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KR20180063333A - 면역 세포로의 만능 줄기 세포의 지정된 분화 방법 - Google Patents

면역 세포로의 만능 줄기 세포의 지정된 분화 방법 Download PDF

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KR20180063333A
KR20180063333A KR1020187014302A KR20187014302A KR20180063333A KR 20180063333 A KR20180063333 A KR 20180063333A KR 1020187014302 A KR1020187014302 A KR 1020187014302A KR 20187014302 A KR20187014302 A KR 20187014302A KR 20180063333 A KR20180063333 A KR 20180063333A
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KR
South Korea
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cells
cell
differentiation
hpc
population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020187014302A
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English (en)
Inventor
막심 에이. 보디아니크
신 장
앤드류 제이. 브랜들
디피카 라제쉬
브래들리 스완슨
크리스티 뮌
사라 에이. 버튼
웬 보 왕
Original Assignee
후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 filed Critical 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
Publication of KR20180063333A publication Critical patent/KR20180063333A/ko
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Abstract

본원에서 조혈 전구 세포로의 체세포-유도된 만능 줄기 세포의 효율적인 시험관내 분화 및 각종 골수 또는 림프구 계통의 면역 세포, 구체적으로는 T 세포, NK 세포 및 수지상 세포로의 조혈 전구 세포의 추가의 분화를 위한 방법이 제공된다. 만능 세포는 정의된 조건 하에 유지되고 분화될 수 있고; 따라서, 조혈 전구 세포의 분화를 위한 소정 실시형태들에서 마우스 피더(feeder) 세포 또는 혈청의 사용은 요구되지 않는다.

Description

면역 세포로의 만능 줄기 세포의 지정된 분화 방법
본 출원은 2015년 10월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/244,101호 및 2016년 10월 5일자로 출원된 출원 번호 제62/404,470호의 우선권 이익을 주장하고, 두 출원의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명의 배경
1. 본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 체세포-유도된 유도 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)로부터 면역 세포를 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
세포 치료요법은 종양, 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 숙주 면역 반응을 향상시키기 위해 개발되었다. 세포 치료법은 종종 T 세포의 생체외 활성화 및 확대를 수반한다. 이러한 유형의 치료의 예로는 종양 침윤성 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte) 세포, 세포독성 T 세포, 확대된 종양 드레이닝 림프절 세포 및 다양한 다른 림프구 조제를 포함한다. 조혈 줄기 및 선조 세포의 상당한 의학적 잠재력으로 인해, 조혈 선조 세포를 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포로 분화시키는 방법을 개선하기 위한 많은 연구가 이루어져 왔다.
사람에 있어서, 유도된 만능 줄기 (iPS: induced pluripotent stem) 세포는 진피 섬유 아세포에서 일반적으로 생성된다. 그러나, 피부 생검에 대한 요구조건과 시험관내에서의 몇몇의 계대배양을 위해 섬유아세포를 확대해야 하는 필요성으로 인하여, 섬유아세포는 환자-특이적 줄기 세포를 생성하는데 있어서 다루기 힘든 공급원이 된다. 또한, 인간 체세포를 재프로그래밍하기 위한 기존 방법은 인간 대상체로부터 직접 체세포를 얻거나 노동 집약적인 세포 배양 시스템에서 세포를 유지할 필요가 있기 때문에 불편하다. 따라서, 간단하고 편리하며 쉽게 접근할 수 있는 대체 공급원으로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발할 필요가 있다. 따라서, 혈액은 환자 또는 건강한 개인으로부터 수집되거나, 저장되거나, 예를 들어, 배포하기 위한 중앙 유닛으로부터 하나 이상의 원거리 장소로 전달될 수 있기 때문에, 혈액 샘플은 이러한 공급원일 수 있다. 따라서, 체세포로부터 iPS 세포를 재프로그래밍하고, 이어서 체세포로부터 유도된 iPS 세포를 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포로 효율적으로 분화시키는 방법에 대한 뚜렷한 필요성이 현재 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 제1 실시형태는 체세포 집단으로부터 재프로그래되는 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)를 얻고, PSC를 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic precursor cell)로 분화하고, 면역 세포 분화를 촉진하는 조건 하에서 HPC를 배양함으로써 면역 세포를 생산하는 것을 포함하는 면역 세포 생산 방법을 제공한다.
일부 양상에서, PSC는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 다른 양상에서, PSC는 배아 줄기 세포(ECS: embryonic stem cell)이다. 일부 양상에서, PSC는 통합된 외인성 바이러스 요소를 본질적으로 포함하지 않는다.
특정 양상에서, 면역 세포는 림프구 세포이다. 특정 양상에서, 림프구 세포는 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포이다. 일부 양상에서, 면역 세포는 골수 세포이다. 특정 양상에서, 골수 세포는 수지상 세포이다.
일부 양상에서, 체세포 집단은 포유 동물이다. 특정 양상에서, 체세포 집단은 인간이다. 일부 양상에서, 체세포 집단은 혈액 세포의 단 또는 피부 세포 집단이다. 일부 양상에서, 혈액 세포 집단은 외인적으로 적용된 G-CSF를 이용하여 동원되지 않았다. 특정 양상에서, 혈액 세포 집단은 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 혈액 세포 집단은 선조 혈액 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 림프아구 세포로서 추가로 정의된다. 특정 양상에서, 혈액 세포 집단은 말초 혈액, 제대혈 또는 림프 조직으로부터 단리된다. 특정 양상에서, 림프 조직은 골수, 림프절 또는 태아 간을 포함한다. 특정 양상에서, 혈액 세포 집단은 T 세포를 포함한다. 일부 양상에서, T 세포는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 존재하에 배양된다. 특정 양상에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 양상에서, T 세포는 T 헬퍼(helper) 1 (TH1) 세포, T 헬퍼 2 (TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 나이브(naive) T 세포, 기억 T 세포 또는 감마 델타 T 세포이다. 특정 양상에서, 재프로그래밍은 재프로그래밍 인자를 체세포 집단에 도입하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 재프로그래밍은 RNA, 단백질 또는 작은 분자를 체세포 집단에 도입하는 것을 포함한다.
특정 양상에서, 체세포 집단은 혈액 세포 또는 피부 세포이다. 일부 양상에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 발현 카세트에 의해 코딩된다. 특정 양상에서, 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin 28로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 유전자를 포함한다. 일부 양상에서, 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin 28로 이루어진 군으로부터 선택된 3개, 4개, 5개 또는 6개의 유전자를 포함한다. 특정 양상에서, 하나 이상의 발현 카세트는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 및 트랜스 포손으로 이루어진 군으로부터 선택된 재프로그래밍 벡터에 포함된다. 일부 양상에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터로서 추가로 정의된다. 특정 양상에서, 에피솜 벡터는 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus: EBV)-기반 에피솜 벡터로서 추가로 정의된다. 일부 양상에서, 재프로그래밍은 제한된 피더(feeder)-불포함 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, HPC는 HPC당 적어도 20개의 면역 세포, 예를 들어, HSC당 적어도 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 70개, 90개, 100개 또는 그 이상의 면역 세포로 분화한다. 일부 양상에서, PSC는 PSC당 적어도 20 개의 면역 세포, 예를 들어, PSC당 적어도 30개, 40개, 50개 또는 그 이상의 면역 세포로 분화한다.
특정 양상에서, PSC를 HPC로 분화시키는 것은 적어도 1개의 성장 인자를 포함하는 1차 제한 배지에서 실질적으로 미분화된 복수의 만능 세포를 배양하거나 유지하는 단계, IL-3, Flt3 리간드 및 GM-CSF를 포함하지 않거나 본질적으로 포함하지 않는 2차 제한 배지에서 세포를 인큐베이션하는 단계, 복수의 세포에서 분화를 확대하거나 촉진시키기에 충분한 BMP4, FGF2 및 VEGF를 포함하는 3차 제한 배지에서 세포를 배양하는 단계, 및 복수의 세포에서 분화를 확대하거나 촉진시키기에 충분한 IL-3 및 Flt3 리간드를 포함하는 1차 제한 배지에서 세포를 배양하는 단계의 순차적 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 복수의 만능 세포는 HPC로 분화된다. 일부 양상에서, 2차 제한 배지는 블레비스타틴(blebbistatin)을 포함한다. 특정 양상에서, 2차 제한 배지는 GSK3 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이다. 일부 양상에서, 2차 제한 배지는 BMP4, VEGF 및 FGF2를 추가로 포함한다. 특정양상에서, 세포는 2차 제한 배지에서 세포를 배양하기 전에 개별화된다. 일부 양상에서, 2차 제한 배지에서 세포를 인큐베이션하고, 3차 제한 배지에서 세포를 배양하고, 4차 제한 배지에서 세포를 배양하는 것은 아민 배양 플레이트를 이용하여 수행한다. 특정 양상에서, 2차 제한 배지는 VEGF 및 FGF2를 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 4차 제한 배지는 IL-3, IL-6, SCF, TPO 및 BMP4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 4차 제한 배지는 헤파린을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 25% 미만의 산소, 예를 들어, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 산소의 대기압에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 복수의 만능 세포는 배상체(embryoid body: EB)를 형성한다. 특정 양상에서 HPC는 CD34를 발현한다. 특정 양상에서, HPC는 CD43, CD34, CD31, CD41, CD235 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 마커를 발현한다.
일부 양상에서, 면역 세포 분화를 촉진하기 위한 조건은 림프구 분화를 촉진하기 위한 조건으로서 추가로 정의된다. 특정 양상에서, CD34 및 CD43을 발현하는 HPC는 림프 분화를 촉진하기 위한 조건하에 배양된다. 일부 양상에서, 림프구 분화를 촉진하기 위해 세포를 배양하는 것은 매트릭스 및 노치 리간드로 코팅된 표면상의 제한 배지에서 HPC를 배양하고, 여기서, 상기 HPC가 CD34, CD43, CD7, DLL4, CD144 및 CD235로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하고, 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 배양을 유지하여 림프구 세포를 생산한다. 일부 양상에서, HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7을 발현한다. 특정 양상에서, HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7을 발현한다.
추가의 양상에서, 림프구 세포 분화를 위한 제1 단계는 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 HPC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 단리는 자성-활성화된 세포 분류 (magnetic-activated cell sorting: MACS)를 포함한다. 특정 양상에서, 세포는 5% 미만의 산소의 대기압에서 배양된다. 특정 양상에서, 세포는 약 5% 산소의 대기압에서 배양된다. 일부 양상에서, 제한 배지는 아스코르브산 및 / 또는 니코틴아미드를 포함한다. 특정 양상에서, 아스코르브산은 50μM 내지 1mM, 예를 들어, 90μM 내지 100μM의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 니코틴아미드는 0.1mM 내지 5mM의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 니코틴아미드는 니코틴산이다. 일부 양상에서, 매트릭스는 세포외 매트릭스 단백질이다. 일부 양상에서, 매트릭스는 레트로넥틴, 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴이다. 특정 양상에서, 매트릭스는 레트로넥틴이다. 일부 양상에서 Notch 리간드는 DLL4입니다. 특정 양상에서, DLL4는 DLL4:Fc 키메라 단백질이다. 특정 양상에서, 하나 이상의 사이토킨은 SCF, TPO, IL-7 및 Flt-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서 제2 단계는 1주 내지 6주, 예를 들어, 2주 내지 4주이다. 일부 양상에서, 림프구 세포는 CD8, CD7, CD45, CD5, CD4 및 CD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 양상에서, 림프구 세포의 5% 이상은 마커들 중 적어도 2개에 대해 양성이다. 특정 양상에서, 림프구 세포의 10% 이상은 마커들 중 적어도 2개에 대해 양성이다.
일부 양상에서, 면역 세포 분화를 촉진하기 위한 조건은 골수 분화를 촉진하기 위한 조건으로서 추가로 정의된다. 특정 양상에서, 골수 분화를 촉진하기 위한 조건하에 HPC를 배양하는 것은 TPO, SCF 및 Flt3 리간드를 포함하는 1차 제한 배지에서 HPC를 배양하여 골수 세포 집단을 생산하고, TPO, SCF 및 Flt3 리간드를 본질적으로 포함하지 않는 2차 제한 배지에서 세포를 인큐베이션하여 농축된 골수 세포집단을 생산한다. 일부 양상에서, 1차 제한 배지는 IL-6 및 IL-3을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 2차 제한 배지는 GM-CSF를 포함한다. 특정 양상에서, 제1 단계에서 생산된 골수 세포 집단의 적어도 50%는 CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성이다. 일부 양상에서, CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인 골수 세포 집단은 본질적으로 CD34의 발현을 갖지 않는다. 특정 양상에서, 농축된 골수 세포 집단의 적어도 80%는 CD43+, CD45+, CD31+ 및 CD34-이다. 일부 양상에서 제2 단계는 5일 내지 10일 동안이다.
특정 양상에서, 상기 방법은 농축된 골수 세포 집단을 수지상 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 농축된 골수 세포 집단을 수지상 세포로 분화시키는 것은 GM-CSF, IL-4 및 TNFα를 포함하는 제한 배지에서 농축된 골수 세포 집단을 배양하여 수지상 세포를 생산하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 제한 배지는 지질단백질을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 수지상 세포는 CD209, CD1a, HLA-DR, CD11c, CD14, CD83 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다. 특정 양상에서, 수지상 세포는 본질적으로 CD12의 발현을 갖지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내는 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변화 및 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한, 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 잘 알려져 있다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 결합하여 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d: (도 1a) iPSC로부터 T, NK 및 NK/T 세포를 유도하기 위한 피더-불포함 방법의 개략도. iPSC는 3D 프로세스에 의해 림프구 및 골수 잠재력을 가진 HPC로 분화되고, 7-10일 선조 세포는 T, NK 및 NK/T 세포를 생산하는 2D 분화 프로세스를 거친다. (도 1b) iPSC로부터 수지상 세포를 유도하기 위한 피더-불포함 방법의 개략도. iPSC는 3D 프로세스에 의해 림프구 및 골수 잠재력을 가진 HPC로 분화되고, 12일 선조 세포는 골수 선조 세포를 생산하기 위해 추가로 분화되고, 단계별 3D 분화 프로세스를 거쳐 수지상 세포를 생산한다. (도 1c) HPC는 분화 12일째에 다양한 혈액 세포-유도된 iPSC 세포주로부터 생산되었으며, 유동 세포 계측법으로 정량화된 CD43+/CD34+ 세포의 백분율은 나타나 있다. (도 1d) 12일 iPSC로부터의 HPC 생산 효율은 iPSC의 입력 수당 생성된 HPC의 절대 수의 비율로 나타나 있다.
도 2: 7-10일 HPC의 림프구 분화 동안 림프구 및 림프구-골수 집단을 확인하는 유동 세포 계측법 산포 플롯이 나타나 있다. 프레 T, NK 및 NK/T 세포의 존재가 결정되었다.
도 3a 내지 도 3d: (도 3a) 제대혈-유도된 iPSC, 바이러스 재프로그래밍된 T 세포 iPSC (TiPSC) 및 에피솜으로 재프로그래밍된 선조 혈액 세포 iPSC (01279.107.3908)를 포함하여 바이러스 및 에피솜으로 재프로그래밍된 iPSC로부터 림프구 세포의 출현을 검출하기 위한 대표적인 염색 프로파일. CD5, CD7, CD45, CD3, CD56 및 CD8을 포함하는 다양한 마커의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포의 백분율은 FSC-SSC 및 림프구 산포 게이트 하에서 유동 세포 계측법으로 정량화되었다. (EB7 = 7일째, EB8 = 8일째, EB9 = 9일째, EB10 = 10일째, EB11 = 11일째) (도 3b) 7-11일째 TiPSC로부터 분화된 HPC (상단: 총 HPC; 하단: CD43+ CD34+ HPC)는 림프구 세포로 추가로 분화되고, CD45, CD7 및 CD5의 표면 발현을 위해 염색되었다. 세포의 백분율은 FSC-SSC 및 림프구 산포 게이트 하에서 유동 세포 계측법으로 정량화되었다. (도 3c) 7-11일째 TiPSC로부터 생산된 HPC (상부: 총 HPC; 바닥: CD43+ CD34+ HPC)를 저산소 조건하에서 분화하고, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 염색하였다. (도 3d) TiPSC로부터 림프구 세포를 생산하는 효율을 나타내었다 (좌측: 총 HPC; 우측: CD43+ CD34+ HPC).
도 4: 7-11일째 TiPSC로부터 분화된 HPC (예를 들어, 바이러스로 재프로그래밍된 TiPSCs1E 또는 에피솜으로 재프로그래밍된 01279.107.3902)는 7일부터 11일까지의 HPC 분화의 다양한 날에 CD43/CD34, CD34, Dll4, Dll4/CD144, CD31/CD144 및 CD235의 발현에 대해 분석하였다. 표시된 경우, 마커의 각 세트에 대해 양성인 세포의 백분율. CD43/CD34 발현은 좌측 컬럼, CD34 우측 컬럼, DLL4/CD144 하단 라인, CD31/CD144 중간 라인 및 CD235 상단 라인에 표시됩니다.
도 5: HPC 분화 동안 림프구 선조 세포를 검출하기 위한 자기 분류 전략의 개략도. 관심 대상의 마커에는 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD7, CD235 FLK1(또한 KDR, VEGFR2, CD309로도 알려짐) 및 DLL4가 포함된다. 분화 8일째에, 관심 대상의 마커에 기초하여 세포를 여러 분획물로 분류한 다음 림프구 분화 프로세스를 거쳤다.
도 6a 및 도 6b: (도 6a) 도 5의 자기 분류 전략으로부터의 세포의 각각의 양성 및 음성 분획물에서의 CD3 양성 세포의 백분율은 대조군으로서 분류되지 않은 세포와 함께 나타냈다. (도 6b) HPC로부터 생산된 T 세포의 폴드 농축은 대조군으로서 분류되지 않은 세포와 함께 도 5의 자기 분류 전략으로부터 양성 및 음성 분획물에 대해 나타났다.
도 7a 및 도 7b: (도 7a) TiPSC로부터 림프구 분화 4주 후 도 5의 자기 분류로부터 세포의 각각의 양성 분획물에 대한 CD3 양성 세포의 백분율을 나타냈다. (도 7b) TiPSCs1E 세포로부터 5주 분화의 FACS 플롯. 신생 림프구 세포의 발현에 대한 CD3 양성 세포의 유동 세포 분석은 CD7+, CD5+, CD3+, CD8+, CD56+, CD335+, CD161+, TCRαβ+, TCRγδ-이다.
도 8a 및 도 8b: (도 8a) 양성 및 음성 자기 분류된 분획물 둘 다의 16일째에 HPC로부터의 TiPC 림프구 분화 프로세스의 효율을 입력 HPC와 출력 림프구 세포의 비율로 나타냈다. (도 8b) 양성 자기 분류 분획물과 시작한 4주말에 분화 프로세스의 누적 효율.
도 9a 및 도 9b: (도 9a) 분화 42일째에 iPSC 02179 (MeCP2 WT)로부터 유도된 수지상 세포의 표현형 분석. 세포는 골수 수지상 마커 CD205, CD209, HLA-DR, CD1a, CD1c, CD80, CD11c, CD80, CD86 및 CD83의 세포 표면 발현을 위해 염색하였다. (도 9b) 수지상 세포에서 발현된 다양한 세포 표면 마커의 발현을 정량화하기 위한 대표적인 FACS 플롯 히스토그램.
도 10: DQ TM 오발부민 (DQ-OVA, Invitrogen)을 1mg/ml PBS에 용해시키고, 100ug/ml의 iPSC 유도된 DC에 첨가하였다. 세포를 37℃ 또는 4℃에서 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, Accuri 유동 세포 계측기에서 분석했다. OVA의 특정 흡수는 4℃에서의 비특이적 OVA 흡수와 비교하여 37℃에서 iPSC 유도된 DC에 의해 입증되었다.
도 11: hPCS 의 피더 -불포함 및 무혈청 T 및 NK 세포 분화를 나타내는 다이어그램. PSC는 9일 동안 응집물 형성, 중배엽 유도 및 HPC 분화의 연속 단계를 통해 유화액 (3D) 배아체(EB) 배양에서 CD34+ 조혈 선조 세포 (HPC)로 먼저 분화하였다. 직접 CD34 상자성 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS에 의해 CD34+ 세포를 단리하고, 2주 동안 T/NK 분화를 위해 DLL4+ 레트로넥틴 코팅된 플레이트로 옮겼다. T 세포는 IL2 단독으로 또는 다른 T 세포 성장 촉진 사이토카인 (IL7, IL15, IL21)과 함께 보충된 T-EM (ImmunoCult-XF T 세포 확대 배지 (Stem Cell Technologies))에서 항-CD3 mAb (OKT3) + 레트로넥틴 코팅된 (둘 다 0.5μg/cm2) 플레이트에서 배양하여 2주 동안 추가로 확대될 수 있다. 약어: SFDM, 무혈청 분화 배지; TCDM, T 세포 분화 배지; TCEM, T 세포 확대 배지; MACS, 자성-활성화된 세포 분류.
