CN1033838A

CN1033838A - 核糖酶

Info

Publication number: CN1033838A
Application number: CN88108572A
Authority: CN
Inventors: 威尼·来利·吉尔拉赫; 詹姆斯·飞利普·哈塞罗夫; 菲利普·安托尼·简宁斯; 费欧纳·海伦·卡麦荣
Original assignee: National Scientific And Industrial Research Society
Current assignee: National Scientific And Industrial Research Society
Priority date: 1987-12-15
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1989-07-12
Anticipated expiration: 2003-12-15
Also published as: EP0321201A3; NO312105B1; DK143390D0; FI902923A0; GR3015374T3; AR243935A1; EP0321201B1; FI104562B; KR970010758B1; NO902661D0; HUT54407A; EP0640688A1; JPH03502638A; AU632993B2; ES2065919T5; CA1340831C; EP0321201A2; AU2800789A; DE3852539D1; KR900700603A

Abstract

叙述了具有高特异性的核糖核酸酶活性的合成 RNA分子(下面称之为核糖酶(ribozymes)。该核糖酶包含一个具有至少与靶RNA部分互补的核苷酸序列的杂交区和一个适于裂解靶RNA的催化区。还叙述了钝化RNA的方法和含该酶的组合物。

Description

本发明涉及一类合成的RNA分子及其衍生物，下面称为核糖酶（ribozymes），它具有高度特异性核糖核酸内切酶活性。

一些天然存在的RNA分子如：鳄梨日斑病类病毒（ASBV），烟草环斑病毒（s TobRV）和紫花苜蓿暂居条斑病毒（s LTSV）的随体RNA都经历自我催化裂解。这种裂解似乎是这些及其它RNA生命循环中的一个必不可少和独特的组成部分。

RNA自我催化裂解反应都需要二价金属离子和中性或较高PH，结果产生具有5′羟基和2′，3′环状磷酸基团末端的RNA（Prody等人，Science 231：1577-1580（1986）和Buzayan等人.，Virology 151：186-199（1986））。裂解反应是由RNA本身催化的，其原因假设是由于构型改变使其反应基团更接近。天然存在的RNA自然催化裂解点位于RNA二级结构的高度保守区（Buzayan等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8859-8862（1986）和Forster，A.C.and Symons，R.H.Cell 50：9-16（1987））。

我们在烟草环斑病毒（s TobRV）随体RNA上进行的实验已使我们设计出新的核糖核酸内切酶（下面称之为“核糖酶”），这类酶是由能催化RNA靶分子特异裂解的RNA组成的。

本说明书所用术语核糖酶是指包括整个RNA或其衍生物的分子。

本发明的核糖酶与在Tetrahymena Fhermophila（已知是IVS或L-19 IVS RNA）中天然存在的RNA核糖核酸内切酶明显不同，这种天然酶已由Thomas Cech和他的合作者深入讨论过（Zaug，A.J.等人，Science（1984）224：574-578;Zang，A.J. 和Cech，T.R.，Science（1986）231：470-475;Zaug，A.J.，等人，Nature（1986）324：429-433;由大学专利公司出版的国际专利申请No.WO88/04300）。赛克（Cech）核糖核酸内切酶具有一个由8个碱基对组成的活性部位，它与靶RNA序列杂交，然后在有游离乌苷或其衍生物存在下使靶RNA裂解。裂解产生的片段含5′端磷酸及3′端羟基。能与一种RNA底物杂交的核苷酸的数目有限，这限制了赛克核糖核酸内切酶的有效性或效率，因为一般来说，少于十二个核苷酸的寡核苷酸不易与靶序列杂交。似乎赛克核酸内切酶的活性部位的核苷酸数目需要保持以保证内切酶活性。这样就限制了活性部位序列的排列数目（对这种排列进行设计可实现与靶序列的杂交），从而限制了可由赛克内切酶酶解的RNA酶序列的范围。赛克内切酶还通过在裂解的RNA的5′端加入一个游离的乌苷酸而修饰RNA。

与上述天然酶形成鲜明对照的是，本发明的核糖酶能有效地与宽范围的一系列靶RNA序列杂交，而且不修饰裂解的靶RNA。

本发明的核糖酶包含一个至少与部分靶RNA在核苷酸序列上互补的杂交区和一个适合裂解靶RNA的催化区。该杂交区含9或更多个核苷酸。

本发明优选的核糖酶具有包含由单链RNA组成且具有一个至少与部分靶RNA互补序列的一个或多个臂，所述的一个或多个臂与能裂解所述靶RNA的催化区相连;当杂交区包含一个RNA单臂时，所述的臂包括至少9个核苷酸，而当杂交区包含2个或多个RNA臂时，所述臂中的核苷酸总数大于9。

在本发明的一个实施方案中，给出了一个式1的核糖酶：

其中X代表任意核糖苷酸，而且每个X残基可相同或不同;n与n′之和大于6并且n和n′可以相同或不同;（＊）表示互补核糖核苷酸间的一个碱基对;X′和X″代表沿着至少它们长度一部分的互补序列的寡核糖核苷酸，从而使得寡核苷酸间碱基可以配对，或X′和X″共同组成一个单个RNA序列，其中所述序列至少部分含有一个由互补核苷酸间碱基配对形成的短臂（stem）;式（1）化合物¹A的后面可任选插入选自A，G，C或U的一个附加核苷酸。

式（1）的（Ⅰ）区代表核糖酶的臂或侧翼序列，这些序列与靶RNA序列的相应部分杂交。该臂可沿着靶RNA全长或部分与其杂交。RNA的催化区示于式（Ⅰ）的（Ⅱ）区中。催化区可含一个或多个对催化活性无逆效应的附加核苷酸。对这种附加部分可根据本说明书不用特定的实验容易地进行核糖酶活性测定。催化区也可形成部分杂交区。

寡核糖核苷酸X′和X″可包含多达5，000或更多个核苷酸。

根据本发明的另一个实施方案，提供式（2）的核糖酶：

其中X代表任意核糖苷酸，每个X残基可相同或不同;（＊）代表互补核糖核苷酸间的一个碱基对;n和n′如上定义;m和m′是1或大于1，也可相同或不同;B代表一个键，一个碱基对，一个核糖核苷酸或一个至少含2个核糖核苷酸的寡核糖核苷酸;式（2）中¹A的后面可任选插入选自A，G，C或U的一个附加核苷酸。

