10% 폴리아크릴아미드, 7몰우레아, 25% 포름아미드 겔상에서 전기 영동하고 자동 방사선 사진을 찍는다.

제1d도에서 볼 수 있는 바와 같이, (-)가닥 RNA 전사체의 절단은 관찰되지 않는다. 이것은 예상한 바와 같은 결과로서,(-)가닥은 자가-촉매 절단 부위를 포함하지 않는다. 야생주 및 D-51 서열 둘 다의 (+)가닥에서는 절단이 일어났고 D-51 RNA의 절단이 야생주 RNA의 절단에 비해 다소 덜 효과적이었다(제1d도). 이 실험은 RNA의 자가-촉매성 절단과 관련있는 52-뉴클레오티드 서열의 오른편에 있는 일본쇄의 루우프 영역이 필수적이 아니라는 것을 나타낸다.

효소와 가실 활성의 분리

D-51에 삽입된 BamH1 제한 효소 부위를 사용하여, 인접 HaeⅢ-BamH1 단편과 BamH1-HaeⅢ 단편을 수득하고 각각을 시험관 내 전사에 적합한 E.coli 플라즈미드로 서브-클로닝한다. 이것은 변이된 일본쇄 루우프를 자가-절단 분역으로부터 제거시키면서 그 영역을 2개의 RNA 단편으로 나눈다(제2a도). 작은HaeⅢ-BamH1 단편은 실제 절단 부위를 포함하는 뉴클레오티드 321 내지 329를 포함하며 S 단편이라 명명한다. sTobRV 뉴클레오티드 7 내지 48을 포함하는 BamH1-HaeⅢ 단편은 리보자임 또는 Rz 단편이라 명명한다. 시험관 내 전사에 사용된 E.coli 플라즈미드는 pGEM3과 pGEM4이다(Promega, Madison, WI, U.S.A.). 이 형질 발현 플라즈미드는 다음(a), (b), (c)를 포함한다.

(a) 복제의 근원 ; (b) 선택적인 약물내성(Amp^r) 유전자 ; (C) 전사체를 시험관 내 생성하는데 사용될 수 있는 RNA 폴리머라제 프로모터에 인접해 있는 다수의 클로닝 부위.

T7 DNA 폴리머라제 처리되고, Kpn I 절단된 Rz-pGEM3과 Xbal 절단된 S-pGEM4를 상기 설정한 바와 동일한 조건하에서 SP6 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사시킨다.

제2도에서 볼 수 있는 바와 같이, S와 Rz-RNA 둘 다는 매우 효율적인 자가-절단에 적합한 조건(50℃, 20mM MgCl₂, pH8.0) 하에 단독 항온 처리한 경우(제2b도, 레인 1과 3) 현저한 분해가 나타나지 않았다. 표지된 Rz-RNA도 S-RNA와 항온 처리한 이후에도 변화하지 않는 것으로 나타났다(제2b도, 레인2와 5). 그러나, S-RNA를 Rz-RNA와 혼합한 경우에는, S-RNA가 효율적으로 절단하여(제2b도, 레인 4와 5) 두 개의 단편을 생성한다. 생성물의 크기는 뉴클레오티드 #359와 #1 사이의 정상부위에서 S-RNA(84 염기)가 절단된 경우와 일치하며, 각각 67 및 17 뉴클레오티드의 5' 및 3' 근접 단편을 생성한다. 이것은 S-RNA가, 촉매형으로 작용하는 Rz-RNA에 의한 리보뉴클레오티드 절단용 기질로서 작용한다는 것을 나타낸다.

sTobRV RNA의 촉매 영역에 근거한 리보자임의 모델은 제3도에 나타내었다. 이 리보자임은 C로 나타낸 일본쇄 RNA의 2개의 인접 서열 또는 아암을 갖고 있고, 이것은 기질 RNA, 즉 절단된 RNA에 상보적인 서열과 하이브리드한다. C로 나타낸 각 인접 서열은 8개의 리보뉴클레오티드를 포함한다. C영역에 포함되는 뉴클레오티드의 수는 중요하지 않다. 그러나 충분한 뉴클레오티드를 제공하여 리보자임이 타겟 RNA에 하이브리드하도록 해야한다. 각각의 C영역에 있어서 4개의 뉴클레오티드가 하이브리드를 위한 최소 수인것으로 나타난다.

촉매 영역 B는 자연발생의 절단 분역(제1a도 참고)에서 고도로 보존되는 서열을 포함한다. 공지된 서열의 절단 분역과 비교해볼 때, 염기쌍 줄기 Ⅱ의 길이는 그것의 한 끝에 연결된 루우프가 존재하므로 중요하지 않다.

타겟 RNA 내부의 절단 부위는 GUC로서 A로 표시하였다(제3도). 자연발생의 RNAs의 절단 부위에 관한 본원의 실험(나타내지 않음)과 고이즈미에 의한 기타 실험(FEBS LETT 288 ; 228-230(1988)) ; 및 FEBS LETT 239 ; 285-288(1988))을 근거로 할 때 서열 GUA, GUC, CUC, AUC 및 UUC도 RNA 절단부위로 작용하기도 한다.

실시예 2

신규하고 고도로 특이적인 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 리보자임의 고안, 합성 및 활성의 입증

본 발명을 예시하기 위해, 박테리아로부터 유리되어 통상적으로 사용되는 표시인자 유전자인 Tn9 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)의 전사체를 표적으로 하는 3개의 리보자임을 고안했고, 상기 유전자는 박테리아, 식물 및 동물에 있어서 항생제 내성을 제공할 수 있어 쉽게 분석할 수 있다. RzCAT-1 내지 3으로 명명한 이 리보자임들은 각각 CAT RNA의 139-140, 494-495 및 662-663 위치에 있는 가능한 GUC 절단부위에 상응한다. 이 리보자임의 서열을 제4도에 도식하였다. 각 경우에 있어서, 타겟 CATRNA에 하이브리드하는 리보자임의 인접 서열은 길이가 8개의 뉴클레오티드였다. 촉매영역은 제3도에 나타낸 바와 같이 sTobRV RNA의 촉매 영역에 상응하는 것으로 선택했다.

