CN104560875B - 一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用，属于细胞生物学和神经生物学技术领域。本发明所提供的方法为将哺乳动物三叉神经组织置于含有L‑15培养液的培养皿上进行清洗处理，剪碎后依次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶‑EDTA进行消化处理，细胞筛过滤后对滤液进行密度梯度离心，悬浮后接种于包被好的细胞培养装置内，用基础神经培养基进行培养。本发明方法大大降低了组织处理过程中对细胞的损伤，去除了消化过程中大量细胞碎片以及其他细胞类型等杂质干扰，大大提高了细胞的纯度，可获百万个较纯的三叉神经细胞，提高了细胞产量和质量，适用于哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养。

Description

一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用，属于细胞生物学和神经生物学技术领域。

背景技术

神经元的分离培养，是研究神经元生长因子、轴突向外生长、分化以及感觉生理学等的常用技术。尽管分离胚胎或新生动物神经细胞形成突触之前的神经元要相对容易一些，但胚胎神经元与成熟神经元在电生理学、发育、再生等方面有着不同的特性。因此对成熟神经细胞的培养在很多研究中是非常必要的。但在神经元原代培养过程中一直存在着细胞产量和质量都不高的问题。

目前，现有的三叉神经细胞原代培养技术多为胶原酶消化法，其在培养过程中，有些细节考虑不够全面，如：在没有CO₂平衡调节装置时培养液的稳定性不好，处理过程对组织或细胞的影响较大，对细胞损伤较大，消化不够彻底，杂质细胞较多，培养所得细胞不纯等问题，因此细胞的产量和质量都不高。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法，该方法是将哺乳动物三叉神经组织置于含有L-15培养液的培养皿上进行清洗处理，剪碎后依次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，细胞筛过滤后对滤液进行密度梯度离心，悬浮后接种于包被好的细胞培养装置内，用基础神经培养基进行培养。

所述方法步骤如下：

1)将所得的哺乳动物三叉神经组织置于含L-15培养液的培养皿上清洗后剪碎，获得预处理三叉神经组织；

2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织依次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，经过中和、离心和悬浮后用细胞筛过滤去除组织碎片，获得细胞悬浮液；

3)步骤2)所得细胞悬浮液，对滤液进行密度梯度离心，去除细胞碎片和杂细胞，获得纯化细胞；

4)将步骤3)所得纯化细胞用基础神经培养基悬浮，然后接种到已经包被好的细胞培养装置内，在培养箱中用基础神经培养基进行培养，培养24-48h获得三叉神经节细胞。

步骤1)所述哺乳动物为除胚胎期和新生期以外的哺乳动物。

优选地，步骤1)所述哺乳动物为8-12周龄的大鼠。

步骤2)所述消化处理过程为：(1)将步骤1)所得的预处理三叉神经组织用5mL经L-15培养液稀释的200U十一型胶原酶于37℃下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织；(2)向混合物中加入500μL的浓度为0.25％的胰蛋白酶，37℃水浴中继续消化20分钟，离心后收集消化的组织和细胞；(3)加入5mL经L-15培养液稀释的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后于37℃水浴继续消化20分钟；(4)加入10mL含10％胎牛血清的神经培养基，中和消化酶，离心得到沉淀细胞；(5)加入200μL含2％B27的神经培养基，悬浮细胞，再用200μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，用2mL的含2％B27神经培养基进行冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液。

步骤3)所述密度梯度离心为Optiprep密度梯度离心，过程为：将OPTI和Nb+B27培养液依次按照173:827，124:876，99:901，74:926的体积比进行混合，得到四个密度梯度液，按顺序依次将其缓慢加至15mL的离心管内，然后将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩余液体。

步骤4)所述包被培养装置是在培养的前一天，向培养装置内加入无菌多聚赖氨酸溶液，包被30分钟，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。

步骤4)所述悬浮是加入10mL基础神经培养基，1000rpm离心5min，收集细胞后用100μL神经培养液悬浮；

所述培养的条件为37℃、5％CO₂及饱和湿度。

所述方法具体步骤为：

1)取出大鼠的三叉神经，置于含L-15培养液的培养皿上，然后进行清洗处理，去除黏附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三叉神经组织；

