JP2023544324A

JP2023544324A - 人工多能性幹細胞のための改善されたリプログラミング、維持及び保存

Info

Publication number: JP2023544324A
Application number: JP2023519777A
Authority: JP
Inventors: ライイー－シン; バラメールバーラム; アブジャローアラムゼイ; スーホイ－ティン
Original assignee: フェイトセラピューティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-10-23
Also published as: AU2021353586A9; CA3193977A1; WO2022072883A1; KR20230078712A; MX2023003818A; IL301733A; EP4222249A4; EP4222249A1; AU2021353586A1; CN116348592A; US20240034999A1

Abstract

高効率で所望の特性を有するｉＰＳＣを提供するために、小分子支持ベクターシステムを使用して非多能性細胞のリプログラミングを誘導するための方法及び組成物が提供される。提供されたリプログラミング方法及び組成物を使用するリプログラミング細胞及びｉＰＳＣ集団又はクローン細胞株も提供される。更に、細胞のゲノム安定性を達成しながらｉＰＳＣを維持及び保存するための組成物及び方法が提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１０月０２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８７，１１９号の優先権を主張し、その開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本開示は、広く、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞）を生成する分野に関する。より詳細には、本開示は、より高い効率及び増加した信頼性を有する望ましい特性を有するフットプリントフリーｉＰＳＣを得るためのプラスミドベクターの組み合わせの使用に関する。

ｉＰＳＣは、本来、重要な転写因子を発現するための組み込みウイルスシステムを使用して作製された。ポリシストロニックシステム及び誘導性システムを含むレトロウイルスシステム及びレンチウイルスシステムは、現在、ｉＰＳＣ生成において成功裏に用いられている。しかしながら、挿入変異誘発及びｉＰＳＣ分化後の外因性遺伝子再活性化の潜在能力に起因する永続的なゲノム変化は、これらの方法によって生成された細胞のその後の薬物スクリーニング及び治療適用に潜在的な問題を提示し得る。実際に、同じウイルスシステムを使用して生成されたｉＰＳＣクローン間の顕著な差が報告されており、分化ニューロスフェアとして移植された場合、クローンの大部分がげっ歯類において腫瘍を形成する。研究は、同じウイルス法を使用して生成されたｉＰＳＣが、いったん分化すると異なって挙動し得ることを示唆している。異所性遺伝子組み込み部位における差異は、異なる挿入変異誘発及び導入遺伝子発現のエピジェネティック調節をもたらし得る。組み込みシステムを含むｉＰＳＣ作製方法では、多くのクローンを誘導し、スクリーニングして、多能性状態及び分化状態の両方で安定なクローンを同定する必要があり得る。

細胞療法製造プロセスにおける多くの重要な態様の中で、細胞増殖及び凍結保存は、重要な関心領域として特定されており、細胞生存率及び機能性は、凍結解凍サイクル中に大いに影響を受け、ｉＰＳＣ分化に由来するエフェクター細胞のインビボ細胞有効性及び持続性は、ｉＰＳＣ分化後のエフェクター細胞増殖段階中に複雑に影響を受ける。

上記を考慮すると、好ましくは多能性の「ナイーブ」又は「基底」状態で、好ましくは規定された培養条件で、フットプリントフリーｉＰＳＣの均質な集団を効率的に産生することが、当技術分野において実質的に必要とされている。多能性の「ナイーブ」又は「基底」状態は、高いクローン性、持続可能な自己複製、最小限の自発的分化及びゲノム異常、並びに解離した単一細胞としての高い生存率を含むがこれらに限定されない品質をｉＰＳＣに付与する。本開示による実施形態の方法及び組成物、特に新規培養培地及びプラスミドベクターシステムは、この必要性に対処し、細胞リプログラミングの分野における他の関連する利点を提供する。

宿主ゲノム組み込みの確率を低下させるために外因性遺伝子の存在を最小限に抑える効率的であるが一過性かつ一時的な発現システムを使用することによって、リプログラミングの誘導のために非多能性細胞に導入される外因性ＤＮＡを含むことなくｉＰＳＣを作製するのに効率的な方法及び組成物を提供することが本開示の目的である。本開示の目的は、多能性及び／又は高クローン性の「ナイーブ」又は「基底」状態を有するｉＰＳＣを効率的に作製するための組み合わせプラスミドシステムを提供することである。基底状態多能性を有するｉＰＳＣは、単一細胞解離ｉＰＳＣの長期生存率及び遺伝的安定性を可能にし、したがって、単一細胞ソーティング及び／又は枯渇、クローンｉＰＳＣ標的ゲノム編集、並びにｉＰＳＣの同種集団の指向性再分化などのバンキング及び操作に適したクローンｉＰＳＣ株を生成することを可能にする。したがって、本開示の目的はまた、ポリヌクレオチド挿入、欠失、及び置換を含む、選択された部位における１つ又はいくつかの遺伝子改変を含み、その改変が、分化、脱分化、リプログラミング、増殖、継代、及び／又は移植後にその後に誘導される細胞において保持され、機能的なままである、単一細胞由来ｉＰＳＣクローン株又はそれからの誘導細胞を生成するための方法及び組成物を提供することである。

本出願の一態様は、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）産生のための組成物（例えば、ＦＭＭ２）であって、組成物が、（ｉ）ＴＧＦβファミリータンパク質と、（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子と、を含み、組成物が、ＴＧＦβ阻害剤を含まず、組成物が、長期ｉＰＳＣ維持においてｉＰＳＣ多能性及びゲノム安定性を改善するのに有効である、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、長期ｉＰＳＣ維持が、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離、解離したｉＰＳＣの単一細胞ソーティング、ｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖、クローンｉＰＳＣマスター細胞バンク（master cell bank、ＭＣＢ）凍結保存、ｉＰＳＣＭＣＢの解凍、及び必要に応じてｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルを含む段階のうちの１つ以上を含むか、又はＴＧＦβファミリータンパク質が、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離時、又はｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖時、若しくはその間の任意の段階で、組成物に必要に応じて添加されるか、又はＭＥＫ阻害剤及び／若しくはＷＮＴ活性化因子が、非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするためのリプログラミング組成物に使用される量の３０～６０％の量にある。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質が、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、Ｎｏｄａｌ、及びそれらの機能的バリアント若しくは断片のうちの少なくとも１つを含み、かつ／又はＷＮＴ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は非多能性細胞が、Ｔ細胞を含むか、又はリプログラミング組成物が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＴＧＦβ阻害剤、及び必要に応じてＨＤＡＣ阻害剤を含み、ＴＧＦβ阻害剤及びＨＤＡＣ阻害剤が、リプログラミング中の特定の段階でリプログラミング組成物に含まれる。

いくつかの実施形態では、改善された長期ｉＰＳＣ多能性は、組成物の接触なしのｉＰＳＣと比較して、低減された多能性復帰又は低減された自発的分化によって示され、改善されたゲノム安定性は、組成物の接触なしのｉＰＳＣと比較して、ゲノム異常における低い傾向によって示される。いくつかの実施形態では、改善されたゲノム安定性は、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｉＰＳＣを更に含み、必要に応じて、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのゲノム編集を含む。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ維持は、操作されたｉＰＳＣプールを得るためのｉＰＳＣの遺伝子編集と、操作されたｉＰＳＣプールの単一細胞ソーティングと、操作されたｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖と、クローン操作されたｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存と、操作されたｉＰＳＣＭＣＢの解凍と、必要に応じて操作されたｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルと、を更に含み、操作されたｉＰＳＣが、少なくとも１つのゲノム編集を含む。

別の態様では、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）産生のための組成物（例えば、ＦＲＭ２）であって、（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子と、（ｉｉ）ＨＤＡＣ阻害剤と、（ｉｉｉ）ＴＧＦβ阻害剤と、を含み、組成物が、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有するｉＰＳＣを得るために非多能性細胞のリプログラミングを改善するのに有効であり、必要に応じて、組成物への（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の添加は、リプログラミング効率の増加のために非多能性細胞のリプログラミング中に段階特異的である。いくつかの実施形態では、非多能性細胞のリプログラミングが、体細胞トランスフェクション（０日目）、外因性遺伝子発現、ヘテロクロマチンの増加、体細胞同一性の喪失、及びｉＰＳＣコロニー形成を含む１つ以上の段階を含むか、又は、ＨＤＡＣ阻害剤の添加は、必要に応じて、クロマチン再構築時、若しくは２～３日目頃（トランスフェクション後）であるか、又は、ＴＧＦβ阻害剤の添加は、必要に応じて、体細胞同一性の喪失時、又は６～８日目頃（トランスフェクション後）であり、リプログラミングにおける１つ以上の段階が、細胞形態変化及び／又はマーカー遺伝子プロファイリングによって示される。

いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸（valproic acid、ＶＰＡ）又はその機能的バリアント若しくは誘導体を含み、かつ／あるいはＷＮＴ活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は非多能性細胞が、Ｔ細胞を含むか、いくつかの実施形態では、確立された多能性が、基底状態多能性を含み、かつ／又は確立された多能性が、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は改善されたゲノム安定性が、組成物の接触なしのｉＰＳＣと比較してゲノム異常におけるより低い傾向によって示され、かつ／又は増加したリプログラミング効率が、リプログラミング中に組成物の接触なしで得られたｉＰＳＣプールのパーセンテージよりも、リプログラミング後のｉＰＳＣプールにおける多能性マーカー遺伝子を発現する細胞の高いパーセンテージによって示される。

更に別の態様では、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生する方法であって、ｉＰＳＣの集団を凍結保存するステップを含み、ｉＰＳＣを本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＲＭ２）と接触させ、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が凍結保存中に維持され、必要に応じて、均質なｉＰＳＣを含むｉＰＳＣの集団をクローンｉＰＳＣ単一細胞から増殖させる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、クローンｉＰＳＣの集団を得るために単一細胞ｉＰＳＣクローンを増殖させるステップを更に含み、ｉＰＳＣは、本明細書に記載される組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触しており、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、増殖中に維持される。

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、解離したｉＰＳＣを単一細胞ソーティングして、単一細胞ｉＰＳＣクローンを得るステップを更に含み、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触しており、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性は、単一細胞ソーティング中に維持される。

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、ｉＰＳＣコロニーを単一細胞ｉＰＳＣに解離させるステップを更に含み、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触しており、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性は、ｉＰＳＣ単一細胞解離中に維持される。

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法は、非多能性細胞のリプログラミングから生成されたｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを得るステップを更に含む。

人工多能性幹細胞を産生する方法の種々の実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞からリプログラミングされるか、又はｉＰＳＣは、Ｔ細胞からリプログラミングされる。種々の実施形態では、多能性は、基底状態多能性を含み、かつ／又は多能性は、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又はゲノム安定性は、本明細書に記載される組成物の接触なしの当該ステップにおけるｉＰＳＣよりもゲノム異常における低い傾向を含む。

更に別の態様では、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、（ｉ）非多能性細胞に１つ以上のリプログラミング因子を移入して、細胞のリプログラミングを開始することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に細胞を本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＲＭ２）と十分な期間接触させ、それによって非多能性細胞をリプログラミングすることによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、移入するステップは、非多能性細胞に、（ｉ）１つ以上の第１のプラスミドであって、第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含まず、１つ以上の第１のプラスミドが、少なくともＯＣＴ４、又は少なくともＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（large T antigen、ＬＴａｇ）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入は、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、（ｉｉ）（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、第２のプラスミドが複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のプラスミドは、ＳＯＸ２及びＫＬＦの一方若しくは両方、又はＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを集合的に更に含む。

いくつかの実施形態では、接触させるステップは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の存在下で、細胞を培養することを更に含む。特定の実施形態では、接触させるステップは、（ａ）ステップ（ｉ）の後の細胞を、必要に応じて外因性リプログラミング因子発現の段階で、又はリプログラミング因子移入（０日目）後１～２日目に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子を含む組み合わせと接触させることと、（ｂ）必要に応じてクロマチン再構築の段階で、又はリプログラミング因子移入後２～３日目頃に、ステップ（ａ）の細胞をＨＤＡＣ阻害剤と接触させることと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を、必要に応じて体細胞同一性の喪失の段階で、又は６～８日目頃（トランスフェクション後）に、ＴＧＦβ阻害剤と接触させ、それによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を含み、当該段階が、細胞形態変化及び／若しくはマーカー遺伝子プロファイリングによって示され、並びに／又はｉＰＳＣが、フットプリントフリーであり、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有し、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングと比較してより高い効率で産生される。いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、確立された多能性は、基底状態多能性を含み、かつ／又は確立された多能性は、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は改善されたゲノム安定性は、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングからのｉＰＳＣよりもゲノム異常における低い傾向を含み、かつ／又は増加したリプログラミング効率が、リプログラミング中に組成物の接触なしで得られたｉＰＳＣプールのパーセンテージよりも、リプログラミング後のｉＰＳＣプールにおける多能性マーカー遺伝子を発現する細胞の高いパーセンテージによって示される。いくつかの実施形態では、改善されたゲノム安定性は、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を更に含む。

更に別の態様では、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生する方法であって、方法が、（ｉ）非多能性細胞に１つ以上のリプログラミング因子を移入して、細胞のリプログラミングを開始することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後の細胞を本明細書に記載される組成物（例えば、ＦＲＭ２）と十分な期間接触させ、それによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することであって、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が確立されている、生成することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のｉＰＳＣコロニーを解離したｉＰＳＣに解離することであって、ｉＰＳＣが、本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触している、解離することと、（ｉｖ）解離したｉＰＳＣをソーティングして、１つ以上の単一細胞ｉＰＳＣクローンを得ることであって、単一細胞ｉＰＳＣクローンが、本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触している、得ることと、必要に応じて、（ｖ）単一細胞ｉＰＳＣクローンを、本明細書に記載の組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触しているクローンｉＰＳＣ集団に増殖させることと、必要に応じて、（ｖｉ）クローンｉＰＳＣの集団を凍結保存することであって、凍結保存された集団が、本明細書に記載される組成物（例えば、ＦＭＭ２）と接触している、凍結保存することと、を含み、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、解離、ソーティング、増殖、凍結保存、又は解凍のステップ中に維持される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子は、少なくともＯＣＴ４を含む。

種々の実施形態では、移入するステップ（ｉ）は、非多能性細胞に、（ａ）１つ以上の第１のプラスミドであって、第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含まず、１つ以上の第１のプラスミドが、少なくともＯＣＴ４、又は少なくともＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、（ｂ）（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、第２のプラスミドが複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のプラスミドは、ＳＯＸ２及びＫＬＦの一方若しくは両方、又はＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを集合的に更に含む。

いくつかの実施形態では、接触させるステップ（ｉｉ）は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の存在下で、細胞を培養することを更に含む。特定の実施形態では、接触させるステップ（ｉｉ）は、（ａ）ステップ（ｉ）の後の細胞を、必要に応じて外因性リプログラミング因子発現の段階で、又はリプログラミング因子移入（０日目）後１～２日目に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子を含む組み合わせと接触させることと、（ｂ）必要に応じてクロマチン再構築の段階で、又はリプログラミング因子移入後２～３日目頃に、ステップ（ａ）の細胞をＨＤＡＣ阻害剤と接触させることと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を、必要に応じて体細胞同一性の喪失の段階で、又は６～８日目頃（移入後）に、ＴＧＦβ阻害剤と接触させ、それによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を更に含み、当該段階が、細胞形態変化及び／若しくはマーカー遺伝子プロファイリングによって示され、並びに／又はｉＰＳＣが、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有し、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングと比較してより高い効率で産生される。いくつかの実施形態では、方法は、（１）ソーティングステップ（ｉｖ）、増殖ステップ（ｖ）、及び凍結保存ステップ（ｖｉ）、並びに必要に応じて解離ステップ（ｉｉｉ）の細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子と接触させることであって、ＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子の一方又は両方の濃度が、ステップ（ｉｉ）における濃度の３０％～６０％である、接触させることと、（２）追加的に、増殖ステップ（ｖ）及び凍結保存ステップ（ｖｉ）、並びに必要に応じて解離ステップ（ｉｉｉ）及び／又はソーティングステップ（ｉｖ）の細胞を、ＴＧＦβファミリータンパク質と接触させることと、を更に含み、ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）における細胞が、ＴＧＦβ阻害剤又はＨＤＡＣ阻害剤のいずれとも接触していない。

種々の実施形態では、非多能性細胞は、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、多能性は、基底状態多能性を含み、かつ／又は多能性は、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又はｉＰＳＣは、少なくとも１つのゲノム編集を含み、かつ／又はゲノム安定性は、ゲノム異常における低い傾向を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム安定性は、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を更に含む。

いくつかの実施形態では、方法は、操作されたｉＰＳＣプールを得るためのｉＰＳＣの遺伝子編集と、操作されたｉＰＳＣプールの単一細胞ソーティングと、操作されたｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖と、クローン操作されたｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存と、操作されたｉＰＳＣＭＣＢの解凍と、必要に応じて操作されたｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルと、を更に含み、操作されたｉＰＳＣが、少なくとも１つのゲノム編集を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＴＴＡ、ＲＦＸ５、若しくはＲＦＸＡＰの欠失若しくは発現低下、又は、ｉＰＳＣ若しくはｉＰＳＣ由来エフェクター細胞における、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ１６、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、エンゲージャー、若しくはエンゲージャーのための表面トリガー受容体の発現の増加若しくは減少をもたらす。

更に別の態様では、本発明は、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、細胞株、クローン集団、又はそのマスター細胞バンクを含む組成物であって、ｉＰＳＣが、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、及びＴＧＦβファミリータンパク質の組み合わせと接触し、ｉＰＳＣが、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加を含み、必要に応じて、ｉＰＳＣが、次の特性：高クローン性、遺伝的安定性、及び基底状態多能性のうちの少なくとも１つを有する、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質は、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、Ｎｏｄａｌ、及びその機能的バリアント若しくは断片のうちの少なくとも１つを含み、かつ／又はＷＮＴ活性化因子はＧＳＫ３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、非多能性細胞のリプログラミングから生成される。いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ゲノム編集を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、組成物は培地を更に含み、培地はフィーダーフリーである。

更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、細胞株、クローン集団、又はそのマスター細胞バンクを提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ゲノム編集を少なくとも含む。