本发明的核糖酶可根据先有技术中合成RNA分子的已知方法制备。（如：根据Promega，Madison，WI，USA推荐的方案）。特别是，本发明的核糖酶可从相应的DNA序列（根据该DNA转录得到一种核糖酶，可根据已知合成DNA的方法合成）来制备，该序列已功能地连接到诸如：T7RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶的启动子上。相应于本发明核糖酶的DNA序列可连接到诸如：质粒或噬菌体DNA的DNA转移载体中。转移载体含功能地连接到相应于该核糖酶的DNA上的RNA聚合酶启动子时，与RNA聚合酶温育可容易地产生核糖酶。因此，核糖酶可以在有各种核糖核苷酸存在下通过RNA聚合酶与功能地连接到相应于该核糖酶的DNA上的RNA聚合酶启动子一起温育来体外生产。在活体中，可用合适的转移载体转染原核或真核细胞（包括哺乳动物细胞和植物细胞），该载体含相应于本发明的核糖酶且功能地连接到一个RNA聚合酶启动子上的遗传物质，从而在宿主细胞中转录该核糖酶。转移载体可以是细菌质粒或病毒RNA或DNA。相应于核糖酶的核苷酸序列通常置于强启动子控制下，这些启动子有：1ac启动子，SV40晚期和早期启动子，金属硫堇（metallothionin）启动子或λ启动子。核糖酶可在活体中从转移载体直接被转录，或转录成一个较大RNA分子的一部分。例如，相应于核糖酶序列的DNA可连接到载体基因的3′端如：一个转移终止信号的后面。较大的RNA分子可帮助稳定该核糖酶分子免遭胞内核酸酶对它的降解。转译时，载体基因可产生蛋白质，可直接通过例如酶反应测试它们的出现。载体基因可以例如编码一种酶。

本发明再一个方面，提供一种DNA转移载体，该载体含有与一个启动子功能地连接的相应于核糖酶的DNA序列，从而转录出核糖酶。

生产核糖酶的一个优选方法中，通过标准步骤（如，采用Applied Biosystems Model 380A DNA合成仪（Applied Biosystems Inc.，Foster City，California 94404）制备互补序列的两种合成寡核糖核苷酸，然后使二者杂交。其中一个寡核苷酸是为所需核糖酶编码的。该杂交的寡核苷酸的各个端相应于不同的限制酶点，比方说，Eco R1在一端，Pst1在另一端。用合适的限制酶（上面例子中为EcoR1和Pst1）降解后，可将双链DNA片段克隆到转移载体中。当质粒载体在相应于本发明的一种核糖酶的DNA序列上游含有一个RNA聚合酶启动子时，相应于该核糖酶的RNA转录产物可很容易地在体外或活体中制备。当核糖酶由两半组成，这两半通过互补核苷酸碱基配对连接时，可根据以上方法先生产核糖酶的各一半，再将二者一起温育形成完整核糖酶。

本发明优选的核糖酶能使含X^·UY序列的靶RNA降解，其中X^·是任意核糖核苷酸，U是尿苷而Y是腺苷、胞苷或尿苷。X^·U形成碱基对侧翼区的一部分，而Y是不配对的碱基。X^·优选地但不是专一地是胍，而X^·UY是GUC或GUA。用本发明的核糖酶可降解任何含这些序列的RNA分子。含X^·UY序列的RNA转录产物的序列一经确定，就可以合成出与X^·UY序列两侧的靶序列上的RNA互补，从而可与之杂交的核糖酶序列的臂。核糖酶的臂一经与X^·UY序列两侧的靶RNA序列杂交。核糖酶的催化区就使X^·UY序列内的靶RNA降解。在有镁离子或其它二价阳离子及PH约8.0时有利于RNA降解。

因此，可设计出本发明的较好核糖酶，以切割其序列已知的任何RNA。被RNA中核糖酶切割下来的残基的高出现率（对于具有随意及等频率碱基分布的RNA中的GUC来说，为1∶64）意味着在任何给定的靶RNA中具有一些潜在的可被准确预测的核糖酶断裂位点。

另一方面，本发明提供了一种钝化靶RNA序列的方法，该方法包括使所说的靶RNA序列与本发明的核糖酶反应。

在体内，也就是在生物体的一个或多个细胞内，可将一个转移载体如细菌质粒或病毒RNA或DNA（它编码一个或多个核糖酶）转染至细胞（如Llewellyn等，J.Mol.Biol.（1987）195：115-123;Hanahan等，J.Mo.Biol.（1983）166）。一旦进入细胞，转移载体就可能复制，且被细胞的聚合酶转录，产生核糖酶RNA，后者便可将欲钝化的靶RNA钝化。或者，也可以将含有一个或多个核糖酶序列的转移载体通过显微操作方法如显微注射转染到细胞中或引入细胞中，从而使转移载体或其一部分整合进缩主细胞的基因组。整合遗传物质的转录产生核糖酶，后者可将所欲钝化的靶RNA钝化。

本发明的核糖酶具有广泛的治疗及生物用途。例如，通过给感染病毒的患者服用本发明的适于和在人及动物体内引起疾病的病毒的RNA转录本杂交并使之裂解的核糖酶，就可以使这种病毒失活。这种核糖酶也可以非肠道服用，也可采用其它方式服用。或者，给予感染了引起疾病的病毒的患者以非烈性病毒，如工程牛痘苗或腺病毒，它们已经过遗传工程方法处理而含有功能性地与RNA启动子连接且与核糖酶相对应的DNA，从而在被工程病毒转染了的宿主动物细胞内转录核糖酶，就可以使引起疾病的病毒的靶RNA转录本断裂和/或钝化。本发明的核糖酶特别适用于由单纯疱疹病毒（HSV）或艾滋病病毒（HIV）引起的疾病。

本发明的核糖酶也特别适用于灭活细菌或其它原核细胞、植物和动物中的RNA转录本。在细菌中，例如噬菌体的RNA转录本，它引起细菌细胞的死亡，可通过用DNA转移载体转染而被灭活，该载体能够产生本发明的核糖酶，从而灭活噬菌体DNA。或者，将核糖酶本身加入且被细菌细胞吸收，以实现噬菌体RNA的断裂。

使用转移载体如根癌农杆菌的Ti质粒编码的核糖酶可使植物中的RNA转录本钝化。当将这种载体转染植物细胞时，在RNA聚合酶的作用下产生核糖酶，从而可能使特定的靶RNA序列断裂。因此，使用核糖酶也可灭活其序列已知的植物病毒，或植物基因的RNA转录本。

使用本发明的核糖酶也可灭活植物、动物或其它细胞类型的内源基因转录本。因此可以转变不需的表型或特性。例如，使用本发明的核糖酶可除去水果中的石细胞，或治疗由于缺失蛋白的产生或特定蛋白的过量产生而引起的人类遗传疾病。

现在通过仅是非限定的实施例来说明本发明，参见下面的实施例及附图。

在附图中：

图1显示了野生型和突变型RNA的本身断裂位点，以及一个显示了自催化RNA断裂产物的电泳图谱。

（a）总结了与ASBV、newt随体DNA转录本及s TobRV、LTSV、绒状烟草斑驳病毒、Solanum nodiflorum斑驳病毒及地三叶矮化斑驳病毒中天然存在的RNA断裂位点相关的保存结构。显示了保存于这些结构之间的核苷酸序列，而其它序列用X代表。碱基配对用“＊”代表，箭头所指为RNA断裂点。

（b）显示了与s TobRV RNA的（+）链断裂相关的保存核苷酸序列。箭头所指为断裂位点。

（c）显示了有8个核苷酸（如方框所示）的插入子的s TobRV体外突变株，该序列两侧都带有3个核苷酸（UGU残基7至9）的重复。

（d）野生型s TobRV和D-51的体外突变型亚克隆HaeⅢ片段均以（+）和（-）方向转录，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对标记转录本进行分级分离。野生型（WT）和突变型（D-51）序列的未断裂的159和170碱基转录本的位置均用箭头表示;显示了断裂产物的大小。

