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CN113755432B - 干细胞培养方法 - Google Patents

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CN113755432B CN202010691416.8A CN202010691416A CN113755432B CN 113755432 B CN113755432 B CN 113755432B CN 202010691416 A CN202010691416 A CN 202010691416A CN 113755432 B CN113755432 B CN 113755432B
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Abstract

在此公开了一种干细胞培养方法，其特征在于，包括在一个大气压之外加有额外压力的气体环境中培养干细胞的步骤，所述额外压力为60‑140mmHg。

Description

干细胞培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及干细胞的培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞是分化能力最强的全能干细胞，然而因其自身成瘤性、伦理问题等多种因素的影响，其临床应用前景目前并不明朗。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的成员之一，存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能以及免疫调节和抗炎作用的功能，已报道可用于治疗免疫相关性疾病，如系统性红斑狼疮、克罗恩病、移植物抗宿主病；另有一些基础研究及临床试验证明间充质干细胞可减轻动脉粥样硬化。
干细胞的高效率培养一直是本领域希望解决的问题。本领域一般从培养基筛选角度提高干细胞的培养效率，鲜有从氧气浓度、压力等因素考虑干细胞培养的效率与活性。有文献报道，正常人骨髓中的氧张力为3.591～6.517kPa，相当于氧体积分数为4％～7％，即正常状态下间充质干细胞生存在低氧环境中。另外也有报道，额外施加压力培养间充质干细胞获得较好效果。但是，尚未曾见到对干细胞培养条件中气体条件参数例如氧气浓度、压力参数等进行筛选和优化的报道。同时，在干细胞研究与生产领域，持续存在对更优化培养方案的需求。
发明内容
本发明通过对培养条件中气体环境的研究与优化提出了一种新的优化的干细胞培养方案。本发明方法培养的干细胞表现出更优的生物活性，包括增殖能力、独立生存能力、分化能力、干性保持和衰老抗性等等。
本文中，内容之一是一种干细胞培养方法，其特征在于，包括在一个大气压之外加有额外压力的气体环境中培养干细胞的步骤，所述额外压力为60-140mmHg。所述额外压力可以是静态的，也可以是动态的，例如周期性波动。
实施方式之一中，所述气体环境具有2％-20％的氧气浓度，优选低氧环境，例如2％-7％的低氧浓度。
本文中，还提供用本发明方法培养得到的干细胞。
本文中，术语“干细胞”不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞。所述干细胞优选间充质干细胞。
附图说明
图1显示不同条件培养的毛囊间充质干细胞的扩增倍数。
图2显示不同培养条件下毛囊间充质干细胞的代数与扩增倍数，其中，代数以Pn表示，n为自然数。
图3显示不同条件培养的脐带和脂肪间充质干细胞的CFU率。
图4显示不同条件培养的毛囊间充质干细胞的成骨率(图4A)与成脂率(图4B)。
图5显示实施方式之一中，在一个大气压以外施加的额外压力在75-115mmHg范围内的正弦或类正弦波动。
以上，“不同(培养)条件”之间的区别仅在于图中如下表示的气体环境差异特征：“20％”表示环境中氧气浓度为20％，不额外施加压力；“5％”表示氧气浓度为5％，不额外施加压力；“5％+静”表示氧气浓度5％，在1个大气压之外额外施加恒定的95mmHg的压力；“5％+动”表示氧气浓度5％，在1个大气压之外施加额外的压力，所述额外的压力在75-115mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动，频率为14次/分钟。