2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织用5mL经L-15培养液稀释后得到的200U十一型胶原酶在37℃下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织；

3)向步骤2)所得混合物中加入500μL浓度为0.25％的胰蛋白酶，37℃水浴中继续消化20分钟，离心，收集消化的组织和细胞，倒掉上清液；

4)向步骤3)所得组织和细胞中加入5mL经L-15培养液稀释后得到的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后37℃水浴继续消化20分钟，加入10mL含10％胎牛血清的神经培养基，中和消化酶，离心得到沉淀细胞，弃掉上清液；

5)向步骤4)所得沉淀细胞中加入200μL含2％B27的神经培养基，悬浮细胞；

6)用200μm孔径的细胞筛过滤步骤5)所得悬液，用2mL的含2％B27基础神经培养基冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液；

7)将OPTI和Nb+B27培养液依次按照173:827，124:876，99:901，74:926的体积比进行混合，得到四个密度梯度液，按顺序依次将各梯度液缓慢加至15mL的离心管内，然后将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩余液体；

8)向步骤7)所得液体中加入10mL基础神经培养基，1000rpm离心5min，收集细胞，用100μL神经培养液悬浮；

9)将步骤8)所得悬浮液均匀地接种到步骤9)所得的已包被的细胞培养装置内，在培养箱中用基础神经培养基于37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养24-48h后获得三叉神经节细胞；

所述已包被的细胞培养基装置，是在培养的前一天向培养装置内加入无菌多聚赖氨酸溶液，包被处理30分钟，洗出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。本发明所述方法适用于哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养。本发明有益效果：

1.本发明优化了组织的消化方法，取缔了原有的蛋白酶消化过程，采用胶原酶和胰蛋白酶联合消化，其消化过程和消化时间可使组织消化比较彻底，同时不使用吹吸的方式来进一步分散细胞，对细胞的损伤大大减小。

2.本发明在对组织体外清洗、消化以及分离细胞的过程中使用了L-15培养基，能够保证没有CO₂平衡调节装置的条件下培养液的稳定性，提供了一个即使无CO₂平衡调节，也能保证稳定、对细胞或组织损伤很小的液体环境，稳定了渗透压、PH值等外部培养条件，大大减小了处理过程中对组织或细胞的影响。

3.现有培养技术多没有取出杂质的过程，本发明首先对消化后组织进行过滤，去除大块杂质，再利用密度梯度离心的方法富集细胞，去除了消化过程中产生的大量的细胞碎片以及其他细胞类型等杂质的干扰，使培养所得细胞更纯，细胞培养的成功率更高。

4.利用本发明培养方法可以获得百万个左右较纯的三叉神经细胞，提高了细胞产量和质量，解决了现有技术的不足，可以满足药理学、电生理学、发育、再生以及神经毒理学等各方面的研究。

附图说明

图1三叉神经细胞相差显微镜图。

图2三叉神经细胞荧光相差显微镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：SD大鼠三叉神经细胞分离培养

1.包被培养板(皿)

在培养的前一天，向要用的培养板(皿)内加入适量的(盖住皿底即可)市售的无菌的多聚赖氨酸溶液，包被30分钟左右，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干，备用。

2.分离三叉神经组织的细胞

将试验用的150-250g的SD大鼠的双侧三叉神经取出，置于含冷的Hank,s平衡盐溶液中，进行清洗处理，去除粘附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三叉神经组织。

首先，用含1.5g/L XI-s胶原酶的HBSS消化，37℃，30分钟，然后用20ug/ml的DNaseI继续消化10分钟，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基中和消化酶，离心得到沉淀细胞，弃掉上清液。

用DMEM-F12培养基清洗沉淀2次，用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液悬浮，用移液器反复吹打，悬浮的细胞接种到包被好的培养装置，进行培养。

实施例2：大鼠三叉神经节细胞的体外分离培养

1.包被培养板(皿)