图2显示了核糖酶的核苷酸序列及通过凝胶电泳分离的核糖酶断裂产物。

（a）D-51突变型中的插入核苷酸（图1c）含有BamHI限制性核酸内切酶位点。BamHI用于剪切突变DNA，且将两个序列亚克隆及在体外分别转录。RNA转录本如图所示，在用“＊”表示的RNA间具有潜在的配对碱基。含有箭头所示断裂位点的片段称作S-RNA，含有核糖酶的片段称作Rz-RNA。

（b）将[³²P]-Rz-RNA（101个碱基）单独保温（泳道1），与未标记的S-RNA一起保温（泳道2）。将[P]-S-RNA单独保温（泳道3），及与未标记的和³²P标记的Rz-RNA一起保温（分别在泳道4和5）。

图3显示了本发明一个实施方案中的核糖酶的图解模型。A区代表靶RNA内的断裂序列。B区代表催化区，C区代表核糖酶的臂。

图4表示作用于CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因转录本的核糖酶。称为Rz（AT-1，2和3的核糖酶在CAT基因的具有835个碱基的体外转录本中作用于三个位点。转录本上切点的相对位置用侧接碱基（a）表示。三条核糖酶序列用其靶序列表示（（b）到（d））。给CAT基因的氨基酸序列编号并用箭头表示RNA裂解的预测位点。Rz CAT-1和3含有衍生于（+）sTobRV链（图3，B区）的24碱基序列，而Rz CAT-2在该区域内包含单一的U-A致变。

图5表明用核糖酶Rz CAT-1到3裂解CAT RNA的结果。

（a）[³²-P]-CAT RNA（-）单独保温或与核糖酶，即Rz CAT-1到3（分别为泳道1，2和3）一起保温之后经凝胶电泳分级分离。箭头所指为全长转录本的位置。

（b）5′末端碱基分析。将由核糖酶酶解CATmRNA所产生的3′片段在激酶作用下用³²P标记5′端，经凝胶纯化后进行完全的核酸酶消化;通过PH3.5聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对释放出的末端残余进行分级分离。参照标记物（泳道M）所测得的5′末端核苷酸为经Rz CAT-1到3酶解所产生片段的A，U和G（分别为泳道1，2和3）。

图6表明核糖酶（Rz CAT-1）对CAT RNA的催化活性的时间进程。定量测定139核苷酸裂解产物的量并作图。插图表示在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，139碱基片段随着时间的积累。

图7表明在不同的温度条件下CAT RNA裂解的相对速率。底物RNA用实线表示。在每种情况下裂解产物都用虚线表示。

图8描述了具有不同长度的臂或侧接序列的三种核糖酶（相应于Rz CAT-1）。

图9表明含有催化反义RNA的核糖酶的生产方案，催化剂反义RNA具有所有Rz CAT-1到3裂解区。

图10所示为与在CAT mRNA中含有GUA（10a）和GVU（10b）基本结构的靶序列杂交的核糖酶。

图11所示为在柑桔剥皮病类病毒（CEV）RNA及其补体中的自催化RNA裂解位点。

图12所示为与靶CEV RNA（a）杂交的核糖酶Rz CEV25X（+），和与Rz CEV25X（+）一起保温的（+）CEV RNA和互补的（-）CEV RNA的凝胶电泳图（分别为b，泳道1和2。箭头所指为裂解产物）。

图13所示为与其靶序列杂交的核糖酶Rz CAT-2（a）和核糖酶Rz SCMo V（b）。方框中为每种核糖酶中的催化区。标明了Rz SCMo V与Rz CAT-2催化区的差别。

图14所示为柑桔剥皮病类病毒（CEV）RNA中的靶序列杂交的核糖酶Rz CEV-2。切点相应于在CEV RNA序列中的核苷酸-336。图14（a）中圈出的部分是与STobRV的催化区相比，催化区中核苷酸序列的改变。图14（b）所示为泳道7中的对照[CEV RNA（-）链]和泳道8中的CEV RNA（+）链与Rz CEV2一起保温后的电泳图。

图15所示为与核糖酶Rz CAT-2B（b）相比较的核糖酶Rz CAT-2（a）。方框表示催化区。与Rz CAT-2相比，Rz CAT-2B催化区的变化也用方框示出。

图16所示为质粒pJ35SN图。

图17所示为对CAT在植物（烟草原生质体）中抑制作用所做四次试验的平均值。

为了说明本发明给出下列实施例，但这些实施例并不能构成对本发明的限制。

涉及DNA的反应和操作，例如连接，限制性酶解，细菌转化，DNA序列化等，按照标准技术，如Maniatis等人所述的方法（Molecular Cloning，Cold Spring Harbour，1982）进行。涉及RNA的操作也按照标准技术，如Uhlenbeck（Nature 328，596-600（1987））和Haseloff & Gerlach（Nature 334，585-591，（1988））所述的方法进行。

实施例1

突变sTobRV RNA的自催化裂解：

与在ASBV，sTobRV、LTSV、绒状烟草斑驳病毒（VMo V）、Solanum nodiflorum斑驳病毒（SNMV）和地三叶矮化斑驳病毒（SCMo V）的newt随体DNA转录本和随体RNA中天然存在的RNA切点相关区的一致性如图1a所示。给出了保存于这些结构中的核苷酸序列，而将非保存序列表示为X。额外的U位于LTSV（+）链中的A残基之后。

为了确定在该区内的酶底物活性，研究了与sTobRV（+）链自催化裂解相关区。首先，采用寡核苷酸连接子（BamH 1）插入方式诱变克隆的s TobRV cDNA。

为s Tob RV体外表达而构建的载体：

从pSP653中分离s Tob RV cDNA的160bp Taq 1-Spe 1片段（Gerlach等，1985，Virology 151：172-185）并与用Acc 1-Spe 1切割并经磷酸酶处理的pGEM4连接以重新形成Acc 1位点。所得到的克隆用Acc 1线性化。用磷酸酶处理;插入s Tob RV cDNA的359bp Taq 1片段。检测所得克隆中含有末端冗余残基277-81的环形排列的520bp sTobRV cDNA序列（pTTS）的存在。s TobRV序列侧接有T7和SP6 RNA聚合酶的启动子，并且体外转录产生含有两个自动裂解位点的（+）或（-）方向的RNA。