图6显示实施例中低氧静态压(5％+静)设备的示意图，细胞在压力罐内培养，氧气浓度5％，在1个大气压下额外施加压力，施加的额外压力维持在95mmHg。
图7显示实施例中低氧动态压(5％+动)设备的示意图，细胞在压力罐内培养，氧气浓度5％，在1个大气压下额外施加压力，施加的额外压力在75-115mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动。图中，箭头所示由控制模块至压力罐的线路表示增压气路，箭头所示由压力罐至控制模块的线路表示减压气路；“控制模块”包括软件控制和气路上的增压气泵、减压气泵、减压阀和增压阀。
具体实施方案
本文中，除非特别指定，名称、量词或单位前的“一”或“1”表示存在即数量上至少为一，因此涵盖复数含义。
本文中，除非特别指定，本文述及的各项技术特征，例如组分、含量、步骤、条件参数、参数值、组件、连接关系、工作关系等等，它们的组合方式不限于本文具体描述的各个实施方式和实施例，它们其他的任意组合方式同样属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，以两端值表示的数值范围视同具体公开了两端值之间的所有实数及其两两组合而成的数值范围。此外，除非特别指定，当对同一参数具体描述了多个可选数值范围或数值时，这些端值和数值可以任意组合，由此得出的范围只要包含在具体描述的最大连续范围之内则均属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，所述数值不论是否带有前行词“约”均涵盖该数值±10％的范围，亦可是±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％的范围。
本文中，除非特别指定，所有科学和技术术语的含义均符合本领域、尤其干细胞、间充质干细胞领域公知或已知的含义，例如教科书、实验手册或现有技术文献中记载的含义。
本文提供一种干细胞的培养方法，所述方法包括在一个大气压之外加有额外压力的气体环境中培养干细胞的步骤，所述额外压力约为60-140mmHg。
本文中，“气体环境”指细胞培养物所处环境中的气体条件，例如培养箱中的气体环境，主要由气体组成和气压来表征。通常，包括干细胞在内，细胞培养气体环境为一个大气压、约5％CO2和约95％相对湿度。
本发明的方法在一个大气压之外施加约60-140mmHg的额外压力。已知正常人舒张压是60-90mmHg，收缩压是140-90mmHg。因此，本发明通过施加额外压力很好地模拟了干细胞在人体内的压力环境。一些实施方式中，额外压力为约70-120mmHg、约75-115mmHg、约80-110mmHg、约85-100mmHg或约90-95mmHg。例如，可以利用培养箱的气体输送系统和气压感测装置来实现上述加压和调控。
一些实施方式中，“一个大气压”指不额外加压的环境大气压，即常压。优选地，“一个大气压”为一个标准大气压，即760mmHg。
本发明中，所述额外压力可以是静态的即恒定的，也可以是动态的。一些实施方式中，额外压力是静态的，即恒定的，例如恒定为70-120mmHg、75-115mmHg、80-110mmHg、85-100mmHg、90-95mmHg范围内任一值，例如95mmHg。本文中，压力“恒定”包括压力基本恒定的情形，即相对于标称压力值的波动幅度不超过10％，优选不超过5％、3％、2％、1％或0.5％，优选无限趋近于0％并包括零波动的情形。保持细胞培养气体环境稳定包括保持气压恒定的手段是本领域技术人员所熟知的，例如常用培养箱及其气体输送系统和监控系统。
一些实施方式中，额外压力是动态的，后文亦称“动态压”。一些实施方式中，所述额外压力在60-140mmHg范围内做周期性波动。所述周期性波动可以是定频的，也可以是变频的，各周期的振幅可以相同，也可以不相同。因此，以60-140mmHg范围为例，所述范围的端值分别表示最低波谷和最高波峰的压力值。优选地，额外压力的波动范围即振幅为约70-120mmHg，更优选约75-115mmHg。其中，75mmHg为常人舒张压(60-90mmHg)的中值，115mmHg则为收缩压(140-90mmHg)的中值。因此，本发明额外施加的动态压在振幅上很好地模拟了干细胞在体内所处的周期性变化的压力环境。优选地，所述波动为正弦或类正弦变化的周期波动，例如图5所示。