CAT 유전자는 pCM4로부터 수득하여 BamH I 단편으로서 pGEM-32(Promega, Madison, WI, U.S.A)에 서브클로닝했다. 이 플라즈미드를 HindⅢ으로 선형화시키고, 220μM[α-³²P]UTP와 함께 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 CAT 유전자 전사체를 수득했다. 그 다음 리보자임 서열을 각각 올리고데옥시뉴클레오티드, RzCAT-1, 2 및 3으로 합성했다. 이것을 키나아제 처리한 뒤, 포스파타제 처리되고, EcoR1-Pst1 절단된 pGEM4와 결찰시킨 다음, DNA 폴리머라제 1의 클레노우 단편과 함께 항온 처리한 후, 박테리아 형질전환에 사용했다. EcoR1 선형화된 플라즈미드를 T7 RNA 폴리머라제로 전사시켜 리보자임 RNAs를 생성한다. 이 리보자임을 50mM Tris-HCl pH8.0, 20mM MgCl₂중에서 50℃에서 60분 동안 CAT 전사체와 함께 항온처리하고, 그 생성물을 5% 폴리아크릴아미드 7M 우레아, 25% 포름아미드 겔 전기 영동으로 분리한 후 자동 방사선 사진을 찍는다.

이러한 3개 리보자임 중 어느 하나와 840개 뉴클레오티드 CAT 전사체를 함께 항온 처리한 경우, 효과적이며 고도로 서열-특이성을 갖는 절단이 일어나(제5도) 각 반응에서 2개의 RNA 단편을 생성한다. 이 단편의 크기는 예상되는 절단부위와 일치하였다(즉, 139 내지 696, 494 내지 341, 662 내지 173 염기 단편은 3개의 촉매 절단에 대한 RzCAT-1으로부터의 5' 및 3 생성물임) 이러한 리보자임-촉매 절단에 필요한 조건은 자연 발생의 절단 반응에서 관찰되는 조건과 유사하며(Foster, A.C. and Symons, R.H., Cell 49 : 211-220(1987) 및 Foster, A.C. and Symons, R.H. Cell 50 : 9-16(1987)), 상승된 pH, 온도, 2가 양이온 농도(자료는 제시하지 않음)에서 더 효율적으로 절단된다. 이 3개의 리보자임은 과다한 몰농도로 존재하는 경우, 50℃에서 50mM Tris HCl, pH8.0, 20mM MgCl₂중에서 60분 후에 거의 완전한 CAT RNA 기질의 절단을 촉매하였다. 유사한 조건 하에, 0.1μM 기질과 3μM 리보자임을 사용한 경우 CAT mRNA 기질의 T_1/2은 RzRNA-1 내지 3의 존재 하에 각각 3.5, 3.5 및 2.5분이었다. 리보자임 서열은 기질 RNA의 상보물(즉, (+) 가닥)과 올리고데옥시리보뉴클레오티드 형태(자료는 제시하지 않음)에 대해서는 불활성적이었다. 각 리보자임 촉매 반응으로 산출된 3'말단의 절단 단편을 분리하고 5'³²P-키나아제 처리하였다(37℃에서 30분 동안, 50uCi, γ-³²P ATP 및 5유니트의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 함께 50mM Tris HCl pH9, 10mM MgCl₂10mM DTT사용). 이 단편들의 효율적인 키나아제 처리 반응은 이 단편들이 자연 발생의 절단 반응에서 생성되는 것과 유사하게 5' 말단의 히드록시기를 갖고 있다는 것을 나타냈다.

Rzcat-1 내지 3에 의한 CAT 서열의 절단으로 생성된 단편의 말단 뉴클레오티드를 결정한다. 간단히 요약하면, 방사능 표시된 단편을 5% 폴리아크릴아미드겔로 정제하고 동 부피의 500유니트/ml RNase T1, 25유니트/ml RNaseT2 및 0.125mg/ml RNase A를 50mM 암모늄 아세테이트 pH4.5 중에서 120분간 37℃로 분해시킨다. 생성물을 25mM 소듐 시트레이트, pH3.5의 7몰 우레아를 포함한 20% 폴리아크릴 아미드겔상에서 분리한다. 제5b도는 RzCAT-1 내지 3에 의한 CAT 서열의 절단이 각각 뉴클레오티드 A.U 및 G 앞에서 정확하게 발생하는 것으로 나타났다.

CAT 유전자 단편의 말단 서열은 염기-특이적 부분 RNA 분해성 절단을 이용하는 부분적인 효소 절단기법(Donis-Keller et al., Nucleic Acids Res. 4 : 2527-2538(1980))을 사용하여 직접 서열 결정한다. 이러한 단편의 서열 결정으로 CAT RNA 내의 예상 위치에서 절단이 일어난 것을 확인했다(나타내지 않음).

효소 촉매 :

리보자임이 촉매 방식으로 CAT mRNA 기질을 절단시키는 지를 증명하기 위하여, 각 리보자임을 효율적인 절단과 생성물 분리가 모두 용이한 조건 하에서 과량의 기질과 함께 항온처리했다 제6도는 50℃, pH8.0, 20mM MgCl₂중에서 75분 후에 10pmole RzCAT-1이 163pmole의 절두형 CAT mRNA(173 염기) 기지를 촉매 특이적 절단시켜 각각 139 및 34 염기의 5' 및 3' 단편을 생성한다는 것을 나타낸 것이다. 보통, 각 리보자임은 10가지 이상의 절단 반응에 참여한다. 50℃에서 75분 후, 극한 조건으로 인한 일부 RNA의 비 특이성 절단이 발생했지만 나머지 본래 RNAs(163pmole)의 70%는 139 염기 단편으로서 축적되었다. 유사한 결과가 RzCAT-2와 3의 경우에도 수득되었고(자료는 나타내지 않음), 따라서 각각은 RNA 효소로서 작용했다.

실시예 3

리보자임 활성에 미치는 온도의 영향

시험관내 리보자임 활성율에 대한 반응 온도의 영향을 조사하였다. 37℃와 50℃에서 CAT RNA 기질에 대한 리보자임 RzCAT-1 내지 3의 시간 경과에 따른 반응을 진행시켰다.