更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載される多能性細胞又は細胞株のインビトロ分化から得られた、誘導された非天然細胞又はその集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は免疫エフェクター細胞であり、必要に応じて、免疫エフェクター細胞が、ｉＰＳＣに含まれたゲノム編集を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血性幹細胞若しくは造血性前駆細胞、造血性多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又は免疫調節細胞を含む。いくつかの実施形態では、その天然細胞対応物と比較して、以下の特性：ヘテロクロマチンの全体的な増加、ミトコンドリア機能の改善、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメア伸長及び短いテロメアのパーセンテージの減少、老化細胞の割合の減少、並びに増殖、生存率、持続、又は記憶様機能のより高い潜在能力、のうちの少なくとも１つを含む若返り細胞である。

更に別の態様では、本発明は、細胞ベースの療法における適用のための多能性細胞の製造において使用するための組成物であって、本明細書に記載の方法によって産生された多能性細胞を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、多能性細胞は同種異系又は自己由来である。更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる多能性細胞を含む医薬用キットを提供する。更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載される人工多能性細胞又は本明細書に記載される、誘導された非天然細胞を含む医薬用キットを提供する。

本出願の更に別の態様は、非多能性細胞においてリプログラミングを開始するためのインビトロシステムであって、１つ以上の第１のプラスミドであって、１つ以上の第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はその誘導体をコードせず、１つ以上の第１のプラスミドは、ＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２、及びＬＴａｇをコードするポリヌクレオチドを集合的に含む、１つ以上の第１のプラスミドと、必要に応じて、（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を含む、インビトロシステムを提供する。いくつかの実施形態では、システムの第２のプラスミドは、高率の喪失を有し、第２のプラスミドによるＥＢＮＡの発現は、短命であり、一過性であり、一時的である。いくつかの他の実施形態では、システムは、核におけるＥＢＮＡ複製及び／又は連続的発現を提供しない。一実施形態では、システムは、短期間、かつ多能性細胞形態の出現及び内因性多能性遺伝子の誘導発現の前に、ＥＢＮＡの一過性／細胞質発現を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、システムは、短期間、かつ多能性細胞形態の出現及び内因性多能性遺伝子の誘導発現の前に、第１のプラスミドに含まれた１つ以上のリプログラミング因子の一過性／細胞質発現を可能にする。

システムの一実施形態では、第１のプラスミドの複製起点は、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、及びＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスからなる群から選択されるものである。いくつかの実施形態では、複製起点は、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（BK virus、ＢＫＶ）、ウシ乳頭腫ウイルス（bovine papilloma virus、ＢＰＶ）、又はエプスタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus、ＥＢＶ）からなる群から選択されるものである。特定の一実施形態では、複製起点は、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、又はそれに由来する。いくつかの他の実施形態では、システム中の第２のプラスミドのＥＢＮＡは、ＥＢＶベースである。いくつかの実施形態では、システムは、（ｉ）ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、及びＬ１ＴＤ１のうちの１つ以上、又は（ｉｉ）ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ、及びＺＩＣ３、を含むリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む１つ以上の第１のプラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、第１のプラスミド中のポリシストロニック構築物又は非ポリシストロニック構築物に含まれる。ポリシストロニック構築物の一実施形態では、それは、単一のオープンリーディングフレーム又は複数のオープンリーディングフレームを含む。システムが２つ以上の第１のプラスミドを含む実施形態では、各第１のプラスミドは、少なくとも１コピーのポリヌクレオチドによってコードされた同じ又は異なるリプログラミング因子を含み得る。いくつかの実施形態では、システムは、４つの第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドは、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによってコードされた同じ又は異なるリプログラミング因子を含む。システムが４つの第１のプラスミドを含む実施形態では、各第１のプラスミドは、それぞれＯＣＴ４及びＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＬＴａｇ、並びにＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのコピーを含む。

システムのいくつかの実施形態では、第１のプラスミドは、リプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、隣接するポリヌクレオチドが、自己切断ペプチド又はＩＲＥＳをコードするリンカー配列によって作動可能に接続されている。一実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａを含む群から選択される２Ａペプチドである。別の実施形態では、第１のプラスミド構築物に含まれた２Ａペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。システムのプラスミドが複数の２Ａを含む更に別の実施形態では、隣接する位置の２つの２Ａペプチドは異なる。システムのいくつかの他の実施形態では、第１及び第２のプラスミドはそれぞれ、リプログラミング因子及びＥＢＮＡの発現のための１つ以上のプロモーターを含み、１つ以上のプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、及び構成的、誘導的、内因的に調節される、又は一時的、組織、若しくは細胞型特異的である、他の適切なプロモーターのうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、第１及び第２のプラスミドはそれぞれ、ＣＡＧプロモーターを含む。

一態様では、本開示はキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ｉＰＳＣ作製のための第１の組成物及びｉＰＳＣ作製のための第２の組成物、並びに／又は（ｉｉ）ｉＰＳＣ作製のための第１の組成物及びｉＰＳＣ維持のための第２の組成物などの、本明細書に開示される１つ以上の組成物を含む。本明細書に記載のインビトロシステムを含むキットも提供される。

方法及び組成物を使用することの様々な目的及び利点は、本発明の特定の実施形態を例証及び例として示す添付の図面と併せて解釈される以下の説明から明らかになるであろう。

ＦＭＭにＴＧＦβファミリーのメンバー（例えば、アクチビンＡ、ＴＧＦβ及び／若しくはＮｏｄａｌ）を補充すること、並びに／又はＦＭＭ中のＭＥＫ及びＧＳＫ３阻害剤の濃度低下が、ｉＰＳＣの長期安定性を増強することを示す。図１Ａ．図は、長期ｉＰＳＣ培養のためのＦＭＭベースの培地の異なる製剤を試験するための例示的な実験設計を示す。ＦＭＭにＴＧＦβファミリーのメンバー（例えば、アクチビンＡ、ＴＧＦβ及び／若しくはＮｏｄａｌ）を補充すること、並びに／又はＦＭＭ中のＭＥＫ及びＧＳＫ３阻害剤の濃度低下が、ｉＰＳＣの長期安定性を増強することを示す。図１Ｂ．ｄｄＰＣＲ及び核型の概要は、図１Ａの実験設計を使用して試験した、Ｔ細胞ドナー１に由来する１つの操作されたクローン、及びＴ細胞ドナー２に由来する２つの操作されていないクローンから生じる。１０継代を超えてＥ８、ＦＭＭ又はＦＭＭ２中で維持された３つのＴｉＰＳＣクローンのＰＣＡ分析からの結果を示す。図２からの３つのＴｉＰＳＣクローンの重要な多能性マーカーのヒートマップを示し、共通の多能性マーカーは、試験した全ての条件において発現され（図３Ａ）、ナイーブ特異的マーカーの発現は、アクチビンＡの添加によって更に上昇する（図３Ｂ）。図２からの３つのＴｉＰＳＣクローンの重要な多能性マーカーのヒートマップを示し、共通の多能性マーカーは、試験した全ての条件において発現され（図３Ａ）、ナイーブ特異的マーカーの発現は、アクチビンＡの添加によって更に上昇する（図３Ｂ）。アクチビンＡを補充したＦＭＭがストレス誘導性ゲノム異常を防止することを示す概略図及びグラフ表示である。図４Ａは、ｉＰＳＣクローンのストレス（操作及び／又はスクリーニング／増殖）を誘導するための例示的な実験設計を示す。アクチビンＡを補充したＦＭＭがストレス誘導性ゲノム異常を防止することを示す概略図及びグラフ表示である。図４Ｂは、ＦＭＭ及びＦＭＭ２（ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ）を使用した、得られたｉＰＳＣ集団における異常細胞の比較を示す。アクチビンＡを補充したＦＭＭがストレス誘導性ゲノム異常を防止することを示す概略図及びグラフ表示である。図４Ｃは、ＦＭＭ及びＦＭＭ２（ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ）を使用して得られたｉＰＳＣ集団における凍結保存後の異常クローンの比較を示す。ｉＰＳＣ作製プロセスの初期に新しいＦＭＭ製剤を適用すると、ｉＰＳＣのゲノム安定性が改善されることを示す。図５Ａは、初代Ｔ細胞からのｉＰＳＣ生成のための例示的な実験設計を示す図である。ｉＰＳＣ作製プロセスの初期に新しいＦＭＭ製剤を適用すると、ｉＰＳＣのゲノム安定性が改善されることを示す。図５Ｂは、新しいＦＭＭ製剤と比較した、ＦＭＭを用いて生成されたｉＰＳＣクローンのゲノム安定性評価の結果を示す。Ｓｈｏｒｔ－ｌｉｖｅｄＴｒａｎｓｉｅｎｔａｎｄＴｅｍｐｏｒａｌＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ（ＳＴＴＲ）システムにおいて使用されるベクター１（１）、ベクター１（２）．．．ベクター１（ｎ）、ベクター１（ｎ＋１）、及びベクター２の例示的なＤＮＡ構築物を示す図である。ＳＴＴＲシステムへのバルプロ酸（valproic acid、ＶＰＡ）の添加がＳＴＴＲのリプログラミング効率を改善することを示す。図７Ａは、ＶＰＡ処理を伴う又は伴わないＳＴＴＲ２システムを使用してリプログラミングされたＴ細胞におけるｉＰＳＣ表面マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、及びＣＤ３０）の発現についてのフローサイトメトリー分析を示す。ＳＴＴＲシステムへのバルプロ酸（valproic acid、ＶＰＡ）の添加がＳＴＴＲのリプログラミング効率を改善することを示す。図７Ｂは、ＶＰＡ処理が、３人の異なるドナーに由来するＴ細胞のＳＴＴＲ２リプログラミングを増強することを示す。複数のドナーのＴ細胞に由来するＳＴＴＲ２誘導性の安定な多能性培養物を実証する。図８Ａは、２人の異なるドナーのＴ細胞からＳＴＴＲ２システムによって誘導されたｉＰＳＣコロニーの画像を示す。複数のドナーのＴ細胞に由来するＳＴＴＲ２誘導性の安定な多能性培養物を実証する。図８Ｂは、ｉＰＳＣ集団の割合が連続継代にわたって増加したことを示しており、複数のドナーに由来する安定な多能性培養物を示している。複数のドナーのＴ細胞に由来するＳＴＴＲ２誘導性の安定な多能性培養物を実証する。図８Ｃは、２人の異なるドナーのＴ細胞からのリプログラミングプールの代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す。同上。段階特異的培地を使用した改善されたリプログラミング及びｉＰＳＣ維持のための例示的なワークフローを示す図である。ＳＴＴＲ２システムを使用したＴ細胞のリプログラミングが、導入遺伝子を含まないｉＰＳＣクローンのロバストな生成をもたらしたことを示す。図１０Ａは、リプログラミングベクターの検出のためのＴａｑＭａｎプローブ（黒色バー）の位置の図を示す。ＳＴＴＲ２システムを使用したＴ細胞のリプログラミングが、導入遺伝子を含まないｉＰＳＣクローンのロバストな生成をもたらしたことを示す。図１０Ｂは、ＴａｑＭａｎアッセイからの平均Ｃｔ値の例を示す。陽性対照１は、複数の導入遺伝子組み込みを有するｉＰＳＣクローンである（ＥＢＮＡ１及びＰ２Ａについて陽性）。陽性対照２は、プラスミド骨格の組み込みを有する（ＫａｎＲについて陽性）。ＮＤ：検出されない。ＳＴＴＲ２システムを使用したＴ細胞のリプログラミングが、導入遺伝子を含まないｉＰＳＣクローンのロバストな生成をもたらしたことを示す。図１０Ｃは、２人の異なるドナーのＴ細胞に由来するＳＴＴＲ２クローンのベクタークリアランス結果の概要を示す。ｉＰＳＣ表面マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１及びＣＤ３０）の均一な発現を示す、ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイルを実証する。ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣクローンが、３つ全ての胚葉を表す細胞型に分化する高い傾向を維持することを実証する。図１２Ａは、示された系統マーカー（内胚葉については膵臓前駆細胞マーカーＳＯＸ１７、中胚葉については間葉マーカーＣＤ５６、外胚葉については神経前駆細胞マーカーＳＯＸ２）の発現を示す。ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣクローンが、３つ全ての胚葉を表す細胞型に分化する高い傾向を維持することを実証する。図１２Ｂは、従来のエピソームシステムを使用して生成された対照ｉＰＳＣと同様に、ＳＴＴＲ２生成ｉＰＳＣが成熟Ｔ細胞に分化したことを実証する、示された時点でのフローサイトメトリー分析を示す。同上。ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣクローンが、３つ全ての胚葉を表す細胞型に分化する高い傾向を維持することを実証する。図１２Ｃは、ＳＴＴＲ２により生成されたｉＰＳＣ奇形腫において形成された３つの胚葉のそれぞれからの組織切片の画像を提供する。多能性表面マーカーの均一な発現を示す、ＳＴＴＲ２により生成され、ＣＡＲにより操作されたｉＰＳＣのフローサイトメトリープロファイルを実証する。ＣＡＲにより操作されたＳＴＴＲ２により生成されたｉＰＳＣに由来するＴ細胞の表現型及び機能特性を実証する。ＣＡＲにより操作されたＳＴＴＲ２により生成されたｉＰＳＣに由来するＴ細胞の表現型及び機能特性を実証する。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１又は１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。

代替（例えば、「又は」）の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。「及び／又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの、およそ、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

本明細書で使用されるとき、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％、又はそれ以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。

本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質又はその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）組成物に含まれるが低密度であり機能的に不活性であることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。

本明細書で使用されるとき、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された細胞、又は細胞の集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない。この用語は、例えば、組織、生検の天然環境で見られるように、一部又は全ての成分から取り除かれた細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、培養物又は細胞懸濁液などの環境で見出されるため、少なくとも１つ、いくつか、又は全ての成分から取り出された細胞を含む。したがって、単離された細胞は、天然で見出される場合、又は非天然の環境で増殖、保管、又は存続する場合、他の物質、細胞、又は細胞集団を含む少なくとも１つの成分から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞、実質的に純粋な細胞、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞又はその集団を、環境中の他の物質又は細胞から分離することから、又は環境から１つ以上の他の細胞集団又は亜集団を取り除くことから取得することができる。

本明細書中で使用されるとき、「精製する」などの用語は、純度を増加することをいう。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％に増加させることができる。

本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるだろう。特定の実施形態では、「含む（include）」、「有する」、「含む（contain）」、及び「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。

「～からなる（consisting of）」とは、「～からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。

「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間若しくは７２時間又はそれ以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。ある特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、そしてエクスビボ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、ある特定の実施形態では、この用語はエクスビボと互換可能に使用できる。

「インビボ」という用語は、一般に、生体内部で起こる活動を指す。

本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「脱分化」又は「細胞能力の増加」又は「発生能力の増加」という用語は、細胞の多能性を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法又はプロセスを指す。例えば、細胞多能性が増加した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。「リプログラミング細胞」は、リプログラミングされた細胞とは対照的に、多能性状態へのリプログラミング／脱分化を受け、過渡的な形態（すなわち、形態の変化）を示すが、多能性幹細胞の形態又はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、ＣＤ３０及び／若しくはＣＤ５０などの安定な内因性多能性遺伝子発現を含む、多能性細胞の特徴を有しない非多能性細胞を指す。「リプログラミング細胞」の移行形態は、リプログラミング誘導前の出発非多能性細胞から、並びに胚性幹細胞ホールマーク形態を有するリプログラミング細胞から、細胞を区別する。例えば、線維芽細胞をリプログラミングする場合、リプログラミング細胞の形態学的変化はＭＥＴ（間葉から上皮への移行）を含む。当業者は、リプログラミングするように誘導された様々な型の体細胞について、そのような移行形態を容易に理解し、同定する。いくつかの実施形態では、リプログラミング細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の日であるが、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、４０日以下、又はその間の任意の日数にわたってリプログラミングするように誘導された中間細胞であり、細胞は、自己維持又は自立多能性状態に入っていない。非多能性細胞は、細胞に１つ以上のリプログラミング因子が導入された場合にリプログラミングするように誘導される。１、２、３、又は４日間リプログラミングするように誘導されたリプログラミング細胞は、リプログラミング因子の形質導入の１、２、３、又は４日後の細胞である（形質導入の日は０日目である）。リプログラミング因子の外因性発現に曝露される前の体細胞とは異なり、リプログラミング細胞は、リプログラミングプロセス内で進行して安定な多能性状態に達することができ、十分な期間が与えられる限り、外因性発現リプログラミング因子が存在しなくてもリプログラミングされた細胞になる。

本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、幹細胞が、分化した成人、新生児又は胎児細胞から産生された、３つの全ての胚葉又は真皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の全ての組織に分化できる細胞に誘導又は変更された（すなわちリプログラミングされた）ことを意味する。

本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生時に３つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての誘導体を発生させる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与しない、かつ、全能性ではない。

本明細書で使用されるとき、「多分化能幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞に分化するが、３つ全てには分化しない発生潜在能力を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多分化能細胞は当該技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば造血性幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が所与の系統での多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多分化能造血性細胞は、多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生潜在能力の程度を有する細胞の状態を指す。

本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、生体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞（すなわち、胚そのもの）の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全な又は部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までの範囲に及ぶ一連の発生能である。

多能性は、細胞の多能性特徴を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴としては、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無制限自己再生の潜在能力、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含むが、これらに限定されない、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成、並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が挙げられるが、これらに限定されない。

これまでに２つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（epiblast stem cell、ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」又は「準安定」状態の多能性、及び多能性初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」又は「基底」状態である。両方の多能性状態が上記のような特徴を示す一方で、ナイーブ状態又は基底状態は、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の前不活性化又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低減、並びに（ｖ）プライミング状態多能性細胞と比較しての分化マーカーの発現低下を更に示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるか又は除去されるかのいずれかである細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、プライミング状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。

多能性は、連続体として存在し、人工多能性幹細胞は、「プライミング」状態及び「ナイーブ」状態の両方で存在するようであり、ナイーブ状態の細胞は、おそらくより大きな分化能を有する。従来の培養培地中で生成された人工多能性幹細胞は、プライミング状態で存在し、移植後胚盤胞に由来する細胞により密接に類似しているが、ナイーブｉＰＳＣは、マウス胚性幹細胞又は移植前胚盤胞に由来する細胞により密接に類似する多能性特徴を示す。プライミング及びナイーブ細胞状態は、コロニー形態、重要なシグナル伝達経路の阻害又は活性化に対する細胞応答、遺伝子発現シグネチャー、及び胚体外細胞に関連する遺伝子を再活性化する能力における差異を含む、様々な差異によって定義することができる。例えば、プライミング多能性状態を表す従来のｉＰＳＣは、平坦なコロニー形態を示すが、ナイーブ型ｉＰＳＣは、マウス胚性幹細胞に類似したコンパクトなドーム型コロニー形態を示す。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くてコンパクトであることを特徴とする。