举例来说，施加动态压的手段可以采用如下方法：将培养物所在的腔室与变压装置气体连通，由变压装置向所述腔室施加气压。实施方式之一中，所述变压装置包括增压气路和减压气路，培养物所在的腔室与增压气路和减压气路连通，增压气路与气源连通。所述腔室可以是例如培养箱、压力罐或压力舱、培养罐等培养设备的培养物所在内腔。所述气源可以是例如储气罐，也可以是培养腔室所处的环境气体。所述气源提供的气体符合本发明所需的气体组成。所述增压气路包括增压气泵和可选的阀门例如增压阀。所述减压气路包括阀门例如减压阀和可选的减压气泵。实施方式之一中，在软件的控制下由增压气泵将来自气源的气体通过增压气路施加到培养物所在的腔室，当检测到气压达到设定的上限时，关闭增压气路，同时开启减压阀，通过减压气路降低培养物所在腔室的气压，当气压降至设定的下限时，停止降压，关闭减压气路，重新开启增压气路，如此循环往复，形成气压波动。所述气泵和阀门可连接软件控制，在软件控制中通过程序来进行升压降压的操作控制，从而使得压力罐内的压力随着时间做周期性的波动，例如正弦或类正弦波动。实施方式之一中，减压气路中包括减压泵，由减压气泵抽取培养物所在腔室的气体令压力下降。另一实施方式中，减压气路可以省略从培养腔室中抽取气体的减压气泵，通过减压阀利用腔室内外的压力差来释放腔室内的压力实现降压。
另一实施方式中，所述变压装置包括气缸。培养物所在的腔室与气缸连通，通过气缸活塞在缸体内的移动改变所述腔室的气压，活塞在缸体内的往复运动使得腔室的气体体积周期性变化，气压随之发生周期性脉动，该压力变化可根据需要设定和控制，例如使之形成正弦或类正弦变化。
一些实施方式中，额外动态压周期性波动的频率为约12-20次/分钟，优选约13-18次/分钟、约14-17次/分钟、约14-16次/分钟或约13-15次/分钟，例如约12、13、14、15、16或17次/分钟。一些实施方式中，额外动态压周期性波动的频率是恒定的。已知正常人的呼吸频率介于12-20次/分钟。因此，本发明额外施加的动态压在频率上亦很好地模拟了干细胞在体内所处的周期性变化的压力环境。
本发明中，气体环境中的气体组成除了氧气浓度之外其余参数都可参照或符合干细胞细胞培养的常规设定，例如CO2浓度约5％，相对湿度约95％。一些实施方式中，气体环境包含约2％-20％的氧气，除氧之外的其余气体选自空气中除氧以外的其他任一组分、其他对干细胞无害的气体，或其组合，例如氮气(N2)、二氧化碳(CO2)或其组合。一些实施方式中，气体环境中的氧气浓度为约2％-7％、约2％-5％、约4％-7％、约5％-7％。保持细胞培养气体环境稳定包括保持气体组成稳定的手段是本领域技术人员所熟知的，例如常用培养箱及其二氧化碳气体控制系统和湿度控制系统。举例来说，可以采用三气培养箱来制造低氧浓度。
本发明的方法可用于培养各种干细胞，包括胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞。其中，成体干细胞可以是例如脂肪、宫膜、毛囊或脐带干细胞。优选人干细胞。需要说明的是，本发明中术语“干细胞”不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞。一些实施方式中，本发明方法用于培养间充质干细胞，例如(人的)脂肪、宫膜、毛囊或脐带间充质干细胞。
一些实施方式中，在额外加压环境中培养干细胞的步骤是或包括原代细胞的扩增、维持和/或传代。一些实施方式中，在额外加压环境中培养干细胞的步骤是或包括后代细胞的维持、扩增和/或传代。一些实施方式中，自原代细胞起即在额外加压环境中培养扩增、维持、传代。
本发明中，气体环境之外，其他培养条件例如培养基和温度都参照或符合干细胞细胞培养的常规设定。例如，本发明方法可采用任意用于培养干细胞例如间充质干细胞的培养基。例如，本发明方法可采用任意干细胞例如间充质干细胞的适宜培养温度，一般为36.5-37.5℃，优选37℃。
本文还提供用本发明方法培养获得的干细胞。本发明方法培养的干细胞表现出更优的生物活性，包括增殖能力、独立生存能力、分化能力、干性保持和衰老抗性等等。
实施例
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
以下各实施例中，“不同条件”或“不同培养条件”表示参与比较的细胞培养条件彼此之间的差别仅在于如下标示的独特气体环境特征，这样一组用于比较的不同培养条件简称为“4种条件”，其中的压力值均为表压，即一个大气压之外额外施加的压力：