본 실험에서, 각 리보자임의 반응을 실시예 2에서 설정한 리보자임 절단의 반응 조건을 사용하여 2회 반복하였다. 1차 반응은 37℃에서, 2차 반응은 50℃에서 항원처리하였다. 샘플을 90분까지 각 시간점마다 채취하고 반응 생성물을 변성된 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 반응 정도에 대해 분석했다. 제7도는 37℃와 50℃에서 리보자임 RzCAT-1 내지 3 각각에 대한 시간 경과에 따른 반응과정을 나타낸 것이다. 각 리보자임의 반응율은 반응 온도가 증가할수록 증가한다.

CAT RNA의 50% 절단에 소요되는 시간(t_1/2)을 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이, 37℃에서의 리보자임의 반응율은 50℃에서의 반응율 보다 약 20배 느리다.

실시예 4

리보자임 촉매 활성에 대한 리보자임의 다양한 아암 길이(또는 인접 서열)변화의 효과

리보자임의 아암 또는 인접 서열(식 1의 영역(1))은 타겟 RNA에 리보자임을 하이브리드시킨 후, RNA절단을 일으킨다. 본 실험에서, 타겟 서열에 대한 리보자임 아암의 연속적인 염기쌍의 길이와 상보성 정도를 변화시키므로써 타겟 서열의 절단율에 대한 효과를 조사했다.

리보자임은 각 아암 상의 타겟 서열 RzCAT-2에 대해 4개, 8개 및 12개의 염기 상보성을 갖게 제조했다(제3a도). 리보자임은 실시예 2의 방법에 따라 제조한다. 리보자임 활성은 전술한 바와 같이 CAT RNA와 함께 리보자임 RNA를 항온처리 측정했다.

각 아암 상에 4개의 염기 상보성을 갖는 리보자임은 기질 RNA를 절단하지 않는다. 각 아암 사에 8개의 염기 상보성을 갖는 리보자임은 12개의 염기 상보성을 갖는 리보자임처럼 CAT 기질을 절단했다. 시험관내 반응율로 판단할 때, 12개의 염기 상보성을 갖는 리보자임은 더 적은 수의 염기 상보성을 리보자임보다 더 효과적으로 타겟 RNA를 절단했다. 따라서, 4개 염기보다 많은 염기 상보성을 갖는 것이 필수적이지만, 리보자임의 하이브리드화 영역의 길이를 증가시키면 반응율로 증가하게 된다.

제2실험으로, (a) CAT 전사 타겟 RNA의 종 길이에 대한 상보성과 (b) 다중 촉매 분역을 갖는 리보자임의 반응 효율성을 조사하였다.

CAT RNA 서열 중 4개의 GUC 타겟 부위를 선택하였다. 이러한 부위에 대한 리보자임 촉매 분역을 시험할 CAT 전사 및 촉매 활성을 위한 완전한 안티센스(-)서열에 ''삽입시켰다.

선택한 4개의 부위는 전술한 RzCAT1 내지 3으로 나타낸 3개와 추가로 다음과 같이 나타낼 수 있는 한부위이다.

새로운 CAT 부위

#192

5'Hia His Aal Cys Asp Qly 3'

CQU CQU GCC GUC UGU GAU GGC

여기에서 192는 CAT 폴리펩티드 중의 아미노산 192를 말하며 절단부위이다.

이러한 절단부위가 각각 전개되고 리보자임 촉매분역을 포함하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 M13돌연변이 유발실험에 사용하여 그 내부에 삽입된 4개의 리보자임 촉매 분역을 가지며 CAT 서열의 전체 상보물을 포함한 서열을 생성한다. M13 돌연변이 유발반응은 우라실을 포함한 일본쇄 M13 DNA에 리보자임 삽입물을 포함한 올리고뉴클레오티드를 결합시킨 후, 그 삽입물을 포함한 상보성 DNA를 합성하므로써 수행한다. 이 상보성 DNA를 적당한 E.coli 균주 내에서 클로닝하여 회수한다(T.A. Kunkel 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 82 : 488-492). 수득되는 이본쇄 cDNA를 시험관 내 형질 발현 벡터에 클로닝시킨 후 T7 폴리머라제 전사 시스템을 사용하여 리보자임 RNA를 생성한다. 리보자임 활성은 리보자임 RNA를 CAT 전사체와 항온처리한 후, 그 반응 혼합물을 겔 전기영동시키고나서 글리옥살 처리를 하여 핵산을 변성시켜 측정한다.

자가 분해성 절단은 CAT 전사체 상의 모든 예상 부위에서 일어났다. 따라서, 아암이나 리보자임의 인접서열은 절단될 RNA 전사체의 전체 길이를 따라 전재될 수 있다.

제9도는 4개 리보자임을 각각 포함하는 촉매성 안티센스 RNA의 생성을 도식적으로 나타낸 것이다. 촉매성 안티센스 RNA는 약 900개의 염기를 포함한다.

상기 반응 조건하에서, 리보자임과 타겟 서열은 확장된 염기 쌍에 의해 고분자량의 복합체를 형성한다. 글리옥살 처리와 같이 강한 변성 처리는 전기 영동중에 반응 생성물을 분리시키는데 필요하다.

실시예 5

리보자임 절단을 위한 타겟 서열

mRNA중의 GUA 모티프를 사용하여 리보자임이 이 서열에서 RNA 절단을 실시할 수 있는지를 알기 위해 시험한다.

GUA 모티프(제10a도)를 포함하는 CATmRNA 중의 특위를 선택하고 적당한 리보자임 서열을 제조한 뒤 활성을 시험한다. 리보자임은 8개 리보뉴클레오티드 아암을 포함한다.

제10도의 리보자임에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드를 실시예 2에 따라 제조하고 이 이본쇄 cDNA를 시험관내에서 E.coli 내의 형질발현 벡터(pGEM4. 상기 참고)에 클로닝하여 T7 폴리머라제 전사 시스템을 사용해 리보자임 RNA를 생성한다. 리보자임 활성은 CAT mRNA와 함께 리보자임 RNA를 항온처리한 후 전술한 바대로 반응 혼합물을 겔 전기영동하여 측정한다.