「多能性因子」又は「リプログラミング因子」は、細胞の発生能を誘導又は増加させるために使用される薬剤又は薬剤の組み合わせを指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子としては、例えば、転写因子ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、並びに小分子リプログラミング剤、例えば、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、特殊化していない（「未コミット」）又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化したり、分化度の低い細胞型に戻ったりすることのできない細胞を指す。

多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤及び細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（embryoid body、ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている三次元のクラスターであり、三次元領域内で多数の系統を発生させる。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、更に分化を続けるように処理される。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を細胞の三次元多層クラスター内で互いに近接させることによって開始され、これは典型的には、多能性細胞を液滴として沈降させ、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させること、又は機械的撹拌によるものを含むいくつかの方法の１つによって実現される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体には更に分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内の中程度の増殖の分化した細胞集団（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の胚葉）を生成する。ＥＢは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化のキューに対する三次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、様々な分化状態の異種細胞を生じさせる。更に、ＥＢは作成及び維持が面倒である。更に、ＥＢによる細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。

対照的に、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」とは異なり、多能性幹細胞由来細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖（proliferation）の間、培養培地は、増殖（proliferation）及び多能性を維持するように選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、これらの凝集体は、日常的に機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養で凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化のキューを必要とする。

本明細書で使用されるとき、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターにわたる分化、すなわち「胚様体」、「ＥＢ」、又は「ＥＢ形成」とは異なる分化方法を指す用語である。単層分化は、本明細書に開示される他の利点の中でも特に、ＥＢ形成が分化を開始するために必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、単層分化は、ＥＢの３つ全ての胚葉分化と比較して、必要に応じて特定の系統に向けられる。

本明細書で使用されるとき、「解離した」細胞は、他の細胞から又は表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離又は精製された細胞をいう。例えば、細胞は、機械的又は酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、例えば、クラスターの懸濁液、単一の細胞又は単一の細胞及びクラスターの混合物への酵素的又は機械的な解離によって、互いに解離され得る。更に別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレート又は他の表面から解離される。したがって、解離には、細胞外マトリックス（extracellular matrix、ＥＣＭ）及び基質（例えば、培養面）との細胞相互作用を破壊すること、又は細胞間のＥＣＭを破壊することが含まれる。

本明細書で使用されるとき、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」は、第２の型の細胞と共培養されて、第２の型の細胞が増殖できる環境を提供する、１つの型の細胞を表す用語であり、フィーダー細胞は、増殖因子、栄養素を提供し、第２の細胞型を支持する。フィーダー細胞は、必要に応じて、それらが支持している細胞とは異なる種に由来する。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。フィーダー細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射又はマイトマイシンなどの抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞又は線維芽細胞）、及び白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）であり得る。一般に、種々のフィーダー細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。

本明細書で使用されるとき、「フィーダーフリー」（feeder-free、ＦＦ）環境とは、フィーダー細胞を本質的に含まない、及び／又はフィーダー細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養又は培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。前処理された培地には、フィーダー細胞から分泌された増殖因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質が含まれる。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞の両方を含まず、フィーダー細胞の培養によって前処理もされていない。フィーダー細胞としては、間質細胞、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、及び胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

「培養」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、増殖及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合で単数は「培地（medium）」）、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。

「培養する」又は「維持する（maintain）」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織又は体外の細胞を維持（sustaining）、増殖（propagating）（増殖（growing））、及び／又は分化させることを指す。「培養」又は「維持すること」は、細胞の増殖及び／又は維持に役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として培地を利用することができる。

本明細書で使用される場合、「継代」又は「継代すること」は、細胞が所望の程度まで増殖したときに、細胞を複数の細胞培養表面又は容器に細分及びプレーティングすることによって、培養細胞を分割する行為を指す。いくつかの実施形態では、「継代」又は「継代すること」は、細胞を細分し、希釈し、プレーティングすることを指す。細胞が一次培養表面又は容器からその後の一連の表面又は容器に継代されるので、その後の培養は、本明細書において「二次培養」又は「第１継代」などと称され得る。新しい培養容器への細分及びプレーティングの各行為は、１継代とみなされる。いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、２、３、４、５、６、７、又はそれ以上の日毎に継代される。いくつかの実施形態では、リプログラミング後に最初に選択されたｉＰＳＣは、３～７日毎に１回継代される。

ｉＰＳＣ及びそれから分化した誘導非多能性細胞のゲノム編集若しくは改変、又は非多能性細胞及びそれからリプログラミングされた誘導ｉＰＳＣのゲノム編集若しくは改変との関連で使用される「機能的」とは、（１）遺伝子レベルでの、成功したノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現（所望の細胞発生段階での誘導性若しくは一時的発現など）、トランスジェニック若しくは制御された遺伝子発現を指し、これは、直接ゲノム編集若しくは改変によって、又は最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」によって達成される、又は（２）細胞レベルでの、（ｉ）直接ゲノム編集を通して細胞において得られた遺伝子発現改変、（ｉｉ）最初にゲノム操作される出発細胞からの分化若しくはそのリプログラミングを介した「継代」を通して当該細胞において維持された遺伝子発現改変、（ｉｉｉ）当該細胞のより初期の発生段階においてのみ出現するか、若しくは分化若しくはリプログラミングを介して当該細胞を生じる出発細胞においてのみ出現する遺伝子発現改変の結果としての、当該細胞における下流遺伝子調節、又は（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆細胞若しくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは改変に最初に由来する成熟細胞産物内に示された、増強された若しくは新たに達成された細胞機能若しくは属性、による細胞の機能／特性の除去、追加、又は変更の成功を指す。

本明細書で使用されるとき、「遺伝的インプリント」という用語は、ソース細胞又はｉＰＳＣの優先的な治療属性に寄与し、ソース細胞由来ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣ由来非天然造血系統細胞で保持可能な遺伝的又はエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用されるとき、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞由来ｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化し得る。ソース細胞由来ｉＰＳＣ、及びそこから分化した細胞は、文脈に応じて、「誘導細胞」と総称することがある。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性を付与する遺伝的インプリントは、ドナー、疾患、又は治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、又はゲノム編集を使用してｉＰＳＣに遺伝子組換えモダリティを導入することにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞の誘導細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー、疾患、若しくは治療応答特異的であるソース細胞は、ｉＰＳＣ及び由来造血系統細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含んでいてもよく、この遺伝的インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（invariant natural killer T、ｉＮＫＴ）細胞からの、予め配置された単一特異的ＴＣＲ、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点変異のホモ接合、及び所定のＨＬＡ要件、すなわち、増加した集団でハプロタイプを示す選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、優先的な治療属性には、由来細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節及び修飾、生存率、並びに細胞傷害性が含まれる。優先的な治療属性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、オフ腫瘍効果の低減を伴うオンターゲット特異性の改善、化学療法などの治療に対する耐性。

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」とは、（１）細胞内若しくは細胞発生において起こる再配列、変異、遺伝子インプリンティング及び／若しくはエピジェネティック改変に天然に由来するもの、又は（２）細胞のゲノムにおける挿入、欠失若しくは置換を含むがこれらに限定されない細胞操作によるゲノム工学を通して得られたものを含む、遺伝子編集を指す。本明細書中で使用される場合、遺伝子改変はまた、ドナー、疾患、又は治療応答特異的である供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含む。遺伝子改変細胞は、そのような遺伝子改変を有しない対応する野生型細胞と比較して、遺伝子改変（例えば、遺伝子編集）を含む細胞である。

本明細書で使用されるとき、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、免疫細胞の観点では、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な未改変及び／又は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強され、改善され、及び／又は増加された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節及び修飾、生存率、並びに細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、オフ腫瘍効果の低減を伴うオンターゲット特異性の改善、化学療法などの治療に対する耐性。

「組み込み」とは、コンストラクトの１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「組み込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失を伴うか又は伴わない、コンストラクトの１つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列又は１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換を更に含み得る。

「コンストラクト」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製及び／又は発現することができる任意の核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、送達されるコンストラクトを含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれることも組み込まれないこともできる。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしているということができる。

本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子又は参照活性が宿主細胞に導入されることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。

本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）又はその断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。

本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４種類のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（Ｕ）である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。

本明細書で使用されるとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、一般に当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。

「作動可能に連結された（operably linked）」又は「作動可能に連結された（operatively linked）」とは、一方の機能が他方の影響を受ける、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。

本明細書で使用されるとき、「エンゲージャー」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球）と、腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bi-specific T cell engager、ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bi-specific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は多重特異性キラー細胞エンゲージャー、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞、例えば腫瘍細胞との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現及び活性化できることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識できる同じエピトープを有するエンゲージャーに結合又は連結できる。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャーを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、ある特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープとを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端の表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。

本明細書で使用されるとき、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在的な毒性又はその他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化及び組織特異的及び／又は一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写及び転写後の遺伝子調節及び／又は抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例において、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、及びそれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。

本明細書で使用されるとき、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び／又は薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的又は緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減（relieve）、緩和、逆転又は軽減（lessen）するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、又はそれが出現した場合にそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、タンパク質又はペプチド全体又はその薬学的に活性な断片が含まれる。それはまた、タンパク質若しくはペプチドの薬学的に活性な類似体又はタンパク質若しくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質、抗体又はその断片、増殖因子、及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調整、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当該技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）固有のキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）に関連するときの抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャーに関連するときのエンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）がん幹細胞の標的化、及びｖ）特異的な抗原又は表面分子の非存在下でのその他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原及び／又はエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用されるとき、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体又はエンゲージャーの能力を指すために使用できる。

ＨＬＡクラスＩ欠損、若しくはＨＬＡクラスＩＩ欠損、又はその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／又はＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現のレベルが不足している、又はもはや維持されていない、又は低減している細胞を指し、減少又は低減したレベルが、他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている。ＨＬＡクラスＩ欠損症は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、又はベータ－２ミクログロブリン（beta-2 microglobulin、Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失若しくは発現レベルの低下によって達成できる。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ－ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失又は減少によって達成できる。ＨＬＡ複合体欠損又は改変ｉＰＳＣが、調節された活性を保持しながら、発生に入り、成熟し、機能的な分化細胞を生成する能力を有するかどうかは、以前は不明であった。加えて、ＨＬＡ複合体欠損分化細胞が、ＨＬＡ複合体欠損を有しながら、ｉＰＳＣにリプログラミングされ、多能性幹細胞として維持され得るかどうかは、以前は不明であった。細胞リプログラミング、多能性の維持及び分化の間の予期せぬ失敗は、発生段階特異的遺伝子発現又はその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、適切かつ効率的なクローンリプログラミングの必要性、及び分化プロトコルの再構成の必要性を含むが、これらに限定されない態様に関連し得る。

本明細書で使用されるとき、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリン又はパラクリン）、走化性、及び細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって更に改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。

「Ｆｃ受容体」はＦｃＲと略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（Fc-gamma receptor、ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（Fc-alpha receptor、ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（Fc-epsilon receptor、ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲｓのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ及びＢ細胞）及び各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。

ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）という２つのアイソフォームとして同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性非切断性ＣＤ１６」は、ＣＤ１６のバリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６Ｖ及びＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６バリアントである。一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンの一例である。

本明細書で使用される「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血性幹細胞若しくは造血性前駆細胞、造血性多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又は免疫調節細胞などの自己由来又は同種異系リンパ球の輸血に関し、当該輸血の前にエクスビボで増殖させた、遺伝的に改変された又は改変されていない細胞ベースの免疫療法を指す。

本明細書で使用されるとき、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療及び／又は医薬組成物の非毒性であるが十分かつ／又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、並びに状態のステージ及び重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、治療的に十分な量は、治療されている対象の疾患又は状態に関連する少なくとも１つの症状を改善、軽減、及び／又は改善するのに十分及び／又は有効である。

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。

本明細書中で使用される場合、「治療する」、「治療」などの用語は、治療処置を必要とする対象に関して使用される場合、疾患の症状の改善又は排除を達成することを含むが、所望の薬理学的効果及び／又は限定されない、生理学的効果を得ることをいう。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的でありってよく、かつ／又は症状の改善若しくは排除を達成するという点で治療的であり得るか、又は疾患及び／又は疾患に起因する副作用の部分的若しくは完全な治癒を提供するという点で治療的であり得る。「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を含み、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを予防することと、（ｂ）疾患を阻害するか、又はその発症を停止させることと、（ｃ）疾患を軽減すること、又は疾患の退行を引き起こすこと、又は疾患の症状を完全に若しくは部分的に排除することと、（ｄ）個体を疾患前状態に回復させること、例えば、造血系を再構成することと、を含む。

Ｉ．人工多能性幹細胞の産生のための組成物
以前に開発されたＦＭＭ（運命維持培地）は、Ｔ細胞ではない種々の体細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣの満足な長期安定性を達成している。したがって、ＦＭＭの種々の改変を行って、長期安定及び保存を向上させ、全ての供給源、特にＴ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣの核型異常の頻度を減少させた。Ｔ細胞は、多能性細胞世代（ＴｉＰＳＣ）及び系統特異的かつ機能的なエフェクター細胞分化にとって困難な細胞種であることが示されている。単一細胞解離、クローン増殖、凍結解凍サイクル、ベクタートランスフェクション及びエレクトロポレーション並びにゲノム編集を含むがこれらに限定されないストレス要因が、細胞のゲノム不安定性を引き起こし、多能性、生存能及び多能性細胞の分化潜在能力を損なうことが観察されている。

本明細書において企図される組成物は、フィーダーフリー環境において最小限のリプログラミング因子を使用して効率的かつ有効なリプログラミングの両方を支持し、１つ以上のストレス要因に供された場合であっても、均質かつゲノム的に安定な多能性集団を長期間（すなわち、２５、３０、３５超、又は５０以上の継代）維持しながら、多能性細胞の単一細胞培養及び増殖を可能にする、化学的に規定されたストック基本培地並びに小分子及びその機能的バリアントを含む小分子の種々の組み合わせを含み得る。更に、本明細書で提供される組成物は、培養ＴｉＰＳＣを含む多能性細胞を、非多能性細胞の遺伝的背景又は多能性細胞が生成されるリプログラミングプロセスに関係なく、自発的分化が減少した状態及び基底状態多能性（ナイーブな多能性とも呼ばれる）まで培養することを提供する。

本明細書で企図される組成物は、一部には、組成物の非存在下で生成又は培養された細胞と比較して自発的分化が減少した工業用又は臨床用グレードの多能性細胞の産生に有用である。一実施形態では、非多能性細胞は、多能性細胞になるように誘導され、多能性を長期間維持するように培養される。別の実施形態では、非多能性細胞は、多能性細胞になるように誘導され、組成物の非存在下で培養された細胞と比較して減少した自発的分化を達成及び／又は維持するように培養される。別の実施形態では、非多能性細胞は、多能性細胞になるように誘導され、基底状態多能性を達成及び／又は維持するように培養される。

種々の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、組成物の接触なしで生成又は維持されたｉＰＳＣと比較して、ｉＰＳＣ、特にＴ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミーを含む核型異常を低減又は予防する。したがって、種々の実施形態では、組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上の継代（任意の介在する継代数を含む）の間、基底状態多能性、正常な核型、及び１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性を維持する。他の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上の継代（任意の介在する継代数を含む）の間、１つ以上の多能性細胞における自発的分化の低下を維持する。

種々の実施形態では、本発明の培養培地で使用するための化学的な規定基本培地は、従来のヒト胚性幹細胞培地などの幹細胞の維持及び／又は増殖を支持するのに適した任意の規定基本培地であってもよい。本発明の実施形態に従って使用され得る規定基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium、「ＤＭＥＭ」）、基本培地イーグル（Basal Media Eagle、ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（１：１ＤＭＥＭ及びＦ－１２ｖｏｌｖｏｌ）、培地１９９、Ｆ－１２（Ｈａｍ）栄養混合物、Ｆ－１０（Ｈａｍ）栄養混合物、最小必須培地（Minimal Essential Media、ＭＥＭ）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、及びＲＰＭＩ１６４０が挙げられるが、これらに限定されず、これらの全ては、とりわけ、Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄから入手可能である。これらの培地の多くのいくつかのバージョンが利用可能であり、これらとしては、ＤＭＥＭ１１９６６、ＤＭＥＭ１０３１４、ＭＥＭ１１０９５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ＭｅｄｉａＥ１２２５１、ＨａｍＦ１２１１０５９、ＭＥＭ－アルファ１２５６１、及びＭｅｄｉｕｍ－１９９１１１５１（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。培養培地は、例えば、以下のうちの１つ以上を含み得る：アミノ酸、ビタミン、有機塩、無機塩、微量元素、緩衝塩、糖、ＡＴＰなど。

本発明の実施形態による細胞培養培地における使用のための小分子及びそのクラスは、以下により完全に記載される。一実施形態では、組成物は、細胞培養培地と、ＴＧＦβファミリータンパク質と、Ｒｈｏキナーゼ（Rho Kinase、ＲＯＣＫ）阻害剤（Rho Kinase inhibitor、ＲＯＣＫｉ）と、ＭＥＫ阻害剤（MEK inhibitor、ＭＥＫｉ）と、ＷＮＴ活性化因子と、を含む。種々の実施形態では、組成物は、ＴＧＦβ阻害剤（TGFβinhibitor、ＴＧＦβｉ）を含まない。種々の実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子のうちの１つ以上を、ｉＰＳＣの作製及び所定の期間にわたる維持の間の１つ又は複数の特定の段階で添加することができる。ｉＰＳＣ維持の間のそのような特定の段階は、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離、解離したｉＰＳＣの単一細胞ソーティング、ｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖、クローンｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存、ｉＰＳＣＭＣＢの解凍、及び必要に応じてｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルを含むが、これらに限定されない。例えば、種々の実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質は、必要に応じて、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離時、又はｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖時、又はその間の任意の段階で組成物に添加されてもよい。種々の実施形態では、ｉＰＳＣ維持の間のＭＥＫ阻害剤及び／又はＷＮＴ活性化因子の濃度は、非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするために使用されるＭＥＫ阻害剤及び／又はＷＮＴ活性化因子の濃度と比較して低減される。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤及び／又はＷＮＴ活性化因子の濃度は、非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするために使用され得るＭＥＫ阻害剤及び／又はＷＮＴ活性化因子の濃度の約３０％～６０％、例えば約３５％～５５％、好ましくは約４０％～５０％の量である。