도 12: T/ NK 분화 배양물의 유동 세포 분석. T/NK 분화 조건에서 2주 후에 PSC (1C TiPSC)-유도된 CD34+ 세포는 낮은 FSC/SSC 파라미터 (좌측 점 - 플롯)에 의해 정의된 전형적인 림프구 세포 집단을 발생시킨다. 이러한 림프구 집단은 대부분 CD3+ T 및 CD56+CD3- NK 세포 (중간 점 - 플롯)를 포함한다. T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ 단일 및 이중 양성 세포뿐만 아니라 이중 음성 세포의 상당 부분을 포함합니다 (우측 점 - 플롯).
도 13: 분화를 통한 상이한 세포 집단의 수율. 각각의 세포 유형의 수율은 도표에 묘사된 세포 유도의 각 단계에서 입력 절대 세포 수에 대한 출력의 비율로 표현된다. 예를 들어, 1.5 CD34+ 세포 수율은 평균 1.5 (출력) CD34+ 세포가 1 (입력) PSC 세포로부터 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 102 T 세포 수율은 102 (출력) T 세포가 1 (입력) CD34+ 세포로부터 유도될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14: PSC -유도된 T 세포의 표현형. 4주 동안 유도되고 확대된 PSC-유도된 T 세포 (CD3+)는 α/β TCR (γ/δ 또는 불변 Vα24NKT TCR이 아님) 및 전형적인 T 세포 마커 CD5, CD27, CD7을 발현한다. 이들은 또한 NK 관련 (CD161, CD94) 및 활성화 (CD69) 마커를 발현한다.
도 15: PSC -유도된 T 세포의 확대. 고정화 항-CD3 항체 (iCD3)는 PSC-유도된 T 세포 (막대 그래프)의 확대를 달성하기 위해 최소한으로 필요하고 충분하다. 가용성 자극 CD3 및 CD28 mAb (sCD3, sCD28)는 단독으로 (나타내지 않음) 또는 조합으로 (sCD3+sCD28) 또는 iCD3 (iCD3+sCD28)에 첨가되었을 때 효과적이지 않았다. 확대 배양에서 증식하는 T 세포는 불규칙한 모양의 림프모구의 특징적인 형태를 얻는다 (사진). 상대적 비균질 입력 세포 집단과 대조적으로, 2주 T 세포 확대에서 수확된 세포는 또한 본질적으로 순수한 CD3+ T 세포이며, 이는 또한 CD56을 발현하고 CD8 발현을 획득한다 (유동 세포 계측법 점 플롯).
도 16a 내지 도 16h: (도 16a) 8일째 HPC 배양물의 대표적인 사진: HPC는 하부 내피 층으로부터 떨어져 나온다. (도 16b) 2D HPC 분화 프로세스의 도식적 묘사. (도 16c) 분화 7-10일째에 01279.107.3902 (MeCP2 KO) 세포주로부터 HPC의 생산. (도 16d) 분화 7-10일째에 TiPSCs1E 세포주로부터 HPCs의 생산. 세포를 수확하고 CD43/CD34 세포의 백분율을 유동 세포 계측법으로 정량화하였다. (도 16e) iPSC로부터 HPC의 생산의 효율. 프로세스의 효율은 iPSC의 입력 수당 생산된 HPC의 절대 수를 나눔으로써 산출된다. (도 16f) 프레 T 및 프레 NK 세포의 분석. iPSC 0.1279.107.3902 (MeCP2 KO)로부터 생산된 HPC를 7-10일째에 수확하고 동결 보존하였다. HPC를 해동시키고 레트로넥틴-DLL4 코팅된 플레이트에 25K/cm2의 밀도로 도금했다. 1% 글루타맥스, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95μM L-아스코르브산 2-포스페이트, 50ng/mL 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), Flt-3 리간드 (Flt-3) 및 IL-7을 함유하는 무혈청 제한 (Serum Free Defined: SFD) 배지에 세포를 넣고 저산소 및 조건 하에서 림프구 분화를 자극하였다. 세포에 48시간마다 새로운 배지를 공급하고, 차가운 PBS를 사용하여 14일째에 수확했다. CD4, CD7, CD5, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포 백분율은 림프구 스케터 게이트 하에서 유동 세포 계측법으로 정량화하였다. T, NK 및 NK/T 세포의 존재를 정량화하였다. (도 16g) 프레 T 및 프레 NK 세포의 분석. CD4, CD7, CD5, CD56, CD8 및 CD3의 표면 발현을 위해 세포를 염색하였다. 세포 백분율은 림프구 산포 게이트 하에서 유동 세포 계측법으로 정량화되었다. (도 16h) HPC로부터 T 세포의 생산의 효율. 프로세스의 효율은 HPC (CD43/34+)의 입력 수당 생산된 T 세포 (CD3+)의 절대 수를 나눔으로써 산출된다.
도 17a 내지 도 17c: (도 17a) E8 배지 및 저산소 조건 하에서 Matrigel 또는 Vitronectin에서 피더-불포함 성장에 적응된 iPSC를 이용한 3D HPC 분화 프로세스의 도식적 묘사. HPC 분화의 제1 단계는 BMP4, VEGF 및 FGF에 의해 4일 동안 구동되며, 분화의 제2 단계는 헤파린, SCF, TPO, Flt-3 리간드, IL-3 및 IL-6을 함유하는 배지에 세포를 넣음으로써 구동된다. (도 17b) 남성 iPSC 세포주 2.038에서 MeCP2 KO를 생산하여 9006 (01279.107.003902)을 만드는 공학적 전략. (도 17c) MeCP2 TALENS 및 Donor 플라스미드 p1553으로 형질감염된 01279 iPSC로부터 유도된 MeCP2 변이체 001, 002, 005 및 008의 아미노산 정렬의 설명. 모든 변이체 (001, 002, 005 및 008)은 MethylCpG 결합 도메인을 코딩하지 않는다.
도 18a 내지 도 18c: HPC 분화 7-11일째에 수확되어 2.5×104/cm2의 밀도로 림프구 분화를 개시하기 위해 Ret-DLL4 코팅된 플레이트에 놓인 프레 T 및 프레 NK 세포 iPSC Tips 1E의 정량화. 저산소 조건 (도 18a) 및 정상 산소 조건 (도 18b) 하에 유지된 01279 (MeCP2WT) 세포뿐만 아니라, 01279.107.3902 세포 (MeCP2K0) (도 18c)에서의 CD8+CD3+ (T 세포), CD56+/CD8+ (NK 세포) 및 CD56+/CD3+ (NK/T 세포)의 백분율을 결정하였다. (도 18a 및 도 18b) NK 세포는 가장 높은 백분율의 양성 세포를 가지며, 다음은 NK/T 세포와 T 세포이다. (도 18c) 7일째부터 10일째까지, 상단부터 하단까지의 양성 세포의 백분율은 T 세포, NK/T 세포 및 NK 세포이다. 11일째에, 가장 높은 백분율의 양성 세포는 NK 세포, 이어서, NK/T 세포 및 T 세포이다.
도 19a 내지 도 19c: 시험관내에서 생산된 림프구 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략. (도 19a) 성인 사람 말초 혈액으로부터의 림프구의 일반적인 산포 프로파일. (도 19b) 분화 18일째에 림프구 세포의 산포 프로파일. FSC-SSC 게이트 및 림프구 게이트가 예시되어 있다. (도 19c) 프로피디움 요오드화물을 사용하는 FSC-SSC 산포 및 림프구 산포 내의 게이팅 라이브 세포.
도 20: 시험관내에서 생산된 림프구 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략. 분화 18일째 림프구 세포의 산포 프로파일을 나타낸다. FSC-SSC 게이트 및 림프구 게이트가 예시되어 있다. 라이브 세포는 프로피디움 요오드화물 사용하여 FSC-SSC 산포 및 림프구 산포 내에서 게이팅되고, 이어서 유동 세포 계측법으로 CD7 및 CD5 양성 세포에 대해 염색하였다.
도 21a 및 도 21b: HPC 분화의 7-11일째에 수확되어 2.5×104/cm2의 밀도로 림프구 분화를 개시하기 위해 Ret-DLL4 코팅된 플레이트에 놓인 NK (CD3-/CD56+) 세포의 정량화. 이중 양성의 모든 라이브 FSC-SSC 게이트 (도 21a) 및 림프구 게이트 (도 21b) 하에서의 CD56+/CD3-의 백분율은 MeCp2 WT 및 MeCp2KO 상태를 함유하는 iPSC 클론에 대해 측정하였다.
본 개시내용은 체세포 (예를 들어, 혈액 세포)의 초기 집단으로부터 재프로그래밍된 유도된 만능 줄기 세포로부터 면역 세포를 생산하기 위한 고도로 효율적인 방법을 제공함으로써 종래 기술과 관련된 문제점들을 극복한다. 종래의 방법에 의해 생산된 면역 세포는 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 체세포의 초기 집단은 T 세포를 포함한다. T 세포는 혈액 샘플과 같은 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다.
체세포 집단은 바이러스 또는 에피솜 벡터와 같은 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 iPSC로 재프로그래밍된다. 이어서, 이러한 체세포 유도된 iPSC (예를 들어, T 세포 유도된 iPSC (TiPSC))는 조혈 전구 세포로 분화된다. 하나의 방법에서, 분화 프로세스는 WNT 활성화, 조혈 유도성 사이토카인에 의한 배양 및 CD34+ 세포 단리를 포함한다. 마지막으로, HPC는 림프구 세포 (예를 들어, T, NK 및 T/NK 세포) 및 골수 세포 (예를 들어, 수지상 세포)와 같은 면역 세포로 분화된다.
림프구 세포로의 분화는 피더-불포함 매트릭스로서 RetroNectin 및 DLL-4를 사용하여 이루어질 수 있다. T 세포 분화는 효율 및 성숙을 증가시키기 위해 아스코르브산을 사용함으로써 뿐만 아니라, 저산소 조건 하에서 배양함으로써 추가로 농축될 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자는 림프구 잠재력에 대해 HPC 분화 동안 (예를 들어, 7-11일) 최적 기간을 결정하였다. 림프구 잠재력을 가진 이들 HPC는 CD34 및 CD43의 발현으로 확인될 수 있다. 또한, 림프구 잠재력이 향상된 HPC는 CD144, CD34, CD45 및 CD7 마커들 중 2개 이상에서 양성인 세포 분획물을 분류함으로써 단리할 수 있다. 일부 양상에서, 수지상 세포 유도를 위한 선조 세포는 HPC 분화 16일 전후에 나타나는 공통 골수 선조 세포이다.
체세포-유도된 PSC로부터 생산된 림프구 세포는 특징적인 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 재배열, 예를 들어, 유전자 추적 마커로서 또는 재분화 실험에서 이용되어 인간 T 세포 발달을 연구할 수 있는 특성을 보유하는 T 세포, NK 세포 및 T/NK 세포를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 특별한 이점은 분화된 T 세포에서 보유될 수 있는 T 세포 수용체의 재배열되고 감소된 V, D, J 유전자 분절에 있다. 이는 T 세포-유도된 iPS 세포의 다양한 클론 집단의 특이적인 특징 또는 "바코드"로서 역할을 하며, 또한 V(D)J 재조합을 거치지 않는 만능 줄기 세포로부터 이들 iPS 세포를 분화시키는데 도움을 준다.
따라서, 본 개시내용의 방법들은 안정한 생체내 이식, 화합물의 시험관내 스크리닝, 및 혈액학적 질병 및 손상의 기전의 밝힘과 같은 광범위한 적용을 위해 T 세포, NK 세포, T/NK 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포를 무제한으로 제공할 수 있다.
I. 정의
본원에서 사용되는 특정 구성성분에 관하여 "본질적으로 포함하지 않는"은 본원에서 상기 특정 구성성분 중 의도적으로 조성물로 제형화된 것은 없었고/없었거나 단지 오염물질로서만 존재하거나 또는 미량으로 존재한다는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로부터 얻어지는 특정 구성성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만인 것이 좋다. 표준 분석 방법을 이용하여 검출될 수 있는 특정 구성성분의 양이 존재하지 않는 조성물이 가장 바람직하다.
본원 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 본원 청구범위(들)에서 사용되는 단어 "한" 또는 "하나"는 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다.
청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은 양자 중 하나(alternative)만을 언급하는 것으로 명확하게 나타내어지거나 양자(alternatives)가 상호 배타적이지 않은 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시는 단지 양자택일만을 언급하는 정의 및 "및/또는"을 지지한다. 본원에 사용되는 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전반에서 용어 "약"은 값이 장치에 대한 고유한 오류의 편차, 상기 값을 결정하는데 사용되는 방법 또는 연구 대상체들 사이에 존재하는 편차를 포함함을 나타내는 것으로 사용된다.
세포 또는 유기체에서의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "외인성(exogenous)"은 인공적 또는 자연적 수단에 의해 상기 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 나타내거나; 또는 세포와 관련하여 상기 용어는 단리되어 후속적으로 인공적 또는 자연적 수단에 의해 다른 세포에 또는 유기체에 도입된 세포를 나타낸다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포 유래일 수 있거나, 또는 상기 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 카피(copy)일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체 유래일 수 있거나, 또는 동일한 유기체 유래일 수 있다. 비-제한적 예로서, 외인성 핵산은 자연 세포 내에 존재할 수 있는 것과 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹(flanking)되어 있는 것이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트(cassette)"는 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직 또는 장기에서 유전자 발현을 지시하는 최소한 하나 이상의 전사 제어 요소(예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 이들의 기능적으로 등가인 구조물)를 포함한다. 또한, 추가의 요소들, 예를 들면 전사 종결 신호도 포함될 수 있다.
"벡터" 또는 "작제물"(유전자 전달 시스템 또는 유전자 전이 "비히클"로서 나타내는 경우가 있음)은 시험관내에서 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자들의 복합체를 나타낸다.
일반적인 유형의 벡터인 "플라스미드"는 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개인 염색체외 DNA 분자이다. 소정 경우에서, 이는 환형 또는 이중-가닥형이다.
"복제의 기원"("ori") 또는 "복제 기원"은 예를 들면 림프영양성 헤르페스(herpes) 바이러스에 있어서, 세포 내의 플라스미드에 존재하는 경우 링크된 서열을 플라스미드 내에 유지할 수 있는 DNA 서열 및/또는 DNA 합성이 개시되는 부위 또는 그 부근이다. 한 예로서, EBV에 대한 ori는 FR 서열(30bp 반복의 20개의 불완전한 카피), 바람직하게는 DS 서열을 포함하지만; EBV의 다른 부위는 EBNA-1에 결합하고, 예를 들면 Rep* 서열은 복제의 기원으로서 DS를 대체할 수 있다(Kirshmaier and Sugden, 1998). 따라서, EBV의 복제 기원은 FR, DS 또는 Rep* 서열 또는 이들로부터 유도된 핵산 변형 또는 합성 조합을 통한 기능적으로 등가인 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 방법은 문헌[Lindner et al., 2008]에 구체적으로 기술되어 있는 바와 같이 예를 들면 개별 요소의 삽입 또는 돌연변이에 의해 EBV의 유전적으로 조작된 복제 기원도 사용할 수 있다.
특정 단백질을 "암호화하는" "유전자", "폴리뉴클레오타이드", "암호화 영역", "서열", "절편", "단편" 또는 "전이유전자"는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓이는 경우 시험관내에서 또는 생체내에서 전사되고 또한 임의로 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩타이드로 번역되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈성 DNA 또는 RNA 형태 중 어느 하나에 존재할 수 있다. DNA 형태 내에 존재하는 경우, 핵산 분자는 단일-가닥(즉, 센스 가닥(sense strand)) 또는 이중-가닥일 수 있다. 암호화 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA 유래의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA 유래의 게놈성 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열의 3'에 위치될 것이다.
용어 "제어 요소"는 총체적으로 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림(upstream) 조절 도메인, 복제의 기원, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site), 인핸서 및 스플라이스 접합(splice junction) 등을 나타내고, 이는 총체적으로 수용자 세포에서 암호화 서열의 복제, 전사, 전사-후 프로세싱 및 번역을 제공한다. 선택된 암호화 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, 번역될 수 있는 한 이들 제어 요소의 전부가 존재할 필요가 있는 것은 아니다.
용어 "프로모터"는 본원에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 나타내는 통상적인 의미로 사용되고, 여기서 상기 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합하여 다운스트림(downstream)(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유도된다. 이는 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합 할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. 어구 "작동적으로 위치된", "작동적으로 링크된", "제어 하에" 그리고 "전사적 제어 하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치에 그리고/또는 배향으로 존재하여 해당 서열의 전사적 개시 및/또는 발현이 제어됨을 의미한다.
"인핸서"는 프로모터에 근접하게 위치되는 경우 인핸서 도메인의 부재시의 프로모터로부터 얻어지는 전사 활성에 비하여 증가된 전사 활성을 부여하는 핵산 서열을 의미한다.
핵산 분자에 관하여 "작동적으로 링크된" 또는 "공동-발현된"은 2개 이상의 핵산 분자(예를 들면, 전사되는 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하도록 하는 방식으로 연결됨을 의미한다. 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드에 관하여 "작동적으로 링크된" 또는 "공동-발현된"은 2개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 융합의 구성성분인 각각의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄, 즉 융합 폴리펩타이드를 수득하도록 하는 방식으로 연결됨을 의미한다. 상기 융합 폴리펩타이드는 바람직하게는 키메라이고, 즉 이종성 분자들로 이루어진다.
"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 사이의 동일성 백분율을 나타낸다. 한 서열과 다른 서열 사이의 상응(correspondence)은 당해 분야에 공지되어 있는 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 2개의 폴리펩타이드 분자들 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의해 결정될 수 있다. 대안으로, 상동성은 상동성 영역 사이의 안정한 듀플렉스(duplex) 형성을 촉진시키는 조건 하의 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화에 의해, 이어서 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)를 이용한 분해(digestion) 및 분해된 단편의 크기 측정에 의해 결정될 수 있다. 2개의 DNA 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 상기 방법을 이용한 측정시 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 약 95% 이상이 상기 분자의 한정된 길이에 각각 일치하는 경우 서로에 대해 "실질적으로 상동성"이다.
용어 "세포"는 본원에서 당해 분야에서 이의 가장 광범위한 의미로 사용되고, 다세포 유기체의 조직의 구조적 단위이고, 외부로부터 이를 단리시키고, 자기-복제 능력을 갖고, 이를 발현하기 위한 유전적 정보 및 메커니즘을 갖는 막(membrane) 구조에 의해 둘러싸인 생체(living body)를 나타낸다. 본원에서 사용된 세포는 자연-발생 세포 또는 인위적으로 변형된 세포(예를 들면, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
용어 "줄기 세포"는 본원에서 적합한 조건 하에 다양한 범위의 특화된 세포 유형들로 분화할 수 있고, 한편 다른 적합한 조건 하에 자기-재생하여 본질적으로 미분화된 만능 상태를 유지할 수 있는 세포를 나타낸다. 용어 "줄기 세포"는 또한 만능 세포, 다능(multipotent) 세포, 전구 세포 및 선조 세포를 포함한다. 예시의 사람 줄기 세포는 골수 조직으로부터 얻어진 조혈 또는 간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 얻어진 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 얻어진 배아 생식 세포로부터 얻어질 수 있다. 예시의 만능 줄기 세포는 또한 만능성(pluripotency)과 관련된 소정 전사 인자의 발현에 의해 이들을 만능 상태로 재프로그래밍함으로써 체세포로부터 생산될 수 있고; 이들 세포는 "유도된 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"라고 칭한다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 포배기에서의 내세포 집단(inner cell mass)과 같은 초기 단계의 배아로부터 얻어지거나 인공적 수단(예를 들면, 핵 이입(nuclear transfer))에 의해 생산되는 미분화된 만능 세포이고, 생식 세포(예를 들면, 정자 및 난자)를 포함하는 배아 또는 성체에서의 임의의 분화된 세포 유형을 발생시킬 수 있다.
"유도된 만능 줄기 세포(iPSC)"는 인자들의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도함에 의해 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 세포이다(본원에서 재프로그래밍 인자로서 언급됨). iPSC는 태아, 출산후, 신생아, 연소자 또는 성인 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는 예를 들면, Oct4(Oct 3/4로서 언급되는 경우가 있음), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28이 포함된다. 몇몇의 실시형태들에서, 체세포는 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위한 적어도 2개의 재프로그래밍 인자들, 적어도 3개의 재프로그래밍 인자들, 적어도 4개의 재프로그래밍 인자들 또는 적어도 5개의 재프로그래밍 인자들을 발현시킴으로써 재프로그래밍된다.