体外诱变：

质粒pTTS（50μg）用BamH 1线性化，用S1核酸酶处理并重新连接，以除去唯一的BamH 1位点。所得构建物pTTS-B在20mM Tris-HCl（PH7.0），1.5mM Mg Cl₂中于37℃用2×10单位DNA酶1处理10分钟。所得线形DNA经修饰和/或用T4 DNA聚合酶填平末端，并通过0.7%LGT琼脂糖凝胶电泳纯化并提取。经激酶作用的BamH 1连接子序列（CGGATCCG）与线性化质粒在室温，在5%聚乙二醇存在的条件下连接过夜。此后，用BamH 1酶解反应物，并通过0.7% LGT琼脂糖凝胶电泳重新提纯线形质粒DNA（为了最后除去痕量的环形质粒以及未连接的连接子，这一步是必不可少的），用T4 DNA连接酶重新使质粒成环并将其转化到大肠杆菌DH-1中，从琼脂平板上刮下菌落（大于1000），在液体培养基中培养至饱和并制备质粒DNA的混合群体。混合的s TobRV cDNA插入子经限制性酶消化作用在侧接的EcoR 1和Pst 1位点处切割，通过1%LGT琼脂糖凝胶电泳纯化，并亚克隆到用EcoR 1-Pst 1切割、经磷酸酶处理的pGEM4中。再收集所得转化体，在液体培养基中培养并制备质粒DNA。用BamH 1处理质粒DNA，只裂解那些含有BamH 1连接子序列的质粒，再通过两次0.7%LGT琼脂糖凝胶电泳提纯线形质粒，用T4 DNA连接酶重新成环，并转化到大肠杆菌DH-1中。检测各转化体中在经限制性酶消化作用的sTobRV序列内所插入的BamH 1连接子的大致位置，再将这些转化体亚克隆到M13 mp19中并通过双脱氧核苷酸链终止技术使之序列化。

得到sTobRV突变体文库;核苷酸序列分析表明，每个突变体都含有一个插入的BamH 1连接子序列（CGGATCCG）以及各种侧翼得到复制或被删去的sTobRV序列。在体外将这些突变体转录，并对其RAN进行裂解能力的分析。根据这些实验，识别出一种52-核苷酸序列，它含有s TobRV RAN的底物部分及裂解部分。这种52-核苷酸序列（示于图1b）含有将其它RNA（图1a）自身裂解所需要的保留序列区域。有一种记为D-51的突变体，它含有一种八核苷酸BamH 1连接子序列，此序列插在编号为7～9的3个重复的sTobRV核苷酸之间。此突变体可进行自身催化的RAN裂解。

从序列化的质粒克隆切去97和108碱基对HaeⅢ片段;这些片段含有有野生型及D-51 RAN（如图1b及1c所示）的52-核苷酸裂解序列。将这些片段与pGEM4的Smal位点相连接，并经过筛选而得到两个方向的插入体。用EcoR1将这些质粒线性化;对长为159和170个碱基的（+）和（-）RAN链进行转录，转录在下述条件下进行：使用在50mM Tris-HCl中的200单位/ml T7 RAN聚合酶，PH7.5，10mM NaCl，6mM Mg Cl₂，2mM亚精胺，1000单位/RNasin，500μMATP、CTP及GTP和200μM[α³²P]UTP在10%聚丙烯酰胺、7摩尔脲、25%甲酰胺凝胶上用电泳法分离RAN并对其进行放射自显影。

如图1d所示，未观察（-）RNA链转录产物裂解。这是可以预料的，因为（-）链中不含自身催化裂解位点。野生型序列及D-51序列的（+）成分则发生裂解，D-51 RAN的裂解有效性稍低于野生型（图1d）。此实验表明，RAN自身催化裂解中涉及的52-核苷酸序列的右手一侧的单链环区并不是必需的。

酶活性与底物活性的区分：

利用插入D-51的BamH 1限制性核酸内切酶位点，得到侧翼HaeⅢ-BamH 1片段和BamH 1-HaeⅢ片段;将每种片段亚克隆到适合于体外转录的大肠杆菌质粒中。由此可从自动裂解区中除去突变的单链环，从而将该区分成两个RAN链段（图2a）。较小的HaeⅢ-BamH 1片段含321～9个核苷酸，包括实际裂解位点，该片段称为S片段。含有7～48个sTobRV核苷酸的BamH 1-HaeⅢ片段称为核糖酶或Rz片段。用来进行体外转录的大肠杆菌质粒是pGEM3和pGEM4（Promega，Madison，WI，U.S.A.）。这些表达质粒中含有：

（a）复制起点;

（b）可以选出的耐药（Amp^r）基因;

（c）侧接RAN聚合酶启动子的多克隆位点，它可用于在体外产生转录本。

经T7DNA聚合酶处理并经Kpn1水解的-pGEM3和经Xba1水解的S-pGEM4在与前述相同的条件下用SP6 RAN聚合酶转录。

如图2所示，在适合于高效自动裂解的条件（50℃，20mM MgCl，PH8.0）下将S-RAN及Rz-RAN单独保温时，它们都不发生明显的降解（图2b，1、3泳道）。将标记的Rz-RAN与S-RAN放在一起保温后，前者似乎也没有什么变化（图2b，第2及第5泳道）。但是当把S-RAN与Rz-RAN相混合后，S-RAN却可以有效地裂解（图2b，第4及第5泳道），产生两个片段。产物的大小与S-RAN（84个碱基）在位于＃359和＃1核苷酸之间的正常位点外裂解所得的产物一致;该裂解产生分别有67和17个核苷酸的5′及3′近侧片段。这说明，S-RAN起着通过Rz-RAN进行核糖核苷酸裂解的底物的作用;Rz-RAN在这种裂解中起催化作用。

基于sTobRV RAN的催化区的核糖酶模型示于图3。此核糖酶的两侧各为单链RAN（C处所示）序列，它们与底物RAN，即待裂解的RAN上的互补序列杂交。每侧序列（C处所示）含有8个核糖核酸。C区所含核苷酸的数目并不十分重要，但必须有足够的核苷酸，以使核糖酶能与靶RAN杂交。看来每个C区的核苷酸数至少为4，杂交才能实现。

催化区B所含的序列中保留了大部分天然存在的裂解区域（见图1a）。与已知序列的裂解区比较可知，碱基对于区Ⅱ的长度不很重要，该干区的一端有无缔合环存在也不很重要。

靶RAN中的裂解位点在表3的A处表示为GUC。根据我们的实验（未叙述）及Koizumi所做的其它实验[FEBS LEFT 288;228-230（1988）;和FEBS LEFT 239;285-288（1988）]，各种天然RAN中已弄清的裂解位点，即序列GUA、GUC、CUC、AUC及UUC在RAN中也是裂解位点。

实施例2

具有新的高特异性的核糖核苷酸内切酶活性的核糖酶的设计、合成及活性示例

为说明本发明，已设计出三种核糖酶，使之作用于通用的指示基因（从细菌中得到），即Tn9氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因的转录本。该转移酶可以使细菌、植物和物质对抗生素产生耐药性，并且易于检测。这三种核糖酶分别记为Rz CAT-1～3，它们分别对应于CAT RAN的第139-140位、第494-495位和第662-663位置上的潜在裂解位点。这些核糖酶的序列示于图4。在每种情况下，与靶CAT RAN杂交的侧翼序列的长为8个核苷酸。所选择的催化区对应于图3所示的sTobRV RAN的催化区。