常氧(20％)：氧气浓度20％，不额外施加压力；
低氧(5％)：氧气浓度5％，不额外施加压力；
低氧静态压(5％+静)：氧气浓度5％，在1个大气压下额外施加恒定的95mmHg的压力，在低氧培养箱(ESCO公司)内放置一个压力罐，细胞培养在该压力罐内进行，通过气泵向罐内充气加压，压力达到95mmHg时，在不停止充气加压的前提下，缓慢开启缓释阀，使进气与出气达到动态平衡，罐内气体维持在95mmHg,详见图6；
低氧动态压(5％+动)：氧气浓度5％，在1个大气压下额外施加压力，所述压力在75-115mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动，频率为14次/分钟，见图5。如图7所示，在低氧培养箱(ESCO公司)内放置一个压力罐，细胞培养在该压力罐内进行。压力罐连有增压气路和减压气路。图中，箭头所示由控制模块至压力罐的线路表示增压气路，箭头所示由压力罐至控制模块的线路表示减压气路；“控制模块”包括软件控制和气路上的增压气泵、减压气泵、增压阀和减压阀。在软件控制的控制下打开增压气路的增压阀，启动增压气泵，由增压气泵抽取培养箱里的气体向压力罐内充气加压，当检测到压力达到115mmHg时，关闭增压气路的增压气泵和增压阀，停止加压，同时打开减压气路的减压阀，启动减压气泵，由减压气泵抽取罐内的气体令压力下降，当压力降至75mmHg时，关闭减压气路的减压阀和减压气泵，停止降压，重新开启增压气路，即开启增压阀和增压气泵，如此循环往复，由程序软件将交变频率控制为14次/分钟。
实施例1：不同条件培养的毛囊间充质干细胞的扩增倍数比较
1)获得完整人毛囊组织，使用显微镊小心将毛囊组织放置在1.5mL EP管底部。按每根毛囊5μL量加入酶解液TripLE(Gibco-12604021)，37℃5％CO2培养箱静置3小时，每隔1小时小心轻弹管底，轻轻混匀。
2)酶解3小时后，镜下可见毛囊的外毛根鞘层已完全酶解，毛干部分不能完全酶解。未酶解部分无需取出，使用100-1000μL移液枪轻柔吹打10次，将酶解液完全混合。静置1分钟待未酶解毛干沉入EP管管底，吸取上层酶解悬液，即为原代间充质干细胞。
在六孔板的一个孔中加入5根毛囊汇总的25μL酶解所得原代间充质干细胞悬液，再加入2mL羊水培养基(购买自广州白云山拜迪生物医药有限公司)重悬。将六孔板分别放入常氧(20％)、低氧(5％)、低氧静态压(5％+静)、低氧动态压(5％+动)这4种条件下37℃培养，每隔3天换液。
3)培养至10-12天，观察六孔板内细胞密度达80％以上即可弃培养基，在六孔板底加入0.5mL TryplE消化液后置于37℃培养箱内消化3分钟，然后向六孔板中加入1mL羊水培养基终止消化，将上清取出置于15mL离心管中，用1mL羊水培养基润洗孔板1次，将润洗液加入该离心管中。在离心机中1500r.p.m.离心5分钟，弃去上清，加入1mL羊水培养基重悬，计数接种至T25培养瓶，培养得P1代毛囊间充质干细胞。
4)细胞连续传代培养至P12代，4种条件下的细胞始终维持各自的培养条件。扩增倍数＝每次传代收获的细胞数/接种细胞数。本实施例中，严格按照5000细胞/cm2的密度进行传代，一个T25培养瓶的面积为25cm2，即一个T25培养瓶每次接种1.25×105个细胞，则扩增倍数计算公式为“扩增倍数＝每次收获的细胞数/(1.25×105)”。
结果见图1、图2。结果显示，低氧培养的间充质干细胞扩增倍数高于常氧，加压进一步提高扩增倍数，在低氧动态压条件下，间充质干细胞的扩增倍数最高。
实施例2：不同条件培养的间充质干细胞克隆形成能力比较
克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外培养时，其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间，通过计数克隆形成率，可对细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖能力和独立生存能力。
人脐带间充质干细胞试验：
1)获取完整的人脐带组织，使用大手术剪刀剪掉脐带两端各1cm，然后多次漂洗以除去血液，使用小剪刀及组织镊沿近脐静脉处将羊膜层完全撕开，摊平，再用组织镊去除组织内的两条脐动脉和一条脐静脉。