"조혈 선조 세포" 또는 "조혈 전구 세포"는 조혈 계대에 전념하지만 추가 조혈 분화를 가능하게 하는 세포를 언급하고, 조혈 줄기 세포, 다능 조혈 줄기 세포, 일반 골수 선조, 거대핵세포 선조, 적혈구 선조, 및 림프구 선조를 포함할 수 있다. 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 골수(단핵구 및 마크로파지, 과립구(중성구, 호염기구, 호산구, 및 거대 세포), 적혈구, 거대핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계대 (T-세포, B-세포, NK-세포)를 포함하는 혈액 세포 타입 모두를 생기게 하는 다능 줄기 세포이다(참조: 예를 들면, Doulatov et al., 2012; Notta et al., 2015). "멀티림프구 선조" (MLP)는 모든 림프구 계대(B, T, 및 NK 세포)를 생기게 하지만 다른 (골수) 잠재성을 갖거나 가질 수 없는 임의의 선조를 기술하기 위해 정의되고(Doulatov et al., 2010) CD45RA+/CD10+/CD7-이다. 임의의 B, T, 및 NK 선조는 MLP로서 언급될 수 있다. "일반 골수 선조" (CMP)는 과립구, 단핵구, 거대핵세포 및 적혈구를 생기게 할 수 있는 CD45+/CD31+/CD43+/CD34- 세포의 발현에 의해 정의된 일반 골수 선조를 언급한다. 조혈 선조 세포는 CD34를 발현할 수 있다. 조혈 선조 세포는 CD133을 공발현하고 CD38 발현에 음성일 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD34+ / CD45+ 조혈 전구 세포 및 CD34+ / CD45+ / CD43+ 조혈 전구 세포를 포함한다. CD34+ / CD43+ / CD45+ 조혈 전구 세포는 골수 선조에 매우 풍부할 수 있다. 조혈 세포는 또한 다양한 하위세트의 원시 조혈 세포를 포함하고 다음을 포함한다: CD34-/CD133+/CD38- (원시 조혈 전구 세포), CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-) (적혈구-거대핵세포(erythro-megakaryopoietic)), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-) (다능), 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+) (골수-왜곡) 세포, CD133+/ALDH+ (알데히드헤하이드로게나제) (예를 들면, Hess et al. 2004; Christ et al., 2007). 이들 원시 조혈 세포 유형 또는 조혈 전구 세포 중 어느 것이 본원에 기재된 iPS 세포 내로 변환될 수 있음이 예상된다. 일부 양상에서, 세포는 거대 세포, 랑게르한스 세포, 파골세포, NK 세포, T 세포, CIK T 세포, 또는 T 세포, NK 세포, 및 B 세포의 다른 서브타입을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 세포(들)"은 면역계의 세포를 언급하고, 이에 제한되는 것은 아니지만, T 세포, NK 세포, T/NK 세포, 수지상 세포, 마크로파지, B 세포, 중성구, 적혈구, 단핵구, 호염기구, 중성구, 거대 세포, 호산구, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.
T 세포의 "활성화제" 또는 T 세포를 활성화시킬 조건은 T 세포를 활성화시키는 자극제를 언급하고, 항원 제시 세포 또는 다른 표면에 존재할 수 있는 항원을 포함하고; 특이성에 상관없이 다수 T 세포 수용체(TCR) 복합체에 결합하는 폴리클로날 활성화제를 포함하고, 여기에는 렉틴, 예를 들면, 콘카나발린-A (Con-A) 및 피토헤마글루티닌 (PHA) 및 TCR 또는 CD3 단백질에 불변 프레임워크 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 제제가 포함되고; 상당수의 T 세포를 자극하는 초항원을 포함하고 여기에는 예를 들면, 엔테로독신, 예를 들면, 스타필로칼 엔테로독신(Staphyloccal enterotoxins)이 포함된다.
용어 "T 림프구" 및 "T 세포"는 상호교환되어 사용되고, 하나 이상의 MHC 분자 또는, 하나 이상의 비-전형적 MHC 분자와 함께 항원 제시 세포 또는 매트릭스의 표면에 나타난 경우, 항원을 인식할 수 있는 T 세포 항원 수용체(TCR)를 발현하는 세포를 언급한다.
용어 "T 세포"는 당해 기술에 정의된 T 림프구를 언급하고, 흉선세포, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것을 의도한다. T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+CD8+ T 세포, 또는 CD4-CD8- 세포일 수 있다. T 세포는 또한 T 헬퍼 세포, 예를 들면, T 헬퍼 1 (TH1), 또는 T 헬퍼 2 (TH2) 세포, 또는 TH17 세포, 뿐만 아니라 세포독성 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 T 세포, 또는 감마 델타 T 세포일 수 있다(Wilson et al., 2009; Wynn, 2005; Ladi et al., 2006). 적어도 하나의 마커, 예를 들면, CD4와 서로 다른 T 세포는 T 세포의 "서브세트"로서 본원에 언급된다.
"CD4+ T 세포"는 이의 표면 상에 CD4를 발현하고 세포-매개된 면역 반응에 관련된 T 세포의 서브세트를 언급한다. 이들은 사이토카인, 예를 들면, IFN-감마, TNF-알파, IL-2, IL-4 및 IL-10의 분비를 포함할 수 있는 자극에 따른 분비 프로파일을 특징으로 한다. "CD4"는 원래 T-림프구 상의 분화 항원으로서 정의되지만, 또한 단핵구/대식세포를 포함하는 다른 세포 상에서 발견되는 55-kD 당단백질이다. CD4 항원은 면역글로불린 초유전자(supergene) 패밀리의 구성원이고, MHC(주요 조직적합성 유전자 복합체) 클래스 II-제한된 면역 반응에서 결합(associative) 인식 요소로서 연루된다. T-림프구 상에서 이들은 헬퍼/유도제 서브세트를 정의한다.
"CD8+ T 세포"는 이들 표면 상 CD8을 발현하는 T 세포의 서브세트를 언급하고, MHC 클래스 I-제한이고, 세포독성 T 세포로서 기능한다. "CD8" 분자는 흉선세포 상 및 세포독성 및 억제제 T-림프구 상에서 발견되는 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 패밀리의 구성원이고, 주요 조직적합성 유전자 복합체 클래스 I-제한 상호작용에서 결합 인식 성분이다.
"만능 줄기 세포"는 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 또는 바람직하게는 3개의 배아층: 내배엽(위 내막, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 골, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(표피 조직과 신경계) 중 어느 하나로 분화시키는 잠재력을 갖는 줄기 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "체세포"는 난자 또는 정자 등과 같은 생식 세포 이외의 임의의 세포를 나타내고, 이는 이의 DNA를 다음 세대로 직접 전이시키지 않는다. 전형적으로, 체세포는 제한된 만능성을 갖거나 만능성을 갖지 않는다. 본원에서 사용되는 체세포는 자연-발생일 수 있거나 유전적으로 변형된 것일 수 있다.
"프로그래밍"은 세포가 생산할 수 있는 자손의 유형을 변경시키는 프로세스이다. 예를 들면, 세포는 프로그래밍 부재의 동일한 조건 하에 형성될 수 있었던 것과 비교하여 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성할 수 있도록 변경된 경우에 배양물에서 또는 생체내에서 프로그래밍되었다. 이는 본질적으로 프로그래밍 전에 이러한 자손이 형성될 수 없으면 충분한 증식 후 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 측정가능한 비율의 자손이 관찰되고; 대안으로는 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율은 프로그래밍 전보다 더 측정가능하게 높음을 의미한다. 이러한 프로세스는 분화, 탈분화(dedifferentiation) 및 전환분화(transdifferentiation)를 포함한다.
"분화"는 분화에 의해 덜 특화된 세포가 더 특화된 세포 유형이 되는 프로세스이다. "탈분화"는 부분 분화된 세포 또는 말단 분화된 세포가 만능성 또는 다능성과 같은 초기 발달 단계로 되돌아가는 세포 프로세스이다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형을 다른 분화된 세포 유형으로 형질전환시키는 프로세스이다. 전형적으로, 프로그래밍에 의한 전환분화는 중간의 만능성 단계를 통과하는 세포의 부재시에 발생한다 - 즉, 상기 세포는 하나의 분화된 세포 유형으로부터 다른 분화된 세포 유형으로 직접적으로 프로그래밍된다. 소정 조건 하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도 순서로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
"재프로그래밍"은 재프로그래밍 없이 동일한 조건하에 갖는 것보다 적어도 하나의 신규한 세포 유형의 자손을 배양에서 또는 생체내에서 형성할 수 있는 측정가능하게 증가된 능력을 세포에게 부여하는 프로세스이다. 보다 특히, 재프로그래밍은 체세포에게 다능성 잠재력을 부여하는 프로세스이다. 이는 충분한 증식 후, 본질적으로 이러한 자손을 재프로그래밍 전에 형성할 수 없는 경우 신규한 세포 유형의 표현형 특성을 갖는 자손의 측정가능한 비율; 그렇지 않으면, 신규한 세포 유형의 특성을 갖는 비율은 측정할 수 있게 재프로그래밍 전보다 많음을 의미한다. 특정 조건하에, 신규한 세포 유형의 특성을 갖는 자손의 비율은 선호도를 증가시키기 위해 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
용어 "순방향 프로그래밍"은 만능성을 갖지 않는 분화된 체세포와는 대조적으로, 다능 또는 만능 세포에 대한 하나 이상의 특정 계통-결정 유전자 또는 유전자 산물의 공급에 의한 다능 또는 만능 세포의 프로그래밍을 나타낸다. 예를 들면, 순방향 프로그래밍은 ESC 또는 iPSC를 조혈 전구 세포 또는 다른 전구 세포로, 또는 조혈 세포 또는 다른 분화된 체세포로 프로그래밍하는 프로세스를 기술할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 포유동물, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식을 필요로 하는 임의의 연령의 남성 또는 여성인 사람을 말한다. 전형적으로, 상기 대상체(본원에서 수용자로서도 언급됨)는 장애 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 병태, 상태 또는 증후군, 또는 세포 또는 조직 이식을 통한 치료에 순응하는 육체적, 형태학적 또는 생리학적 이상으로 인하여 세포 또는 조직 이식을 필요로 한다.
본원에 사용된 유전자의 "분열"은 분열의 부재하에 유전자 생산물의 발현 수준과 비교하여 세포에서 대상 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 유전자 생산물의 발현의 제거 또는 감소를 언급한다. 예시적인 유전자 생산물은 mRNA 및 유전자에 의해 암호화되는 단백질 생산물을 포함한다. 일부 경우 분열은 일시적 또는 가변적이고, 다른 경우 불변적이다. 일부 경우 분열은 절두된 또는 비-기능적 생산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고 기능적 또는 전체길이 단백질 또는 mRNA이다. 본원의 일부 실시형태에서, 유전자 활성 또는 기능이, 발현과 대조적으로, 방해된다. 유전자 분열은 일반적으로 합성 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합물, 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 핵산 또는 유전자 관련, 예를 들면, DNA 수준에서의 분열에 의해 유도된다. 유전자 분열을 위한 예시적인 방법은 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 분열 기술, 예를 들면, 유전자 편집을 포함한다. 이의 예는 안티센스 기술, 예를 들면, RNAi, siRNA, shRNA, 및/또는 리보자임을 포함하고, 이는 일반적으로 발현의 일시적 감소, 뿐만 아니라 표적화된 유전자 비활성화 또는 예를 들면, 파괴의 유도 및/또는 상동 재조합에 의한 분열을 야기하는 유전자 편집 기술을 야기한다. 이의 예는 삽입, 돌연변이화, 및 결실을 포함한다. 분열은 전형적으로 유전자에 의해 암호화되는 정상 또는 "야생형" 생산물의 발현의 억압 및/또는 완전 부재를 야기한다. 예시적인 이러한 유전자 분열은 유전자 또는 유전자 부분의 삽입, 프레임시프트 및 미스센스 돌연변이화, 결실, 녹-인, 녹-아웃이고, 이는 전체 유전자의 결실을 포함한다. 이러한 분열은 암호화 영역에서, 예를 들면, 하나 이상의 엑손에서 일어날 수 있고, 이는 예를 들면, 정지 코톤의 삽입에 의한 전체-길이 생산물, 기능적 생산물, 또는 임의의 생산물을 생산 불능을 야기한다. 이러한 분열은 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서 분열에 의해 발생할 수 있다. 유전자 분열은 유전자 표적화를 포함하고, 이는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 비활성화를 포함한다.
"노치(Notch) 리간드"는 다수의 상이한 포유동물 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 막에 존재하는 노치 수용체 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 단백질이다. 사람 세포에서 확인된 노치 수용체는 노치-1, 노치-2, 노치-3, 및 노치-4를 포함한다. 노치 리간드는 전형적으로 DSL 도메인(D-Delta, S-Serrate, 및 L-Lag2)을 갖고, 이는 아미노 말단에서 세포외 표면 상 3 내지 8 EGF-유사 반복 사이에 20 내지 22 아미노산을 포함한다(참조: Furie and Furie, 1988; Knust et al., 1987; Suzuki et al., 1987).
II. 체세포-유도된 iPSC
A. 체세포의 출발 집단
본 발명의 실시형태는 iPSCs로 재프로그래밍된 체세포의 출발 집단(예를 들면, 혈액 세포 또는 피부 세포)에 관한 것이다. 혈액 세포의 집단은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 전혈 또는 혼합 집단을 포함하는 이의 부분, 비장 세포, 골수 세포, 종양 침윤 림프구, 백혈구성분채집술에 의해 수득된 세포, 생검 조직, 및 림프절, 예를 들면, 종양으로부터 배출된 림프절을 포함할 수 있다. 적합한 공여체는 면역화된 공여체, 비-면역화된 (나이브) 공여체, 처리된 또는 처리되지 않은 공여체를 포함한다. "처리된" 공여체는 하나 이상의 생물학적 변형제에 노출된 것이다. "처리되지 않은" 공여체는 하나 이상의 생물학적 변형제에 노출되어 않았다.
일부 양상에서, 혈액 세포의 집단은 T 세포를 포함한다. T 세포는 T 세포의 정제된 집단일 수 있고, 또는 대안으로 T 세포는 상이한 유형의 세포, 예를 들면, B 세포 및/또는 다른 말초 혈액 세포를 갖는 집단일 수 있다. T 세포는 T 세포, 예를 들면, CD4+ T 세포의 서브세트의 정제된 집단일 수 있고, 또는 이들은 T 세포의 상이한 서브세트를 포함하는 T 세포의 집단일 수 있다. 다른 실시형태에서, T 세포는 연장된 시간 기간 동안 배양 유지된 T 세포 클론이다. T 세포 클론은 상이한 정도로 변형될 수 있다. 소정 실시형태에서, T 세포는 배양에서 무기한으로 증식하는 T 세포 클론이다.
일부 양상에서, T 세포는 원발성 T 세포이다. 용어 "원발성 T 세포"는 연장된 시간 기간 동안 배양 유지된 T 세포와 대조적으로 개체로부터 수득되는 T 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 원발성 T 세포는 특히 대상체로부터 수득된 말초 혈액 T 세포이다. 원발성 T 세포의 집단은 T 세포의 대부분 하나의 서브세트로 구성될 수 있다. 대안으로, 원발성 T 세포의 집단은 T 세포의 상이한 서브세트로 구성될 수 있다.
T 세포는 건강한 개체로부터, 또는 대안으로 병태를 갖는 개체로부터 사전 저장된 혈액 샘플로부터 것일 수 있다. 병태는, 예를 들면, 바이러스 감염, 세균 감염 또는 기타 다른 미생물에 의한 감염으로부터 야기된 감염 질환, 또는 과증식 질환, 예를 들면, 흑색종과 같은 암일 수 있다. 소정 실시형태에서, T 세포는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)로 감염된 개체로부터의 것이다. 또한 또다른 실시형태에서, T 세포는 자가면역 질환 또는 T-세포 병리를 앓고 있거나 이에 취약한 개체로부터의 것이다. T 세포는 사람 기원, 뮤린 기원 또는 임의의 다른 포유동물 종의 것일 수 있다.
T 세포를 포함하는 세포의 집단을 수득하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라서 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이러한 방법의 예는 실시예에 열거되고 문헌에 논의된다[참조: Kim et al. (1992); Biswas et al. (1990); Biswas et al. (1991)].
일부 양상에서, 혈액 세포의 출발 집단은 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 포함한다. HSCs는 정상적으로 골수에 존재하지만, 혈액 내로 강제될 수 있고, 동원으로 언급된 프로세스는 임상적으로 다수의 HSCs를 말초 혈액에서 수집하는데 사용된다. 선택된 하나의 동원 제제는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)이다. 말초 혈액에서 순환하는 CD34+ 조혈 줄기 세포 또는 선조는 성분채집술 기술로 비섭동 상태에서, 또는 G-CSF와 같은 조혈 성장 인자의 외부 투여에 따른 동원 후 수집될 수 있다. 동원 후 수집된 줄기 또는 선조 세포의 수는 비섭동 상태에서 성분채집술 후 수득된 것보다 더 많다. 일부 양상에서, 세포 집단의 공급원은 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포가 풍부할 필요가 없기 때문에 세포가 외부로 적용된 인자에 의해 동원되지 않은 대상체이다.
세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포의 수득 방법은 또한 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 조혈 전구 세포는 다양한 사이토카인, 예를 들면, hSCF, hFLT3, 및/또는 IL-3을 사용하여 팽창될 수 있거나(Akkina et al., 1996), 또는 CD34+ 세포는 MACS 또는 FACS를 사용하여 농축시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 음성적 선택 기술은 또한 CD34+ 세포를 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 세포의 집단은 포유동물 세포, 예를 들면, 사람 세포, 비-사람 영장류 세포, 설치류 세포 (예를 들면, 마우스 또는 래트), 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포, 및 고양이 세포 또는 이의 혼합물일 수 있다. 비-사람 영장류 세포는 히말라야원숭이 세포를 포함한다. 세포는 동물, 예를 들면, 사람 환자로부터 수득할 수 있고, 또는 이들은 세포주로부터의 것일 수 있다. 세포가 동물로부터 수득되는 경우, 이들은, 예를 들면, 분리되지 않은 세포(즉, 혼합된 집단)으로서 사용될 수 있고; 이들은 배양에서 먼저, 예를 들면, 변형에 의해 확립될 수 있고; 또는 이들은 예비 정제 방법에 적용할 수 있다. 예를 들면, 세포 집단을 세포 표면 마커의 발현을 기초로 하여 양성 또는 음성 선택에 의해 조작하고; 하나 이상의 항원으로 시험관내 또는 생체내 자극하고; 하나 이상의 생물학적 변형제로 시험관내 또는 생체내 처리할 수 있고; 또는 이들 일부 또는 모두의 조합일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 세포 집단은 비-T 세포 및/또는 특정 T 세포 서브세트의 고갈을 위한 음성적 선택에 적용된다. 음성적 선택을 B 세포 마커, 예를 들면, CD19, 및 CD20; 단핵구 마커 CD14; NK 세포 마커 CD56를 포함하는 다양한 분자의 세포 표면 발현을 기초로 하여 수행할 수 있다. 대안으로, 세포 집단을 비-CD34+ 조혈 세포 및/또는 특정 조혈 세포 서브세트의 고갈을 위해 음성적 선택에 적용할 수 있다. 음성적 선택을 다양한 분자, 예를 들면, 항체의 칵테일(예를 들면, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a, 및 CD41(예를 들면, 거핵구 계통의 세포에 대해)의 세포 표면 발현을 기초로 하여 수행할 수 있고, 이는 다른 세포 유형의 분리를 위해, 예를 들면, MACS 또는 컬럼 분리를 통해 사용할 수 있다.
또한 대상체로부터 세포 샘플을 수득할 수 있고, 이어서, 목적하는 세포 유형에 대해 이를 농축시킬 수 있다. 예를 들면, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본원에 기술된 혈액으로부터 단리될 수 있다. 역류 원심분리(세정)를 PBMC로부터의 T 세포에 대해 농축시키기 위해 사용할 수 있다. 세포는 또한 다른 세포로부터 다양한 기술, 예를 들면, 목적하는 세포 유형의 세포 표면 상 에피토프로의 항체 결합으로 단리 및/또는 활성화를 사용하여 단리할 수 있고, 예를 들면, 일부 T-세포 단리 키트는 항체 공액된 비드를 사용하여 세포를 둘 다 활성화하고 이어서 일부 비드로 컬럼 분리되게 한다. 사용할 수 있는 또다른 방법은 세포 표면 마커에 항체를 사용하여 수용체 체결에 의한 세포 활성화 없이 특정 세포 유형에 대해 선택적으로 농축시키는 음성적 선택을 포함한다.
골수 세포는 엉덩뼈능선, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 다른 골수강으로부터 수득될 수 있다. 골수는 환자로부터 수집될 수 있고, 다양한 분리 및 세척 프로세스를 통해 단리될 수 있다. 골수 세포의 단리를 위해 공지된 프로세스는 다음 단계를 포함한다: a) 골수 현탁액의 3 분획으로 원심 분리 및 중간체 분획, 또는 연막 수집; b) 단계 (a)로부터의 연막 분획을 분리 유체에서 1회 이상 통상 Ficoll(상표명 Pharmacia Fine Chemicals AB)로 원심분리하고, 골수 세포를 포함하는 중간체 분획을 수집하고; c) 재주입가능한 골수 세포의 회수를 위해 단계 (b)로부터 수집된 분획을 세척한다.