CAT基因得自pCM4，并以BamH1形式亚克隆至pGEM-32（Promega，Madison，WI，U.S.A.）。用Hind Ⅲ将此序列线性化;使用含220μM[α-³²P]UTP的T7 RAN聚合酶，得到CAT基因转录本。分别合成寡脱氧核苷酸形式的核糖酶序列，即Rz CAT-1、2和3。它们经激酶作用后与经过磷酸酶处理、经EcoK I-Pst I切割的pGEM4相连结，并在细菌转化之前将其与DNA聚合酶1的Klenow片段一同保温。用T7 RAN聚合酶转录EcoR I线性化的质粒，生成各核糖酶RAN。在50mM Tris-HCl中（PH8.0，20mM Mg Cl₂），温度为50℃，时间为60分钟的条件下，将核糖酶与CAT转录本一起保温，并在放射自显影前，在5%聚丙烯酰胺、7M脲、25%甲酰胺凝胶上用电泳方法分级分离所得各产物。

当把840-核苷酸CAT转录本与三种核糖酶中的任一种一起保温时，发生有效且高序列特异性的裂解（图5），每个反应中都产生2个RAN片段。片段大小与预测的裂解位点一致（即，139和696、494和341、662和173碱基片段分别是由Rz CAT-1到3催化裂解的5′和3′产物）。为由这些核糖酶催化的裂解过程所要求的条件同已观察到的、天然存在的裂解反应所要求的条件[Foster，A.C.and Symons，R.H.，Cell 49：211-220（1987）;Foster，A.C.and Symons，R.H.Cell 50：9-16（1987）]相似，但在较高的PH、温度和二价阳离子浓度（未给出具体数据）下，裂解更为有效。当这三种核糖酶的摩尔数过量时，它们的催化作用几乎可以使CAT RAN底物在50mM Tris-HCl中，在PH8.0时，在20mM的Mg Cl₂浓度及50℃温度下经60分钟后完全裂解。在相似条件下，底物浓度为0.1μM，核糖酶浓度为3μM时，CAT mRAN底物的T_1/2在Rz CAT-1到3存在时分别为3.5、3.5和2.5分钟。这些核糖酶序列作用于底物RAN（即（+）链）的补体时以及这些序列为寡脱氧核糖核酸形式时是无效的（未给出具体资料）。将每个由核糖酶催化的反应中得到的3′末端裂解片段分离出来并用激酶对其5′端进行³²P标记（50mM Tris-HCl，PH9，10mM Mg Cl₂，10mM DDT，50UCi γ-P³²ATP，5单位T4多核苷酸激酶，30分钟，37℃）。这些片段可以在激酶作用下有效地标记，说明这些片段与天然裂解反应中产生的片段相似，也具有5′末端羟基。

对CAT序列在Rz CAT1-3作用下裂解所产生的片段的末端核苷酸进行了测定。简要地说，在5%聚丙烯酰胺凝胶上纯化放射标记的片段，并在37℃用等体积、在50mM乙酸铵中的500单位/ml RNA酶T1、25单位/ml RNA酶Tz及0.125mg/ml RNA酶A（PH4.5）对其水解120分钟。产物在含有25mM柠檬酸钠（PH3.5）和7摩尔量脲的聚丙烯酰胺凝胶上进行分级分离。图5b说明，CAT序列在Rz CAT1～3作用下的裂解分别准确地发生在核苷酸A、U和G前面。

采用部分酶解法[Donis-Keller等，Nucleic Acids Res.4：2527-2538（1980）]，利用核糖核酸特异性碱基对部分裂解作用，直接检测CAT基因片段的末端序列。测出的片段序列证实，裂解是在CAT RAN中的预料的位置（未示出）上发生的。

酶催化：

为说明上述核糖酶是以催化方式使CAT mRAN底物裂解的，在对有效分离及产物解离都有利的条件下，将每种核糖酶与摩尔量过量的底物放在一起保温。图6所示为下述实验所得结果：实验时间为75分钟，温度50℃，PH8.0，在20mM Mg Cl₂中;在10微微摩尔Rz CAT-1催化下，163微微摩尔截断了的CAT mRAN（173个碱基）底物发生特异性裂解，产生分别具有139和34个碱基的5′及3′片段。平均每个核糖酶引起10次以上裂解。在50℃经75分钟后，观察到某些因条件剧烈而发生的非特异性RAN裂解，但剩下的完整的RAN（163微微摩尔）中有70%以139个碱基的片段形式积累起来。对Rz CAT-2及了进行实验得到类似的结果，因此每种核糖酶均起RAN酶的作用。

实施例3

温度对核糖酶活性的影响

测定了反应温度对核糖酶体外活性的影响。

分别在37℃和50℃，对核糖酶RCAT1-3作用于CAT RAN底物的反应的时间进程进行了监测。

在此实验中，每种核糖酶的反应都同样进行两次，反应采用实施例2中所述的核糖酶裂解反应条件。一个反应在37℃，另一反应在50℃进行。在90℃内的各时间点提取样品，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析反应程度。图7所示为Rz CAT1～3中每一种在37℃和50℃反应的时间过程。每种核糖酶的反应速度随着反应温度的提高而增加。

50% CAT RAN裂解所需时间（t_1/2）列于表1。

表1

Rz CAT-1 Rz CAT-2 Rz CAT-3

t_1/2（分钟）

50℃ 3.5 3.5 2.5

37℃ 55.5 70.0 65.0

如表1所示，37℃时的反应速度约为50℃时反应速度的1/20。

实施例4

改变核糖酶的臂（或两翼序列）的长度对核糖酶活性的影响

当RNA裂解发生后，核糖酶的两翼序列（式1中的（Ⅰ）区）使核糖酶与靶RNA杂交。在此实验中，研究了改变核糖酶碱基对与靶序列互补的程度以及其相应长度对靶序列裂解速率的影响。

制成每臂有4、8和12个碱基与靶序列Rz CAT-2互补的各个核糖酶（图8a）。这些核糖酶是按实施例2的方法制备的。依照前述，通过将核糖酶RNA与CAT RNA一起保温，测定核糖酶活性。每臂含4个互补碱基对的核糖酶不能使底物RNA裂解。每臂含8个互补碱基对的核糖酶和含12个互补碱基对的核糖酸一样，能使底物RNA裂解。根据体外反应速率判断，具有12个互补碱基的核糖酶比互补碱基数较少的核糖酶能更有效地使靶RNA裂解。尽管互补碱基的数目看来不得不大于4，但核糖酶的杂交区长度增加，反应速率也得以提高。

在第二个实验中，研究了（a）与整个CAT转录本靶RAN互补和（b）具有多个催化区的核糖酶的反应效率。

选出CAT RNA序列中的4个GUC靶位点。将作用于这些位点的核糖酶催化区“插入”到CAT转录本的完整反义（-）序列中，并试验，催化活性。

所选出的4个位点中有三个是前述Rz CAT-1到3的特异位点，而另一个位点可表示如下：

新的CAT位点

＃192

His His Ala Val Cys Asp Gly

5′ 3

CAU CAU GCC GUC UGU GAU GGC

其中“192”指CAT多肽中的第192位氨基酸及一个断裂位点。

含有核糖酶催化区并且复盖所有这些裂解位点的寡脱氧核糖核酸在M13诱变实验中被用来制造含有完整的CAT互补序列但其中插入4个核糖酶催化区的序列。通过将含有核糖酶的寡核苷酸插入子结合至含有尿嘧啶的单链M13 DNA中，然后合成含有该插入子的互补DNA，就完成了M13突变。回收互补DNA DNA后，将其克隆在一合适大肠菌杆菌株中（T.A.Kunkel.1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492）。将产生的双链cDNA克隆至一体外表达载体中，利用T7多聚酶转录系统而产生核糖酶RNA。其核糖酶活性是通过将核糖酶RNA与CAT转录本一起保温，在乙二醛处理使核苷酸变性之后再进行凝胶电泳而测得。