一実施形態では、細胞培養培地を含む組成物は、ＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子、並びに必要に応じてＬＩＦ及び／又はｂＦＧＦを更に含むが、組成物はＴＧＦβ阻害剤を含まず、必要に応じて、組成物へのＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子の任意の添加は、ｉＰＳＣ維持の間に段階特異的である。

更なる実施形態では、組成物に含まれる細胞培養培地は、サイトカイン及び／又は増殖因子を実質的に含まず、必要に応じてフィーダーフリー環境である。他の実施形態では、細胞培養培地は、血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカインなどのサプリメントを含有する。

更なる実施形態では、本発明は、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子、ヒストンデアセチラーゼ（histone deacetylase、ＨＤＡＣ）阻害剤、並びにＴＧＦβ阻害剤を含む細胞培養培地を含み、必要に応じて、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤、並びにＴＧＦβ阻害剤の任意の添加が、以前の組成物を使用したリプログラミングと比較して、リプログラミング効率が増加したｉＰＳＣへの非多能性細胞のリプログラミングプロセス中に段階特異的である、人工多能性幹細胞培養生成のための組成物を提供する。ｉＰＳＣリプログラミング中のそのような特定の段階としては、体細胞トランスフェクション（０日目）、外因性遺伝子発現、ヘテロクロマチンの増加、体細胞同一性の喪失、及びｉＰＳＣコロニー形成が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、種々の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、クロマチン再構築時に、又は２～３日目頃（トランスフェクション後）に必要に応じて添加されてもよく、かつ／又はＴＧＦβ阻害剤は、体細胞同一性の喪失の段階で、又は６～８日目頃（トランスフェクション後）に必要に応じて添加されてもよい。トランスフェクション後１３～１５日目頃に、ｉＰＳＣコロニーは、通常、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して形成される。

一実施形態では、人工多能性幹細胞産生のための組成物は、ＲＯＣＫｉと、ＭＥＫｉと、ＷＮＴ活性化因子と、ＨＤＡＣ阻害剤と、ＴＧＦβ阻害剤と、必要に応じて、ＬＩＦ及び／又はｂＦＧＦと、を含む細胞培養培地を含み、必要に応じて、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の任意の添加は、ｉＰＳＣリプログラミング中に段階特異的である。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸（valproic acid、ＶＰＡ）又はその機能的バリアント若しくは誘導体である。

ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈｏＣの３つのアイソフォームが存在する）の下流エフェクターとして働くセリン／スレオニンキナーゼである。本明細書において企図される組成物における使用に適したＲＯＣＫ阻害剤としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図されるＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ発現及び／又はＲＯＣＫ活性を減少させ得る。例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、ＲＯＣＫに対する抗体、ドミナントなネガティブＲＯＣＫバリアント、並びにＲＯＣＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２－８６、Ｙ２７６３２Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）尿素、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、及び（Ｒ）－（＋）－トランス－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミドが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の実施形態による細胞培養培地において使用するための例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ピルインテグリン、ブレビスタチン、及びそれらの機能的バリアント又は誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。

ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
ＥＲＫ／ＭＥＫ経路の例示的な阻害剤としては、ＭＥＫ又はＥＲＫに対する抗体、ドミナントなネガティブＭＥＫ又はＥＲＫ改変体、並びにＭＥＫ及び／又はＥＲＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ－１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫ１１２０２１２、ＡＲＲＹ－４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥＡｌ１９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４、ＰＴＫ７８７、及びそれらの機能的バリアント又は断片が挙げられるが、これらに限定されない。

ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の更なる例示的な例としては、以下の化合物：６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２，３－ジヒドロキシ－プロポキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－ピラン－２－イルメチル）－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、１－［６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－１，１－ジメチル－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（２，４－ジクロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、以下、ＭＥＫ阻害剤１と呼ぶ、２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド、以下、ＭＥＫ阻害剤２と呼ぶ、４－（４－ブロモ－２－フルオロフェニルアミノ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－カルボキサミド又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である。

Ｗｎｔ活性化因子
本明細書で使用される場合、「Ｗｎｔシグナル促進剤」、「Ｗｎｔ経路活性化因子」、「Ｗｎｔ活性化因子」又は「Ｗｎｔ経路アゴニスト」という用語は、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを指し、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、又はＷｎｔ１６のうちの１つ以上のアゴニストを含むが、これらに限定されない。Ｗｎｔ経路アゴニストには更に、以下：Ｄｋｋポリペプチド、クレセントポリペプチド、サーベラスポリペプチド、アキシンポリペプチド、Ｆｒｚｂポリペプチド、Ｔ細胞因子ポリペプチド、又はドミナントなネガティブなディシブルドポリペプチドのポリペプチド又はその断片のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。

Ｗｎｔ経路アゴニストの非限定的な例には、Ｗｎｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｗｎｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、活性化されたＷｎｔ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化されたＷｎｔ受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を促進する小さな有機分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現又は活性を阻害する小さな有機分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するリボザイム、ＲＮＡｉ構築物、ｓｉＲＮＡ、又はＷｎｔアンタゴニストの発現を阻害するｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔアンタゴニストに結合してその活性を阻害する抗体、β－カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β－カテニンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌｅｆ－１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｌｅｆ－１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びその機能的バリアント又は断片のうちの１つ以上が更に含まれる。

ＧＳＫ－３β阻害剤
ＧＳＫ－３β阻害剤は、本明細書において企図される組成物における使用に適した特定の例示的なＷｎｔ経路アゴニストであり、ＧＳＫ－３βに結合する抗体、ドミナントなネガティブＧＳＫ－３βバリアント、並びにＧＳＫ－３βを標的とするｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を含み得るが、これらに限定されない。他の例示的なＧＳＫ－３β阻害剤としては、ケンパウロン、１－アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム錯体、ＴＤＺＤ－８４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ１４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ１９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２又はそのミリストイル化形態；２－クロロ－１（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、及びそれらの機能的バリアント又は断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態による細胞培養培地において使用するための例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、及びケンパウロンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。

ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）の発現を抑制する抗体、ドミナントなネガティブバリアント、及びアンチセンス核酸を含み得る。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８（－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈピラン－４－イル）ベンズアミド）、ＳＭ１６、ＩＮ－１１３０（３－（（５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（キノキサリン－６－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）ベンズアミド）、ＧＷ６６０４（２－フェニル－４－（３－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン）、ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩）及びピリミジン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。更に、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えば、ＳＢ－４３１５４２などの、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害する阻害剤を包含すると理解されるべきである。本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉から上皮への変換／移行（mesenchymal to epithelial conversion/transition、ＭＥＴ）プロセスに影響を及ぼすと考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮間葉転換（epithelial to mesenchymal transition、ＥＭＴ）の駆動因子である。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することにより、ＭＥＴ（すなわち、リプログラミング）プロセスを促進することができる。

ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は、ＡＬＫ５を阻害する同様の効果を有することが示されている。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流又は下流）は、本明細書の各段落に記載されるＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、又はその代わりに使用することができる。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤としては、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、並びにＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。更に、以下に記載される分類は、単に組織化の目的のためであり、当業者は、化合物が経路内の１つ以上の点に影響してよく、したがって、化合物が定義された分類のうちの１つより多くにおいて機能し得ることを知るであろう。

ＴＧＦβ受容体阻害剤の具体例としては、ＳＵ５４１６；２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ－５０５１２４）；レルデリムムブ（ＣＡＴ－１５２）；メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２）；ＧＣ－１００８；ＩＤ１１；ＡＰ－１２００９；ＡＰ－１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ－５０５１２４；ＳＢ－４３１５４２；ＳＤ－２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ－３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ－２０３５８０；ＳＤ－０９３；Ｇｌｅｅｖｅｃ；３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン－Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ；及びＴＧＦβ受容体を標的とするアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤は、ＳＭＡＤ２又はＳＭＡＤ３を標的とする核酸のドミナントなネガティブバリアント及びアンチセンス核酸に対する抗体を含み得る。阻害剤の具体例としては、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ－４３１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７－０１；及び３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）が挙げられる。ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤には、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３及び／又はＳＭＡＤ４を標的とするアンチセンス核酸のドミナントなネガティブバリアント並びにアンチセンス核酸に対する抗体が含まれ得る。ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤の具体例としては、Ｔｒｘ－ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ－ｘＦｏｘＨ１ｂ及びＴｒｘ－Ｌｅｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストには、ＳＭＡＤ６又はＳＭＡＤ７を標的とする抗体、ドミナントなネガティブバリアント、及びアンチセンス核酸が含まれるが、これらに限定されない。

ＨＤＡＣ阻害剤
例示的なＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤は、ＨＤＡＣを標的とするｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸のドミナントなネガティブバリアントに結合する抗体を含むことができる。ヒストンアセチル化は、ヒストン及びＤＮＡメチル化調節に関与する。一般に、全体的なレベルでは、多能性細胞はより多くのヒストンアセチル化を有し、分化細胞はより少ないヒストンアセチル化を有する。ＨＤＡＣ阻害剤は、サイレンシングされた多能性遺伝子の活性化を促進する。ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＴＳＡ（トリコスタチンＡ）、ＶＰＡ（バルプロ酸）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸又はボリノスタット）、フェニル酪酸ナトリウム、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８、ＦＫ２２８）、トラポキシン（ＴＰＸ）、２０環状ヒドロキサム酸含有ペプチド１（ＣＨＡＰＩ）、ＭＳ－２７５、ＬＢＨ５８９及びＰＸＤＩＯＩが挙げられるが、これらに限定されない。

サイトカイン及び増殖因子
特定の実施形態では、本発明の組成物及び／又は細胞培養培地は、サイトカイン及び／又は増殖因子を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカインなどを含むが、これらに限定されない１つ以上のサプリメントを含有し、これらは、リプログラミング及び／又は維持プロセスの質及び効率を改善するために段階特異的な様式で添加され得る。

種々の増殖因子及び培養培地におけるそれらの使用は、公知であり、例えば、ＥＣＭタンパク質、ラミニン１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、塩化物細胞内チャネル１、膜貫通レセプターＰＴＫ７、インスリン様増殖因子、インヒビンベータＡ、ＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達経路の誘導因子、及びアクチビンＡが挙げられる。培養培地中で使用されるサイトカインは、例えば、上皮増殖因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor、ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor、ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（insulin-like growth factor1、ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（insulin-like growth factor2、ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト増殖因子（keratinocyte growth factor、ＫＧＦ）、神経増殖因子（nerve growth factor、ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth factor、ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（transforming growth factor beta、ＴＧＦ－β）、白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor、ＬＩＦ）、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial cell growth factor、ＶＥＧＦ）トランスフェリン、種々のインターロイキン（ＩＬ－１～ＩＬ－１８など）、種々のコロニー刺激因子（顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte/macrophage colony-stimulating factor、ＧＭ－ＣＳＦ）など）、種々のインターフェロン（ＩＦＮ－γなど）、並びに幹細胞因子（stem cell factor、ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（erythropoietin、Ｅｐｏ）などの幹細胞に対して効果を有する他のサイトカインなどの増殖因子のうちの１つ以上を含み得る。

特定の実施形態では、組成物及び／又は培養培地は、組成物のサイトカイン／増殖因子成分としてＴＧＦβファミリーのタンパク質を含んでもよい。ＴＧＦβファミリータンパク質の例としては、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、ｎｏｄａｌ及びその機能的バリアント又は断片が挙げられるが、これらに限定されない。これらのサイトカイン／増殖因子は、商業的に入手されてよく、そして天然又は組換えのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、多種多様な哺乳動物細胞の培養のために、基本培地は、約０．０１～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．２～２０ｎｇ／ｍｌ、特定の実施形態では約０．５～１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＦＧＦを含有するであろう。他のサイトカインは、使用される場合、経験的に決定されるか又は確立されたサイトカイン技術によって導かれるような濃度で添加され得る。

ＩＩ．改善されたリプログラミング及び維持システム並びにそれから作製される細胞
一般に、本開示は、必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＷｎｔ活性化因子、並びに必要に応じてＴＧＦβ阻害剤及び／又はＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせの存在下で、非多能性細胞を少なくとも１つのリプログラミング因子と接触させることによって開始される改善されたリプログラミングプロセスを提供し、ＴＧＦβ阻害剤及びＨＤＡＣ阻害剤の一方又は両方は、リプログラミングの１つ以上の選択された段階で添加される（例えば、ＦＲＭ２、表１及び２、図９も参照）。本開示はまた、１つ以上のストレス要因に供されるｉＰＳＣのための改善された維持プロセスを提供し、細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子、及びＴＧＦβファミリータンパク質の組み合わせと、必要に応じて１つ以上の選択された段階で接触して提供され、組成物は、ＴＧＦβ阻害剤を含まない（例えば、ＦＭＭ２、表１及び２、図９も参照）。

細胞のリプログラミング
フットプリントフリーのｉＰＳＣ（すなわち、ｉＰＳＣがいかなる外因性リプログラミング因子ポリヌクレオチドも保持していない）を得る１つの方法は、一過性及び一時的導入遺伝子発現を媒介するプラスミドシステムを使用することである。リプログラミングのための１つの例示的なプラスミドシステムは、複製起点及びリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡを含まないポリヌクレオチドを担持する１つ以上の第１のプラスミドと、ＥＢＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むが複製起点又はリプログラミング因子コード配列を含まない第２のプラスミドとを含む（例えば、米国特許出願公開第２０２０／０２７０５８１号における「ＳＴＴＲシステム」を参照。その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

プラスミドの組み合わせは、形質導入時に細胞内で一時的に導入遺伝子（ＥＢＮＡ及び外因性リプログラミング因子）の細胞質発現を可能にし、リプログラミング細胞とも呼ばれるＥＢＮＡを含まない中間細胞の集団を生成し、これは、移行形態又は形態変化（例えば、間葉から上皮への移行（ＭＥＴ））を提示するが、任意の多能性細胞形態又は内因性多能性遺伝子発現（例えば、ＯＣＴ４）を欠き、それでも安定な自立多能性状態に入ることができる。本明細書に記載されるリプログラミング細胞はまた、リプログラミングプロセスの継続を支持する培養条件（例えば、従来のｈＥＳ培地、ＦＲＭ、又はＦＲＭ２）下で十分な期間が与えられると多能性状態にリプログラミングすることができるという点で、リプログラミング因子の導入前の体細胞と前の体細胞と形態学的にだけでなく機能的にも異なる。いくつかの実施形態では、ＥＢＮＡを含まないリプログラミング細胞は、導入遺伝子を含まず、したがって、得られるｉＰＳＣは、ＥＢＮＡに対する選択も、エピソームリプログラミングにおいてしばしば必要とされるようなＥＢＮＡ及び導入遺伝子を排除するための連続継代も必要とせずに、フットプリントを含まない。

上記のプラスミドシステムを使用する以外に、外因性リプログラミング因子はまた、アデノウイルス形質導入によって導入されてもよい（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（２００９）；２７：２６６７－２６７４）、センダイウイルスベクター（Ｆｕｓａｋｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＡｃａｄＳｅｒＢＰｈｙｓＢｉｏｌＳｃｉ．（２００９）；８５：３４８－３６２；Ｓｅｋｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ（２０１０）；７：１１～１４；Ｂａｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１１）；１０８：１４２３４－１４２３９）、ミニサークルＤＮＡベクター（Ｏｋｉｔａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４９－９５３）、及びｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクター（Ｍａｌｉｋｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．（２０１３）；９９７：２３－３３）。

当該分野で幹細胞リプログラミングのために知られているリプログラミング因子は全て、本リプログラミングシステム及び方法とともに使用され得る。一実施形態では、リプログラミング因子としては、ＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。更なるリプログラミング因子としては、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、及びＬ１ＴＤ１が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、リプログラミング因子は、体細胞リプログラミングのための、及びＫＬＦを使用しないＴ細胞リプログラミングのためのＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２、ラージＴ抗原、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３を含むが、これらに限定されない。これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、ｏｒｉＰを含有するがＥＢＮＡを含有しない同じプラスミド構築物（すなわち、同じ第１のプラスミド）中に含まれ得る。これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、それぞれｏｒｉＰを含有するがＥＢＮＡを含有しない少なくとも２つのプラスミド構築物（すなわち、複数の第１のプラスミド）に含まれ得る。種々の実施形態では、これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、各々がｏｒｉＰを含有するがＥＢＮＡを含有しない４つのプラスミド構築物（すなわち、４つの第１のプラスミド）に含まれる。

これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、ポリシストロニック構築物（すなわち、１つのプロモーターによって制御される複数のコード配列）又は非ポリシストロニック構築物（いくつかが１つのプロモーターによって制御され、いくつかが異なるプロモーターによって制御される複数のコード配列）に含まれ得る。プロモーターは、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、及び構成的、誘導性、内因的に調節される、又は一時的、組織、若しくは細胞型特異的である他の適切なプロモーターであってもよい。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。別の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αである。いくつかの実施形態では、ポリシストロニック構築物は、単一のオープンリーディングフレーム（例えば、複数のコード配列が、２Ａなどの自己切断ペプチドコード配列によって作動可能に連結される）又は複数のオープンリーディングフレーム（例えば、内部リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳによって連結された複数のコード配列）を提供し得る。

本発明のプラスミドシステムのいくつかの実施形態では、１つ以上のプラスミド構築物（第１のプラスミド）は、ＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）からなる群より選択される１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む。更なる実施形態では、１つ以上のプラスミド構築物（第１のプラスミド）は、ＳＯＸ２及びＫＬＦの一方若しくは両方、又はＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを集合的に更に含む。いくつかの実施形態では、１つの第１のプラスミド構築物のみがシステム内にあり、全ての選択されたリプログラミング因子を提供する。いくつかの他の実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子を提供する２つ以上の第１のプラスミド構築物がシステム中に存在し、各構築物は、少なくとも１コピーのポリヌクレオチドによってコードされた同じ又は異なるリプログラミング因子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のプラスミド構築物は、ＯＣＴ４をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド、並びにＹＡＰ１、ＳＯＸ２、ＬＴａｇ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、及びＬ１ＴＤ１の少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを集合的に含む。

第１のプラスミド構築物が２つ以上のリプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む場合、隣接するポリヌクレオチドは、自己切断ペプチド又はＩＲＥＳをコードするリンカー配列によって作動可能に連結される。自己切断ペプチドは、２Ａペプチドでもよい。２Ａペプチドは、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ＥＲＡＶ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、ＰＴＶ－１（ブタテッショ（tescho）ウイルス－１）、又はＴａＶ（ソセアアシグナ（thosea asigna）ウイルス）に由来してもよく、これらはそれぞれＦ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａと呼ばれる。第１のプラスミド構築物中の複数の２Ａペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、２つの最も近接する２Ａペプチドは異なり、例えば、ＲＦ－２Ａ１－ＲＦ－２Ａ２－ＲＦ－２Ａ１であり、２Ａ１及び２Ａ２は異なる。