在培养的前一天，向要用的培养板(皿)内加入适量的(盖住皿底即可)市售的无菌的多聚赖氨酸溶液，包被30分钟左右，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干，备用。

2.分离三叉神经组织的细胞

将试验用的8-12周龄大鼠的三叉神经取出，置于含L-15培养液的培养皿上，上述过程在冰上进行操作，然后进行清洗处理，去除粘附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三叉神经组织。

首先，用5mL经4.5mL的L-15培养液稀释所得的200U十一型胶原酶处理预处理三叉神经组织，在37℃下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织。其次，向混合物中加入500uL的浓度为0.25％的胰蛋白酶，在37℃水浴中继续消化20分钟，离心步，收集消化的组织和细胞，弃掉上清液。最后，加入5mL经4.5mL的L-15培养液稀释获得的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后37℃水浴继续消化20分钟，加入10mL含10％胎牛血清的神经培养基(neurobasal medium)，中和消化酶，离心得到沉淀细胞，弃掉上清液。

向上述步骤所得的沉淀细胞中加入200μL含2％B27的神经培养基(neurobasalmedium)，悬浮细胞，用200μm孔径的细胞筛过滤所得悬液，用2mL的含2％B27神经培养基(neurobasal medium)冲洗细胞筛，获得2.2mL细胞悬浮液。

3.纯化三叉神经组织的细胞

利用Optiprep密度梯度离心法纯化细胞。首先用4个1.5ml离心管按照表1分别配制密度梯度。

表1密度梯度液配制

分别用漩涡器混匀以上四管。分别按顺序将1、2、3、4缓慢加入15mL离心管内，最后将2mL细胞悬液也缓慢加到密度梯度液的上面。然后800的离心力下离心15分钟，弃掉离心管中的上两层液体，收集剩余液体，再向所收集的液体中加入10mL基础神经培养基(neurobasal medium)，1000rpm下离心5min，收集细胞。

4.细胞的接种培养

收集的细胞用100μL神经培养液悬浮，以适当的浓度均匀接种于步骤1中准备的培养装置中，在培养箱中用基础神经培养基(neurobasal medium)在37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下进行培养。24-48h后观察细胞的生长状况(图1-2)。

将实施例1和实施例2培养方法的效果进行比较，比较结果如表2所示：

表2实施例1和实施例2培养方法效果的对比

	获得细胞数量/个	细胞纯度
			实施例1	(2～3)×105	细胞碎片、胶质细胞等杂细胞较多
实施例2	(1～2)×106	细胞碎片、杂细胞较少

从表2可以看出，利用本发明所提供的方法，可以获得(1～2)×10⁶个细胞，可达百万个细胞，而现有方法仅能获得(2～3)×10⁵，仅几十万个细胞，本发明方法获得细胞数量显著高于现有方法，并且本发明方法获得细胞中细胞碎片、杂细胞较少，而传统方法获得的细胞碎片、胶质细胞等杂细胞较多，因此，本发明方法在获得的细胞数量细胞的纯度等方面明显优于现有方法。本发明由于控制了体外培养的渗透压、pH值等外部培养条件，采用了胶原酶和胰蛋白酶联合消化的方法，在组织处理过程中大大降低了对分离细胞的损伤，利用密度梯度离心等方法富集细胞，去除了消化过程中产生的大量的细胞碎片以及其他细胞类型等杂质的干扰，提高了细胞产量和质量。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种哺乳动物三叉神经节细胞的体外分离培养方法，其特征在于：将哺乳动物三叉神经组织置于含有L-15培养液的培养皿上进行清洗处理，剪碎后依次用经L-15培养液稀释的十一型胶原酶、胰蛋白酶和经L-15培养液稀释的胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，细胞筛过滤后对滤液进行密度梯度离心，悬浮后接种于包被好的细胞培养装置内，用基础神经培养基进行培养。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)将所得的哺乳动物三叉神经组织置于含L-15培养液的培养皿上清洗后剪碎，获得预处理三叉神经组织；