T 세포 풍부 세포의 집단을 사용하는 것이 바람직한 경우, 이러한 세포의 집단은 백혈구성분채집술 및 기계적 성분채집술로 연속유동 세포 분리기를 사용하여 혼합된 세포의 집단으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 Ficoll-Hypaque™ 구배 분리, Percoll 구배 분리 또는 세정을 포함하는 임의의 공지된 방법으로 연막으로부터 단리할 수 있다.
소정 양상에서, T 세포는 T 세포 수용체에 결합되는 제제에 의해 활성화되어 T 세포 활성화를 위한 신호전달 캐스케이드를 촉발한다. 예를 들면, CD3 항체를 사용할 수 있다. 재프로그래밍을 위한 유의한 수 및 증식 상태의 T 세포 팽창을 위해, 사이토카인, 예를 들면, IL-2를 또한 사용할 수 있다. 특정한 양상에서, 둘 다의 항-CD3 및 항-CD28을 T 세포 활성화를 위해 사용할 수 있고, 여기서, 공-자극이 관련된다. 대안적인 양상에서, 항-CD3의 가교-결합이, 예를 들면, 플레이트 결합된 항-CD3에 적용될 수 있다. 가용성 항-CD3이 사용되어 T 세포를 PBMC에서 활성화시키면, 가용성 항-CD3 항체는 PBMC에서 APCs에 결합되고, 이어서, T 세포에 대해 항체를 제시한다. 가용성 항-CD3 항체 단독이 정제된 T-세포의 집단에서 사용되는 경우, 에너지가 상기 언급된 이유로 야기될 수 있다. 소정 실시형태는 T 세포를 항-CD3 (OKT3) 및 IL2의 존재하에 배양함을 포함하고, 이는 고가의 다루기 힘든 비드 또는 플레이트-결합된 항체를 사용할 필요가 없기 때문에 유리하고 용이하고; OKT3 및 IL2 첨가 후, PBMC의 세포 환경은 T 세포 활성화를 도울 것이다. 이어서, T 세포는 우선 팽창 때문에 PBMC 배양 중 다른 세포 유형을 수용한다.
소정 양상에서, 혈액 세포의 출발 집단은 예를 들면, 림프아구성 세포주(LCLs)로부터의 림프아구성 세포를 포함한다. LCLs의 생산은 예를 들면, Epstein-Barr 바이러스(EBV)를 사용한 B 세포의 감염으로 당해 기술 분야에 공지된다(Frisan et al., Epstein-Barr Virus Protocols, Part III, 125-127, 2001).
B. 재프로그래밍 인자
소정 실시형태에서, 체세포의 출발 집단은 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 iPS 세포에 재프로그래밍된다. iPS 세포의 생산은 유도를 위해 사용된 재프로그래밍 인자에서 중요하다. 하기 인자 또는 이의 조합은 본 발명에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 소정 양상에서, Sox 및 Oct(특히 Oct3/4)를 암호화하는 핵산은 재프로그래밍 벡터 내에 포함될 것이다. 예를 들면, 하나 이상의 재프로그래밍 벡터는 Sox2, Oct4, Nanog 및 임의로 Lin28을 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, Klf4 및 임의로 c-Myc를 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, 및 임의로 Esrrb를 암호화하는 발현 카세트, 또는 Sox2, Oct4, Nanog, Lin28, Klf4, c-Myc, 및 임의로 SV40 거대 T 항원을 암호화하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이들 재프로그래밍 인자를 암호화하는 핵산은 동일한 발현 카세트, 상이한 발현 카세트, 동일한 재프로그래밍 벡터, 또는 상이한 재프로그래밍 벡터에 포함될 수 있다.
Oct4 및 Sox 유전자 패밀리의 특정 구성원(Sox1, Sox2, Sox3, 및 Sox15)은 유도 프로세스에 관련된 중요한 전사 조절자로서 확인되었고, 이의 부재는 유도를 불가능하게 만든다. 그러나, Klf 패밀리의 특정 구성원(Klf1, Klf2, Klf4, 및 Klf5), Myc 패밀리 (c-Myc, L-Myc, 및 N-Myc), Nanog, 및 Lin28을 포함하는 추가 유전자는, 유도 효율을 증가시키기는 것으로 확인되었다.
Oct4 (Pou5f1)는 옥타머 패밀리("Oct") 전사 인자 중 하나이고, 전분화능의 유지에서 중요한 역할을 한다. Oct4+ 세포, 예를 들면, 난할구 및 배아 줄기 세포에서 Oct4의 부재는, 자발적 영양막 분화를 야기하고, 이에 따라 Oct4의 존재는 배아 줄기 세포의 전분화능 및 분화 잠재력을 증가시킨다. Oct4'의 근접한 동족, Oct1 및 Oct6을 포함하는 "Oct" 패밀리에서 다양한 다른 유전자는, 유도를 도출하는데 실패하고, 이에 따라 유도 프로세스에서 Oct-4의 배타성을 입증한다.
유전자의 Sox 패밀리는, 다능성 줄기 세포에서 배타적으로 발현되는 Oct4와 대조적으로 다분화능 및 단분화능 줄기 세포와 연관되지만, Oct4와 유사한 전분화능 유지와 연관된다. Sox2가 재프로그래밍 유도를 위해 사용되는 초기 유전자인 반면, Sox 패밀리에서 다른 유전자는 유도 프로세스에서도 작동하는 것으로 밝혀졌다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생산하고, 유전자 Sox3, Sox15, 및 Sox18은 또한 감소된 효율을 갖지만 iPS 세포를 생산한다.
배아 줄기 세포에서, Nanog는, Oct4 및 Sox2와 함께, 전분화능을 촉진하는데 필수적이다. 따라서, 토마스 등(Thomson et al.)이 인자 중 하나로서 Nanog로 iPS 세포를 생산할 수 있다고 보고했음에도 불구하고 야마나카 등(Yamanaka et al.)이 Nanog가 유도에 필수적이지 않다고 보고한 것을 놀라운 것이다.
Lin28은 분화 및 증식에 관련된 배아 줄기 세포 및 배아 암종 세포에서 발현된 mRNA 결합 단백질이다. 토마스 등(Thomson et al.)은 필수적이지 않지만 iPS 생산에서 인자인 것을 입증하였다.
유전자의 Klf 패밀리의 Klf4는 초기에 야마나카 등[참조: Yamanaka et al., 2007]에 의해 확인되었고, 야에니쉬 등[참조: Jaenisch et al., 1988]에 의해 마우스 iPS 세포의 생산을 위한 인자로서 확인되었고, 야마나카 등[참조: Yamanaka et al., 2007]에 의해 사람 iPS 세포의 생산을 위한 인자로서 확인되었다. 그러나, 톰프슨 등(Thompson et al.)은 Klf4가 사람 iPS 세포의 생산에 필수적이지 않고 사실상 사람 iPS 세포를 생산하는데 실패하였다고 보고하였다. Klf2 및 Klf4는 iPS 세포를 생산할 수 있는 인자인 것으로 발견되었고, 관련된 유전자 Klf1 및 Klf5는 또한 감소된 효율을 갖지만 그러하다는 것을 발견하였다.
유전자의 Myc 패밀리는 암에 연루된 원발암유전자이다. 야마나카 등[참조: Yamanaka et al., 2007] 및 야에니쉬 등[참조: Jaenisch et al., 1988]은 c-Myc가 마우스 iPS 세포의 생산에 연루된 인자임을 입증하였고, 야마나카 등[참조: Yamanaka et al., 2007]은 사람 iPS 세포의 생산에 연루된 인자임을 입증하였다. 그러나, 톰슨 등 및 야마나카 등은 c-Myc가 사람 iPS 세포의 생산에 필수적이지 않음을 보고하였다. SV40 거대 항원을 사용하여 c-Myc가 발현되는 경우 발생될 수 있는 세포독성을 감소 또는 예방할 수 있다.
본 발명에 사용된 재프로그래밍 단백질은 대략 동일한 재프로그래밍 기능을 갖는 단백질 동족체에 의해 치환될 수 있다. 이들 동족체를 암호화하는 핵산은 또한 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환이 바람직하다 - 즉, 예를 들면, 극성 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 극성 염기성 아미노산으로서 리신/아르기닌/히스티딘; 비-극성 또는 소수성 아미노산으로서 류신/이소류신/메티오닌/발린/알라닌/글리신/프롤린; 극성 또는 비하전 친수성 아미노산으로서 세린/트레오닌. 보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기초로 한 그룹화를 포함한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들면, 류신의 이소류신 또는 발린로의 대체, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 대체, 트레오닌의 세린으로의 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는 수득된 폴리펩타이드의 성질에 주요한 영향을 미치지 않을 것임을 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 폴리펩타이드를 야기하는지 여부는 폴리펩타이드의 특정 활성을 검정하여 용이하게 측정할 수 있다.
C. 체세포의 재프로그래밍
본 발명의 특정한 양상에서, 재프로그래밍 인자는 이상의 벡터, 예를 들면, 통합 벡터 또는 에피솜 벡터에 포함된 발현 카세트로부터 발현된다. 추가의 양상에서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질변환에 의해 체세포 내로 직접적으로 도입될 수 있다.
당해 분야 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 소양을 잘 갖추고 있을 것이다(예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Sambrook et al., 2001] 및 문헌[Ausubel et al., 1996]을 참조한다). 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공적 염색체(예를 들면, YAC), 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도됨), 렌티바이러스 벡터(예를 들면, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도됨), 복제 컴피턴트(competent), 복제 결함 및 이들의 거트리스(gutless) 형태를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하비(Harvey) 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유선 종양 바이러스 벡터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
1. 바이러스 벡터
본 개시의 소정 양상들에서 바이러스 벡터가 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성함에 있어서, 비-필수 유전자는 전형적으로 이종(또는 비-천연) 단백질에 관한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 핵산 및 가능한 단백질을 세포 내로 도입하기 위해 바이러스 서열을 이용하는 발현 작제물의 일종이다. 수용체 매개된 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고, 숙주 세포 게놈에 통합되어 바이러스 유전자를 안정하게 그리고 효율적으로 발현시키는 소정 바이러스의 능력은 이들 바이러스를 외래 핵산의 세포(예를 들면, 포유동물 세포)로의 전이를 위한 매력적인 후보자가 되게 하였다. 본 개시의 소정 양상들의 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비-제한적인 예는 하기에 기술된다.
레트로바이러스는 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시키고, 다량의 외래 유전자 물질을 전이시키고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특정 세포주에 패키징되는(packaged) 능력으로 인하여 유전자 전달 벡터로서의 가능성을 갖는다(Miller, 1992).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해서, 소정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 핵산을 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해서, gag, pol 및 env 유전자를 함유하는 패키징 세포주 - LTR 및 패키징 구성성분은 제외됨 - 가 작제된다(Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특별한 세포주에 (예를 들면, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 도입되는 경우, 상기 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자에 패키징되도록 한다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).
렌티바이러스는 복합적인 레트로바이러스이고, 이는 통상적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에도 조절성 또는 구조적 기능을 지닌 다른 유전자들을 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Naldini et al., 1996]; 문헌[Zufferey et al., 1997]; 문헌[Blomer et al., 1997]; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호를 참조한다).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전이 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용될 수 있다. 예를 들면, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스 - 여기서, 적합한 숙주 세포는 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat를 갖는 2개 이상의 벡터로 형질감염된다 - 는 미국 특허 제5,994,136호(본원에 인용에 의해 포함됨)에 기술되어 있다.
2. 에피솜 벡터
본 개시의 소정 양상들에서 플라스미드- 또는 리포솜-기반 염색체외(즉, 에피솜) 벡터의 용도도 제공될 수 있다. 이러한 에피솜 벡터로는 예를 들면, oriP-기반 벡터 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터가 포함될 수 있다. 이들 벡터는 DNA의 큰 단편이 세포에 도입되어 염색체외에 유지되고, 세포 주기당 1회 복제되고, 효율적으로 딸 세포로 분할되고, 실질적으로 면역 반응을 유발하지 않도록 할 수 있다.
특히, oriP-기반 발현 벡터의 복제에 요구되는 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은, MHC 클래스 I 분자 상의 이의 항원 제시에 요구되는 프로세스를 우회시키는 효율적인 메커니즘이 개발되었기 때문에 세포 면역 반응을 유발하지 않는다(Levitskaya et al., 1997). 또한, EBNA-1은 트랜스로(in trans) 작용하여 클로닝된 유전자의 발현을 향상시킬 수 있고, 이는 몇몇의 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100배까지 유도할 수 있다(Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 마지막으로, 이러한 oriP-기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체-외 벡터로는 다른 림프영양성 헤르페스 바이러스-기반 벡터가 포함된다. 림프영양성 헤르페스 바이러스는 림프아구(예를 들면, 사람 B 림프아구)에서 복제하고 자연 생명-주기의 일부를 위한 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus)는 "림프영양성" 헤르페스 바이러스가 아니다. 예시의 림프영양성 헤르페스 바이러스로는 EBV, 카포시(Kaposi) 육종 헤르페스 바이러스(KSHV); 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 및 마렉(Marek) 질환 바이러스(MDV)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40 또는 BPV와 같은 에피솜-기반 벡터의 다른 공급원도 고려된다.
당해 분야 숙련가는 표준 재조합 기술(예를 들면, 문헌[Maniatis et al., 1988] 및 문헌[Ausubel et al., 1994]을 참조하고, 상기 문헌 둘 다는 본원에 인용에 의해 포함된다)을 통해 벡터를 작제하기 위한 소양을 잘 갖추고 있을 것이다.
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 또는 그렇지 않으면 표적화된 세포에 이로운 특성을 제공하는 다른 구성성분 또는 작용성(functionality)을 포함할 수 있다. 이러한 다른 구성성분으로는 예를 들면, 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 구성성분(세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 구성성분을 포함함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수(uptake)에 영향을 미치는 구성성분; 흡수 후 세포 내의 폴리뉴클레오타이드의 국부화에 영향을 미치는 구성성분(예를 들면, 핵 국부화를 매개하는 제제(agent)); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 구성성분이 포함된다.
이러한 구성성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출하거나 선택하는데 사용될 수 있는 검출가능한 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 구성성분은 벡터의 자연적인 특징(예를 들면, 결합 및 흡수를 매개하는 구성성분 또는 작용성을 갖는 소정 바이러스 벡터의 사용)으로서 제공될 수 있거나, 또는 벡터는 이러한 작용성을 제공하도록 변형될 수 있다. 매우 다양한 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고 일반적으로 입수가능하다. 벡터가 숙주 세포 내에 유지될 때, 벡터는 자율 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 혼입되거나, 또는 숙주 세포의 핵 또는 세포질 내에 유지될 수 있다.
3. 트랜스포손 -기반 시스템
소정 양상들에서, 프로그래밍 인자의 전달은 트랜스포손-트랜스포사제 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 트랜스포손-트랜스포사제 시스템은 익히 공지되어 있는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 프로그 프린스(Frog Prince) 트랜스포손-트랜스포사제 시스템(후자의 설명을 위해서는 예를 들면, EP1507865를 참조한다) 또는 TTAA-특이적 트랜스포손 피기백(PiggyBac) 시스템일 수 있다.
트랜스포손은 전위(transposition)라고 칭하는 프로세스인 단일 세포의 게놈 내의 상이한 위치로 이동할 수 있는 DNA의 서열이다. 상기 프로세스에서, 이들은 돌연변이를 야기하여 게놈 내의 DNA의 양을 변화시킬 수 있다. 또한, 트랜스포손은 한 때 점핑 유전자(jumping gene)라고 칭하였고, 이동성 유전적 요소의 예이다.
다양한 이동성 유전적 요소가 존재하고, 이들은 이들의 전위 메커니즘에 기초하여 분류될 수 있다. 클래스 I 이동성 유전적 요소 또는 레트로트랜스포손은 우선 RNA로 전사된 후 역전사효소에 의해 DNA로 역전사되고, 이어서 게놈 내의 다른 위치에 삽입됨으로써 스스로 카피한다. 클래스 II 이동성 유전적 요소는 게놈 내에서 트랜스포사제를 이용하여 한 위치에서 다른 위치로 "컷 앤 페이스트(cut and paste)"한다.
특정 실시형태들에서, 본 개시에 제공된 작제물(예를 들면, 다중-계통 작제물)은 PiggyBac 발현 시스템을 사용한다. PiggyBac(PB) DNA 트랜스포손은 "컷 앤드 페이스트" 메커니즘을 통해 동원되고, 이에 의해 트랜스포손 자체에 의해 암호화되는 트랜스포사제 효소(PB 트랜스포사제)가 트랜스포손을 절제하여 게놈 내의 다른 부위에 재-통합시킨다. PB 트랜스포사제는 트랜스포손을 플랭킹하는 PB 역전된 말단 반복단위(ITR: inverted terminal repeat)를 특이적으로 인식하고; 이는 이들 서열에 결합하여 트랜스포손의 절제를 촉진시킨다. 이어서, PB는 그런 다음 PB는 상대적으로 무작위 방식으로 게놈을 통해 TTAA 부위에 통합된다. 유전자 트랩 돌연변이의 생성(또는 형질전환 동물을 생성하는데 적합함 생성용으로 개작됨)을 위해, 트랜스포손은 하나의 플라스미드 상에 트랜스로 공급되고, 트랜스포사제에 대한 결합 부위에 의해 플랭킹된 유전자 트랩을 포함하는 재조합 트랜스포손인 공여자 트랜스포손을 함유하는 플라스미드로 공동-형질감염된다. 트랜스포손은 플라스미드로부터의 트랜스포손 절제 및 게놈으로의 후속적 통합을 촉진시킬 것이다. 암호화 영역 내에서의 통합은 유전자 트랩 발현에 필요한 요소를 포착할 것이다. PB는 몇몇의 이상적인 성질을 갖는다: (1) 유전자 내에 우선적으로 삽입한다(삽입의 50 내지 67%가 유전자에 도달한다). (2) 국부 호핑(hopping)(광범위한 게놈 도달 범위(coverage))을 나타내지 않는다. (3) 과-생산 억제에 민감하지 않고, 여기서 트랜스포사제 효소의 상승된 수준은 감소된 전위 4를 야기한다. (4) 공여자 부위로부터 깨끗하게 절제되어 슬리핑 뷰티와 달리 "풋프린트(footprint)"를 남기지 않는다.
4. 조절 요소
본 개시에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 바람직하게는 (5'-대-3' 방향으로) 단백질-암호화 서열에 작동적으로 링크되는 진핵생물 전사적 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호 및 전사적 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다
a. 프로모터/인핸서
본원에서 제공되는 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 출발 부위를 위치선정하는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이것의 가장 잘 알려져 있는 예는 TATA 상자이지만, 예를 들면, 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같은 TATA 상자가 없는 몇몇의 프로모터에서는 출발 부위 위에 놓이는 별개의 요소 자체가 개시 장소를 고정정시키는 것을 보조한다. 부가적인 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 출발 부위 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 출발 부위 업스트림의 30 내지 110bp 영역에 위치한다. 프로모터"의 제어 하의" 암호화 서열을 가져 오기 위해, 선택된 프로모터의 "다운스트림"(즉, 3')의 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 간격은 주로 유연하므로 요소가 서로에 대해 역전되거나 이동되는 경우 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은 활성이 감소되기 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 밝혀진다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스(cis)-작용성 조절 서열을 나타내는 "인핸서(enhancer)"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 절편 및/또는 엑손(exon)의 업스트림에 위치된 5' 비-암호화 서열을 단리함으로써 얻어질 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 나타내어질 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 대안으로, 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합되지 않은 프로모터를 나타내는 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 암호화 핵산 절편을 위치시킴으로써 소정 이점이 얻어질 것이다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합하지 않는 인핸서를 말한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서 및 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연 발생"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 작제에 가장 흔히 사용되는 프로모터로는 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호를 참조한다). 또한, 미토콘드리아 및 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관 내에서의 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 또한 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포소기관, 세포 유형, 조직, 장기 또는 유기체에서의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당해 분야 숙련가들은 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 용도를 일반적으로 알고 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al. 1989]을 참조한다). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이 도입된 DNA 절편의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건 하에서 구성적이고/이거나, 조직-특이적이고/이거나, 유도가능하고/하거나, 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들면, 진핵생물 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따름)을 사용하여 발현을 유도할 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 다른 가능한 실시형태이다. 진핵생물 세포는 적절한 세균성 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가적인 유전적 발현 작제물의 일부로서 제공되는 경우, 소정의 세균성 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
프로모터의 비-제한적 예로는 초기 또는 후기 바이러스성 프로모터, 예를 들면, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵생물 세포 프로모터, 예를 들면, 베타 액틴 프로모터(Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 농축된 반응 요소 프로모터, 예를 들면, 환상 AMP 반응 요소 프로모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르 프로모터(TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터(tre)가 포함된다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(Genbank, 수탁 번호 제X05244호, 뉴클레오티드 283 내지 341에 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 입수가능함)를 사용할 수 있다.