第１のプラスミド構築物のライブラリーを予め構築することができ、各構築物は、様々な数、タイプ及び／又は組み合わせのリプログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有する。リプログラミングは、長い待ち時間を伴う非効率的かつ確率的なプロセスであることが知られている。発現のタイミング及びレベル、並びにリプログラミング因子の化学量論は、リプログラミングの異なる段階及びリプログラミングを受ける細胞の中間状態におけるリプログラミング動態を駆動し、リプログラミングの完了を決定する。リプログラミング因子の化学量論はまた、リプログラミング効率に影響を及ぼし、プライミング対基底状態多能性などの様々な品質、並びにｉＰＳＣのクローン性、自己複製、均質性、及び多能性維持（自発的分化とは対照的に）を含む関連する生物学的特性を有するｉＰＳＣを産生する。化学量論は、反応プロセスにおける試薬間の定量的関係を測定し、所与の反応において必要とされる試薬の量、及び時には生成される生成物の量を決定するために使用される。化学量論は、反応を完了するための試薬の最適な量又は比である、試薬の化学量論量又は試薬の化学量論比の両方を考慮する。本出願の一態様は、１つ以上の第１のプラスミドをライブラリーから好都合に選択し、種々をうまく組み合わせ、用量調整し、同時トランスフェクトすることを可能にすることによって、リプログラミング因子化学量論を評価又は利用するためのシステム及び方法を提供する。

本リプログラミングシステムの第２のプラスミドは、プロモーター及びＥＢＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供し、発現カセットも第２のプラスミドもリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない。第２のプラスミドに含まれるプロモーターは、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、及び構成的、誘導性、内因的に調節される、又は一時的、組織、若しくは細胞型特異的である他の適切なプロモーターであってもよい。一実施形態では、外因性プロモーターはＣＡＧである。別の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αである。少なくとも１つの第１のプラスミド及び第２のプラスミドの上記の組み合わせを非多能性細胞に同時トランスフェクトすることによって、独立型ＥＢＮＡ及びｏｒｉＰが、少なくとも１つのリプログラミング因子とともに非多能性細胞に導入され、リプログラミングが開始される。

いくつかの実施形態では、リプログラミングは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む小分子化合物の組み合わせの存在下で開始され、ｉＰＳＣは、十分な期間後に生成される。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子を含む小分子化合物の組み合わせの存在下で、必要に応じて外因性リプログラミング因子発現の段階で、又はリプログラミング因子導入後約１～２日目に開始される。その後、クロマチン再構築の段階で、又はリプログラミング因子導入後２～３日目頃に、ＨＤＡＣ阻害剤を必要に応じて添加し、その後、体細胞同一性の喪失の段階で、又はトランスフェクション後６～８日目頃に、ＴＧＦβ阻害剤を必要に応じて添加して、ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される、第１及び第２のベクターの使用、リプログラミング因子の組み合わせ、並びに／又はリプログラミング中の１つ以上の選択された段階中の小分子処理を含む最適化されたリプログラミング組成物及びプロセスは、以前のシステムと比較して、より高い効率で産生され、確立された多能性（ナイーブ多能性を含む）及び改善されたゲノム安定性を有する、確実にフットプリントフリーのｉＰＳＣをもたらす。更に、開示される最適化されたリプログラミング組成物及びプロセスを使用してＴ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣは、トリソミーを含む核型異常を有する傾向がはるかに低い。

いくつかの実施形態では、リプログラミングはフィーダーフリー条件下である。特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、ヒトフィーダー細胞を本質的に含まず、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、及び胚性幹細胞を含むがこれらに限定されないフィーダー細胞によって予め馴化されていない。

細胞の維持
細胞療法製造プロセスにおける多くの重要な態様の中で、細胞増殖及び凍結保存は、重要な関心領域として特定されており、細胞生存率及び機能性は、凍結解凍サイクル中に大いに影響を受け、ｉＰＳＣ分化に由来するエフェクター細胞のインビボ細胞有効性及び持続性は、ｉＰＳＣ分化後のエフェクター細胞増殖段階中に複雑に影響を受ける。したがって、本発明の別の態様は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が、単一細胞解離、クローン増殖、凍結解凍サイクル、ベクタートランスフェクション及びエレクトロポレーション、並びにゲノム編集を含むがこれらに限定されない１つ以上のストレス要因を受ける場合の、特にフィーダー細胞を含まない条件における、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の長期保存に対処する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのゲノム編集は多重編集である。

したがって、いくつかの実施形態では、約７～３５日間、約１０～３２日間、約１５～３１日間、約１７～２９日間、約１９～２７日間、又は約２１～約２５日間誘導された後の細胞は、酵素的手段又は機械的手段のいずれかによって、細胞が単一細胞懸濁液に解離されるように、必要に応じて解離に供される。解離された細胞は、細胞を維持するか、又は細胞ソーティングを行うために、任意の適切な溶液又は培地中に再懸濁され得る。いくつかの実施形態では、単一の解離された細胞懸濁液は、ＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質は、必要に応じて、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離時、又はｉＰＳＣ単一細胞増殖時、又はその間の任意の段階で添加される。特定の実施形態では、ＷＮＴ活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤を含み、かつ／又はＴＧＦβファミリータンパク質は、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、ｎｏｄａｌ、及びそれらの機能的バリアント若しくは断片のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、及び／又はＲｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。

いくつかの実施形態では、単一の解離された細胞懸濁液を更にソーティングしてもよい。種々の実施形態では、濃縮は、比較的短時間でクローンｉＰＳＣコロニーを誘導し、それによってｉＰＳＣ作製の効率を改善するための方法を提供する。濃縮は、多能性のマーカーを発現する細胞を同定及び取得し、それによって濃縮された多能性細胞の集団を取得することによって、細胞の集団をソーティングすることを含み得る。更なる濃縮方法論は、分化のマーカーを発現する細胞、リプログラミングされていない細胞又は非多能性細胞の枯渇を含む。いくつかの実施形態では、ソーティングのための細胞は、多能性細胞である。いくつかの実施形態では、ソーティングのための細胞はリプログラミング細胞である。いくつかの実施形態では、ソーティングのための細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日以上であるが、２５、２６、２８、３０、３２、３５、４０日以下、又はその間の任意の日数の間、リプログラミングするように誘導されている。いくつかの実施形態では、ソーティングのための細胞は、約２１～２５日間、約１９～２３日間、約１７～２１日間、約１５～約１９日間、又は約１６～約１８日間、リプログラミングするように誘導されている。

細胞は、磁気ビーズ又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ソーティングなどの細胞をソーティングする任意の適切な方法によってソーティングされ得る。細胞は、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０及び／又はＣＤ５０の発現を含むが、これらに限定されない、多能性の１つ以上のマーカーに基づいてソーティングされ得る。種々の実施形態では、細胞は、多能性の少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのマーカーに基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４の発現に基づいてソーティングされ、ある特定の実施形態では、ＴＲＡ１－８１及び／又はＴＲＡ１－６０と組み合わせたＳＳＥＡ４の発現に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、若しくはＴＲＡ１－６０、及び／又はＣＤ３０発現に基づいてソーティングされる。一実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１及びＣＤ３０に基づいてソーティングされる。別の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－６０及びＣＤ３０に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態では、細胞は、最初に、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６及びＣＤ７を含むがこれらに限定されない分化細胞の１つ以上の表面マーカーを使用して、リプログラミングされていない細胞について枯渇され、次いで、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１及び／又はＣＤ３０などの多能性マーカーについて濃縮される。

リプログラミング後、ｉＰＳＣは、維持、継代、増殖、及び／又は凍結保存される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、単一細胞として、維持培地、例えば、表２に示すＦＭＭ２中で長期間培養され、すなわち、維持され、継代され、増殖され、凍結保存される。ＦＭＭ２中で培養されたｉＰＳＣは、それらの未分化で、かつ基底又はナイーブプロファイルを維持し続けること、培養洗浄又は選択を必要としないゲノム安定性、かつ胚様体又は単層（胚様体の形成を伴わない）を介したインビトロ分化、及び奇形腫形成によるインビボ分化の３つの体細胞系統全てを容易に生じさせることが、示されている。例えば、国際公開第２０１５／１３４６５２号及び米国特許出願公開第２０１７／００７３６４３号を参照、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。種々の実施形態では、ＦＭＭ２中で培養されたｉＰＳＣは、１つ以上のナイーブ特異的マーカーの発現増加を示し、以前のシステムでの発現と比較して、限定なしで、ＴＢＸ３（Ｔボックス転写因子；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ１５１１９）、ＴＦＣＰ２Ｌ１（転写因子ＣＰ２様タンパク質１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＩ６）、ＵＴＦ１（未分化胚細胞転写因子１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ５Ｔ２３０）、ＦＧＦ４（線維芽細胞増殖因子受容体４；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２２４５５）、ＴＦＣＰ２Ｌ１（転写因子ＣＰ２様タンパク質１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＩ６）、ＰＲＤＭ１４（ＰＲドメイン亜鉛フィンガータンパク質１４；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＧＺＶ８）、ＤＰＰＡ５（発生多能性関連５タンパク質；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ６ＮＣ４２）、ＤＮＭＴ３Ｌ（ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３様；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＪＷ３）、ＫＬＦ４（クルッペル様因子４；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４３４７４）、及びＭＡＥＬ（タンパク質渦巻きホモログ；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９６ＪＹ０）が含まれる。本発明のリプログラミングシステム及び方法を使用するリプログラミングに適した細胞は、一般に、任意の非多能性細胞を含む。非多能性細胞は、最終分化細胞、又は多分化能細胞若しくは前駆細胞を含むが、これに限定されず、これらは、胚葉系統細胞の３つのタイプ全てを生じさせることができない。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、初代細胞、すなわちヒト又は動物組織から直接単離された細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、供給源特異的幹細胞、例えば、ドナー、疾患、又は治療応答特異的である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、初代免疫細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、それ自体が、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞を含む多能性細胞に由来する。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、誘導された免疫エフェクター細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来非天然Ｔ－又はＮＫ－様細胞である。

いくつかの他の実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、ゲノム改変初代又は誘導細胞である。非多能性細胞に含まれる遺伝子改変は、遺伝子発現のノックイン、ノックアウト又はノックダウンをもたらす、ゲノムにおける挿入、欠失又は置換を含む。リプログラミングのための非多能性細胞における改変された発現は、構成的又は誘導性（例えば、発生段階、組織、細胞、又は誘導特異的）であってもよい。いくつかの実施形態では、挿入又は置換は、遺伝子座特異的標的化組み込みである。いくつかの実施形態では、組み込みのために選択される遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座又は目的の内因性遺伝子座である。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ－２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、又はＲＵＮＸ１、及びゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含み得る。組み込み部位が、潜在的なセーフハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断されるような、調節エレメント又は遺伝子の破壊が存在しないこと、遺伝子密集領域内の遺伝子間領域、又は反対方向に転写された２つの遺伝子の間の収束位置であること、ベクターにコードされた転写活性化因子と、隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子及びマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモーターとの間の長距離相互作用の可能性を最小限にする距離を保つこと、並びに遍在的な転写活性を示す、広範な空間的及び時間的発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるような、明らかに遍在的な転写活性を有すること。この後者の特徴は、多能性細胞に関して特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシング及び他の遺伝子座の潜在的な活性化をもたらす。外因性挿入に適した領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素及び保存された配列を欠き、ホモロジーアームの増幅用のプライマーを簡単に設計できるはずである。一例では、本システム及び方法を使用するリプログラミングのための非多能性細胞は、内因性ＴＣＲ遺伝子座にＣＡＲを含むＴ細胞であり、ＴＣＲ発現は、ＣＡＲ組み込みの結果として破壊される。

一実施形態では、遺伝子改変された非多能性細胞のリプログラミングは、同じ遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることである。したがって、いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣを得るために、リプログラミング後に１つ以上のそのようなゲノム編集をｉＰＳＣに導入してもよい。一実施形態では、ゲノム編集のためのｉＰＳＣは、クローン株又はクローンｉＰＳ細胞の集団である。

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的遺伝子編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子を含む培地で維持、継代、増殖及び／又は凍結保存され、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、又は本質的に含まず、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質、ＲＯＣＫｉ及び／又はＭＥＫｉ及びＷＮＴ活性化因子は、ｉＰＳＣ維持の間の特定の段階で添加される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ維持は、限定されるものではないが、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離、解離したｉＰＳＣの単一細胞ソーティング、ｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖、クローンｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存、ｉＰＳＣ／ＭＣＢの解凍、及び必要に応じて、ｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルを含む連続段階のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβファミリータンパク質の添加は、必要に応じて、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離時、ｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖時、又はその間の任意の段階で行われる。いくつかの実施形態では、ＭＥＫｉ及び／又はＷＮＴ活性化因子は、非多能性細胞をリプログラミングするために用いられる量の約３０～６０％である量で存在する。

いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質又はペプチド、薬物標的候補、並びに多能性細胞及び／又はその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、腫瘍浸潤、生存率、自己複製、持続性、及び／又は生存を促進するタンパク質のうちの１つ以上を導入する。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上の自殺遺伝子媒介安全スイッチを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、キメラ受容体、ホーミング受容体、抗炎症性分子、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン／ケモカインデコイ受容体、増殖因子、改変された炎症促進性サイトカイン受容体、ＣＡＲ、又は二重若しくは多重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャーとカップリングするための表面トリガー受容体の発現の導入又は増加、又は共刺激遺伝子の発現の減少若しくはサイレンシングを含む、少なくとも１つのゲノム改変を有する。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、標的化モダリティとして高親和性及び／又は非切断性ＣＤ１６を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣに含まれる標的化モダリティは、Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的であるか、又はＴ細胞及びＮＫ細胞の両方に適合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、１つ以上の外因性ポリヌクレオチド又は１つ以上の内因性遺伝子中のインデルを含む。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子に含まれるインデルは、遺伝子発現の破壊をもたらす。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子に含まれるインデルは、編集された遺伝子のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子に含まれるインデルは、編集された遺伝子のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態では、選択された部位に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、選択された部位にインデルを含む１つ以上の標的編集を更に含み得る。いくつかの実施形態では、インデルは、免疫応答の調節及び媒介に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体に関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。一実施形態では、改変ｉＰＳＣ細胞は、染色体６ｐ２１領域内のＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及びＨＬＡ遺伝子のいずれかのうちの少なくとも１つにおいて欠失、破壊、又は低下した発現を含む。別の実施形態では、改変ｉＰＳ細胞は、ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇの導入を含む。更にいくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳ細胞は、中断されたＴＣＲ遺伝子座を含む。

ｉＰＳＣの様々な標的遺伝子編集方法、特に、複数遺伝子座における複数遺伝子標的化戦略を用いて単一細胞レベルでｉＰＳＣを効果的に操作するための方法としては、例えば、国際公開第２０１７／０７９６７３号に示されているものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ＩＩＩ．インビトロで得られたｉＰＳＣ誘導細胞
本発明は、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシステム及び方法を使用して得られるｉＰＳＣに由来する非多能性細胞を更に提供する。いくつかの実施形態では、誘導非多能性細胞を生成するためのｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの標的編集を通じて、又は部位特異的組み込み若しくはインデルを有するゲノム改変非多能性細胞のリプログラミングを通じて、ゲノム操作される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来非多能性細胞は、前駆細胞又は完全に分化した細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来非多能性細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣに含まれる同じ標的編集を保持するｉＰＳＣ由来細胞は、非天然中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血性幹細胞若しくは造血性前駆細胞、造血性多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、免疫調節細胞又は任意の胚葉系統の任意の所望の細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来非天然免疫調節細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（myeloid-derived suppressor cell、ＭＤＳＣ）、調節マクロファージ、調節樹状細胞又は間葉系間質細胞を含み、これらは、ＮＫ、Ｂ及びＴ細胞の強力な免疫調節因子である。

ドナー源からの単離を通して得ることが困難である特定のタイプ又はサブタイプの無制限の数の細胞を産生することに加えて、ヒトｉＰＳＣ由来系統は、リプログラミングプロセスが細胞運命（特定／分化から多能性へ）だけでなく、最初の体細胞ドナーの年齢とは無関係にドナー細胞集団に特徴的な暦年齢もリセットするように、胎児期細胞の特性を示すことが示されている。神経細胞、心臓細胞、又は膵臓細胞を含むｉＰＳＣ由来系統において観察される胎児様特性以外に、老化の細胞ホールマークは、リプログラミングプロセス後のｉＰＳＣからの再分化細胞の若返りを示す測定可能な変化を示している。高齢ドナー線維芽細胞集団において発現される年齢関連パラメータは、ｉＰＳＣ誘導及びｉＰＳＣ由来線維芽細胞様細胞への分化後にリセットされた（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，２０１３）。Ｔ細胞クローンからリプログラミングされたｉＰＳＣから分化したｉＰＳＣ由来抗原特異的Ｔ細胞は、元のＴ細胞クローンにおけるテロメアよりも伸長したテロメアを介した若返りを実証する。若返りプロセスを示す完全に分化した細胞における更なる変化としては、ヘテロクロマチンの全体的な増加、ミトコンドリア機能の改善（ＲＯＳ減少、ｍｔＤＮＡ変異の減少、超微細構造の存在）、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメア伸長及び短いテロメアのパーセンテージの減少、並びに老化細胞のパーセンテージの減少が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ．，２０１３）。これらの様々な加齢関連の態様における正のリセットは、増殖、生存率、持続、及び記憶様機能についてのより高い潜在能力を有する非天然細胞をもたらす。したがって、リプログラミング及び再分化媒介性若返りは、完全に分化したｉＰＳＣ由来細胞において多くの分子的、表現型的及び機能的特性を付与し、その非天然特性は、細胞系統におけるそれらの類似性にもかかわらず、その初代細胞対応物からそれを区別する。

ｉＰＳＣ由来造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法及び組成物としては、例えば、国際公開第２０１７／０７８８０７号に示されるものが含まれ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法及び組成物は、無血清、フィーダーを含まない、及び／又は間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する決定的な造血内皮（hemogenic endothelium、ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化できる細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットした前駆細胞、及び多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した種々の系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞の分化によって産生される細胞は、多分化能幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞まで、及び全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。

単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び増殖させる方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、及び必要に応じてｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＷＮＴ経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮（ＨＥ）潜在能力を有する増殖中胚葉細胞を取得する。その後のｂＦＧＦとの接触、及び必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＷＮＴ経路活性化因子との接触により、決定的なＨＥ潜在能力を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なＨＥ細胞に分化する。