이 리보자임은 GUA 타겟 부위에 대해 절단 효과가 있었다(나타내지 않음). 따라서, RNA 중의 모티프GUA는 본 발명의 리보자임의 기질이다. 이 부위는 하나의 sLTSV(satellite RNA lucerne transient streak virus)중의 자연 발생적인 한 절단 부위가 GUA 부위의 인식을 필요로 하므로 전혀 예상치 못한 것은 아니다.

이와 유사하게, CAT RNA 타겟 서열중의 GUU 모티프를 적당한 리보자임으로 시험하고(제10b도 참조)절단을 수행하였다.

실시예 6

비루스 RNA의 리보자임 절단

CEV(citrus exocortis) 비로이드 RNA형의 비로이드 RNA를 본 발명의 리보자임을 사용하여 절단했다.

CEV RNA 중에서 2개의 GUC 타겟 부위를 선택했다. 상보적인 가닥 서열중의 한 부위도 선택했다. 이러한 부위들에 대해서 리보자임을 제조하고 활성을 시험하였다. 이 리보자임을 CEV 9x(+), CEV 9x(-) 및 CEV 25x(+)로 명명한다. 제11도는 상기 각 리보자임에 대한 CEV RNA 중의 3개의 절단 부위를 나타낸다.

리보자임은 전술한 방법에 따라 제조했다. 리보자임 RzCEV 25x(+)는 제12도에 나타내었다. 이 리보자임은 CEV RNA의 뉴클레오티드 116에서 GUC 모티프를 절단한다.

제12(b)도는 리보자임 RzCEV 9x(+)로 CEV RNA를 절단한 결과를 나타낸 것이다. 리보자임 RzCEV 9x(-)로는 절단이 관찰되지 않았다.

이 실험은 리보자임이 다양한 근원의 타겟 RNA 서열에 대해 활성적임을 나타낸다. 모든 RNA가 동물, 식물 또는 미생물원에 상관없이, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실의 기본적인 리보뉴클레오티드 빌딩 블록으로 형성되므로 충분히 예상되는 것이다.

실시예 7

다양한 촉매분역을 갖는 리보자임의 예

CAT-2 부위를 표적으로 하는 리보자임은 SCMoV(Subterranean clover mottle virus)의 위성 RNA 유래의 촉매 분역 서열을 사용하여 제조한다. 12개의 염기 상보성을 지닌 리보자임 아암 인접 서열을 리보자임 RzSCMoV의 디자인에 병입시킨다. 리보자임 RzCAT-2와 RzSCMoV는 각각 제13a도 및 제13b도에 나타내었다. RzSCMoV의 루우프 영역은 5개 뉴클레오티드로 AAAUC 서열을 함유한다. 이것은 서열 AGAG를 갖는 4개 뉴클레오티드를 포함하는 RzCAT-2의 루우프 영역과 비교된다. 부가적으로, RzSCMoV는 RzCAT-2 중의 촉매 부위에 U^*대신에 C를 포함한다. RzCAT-2와 비교하였을 때 RzSCMoV의 상이한 서열은 표시되어 있다.

RzSCMoV는 실시예 2에 따라 제조한다. RzSCMoV는 활성이 있으며, 예상한 바대로 2개의 절단 생성물을 산출한다.

기타 실험에 있어서, CEV의 상보성 RNA 중 뉴클레오티드-336에 해당하는 CEV 타겟 부위를 제14a도에 예시된 서열을 갖는 리보자임(RzCEV2)을 사용하여 절단한다. 제14도에서 문자 ''L''로 규정된 루우프 영역은 서열 3'-CCTATA-5'를 갖는 6개 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 서열 3'-AGAG-5'를 갖는 4개 뉴클레오티드를 포함하는 sTobRV의 루우프 영역과 구별된다. 이 보자임은 제14b도의 전기 영동 프로파일에 나타낸 바와 같이 -336 위치에서 타겟 CEV 상보성 RNA를 절단한다.

이 실험은 루우프 영역의 뉴클레오티드 수와 뉴클레오티드 서열이 리보자임 활성에 있어서 중요하지 않다는 것을 나타내고 있다. 본 실험에 있어서, 리보자임은 본 명세서에 전술된 방법에 따라 제조한다.

또 다른 실험으로서, 리보자임 활성에 대한 촉매 분역(줄기 영역) 내의 염기 쌍의 효과를 조사하였다. 그 이외의 염기 쌍을 포함하지만 RzCAT-2에 상응하고 4개의 초과 염기 쌍을 함유하는 변형된 리보자임을 제조하여 시험하였다. 제15a도에서, 리보자임 RzCAT-2의 서열은 타겟 CAT RNA에 하이브리드하는 것으로 나타났다. 시험 리보자임을 제15b도에 나타냈고, 박스에는 부가의 염기쌍을 나타내었다. 시험 리보자임은 RzCAT-2의 활성과 비교되는 활성을 갖고 있었다 이것은 리보자임 촉매 분역의 염기 쌍 영역이 촉매 활성에 영향을 미침이 없이, 다양한 길이를 가질 수 있다는 것을 나타낸다.

돌연변이 식물에서 형질 발현된 sTobRV RNA 전사체의 안정한 생체내 형태는 아마도 5'및 3' 말단의 결찰 결과로서 주로 원형이다. 따라서, 생체내 RNA 전사체중에서 목적하는 서열에 인접한 2개의 자가분해 절단부위를 사용하면 선형 전사체보다 더 안정성을 가질 수 있는 원형 생성물로 유도되기 쉽다. 이 시도는 리보자임 서열을 생체내에서 안정화시키는 신규 방법이다. 이것을 원형화라 명명한다.

실시예 8

생체내 리보자임 활성

식물 세포 생체내의 리보자임 활성을 본 실시예에서 조사하였다.

실험방법

항-CAT(CAT=클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제) 또는 복합된 항-CAT/리보자임 유전자 작제물(하기 참고)을 포함하는 플라즈미드를 기능성 CAT 유전자 작제물을 포함하는 다른 플라즈미드와 함께 동량으로, 그리고 서로 상대적인 비율로 담배 원형질에 도입한다. CAT 활성을 측정하고 유전자 활성의 기준치와 비교한다.