조직-특이적 전이유전자 발현, 특히 조혈 세포 및 프로그래밍으로부터 유도된 조혈 세포의 전구체에서의 리포터 유전자 발현은 유도된 조혈 세포 및 전구체를 확인하는 방법으로서 바람직할 수 있다. 특이성 및 활성 둘 다를 증가시키기 위해, 시스-작용성 조절 요소의 사용이 고려되어 왔다. 예를 들면, 조혈 세포-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 다수의 이러한 조혈 세포-특이적 프로모터는 표 1에 제공된 조혈 유전자의 프로모터와 같이 당업계에 공지되어 있다.
소정 양상들에서, 본 발명의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열 및 심지어 상대적으로 긴 거리(표적 프로모터로부터 수 킬로베이스(kilobase) 이하)에 걸쳐서도 시스로 그리고 이들의 배향에 관계없이 작용하는 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 주어진 프로모터에 매우 근접하게 기능할 수도 있으므로 이러한 긴 거리에 반드시 제한되는 것은 아니다.
다수의 조혈 세포 프로모터 및 인핸서 서열이 동정되었고, 이는 본 발명에서 유용할 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제5,556,954호; U.S. 특허 출원 20020055144; U.S. 특허 출원 20090148425를 참조한다.
b. 개시 신호 및 연계된 발현
특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 본 발명의 방법에서 제공되는 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호로는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야 숙련가는 쉽게 이를 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 암호화 서열의 판독 프레임과 "프레임-내에" 존재해야 한다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시킴으로써 향상될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 사용은 다중 유전자 또는 폴리시스트론(polycistronic) 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존적 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서의 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 2개의 구성원(소아마비와 뇌 심근염)으로부터의 IRES 요소(Pelletier and Sonenberg, 1988) 및 포유동물 메시지로부터의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)가 기술되어 있다. IRES 요소는 이종성 개방 판독 프레임과 링크될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론성 메세지를 생성할 수 있다. IRES 요소 덕분에, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 다중 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호를 참조한다).
추가로, 소정 2A 서열 요소는 본 개시에서 제공되는 작제물에서 프로그래밍 유전자의 연계- 또는 공동-발현을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 절단 서열은 개방 판독 프레임을 링크하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동-발현시키는데 사용될 수 있다. 예시의 절단 서열은 F2A(구제역 바이러스 2A) 또는 "2A-유사" 서열(예를 들면, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다(Minskaia and Ryan, 2013). 소정 실시형태들에서, F2A-절단 펩타이드는 다중-계통 작제물에서 유전자의 발현을 연계시키는데 사용된다.
c. 복제의 기원
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이는 하나 이상의 복제 부위 기원(종종 "ori"라고 칭함), 예를 들면, 상기 기술된 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍시 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전자 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있고, 상기 핵산 서열은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 상기 기술된 다른 염색체외 복제성 바이러스 또는 자율 복제 서열(ARS)의 복제 기원이 사용될 수 있다.
d. 선택 및 스크리닝가능한 마커
소정 실시형태들에서, 본 개시의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 허용하는 세포에 확인가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로 선택 마커는 선택을 허용하는 성질을 부여하는 선택 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 마커이고, 한편 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 방해하는 마커이다. 양성 선택 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하고, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 구현에 기초한 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에도, 그 기초가 비색 분석인 GFP와 같은 스크리닝가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 이용될 수 있다. 당해 분야 숙련가 중 하나는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝가능한 마커의 추가의 예는 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
본 방법을 이용하여 조혈 전구 세포로 프로그래밍되는 만능 줄기 세포에 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 도입하는 것은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달을 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들면, 생체외 형질감염(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989)에 의한, 마이크로인젝션(microinjection)(본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Harland and Weintraub, 1985]; 미국 특허 제5,789,215호)을 포함하는 주사(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호)에 의한; 인산 칼슘 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); 전기천공(본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,384,253호; 문헌[Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984])에 의한; 칼슘 포스페이트 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)에 의한; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 이용함(Gopal, 1985)에 의한; 직접적 초음파 부하(Fechheimer et al., 1987)에 의한; 리포솜 매개된 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) 및 수용체-매개된 형질감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)에 의한; 미세발사체 충격(microprojectile bombardment)(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 PCT 출원 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호)에 의한; 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호)에 의한; 아그로박테리움 매개된 형질전환(각각 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호)에 의한; 건조화(desiccation)/억제 매개된 DNA 흡수(Potrykus et al., 1985)에 의한 그리고 이러한 방법들의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접적 전달이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 기술의 적용을 통해 예를 들면, 이들 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
III. 면역 세포의 제조
A. HPC의 제조
본 명세서의 실시형태는 체세포에서 유래한 PSC의 HPC로의 분화에 대한 것이다. 상기 체세포에서 유래한 PSC는 본원에 참조로 포함되는 미국특허 제8,372,642호에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 HPC로 분화될 수 있다. 예를 들어, BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및 GM-CSF의 조합을 사용하여 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 배양액을 분화를 위해 PSC를 제조하기 위한 제1 배지, BMP4, VEGF 및 FGF를 포함하는 제2 배지, 이후 Flt3 리간드, SCF, TPO, IL-3 및 IL-6을 포함하는 제3 배지에 연속적으로 노출시켜 만능 세포를 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로 분화시킬 수 있다. 상기 제2 한정 배지는 헤파린을 포함할 수도 있다. 또한, BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지 중에 FGF-2 (50 ng/㎖)를 포함시키면 만능 세포로부터 조혈 전구 세포를 생성하는 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 제1 한정 배지 중에 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제 (예를 들면, CHIR99021, BIO 및 SB-216763)를 포함시키는 것도 HPC의 생성을 향상시킬 수 있다.
만능 세포의 조혈 전구 세포로의 분화는 한정 또는 비한정 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 한정 조건은 생성되는 세포가 인간 대상체에 투여될 목적의 실시형태에서 일반적으로 바람직할 것이다. 조혈 줄기 세포는 (예를 들면, TeSR 배지를 사용하는) 한정 조건 하에 만능 줄기 세포로부터 유도될 수 있으며, 조혈 세포는 만능 세포로부터 유도된 배상체로부터 생성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 만능 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포 상에서 공동 배양된 후 분화될 수 있다.
만능 세포는 분화 프로세스의 일부로서 배상체 또는 응집체를 형성할 수 있다. 분화를 유도하기 위한 "배상체" (EB), 즉 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 수반하여 인간 만능 줄기 세포가 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래의 다수의 조직 유형으로 자발적이고 무작위적으로 분화하도록 한다. 따라서, 3차원 EB를 사용하여 일부의 조혈 세포 및 내피 세포를 생성할 수 있다.
EB는 하기의 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. MatrigelTM이 코팅된 플레이트 상에서 배양보조세포가 없는 생장에 맞게 적응된 미분화된 iPSC는 실온에서 약 8-10분 동안 0.5M의 EDTA 처리를 사용하는 융합도로 수확될 수 있다. EDTA는 항온배양 후 흡인시키고, EB는 ROCK 억제제 또는 블레비스타틴을 함유하는 SFD 배지 중에서 세포를 수거함으로써 형성될 수 있다. 상기 배지는 다음날 상이한 사이토카인 제제를 함유하는 EB1 분화 배지로 바뀔 수 있다. 세포를 0.25-0.5 백만 개의 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하여 응집 형성을 촉진시킨다.
응집 형성을 촉진하기 위해, 세포들을 RA 보충물이 없는 0.05% N2 및 B-27, 200 mM의 1-글루타민, 0.05 mg/㎖의 아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘염 (Asc 2-P) (WAKO) 및 4.5 × 10-4 MTG로 보충된, 75% IMDM (Gibco), 25% 햄의 변형(Ham’s Modified) F12 (Cellgro)으로 이루어진 무혈청 분화 (SFD) 배지 중에서 밤새 항온배양하기 위한 저부착 플레이트로 이동시킬 수 있다. 다음날, 세포들을 각 웰로부터 수거하여 원심분리할 수 있다. 이후, 세포들을 분화의 처음 4일 동안 약 50 ng/㎖의 뼈 형성 인자 (BMP-4), 약 50 ng/㎖의 혈관 내피 생장 인자 (VEGF) 및 50 ng/㎖의 zb FGF로 보충된 SFD 기본 배지로 이루어진 "EB 분화 배지" 중에 재현탁시켰다. 상기 세포들을 48시간 간격으로 반절식시킨다. 분화 5일째에, 배지를 50 ng/㎖ 줄기 세포 인자 (SCF), 약 50 ng/㎖의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/㎖의 인터류킨-6 (IL-6), 50 ng/㎖의 인터류킨-3 (IL-3), 50 ng/㎖의 트롬보포이에틴 (TPO)이 보충된 SFD 배지를 포함하는 제2 배지로 대체한다. 상기 세포들을 신선한 분화 배지를 사용하여 48시간 간격으로 반절식시킨다. 배지의 변경은 300 g로 5분간 분화 배양액의 회전 속도를 감속시키고, 상기 분화 배지의 부피를 절반을 흡인시킨 후, 이를 신선한 배지로 보충하는 단계에 의해 수행된다. 특정 실시형태에서, EB 분화 배지는 약 BMP4 (예를 들면, 약 50 ng/㎖), VEGF (예를 들면, 약 50 ng/㎖) 및 임의로 FGF-2 (예를 들면, 약 25-75 ng/㎖ 또는 약 50 ng/㎖)를 포함할 수 있다. 상청액을 흡인시키고 신선한 분화 배지로 대체할 수 있다. 다르게는, 세포들을 신선한 배지로 2일 간격으로 반절식시킬 수 있다. 세포들을 분화 프로세스 동안 서로 다른 시점에 수거할 수 있다.
조혈 전구 세포는 제한 배지를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다. 한정 배지를 사용하여 만능 세포를 조혈 CD34+ 줄기 세포로 분화시키는 방법은 예를 들면, 미국 출원 12/715,136호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그에 대한 포기 표명 진술 없이 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 이러한 방법들은 본 개시내용과 함께 사용될 수 있을 것이다.
예를 들어, 제한 배지는 조혈 CD34+ 분화를 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 한정 배지는 성장 인자인 BMP-4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 포함할 수 있다. 만능 세포는 BMP4, VEGF 및 임의로 FGF-2를 포함하는 제1 한정 배지 중에서 배양된 후, (Flt3 리간드, IL-3 및 GMCSF) 또는 (Flt3 리간드, IL-3, IL-6 및 TPO)를 포함하는 제2 배지 중에서 배양될 수 있다. 제1 및 제2 배지는 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2 및/또는 TPO 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 실질적으로 저산소인 조건 (예를 들면, 20% 미만의 O2)도 조혈 또는 내피 분화를 촉진할 수 있다.
세포들을 기계적 또는 효소적 수단을 통해 (예를 들면, 트립신 또는 TrypLETM을 사용하여) 실질적으로 서로 개별화시킬 수 있다. ROCK 억제제 (예를 들면, H1152 또는 Y-27632)도 배지 중에 포함될 수 있다. 이러한 접근법들은 예를 들면 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 실질적으로 저산소인 조건을 사용하여 만능 세포가 조혈 선조체로 분화시키는 것으로 촉진할 수 있다. 당업계의 숙련자가 주지하는 바와 같이, 대기 중 약 20.8% 미만의 산소 함유량이 저산소인 것으로 간주될 것이다. 배양액 중의 인간 세포는 주위 공기에 비해 감소된 산소 함유량을 갖는 대기 조건에서 성장할 수 있다. 이러한 상대적인 산소부족 상태는 배양 배지에 노출된 대기 중의 산소를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 배아 세포는 보통 감소된 산소 조건, 일반적으로 약 1% 내지 약 6%의 대기 중의 산소 및 주위 수준의 이산화탄소 하의 생체 내에서 발달한다. 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 저산소 조건은 특정 배아의 발달 조건의 양상을 모방할 수 있을 것으로 기대된다. 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이, 저산소 조건을 특정 실시형태에서 사용하여 만능 세포, 예를 들면 iPSC 또는 hESC가 보다 분화된 세포 유형, 예를 들면 조혈 전구 세포로 추가로 분화되는 것을 촉진할 수 있다.
하기의 저산소 조건을 사용하여 만능 세포가 조혈 선조체로 분화시키는 것을 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 대기 중의 산소 함유량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 저산소 대기는 약 5%의 산소 기체를 포함한다.
임의의 주어진 조혈 선조체 증식에 사용되는 구체적인 배지에 관계없이, 사용되는 배지는 바람직하게는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 500 ng mL, 보다 통상적으로는 10 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ 농도의 하나 이상의 사이토카인으로 보충된다. 적절한 사이토카인으로는, 이에 제한되지는 않지만, c-kit 리간드 (KL) (스틸 인자 (StI), 비만 세포 성장 인자 (MGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로도 지칭됨), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11 MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO 및 flk2/flk3 리간드 (Flt2L 또는 Flt3L)를 포함한다 (Nicola et al., 1979; Golde et al., 1980; Lusis, 1981; Abboud et al., 1981; Okabe, 1982; Fauser et al., 1981). 특히, 상기 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO 중 적어도 하나를 포함할 것이다. 보다 구체적으로는, 상기 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO를 포함할 것이다.
한 실시형태에서, 사이토카인을 배지 중에 포함시키고 배지 관류에 의해 보충한다. 다르게는, 생물 반응기를 사용하는 경우에는, 배지 관류를 하지 않고 사이토카인을 별도의 주입 포트를 통해 농축액으로서 별도로 첨가할 수 있다. 관류없이 사이토카인을 첨가하는 경우, 이들은 통상 상기 생물반응기 내의 부피의 1/10 내지 1/100과 같은 양의 10× 내지 100× 용액으로 첨가될 것이고, 신선한 사이토카인은 대략 2일 내지 4일 간격으로 첨가한다. 또한, 신선한 농축 사이토카인도 관류된 배지 중의 사이토카인 이외에 별도로 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, HPC는 붕괴된 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)를 나타내며, 골수 분화 또는 림프구 분화를 촉진하는 조건 하에 배양된다. 일부 양상에서, HPC는 본질적으로 메틸화된 DNA에 대한 결합이 없는 비기능성 MeCP2를 발현한다. 특정 양상에서, HPC는 MeCP2 DNA 결합 활성을 유효화하는데 충분한 수준으로 MeCP2를 발현하지는 않는다. 특정 양상에서, MeCP2는 해당 MeCP2 유전자에 있어서 절단 또는 돌연변이에 의해 비기능성이 된다. 일부 양상에서, 붕괴된 MeCP2를 나타내는 HPC를 수득하는 것은 상기 HPC를 siRNA, shRNA 또는 MeCP2의 소분자 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
B. 림프구 세포 분화
이후, 체세포에서 유래한 PSC로부터 분화된 HPC는 T 세포, NK 세포 및 T/NK 세포를 비롯한 림프계통의 세포로도 분화될 수 있다. 일부 양상에서, 분화를 하는 동안 HPC는 림프구 세포로의 분화를 위해 7-12일째, 예를 들면 8-11일째에 분리될 수 있다. 이 단계에서 HPC는 CD34 및 CD43의 발현에 의해 확인될 수 있다. 또한 림프 잠재성이 있는 HPC는 낮은 수준으로 CD144, DLL4, CD7 및 CD235를 발현할 수 있는데(이는 11일째에 감소함), 이는 이들 마커의 발현에 대한 특정 한계 수준을 DLL4의 존재 하에 세포를 림프구 분화에 대하여 프라이밍할 필요가 있다는 것을 의미한다.
일부 양상에서, 분화 프로세스의 7-11일째, 예를 들면 7일, 8일, 9일, 10일 또는 10일째에 분리된 HPC는 T 및 NK 세포와 같은 림프구 세포로 분화될 수 있다. 일부 양상에서, 림프구 선조체의 발생 시기는 HPC 분화 동안 혈관내피 선조체의 쇠퇴 및 적혈구 선조체의 출현과 일치한다. 특정 양상에서, 9일째의 HPC는 T 세포를 생산하는데 있어서 효율이 증가될 수 있다. 림프구 분화가 가능한 HPC는 특정 마커들의 발현에 의해 분리 및/또는 확인될 수 있다. 예를 들어, CD34 및/또는 CD43의 표면 발현이 있는 세포들은 림프구 분화를 위해 선택될 수 있다. 림프구 선조체를 검출하기 위한 추가의 마커들로는 DLL4, CD144, CD31, CD34, CD43lo, CD45lo /-, CD235, CD7, Flk-1, APNLR을 포함한다. 특정 양상에서, CD34/CD7, CD235/CD7, DLL4/CD34, DLL4/CD31, DLL4/CD144 또는 CD34/CD43lo 이중 양성 군집의 존재를 사용하여 림프구 선조체를 확인한다. HPC 상에서 CD144 발현은 CD31, CD34 및 DLL4과 함께 공동 염색한다. 이러한 이유로, CD144 및 CD7를 공동 발현하는 HPC는, 림프 잠재성이 막결합 노치 리간드 (DLL4)와 혈관내피 마커를 발현하는 전구체를 포획하여 시험관내에서 완성된 조혈 계통을 생성할 수 있는 림프구 선조체를 출현시키기 위한 표현형 유전자군을 생성함을 입증하는 것이다. 특정 양상에서, HPC는 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD6, CD335, Flk-1 및 DLL4를 비롯한 표면 마커들의 분류에 의해 향상된 림프 잠재성을 갖는 세포로 분류될 수도 있다. 일부 양상에서, HPC의 CD114/CD34, CD144/CD45, CD144/CD7 및 CD144/CD34/CD45/CD7의 양성 분획은 림프구 세포로 분화된다. 특정 양상에서, HPC의 CD144/CD7 양성 분획은 림프구 세포로 분화된다.
HPC는 림프구 분화를 위해 한정된 피더 불포함 조건 중에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 하나 이상의 매트릭스 성분, 예를 들면 예를 들면 레트로넥틴, 피브로넥틴 또는 RGD 펩타이드를 포함할 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 매트릭스 성분은 배아 줄기 세포의 성장을 위한 고체 지지체를 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포를 배지에 분주하기 전에, 매트릭스 성분을 배양 표면에 적용하여 배양 배지와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 세포를 기계적으로 분리하거나 세포를 개별화하여 조혈 전구 세포로의 분화를 유도하기 전에, 해당 세포를 피브로넥틴 또는 MatrigelTM로 코팅된 플레이트 상의 한정 배지 (예를 들면, TeSR 배지) 중에서 배양할 수 있다.
다양한 매트릭스 성분들을 사용하여 콜라겐 (예를 들면, 콜라겐 IV), 라미닌, 비트로넥틴, MatrigelTM, 젤라틴, 폴리라이신, 트롬보스폰딘 (예를 들면, TSP-1, -2, -3, -4 및/또는 -5) 및/또는 ProNectin-FTM를 비롯한 만능 세포를 배양할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 생존력에 대한 불리한 효과의 가능성으로 인해, TeSR을 사용하여 사전에 배양된 세포와 함께 MatrigelTM, 콜라겐 IV, 또는 라미닌만을 사용하는 것은 피할 수 있지만; 그럼에도, 이러한 조성물은 다른 매트릭스 성분들과 병용하여 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 매트릭스 성분들의 조합은 세포 성장과 세포 생존력을 증진시키는데 있어서 추가의 유익함을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 상기 매트릭스 성분들을 사용하여, 예를 들면 조혈 분화 이전에 세포를 배양할 수 있다.
림프구 분화를 위한 예시적인 피더 불포함 매트릭스는 실시예 4에 개시되어 있다. 특정 양상에서, 비-조직배양 처리된 플레이트는 HPC의 림프구 분화에 사용하기 위한 DLL4:Fc 키메라 단백질 및 레트로넥틴 (피브로넥틴 단편 CH-296; 일본의 다카라 슈조(Takara Shuzo))으로 코팅될 수 있다.
일부 실시형태에서, 아스코르브산을 사용하여 림프구 분화를 향상시킬 수 있다. 한정 배지는 약 10 μM 내지 약 1 mM의 아스코르브산, 예를 들면 약 50 μM 내지 약 100 μM, 예를 들면 약 95 μM의 아스코르브산으로 보충될 수 있다. 아스코르브산은 다양한 아스코르브산염, 예를 들면 아스코르브산 마그네슘 포스페이트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 니코틴아미드 (예를 들면, 니코틴산)를 사용하여 예를 들면 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 림프구 분화를 향상시킬 수 있다.
일부 양상에서, HPC는 대상체에서 노치 리간드의 생성을 증가시키는 물질을 투여하여 노치 리간드의 내생적 활성을 변화시킴으로써 림프구 세포, 예를 들면 T 세포로 분화된다. 본 방법은 또한 배지 중에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는데, 이 경우 상기 배지는 유효량의 노치 리간드와, IL-7, IL-15, SCF, Flt-3 및 IL-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 상기 배지는 IL-6도 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 노치 리간드는 델타4 노치 리간드 (DLL4), 예를 들면 DLL4:Fc 키메라이다.