本明細書で提供される造血系統の細胞を取得するための方法はＥＢ媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、ＥＢ形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均質な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、及び集団内の細胞の均質な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。

提供されている単層分化プラットフォームは、造血性幹細胞並びにＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ様細胞、及び調節細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす、決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせて、種々の治療用途のための多能性幹細胞由来造血エフェクター細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書で提供される方法を使用した単層培養は、インビトロ分化、エクスビボ修飾、及びインビボ長期造血自己複製、再構成及び生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されるように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、限定されないが、決定的な造血内皮、造血性多分化能前駆細胞、造血性幹細胞及び造血性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、並びにＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、間葉系間質細胞、又はそれらの任意の組み合わせの機能を有する免疫エフェクター細胞を含む。

決定的な造血系統の細胞への多能性幹細胞の分化を指示するための方法であって、方法は、（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子、及び必要に応じてｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることと、（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞からの決定的なＨＥ潜在能力を有する中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、開始させることと、（ｉｉｉ）決定的なＨＥ潜在能力を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じてＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮潜在能力を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞からの決定的な造血内皮の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、開始させることと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子、並びに必要に応じてＴＧＦβファミリータンパク質を含む組成物と接触させるステップであって、組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、組成物と接触させない多能性幹細胞と比較してゲノム異常における低い傾向を有する多能性幹細胞を播種し、増殖させるステップを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、又はナイーブｉＰＳＣ、又は１つ以上の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、取得された多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、取得された決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－ＣＸＣＲ４^－ＣＤ７３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＸＣＲ４^－ＣＤ７３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４３^－ＣＤ９３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ９３^－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ９３^－ＣＤ７３^－である。

上述の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、必要に応じてＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体への決定的な造血内皮の分化を開始させることと、必要に応じて、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体又はＴ細胞へのプレＴ細胞前駆体の分化を開始させることと、を更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞は、ドナー源から単離された初代Ｔ細胞よりもはるかに高いγδＴ細胞の画分を含む。

多能性幹細胞の、改善されたゲノム安定性を有する造血系統細胞への分化を誘導するための上記方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じてＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血内皮のプレＮＫ細胞前駆体への分化を開始することと、必要に応じて（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む組成物と接触させ、培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まず、プレＮＫ細胞前駆体からＮＫ細胞前駆体又はＮＫ細胞への分化を開始することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ前駆体は、ＣＤ３^－ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋ＣＤ７^＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ細胞は、ＣＤ３^－ＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ細胞は、必要に応じて、ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）、ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ５７及びＣＤ１６のうちの１つ以上によって更に定義される。

方法の別の実施形態では、方法は、多能性幹細胞由来決定的なＨＥを、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、並びにＩＬ１ｂ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦＬＴ３Ｌからなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じて、ＡｈＲアンタゴニスト及びプロスタグランジン経路アゴニストの一方又は両方を含む培地と接触させることから免疫調節細胞を産生することを可能にする。

いくつかの実施形態では、誘導免疫調節細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（myeloid derived suppressor cell、ＭＤＳＣ）を含む。一実施形態では、誘導免疫調節細胞の集団は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、誘導免疫調節細胞の集団は、単球を含む。いくつかの実施形態では、単球は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ１４^＋細胞を含む。更にいくつかの他の実施形態では、誘導免疫調節細胞の集団は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＰＤＬ１^＋細胞を含む。本発明の一態様は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋、ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ１４^＋、又はＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＰＤＬ１^＋細胞を含むｉＰＳＣ由来免疫調節細胞の濃縮された細胞集団又は亜集団を提供する。いくつかの他の実施形態では、誘導免疫調節細胞の集団は、ＣＤ３３^＋ＣＤ１５^＋ＣＤ１４^－ＣＤ１１ｂ^－細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＭＤＳＣを含む誘導免疫調節細胞の集団は、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約２％、約１％、約０．１％未満の赤血球、リンパ系、顆粒球、ＣＤ４５^－ＣＤ２３５^＋細胞、ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋細胞、又はＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ６６ｂ^＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、誘導免疫調節細胞の集団は、赤血球、リンパ系、顆粒球、ＣＤ４５^－ＣＤ２３５^＋細胞、ＣＤ４５^＋ＣＤ７^＋細胞、又はＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋ＣＤ６６ｂ^＋細胞を本質的に含まない。

ＩＩＩ．ｉＰＳＣ及びそれから誘導された免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用して当該ｉＰＳＣに由来するｉＰＳＣ及び／又は免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来免疫エフェクター細胞に保持可能な１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその誘導細胞は、細胞ベースの養子療法に適している。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞又はＴ様細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＮＫ細胞又はＮＫ様細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫調節細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療の潜在能力のために、エクスビボで更に調整される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の数又は比率の増加を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作された免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、適応ＮＫ細胞の数又は比率の増加を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＭＤＳＣの単離された集団又は亜集団は、自家性（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ）である。

いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞において望ましい治療属性を伝達する遺伝的インプリントを含み、この遺伝的インプリントは、当該ｉＰＳＣに由来する分化した造血細胞において保持され、機能する。

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間若しくはその後に、多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失若しくは置換を通じて得られる１つ以上の遺伝子組換えモダリティ、又は（ｉｉ）ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である、供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣは、供給源治療属性を保持し、供給源治療属性はまた、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれている。

いくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはその誘導細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び修飾、並びに／若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を含む。いくつかの他の実施形態では、遺伝子改変モダリティは、（ｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、又はＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子の欠失、破壊、又は発現低下、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ１６、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体の導入、又は二重特異性若しくは多重特異性又はユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの１つ以上を更に含む。

更にいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、（ｉ）抗原標的化受容体発現、（ｉｉ）ＨＬＡ提示又はその欠如、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、（ｖ）低減されたオフ腫瘍効果を伴う改善されたオンターゲット特異性、（ｖｉ）化学療法などの治療に対する抵抗性、並びに（ｖｉｉ）ホーミング、持続性、及び細胞毒性の改善のうちの１つ以上に関連する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその誘導造血細胞は、Ｂ２Ｍヌル又は低、ＨＬＡ－Ｅ／Ｇ、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＤ４７、ＬＡＧ３ヌル又は低、ＴＩＭ３ヌル又は低、ＴＡＰ１ヌル又は低、ＴＡＰ２ヌル又は低、タパシンヌル又は低、ＮＬＲＣ５ヌル又は低、ＰＤ１ヌル又は低、ＲＦＫＡＮＫヌル又は低、ＣＩＩＴＡヌル又は低、ＲＦＸ５ヌル又は低、及びＲＦＸＡＰヌル又は低のうちの１つ以上を含む。改変されたＨＬＡクラスＩ及び／又はＩＩを有するこれらの細胞は、免疫検出に対する増加した耐性を有し、したがって、改善されたインビボ持続性を示す。更に、そのような細胞は、養子細胞療法におけるＨＬＡ適合の必要性を回避することができ、したがって、ユニバーサル市販治療レジメンの供給源を提供することができる。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその誘導造血細胞は、ＣＤ１６又はｈｎＣＤ１６（高親和性非切断性ＣＤ１６）、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ_２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、エンゲージャー、又はエンゲージャーの表面トリガー受容体を含む、そのバリアントのうちの１つ以上を含む。このような細胞は、改善された免疫エフェクター能力を有する。

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその誘導造血細胞は抗原特異的である。

本発明の実施形態による免疫細胞を養子細胞療法に適した対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）；急性及び慢性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫及び骨髄異形成症候群を含むが、これらに限定されない血液悪性腫瘍；脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、頸部、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、又は食道の腫瘍を含むがこれらに限定されない固形腫瘍；並びにＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン・バールウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、アデノウイルス及びＢＫポリオーマウイルス関連障害を含むがこれらに限定されない感染症が含まれるが、これらに限定されない種々の自己免疫疾患を含む疾患の例。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製される多能性細胞由来造血系統細胞を含む治療用途のための組成物を更に提供し、医薬組成物は、薬学的に許容される培地を更に含む。一実施形態では、治療使用のための組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来Ｔ細胞を含む。一実施形態では、治療使用のための組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療使用のための組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療使用のための組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＨＳＣを含む。一実施形態では、治療使用のための組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＭＤＳＣを含む。

追加的に、本発明は、いくつかの実施形態では、本発明は、組成物を養子細胞療法に適した対象に導入することによる本明細書の組成物の治療的使用を提供し、対象は、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。

分離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離された多能性幹細胞由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節マクロファージ、調節樹状細胞又は間葉系間質細胞を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞療法を必要とする対象を治療するための、精製されたＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、プロＮＫ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞又は間葉系間質細胞を有する治療用組成物、例えば、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４^＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞又は間葉系間質細胞の単離集団を有する組成物を提供する。

本明細書に開示されている実施形態の誘導造血系統細胞を使用する治療は、症状に基づいて、又は再燃防止のために行うことができる。治療剤又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。特定の実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を治療、改善、及び／又は改善することができる疾患、状態、及び／又は傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄又は幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又はがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害又はがんを有するか又は有するリスクがある対象、腫瘍、例えば、固形腫瘍を有するか又は発症するリスクがある対象、ウイルス感染又はウイルス感染に関連する疾患を有するか又は有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。

開示されるような誘導造血性系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、間、及び／又は後に対象に投与することができる。したがって、組み合わせ療法の方法は、追加の治療剤の使用前、使用中、及び／又は使用後のｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与又は調製を含み得る。上述のように、１つ以上の追加の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分又はその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤又は放射性部分、又は免疫調節薬（immunomodulatory drug、ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療剤の投与から、時間、日、又は週単位によって時間的に分離することができる。追加的又は代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤又はモダリティと組み合わせることができる。

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗体又は抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血性系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来造血性系統細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に適した抗体は、抗ＣＤ２０（レツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗Ｈｅｒ２（トラスツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）、及び抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、並びにそれらのヒト化バリアント及びＦｃ改変バリアントを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、１つ以上の化学療法剤又は放射性部分を含む。「化学療法剤」という用語は、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、又は急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又はがん幹細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と呼ばれることもあり、当該技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の適切な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師及び腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＮｉｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。

サリドマイド、レナリドマイド、及びポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためにｉＰＳＣ由来治療用免疫細胞とともに使用され得る。

当業者が理解するように、本明細書の方法及び組成物に基づくｉＰＳＣに由来する自己由来及び同種異系の造血性系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自己由来移植の場合、誘導造血性系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にＨＬＡ一致する。別の実施形態では、誘導造血性系統細胞は、対象に対してＨＬＡ適合性ではない。

いくつかの実施形態では、治療組成物中の誘導造血性系統細胞の数は、１用量当たり、少なくとも０．１×１０^５細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、又は少なくとも５×１０^９細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の誘導造血性系統細胞の数は、１用量当たり、約０．１×１０^５細胞～約１×１０^６細胞、１用量当たり、約０．５×１０^６細胞～約１×１０^７細胞、１用量当たり、約０．５×１０^７細胞～約１×１０^８細胞、１用量当たり、約０．５×１０^８細胞～約１×１０^９細胞、１用量当たり、約１×１０^９細胞～約５×１０^９細胞、１用量当たり、約０．５×１０^９細胞～約８×１０^９細胞、１用量当たり、約３×１０^９細胞～約３×１０^１０細胞、又はその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０^８細胞／用量は１．６７×１０^６細胞／ｋｇに変換される。

一実施形態では、治療組成物中の誘導造血性系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも０．１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０^６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０^６細胞／ｋｇ体重、１×１０^８細胞／ｋｇ体重、５×１０^８細胞／ｋｇ体重、又は１×１０^９細胞／ｋｇ体重である。

一実施形態では、ある用量の誘導造血性系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇ、又は少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇ、又は約１０×１０^６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、又は６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。

投与量のいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量を決定する。

いくつかの実施形態では、誘導造血性系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、誘導造血性系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日毎、７日毎、１０日毎、１５日毎、２０日毎、２５日毎、３０日毎、３５日毎、４０日毎、４５日毎、５０日毎の１回の投与、又はその間の任意の日数の任意の回数の投与である。

本発明の実施形態による誘導造血性系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であってよく、ヒト患者への投与に適しており、そしてすぐに投与され得る（すなわち、更なる処理なしに投与され得る）。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、いずれかの更なる処理又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤の投与前に増殖及び／又は調整される、誘導造血性系統細胞の単離された集団を提供する。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように遺伝子操作された誘導造血性系統細胞については、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して活性化及び増殖させることができる。

ある特定の実施形態では、誘導造血性系統細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）又は別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であってよく、次いで、本発明の実施形態におけるＴリンパ球の活性化及び増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、Ｆｃ受容体を発現する細胞又は抗体又は米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋結合する。

患者への投与に適した治療組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）及び／又は希釈剤（例えば、薬学的に許容される媒体、例えば、細胞培養培地）、又は他の薬学的に許容される成分を含むことができる。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の実施形態による治療用組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈｅｄ．１９８５を参照されたい）。

特定の実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血性系統細胞の単離された集団を有する治療用細胞組成物はまた、薬学的に許容される細胞培養培地、又は薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を有する。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血性系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、又は気管投与方法によって個別に、又は他の適切な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標を達成することができる。

これらの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約５％もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲にある。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、又は約６．５～約８の範囲にある。別の実施形態では、治療用組成物は、当該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。

本発明はまた、部分的に、本発明の実施形態による特定の組成物及び／又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来免疫細胞の維持、増殖、及び／又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び／又はフィーダーを含まない培地である。種々の実施形態では、無血清培地は動物成分を含まず、必要に応じて無タンパク質であり得る。必要に応じて、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物成分を含まない培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物の供給源から取得される。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、培地の上記例が例示であり、本発明の実施形態での使用に適した培地の処方を決して限定しないことを理解するであろう。

次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。

－材料及び方法
単一細胞解離全てのリプログラミング培養物を、トランスフェクション後約１４日目にＦＭＭ又はＦＭＭ２に切り替えた。ＦＭＭ／ＦＭＭ２において、全てのリプログラミング培養物を維持し、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離させた。次いで、単一細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はビトロネクチンのいずれかでコーティングされた表面上で継代した。次いで、単一細胞解離細胞をＦＭＭ又はＦＭＭ２中で増殖させ、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。

フローサイトメトリー分析及びソーティング単一細胞解離リプログラミングプールを、冷却した染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＦＩＴＣ、ＴＲＡ１８１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７及びＣＤ３０－ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むコンジュゲートされた一次抗体を細胞溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体は、１００万個の細胞当たり１００μＬの染色緩衝液で７～１０μＬで使用された。染色緩衝液中に再懸濁した解離単一細胞をスピンダウンし、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する染色緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。フローサイトメトリーによるソーティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。ソーティングされた細胞を、ウェル当たり３及び９事象の濃度で９６ウェルプレートに直接排出した。各ウェルには、ＦＭＭ２を予め充填した。ソーティングが完了したら、コロニー形成及び増殖のために９６ウェルプレートをインキュベートした。ソーティングの７～１０日後、細胞を継代した。ＦＭＭ２中でのその後の継代は、７５～９０％の集密度で日常的に行った。フローサイトメトリー分析はＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実行され、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ４（ＤｅＮｏｖｏＳｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析された。

導入遺伝子の存在の試験ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ及びプロテイナーゼＫ消化（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、リプログラミング因子及びＥＢＮＡ１を含む導入遺伝子に特異的なプライマーセットを使用して増幅した。ＰＣＲ反応を、以下のように３５サイクル行った：９４℃で３０秒間（変性）、６０～６４℃で３０秒間（アニーリング）及び７２℃で１分間（伸長）。レンチウイルス法を使用して生成された線維芽細胞、Ｔ細胞、及びｈｉＰＳＣからのゲノムＤＮＡを陰性対照として使用した。エピソーム構築物のＤＮＡを陽性対照として使用した。

核型分析細胞遺伝学的分析を、ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、Ｇバンド分裂中期細胞に対して行った。各核型分析は、非クローン異常が最初の２０個で同定される場合、４０個のスプレッドカウントに拡張された分析を有する２０個のスプレッドの最小カウントを含む。

統計分析少なくとも３回の独立した実験を行った。値を平均±ＳＥＭとして報告する。統計的分析をＡＮＯＶＡで行い、ｐ＜０．０５を有意とみなした。

培養培地従来のｈＥＳＣ培養物は、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ（又は１％ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１～２ｍＭＬ－グルタミン、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール及び１０～１００ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を含有する。比較すると、多段階培養培地は、ＨＤＡＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤／ＷＮＴ活性化因子、ＭＥＫ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤のうちの１つ以上を追加的に含む。この段階特異的培養プラットフォームはまた、フィーダーフリーリプログラミング及び維持を支持する。

ある特定の適用において、従来の培養のための成分に加えて、リプログラミング培地（例えば、ＦＲＭ）は、ＳＭＣ４：ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤／ＷＮＴ活性化因子、ＭＥＫ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の組み合わせを含有する。ＳＴＴＲ２リプログラミングシステムでは、増強リプログラミング培地（例えば、ＦＲＭ２）は、６～８日目頃に体細胞がその体細胞同一性を失う（例えば、細胞種特異的遺伝子発現の喪失）までＴＧＦβ阻害剤を含まず、必要に応じてＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＧＳＫ３ｉより後に添加されるＨＤＡＣ阻害剤を含む。ある特定の適用において、維持培地（ＦＭＭ）は、ＳＭＣ３：ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の組み合わせを含有する。ＳＴＴＲ２リプログラミングのために、強化維持培地（ＦＭＭ２）は、トランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーのメンバー（その例としては、アクチビンＡ、ＴＧＦβ及びＮｏｄａｌが挙げられるが、これらに限定されない）を含有し、必要に応じて、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の一方又は両方の濃度が、ＦＲＭ２における濃度と比較して３０％～６０％低減されている。Ｎｏｄａｌは、ＴＧＦｂスーパーファミリーに属する分泌タンパク質であり、ヒトの染色体１０ｑ２２．１上に位置するＮＯＤＡＬ遺伝子によってコードされる。ＴＧＦβは、ＴＧＦｂスーパーファミリーに属する多機能サイトカインである。アクチビンＡは、ＴＧＦβに密接に関連するＴＧＦβスーパーファミリーサイトカインである。