재료 및 방법 :

(a) 전기 영동과 CAT 분석

일리웰린 등에 의해 기술된 바에 따라 수행한다(Llewellyn et al. J.Mol. Biol.(1987) 195 : 115-123). 간단하게 요약하면, 니코티아나 플럼바지니폴리아주 T5의 원형질을 10mM HEPES, pH 7.2, 150mM NaCl, 0.2M 만니톨중에 현탁시켜 밀도 3×10⁶/ml로 맞춘다. 250V에서 50ms 펄스를 일회 사용하여 일렉트로포레이션을 수행한다. 원형질을 10배 희석하고 20시간 동안 26℃의 암실에서 배양한다. 이 원형질체를 소니케이션(sonication)으로 파쇄하고 추출물을 수득한다. 추출물을 단백질 함량에 대해 규정화하고,¹⁴C-클로람페닐콜과 아세틸 CoA를 사용하여 시험관내에서 CAT 활성을 분석한다. 반응 생성물을 박층 크로마토그래피로 분리하고 자동 방사선 사진술로 가시화시킨다. 반응 정도는¹⁴-C-클로람페니콜 주형(template)으로부터의 방사능 생성물 유도체 생산으로 측정한다.

(b) 유전자 작제물

유전자 작제물을 박테리아로부터 추출과 2회의 CsCl 평균 밀도 구배 원심분리법으로 정제한 플라즈미드 DNA로서 원형질 현탁액 0.1ml 내로 도입시켰다. 이것을 10mM Tris/1mM EDTA/pH=7.5 중에 재현탁하여 사용한다.

활성 CAT 유전자 작제물은 pCAT7+로 명명되는 플라즈미드에 함유되어 있었다. 이것은 플라즈미드 pJ35SN(pJ35SN으로부터 유도됨, W.L. Gerlach et. al.,1987, Nature 328 : 802-805)에 CAT 유전자 서열(플라즈미드 pCM4로부터 유도됨, T.J. Close and R. Rodriguez, 1982, Gene 20 : 305-316 참고)을 융합시켜 다음과 같은 활성 유전자 작제물을 제조한다 :

35S는 35S CaMV(cauliflower vosaic mirus) 프로모터를 나타내며, NOS는 노팔린 합성효소 폴리아데닐화 신호를, T/C는 전사를 나타낸다.

이 pCAT7+0.2μg과 함께 하기에 기술한 바와 같은 다양한 유전자 작제물을 과량으로 첨가한다. 이 유전자 작제물이 하기 명칭의 플라즈미드내에 포함되었다 :

pJ35SN-제16도에 나타낸 지도를 갖는 벡터 플라즈미드는 35S CaMV 프로모터와 식물의 노팔린 합성효소 3' 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 이것은 다음과 같이 도식된다.

pCAT7-이것은 pJ35SN에 삽입된 CAT 유전자 서열을 포함하여 전사 결과 안티센스 CAT RNA를 생성하여, 다음과 같이 도식된다 :

pCAT19-이것은 그 내부에 4개의 촉매성 리보자임 분역을 갖는 CAT 유전자를 포함하며(실시예 4와 제9도 참고), PJ35SN에 삽입되어 전사 결과 4개의 촉매성 리보자임 분역을 포함하는 안티센스 CAT RNA를 생성하게 되며, 다음과 같이 도식된다 :

결과 :

하기의 표는 일렉트로포레이션한지 20시간후 세포중의 상대적인 CAT 활성을 나타낸 것이다. 활성은 1시간 분석중 클로람페니콜 기질의 전환율로서 나타낸다.

(각 처리에 있어서 A와 B는 복제물임)

상기 결과로부터 하기의 결론을 유출해 낼 수 있다 :

(a) CAT 유전자 작제물을 도입하면 현저한 CAT 활성이 나타난다-1A, 1B와 2A, 2B를 비교하라. 복제물간에는 가변성이 있다. 다른 샘플중에서 관찰되는 경향으로부터(하기 b와 c 참고) 2A는 비정상적으로 낮은 활성을 나타내는 것 같다.

(b) 안티센스 유전자 작제물을 동시 도입하면 활성율이 감소한다(2B와 3A, 3B 및 4A, 4B 비교). 감소 정도는 플라즈미드로 첨가된 안티센스 유전자의 레벨과 직접 관련이 있다(3A, 3B와 4A, 4B 비교).

(c) 복합된 안티센스/리보자임 유전자 작제물을 동시 도입하면 유전자 활성이 감소한다(2B와 5A, 5B 및6A, 6B 비교). 또한, 안티센스 유전자 작제물의 상응하는 레벨보다도 감소가 더 크게 나타났다(3A, 3B와 5A, 5B 비교, 4A, 4B와 6A, 6B 비교).

4가지 생체내 실험에 대한 평균 결과를 제17도에 나타내었다. 이 도면에서 대조군은 처리 2이고, 안티센스는 처리 4이며, 촉매는 처리 6, 배경은 처리 1이다.

안티센스 리보자임이 평균 24%로 CAT 활성을 억제하는데 반해, 촉매 리보자임은 평균 47%로 CAT 활성을 억제했다.

식물 세포로 리보자임-함유 유전자를 도입하면 리보자임이 표적으로 하는 유전자의 활성을 억제한다. 또한, 상응하는 안티센스 RNA 분자보다도 억제율이 더 커진다.

이러한 결과는 리보자임이 일정 범위의 타겟 RNA 분자에 대하여 동물, 식물 또는 미생물 세포내에서 활성이 있음을 나타내는 것이다.

본 실시예에 있어서 리보자임의 작용 메카니즘은 불명확하다. 예를 들면, 안티센스 리보자임은 타겟 RNA에 비가역적으로 하이브리드하여 타겟 RNA를 따라 하나 이상의 소정 타겟 부위에서 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매할 수 있다. 대안적으로 세포성 효소가 안티센스 RNA를 그 타겟 서열로부터 해리시켜, 타겟 RNA를 두개 이상의 단편으로 절단시킬 수 있다.

실시예 9

동물 세포의 생체내 리보자임 활성 :

포유류 세포내의 타겟 RNA를 블활성화시키는 리보자임의 활성은 본 실시예로 입증한다.