노치 리간드는 T 세포 계통의 분화와 증식을 촉진하고 유지하는 것이 선택된다. 노치 리간드는 인간 기원일 수 있거나, 또는 설치류, 개, 고양이, 돼지, 양, 소, 염소 및 영장류와 같은 포유류종을 비롯한 다른 종들로부터 유래할 수도 있다. 노치 리간드의 구체적인 예로는 델타 패밀리를 들 수 있다. 델타 패밀리는 델타-1 (Genbank Accession No. AF003522, 호모 사피엔스), 델타-3 (Genbank Accession No. AF084576, 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus , 시궁쥐)), 델타-유사 1 (Genbank Accession No. NM_005618 및 NP_005609, 호모 사피엔스; Genbank Accession No. X80903, I48324, 무스 무스쿨루스(mus musculus , 생쥐)), 델타-유사 3 (Genbank Accession No. NM_053666, N_446118, 라투스 노르베기쿠스), 델타-4 (Genbank Accession No. AF273454, BAB18580, 무스 무스쿨루스; Genbank Accession No. AF279305, AAF81912, 호모 사피엔스) 및 델타-유사 4 (Genbank Accession. No. Q9NR61, AAF76427, AF253468, NM_019074, 호모 사피엔스; Genbank Accession No. NM_019454, 무스 무스쿨루스)를 포함한다. 노치 리간드는 시판되거나, 또는 재조합 DNA 기법에 의해 제조되어 다양한 정도로 정제될 수 있다.
본 방법은 또한 분화된 NK 세포를 생성하는데 충분한 시간 동안 상기 기술된 배양액 중에서 HPC 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분화된 NK 세포가 T 세포와 함께 배양액 중에서 출현하지만, 상기 NK 세포는 6주 후에 증식을 중지할 수 있다. 일반적으로, NK 세포수의 증가 및/또는 이들의 분화 상태에 대한 판단은 당업계의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 평가한다. 예를 들어, 상기 배양된 세포는 항-CD56 및 항-CD3 항체로 세포들을 염색하여 NK 세포의 발달에 대한 유세포 분석으로 모니터링할 수 있다. CD56+/CD3-인 세포들은 분화된 NK 세포들을 나타낸다.
C. 골수 분화
체세포에서 유래한 PSC로부터 생성된 HPC는 예를 들면, 골수 분화 배지를 사용하여 골수 세포로 분화될 수 있다. 골수 분화 배지는 무혈청 또는 한정 배지일 수 있으며, 상기 배지는 SCF, EPO, TPO, 인슐린, 덱사메타손 또는 히드로코르티손 및/또는 트랜스페린을 포함할 수 있다. 골수 세포는 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 단핵구, 호염기구, 호중구, 비만 세포, 및/또는 호산구일 수 있다. 특정 양상에서, 골수 세포는 수지상 세포이다. 예시적인 골수 분화 및 증식 배지는, 예를 들어, 표 4-6에 기재되어 있다.
한 예시적인 방법에서, HPC를 저부착 플레이트 내에서 SFEM (스템 셀 테크놀로지스(줄기 Cell Technologies)), 헤파린 (예를 들면, 1 내지 10 U/㎖, 예를 들면 5 U/㎖, 시그마(Sigma)), TPO (예를 들면, 50 내지 150 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖), 인간 재조합 SCF (예를 들면, 50 내지 150 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖), FLT3L (예를 들면, 50 내지 150 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖), IL-3 (예를 들면, 1 내지 20 ng/㎖, 예를 들면 10 ng/㎖) 및 IL-6 (예를 들면, 1 내지 20 ng/㎖, 예를 들면 10 ng/㎖)를 포함하는 배지로 이동시킨다. 약 5-15일 후, 예를 들면 8일 후에, 골수 세포를 GM-CSF (예를 들면, 25 내지 150 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖)를 포함하는 SFEM 배지 중에서 증식시킨다. 마지막으로, 세포를 SFEM (스템 셀 테크놀로지스), Excyte (예를 들면, 0.1% to 2%, 예를 들면 1%), GM-CSF (25 내지 150 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖), IL-4 (10 내지 30 ng/㎖, 예를 들면 20 ng/㎖) 및 TNFα (0.5 내지 5 ng/㎖, 예를 들면 2.5 ng/㎖)를 포함하는 배지 중에서 1-2주 추가로 더 배양하여 수지상 세포를 생성한다. 수지상 세포는 CD209+, CD1a+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+, CD83+ 및 CD86+.로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 발현이 특징일 수 있다. 이러한 마커들은 형질세포성 DC가 아닌 골수 DC를 우선적으로 염색시킨다 (CD123+). 라이트 염색법(Wright staining)을 수지상 세포의 전형적인 형태를 확인하기 위해 사이토스핀(cytospin) 샘플 상에서 수행할 수 있다.
D. 세포 배양
특정 실시형태에서, 실질적으로 저산소인 조건을 사용하여 HPC의 골수 또는 림프계통으로의 분화를 촉진할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%의 대기 중의 산소 함유량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 특정 실시형태에서, 저산소 대기는 약 5%의 산소 기체를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 한정 배양 배지는 HPC의 골수 또는 림프계통으로의 분화를 촉진하는데 유리하게 사용될 수 있으며; 특히, 혈청 및 마우스 배양보조세포층과 같은 동물성 생성물의 제거는, 동물성 생성물에 대한 세포의 노출과 관련된 위험을 감소시켜 인간 대상체에 보다 안전하게 투여될 수 있는 세포의 생성을 가능하게 한다. 전통적인 줄기 세포 배양 개발이 줄기 세포를 다양한 세포 유형으로 분화시키기 위한 혈청 생성물 및 마우스 배양보조세포층에 의존하였기 때문에, 이러한 전통적인 절차들은 분화가 수행될 수 있는 스케일을 한정시키고, 생물학적 변동성과 오염 가능성을 증가시키며, 유용할 수 있는 ES 세포의 사용을 심각하게 제한시켰다.
일반적으로, 본 개시내용의 세포는 세포 성장을 지속할 수 있는 영양이 풍부한 완충 용액인 배양 배지에서 배양된다. 본원에 기술된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로 분리, 확대 및 분화시키기에 적합한 배양 배지로는, 이에 제한되지는 않지만, 고 글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), DMEM/F-15, RPMI 1640, 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 및 Opti-MEM SFM(인비트로겐 인코포레이티드(Invitrogen Inc.))이 포함된다. 화학적으로 정의된 배지는 최소 필수 배지, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 인간 ExCyte 지질단백질, 트랜스페린, 인슐린, 비타민, 필수 및 비-필수 아미노산, 피루브산나트륨, 글루타민 및 미토겐이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(Gibco)를 포함하고, 미토겐도 적합하다. 본원에서, 미토겐은 세포의 분열을 자극하는 제제를 말한다. 제제는 세포가 세포 분열을 시작하여 유사분열이 유발되도록 독려하는 화학물질, 보통 단백질의 일부 형태일 수 있다. 한 실시형태에서, 미국 출원 일련번호 제08/464,599호 및 WO 96/39487호에 기술된 바와 같은 무혈청 배지 및 미국 특허 제5,486,359호에 기술된 바와 같은 "완전 배지"가 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS), 인간 자가 혈청, 인간 AB 혈청 또는 헤파린(2U/㎖)이 보충된 혈소판 풍부 혈장이 보충된다.
면역 세포는 세포의 골수 또는 림프계통으로의 분화를 촉진하기에 충분한 인자들의 세포내 수준을 증가시키는 조건 하에 배지 중에서 만능 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 배지는 또한 다양한 종류의 성장 인자와 같은, 하나 이상의 조혈 세포 분화 및 성숙 제제를 함유할 수 있다. 이들 제제는 세포가 보다 성숙한 표현형이 되도록 - 또는 성숙한 세포의 생존을 우선적으로 촉진시키도록 - 또는 이들 양자 모두의 효과 조합을 가지도록 세포를 유도하는 것을 보조할 수 있다. 분화 및 성숙 제제로는 조혈 세포 계통의 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 가용성 성장 인자(펩타이드 호르몬, 사이토카인, 리간드-수용체 복합체 및 기타 화합물)들이 포함될 수 있다. 이러한 제제의 비-제한적인 예로는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FLT-3 리간드(FLT3L), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-9(IL-9) 또는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 이들의 이소형 또는 변이체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
IV. 면역 세포의 용도
본 특정 양상의 방법 및 조성물에 의해 제공되는 면역 세포는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 이들의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 몇 가지 예를 들자면, 생체내 세포의 이식(transplantation) 또는 체내이식(implantation); 시험관내 세포독성 화합물, 발암원, 돌연변이 유발원 성장/조절 인자, 약학적 화합물 등의 스크리닝; 혈액학적 질환 및 손상의 메커니즘의 설명; 약물 및/또는 성장 인자가 작동하는 메커니즘의 연구; 환자에서의 암의 진단 및 모니터링; 유전자 요법; 및 생물학적 활성 산물의 제조가 포함된다.
A. 시험 화합물 스크리닝
본 개시내용의 면역 세포는 본원에서 제공되는 림프구 세포의 특징에 영향을 미치는 인자(예를 들면, 용매, 소분자 약물, 펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경적 조건(예를 들면, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 스크리닝 용도는 약물 연구에서 약학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 독자들은 일반적으로 표준 교과서[In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997] 및 미국 특허 제5,030,015호를 참조한다. 특정 양상에서, 골수 및 림프구 세포는 단기간 배양에서 조혈 세포 및 전구체에 대해 이전에 수행되었던 바와 같은 표준 약물 스크리닝 및 독성 검정을 위한 시험 세포의 역할을 한다. 후보 약제학적 화합물에 대한 활성의 평가는 일반적으로 특정 양상에서 제공된 조혈 세포 또는 전구체를 후보 화합물과 혼합하는 단계, (처리되지 않은 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 화합물에 기여할 수 있는 세포의 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의의 변화를 측정하는 단계, 및 이후 상기 관찰된 변화와 상기 화합물의 효과를 관련시키는 단계를 포함한다. 화합물이 조혈 세포 또는 전구체에 대한 약리학적 효과를 갖도록 설계되기 때문에, 또는 다른 곳에 효과를 갖도록 설계된 화합물이 조혈 세포 또는 전구체에 의도하지 않은 효과를 가질 수 있기 때문에, 스크리닝을 수행할 수 있다. 가능한 약물-약물 상호작용 효과를 검출하기 위해, 2개 이상의 약물을 조합하여(동시에 또는 순차적으로 세포와 조합하여) 시험할 수 있다.
B. 조혈 세포 치료요법
또한, 본 발명의 개시내용은 아마도 혈액학적 질환 또는 장애 또는 손상으로 인한 아마도 이러한 치료요법을 필요로 하는 대상체에 대한 기능의 정도를 회복시키기 위해 본원에서 제공되는 면역 세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 의해 유도된 면역 세포는 혈액학적 질환 및 장애, 예를 들면 혈색소병증, 빈혈 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포는 화학 치료요법과 같은 세포-억제성 치료요법에 의해 야기된 조혈 세포 결핍증의 치료에 유용할 수 있다.
치료학적 적용을 위해 본원에서 제공되는 세포의 적합성(suitability)을 결정하기 위해, 우선 세포를 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 한 양상에서, 세포는 생체내에서 이들의 표현형을 생존시키고 유지하는 능력에 대해 평가된다. 본원에서 제공된 세포는 면역결핍 동물(예를 들면, NOG 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선조사에 의해 면역결핍된 동물)에게 추가의 관찰이 가능한 부위에, 예를 들면 신장 캡슐 아래에, 비장 내에, 간 소엽 내에 또는 골수 내에 투여된다. 조직은 수일 내지 수주 이상의 기간 후에 수거하여, 적혈구와 같은 출발 세포 유형이 여전히 존재하는지 여부에 관해 평가한다. 이는 투여된 세포에 검출가능한 표지(예를 들면, 녹색 형광성 단백질 또는 β-갈락토시다제)를 제공함으로써; 또는 투여된 인간 세포에 대해 특이적인 구성적 마커를 측정함으로써 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 세포가 설치류 모델에서 시험되고 있는 경우, 투여된 세포의 존재 및 표현형은 인간-특이적 항체를 사용하는 면역조직화학 또는 ELISA에 의해, 또는 인간 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 특이적인 증폭을 유도하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 이용하는 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하는데 적합한 마커는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
본 개시의 방법에 의해 제공되는 면역 세포는 혈액학적 장애 및 손상을 치료하는 이들의 능력에 대해 다양한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들면, 겸상 적혈구 빈혈증 마우스 모델 또는 T/B 세포-결핍 Rag-2 녹아웃 마우스는 본원에 개시된 골수 및 림프 세포를 시험하는데 특히 유용한 동물 모델일 수 있다.
동물 모델에서의 바람직한 기능적 특성 또는 효능을 입증하는 본 개시내용의 특정 양상들에서 제공되는 면역 세포는 또한 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 직접 투여하기에 적합할 수 있다. 조혈 목적을 위해, 세포는 순환계에 적절히 접근할 수 있는 임의의 부위에 투여될 수 있다. 조혈 세포 또는 이의 전구체는 손상 또는 질환이 있는 부위에도 전달될 수 있다.
본 개시내용의 특정 양상에서 제공되는 세포는 이를 필요로 하는 임의의 대상체의 치료요법에 사용될 수 있다. 이러한 치료요법에 적절할 수 있는 인간 질환으로는 다양한 빈혈 및 혈색소병증뿐만 아니라 감소된 조혈 세포수를 특징으로 하는 질환(예를 들면, 골수형성이상 증후군, 골수섬유증, 호중구 감소증, 무과립구증, 글란츠만(Glanzmann) 혈소판 감소증, 혈소판 기능 저하증 및 후천성 면역 결핍 증후군)도 포함된다. 인간 치료요법의 경우, 투여량은 일반적으로 약 109 내지 1012개의 세포이고, 보통 약 5×109 내지 5×1010개의 세포이고, 이는 대상체의 체중, 고통의 성질과 중증도 및 투여된 세포의 복제 능력에 대해 조정할 수 있다. 치료 방식 및 적절한 투여량을 결정하기 위한 궁극적인 책임은 관리 임상의에게 있다.
C. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 배포(distribution)
제조, 배포 및 사용할 목적으로, 본 개시의 면역 세포는 전형적으로 수송 또는 보관을 용이하게 하기 위해 임의로 동결된, 등장성 부형제 또는 배양 배지 중의 세포 배양물 또는 현탁액의 형태로 제공된다.
또한, 제조, 배포 또는 사용 동안 임의의 시점에 존재하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 서로 다른 시약 시스템이 제공된다. 상기 세포 세트는 본 개시내용에 기술된 2개 이상의 세포 집단의 임의의 조합을 포함하고, 프로그래밍-유도된 세포(조혈 계통 세포, 이들의 전구체 및 아형)가 미분화된 줄기 세포, 체세포-유도된 조혈 세포 또는 다른 분화된 세포 유형과 조합하여 예시된다. 상기 세트의 세포 집단은 때때로 동일한 게놈 또는 이의 유전자 변형된 형태를 공유한다. 세트 내의 각각의 세포 유형은 동일한 시설에 또는 비즈니스 관계를 공유하는 동일한 실체 또는 상이한 실체의 통제 하에 동일하거나 다른 시간에, 상이한 위치에, 함께 또는 별도의 컨테이너에 패키징될 수 있다.
V. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태들을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에서 양호하게 기능하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 본 발명의 실행에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각될 수 있음이 당해 분야 숙련가에 의해 이해되어야만 한다. 하지만, 당해 분야 숙련가는 본 개시에 비추어 개시되는 특정 실시형태들에 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 이는 또한 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 유사하거나 동일한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야만 한다.
실시예 1 - T 세포 유래된 PSC ( TiPSC )의 생산
iPS 세포의 생산을 위해, T 세포를 혈액 샘플로부터 단리시키고 레트로바이러스의 iPSC로의 재프로그래밍 전에 활성화시켰다. 첫 번째로, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 새롭게 제조된 AIM-V 배지 + pen/strep/글루타민 (AIV-V/ps/s/g 배지) (Invitrogen) + 300 IU/ml rhIL2 (Peprotech) 및 10 ng/ml의 가용성 항-CD3 항체 (OKT3 클론, eBiosciences) 및 항-CD28 항체에서 증식시켰다. 활성화 몇일 후에 대수 증식을 CEDEX 세포 계수에 의해 확인하였다. 배양 3일 후 세포는 T-세포 표현형에 대해 검정하고 이어서 재프로그래밍 인자들로 형질도입하였다.
레트로바이러스 벡터 Nanog RFP, Lin28 RFP, Oct4 eGFP, 및 Sox2 eGFP은 이전에 기재된 바와 같이 작제하였다(미국 출원 번호 제61/088,054호, 본원에 참조로서 인용됨). 레트로바이러스 벡터 c-Myc RFP, Klf4 RFP, Oct4 eGFP, 및 Sox2 eGFP을 유사하게 작제하였다.
CD3- 및 CD28-활성화된 말초 단핵구 세포는 2% 사람 AB 혈청 및 10 ng/mL IL-2을 함유하는 AIM-V 배지를 포함하는 T 세포 배지에서 배양하였다. 6일째에, T 세포는 Amaxa U-014 프로그램을 사용한 전기영동을 통해 6개 재프로그래밍 인자들로 형질감염시켰다(1-5 x 106 세포/형질감염, Amaxa T 세포 형질감염 용액). 형질감염 후 25일까지, 세포를 웰 당 하나가 형질감염된 6-웰 플레이트의 레트로넥틴 (0.3 μg/cm2)- 및 비트로넥틴 (0.2 μg/cm2)-코팅된 웰 상에서 배양하고 14일째에 개시하여 T 세포 배지로부터 E8 PSC 배지로 점진적으로 이동시켰다.
활성화되고 증식하는 T 세포는 특징적인 세포 형태 및 클로스터링 거동을 나타냈다. 레트로바이러스 형질도입 효율의 검출은 형질도입 개시 72시간 후 GFP 및 RFP 발현에 의해 결정하였고, 약 3주간에 걸쳐 전이유전자를 침묵화시키고 hES 세포 표현형을 디스플레이한다. 매우 규정된 iPS 세포 콜로니는 23일째에 나타나기 시작했다. GFP 및 RFP 침묵화는 형광 현미경에 의해 확인하였고 콜로니는 피펫 팁을 사용하여 절개용 후드에서 취득하였다. 콜로니 조각을 이어서 새로운 6웰 플레이트에 이전시켰다. 콜로니의 수를 계수하여 투입 분주된 세포의 수로서 주어지는 재프로그랭 효율을 평가하였다. 상기 시점으로부터 클로날 콜로니를 매일 공급하고 수동으로 1회 초과로 계대함에 이어서 증식시켜 TiPSC 세포주를 생성하였다.
실시예 2 - 조혈 전구 세포 (HPC)로의 TiPSC 분화
실시예 1의 TiPSC를 포함하는, 다양한 에피좀 및 바이러스 재프로그래밍된 iPSC (표 1)를 HPC의 생성을 위해 3D 분화 프로토콜에 적용하였다(도 1). 첫 번째로, iPSC는 피더 불포함 조건하에 필수 8 (E8) 배지에서 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 초-저 접착 (ultra-low attachment) (ULA) 플레이트상에서 5 내지 10회 계대 동안 저산소 조건에 순응시켰다. 응집체를 5 uM 블레비스타틴이 보충된 무혈청 제한 (SFD) 배지의 존재하여 ml 당 25만 내지 50만 세포의 밀도로 서브 컨플루언트 iPSC로부터 제조하였다. 상기 프로세스는 75% IMDM (Invitrogen 12200-069) (글루타민 및 25 mM HEPES+P/S를 갖는), 25% Hams F12 (Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충물 (Invitrogen 17502-048), 레티산이 부재인 1% B27 보충물(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50 ug/ml 아스코르브산, 및 4.5 ×10-4 M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기본 배지에서 초-저 접착 (ULA) 플레이트 또는 스피너 플라스크에서 수행하였다.
일단 EB가 형성되면, SFD 기본 배지에 50 ng/ml의 BMP-4, VEGF, 및 FGF2를 처음 4일 동안 보충함에 의해 분화를 개시하였다. EB를 분화시키는 제5일 째에, 배양물을 각각 50ng/ml인 Flt-3 리간드, IL3, IL6, SCF, 및 TPO, 및 5000 유닛에서의 헤파린의 존재하에 위치시켰다. EB 배양물에 저산소 조건하에 12 내지 16일의 분화때까지 분화 프로세스 동안에 2일 마다 사이토킨을 함유하는 새로운 분화 배지의 절반 용적을 보충하였다. 세포는 분화 프로세스 후 수거하고 표현형은 유동 세포측정으로 평가하고 기능적 능력은 CFU 검정을 사용하여 평가하였다. 세포를 수거하고 CD43/CD34 세포의 %는 유동 세포측정에 의해 정량하였다(도 1b). 프로세스 효율은 iPS 세포의 투입 수 당 생성된 HPC의 절대 수를 나눔에 의해 계산하였다(도 1c).