2)将去除血管的组织转移至装有10ml消化酶液TripLE(Gibco-12604021)的50ml离心管中，使用大手术剪刀剪碎组织，将组织块剪至1mm3左右，封口膜封口后，转移至37℃振荡摇床，转速60-80次/分钟，振荡消化3小时。
3)消化结束后，加入30ml Hank平衡盐溶液稀释混匀，混匀后管内液体不分层，呈淡淡的浅黄色，液体呈胶状，使用100μm细胞过滤筛网缓慢过滤。
4)滤液分装至13个15ml离心管，400g常温离心6分钟，离心完成后缓慢去除上清，各加入1ml DMEM/F12(购买自Gibco公司)重悬沉淀细胞，混合至一管后400g常温离心6分钟，弃去上清，1ml DMEM/F12重悬，得原代间充质干细胞。计数，将细胞接种至T25培养瓶中，所用培养基为埃德斯培养基(购买自上海埃德斯生物科技有限公司)。
5)每隔3天换液，培养至9天，观察T25培养瓶内细胞密度达80％以上即可弃培养基，在培养瓶底加入1mL TryplE消化液后置于37℃培养箱内消化3分钟，然后使用10mL移液管向培养瓶中加入3mL埃德斯培养基终止消化，将上清取出置于15mL离心管中，再加入1mL埃德斯培养基润洗瓶底1次，润洗液加入该离心管中。在离心机中1500r.p.m.离心5分钟，弃去上清，加入1mL埃德斯培养基重悬，计数接种至T25培养瓶，传为P1代脐带间充质干细胞。
6)细胞连续传代培养，将P6代细胞按5000细胞/cm2的密度接种于4个T25培养瓶里面，分别置于前述4种条件下37℃培养。4天后，收集细胞于埃德斯培养基重悬，制成细胞悬液并计数。
7)计算菌落形成单位(CFU)：
将不同条件下培养的细胞分别接种于10cm2培养皿，2200个细胞/皿。铺板后摇匀，分别放入培养箱中培养，培养条件分别与步骤6)中的培育条件相同。培养周期为14天，培养过程中每3天进行一次换液并观察细胞群落生长状况。
待培养皿中大多数单个克隆细胞数大于50时，每个培养皿加入2mL 4％多聚甲醛，4℃固定细胞60分钟，PBS洗涤细胞1次。每个培养皿加入洁净、无杂质结晶紫染液2mL，染细胞30分钟。
洗涤细胞，晾干，拍照，克隆计数。清点每个培养皿里菌落形成单位(CFU)的数量，然后计算CFU率：CFU率＝CFU数量/接种量，本例中接种量为2200。
结果见图3。在低氧动态压条件下，脐带充质干细胞的CFU率最高，达到3.55％。
人脂肪间充质干细胞试验：
1)获取完整的人脂肪手术样本，用细胞清洗液洗涤手术后的固体脂肪组织，用医用直尖头眼科剪和医用弯头有齿眼科镊去掉肉眼可见的血管和结缔组织，取5mL的脂肪于50mL离心管中。
2)加入两倍体积的酶解工作液(10mg/mL的胶原酶I，溶剂为DMEM/F12)(10mL)，即以体积比1:2的比例混匀，用无菌医用直窄头精细剪将脂肪组织剪至1mm3肉泥状，拧紧管盖，封口膜封口后倾斜放入37℃恒温摇床以80r.p.m.的摇速消化1小时，至无明显的脂肪颗，然后用10mL移液管反复轻轻吹打消化后的脂肪组织4-5次，加入15mL的洗液，上下颠倒混匀终止消化，1500r.p.m.室温离心5分钟，弃上清液。
3)用20mL的细胞清洗液重悬沉淀，所有重悬液过100μm细胞筛网，再加入5mL细胞清洗液清洗细胞筛网。1500r.p.m.室温离心5分钟，弃上清液。加入5mL DMEM-F12悬浮细胞，进行细胞计数，接种细胞于T25培养瓶中(所用培养基为羊水培养基，购买自广州白云山拜迪生物医药有限公司)。细胞37℃培养48小时后，换液洗去未贴壁红细胞，继续进行培养，每隔四天换液一次，由此获得原代间充质干细胞。培养至7-9天，融合度达到80％-90％即可进行传代培养。TrypLE室温消化2分钟，加入2倍体积的羊水培养基终止消化，离心，弃去上清，加入1mL羊水培养基重悬，计数接种至T25培养瓶，为P1代脂肪间充质干细胞。
4)细胞连续传代培养，将P4代细胞按5000细胞/cm2的密度接种于4个T25培养瓶里面，分别置于前述4种条件下37℃培养。4天后，收集细胞于羊水培养基重悬，制成细胞悬液并计数。
5)如前所述计算菌落形成单位(CFU)。
结果见图3。结果显示，低氧条件下培养的脂肪间充质干细胞CFU率显著高于常氧，在低氧动态压条件下，脂肪间充质干细胞的CFU率最高，达到8.18％。
实施例3：不同条件培养的毛囊间充质干细胞成骨分化与成脂分化比较
如实施例1所述制备毛囊间充质干细胞并传代培养，自原代细胞起分别维持于4种条件下培养和传代。收获P5代毛囊间充质干细胞进行成骨分化和成脂分化诱导。