재료 및 방법 :

리보자임을 암호하는 활성 유전자 작제물을 입수용이한 원숭이 신장 세포주 COS1에 일렉트로포레이션시켜 형질 감염시켰다. 이 방법에서는 10% FCS(태중 송아지의 혈청)을 포함하는 생리 식염수중에 현탁시킨 3×10⁶/ml COS1 세포를 여러 유전자 작제물과 접촉시키고 세포에 DNA를 일렉트로포레이션시키기 위해 전기 방전시켰다. 형질 감염된 세포를 48시간 동안 배지중에서 37℃하에 배양한 후 CAT 및 루시페라아제 활성을 분석하였다.

CAT 유전자 작제물을 pTK CAT(Miskicek et al., Cell 46 : 283-390, 1986)로 명명되는 플라즈미드에 포함시킨다. 이 플라즈미드는 CAT 유전자 서열을 플라즈미드 pSV2내로 HSV(단순 포진 비루스)의 티미딘키나아제 프로모터의 조절하에 있도록 도입시켜 제조한다.

리보자임을 암호하는 유전자 작제물은 SV40 전기 프로모터에 융합된 루시 페라아제 유전자를 포함하는 플라즈미드 pSV 232A(De Wet et al., Molecular and Cellular Biology 7 : 725-737, 1987)에 포함시킨다. 리보자임을 암호하는 DNA를 매니아티스 등의 표준 방법에 따라 루시페라아제 유전자의 3' 말단에 있는 Xba I 부위에 결찰시켰다(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1982).

다음 작제물은 매니아티스 등의 기본 기법을 사용하여 제조한 것이다(상기 문헌) :

pFC 58-이 플라즈미드 벡터는 비기능적 배향으로 루시페라아제 유전자의 3' 말단에 융합된 리보자인 RzCAT-1을 암호하는 DNA를 포함한다. 이것을 도식하면 다음과 같다 :

여기에서, 232A는 pSV 232A 서열을 나타내며, SV40 전기는 SV40의 전기 프로모터를 나타내며 작은 T는 SV40의 작은 T 중재 서열을 암호하는 DNA이다. 이 작제물은 결과적으로 루시페라아제와 리보자임 RzCAT-1을 암호하는 RNA 분자를 생성하며, RzCAT-1은 촉매성이 아닌 배향하에 있다.

pFC4-이 플라즈미드는 RzCAT-1이 RzCAT-3으로 대체되는 점 이외는 pFC58과 동일하다.

pFCl-6-이 플라즈미드는 RzCAT-1이 센스 배향(5'-3)의 RzCAT-3으로 대체되는 점외에는 pFC58과 동일하다.

pFC20-이 플라즈미드는 RzCAT-3이 8개의 뉴클레오티드 인접 서열을 갖는 RzCAT-2로 대체되는 점이외에는 pFCl-6과 동일하다.

pFC12-이 플라즈미드는 리보자임 RzCAT-2가 12개의 뉴클레오티드 인접 서열을 포함하는 점 이외에는 pFC20과 동일하다.

pFC50-이 플라즈미드는 센스 배향(5'-3)으로 함유된 4개의 촉매성 리보자임 분역을 갖는 CAT 유전자를 포함하며(실시예 4와 제9도 참고), 전사되어 불활성 리보자임을 산출한다. 이 플라즈미드는 다음과 같이 도식된다 :

pFC54-이 플라즈미드는 CAT 유전자와 리보자임 분역이 안티센스(3'-5') 활성 배향으로 배치된 점을 제외하고, pFC50과 동일하다.

pFC64-이 플라즈미드는 pFC50과 SV40 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 공유하며 리보자임 분역이 삽입되지 않은 야생주 CAT 유전자를 포함한다. 이 유전자는 안티센스 배향으로 CAT 단백질을 생산하지 않는다.

pFC65-이 플라즈미드는 야생주 CAT 유전자가 센스(5'-3') 배향에 있으며 따라서 CAT 단백질을 생성할 수 있다는 점외에는 pFC64와 동일하다.

분석법 :

루시페라아제 활성은 드

트 등의 방법에 따라 분석한다(상기 문헌 참조). 간단하게 요약하면, COS 세포를 형질 감염시킨지 48시간 후에 용균시키고, 이 세포 용균물을 루시페라아제의 기질인 루시페린과 함께 항온 처리하고, 발광성(luminescence)을 신틸레이숀 계수기를 사용하여 측정한다.

CAT 활성도 또한 Sleigh, M.J.(Anal. Biochem. 156 : 251-256(1986)의 방법에 따라 COS 세포 용균물을 사용하여 측정한다(세포 용균물은 둘로 나누고 각 분획을 루시페라아제 또는 CAT 활성에 대해 분석한다).

생체내 분석에 있어서, pFC58과 pFC4는 형질감염된 세포중에서 CAT 활성에 영향을 미치지 않았다. 이 활성을 100% CAT 활성 및 0% CAT 억제성으로 나타낸다. 기타 플라즈미드로 형질감염된 세포중의 CAT활성을 pFC58에 상대적으로 비교하여 측정했다. CAT 억제율 %는 다음과 같이 측정하였으며, 루시페라아제 생성으로 규정화시켰다.

CAT 시험은 시험 작제물에 대한 CAT 분석 결과이며 CAT 대조군은 대조군 작제물에 대한 CAT 분석결과이다(pFC4와 pFC58).

루시페라아제 생성은 일렉트로포레이션에 대한 내부 대조군으로, 각각 개별적으로 일렉트로포레이션된 조직 배양판내에서 리보자임 생성의 척도를 제공한다.

결과 :

실험(ⅰ)

일렉트로포레이션된 플라즈미드(μg)/1.5×10⁶세포

모든 처리는 2 반복으로 수행하여 평균값을 제시한 것이다.

실험(ⅱ)

일렉트로포레이션된 플라즈미드(㎍)/1.5×10⁶세포

처리 5 내지 10은 2 반복으로 수행하여 평균값을 제시한 것이다.

실험(ⅲ)

일렉트로포레이션된 플라즈미드(㎍)/1.5×10⁶세포

처리는 5회 반복 수행하여 평균 값을 제시하였다.

실험(ⅳ)

일렉트로포레이션된 플라즈미드(㎍)

처리 13 내지 16 각각은 4회 반복 수행한 것이다.