Figure pct00001
유동 세포측정 분석을 위해, 세포를 수거하고 배지로 1회 세척하였다. 세포 펠렛은 37℃ 인큐베이터에서 5 내지 10분동안 TrypLETM 또는 0.5% 트립신을 사용하여 분해시킴에 이어서 배지로 세척하고 70-μm 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포는 PBS-FBS 함유 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 계수하여 세포 생존능을 평가하고 형광색소-접합된 모노클로날 항체로서 항-사람 CD43 (1G10), 항-사람 CD31 (WM-59), 항-사람 CD41 (HIP8); 항-사람 CD45 (HI30); 항-사람 CD34 (581, 8G12) (BD Biosciences San Jose, CA); 및 항-사람 CD235을 사용하여 염색시켰다. 비-생존성 세포는 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD, BD Biosciences)로 배제하였다. 라이브 세포 분석은 FACSCaliburTM 또는 Accuri 유동 세포측정기 및 세포 탐색 소프트웨어 상에서 수행하였다.
클론원성 조혈 선조 검정(CFU 검정)을 위해, EB는 TryplE 또는 0.5% 트립신/EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분산시켰다. 생존 세포를 정량하고 분주하고(mL 당 50,000-300,000개 세포), 줄기 세포 인자 (SCF) 50 ng/mL, 에리트로포이에틴 (EPO) 3 U/mL, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 10 ng/mL, 인터류킨-3 (IL-3) 10 ng/mL을 함유하는 사람 메틸셀룰로스 완전 배지(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 조혈 CFC에 대해 습화된 챔버에서 검정하였다. 14일 후, 콜로니는 이들의 형태에 따라 스코어링하고 분주된 105 세포 당 콜로니를 정량하였다.
실시예 3 - 조혈 전구 세포 (HPC)로의 변형된 iPSC 분화
1C T-세포 유래된 iPSC (TiPSC, 레트로바이러스 재프로그래밍에 의해 유래된)는 응집체 현탁 (3D) 배양을 통해 CD34+ 조혈 선조체로 분화하였다. 1C 세포는 피더 불포함하에 필수 8 (E8) 배지에서 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에 유지시켰다. 응집체는 50 ng/ml FGF2, 50 ng/ml VEGF, 2 μM CHIR99021 (GSK-3 억제제), 및 10 μM 블레비스타틴 (미오신-II 억제제)가 보충된 필수 3 (E3) 배지 (E8 배지의 8개 성분 중 단지 3개를 함유하는: DMEM/F12 기본 배지, 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 및 나트륨 셀레나이트)에서 ml 당 50만 내지 100만 세포의 밀도로 서브-컨플루언트 1C 세포 (<80% 컨플루언스)로부터 제조하였다. 응집체 형성은 락커 플래폼 상에 15rpm에서 연속 교반 하에 초-저 접착 (ULA) 플라스크에서 24시간 동안에 수행하였다(모든 후속적 배양 단계를 포함함).
형성된 세포 응집체 (즉, 배상체 - EB)는 추가로 조혈 중배엽 유도 사이토킨 - 25 ng/ml BMP4, 50 mg/ml VEGF 및 50 ng/ml FGF2이 보충된 무혈청 분화 배지(50% IMDM, 50% Hams F12 배지, 100 μg/ml의 폴리비닐 알콜, 100 μg/ml 재조합 사람 혈청 알부민, 1x 비-필수 아미노산 보충물 (Invitrogen), 0.1x 화학적으로-규정된 지질 보충물 (Invitrogen), 125 μM 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘, 0.25 μM 리놀렌산, 미량 원소 보충물 A (0.3x), B (0.2x) 및 C (0.1x) (Corning), 5 mM 염화나트륨, 100 μM 모노티오글리세롤, 20 μM 에탄올아민, 100 ng/ml 헤파린, 및 10 ng/ml IGF1)로 이전시켰다. 배양은 제2 일째에 완전한 배지 변화와 함께 4일 동안 계속하였다.
조혈 CD34+ 선조체의 분화 및 증식을 지지하기 위해, 세포 응집체는 추가로조혈 지지 사이토킨 - 50 ng/ml SCF, 20 mg/ml TPO, 10 ng/ml FLT3L, 20 ng/ml IL-3, 및 25 ng/ml BMP4가 보충된 무혈청 분화 배지에 이전시켰다(상기와 같이). 배양은 제2 일째에 완전한 배지 변화와 함께 4일 동안 계속하였다.
배양물은 분화 프로세스 7 내지 9일 동안 수거하였다. 단일 세포 현탁액은 37℃에서 15 내지 20분동안 아쿠타제 (또는 Accumax) 용액 중에서 분화된 세포 응집체의 분해를 통해 수득하였다. 세포는 MACS 완충액 (예를 들어, 5 mg/ml BSA 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS)에서 세척하고, 70 μM 세포 스트레이너를 통해 여과하고 4℃에서 30분동안 직접적인 CD34 상자성 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)로 표지하였다. CD34+ 세포는 MS 또는 LS 자성 칼럼, 적절한 자석 및 제조업체 (Miltenyi Biotec)으로부터의 추천에 따른 표준 분리 과정을 사용하여 단리시켰다. 단리된 CD34+ 세포는 T/NK 분화 배양물에 분주하거나 단리 후 1시간 이내에 후속 사용을 위해 냉동보존하였다.
실시예 4 - HPC의 림프구 분화
실시예 2 및 실시예 3의 림프구 분화를 위한 파라미터를 결정하기 위해, 세포주는 T 및 NK 세포 분화를 위한 배양 조건에 적용하였다. 첫번째로, 간질 의존성 프로토콜에서 시험된 T 세포 분화에 대해 여러 변수를 시험하였다. 12일째에, 상이한 세포주 기원의 HPC에 대해 OP9 골수 간질 세포 및 MS5 뮤린 골수 간질 세포를 포함하는 간질 세포주에 대한 T 세포 잠재성을 시험하였다. 세포는 20% FBS, 10 ng/mL SCF, 5 ng/mL Flt-3 및 5 ng/mL IL-7을 갖는 αMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 주당 3회 절반-배지 변화에 의해 새롭게하였다. T 세포의 존재에 대한 세포의 분석은 세포가 골수 세포를 생성시키는 경향을 갖고 CD3+ 세포의 존재가 검출될 수 없음을 보여주었다. 추가로, 간질 공동 배양은 저산소 조건하에서는 불량하게 수행되었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
따라서, 피더 불포함 T 세포 분화 프로토콜을 개발하였다. HPC는 약 5,000 내지 약 25,000 세포/cm2의 세포 밀도로 0.5 μg/cm2으로 레트로넥틴 및 Notch DLL4로 코팅된 비-처리된 조직 배양 플레이트 상에 분주하였다. HPC는 1% Glutamax, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95 μM 아스코르브산 (WAKO labs), 및 50 ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3, 및 TPO (Peprotech)이 보충된 StemSpan 무혈청 증식 배지 II(SFEM; StemCell Technologies) 배지에서 배양하였다. 상기 배지는 48 시간 마다 새롭게 갈아주었고 2주째에 상기 세포는 새로운 리간드 코팅된 플레이트에 분할하였다. 추가로, 2 내지 3주 사이에 세포는 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레-T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 세포는 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대하여 분석하였다. 6 내지 8주째에, 세포는 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 사용하는 T 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
T 세포 분화에 대한 이의 효과에 대해 시험된 파라미터 중 하나는 배양 플레이트 상에 매트릭스 코팅의 선택이다. 분주 후 3주째에 제대혈과 함께 Notch DLL4와의 다양한 매트릭스 조합을 사용하여 무혈청 조건하에 프레-T 세포의 출현을 분석함에 의해 비교하였다. 상기 결과는 DLL4과 레트로넥틴의 조합이 비트로넥틴 또는 테나신과의 조합 보다 제대혈 세포의 프레-T 세포로의 분화에 보다 효과적이었음을 보여주었다(표 2).
놀랍게도, 저산소 조건이 피더 불포함 T 세포 분화를 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 저산소증이 정상 산소 조건하에서 분화된 세포와 비교하여 CD8에 대해 양성인 세포의 %를 증가시키고 CD4에 대해 양성인 세포의 %를 감소시키는 것으로 관찰되었다(표 3).
혈액 세포-유래된 iPSC의 림프구 계통으로의 분화 효율은 실시예 2에 기재된 HPC 분화의 5일, 7일, 9일 및 11일에 다양한 세포주를 수거함에 의해 분석하였다. HPC 세포는 해동시키고 레트로넥빈 및 DLL4 코팅된 플레이트상에 분주하였다. 세포에 2일 마다 새로운 배지를 공급하고 HPC 세포가 해동된 후 2주째에 프레-T 세포 마커, 4주째에 T 세포 마커 및 6주째에 T 및 NK 세포 마커에 대해 분석하였다. 세포는 T, NK 및 NK/T 세포의 존재에 대한 CD7, CD8, CD56 (도 3a), CD45, CD7, CD5 (도 3b), 및 CD56, CD8, CD3 (도 3c)의 표면 발현에 대해 염색하였다. TiPSC 및 에피좀적으로 재프로그램화된 3908 세포는 7일 내지 11일째에 증가된 림프구 잠재성을 갖는 것으로 관찰되었다(도 3a).
표면 마커가 림프구 분화의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있는지를 결정하기 위해, CD43/CD34, CD34, DLL4, CD31/CD144, 및 CD235의 분석은 TiPSCs1E 세포주 및 에피좀 3902 세포주 둘다에 대해 수행하였다(도 4). DLL4의 발현 및 CD235의 수준이 분화 11일째에 감소하고 분화 일자와 함께 CD34 발현이 감소하고 CD43 발현이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 분화 11일째에 림프구 세포가 부재이기 때문에, 이것은 이들 마커의 특정 발현 역치 수준이 DLL4의 존재하에 림프구 분화쪽으로 세포를 프라이밍하는데 필수적임을 의미한다.
HPC 분화 동안에 림프구 선조체의 추가의 분석은 표면 마커 CD31, CD34, CD144, CD43, CD45, CD6, CD335, Flk-1, 및 DLL4의 자성 분류에 의해 수행하였다. 8일째 HPC는 CD114/CD34, CD144/CD45, CD144/CD7, 및 CD144/CD34/CD45/CD7 양성 및 음성 분획 및 비분류된 대조군으로 분류하였다(도 5). 이들 분획은 이어서 림프구 분화 프로세스에 적용하고 16일째에 CD3+ 세포의 존재에 대해 분석하였다(도 6a). 양성 분획의 각각은 음성 분획 및 비분류된 대조군과 비교하여 상당히 증가된 림프구 잠재성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이것은 양성 분획 자성 분류로부터의 T 세포 생성의 폴드 농축 증가에 의해 추가로 지지되었다(도 6b). 양성 분획은 추가로 2주 동안 새로운 Ret-DLL4 표면 상에 다시 분주하였다.
림프구 분화 4주째에, 8일 CD144+/CD7+ 및 CD144+/CD45+ HPC는 도 7a에서 CD3 양성 세포의 %에 의해 나타낸 바와 같이 시험관내 T 세포의 생성을 유지하였다. CD3 세포는 CD335 양성, CD161 양성, 및 불변 T 세포 수용체 (6B11) 음성이었다. 따라서, 후기 상태의 배양물은 드러나는 NK/T 세포 표현형을 갖는다. 추가로, CD144+/CD7+ HPC는 16일째 T 세포의 산출에 대한 HPC의 투입의 비율에 의해 측정된 바와 같이 T 세포를 생성하는데 증가된 효율을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 4주 말기에 프로세스의 누적 효율은 CD144/CD34/Cd45/CD7 양성 분획에서 최고인 것으로 나타났다.
실시예 5 - HPC의 골수 분화
실시예 2 및 3의 CD34+ HPC는 사람 수지상 세포(DC)의 상대적 순수 집단의 생성을 위한 골수 분화에 적용하였다. 세포는 전체 프로세스를 위해 저 접착 조직 배양 플레이트 또는 플라스크 상에서 배양하였다. 세포는 0.5-1 x 106 세포/mL의 밀도로 50 ng/mL Flt-3 리간드 (Flt-3L), 50 ng/mL 줄기 세포 인자(SCF), 50 ng/mL 트롬보포에이틴(TPO), 50 ng/mL 인터류킨-3 (IL-3), 및 50 ng/mL 인터류킨-6 (IL-6)을 함유하는 무혈청 배지에서 재현탁시켰다.
골수 분화를 개시하기 위해, 세포는 골수 선조체 배지에서 mL 당 25만 내지 50만 세포의 밀도로 씨딩하고(표 4) 약 2주 동안 증식시켰다. 세포는 4일 및 8일째 생존능 및 CD34+/CD45+/CD43+의 발현에 대해 모니터링하였다. CD34+ 집단은 감소하는 것으로 관찰되었고 배양물 내 CD45+/CD43+/CD31+ 집단이 출현하였다. 상기 단계에서 배양물의 표현형은 주로 CD43+/CD45+/CD31+/CD34Lo이었다.
Figure pct00004
세포가 CD43+/CD45+/CD31+/CD34- 세포 표면 마커의 50% 초과 발현을 나타내는 경우, 세포를 이어서 8일 동안 골수 증식 배지 (표 5)에 위치시켰다. 세포에 격일로 새로운 배지를 공급하였다. 8일 말기에, 배양된 세포는 0-90% CD43+/CD45+/CD31+/CD34-를 나타내는 농축된 골수 세포 집단을 가졌다. 상기 골수 증식 단계 말기에, 세포 수, 생존능 및 순도를 측정하였다.
Figure pct00005
최종적으로, 16일 배양 말기에, 배양물을 수지상 세포 농축 배지에 위치시켰다 (표 6). 세포 밀도는 mL 당 50만 내지 100만 세포로 유지하고 세포에 스핀 단계 없이 4일 마다 새로운 배지를 공급하였다. 분화 단계에서 거의 어떠한 증식이 관찰되지 않았다. 대신, 세포는 낮은 접착 플레이트에 들러붙고 크기가 증가하는 것으로 관찰되었다. 1주 말기에, 샘플을 수거하고 유동 세포측정을 사용하여 CD209+, CD1a+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+, CD83+, 및 CD86+의 존재에 대해 시험하였다(도 9-10). 이들 마커는 주로 골수 DC를 염색시키지만 혈장 세포 DC (CD123+)를 염색시키지 않았다. 세포는 수지상 세포 농축 배지에 유지시키고 수율 및 순도를 정량하기 위해 다양한 시점에서 분석하였다. 라이트 염색은 수지상 세포의 전형적 형태를 확증하기 위해 사이토스핀 샘플에 대해 수행하였다.
Figure pct00006
실시예 6 - PSC 분화 및 T 세포 확장 방법
CD34 + 림프 조혈 선조체로의 PSC 분화: 1C T-세포 유도된 iPSC(TiPSC, 레트로바이러스 재프로그래밍에 의해 유도됨)는 응집체 현탁액(3D) 배양을 통해 CD34+ 조혈 선조체로 분화되었다. 1C 세포를 필수 8(E8) 배지의 Matrigel™- 또는 비트로넥틴-코팅된 6-웰 플레이트 상에서 피더-불포함 조건 하에 유지하였다. 응집체는 50ng/ml FGF2, 50ng/ml VEGF, 2μM CHIR99021(GSK-3 억제제) 및 10μM의 블레비스타틴(미오신-II 억제제)이 보충된 필수 3(E3) 배지(E8 배지의 8개의 구성성분들 중 3개만을 함유: DMEM/F12 기초 배지, 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘 및 나트륨 셀레나이트)에서 서브-컨플루언트(sub-confluent) 1C 세포(<80% 컨플루언스)로부터 ml당 0.5 내지 1백만 세포의 밀도로 제조되었다. 15rpm으로의 록커 플랫폼(rocker platform) 상에서의 연속적 교반 하의 초-저 부착(ULA: ultra-low attachment) 플라스크에서 24시간 배양 동안 응집체 형성을 수행하였다(모든 후속 배양 단계 포함).
형성된 세포 응집체(배상체 - EB)를 조혈 중배엽 유도성 사이토카인 - 25ng/ml BMP4, 50mg/ml VEGF 및 50ng/ml FGF2가 보충된 무혈청 분화 배지(50% IMDM, 50% Hams F12 배지, 100㎍/ml 폴리비닐 알콜, 100㎍/ml 재조합 사람 혈청 알부민 1x 비-필수 아미노산 보충제(Invitrogen), 0.1x 화학적으로 정의된 지질 보충제(Invitrogen), 125μM 아스코르브산 2-포스페이트 마그네슘, 0.25μM 리놀레산, 미량 원소 보충제 A(0.3x), B(0.2x) 및 C(0.1x)(Corning), 5mM 염화 나트륨, 100μM 모노티오글리세롤, 20μM 에탄올아민, 100ng/ml 헤파린 및 10ng/ml IGF1)에 추가로 이동시켰다. 둘째날에 완전 배지 교환하여 4일 동안 배양을 계속하였다.
조혈 CD34+ 선조체의 분화 및 확장을 지지하기 위해, 세포 응집체를 조혈 사이토카인 - 50ng/ml SCF, 20mg/ml TPO, 10ng/ml FLT3L, 20ng/ml IL-3 및 25ng/ml BMP4가 보충된 무혈청 분화 배지(상기와 같음)에 추가로 이동시켰다. 둘째날에 완전 배지 교환하여 4일 동안 배양을 계속하였다.
1+4+4일(총 9일) 분화 프로세스 후 배양물을 수거하였다. 37℃에서 15 내지 20분 동안 Accutase(또는 Accumax)에서의 분화된 세포 응집체의 분해를 통해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 MACS 완충액(5mg/ml BSA 및 1mM EDTA를 함유하는 PBS)에서 세척하였고, 70μM 세포 스트레이너(strainer)를 통해 여과하였고, 4℃에서 30분 직접 CD34 상자성 마이크로비드(Myltenyi Biotec)로 표지하였다. MS 또는 LS 자성 컬럼, 적절한 자석 및 제조업자(Myltenyi Biotech)로부터의 권고에 따른 표준 분리 절차를 이용하여 CD34+ 세포를 단리하였다. 단리된 CD34+ 세포를 T/NK 분화 배양물에 플레이팅하거나 단리 후 1시간 이내에 이후 사용을 위해 동결보존하였다.
T/ NK 분화 배양: T/NK 분화를 위해, 비-조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트를 PBS 중에 희석된 Notch 리간드 hDLL4-Fc 키메라 단백질 및 레트로넥틴으로 (각각 0.5㎍/㎠으로) 코팅하였다. 세포 플레이팅 전에 코팅 용액을 흡인하였고, 플레이트를 세포 배양 기초 배지(DMEM/F12 또는 기타)로 1회 세척하였고, StemSpan SFEM(Stem Cell Technologies), GlumaMax(1/100), PenStrep(1/200), 아스코르브산 마그네슘 포스페이트(250μM), 니코틴아미드(2mM) 및 사이토카인 SCF, TPO, FLT3L 및 IL7(각각 50ng/ml)로 이루어진 0.25ml/㎠의 T 세포 분화 배지(TCDM)를 채웠다. 단리된 PSC-유도된 CD34+ 세포를 5000개 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하였고, 저산소성(5% O2) CO2 인큐베이터에서 3일째 및 6일째에 신선한 TCDM 배양 체적을 부가하고 이후 세 번째날마다 절반 배양 체적을 교환하여 2주 동안 배양하였다. 전체 분화된 세포를 온화한 재현탁 및 비-부착성 세포의 수집, 이어서 PBS-EDTA(0.5mM)로의 10 내지 15분 처리에 의한 부착성 세포의 탈착에 의해 수거하였다.
T 세포 확장 배양: T 세포 확장을 위해, 조직 배양 플라스틱 플레이트를 PBS 중에 희석된 항-CD3 mAb(클론 OKT3) 및 레트로넥틴으로 (각각 0.5㎍/㎠으로) 코팅하였다. 세포 플레이팅 전에 코팅 용액을 흡인하였고, 플레이트를 세포 배양 기초 배지(DMEM/F12 또는 기타)로 2회 세척하였고, ImmunoCult XF 배지(Stem Cell Technologies), GlumaMax(1/100), PenStrep(1/200) 및 사이토카인 IL2 및 IL7(각각 10ng/ml)로 이루어진 0.2ml/㎠의 T 세포 확장 배지(TCEM)를 채웠다. IL15 및/또는 IL21은 또한 확장을 향상시키기 위해 부가될 수 있다. T/NK 분화 배양으로부터 수거된 세포를 20000개 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하였고, 저산소성(5% O2) CO2 인큐베이터에서 3일째에 신선한 TCEM 배양 체적을 부가하고 이후 세 번째날마다 절반 배양 체적을 교환하여 2주 동안 배양하였다. 확장된 T 세포를 온화한 재현탁 및 비-부착성 세포의 수집에 의해 수거하였다.