成骨分化并染色：
按活细胞浓度取2.5×105细胞于15mL离心管中，加入完全生长培养基至总体积为2.5mL，即终浓度1.0×105细胞/mL。以1mL/孔，即1.0×105细胞/孔的细胞浓度在4种条件下的培养箱中培养3-4天至细胞融合率90％-100％。于超净台中吸弃孔内培养基，每孔加入1mL成骨诱导分化完全培养基(购买自赛业生物科技有限公司)。每3天更换一次培养基，成骨诱导分化14天时，用茜素红S对成骨分化细胞进行染色。成骨率(％)结果见图4A。
成脂分化并染色：
按活细胞浓度取2.5×105细胞于15mL离心管中，加入完全生长培养基至总体积为2.5mL，即终浓度1.0×105细胞/mL。以1mL/孔，即1.0×105细胞/孔的细胞浓度在4种条件下的培养箱中培养3-4天至细胞融合率90％-100％。于超净台中吸弃孔内培养基，每孔加入1mL成脂诱导分化培养基(购买自STEMCELL)。每3天更换一次培养基，成脂诱导分化14天时，用油红O染色液对成脂分化细胞染色。成脂率(％)结果见图4B。
结果显示，低氧培养的间充质干细胞成骨与成脂分化能力强于常氧，加压进一步增强了分化能力。尤其，低氧动态压培养条件下的间充质细胞，其成骨与成脂分化能力明显增强。
实施例4：不同条件培养的间充质干细胞干性和衰老基因表达水平比较
人毛囊间充质干细胞的制备与培养：
如实施例1所述制备毛囊间充质干细胞并传代培养，自原代细胞起分别维持于4种条件下培养和传代。所不同的是，用赛业培养基(购买自赛业(广州)生物科技有限公司)替代羊水培养基。留取收获的P3、P5代毛囊间充质干细胞用于干性基因表达水平的检测。
人宫膜间充质干细胞的制备与培养：
1)组织分离：将50mL离心管中的经血样本依次过18目不锈钢细胞筛、36目不锈钢细胞筛、80目不锈钢细胞筛和100μm滤膜。
2)单核细胞分离法：
将步骤1)中过滤的经血样本进行400g，20℃预离心10分钟，去除大部分上清，剩底部2mL上清和细胞沉淀，用清洗液稀释沉淀，稀释后样本总体积为纯血量的2倍，混合均匀。用注射器吸取16mL的室温淋巴细胞分离液，加到50mL分离管底部，将底部完全填充满，然后沿管壁直接加入20mL血液，800g，20℃离心15分钟。离心完成，样本从上到下分为四层，隔板上层：血浆层、白膜层、以及隔板下层的淋巴细胞分离液层和红细胞层。用3mL巴士吸管吸去大部分上层血浆层(15mL左右)。将剩余的2mL血浆层与白膜层用3mL巴氏吸管小心吸取，加入新的50mL离心管中。
3)组织培养
用两倍白膜层样本体积的清洗液洗涤一次，然后每管加入10mL清洗液重悬沉淀，然后合并各管中的沉淀，40mL/管，超过40mL的悬液需分管离心，弃去上清。然后再洗涤一次，去上清。加入2ml培养基(7501培养基，购买自ScienCell公司)，重悬所有细胞沉淀，其中包含原代间充质干细胞，计数，以3×105个/cm2的密度接种于六孔板中，摇匀，置于前述4种条件下37℃培养。48小时后，换液洗去未贴壁红细胞，以后每隔3天换液。培养至第7天，观察6孔板内细胞密度达80％以上，胰酶37℃消化3分钟，加入2倍体积的7501培养基终止消化，离心，弃去上清，加入1mL7501培养基重悬，计数接种至T25培养瓶，即P1代。
细胞连续传代培养至P8代，4种条件下的细胞始终维持各自的培养条件，留取收获的P6、P8代宫膜间充质干细胞用于衰老基因表达水平的检测。
干性基因与衰老基因表达水平检测：
提取总RNA：收集间充质干细胞于1.5mL离心管，PBS清洗2次后加入1mL RNAisoPlus裂解液(购自Takara公司)，冰上静置后加入200μL氯仿，充分混匀，冰置5min后，4℃离心12000r.p.m.，15分钟，轻轻吸取500μL上层透明水相至新的1.5mL离心管中，并加入等体积异丙醇，轻柔颠倒8次混匀，冰置15分钟，4℃离心12000r.p.m.，15分钟，此时管底会有白色沉淀，弃上清，并用75％乙醇清洗沉淀，再次离心去上清后，开盖室温晾干沉淀，加入15-20μL的DNase/RNase Free H2O(InvitrogenTM)，充分混匀至沉淀完全溶解。
总RNA逆转录成cDNA：用逆转录试剂盒“TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis Super Mix”(AT311-03，北京全式金生物技术有限公司)进行逆转录。具体地说，按照说明书，取1μg总RNA，加入Dnase/RNase Free H2O至7μL，加入1μL随机引物混匀，65℃5分钟，配制成RNA Mix；然后，按照说明书加入其他组分配制成逆转录体系。梯度PCR仪中逆转录，程序：25℃10分钟，42℃30分钟，85℃5秒钟。