在CAT转录在上的所有预期位点都发生自溶断裂。因此，臂的两侧序列或核糖酶可沿着需使之断裂的RNA转录本的全长延伸。

图9表示了含有所有4种核糖酶的催化反义RNA的产生。催化反义RNA含有大约900个碱基。

假定扩大碱基配对的话，那么在上述反应条件下，核糖酶和靶序列将形成大分子量复合物。为了在电泳时溶解反应产物，需要进行强变性处理（如乙二醛处理）。

实施例5

核糖酶断裂的靶序列

本实例测试了mRAN中的GUA，以了解核糖酶是否对RNA在该序列处的断裂产生影响。

在CAT mRNA中选择一特定位点，它含有GUA（图10a），制备一合适的核糖酶序列且测定其活性。该核糖酶含有8个核糖核苷酸的臂。

按照实施例2的方法制备出与图10的核糖酶相应的合成寡核苷酸，且将双链cDNA克隆到一个体外表达载体（pGEM4，见上述，存在于大肠杆菌中），从而利用T7多聚酶转录系统产生核糖酶RNA。在将核糖酶RNA与CAT mRNA一起保温后按前述方法对反应混合物进行电泳，就可测得核糖酶活性。

核糖酶影响了在GUA靶位点的断裂（未示出）。因此，RNA中的 GUA是本发明核糖酶的作用底物。这一结果并非完全出乎意料，因为苜蓿暂居条斑病毒（lucerne transient streak virus）的随体RNA中的一个天然存在的断裂位点就需要识别GUA位点。

类似地，也用一合适的核糖酶测试了CAT RNA靶序列中的GUU（见图10b），且发现断裂也受到影响。

实施例6

病毒RNA在核糖酶作用下的断裂

利用本发明的一种核糖酶，对以柑桔剥皮病类病毒RNA形式存在的类病毒RNA进行了断裂。

在柑桔剥皮病类病毒（CEV）RNA中选择了两个GUC靶位点。在互补链序列中也选择了一个位点。制备针对所有这些位点的核糖酶，且测定其活性。核糖酶分别被命名为CEV9x（+），CEV9x（-）和CEV25x（+）。图11显示了这三种核糖酶在CEV RNA中的三个不同断裂位点。

核糖酶按前述方法制备。核糖酶Rz CEV25x（+）示于图12。这一核糖酶断裂CEV RNA的116位核苷酸处的GUC。

图12（b）显示了被核糖酶Rz CEV9x（+）断裂的CEV RNA。当使用核糖酶Rz CEV9x（+）断裂的CEV RNA。当使用核糖酶Rz CEV9x（-）时未发现有断裂。

这一实验表明，核糖酶对各种不同来源的靶RNA序列都具有活性。这是意料之中的，因为所有RNA都是由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶与基本的核糖核苷酸组装而成，而不管它们是来自动物、植物或还是微生物。

实施例7

具有可变催化区的核糖酶的实例

利用地三叶矮化斑驳病毒（SCMo V）随体RNA的催化区序列制备利用于CAT-2位点的核糖酶。将核糖酶臂两侧序列的12个互补碱基整入所设计的核糖酶Rz SCMo V。图13a和13b分别表示核糖酶Rz CAT-2和Rz CMo V。Rz SCMo V的环区含有5个核苷酸，其序列为AAAUC。这与Rz CAT-2的环区相差太远，Rz CAT-2的环区含有4个核苷酸，其序列为AGAG。另外，Rz SCMo V在其催化区含有一个C，而在Rz CAT-2中则为U^＊。当将Rz SCMo V与Rz CAT-2进行比较时，其序列的差异很明显。

按实例2制备Rz SCMo V。Rz SCMo V具有活性，同预期的一样它产生两个断裂产物。

在另一实验中，用具有图14a所示序列的核糖酶（Rz CEV2）切割柑桔剥皮病类病毒（CEV），其靶位点位于其互补RNA的-336位核苷酸处。图14中用“L”表示的环区由序列为3-CCTATA-5′的6个核苷酸组成。这一序列不同于STobRV的环区，STobRV的环区由序列为3′-AGAG-5′的4个核苷酸组成。此核糖酶在靶CEV互补RNA的-336位置处将其断裂，如图14b的电泳图所示。

此实验表明，环区的核苷酸数及核苷酸序列对于核糖酶的活性是不太重要的。在这些实验中，核糖酶均按说明书中早已叙述的方法制备。

在另一实验中，研究了催化区（短臂区）的碱基配对对于核糖酶活性的影响。

制备一经改进的核糖酶，它与Rz CAT-2相对应，但含有4个额外碱基对，并用其进行试验。在图15a中，显示了核糖酶Rz CAT-2的序列与靶CAT RNA进行杂交。图15b表示了所试验核糖酶附带有框架所示的碱基对。试验核糖酶具有与Rz CAT-2相当的活性。这表明，核糖酶催化区的碱基配对区可能具有不同的长度，而对催化活性无影响。

本发明人已发现（未给出数据），在基因转移植物中表达的s TobRV RNA转录本的体内稳定形式主要为环型，这可能是由于5′-末端与3′-末端的连接。因此，在体内RNA转录本中感兴趣序列两侧使用两个自溶断裂位点，很可能导致产物的环化，从而产生比线型转录本更稳定的产物。这一研究似乎提供了一种内稳定核糖酶序列的新方法。它称作环化。

实施例8

核糖酶的体内活性

本例研究了核糖酶在植物细胞中的体内活性。

实验方案：

将含有抗CAT（CAT＝氯酶素乙酰转移酶）或含有结合的抗CAT/核糖酶基因组建物的质粒（见下述），以彼此相同的量及比例，与含有功能性CAT基因组建物的另一种质粒一起引入烟草原生质体。测定CAT活性，并将其与基因活性的基本水平进行比较。

材料和方法：

（a）电击及CAT检测

按L Iewellyn等人所述的方法（J.Mol.Biol.（1987）195：115-123）进行。简单地说，在继代培养两天后，从悬浮液中制备Nicotiana plumbaginifolia T5系原生质体，将其悬浮于由10mM HEPES（PH7.2）、150mM Na Cl、0.2M甘露醇组成的溶液中，且调整密度至3×10⁶/ml。在250V电压下用50ms单脉冲进行电击。将原生质体10倍稀释，然后在暗处于26℃下培养20小时。用声波将其破碎，得到提取物。对该提取物的蛋白质含量进行归一，用¹⁴C-氯酶素及乙酰辅酶A测定CAT的体外活性。用薄层层析法分离反应产物，且用放射自显影法进行检测。通过从¹⁴C-氯霉素模板产生的放射性产物可计测出反应的程度。