센스 CAT 작제물(처리 16)은 정상 상태에서 높은 수준의 CAT 활성을 제공한다. 따라서 억제율(%)은 적절하지 않다(NA).

pTKCAT의 TK 프로모터를 인체의 메탈로티오네인 프로모터로 대체시켜 수많은 실험을 실시하였다. 이 CAT 작제물을 하나 이상의 리보자임을 암호하는 플라즈미드와 함께 사용해 COSl 세포를 동시 형질 감염시키면, CAT 활성이 현저하게 감소하였다.

상기 결과로 동물 세포중에서 리보자임의 생체내 불활성화 활성이 명백하게 입증되었다.

생체 내에서의 리보자임의 효율성은 타겟 RNA을 절단할 수 있는 하나 이상의 촉매 영역에 의해 야기되는 것으로 사료되는 반면, 안티센스 RNA형 리보자임 내에 상기 촉매 영역의 존재는 실질적으로 전체 RNA/안티센스 RNA 분자가 떨어져 있지 않다면 생체내에서 절단 반응을 실제로 유도할 수 없을 것이다. 그러나, 분자가 떨어져 있는지의 여부에 상관없이, 전술한 실시예는 타겟 RNA를 불활성화시키는 리보자임의 효율성을 입증하고 있다. 따라서, 본 발명은 실질적으로 타겟 RNA에서 발생하는지에 관계없이 절단을 일으킬 수 있는 촉매 영역과 하이브리드 영역을 갖는 모든 리보자임에 적용할 수 있다. 즉, 하이브리드 영역은 매우 커서, 결합된 RNA/리보자임이 함께 결합하여 존재하고, 촉매 영역이 스스로 절단을 일으킬 수도 있지만 분리된 성분으로 타겟 RNA가 절단되는 것을 방지할 수 있다.

Claims

(ⅰ) 일정 절단 부위에서 타겟 RNA를 절단하며 타겟 RNA의 서열과는 무관한 촉매 활성을 지닌 촉매 영역, 및 (ⅱ) 그 촉매 영역의 5' 말단으로부터 신장된 하이브리드화 아암 및 촉매 영역의 3' 말단으로부터 신장된 하이브리드화 아암을 함유하는 9개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 하이브리드화 영역을 포함하고, 이때 아암의 길이는 상기 일정 절단 부위에 인접한 타겟 RNA중의 상보적인 서열의 영역에 안정하게 하이브리드시키기에 충분한 길이인, 상기 일정 절단 부위에서 타겟 RNA 분자를 절단할 수 있는 올리고리 보뉴클레오티드 화합물.
제1항에 있어서, 하기 식(1)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 :

상기 식중에서, 각 X는 동일하거나 상이할 수 있는 리보뉴클레오티드를 나타내며 ; (X)n 및 (X)n' 각각은 절단될 RNA 타겟 서열과 염기쌍을 통해 상호작용할 수 있으며, 서열 X-A-A-G-C- 및 X-C-U-G-A-에 각각 천연적으로 공유결합하지 않는 소정의 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고 ; n 및 n'는 각각 n+n'의 합이 7 이상이고 염기쌍을 통해 RNA 타겟 서열과 리보자임이 안정하게 상호작용할 수 있도록 하기에 충분한 수인 상기 올리고리보뉴클레오티드중의 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수이고 ; 각^*는 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간의 염기쌍을 나타내며 ; 각각의 직선은 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학결합을 나타내고; a는 0이거나 1일 수도 있는 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수로서, 0인 경우 (X)_a의 5'쪽에 위치한 A는 (X)_a의 3'쪽에 위치한 G에 결합하게 되며, m 및 m' 각각은 1 이상의 정수를 나타내고 ; 각 점선은 각각 어느 한쪽 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내거나 그러한 화학 결합이 존재하지 않음을 나타내며 ; (X)_b는 존재하거나 존재하지 않을 수도 있고 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고, 단 (X)_b가 존재하는 경우에는 b는 2이상의 정수를 나타낸다.
제1항에 있어서, 하기 식(2)를 갖는 올리고리보뉴클레오티드 화합물 :

상기 식중에서, 각 X는 동일하거나 상이할 수도 있는 리보뉴클레오티드를 나타내고 ; (X)n 및 (X)n' 각각은 절단될 RNA 타겟 서열과 염기쌍을 통해 상호작용할 수 있으며, 서열 A-A-A-G-C- 및 X-C-U-G-A-에 각각 천연적으로 공유결합하지 않는 소정의 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고; 이때, n 및 n'는 각각 n+n'의 합이 7 이상이고 염기쌍을 통해 RNA 타겟 서열과 화합물이 안정하게 상호작용할 수 있도록 하는 충분한 수의 조건하에서 상기 올리고리보뉴클레오티드중의 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수이고 ; 각^*는 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간의 염기쌍을 나타내며 ; 각각의 직선은 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드가 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내고 ; a는 0이거나 1일 수도 있는 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수로서, 0인 경우(X)_a의 5'쪽에 위치한 A는 (X)_a의 3'쪽에 위치한 G에 결합하게 되며 ; m 및 m' 각각은 1 이상의 정수를 나타내고 ; 각 점선은 각각 어느 한쪽 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내거나 그러한 화학 결합이 존재하지 않음을 나타내며 ; (X)_b는 존재하거나 존재하지 않을 수도 있고 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고, 단 (X)_b가 존재하는 경우에는 b의 2 이상의 정수를 나타낸다.
제1항에 있어서, 하기 식(3)을 갖는 올리고리보뉴클레오티드의 화합물 :

상기 식중에서, 각 X는 동일하거나 상이할 수도 있는 리보뉴클레오티드를 나타내고; (X)_n-1및 (X)_n'각각은 절단될 RNA 타겟 서열과 염기쌍을 통해 상호작용할 수 있으며, 서열 C-A-A-A-G-C- 및 X-C-U-G-A-에 각각 천연적으로 공유결합하지 않는 소정의 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고; 이때, n및 n'는 각각 n+n'의 합이 7이상이고 염기쌍을 통해 RNA 타겟 서열과 올리고리보뉴클레오티드 화합물이 안정하게 상호작용할 수 있도록 하는 충분한 수의 조건하에서 상기 올리고리보뉴클레오티드중의 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수이고 ; 각^*는 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간의 염기쌍을 나타내며 ; 각각의 직선은 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내고; a는 0이거나 1일 수도 있는 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수로서, 0인 경우 (X)_a의 5'쪽에 위치한 A는 (X)_a의 3'쪽에 위치한 G에 결합하게 되며 ; m 및 m' 각각은 1 이상의 정수를 나타내고 ; 각 점선은 각각 어느 한쪽 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내거나 그러한 화학 결합이 존재하지 않음을 나타내며 ; (X)_b는 존재하거나 존재하지 않을 수도 있고 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고, 단 (X)_b가 존재하는 경우에는 b는 2 이상의 정수를 나타낸다.
제1항에 있어서, 하기 식(4)를 갖는 올리고리보뉴클레오티드 화합물 :