－ＦＭＭ２を用いた長期安定性及び保存の増強
特にフィーダー細胞フリー条件における人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の長期保存は、単一細胞解離及びソーティング、クローン増殖、凍結解凍サイクル、ベクタートランスフェクション及びエレクトロポレーション並びにゲノム編集を含むがこれらに限定されない細胞操作プロセスにおける様々なストレス要因によって影響を受け、これは、様々な核型異常を含む、Ｇバンド核型分析、液滴デジタルＰＣＲによって検出され得るような、細胞のゲノム不安定性をもたらす。染色体欠失、重複、転座、又は逆位の中で、特定の染色体のトリソミーは、線維芽細胞などの他の体細胞型よりも、Ｔ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）においてより頻繁に観察されている。加えて、これらのストレス要因は、得られた多能性細胞の多能性、及び分化潜在能力を損ない、これらの細胞は、長期間にわたって凍結保存されることが多い。

以前に開発されたＦＭＭ（運命維持培地）は、Ｔ細胞ではない種々の体細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣの満足な長期安定性を達成している。いくつかの基本成分に加えて、ＦＭＭは、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、及びＭＥＫ阻害剤などの小分子を含む。長期安定性及び保存を増強し、全ての細胞供給源から、特にＴ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣの核型異常の頻度を低減するために、本明細書において図１Ａに開示及び例示されるように、ＦＭＭの様々な改変を実施し、改変及び増強されたｉＰＳＣ維持培地を、本出願において時々ＦＭＭ２と呼ぶ。Ｔ細胞リプログラミングを、非組み込みＳＴＴＲプラスミド及びＦＲＭ（ＦａｔｅＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇＭｅｄｉｕｍ）又は改変及び増強されたＦＲＭ（ＦＲＭ２と呼ばれる）を使用して開始し、得られた細胞を、遺伝子座特異的標的化挿入若しくは欠失を媒介するＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ribonucleoprotein、ＲＮＰ）複合体でトランスフェクトする（操作された）か、又は単一細胞ソーティング（非操作）に直接進めて、単一細胞ソーティングされた、操作された、又は操作されていないｉＰＳＣクローンを生成した。長期ｉＰＳＣ保存、特に凍結解凍サイクルを経るｉＰＳＣバンクに対するＦＭＭ２の影響の効果を試験するために、単一細胞ソーティングされたｉＰＳＣクローンをＦＭＭ中で増殖させ、次いでＦＭＭ中で同様に凍結保存した（第１のバンク）。第１のバンクからのｉＰＳＣクローンを解凍し、ＦＭＭ又はＦＭＭ２中で増殖させ、それぞれのＦＭＭ又はＦＭＭ２中で凍結保存して、二次バンク（第２のバンク）を作製した。ＦＭＭ改変は、主にＦＭＭの小分子組成物に対するものであり、試験された改変は、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）、ＴＧＦβ、及びフォルスコリンのうちの少なくとも１つの補充を、ＦＭＭと比較して約４０～６０％のＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫｉ）及び／又はＧＳＫ３阻害剤（ＧＳＫｉ）の濃度低下と組み合わせて、又は組み合わせずに含む。ここで、ＭＥＫｉ又はＧＳＫ３ｉにおける５０％濃度減少を、例示の目的のために使用した。

第２のバンク解凍後試験を実施して、異なる培地処理によるｉＰＳＣクローンの長期安定性を試験した。ゲノム安定性を２つの独立した方法：ｄｄＰＣＲによる第１２染色体コピー数の決定及び示された継代でのＧバンド核型分析によって決定される全ゲノム安定性によって調べた。Ｇバンド核型は、１０％超のモザイク現象の感度で、逆位、重複／欠失、平衡及び不平衡転座、並びにモザイク現象の感度が１０％超の異数性などの微視的なゲノム異常（＞５Ｍｂ）を明らかにした。

図１Ｂに示すように、Ｔ細胞ドナー１に由来する１つのｉＰＳＣクローン及びＴ細胞ドナー２に由来する２つのｉＰＳＣクローンを上記のように試験した。核型の結果は、「正常核」（すなわち、４６、ＸＹ又は４６、ＸＸ）及び「異常核」として示された。トリソミー１２の存在を決定するために、ｄｄＰＣＲを使用して異常な核型を有するクローンを更に分析した。ｄｄＰＣＲ結果は、「正常１２」（すなわち、コピー数＜２．３）及び「トリソミー１２」（すなわち、コピー数＞２．３）として示された。様々なＦＭＭ改変からの利益の異なる程度にかかわらず、ドナー及びクローンの不一致の考慮を考慮して、ＦＭＭ中のＭＥＫ及びＧＳＫ３阻害剤の濃度減少の組み合わせを伴うか又は伴わないＴＧＦβファミリーのメンバー（例えば、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、又はＮｏｄａｌ）でＦＭＭを補充することは、ＦＭＭに対する上記の改変への曝露の利益を伴わずにＦＭＭ中で培養されたＴｉＰＳＣと比較して、第１２染色体トリソミーの減少及び延長された継代にわたる及び複数の凍結解凍サイクルを通した（そしておそらく、解凍と凍結との間の増殖、ゲノム操作及びソーティングを伴う）正常な核型の維持によって示されるように、ＴｉＰＳＣｓを含むｉＰＳＣの長期安定を改善及び増強することが見出された。

Ｅ８は、ｉＰＳＣの維持及び保存のための市販の培地であり、ｉＰＳＣにおいてプライミングされた多能性を促進することが知られている。記載されるリプログラミングプラットフォームを使用して生成された培養ＴｉＰＳＣをそれぞれ、Ｅ８、ＦＭＭ、又はＦＭＭ２中で１０超の継代にわたって維持し、遺伝子発現プロファイリング及び主成分分析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）のために採取した。図２に示されるように、Ｅ８、ＦＭＭ又はＦＭＭ２中で維持されたＴｉＰＳＣクローンは、３つの異なるクラスターを形成し、各々は、細胞が曝露された培地に相関した。

多能性マーカーのＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために、Ｅ８、ＦＭＭ又はＦＭＭ２培養ＴｉＰＳＣクローンを更に調製した。ＤＰＰＡ３、ＴＤＧＦ１、ＳＡＬＬ４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２を含む共通の多能性マーカーは、クラスター化なしで試験した全ての培養条件において発現された。注目すべきことに、ＴＨＹ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６及びＺＩＣ２などのプライミングされた多能性特異的遺伝子は、Ｅ８条件下でＴｉＰＳＣ中で上方制御された。クローンは、プライミングされた特異的マーカーの低レベルの発現及びナイーブ特異的マーカー、例えば、ＴＢＸ３、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＵＴＦ１、ＦＧＦ４、ＰＲＤＭ１４、ＤＰＰＡ５、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＬＦ４及びＭＡＥＬの中レベルの発現を示した。これら全てのナイーブ特異的マーカーの発現は、この実施例ではアクチビンＡを添加してＦＭＭ２中で培養したＴｉＰＳＣクローンにおいて更に上昇した。加えて、ＦＭＭ２培養ｉＰＳＣはまた、非常に高レベルのＰＲＤＭ１４、ＤＰＰＡ５、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＬＦ４及びＭＡＥＬ（Ｅ８又はＦＭＭ条件で維持されたｉＰＳＣにおいて大部分がサイレンシングされる更なるナイーブ多能性特異的遺伝子の群）を最も特徴的に発現し（図３Ａ及び図３Ｂ参照）、これは、多能性のスペクトル又は連続体上のｉＰＳＣの多能性レベルを深くする（例えば、プライミングからナイーブへ、低ナイーブから高ナイーブへ）際のＦＭＭ２の能力、及び使用されるリプログラミングプロセスにかかわらず、より低い多能性レベルのｉＰＳＣを多能性スペクトル上のより高いレベルに適合させる際のその適用を実証する。

－ＦＭＭ２はｉＰＳＣにおけるストレス誘導性ゲノム異常を予防する
ＦＭＭへのＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーの添加が、以前にバンク化されたｉＰＳＣのストレス誘導性遺伝子操作及び凍結保存後のゲノム安定性を改善するかどうかを試験するために、図４Ａに示されるように、上記の第１のバンクのクローンｉＰＳＣ試料を解凍し、操作し、ソーティングし、増殖させ、再度、ＦＭＭ又は約１０～３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを補充したＦＭＭ中で別々に凍結保存して、二次バンクを生成した。上記のように、指定されたゲノム遺伝子座への所望の導入遺伝子の標的挿入を媒介するＣＲＩＳＰＲＲＮＰ複合体でｉＰＳＣをエレクトロポレーションすることによって、操作を行った。

トランスフェクトされた集団の試料（操作されたｉＰＳＣプール、及びｉＰＳＣは第１の凍結保存バンクからのものであった）を核型分析のために採取し、残りの細胞を単一細胞ソーティングに使用してクローン操作されたｉＰＳＣを生成した。遺伝子操作されたｉＰＳＣプール、並びにＦＭＭ又はＦＭＭ＋アクチビンＡ中で培養されたソーティング及び拡大されたクローンｉＰＳＣ集団に対して、トランスフェクション後に核型分析を行った。図４Ｂに示されるように、遺伝子操作によって操作された細胞集団については、ＦＭＭ中で培養された操作された細胞集団の８０％のみが正常な核型（４６＋ＸＹ）を示したが、ＦＭＭ２中で培養された操作された細胞の１００％が正常な核型を示した。

単一細胞ソーティングに更に供されたトランスフェクトされた集団のうち、個々のクローンを、成功した正確な操作を含む定義された属性についてスクリーニングした。受容されたクローンを増殖させ、個々のクローン集団として凍結保存して（図４Ａ）、二次（第２の）ｉＰＳＣ凍結保存バンクを生成した。次いで、ｉＰＳＣを第２のバンクから取り出し、解凍し、ＦＭＭ又はＦＭＭ２培地中で維持した。第２の凍結保存バンクのｉＰＳＣクローン集団に対して凍結保存／解凍後に行われたＳＮＰマイクロアレイアッセイによる核型分析及びコピー数変動分析の結果を図４Ｃに示す。ＦＭＭにおいて生成された３つのクローンのうちの１つのみ（３３％）が正常な核型（４６＋ＸＹ）を示したのに対して、ＦＭＭ２において生成されたクローンの１００％が正常な核型（４６＋ＸＹ）を示した。ＦＭＭ２において生成された全てのクローンは、複数ラウンドの凍結及び解凍プロセスにもかかわらず、ＳＮＰマイクロアレイ分析によって報告可能なコピー数変化を有さず、ヘテロ接合性の喪失／非存在の報告可能な領域を有しないことが示された。したがって、操作、単一細胞ソーティング、スクリーニング、増殖、並びに複数サイクルの凍結及び解凍を伴うｉＰＳＣ製造プロセスにおける複数のストレス要因は、ｉＰＳＣゲノム安定性に対して累積的な負の影響を及ぼすが、これは、少なくともアクチビンＡ、ＴＧＦｂ、及びＮｏｄａｌを含むＴＧＦｂスーパーファミリーのメンバーの添加を含むＦＭＭ２によって低減又は防止され得る。

－ＦＭＭ２はＴ細胞からリプログラミングされたｉＰＳＣのゲノム安定性の改善をもたらす
Ｔ細胞（ＴｉＰＳＣ）からリプログラミングされたｉＰＳＣを作製するために、初代Ｔ細胞をリプログラミングプラスミドでトランスフェクトして、本質的に異種であるｉＰＳＣプールを作製した。ｉＰＳＣクローンを確立するために単一細胞ソーティングを行った。図５Ａに示すように、ソーティング後のＴｉＰＳＣクローンをＦＭＭ、又は様々な形態のＦＭＭ２：ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ；ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ、ＦＭＭ（ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＣＨＩＲ）で使用されたものよりもＧＳＫ３阻害剤濃度が５０％減少したもの、ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ、ＭＥＫ阻害剤濃度が５０％減少したもの（ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＰＤ）；又はＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤濃度の両方が５０％減少したＦＭＭ＋ＡｃｔＡ（ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＣＨＩＲ／ＰＤにおいて増殖させた。

完全にリプログラミングされたＴｉＰＳＣクローンのスクリーニング基準は、形態及び多能性マーカー発現を含んでいた。受容されたクローンを増殖させ、上記に示した培地の各々で凍結保存した。ゲノム安定性は、最初に、凍結前に液滴デジタルＰＣＲ（droplet digital PCR、ｄｄＰＣＲ）によって第１２染色体コピー数を決定することによって調べ、次いで、選択されたクローンを、凍結後にＧバンド核型分析によって全ゲノム安定性について試験した。図５Ｂに示されるように、ｄｄＰＣＲ及び核型分析によるコピー数決定は、Ｔ細胞リプログラミングの状況におけるＦＭＭと比較して、様々なＦＭＭ２製剤を使用したゲノム異常の顕著な低減を明らかにした。操作又は複数回の凍結解凍サイクルを行わなくても、ＦＭＭ条件下でのＴｉＰＳＣのゲノム異常率は約７５％であり、複数回の凍結解凍サイクル及び更なるストレスの多い操作を経たＦｉＰＳＣｓで観察されるゲノム異常率に近く、Ｔ細胞リプログラミングの困難さを反映している。対照的に、ＦＭＭ２条件下でのＴｉＰＳＣのゲノム異常率は、実質的により低く、ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＰＤ下で０％、並びにＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＣＨＩＲ／ＰＤ、ＦＭＭ＋ＡｃｔＡ、及びＦＭＭ＋ＡｃｔＡ－５０％ＣＨＩＲ下でそれぞれ約８％、１５％及び２０％である。

－ＦＭＭ２ｉＰＳＣ維持に加えて強化された一過性及び一時的リプログラミングシステムを使用するリプログラミング
一過性及び一時的リプログラミングシステム（ＳＴＴＲ）において必要とされるベクターを図６に示す。ベクター１は、１つ以上の作動可能に連結された選択されたリプログラミング因子（reprogramming factor、ＲＦ）の発現を駆動するプロモーターであるｏｒｉＰを含有するプラスミドベクターである。ベクター１は、ｏｒｉＰ／ＲＦプラスミドとも呼ばれる。１つのベクター１プラスミド中に２つ以上のＲＦが存在する場合、隣接するＲＦは、２Ａペプチド又はＩＲＥＳによって分離される。ベクター１はＥＢＮＡコード配列を有さず、結果として宿主細胞中での保持時間が短縮されている。リプログラミングに使用されるＲＦの総数に応じて、複数のベクター１プラスミドを使用することができ、これは、所望の異なる組み合わせで、選択された全てのＲＦを集合的に含有する。更に、コトランスフェクションに複数のベクター１プラスミドを使用することは、リプログラミング因子の化学量論が、複数のベクター１プラスミドの組み合わせにおける各リプログラミング因子の相対コピー数を制御することによって精密化される場合に望ましい。ベクター２は、プロモーター及びＥＢＮＡコード配列を含むプラスミドであり、その発現はプロモーターによって駆動される。より重要なことに、ベクター２はｏｒｉＰを欠き、これは、トランスフェクトされた宿主細胞集団におけるベクター２の保持時間の顕著な減少をもたらす。別々の構築物におけるＥＢＮＡ及びｏｒｉＰ配列の分離は、導入遺伝子の一過性発現及び細胞分裂に伴うリプログラミングベクターのより迅速かつ早期の自発的喪失を確実にし、フットプリントフリーのｉＰＳＣをもたらす。ベクター２はまた、ＥＢＮＡｍＲＮＡ又はタンパク質／ペプチドで置換され得る。

例示のために、一連のベクター１構築物及びベクター２構築物を、表３及び図６に示されるように作製した。この例示的なシステムで使用したリプログラミング因子は、４つのベクター１プラスミドを含み、それぞれがＯＣＴ４及びＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）、並びにＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３をそれぞれ含有していた。しかしながら、複数のベクター１プラスミドが少なくともＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びＬＴａｇをコードするポリヌクレオチドを集合的に含むという条件で、任意の数のベクター１プラスミドが使用されてもよく、１つのベクター１プラスミド中のＲＦの順序も変化してもよいことが理解されるべきである。

３人の異なるドナーからのヒトＴ細胞を、０日目に上記のリプログラミングプラスミドでトランスフェクトした。ＨＤＡＣ阻害剤が、同じ処理を行わないリプログラミング培養物と比較して、リプログラミング効率、又は特にＴ細胞リプログラミング効率を改善するかどうかを決定するために、トランスフェクション後約２～３日目に、リプログラミング培養物を、異種ｉＰＳＣ集団が生成されるまでバルプロ酸（ＶＰＡ）で処理した。ｉＰＳＣ表面マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、及びＣＤ３０）の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ＶＰＡ処理は、異なるＴ細胞ドナーにわたって集団中のＳＳＥＡ４^＋ＴＲＡ－１－８１^＋ＣＤ３０^＋ｉＰＳＣ細胞のパーセンテージを有意に増加させることが見出され、それによって、改善された効率でＴ細胞リプログラミングを増強することにおけるＶＰＡの利点が実証された。

ストレスを誘導するために、上記のリプログラミングシステム（図８Ａ）を使用して生成されたｉＰＳＣコロニーから解離した単一細胞のクローン増殖を実施し、増殖した多能性培養物の安定性を異なるドナー間で決定した。図８Ｂに示すように、ｉＰＳＣ集団の画分は、連続継代にわたって増加し、複数のドナーに由来する安定した自己複製多能性培養物を示した。継代されたリプログラミングプールのフローサイトメトリー分析により、ｉＰＳＣ多能性マーカーの発現が確認され、増殖後の持続的な多能性が示された（図８Ｃ）。

ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＭＥＫ阻害剤、及びＴＧＦβ阻害剤を含む以前のＦＲＭ（運命リプログラミング培地）は、体細胞リプログラミングに使用されており、従来、トランスフェクションの直後に適用されている。リプログラミングシステムにおける細胞は、約１日目からｉＰＳＣプールが生成されるまで（１２～１６日のプロセス）、ＦＲＭの存在下にある。ＳＴＴＲプラスミドでトランスフェクトされた体細胞を、ＶＰＡ及びＴＧＦβ阻害剤を含む小分子に段階特異的な様式で曝露することにより、図９に示すように、１２～１６日間のプロセス中のリプログラミングプロセスの質及び効率を更に改善することができることが発見され、段階特異的ＨＤＡＣｉ及びＴＧＦβｉを含むこのＳＴＴＲ＋ＦＲＭは、本出願において「ＳＴＴＲ２リプログラミング」とも呼ばれる。