（b）基因组建：

将基因组建物作为质粒DNA加进0.1ml原生质体，该DNA是通过提取和两轮Cs Cl平衡密度梯度离心从细菌中纯化。再将其悬浮于10mM Tris/1mM EDTA/PH＝7.5中以备使用。

活性CAT基因组建物被装在质粒pCAT7+上。它是通过将CAT基因序列（来自质粒pCM4，见T.J.Close及R.Rod riguez，1982，Gene 20：305-316）融合进质粒pJ35SN（得自p35SN，W.L.Gerlach等，1987，Nature 328：802-805）之中而产生的，因此，活性基因结构为：

35S指35S Ca MV（花椰菜花叶病毒）启动子，NOS指nopaline合成酶多聚腺苷酰化信号，T/C指转录。

将过量的下述各种基因与0.2μg pCAT7+一起加入。基因组建物含于具有下列命名的质粒之中。

p J35 SN-其图谱示于图16的这一载体质粒含有35S Ca MV启动子及植物nopaline合成酶3′多聚腺苷酰化信号，它可图示如下：

pCAT7-它含有插入至pJ35SN中的CAT基因序列，因此转录将导致反义CAT RNA的产生，它可图示如下：

pCAT19-它含有CAT基因，在其中含有4个催化核糖酶区（见实例4和图9），它插入至pJ35SN，因此转录将导致含有4个催化核糖酶区的反义CAT RNA的产生，它可图示如下：

结果：

下表显示了电击20小时后细胞中CAT的相对活性。活性表示为1小时检测中氯酶素底物的转化百分数。

电击的质粒微克数

处理pCAT7+ pJ35SN pCAT7- pCAT19- 转化百分数

1A 0

1B 0

2A 0.2 18 21

2B 0.2 18 46

3A 0.2 9 9 28

3B 0.2 9 9 32

4A 0.2 18 26

4B 0.2 18 19

5A 0.2 9 9 19

5B 0.2 9 22

6A 0.2 18 14

6B 0.2 18 16

（对于每种处理，“A”和“B”均进行两次）

从这些结果可得出下列结论：

（a）加入CAT基因组建物导致显著的CAT活性-将2A、B与1A、B比较。两次处理之间具有可变性。从其它样品所见的趋势和（见下面的“b”和“c”），很可能是2A显示了异常低的活性。

（b）反义基因结构的伴随加入导致活性水平的下降-将3A、B和4A、B与2B比较。下降的程度直接与作为质粒加进的反义基因的水平有关-比较3A、B和4A、B。

（c）结合的反义/核糖酶基因组建物的伴随加入导致基因活性的下降-将5A、B和6A、B与2B比较。而且，与反义基因组建物的相应水平相比，下降更加明显-比较5A、B与3A、B及6A、B与4A、B。

四个体内实验的平均结果示于图17。在该图中，“对照”代表处理2，“反义”代表处理4，“催化”代表处理6，“本底”代表处理1。

与反义核糖酶的平均34%相比，催化核糖酶抑制CAT活性平均为47%。

将带有核糖酶的基因加进植物细胞，抑制了它们所作用的基因活性。而且，这种抑制比相应的反义RNA分子更大。

这些结果表明，核糖酶在动物、植物或微生物细胞中对一系列靶RNA分子都具有活性。

在本实验中不清楚核糖酶的作用机制。例如，反义核糖酶可能不可逆地与靶RNA杂交，且在靶RNA的一个或多个靶点催化磷酸二酯键的断裂。或者，细胞酶可能从其靶序列中解开反义RNA，从而使靶RNA断裂为两个或多个片段。

实施例9

动物细胞中核糖酶的活体活性：

本例说明在哺乳动物细胞中核糖酶使靶RNA失活的活性。

材料与方法：

将为核糖酶编码的活性基因组建物根据电击法广泛地用于转染猴肾细胞株COS1。在本方法中，将3×10⁶/ml COS1细胞悬在含10%FCS（胎儿牛血清）的缓冲盐水中，与不同的基因组建物接触，放电，电击DNA使其进入细胞。在测定CAT和虫荧光素酶活性前将转染细胞置于培养基中37℃下温育48小时。

CAT基因组建物在pTK CAT质粒上产生。（Miksicek等，Cell 46：283-290，1986）。该质粒是通过将CAT基因序列引入质粒pSV2衍生的，从而它在单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下。

为核糖酶编码的基因组建物是在质粒pSV232 A上产生的（DeWet等人，Molecular and Cellular Biology 7：725-737，1987），它含融合到SV40早期启动子上的虫荧光素酶基因。根据Maniatis等人的标准方法将为核糖酶编码的DNA连接到虫荧光酶基因的3′端的Xba I位点中。（Molecular Cloning，A Laboratory Manuzl，Cold Spring Harbour，1982）。

用Maniatis等人（见上述文献）的标准方法制备下列组建物：

pFC58-该质粒载体含为以非功能方向融合到虫荧光素酶3′端的核糖酶Rz CAT-1编码的DNA。图示如下：

其中的232A为pSV 232A序列，SV40早期为SV40的早期启动子，小T是为SV40的小T插入序列编码的DNA。这个组建物可生产为虫荧光素酶和核糖酶Rz CAT-1编码的RNA分子，后者是以不能被催化的方向插入的。

pFC4-这个质粒与pFC58基本相同，只是Rz CAT-1被Rz CAT-3取代。

pFC1-6-这个质粒与pEC58基本相同，只是有意义方向（5′-3′）的RCAT-3取代了Rz CAT-1。

pFC20-这个质粒与pFC1-6基本相同，只是具有8个核苷酸侧翼序列的Rz CAT-2取代了Rz CAF-3。

pFC12-这个质粒与pFC20基本相同，只是核糖酶Rz CAT-2含有12个核苷酸侧翼序列。

pFC50-这个质粒含CAT基因，该基因含以有意义方向（5′-3′）插入的四个催化剂核糖酶区（见例4和图9），该基因转录得到一个钝化核糖酶，该质粒图示如下：

pFC54-这个质粒与pFC50基本相同，只是CAT基因和核糖酶区是以反义（3′-5′）活性方向插入的。

pFC64-这个质粒与pFC50均有SV40启动子和聚A⁺信号，含有无插入的核糖酶区的野生型CAT基因。这个基因是以反义方向插入的，所以不能产生CAT蛋白。

pFC65-这个质粒与pFC64基本相同，只是野生型CAT基因是以有意义方向（5′-3′）插入的，因而可产生CAT蛋白。

测定：

根据De Wet等人的方法（见上述文献）测定虫荧光素酶活性。简言之，转染后使COS细胞溶胞48小时，然后与虫荧光素酶的底物虫荧光素温育，用闪烁计数器测定荧光。

用COS细胞溶胞物测定CAT活性（将溶胞物分成两份，每份既测虫荧光素酶活性也测CAT的活性）该试验是根据Sleigh，M.J.的方法，Anal.Biochem.156：251-256，（1986）。

在活体试验中，pFC58和pFC4不影响转染细胞中CAT的活性。该活性定为100% CAT活性和0% CAT抑制性。用相对于pFC58的活性来度量其质粒转染细胞的CAT活性。用下式度量CAT的抑