逆转录体系：
组分 体积
RNA Mix 8μL
2×TS Reaction Mix 10μL
TransScript RT/RI Enzyme Mix 1μL
gDNA Remover 1μL
总体积 20μL
qPCR检测基因表达：用试剂盒PerfectStart Green qPCR Super Mix(AQ601-04，北京全式金生物技术有限公司)进行qPRCR。具体地说，向含有cDNA的20μL逆转录体系中加入180μL DNase/RNase Free Water(InvitrogenTM)，由此得到cDNA模板液。取荧光定量96孔板，按照说明书，每孔加入以下表中所示组成，形成20μL反应体系。96孔板加完样品后使用封口膜封好后，离心机4000r.p.m.，4℃离1分钟后即可上机。PCR扩增参数为：94℃变性30秒；然后每轮94℃5秒、60℃15秒、72℃15秒，循环40次。得到Ct值。
反应体系：
组分 体积
cDNA模板 3μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
2×TransScript Top/Tip Green qPCR SurperMix 10μL
DNase/RNase-Free蒸馏水 6μL
总体积 20μL
PCR引物：
Figure BDA0002589524630000121
Figure BDA0002589524630000131
数据计算与处理：
Ct值代表PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数，则此时的模版数为：M×2Ct，(M代表初始模版数量)。
假设，M1、Ct1代表目的基因(即衰老基因或者干性基因)，M2、Ct2代表内参基因(一般认为在间充质干细胞中恒定表达的基因，本实施例采用的是GAPDH基因)，则：
M1×2Ct1＝M2×2Ct2
M1/M2＝2Ct2/2Ct1＝2-(Ct1-Ct2)
则，M1/M2即2-(Ct1-Ct2)可以去除细胞数量差异的影响，准确反应同一细胞数量下目的基因初始模版的数量。
人毛囊间充质干细胞干性基因表达量的检测结果见表1。从表中可见，无论是P3代、还是P5代，在低氧动态压培养条件下的毛囊间充质干细胞的4种干性基因表达量均是最高的。
表1
Figure BDA0002589524630000141
人宫膜间充质干细胞衰老基因表达量的检测结果见表2。从表中可见，无论是P6代、还是P8，在低氧动态压培养条件下的宫膜间充质干细胞的3种衰老基因表达量均是最低的。
表2
Figure BDA0002589524630000142
综上，低氧和动态压培养条件有利于间充质干细胞的干性基因表达上调，衰老基因下调。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表
<110> 上海我武干细胞科技有限公司
<120> 干细胞培养方法
<130> 204237 1CNCN
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ttcgtcatgg gtgtgaacca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ctgtggtcat gagtccttcc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gaggttggct ctgactgtac c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tccgtcccag tagattacca c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
tcactgtctt gtacccttgt gc 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物
<400> 6
ggattagggc ttcctcttgg 20