2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织依次用十一型胶原酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，经过中和、离心和悬浮后用细胞筛过滤去除组织碎片，获得细胞悬浮液；

3)步骤2)所得细胞悬浮液，对滤液进行密度梯度离心，去除细胞碎片和杂细胞，获得纯化细胞；

4)将步骤3)所得纯化细胞用基础神经培养基悬浮，然后接种到已经包被好的细胞培养装置内，在培养箱中用基础神经培养基进行培养，培养24-48h获得三叉神经节细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述哺乳动物为除胚胎期和新生期以外的哺乳动物。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述哺乳动物为8-12周龄的大鼠。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述消化处理过程为：(1)将步骤1)所得的预处理三叉神经组织用5mL经L-15培养液稀释的200U十一型胶原酶于37℃下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织；(2)向混合物中加入500μL的浓度为0.25％的胰蛋白酶，37℃水浴中继续消化20分钟，离心后收集消化的组织和细胞；(3)加入5mL经L-15培养液稀释的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后于37℃水浴继续消化20分钟；(4)加入10mL含10％胎牛血清的神经培养基，中和消化酶，离心得到沉淀细胞；(5)加入200μL含2％B27的神经培养基，悬浮细胞，再用200μm孔径的细胞筛过滤细胞悬液，用2mL的含2％B27神经培养基进行冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述密度梯度离心为Optiprep密度梯度离心，过程为：将OPTI和Nb+B27培养液依次按照173:827，124:876，99:901，74:926的体积比进行混合，得到四个密度梯度液，按顺序依次将其缓慢加至15mL的离心管内，然后将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩余液体。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述包被培养装置是在培养的前一天，向培养装置内加入无菌多聚赖氨酸溶液，包被30分钟，吸出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述悬浮是加入10mL基础神经培养基，1000rpm离心5min，收集细胞后用100μL神经培养液悬浮；所述培养的条件为37℃、5％CO₂及饱和湿度。

9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为：

1)取出大鼠的三叉神经，置于含L-15培养液的培养皿上，然后进行清洗处理，去除黏附的其他组织，用眼科剪或手术刀将其剪碎，获得预处理三叉神经组织；

2)将步骤1)所得预处理三叉神经组织用5mL经L-15培养液稀释后得到的200U十一型胶原酶在37℃下消化90分钟，消化时每10-15分钟摇动一次，使胶原酶能够充分而均匀地消化组织；

3)向步骤2)所得混合物中加入500μL浓度为0.25％的胰蛋白酶，37℃水浴中继续消化20分钟，离心，收集消化的组织和细胞，倒掉上清液；

4)向步骤3)所得组织和细胞中加入5mL经L-15培养液稀释后得到的胰蛋白酶-EDTA，摇匀后37℃水浴继续消化20分钟，加入10mL含10％胎牛血清的神经培养基，中和消化酶，离心得到沉淀细胞，弃掉上清液；

5)向步骤4)所得沉淀细胞中加入200μL含2％B27的神经培养基，悬浮细胞；

6)用200μm孔径的细胞筛过滤步骤5)所得悬液，用2mL的含2％B27基础神经培养基冲洗细胞筛，获得细胞悬浮液；

7)将OPTI和Nb+B27培养液依次按照173:827，124:876，99:901，74:926的体积比进行混合，得到四个密度梯度液，按顺序依次将各梯度液缓慢加至15mL的离心管内，然后将2mL细胞悬浮液缓慢加到密度梯度液的上面，800g离心15min，弃掉上两层液体，收集剩余液体；

8)向步骤7)所得液体中加入10mL基础神经培养基，1000rpm离心5min，收集细胞，用100μL神经培养液悬浮；

9)将步骤8)所得悬浮液均匀地接种到步骤9)所得的已包被的细胞培养装置内，在培养箱中用基础神经培养基于37℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养24-48h后获得三叉神经节细胞；

所述已包被的细胞培养基装置，是在培养的前一天向培养装置内加入无菌多聚赖氨酸溶液，包被处理30分钟，洗出多余的多聚赖氨酸，在生物安全柜内过夜晾干备用。