制%。

100-（ (CAT（试验）)/(CAT（对照）) ）×100

作为对虫荧光素酶生产的当量。CAT（试验）＝对每个试验组建物CAT试验所得的结果。CAT（对照）＝对照组建物（pFC4和pFC58）CAT试验的结果。

虫荧光素酶产生是对电击的一个内部对照，在每个电击组织培养皿中测定产生的核糖酶量。

结果：

试验（ⅰ）

电击质粒的微克数/1.5×10⁶细胞

处理pTKCAT pFC58 pFC20 pFC1-6 pFC12，CAT抑制%

1 5 2 56

2 5 1 1 53

3 5 2 40

4 5 2 0

每个处理为两个重复，取平均值。

试验（ⅱ）

电击质粒微克数/1.5×10⁶细胞

处理 pTKCAT pFC-1-6 pFC20 pFC12 pFC4 CAT抑制%

5 5 2 75

6 5 2 75

7 5 4 62

8 5 1 1 70

9 5 4 51

10 5 2 0

处理5～10，每个处理两个重复，取平均值。

试验（ⅲ）

电击质粒微克数/1.5×10⁶细胞

处理 pTKCAT pFC-1-6 pFC4 CAT抑制%

11 5 2 66

12 5 2 0

每个处理为五个重复，取平均值。

试验（ⅳ）

电击质粒微克数/1.5×10⁶细胞

处理 pTKCAT pFC50 pFC54 pFC64 pFC65 CAT抑制%

13 5 2 0

14 5 2 26

15 5 2 2

16 0 2 NA

13-16每个处理均五个重复。

有意义的CAT组建物（处理16）产生高水平的CAT活性，所以%的抑制是没有抑制活性（NA）。

也用pTKCAT的TK启动子进行一系列试验以取代人金属硫堇（metallothionein）启动子。当用为一种或多种核糖酶编码的质粒将该CAT组建物共转染到COS1细胞时观察到CAT活性明显降低。

上述结果明显说明动物细胞中核糖酶的活体内钝化活性。

尽管在活体中核糖酶的有效性被认为是由能降解靶RNA的一个或多个催化区产生的，但如果整个RNA/反义RNA分子没有分开，则在“反义”RNA型核糖酶中存在的这类催化区实际上也许并不能在活体中导致RNA降解。然而无论这两种分子分开与否，上述的例子都说明核糖酶在钝化靶RNA方面的有效性。因此，本发明适用于所有具有能导致降解的催化区和杂交区的核糖酶，无论降解是否发生在靶RNA中。即，杂交区可能很大，致使结合在一起的RNA/核糖酶不发生变化，并使靶RNA不能降解成各个成分，虽然催化区本身能够引起降解。

Claims

1、一种核糖酶，包括一个核苷酸序列至少与靶RNA部分互补的杂交区和一个适合裂解所述靶RNA的催化区，杂交区含9个以上核苷酸。

2、一种核糖酶，包括一个或多个由单链RNA组成的臂，该臂具有至少与靶RNA部分互补的序列，所述一个以上的臂与能裂解靶RNA的催化区连接;当杂交区含一个RNA单臂时所述臂至少含9个核苷酸，而杂交区包括2个以上RNA臂时，所述臂的核苷酸总数大于9。

3、根据权利要求2的核糖酶，具有两个单链RNA臂，它们通过催化区相连。

4、根据以上各权利要求的核糖酶，它没有修饰裂解的靶RNA。

5、下式的核糖酶：

其中X代表任意核糖核苷酸而每个X基团可相同或不同;n和n′的总数大于6而n和n′可相同或不同;（X）代表互补核糖核苷酸间的碱基对;X′和X″代表至少沿全长一部分的互补序列的核糖核苷酸，从而使寡核糖核苷酸间碱基配对，或X′和X″一起组成一个单RNA序列，其中该序列至少部分含一个由互补核糖核苷酸间碱基配对形成的小臂;A，G，C或U的一个附加核苷酸任选插入¹A后面。

6、前面任一权利要求所述的核糖酶，具有下式结构：

其中X代表任意核糖核苷酸，而每个X基团可相同或不同;（X）代表互补核糖核苷酸间的碱基对;n和n′如上定义;B代表一个键，一个碱基对，一个核糖核苷酸或一个至少含两个核糖核苷酸的寡核糖苷酸;m和m′为1或大于1，可相同或不同;任选将选自A，G，C或U的一个附加核苷酸插入¹A后面。

7、根据权利要求5或6所述的核糖酶，其中n和n′的总数是16或大于16。

8、根据上述任一权利要求所述的核糖酶，其中催化区能在序列X^·YY后面裂解靶RNA，当X^·是任意核糖核苷酸时，U是尿苷而Y是腺苷，胞苷或尿苷。

9、含有通过侧翼序列连接的多催化区的核糖酶，每个所述侧翼序列包括与靶RNA互补的序列，该靶RNA需要钝化。

10、根据上述各权利要求的核糖酶，它通过环化而稳定。

11、根据上述各权利要求的核糖酶，包含催化反义序列。

12、钝化或裂解靶RNA的方法，包括，使所述靶RNA与权利要求1～11所述任一种核糖酶反应。

13、根据权利要求12的方法，其中所述钝化发生在原核生物或真核生物活体中，结果从转染到所述细胞或其前体中的DNA或RNA转移载体转录所述核糖酶，或表达为该核糖酶编码的基因，该核糖酶整合到宿主基因组，从而所述核糖酶与所需细胞靶RNA杂交并使其钝化。

14、根据权利要求13的方法，其中所述细胞为植物或动物细胞。

15、根据权利要求13或14的方法，其中的靶RNA是细胞内源的或诸如病毒RNA的外源RNA。

16、根据权利要求15的方法，其中的靶病毒RNA选自艾滋病、肝炎或其它引起哺乳类疾病的病毒RNA。

17、根据权利要求15的方法，其中的病毒RNA是噬菌体RNA。

18、治疗动物或人病毒病的方法，包括给治疗对象施用有效量的权利要求1～11所述的任一种核糖酶，所述酶与致病病毒RNA的转录本杂交并使其失活。

19、治疗植物病毒和类病毒病的方法，包括给植物施用权利要求1～11的任一种核糖酶，所述酶与致病病毒转录本RNA杂交并使其失活。

20、含有权利要求1～11任一种核糖酶的组合物，将该酶与药物学，兽医学或农业上可按受的载体或赋形剂结合。

21、生产权利要求1～11任一种核糖酶的方法，包括下列步骤：

（1）将由DNA，RNA或其给合物组成的转移载体与所述核糖酶对应的核苷酸序列连接;

（2）用RNA聚合酶转录步骤（1）所得核苷酸序列;和

（3）用任意方法纯化该酶。

22、由RNA或DNA或其结合物组成的转移载体，含有能转录出权利要求1～11任一项所述核糖酶的核苷酸序列。

23、根据权利要求22的转移载体，它是细菌质粒或噬菌体DNA。

24、原核或真核生物细胞，含有能转录出权利要求1～11所述任一种核糖酶的核苷酸序列。