상기 식중에서, 각 X는 동일하거나 상이할 수도 있는 리보뉴클레오티드를 나타내고 ; (X)_n-1및 (X)_n'각각은 절단될 RNA 타겟 서열과 염기쌍을 통해 상호작용할 수 있으며, 서열 C-A-A-A-G-C- 및 X-C-U-G-A-에 각각 자연적으로 공유결합하지 않는 소정의 서열을 갖는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고 ; 이때, n 및 n'는 각각 n+n'의 합이 7 이상이고 염기쌍을 통해 RNA 타겟 서열과 올리고리보뉴클레오티드 화합물이 안정하게 상호작용할 수 있도록 하는 충분한 수의 조건하에서 상기 올리고리보뉴클레오티드중의 리보뉴클레오티드의 수를 나타내는 정수이고; 각^*는 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간의 염기쌍을 나타내며 ; 각각의 직선은 어느 한쪽의 리보뉴클레오티드 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내고 ; m 및 m' 각각은 1 이상의 정수를 나타내고 ; 각 점선은 각각 어느 한쪽 상에 위치한 리보뉴클레오티드간 공유결합을 제공하는 화학 결합을 나타내거나 그러한 화학 결합이 존재하지 않음을 나타내며 ; (X)_b는 존재하거나 존재하지 않을 수도 있는 올리고리보뉴클레오티드를 나타내고, 단 (X)_b가 존재하는 경우에는 b는 2 이상의 정수를 나타낸다.
제2항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, n+n'의 총 합이 14 이상인 것을 특징으로 하는 올리고리보뉴클레오티드 화합물.
제2항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, n 및 n' 각각이 6보다 큰 것을 특징으로 하는 올리고리보뉴클레오티드 화합물.
하기 식(5)를 갖는 화합물 :

3' -〔-(Y)_r-Q-(Y)₃-〕_z-5'

상기 식중에서, Q는 제2항의 화합물을 나타내고 ; 각 Y는 동일하거나 상이할 수 있는 리보뉴클레오티드를 나타내며 ; r 및 s 각각은 0 이상일 수 있는 정수를 나타내고 ; z는 1 이상일 수 있는 정수를 나타낸다.
제1항 및 제2항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 절단될 RNA 타겟 서열이 바이러스 RNA 서열인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 화합물.
세포내의 타겟 RNA를 제1항의 화합물과 접촉시켜, 그 화합물이 타겟 RNA와 염기쌍을 형성하여 안정하게 상호작용한 뒤 타겟 RNA가 절단될 수 있는 조건하에서 세포내의 표적 RNA를 불활성화시키는 방법.
제10항에 있어서, 타겟 RNA가 세포에 대해 내인성인 유전자의 전사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 타겟 RNA가 세포에 대해 외인성인 유전자의 전사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 세포가 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 세포가 식물 또는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 식물 세포가 식물의 한 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 화합물과 함께 약학적, 수의학적, 또는 농업적 허용성 담체를 포함하여 동물의 바이러스 질환 또는 식물 바이러스 또는 식물 비로이드 질환 치료용 조성물.
(a) 제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물에 상응하는 뉴클레오티드 서열, DNA, RNA 또는 그 복합체로 구성된 전이 벡터에 결찰시키는 단계 ; (b) 상기 단계(a)의 뉴클레오티드 서열을 RNA 폴리머라제로 전사시키는 단계, 및 (c) 상기 화합물을 회수하는 단계로 구성되는, 제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물을 제조하는 방법.
전사시 제1항의 화합물을 산출하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 RNA 또는 DNA 또는 그 복합체로 구성된 전이 벡터.
일정한 내인성 또는 외인성 타겟 RNA를 절단 및 불활성화시키기 위해 일정한 절단부위에서 상기 타겟 RNA를 절단할 수 있는 제1항의 외인성 올리고리보뉴클레오티드를 포함하는 진핵 숙주 세포.
제18항의 전이 벡터와 함께 약학적, 수의학적 또는 농업적 허용성 담체를 함유하는, 동물의 바이러스질환 또는 식물의 바이러스 또는 비로이드 절환 치료용 조성물.
제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물 또는 전사시 그 화합물을 산출하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 원핵 또는 진핵 세포.
제21항의 진핵 세포.
제22항의 식물 세포 또는 동물 세포.
제23항의 식물 세포를 함유하는 식물.
제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물 또는 제18항의 전이 벡터를 사용하는 것으로 구성되어, 인간을 제외한 동물중의 타겟 RNA와 관련된 질환을 치료하는 방법.
제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물 또는 제18항의 전이 벡터를 사용하는 것으로 구성되어, 식물내의 타겟 RNA를 불활성화시키는 방법.
제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물 또는 제18항의 전이 벡터를 사용하는 것으로 구성되어, 인간을 제외한 동물의 바이러스 질환을 치료하는 방법.
소정의 절단 부위에서 타겟 RNA를 절단할 수 있는 제1항의 올리고리보뉴클레오티드 화합물, 또는 전사시 이 화합물을 생성할 수 있는 외인성 핵산 서열을 진핵 세포내로 도입시켜 상기 타겟 RNA가 절단되어 불활성화되도록 하는 조건하에서 그 타겟 RNA를 불활성화시키는 것으로 구성되는 진핵 세포내의 타겟 RNA를 불활성화시키는 방법.
제28항에 있어서, 올리고리보뉴클레오티드 화합물이 진핵 세포내에서 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제28항에 있어서, 올리고리보뉴클레오티드 화합물이 진핵 세포외에서 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.