실시예 7 - HPC 생산을 위한 2D 프로토콜
HPC 생산을 위해 01279.107.3902 MeCP2 녹아웃 및 TiPSCs1E 세포에 2D 분화 프로토콜을 적용시켰다(도 16). 우선, iPSC를 필수 8(E8) 배지 중의 Matrigel™ 또는 비트로넥틴-코팅 상에서 피더-불포함 조건 하에 5 내지 10계대 동안 저산소성 조건에 순응시켰다. iPSC를 개별화하였고, 5uM 블레비스타틴이 보충된 무혈청 제한(SFD) 배지 존재 하의 PureCoat 아민-코팅된 6-웰 플레이트(Corning Inc.) 상에 25000/㎠의 밀도로 플레이팅하였다. SFD 기초 배지는 75% IMDM(Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25mM HEPES+P/S 포함), 25% Hams F12(Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충제(Invitrogen 17502-048), 레티노산 불포함 1% B27 보충제(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50ug/ml 아스코르브산 및 50ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF가 보충된 4.5×10-4M 모노티오글리세롤을 함유하였다.
1일째에 75% IMDM(Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25mM HEPES+P/S 포함), 25% Hams F12(Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충제(Invitrogen 17502-048), 레티노산 불포함 1% B27 보충제(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50ug/ml 아스코르브산 및 50ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF가 보충된 4.5×10-4M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기초 배지에서 배양함으로써 조혈 분화의 유도를 개시하였다. 2일째에, 배지를 흡인하였고, 상기 세포를 추가의 48시간 동안 신선한 EB1 배지(75% IMDM(Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25mM HEPES+P/S), 25% Hams F12(Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충제(Invitrogen 17502-048), 레티노산 불포함 1% B27 보충제(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50ug/ml 아스코르브산 및 50ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF가 보충된 4.5×10-4M 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기초 배지)에 두었다.
5 내지 10일째에, 배지를 흡인하였고, 상기 세포를 다음 48시간 동안 EB2 배지에 두었다. EB2 배지는 75% IMDM(Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25mM HEPES+P/S), 25% Hams F12(Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2- 보충제(Invitrogen 17502-048), 레티노산 불포함 1% B27 보충제(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50ug/ml 아스코르브산, 및 각각 50ng/ml 및 5000U/ml의 헤파린에서 50ng/ml의 Flt-3 리간드, IL3, IL6, SCF 및 TPO가 보충된 4.5×10-4M 모노티오글리세롤을 함유하는 신선한 SFD 기초 배지를 포함하였다. 상기 세포를 TrypLE을 이용하여 분화 7, 8, 9, 10일째에 수거하였고 HPC 마커 및 림프구 선조체의 존재에 대해 염색하였다.
T 세포 분화를 위해, 상기 HPC를 레트로넥틴 및 Notch DLL4가 0.5㎍/㎠로 코팅된 비-처리된 조직 배양 플레이트 상에 약 5,000 내지 약 25,000개 세포/㎠의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 상기 HPC를 1% 글루타맥스, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95μM 아스코르브산(WAKO labs) 및 50ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3 및 TPO(Peprotech)가 보충된 StemSpan 무혈청 확장 배지 II(SFEM; StemCell Technologies) 배지 또는 SFD에서 배양하였다. 상기 배지를 48시간마다 보충하였고, 2주째에 상기 세포를 새로운 리간드 코팅된 플레이트에 비-효소적으로 분할하였다. 또한, 2 내지 3주 사이에 상기 세포를 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레-T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 상기 세포를 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 6 내지 8주째에, 상기 세포를 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 이용하여 T 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
실시예 8 - 림프구 분화에 대한 MeCP2 붕괴의 효과
조혈 분화 프로세스에서 MeCP2의 역할을 결정하기 위해서, MeCP2 녹아웃 iPSC 세포주를 생성하였다. MeCP2를 녹아웃하도록 수컷 야생형(WT) 01279 iPSC 세포주를 조작하여 MyCell® 01279.107.3902 세포주를 생성하였다. TAL 뉴클레아제를 이용하여, MeCP2 TALEN의 형질감염에 의해 MeCP2의 메틸 CpG 결합 도메인(도 17b) 앞에 일련의 정지 코돈을 삽입하였고, 정지 코돈 삽입을 함유하는 공여자 플라스미드에는 역 배향으로의 LoxP 플랭킹된 PGKp-퓨로마이신-SV40pA의 삽입이 이어졌다. 0.1279 iPSC를 MeCP2 TALENS 및 야생형 EBNA1을 발현하는 공여자 플라스미드 p1553으로 형질감염시켰다.
퓨로마이신 선택을 위해 삽입에 대해 양성인 세포를 선택하였고, 이어서 콜로니를 떼어 통합 PCR에 의해 스크리닝하였다. 스크리닝된 콜로니 중에서 96%는 2회의 PCR 스크리닝 반응에 의해 삽입에 대해 양성이었다. 클론들 중 14개를 확장시켜 계대 3에서 스크리닝하였고, 클론들 중 8개는 백본(backbone) 플라스미드의 통합에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 나머지 클론들 중 3개는 삽입물을 통해 서열분석하였고, 2개는 폴리클로날인 것으로 밝혀졌다. 하나의 모노클로날 세포주 0.1279.107.302를 선택하였고, 추가의 연구를 위해 완전히 특성확인하였다. 또한, 추가의 클론을 수득하였고 정확하게 조작된 것으로 특성확인되었다. MeCP2 변이체 001, 002, 005 및 008의 아미노산 정렬은 도 17c에 도시한다. 변이체 008은 메틸CpG 결합 도메인을 암호화하지 않는다.
HPC의 생산을 위해 실시예 1의 01279.107.3902 MeCP2 녹아웃 세포 및 WT 01279 세포에 3D 분화 프로토콜을 적용시켰다(도 17a). 우선, iPSC를 필수 8(E8) 배지 중의 Matrigel™ 또는 비트로넥틴-코팅 상에서 피더-불포함 조건 하에 5 내지 10계대 동안 저산소성 조건에 순응시켰다. 응집체는 5uM 블레비스타틴이 보충된 무혈청 제한(SFD) 배지에서 서브-컨플루언트 iPSC로부터 ml당 0.25 내지 0.5백만 세포의 밀도로 제조되었다. 상기 프로세스는 75% IMDM(Invitrogen 12200-069)(글루타민 및 25mM HEPES+P/S), 25% Hams F12(Mediatech 10-080-CV), 0.5% N2-보충제(Invitrogen 17502-048), 레티노산 불포함 1% B27 보충제(Invitrogen 12587-010), 0.05% BSA, 50ug/ml 아스코르브산, GlutaMAX, Pen/Strep 및 4.5×10-4 모노티오글리세롤을 함유하는 SFD 기초 배지의 초-저 부착(ULA) 플레이트 또는 스피너 플라스크에서 수행하였다.
일단 배상체(EB)가 형성되면, 처음 4일 동안 SFD 기초 배지에 50ng/ml의 BMP-4, VEGF 및 bFGF를 보충함으로써 분화가 시작되었다. 5일째에, 상기 EB 배양물을 각각 50ng/ml의 Flt-3 리간드, IL3, IL6, SCF, 헤파린 및 TPO의 존재 하에 두었다. EB 배양물은 저산소성 조건 하에서 분화 12 내지 16일까지 분화 프로세스 동안 2일마다 사이토카인을 함유하는 새로운 분화 배지 체적의 절반으로 보충되었다.
림프구 분화를 위해, 상기 HPC를 레트로넥틴 및 Notch DLL4가 0.5㎍/㎠로 코팅된 비-처리된 조직 배양 플레이트 상에 약 5,000 내지 약 25,000개 세포/㎠의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 상기 HPC를 1% 글루타맥스, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 95μM 아스코르브산(WAKO labs) 및 50ng/mL의 IL-7, SCF, Flt-3 및 TPO(Peprotech)가 보충된 StemSpan 무혈청 확장 배지 II(SFEM; StemCell Technologies) 배지에서 배양하였다. 상기 배지를 48시간마다 보충하였고, 2주째에 상기 세포를 새로운 리간드 코팅된 플레이트에 비-효소적으로 분할하였다. 또한, 2 내지 3주 사이에 상기 세포를 세포 표면 마커 CD5 및 CD7에 의해 프레-T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 4주째에, 상기 세포를 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8에 의해 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. 6 내지 8주째에, 상기 세포를 세포 표면 마커 CD4, CD8, CD3, CD94 및 CD56을 이용하여 T 및 NK 세포의 존재에 대해 분석하였다.
림프구 계통으로의 분화시 MeCP2 녹아웃 클론의 효율은 상기 HPC 분화의 5일째, 7일째, 9일째 및 11일째에 01279.107.3902, 01279.107.3905, 01279.107.3906, 01279.107.3907 및 01279.107.3908 클론을 수거함으로써 분석하였다. 이전에 기술된 시점에서 동결보존된 상기 HPC 세포를 해동시켰고, 레트로넥틴 및 DLL4 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 상기 세포에 2일마다 신선한 배지를 공급하였고, HPC 세포가 해동된 후 2주째에 프레-T 세포 마커에 대해(도 18a, 도 18b), 4주째에 T 및 NK 세포 마커에 대해 분석하였다. 프레-T 세포 마커의 분석에 있어서, 야생형 01279.107.0904 세포를 제외한 모든 상기 세포는 CD5+CD7+, CD7+CD45+ 및 CD5+CD45+로서 동정된 프레-T 세포의 존재를 가졌다. CD45, CD7 및 CD5(도 19) 및 CD56, CD8 및 CD3(도 20)의 표면 발현을 위해 상기 세포를 염색하였고, T, NK 및 NK/T 세포의 존재를 정량화하였다.
세포의 투입 수는 공지되어 있었으므로, T(CD3+/CD8+), NK(CD3-/CD56+) 및 NK/T 세포(CD3+/CD56+)의 절대 수를 측정하였다. 상기 프로세스의 효율은 한 세포 유형(T, NK 또는 NK/T)의 절대 수/총 세포의 투입 수의 비율에 의해 또는 세포 유형의 절대 수/HPC의 투입수의 비율에 의해 계산된다. T 세포(CD3+/CD8+)의 백분율(도 17) 및 NK 세포(CD3-/CD56+)의 백분율(도 21)은 FSC-SSC 게이트 및 림프구 산포 게이트 하의 유동 세포측정법에 의해 정량화하였다. 드러나는 NK/T(CD3+/CD56+), (CD3+/CD8+), NK/T(CD3+/CD56+) 및 NK(CD3-/CD56+) 세포의 양도 측정하였다. 추가의 분석은 CD235/CD7, CD144+/Dll4+ 및 Flk-1+/CD34+의 발현이 분화 11일째에 감소함을 나타냈다. 분화 11일째에 림프구 세포가 부재하므로, 이는 이들 마커의 소정 역치(threshold) 수준의 발현이 DLL4의 존재시 림프구 분화를 위해 세포를 프라이밍하는데 필수적임을 의미할 수 있다.
T 세포 마커의 분석은 MeCP2 WT 세포주가 아닌 MeCP2 KO 세포주가 림프구 분화에 대한 잠재성을 가졌음을 나타냈다. MeCP2 WT 세포로부터의 9일째 HPC 선조체는 본질적으로 CD3+CD8+ T 세포를 갖지 않았고, 한편 시험된 다른 HPC 선조체는 CD3+CD8+ T 세포의 집단으로 분화하였다. 따라서, MeCP2의 메틸 결합 도메인의 녹아웃은 T 및 NK 세포를 생산하는 HPC 선조체의 잠재성을 향상시켰다.
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 실시형태들의 관점에서 기술되었지만, 당해 분야 숙련가에게는 변경이 본원에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 방법 단계들의 순서에 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 적용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련이 있는 소정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있으면서 본원에 기술된 제제 대신에 대체될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 당해 분야 숙련가에게 명백한 이러한 모든 유사 대체 및 변형은 첨부되는 청구범위에서 정의하는 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참조문헌
다음 참고문헌은 예시적 절차를 제공하거나 또는 본원에 제시된 것에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 인용에 의해 포함된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
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Figure pct00010

Claims (85)

  1. (a) 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)를 수득하는 단계(여기서, 상기 PSC는 체세포 집단으로부터 재프로그래밍된다);
    (b) 상기 PSC를 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic precursor cell)로 분화시키는 단계; 및
    (c) 면역 세포 분화를 촉진시키는 조건 하에 상기 HPC를 배양함으로써 면역 세포를 생산하는 단계
    를 포함하는, 면역 세포의 생산 방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 PSC가 유도된 만능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PSC가 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포가 림프구 세포인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 림프구 세포가 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포가 골수 세포인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 골수 세포가 수지상 세포인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 체세포 집단이 혈액 세포 집단 또는 피부 세포 집단인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 혈액 세포 집단이 T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 혈액 세포 집단이 선조 혈액 세포, 말초 혈액 단핵구 세포 또는 림프아구성 세포로서 추가로 정의되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 체세포 집단이 포유동물인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 체세포 집단이 사람인, 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 혈액 세포 집단이 말초혈, 제대혈 또는 림프구 조직으로부터 단리되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 림프구 조직이 골수, 림프절 또는 태아 간을 포함하는, 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 혈액 세포 집단이 T 세포를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 T 세포가 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 존재 하에 배양되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 T 세포가 T 헬퍼(helper) 1(TH1) 세포, T 헬퍼 2(TH2) 세포, TH17 세포, 세포독성 T 세포, 조절성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 나이브(naive) T 세포, 기억 T 세포, 또는 감마 델타 T 세포인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 체세포 집단에 재프로그래밍 인자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 체세포 집단에 RNA, 단백질, 또는 소형 분자를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 체세포 집단이 혈액 세포 또는 피부 세포인, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자가 하나 이상의 발현 카세트에 의해 암호화되는, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자가 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 유전자를 포함하는, 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자가 Sox2, Oct4, cMyc, Klf4, Nanog, SV40 거대 T 항원 및 Lin 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자들 중 3, 4, 5 또는 6개를 포함하는, 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 카세트가 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 및 트랜스포손으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 재프로그래밍 벡터에 포함되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터로서 추가로 정의되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 에피솜 벡터가 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)-기반 에피솜 벡터로서 추가로 정의되는, 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 정의된 피더(feeder)-불포함 조건 하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 PSC가 통합된 외인성 바이러스 요소를 본질적으로 포함하지 않는, 방법.
  30. 제8항에 있어서, 상기 혈액 세포 집단이 외인적으로 적용된 G-CSF를 이용하여 동원되지 않은, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 HPC당 적어도 20개의 면역 세포로 분화시키는, 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 HPC당 적어도 50개의 면역 세포로 분화시키는, 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 HPC가 HSC당 적어도 100개의 면역 세포로 분화시키는, 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 PSC가 PSC당 적어도 50개의 면역 세포로 분화시키는, 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 PSC를 HPC로 분화시키는 것이
    (a) 적어도 1개의 성장 인자를 포함하는 1차 제한 배지에서 복수의 실질적으로 미분화된 만능 세포를 배양하거나 유지하는 단계;
    (b) IL-3, Flt3 리간드 및 GM-CSF를 포함하지 않거나 본질적으로 포함하지 않는 2차 제한 배지에서 상기 세포를 인큐베이션하는 단계;
    (c) 복수의 세포에서 분화를 확대하거나 촉진시키기에 충분한, BMP4, FGF2 및 VEGF를 포함하는 3차 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 복수의 세포에서 분화를 확대하거나 촉진시키기에 충분한, IL-3 및 Flt3 리간드를 포함하는 4차 제한 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계
    의 순차적 단계를 포함하고,
    여기서 복수의 만능 세포가 HPC로 분화되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 2차 제한 배지가 블레비스타틴 및/또는 Rock 억제제를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 2차 제한 배지가 GSK3 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 2차 제한 배지가 BMP4, VEGF 및 FGF2를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세포가 단계 (b) 전에 개별화되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)가 아민 배양 플레이트를 이용하여 수행되는, 방법.
  42. 제36항에 있어서, 상기 2차 제한 배지가 VEGF 및 FGF2를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제35항에 있어서, 상기 4차 제한 배지가 IL-3, IL-6, SCF, TPO 및 MBP4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사이토카인들 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제35항에 있어서, 상기 4차 제한 배지가 헤파린을 포함하는, 방법.
  45. 제35항에 있어서, 상기 방법이 25% 미만의 산소의 대기압에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  46. 제35항에 있어서, 상기 방법이 5% 미만의 산소의 대기압에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  47. 제35항에 있어서, 복수의 만능 세포가 배상체(EB: embryoid body)를 형성하는, 방법.
  48. 제35항에 있어서, 상기 HPC가 CD34를 발현하는, 방법.
  49. 제35항에 있어서, 상기 HPC가 CD43, CD34, CD31, CD41, CD235 및 CD45로 이루어진 그룹으로부터 적어도 2개의 마커를 발현하는, 방법.
  50. 제1항에 있어서, 면역 세포 분화를 촉진하기 위한 조건이 림프구 분화를 촉진하기 위한 조건으로서 추가로 정의되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, CD34 및 CD43을 발현하는 HPC가 림프구 분화를 촉진하기 위한 조건 하에 배양되는, 방법.
  52. 제1항에 있어서, 림프구 분화를 촉진하기 위해 상기 세포를 배양하는 것은:
    (i) 매트릭스 및 Notch 리간드로 코팅된 표면 상의 제한 배지에서 HPC를 배양하는 단계(여기서, 상기 HPC는 CD34, CD43, CD7, DLL4, CD144 및 CD235로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커들 중 하나 이상을 발현한다); 및
    (ii) 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 상기 배양을 유지하여 림프구 세포를 생산하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 매트릭스가 세포외 매트릭스 단백질인, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 HPC가 CD144, CD34, CD45 및/또는 CD7을 발현하는, 방법.
  55. 제52항에 있어서, 단계 (i)가 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 상기 HPC를 단리하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 단리는 자성-활성화된 세포 분류(MACS: magnetic-activated cell sorting)를 포함하는, 방법.
  57. 제52항에 있어서, 상기 세포가 5% 미만의 산소의 대기압에서 배양되는, 방법.
  58. 제52항에 있어서, 상기 세포가 5% 미만의 산소의 대기압에서 배양되는, 방법.
  59. 제52항에 있어서, 상기 제한 배지가 아스코르브산 및/또는 니코틴아미드를 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 아스코르브산이 50μM 내지 1mM의 농도로 존재하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 아스코르브산이 90μM 내지 100μM의 농도로 존재하는, 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 니코틴아미드가 0.1mM 내지 5mM의 농도로 존재하는, 방법.
  63. 제52항에 있어서, 상기 매트릭스가 레트로넥틴, 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴인, 방법.
  64. 제52항에 있어서, 상기 매트릭스가 레트로넥틴인, 방법.
  65. 제52항에 있어서, 상기 Notch 리간드가 DLL4인, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 DLL4가 DLL4:Fc 키메라 단백질인, 방법.
  67. 제52항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인이 SCF, TPO, IL-7 및 Flt-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제52항에 있어서, 단계 (ii)가 1 내지 6주인, 방법.
  69. 제52항에 있어서, 단계 (ii)가 2 내지 4주인, 방법.
  70. 제52항에 있어서, 상기 림프구 세포가 CD8, CD7, CD45, CD5, CD4 및 CD3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상을 발현하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 림프구 세포 중 5% 초과가 상기 마커들 중 적어도 2개에 대해 양성인, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 림프구 세포 중 10% 초과가 상기 마커들 중 적어도 2개에 대해 양성인, 방법.
  73. 제1항에 있어서, 면역 세포 분화를 촉진하기 위한 조건이 골수 분화를 촉진하기 위한 조건으로서 추가로 정의되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 골수 분화를 촉진하기 위한 조건 하에 상기 HPC를 배양하는 것은:
    (i) TPO, SCF 및 Flt3 리간드를 포함하는 1차 제한 배지에서 상기 HPC를 배양하여 골수 세포 집단을 생산하는 단계; 및
    (ii) TPO, SCF 및 Flt3 리간드를 본질적으로 포함하지 않는 2차 제한 배지에서 상기 세포를 인큐베이션하여 농축된 골수 세포 집단을 생산하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 1차 제한 배지가 IL-6 및 IL-3을 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 2차 제한 배지가 GM-CSF를 포함하는, 방법.
  77. 제74항에 있어서, 단계 (i)에서 생산되는 골수 세포 집단의 적어도 50%가 CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, CD45, CD43 및 CD31에 대해 양성인 골수 세포 집단이 본질적으로 CD34의 발현을 갖지 않는, 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 농축된 골수 세포 집단의 적어도 80%가 CD43+, CD45+, CD31+ 및 CD34-인, 방법.
  80. 제74항에 있어서, 단계 (ii)가 5 내지 10일 동안인, 방법.
  81. 제74항에 있어서, 상기 농축된 골수 세포 집단을 수지상 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 농축된 골수 세포 집단을 수지상 세포로 분화시키는 것이 GM-CSF, IL-4 및 TNFα를 포함하는 제한 배지에서 상기 농축된 골수 세포 집단을 배양하여 수지상 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 제한 배지가 지질단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 수지상 세포가 CD209, CD1a, HLA-DR, CD11c, CD14, CD83 및 CD86으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 마커들 중 하나 이상을 발현하는, 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 수지상 세포가 본질적으로 CD12의 발현을 갖지 않는, 방법.
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