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<211> 19
<212> DNA
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<223> 引物
<400> 7
atggagcctt cggctgact 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gtaactattc ggtgcgttgg g 21
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<400> 9
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gggaatggac cttgtatag 19
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<212> DNA
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gcaaagctcc taccgtacca 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gggagaagac actgcgtca 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ggaagcactg ggggaagt 18

Claims (16)

1. 一种干细胞的培养方法，其特征在于，包括在一个大气压之外加有额外压力的气体环境中培养干细胞的步骤，其中所述额外压力在60-140 mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动，所述周期性波动的频率为12-20次/分钟，所述气体环境中的氧气浓度为2%-7%；其中，所述干细胞不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述额外压力在70-120 mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述额外压力在75-115 mmHg范围内做正弦或类正弦变化的周期波动。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述周期性波动的频率为13-18次/分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述周期性波动的频率为14-17次/分钟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述周期性波动的频率为14-16次/分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述周期性波动的频率为13-15次/分钟。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气体环境中的氧气浓度为2%-5%。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气体环境中的氧气浓度为4%-7%。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气体环境中的氧气浓度为5%-7%。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤中的干细胞是原代干细胞和/或经传代的干细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞是人干细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞选自人脂肪间充质干细胞、人宫膜间充质干细胞、人毛囊间充质干细胞和人脐带间充质干细胞。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为36.5-37.5℃。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃。
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