ＳＴＴＲ２方法及び組成物において、上記のようなバルプロ酸（ＶＰＡ）処理に加えて、ベクタープラスミドにおける外因性遺伝子の発現の時間あたりからｉＰＳＣコロニーが出現する時間まで（トランスフェクション後２～３日目頃から１２～１６日目頃まで）、ＴＧＦβ阻害剤への曝露は、ＳＴＴＲ方法における１日目頃から、トランスフェクトされた体細胞がＴ細胞同一性を失うＳＴＴＲ２方法における６～８日目頃まで、１２～１６日目頃のｉＰＳＣコロニー形成まで遅延される。ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、及びＭＥＫ阻害剤は、リプログラミング、単一細胞解離による細胞採取、ｉＰＳＣクローンを確立するための単一細胞ソーティングの後に培地中に残る。完全にリプログラミングされたｉＰＳＣクローンのスクリーニング基準は、形態、多能性マーカー発現及びリプログラミングプラスミドのクリアランスを含んでいた。受容されたクローンを増殖させ、高純度クローンｉＰＳ細胞（＞９９％）を含むマスター細胞バンク（ＭＣＢ）として、上記のようにＦＭＭ２を使用して、すなわち、ソーティング後又はｉＰＳＣコロニー形成後にアクチビンＡを添加し、必要に応じてＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化の一方又は両方の濃度を約３０％～６０％低下させて、凍結保存した。核型分析及び多能性遺伝子プロファイリングを使用して、ｉＰＳＣクローンの凍結後安定性を決定した。

ＴａｑＭａｎプローブ（図１０Ａ；黒いバー）は、ｉＰＳＣクローンにおけるリプログラミングベクターの検出におけるリプログラミングベクターの検出に使用された。ＳＴＴＲ２システムを使用して異なるドナーＴ細胞をリプログラミングすることにより、完全なベクタークリアランスで１００％導入遺伝子フリーであるｉＰＳＣクローンのロバストな生成がもたらされることが観察され（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）、以前のシステムと比較して、より高い量及びより信頼性のあるフットプリントフリーの結果を示す。更に、ＳＴＴＲ２産生ｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリー分析により、ｉＰＳＣ表面マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１及びＣＤ３０）の均一な発現が示された（図１１）。全てのｉＰＳＣクローンは、親Ｔ細胞と比較して、それらの遺伝子発現プロファイルにおいて等しくかつ明確に分岐しており、ＳＴＴＲ２システムが、例えば線維芽細胞又はケラチノサイトと比較してリプログラミングすることが特に困難である最終分化Ｔ細胞に由来する高品質の多能性細胞の生成をもたらしたことが確認された。

更に、ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣクローンは、３つ全ての胚葉を表す細胞型に分化する高い傾向を維持することが見出された。ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣの多能性を、それらの三系統分化能を試験することによって評価した。ｉＰＳＣ分化は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＴｒｉｌｉｎｅａｇｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＫｉｔ（Stem Cell Technologies）を使用して実施した。系統特異的分化を誘導するために示された培地中で培養してから１週間後、分化細胞を採取し、示された系統マーカー（内胚葉については膵臓前駆細胞マーカーＳＯＸ１７、中胚葉については間葉系マーカーＣＤ５６、及び外胚葉については神経前駆細胞マーカーＳＯＸ２）の発現をフローサイトメトリーによって評価した（図１２Ａ）。

ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣの多能性を、Ｔリンパ球のような最終分化細胞へと分化するそれらの能力を試験することによって評価した。ｉＰＳＣを段階特異的培地中で培養して、造血性特異化及びＴ細胞分化を誘導した。図１２Ｂに示されるように、示された時点でのフローサイトメトリー分析は、ＳＴＴＲ２によって生成されたｉＰＳＣが、従来のエピソームシステムを使用して生成された対照ｉＰＳＣと同様に成熟Ｔ細胞に分化することを実証した。

別の実験において、ＳＴＴＲ２を使用して得られたｉＰＳＣの多能性を、インビボ奇形腫形成アッセイによって評価した。ＳＴＴＲ２によって生成された０．５～２００万個のｉＰＳＣを、皮下注射によって免疫不全ＮＳＧマウスに移植した。注射の６～１０週間後、奇形腫組織を採取し、処理し、ヘアトキシリン（heatoxylin）及びエオシンによるパラフィン包埋組織切片の染色を含む組織学的分析に供した。図１２Ｃに示されるように、ＳＴＴＲ２システムを使用して生成されたｉＰＳＣクローンの多能性は、奇形腫が胚性胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のそれぞれに由来する組織を含有することから確認された。

まとめると、データは、ＦＭＭのＲＯＣＫｉ、ＭＥＫｉ及びＧＳＫ３ｉに加えて、ＨＤＡＣｉ及びＴＧＦβｉなどのリプログラミング段階特異的小分子を含む増強されたＳＴＴＲ２システムを使用してリプログラミング遺伝子を一過的及び一時的に発現させることによって、フットプリントフリーｉＰＳＣを容易に作製することができることを示す。強化されたプラットフォームは、広範な継代にわたって多能性を維持するＴｉＰＳＣを含む実質的に均質なフットプリントフリーのｉＰＳＣ集団の効率的かつ迅速な生成を支持する。

－ＳＴＴＲ２を使用して得られたｉＰＳＣは連続的に操作された後にゲノム安定性を維持し機能的Ｔ細胞を産生する
ｉＰＳＣクローンを解凍し、実施例２に記載したように増殖させた。この実験では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現カセットの指定されたゲノム遺伝子座への標的挿入を媒介するＣＲＩＳＰＲＲＮＰ複合体でｉＰＳＣをエレクトロポレーションすることによって、操作を行った。操作された細胞集団を単一細胞ソーティングし、所望の遺伝子モダリティのスクリーニングのために増殖させた。試験した最後の継代（すなわち、ｉＰＳＣ解凍後の継代１０）において正常な核型（46、ＸＸ）を示す選択されたクローンを増殖させ、ＦＭＭ２中で凍結保存し、凍結保存後の核型分析によってゲノム安定性について試験した。図１３に示されるように、ＳＴＴＲ２によって生成され、ＣＡＲによって操作されたｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイルは、ｉＰＳＣ表面マーカー（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１及びＣＤ３０）の均一な発現を示した。

別の実験において、ｉＰＳＣを段階特異的培地中で培養して、造血性特異化及びＴ細胞分化を誘導した。Ｔ細胞増殖の終わりに、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞をフローサイトメトリー及びインビトロ死滅アッセイによって分析した。図１４Ａに示されるように、ＳＴＴＲ２生成、ＣＡＲ操作されたｉＰＳＣクローンから生成されたＴ細胞のフローサイトメトリープロファイルは、Ｔ同一性マーカー（ＣＤ３ｉｃ及びＣＤ７）の均質な発現を示した。ＣＡＲ発現は、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の９０％超において示された。ＴＣＲ発現の欠如により、Ｔ細胞受容体アルファ定常（T Cell Receptor Alpha Constant、ＴＲＡＣ）遺伝子が、ｉＰＳＣ段階でＣＲＩＳＰＲ操作によって破壊されたことが確認された。

ＳＴＴＲ２により生成され、ＣＡＲにより操作されたｉＰＳＣから分化したＴ細胞を、フローサイトメトリーに基づくインビトロ細胞傷害性アッセイを使用して、腫瘍標的細胞を認識し、死滅させるそれらの能力について評価した。初代ＣＡＲ－Ｔ細胞を、比較のためにアッセイに含めた。エフェクター細胞（初代ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｉＰＳＣＣＡＲ－Ｔ細胞）を、ＣＡＲ特異的抗原発現を有するがん細胞株（ｐｏｓ抗原腫瘍）及びＣＡＲ特異的抗原発現を有しないがん細胞株（ｎｅｇ抗原腫瘍）とともに、示されたエフェクター対標的（effector to target、Ｅ：Ｔ）比で約４時間共培養して、フローサイトメトリーによって分析した。図１４Ｂに示されるように、各エフェクター対標的（Ｅ：T）比についてのパーセント細胞傷害性を、以下の式に従って計算した。細胞傷害性パーセント＝１００－（被験物質を含む残存する生存標的細胞の％／被験物質の非存在下で残存する生存標的細胞の％×１００）。まとめると、データは、ＳＴＴＲ２によって生成され、ＣＡＲ操作されたｉＰＳＣクローンから分化したＴ細胞が、ＣＡＲ操作された初代Ｔ細胞と比較して、同様の抗原特異的死滅機能を示したことを示す。

－治療的使用のための誘導細胞の供給源として単一細胞由来ｉＰＳＣバンクを作製するための一過性及び一時的リプログラミングシステム
ＳＴＴＲ２リプログラミング及びＦＭＭ２維持組成物及び方法は、既製の免疫療法のための再生可能で信頼できる細胞源として使用するために、本出願においてクローンマスターｉＰＳＣ株を作製するために並行して使用されている。ドナーに同意した線維芽細胞又はＴ細胞を、開示されるようなプラスミドの組み合わせでトランスフェクトした。リプログラミング細胞をクローン密度で９６ウェルプレートにソーティングし、単一細胞由来のｉＰＳＣクローンを増殖させ、多能性、リプログラミングプラスミドの喪失、ゲノム安定性及び分化能を含む所望の属性についてスクリーニングした。選択されたクローンｉＰＳＣ株を、厳密な製造及びプロセス品質管理の下で製造及び凍結保存し、関連する規制の下で必要とされる「マスター細胞バンク」として認定するために、株を更に広範な特徴付け及び試験に供した。製造されたｉＰＳＣバンクのｉＰＳＣを、現在の優良製造規範に従って、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）系統又はＴ系統の細胞に、臨床的に関連する規模まで分化させた。誘導細胞は更に、関連する規制下で必要とされる「薬物物質及び薬物製品」として認定するために、広範な特徴付け及び試験に供された。ｉＰＳＣ由来のＮＫ又はＴ系統細胞は、単剤療法として、又は免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、血液がん及び固形がんの養子細胞療法に使用するために、例えば、約１×１０^８細胞／用量で多数の用量を生成するために凍結保存された。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０^８細胞／用量は１．６７×１０^６細胞／ｋｇに変換される。各適応症についての投薬形態、投与経路及び投薬レジメンを設計し、ＧＬＰ（優良試験所基準）及び非ＧＬＰ試験インビトロ及びインビボの両方からの臨床前データに従って決定した。

ＳＴＴＲ２リプログラミングプラットフォーム及び／又はＦＭＭ２維持培地によって生成されたフットプリントフリー及びフィーダー細胞フリーマスターｉＰＳＣ株は、がん及び免疫疾患を処置するためのｉＰＳＣ由来免疫細胞を支持することを超えて、黄斑変性症から心血管疾患に及ぶ変性障害のための既製の細胞療法も可能にする潜在能力を有する。

当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。

本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び必要に応じた特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によってしばしば想到され得、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。

Claims

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）産生のための組成物であって、
（ｉ）ＴＧＦβファミリータンパク質と、
（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤及びＷＮＴ活性化因子と、を含み、
前記組成物が、ＴＧＦβ阻害剤を含まず、
前記組成物が、長期ｉＰＳＣ維持においてｉＰＳＣ多能性及びゲノム安定性を改善するのに有効である、組成物。
（ａ）前記長期ｉＰＳＣ維持が、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離、解離したｉＰＳＣの単一細胞ソーティング、ｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖、クローンｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存、ｉＰＳＣＭＣＢの解凍、及び必要に応じて前記ｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルを含む段階のうちの１つ以上を含むか、又は
（ｂ）前記ＴＧＦβファミリータンパク質が、ｉＰＳＣコロニーの単一細胞解離時、又はｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖時、若しくはその間の任意の段階で、前記組成物に必要に応じて添加されるか、又は
（ｃ）前記ＭＥＫ阻害剤及び／若しくは前記ＷＮＴ活性化因子が、非多能性細胞を前記ｉＰＳＣにリプログラミングするためのリプログラミング組成物に使用される量の３０～６０％の量にある、請求項１に記載の組成物。
（ｉ）前記ＴＧＦβファミリータンパク質が、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、Ｎｏｄａｌ、及びそれらの機能的バリアント若しくは断片のうちの少なくとも１つを含み、かつ／又は
（ｉｉ）前記ＷＮＴ活性化因子がＧＳＫ３阻害剤を含む、
請求項１に記載の組成物。
（ｉ）前記非多能性細胞が、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は
（ｉｉ）前記非多能性細胞が、Ｔ細胞を含むか、又は
（ｉｉｉ）前記リプログラミング組成物が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＴＧＦβ阻害剤、及び必要に応じてＨＤＡＣ阻害剤を含み、前記ＴＧＦβ阻害剤及び前記ＨＤＡＣ阻害剤が、リプログラミング中の特定の段階で前記リプログラミング組成物に含まれる、
請求項２に記載の組成物。
（ｉ）前記改善された長期ｉＰＳＣ多能性が、前記組成物の接触なしのｉＰＳＣと比較して、低減された多能性復帰又は低減された自発的分化によって示され、
（ｉｉ）前記改善されたゲノム安定性が、前記組成物の接触なしのｉＰＳＣと比較してゲノム異常におけるより低い傾向によって示される、
請求項１に記載の組成物。
前記改善されたゲノム安定性が、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を含む、請求項５に記載の組成物。
ｉＰＳＣを更に含み、必要に応じて、前記ｉＰＳＣが少なくとも１つのゲノム編集を含む、請求項１に記載の組成物。
（ｉ）前記ｉＰＳＣ維持が、操作されたｉＰＳＣプールを得るためのｉＰＳＣ遺伝子編集と、操作されたｉＰＳＣプールの単一細胞ソーティングと、操作されたｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖と、クローン操作されたｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存と、操作されたｉＰＳＣＭＣＢの解凍と、必要に応じて、前記操作されたｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルと、を更に含み、
（ｉｉ）前記操作されたｉＰＳＣが、少なくとも１つのゲノム編集を含む、
請求項２に記載の組成物。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）産生のための組成物であって、
（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子と、
（ｉｉ）ＨＤＡＣ阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ阻害剤と、を含み、
前記組成物が、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有するｉＰＳＣを得るために非多能性細胞のリプログラミングを改善するのに有効であり、必要に応じて、
前記組成物への（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の添加が、増加したリプログラミング効率のための前記非多能性細胞のリプログラミング中に段階特異的である、組成物。
（ａ）前記非多能性細胞の前記リプログラミングが、体細胞トランスフェクション（０日目）、外因性遺伝子発現、ヘテロクロマチンの増加、体細胞同一性の喪失、及びｉＰＳＣコロニー形成を含む１つ以上の段階を含むか、又は
（ｂ）前記ＨＤＡＣ阻害剤の前記添加が、必要に応じて、クロマチン再構築時、若しくは２～３日目頃（トランスフェクション後）であるか、又は
（ｃ）前記ＴＧＦβ阻害剤の前記添加が、必要に応じて、体細胞同一性の喪失時、若しくは６～８日目頃（トランスフェクション後）におけるものであり、
リプログラミングにおける１つ以上の段階が、細胞形態変化及び／又はマーカー遺伝子プロファイリングによって示される、
請求項９に記載の組成物。
（ｉ）前記ＨＤＡＣ阻害剤が、バルプロ酸（ＶＰＡ）又はその機能的バリアント若しくは誘導体を含み、かつ／あるいは
（ｉｉ）前記ＷＮＴ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤を含む、
請求項９に記載の組成物。
（ｉ）前記非多能性細胞が、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は
（ｉｉ）前記非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む、
請求項９に記載の組成物。
（ｉ）前記確立された多能性が、基底状態多能性を含み、かつ／又は
（ｉｉ）前記確立された多能性が、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は
（ｉｉｉ）前記改善されたゲノム安定性が、リプログラミング中に前記組成物の接触なしで得られたｉＰＳＣよりもゲノム異常における低い傾向によって示され、かつ／又は
（ｉｖ）前記増加したリプログラミング効率が、リプログラミング中に前記組成物の接触なしで得られたｉＰＳＣプールのパーセンテージよりも、リプログラミング後のｉＰＳＣプールにおける多能性マーカー遺伝子を発現する細胞の高いパーセンテージによって示される、
請求項９に記載の組成物。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生する方法であって、ｉＰＳＣの集団を凍結保存するステップを含み、
前記ｉＰＳＣが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触しており、
前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、凍結保存中に維持され、必要に応じて、
均質なｉＰＳＣを含む前記ｉＰＳＣの集団が、クローンｉＰＳＣ単一細胞から増殖される、方法。
単一細胞ｉＰＳＣクローンを増殖させてクローンｉＰＳＣの集団を得るステップを更に含み、
前記ｉＰＳＣが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触しており、
前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、増殖中に維持される、請求項１４に記載の方法。
単一細胞ｉＰＳＣクローンを得るために、解離したｉＰＳＣを単一細胞ソーティングするステップを更に含み、
前記ｉＰＳＣが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触しており、
前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、単一細胞ソーティング中に維持される、請求項１５に記載の方法。
ｉＰＳＣコロニーを単一細胞ｉＰＳＣに解離するステップを更に含み、
前記ｉＰＳＣが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触しており、
前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、ｉＰＳＣ単一細胞解離中に維持される、請求項１６に記載の方法。
非多能性細胞のリプログラミングから生成されたｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを得るステップを更に含む、請求項１７に記載の方法。
前記ｉＰＳＣが、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞からリプログラミングされるか、又は前記ｉＰＳＣが、Ｔ細胞からリプログラミングされる、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）前記多能性が、基底状態多能性を含み、かつ／又は
（ｉｉ）前記多能性が、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は
（ｉｉｉ）前記ゲノム安定性が、前記組成物の接触なしの前記ステップにおけるｉＰＳＣよりもゲノム異常における低い傾向を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生する方法であって、前記方法が、
（ｉ）非多能性細胞に１つ以上のリプログラミング因子を移入して、前記細胞のリプログラミングを開始することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後の前記細胞を請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物と十分な期間接触させ、それによって、前記非多能性細胞をリプログラミングすることによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を含む、方法。
移入するステップが、前記非多能性細胞に、
（ｉ）１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含まず、前記１つ以上の第１のプラスミドが、少なくともＯＣＴ４、又は少なくともＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、
（ｉｉ）（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、前記第２のプラスミドが複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を導入することを含む、請求項２１に記載の方法。
前記１つ以上の第１のプラスミドが、ＳＯＸ２及びＫＬＦの一方若しくは両方、又はＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを更に集合的に含む、請求項２２に記載の方法。
接触させるステップが、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の存在下で、前記細胞を培養することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
接触させるステップが、
（ａ）ステップ（ｉ）の後の前記細胞を、必要に応じて外因性リプログラミング因子発現の段階で、又はリプログラミング因子移入（０日目）後１～２日目に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子を含む組み合わせと接触させることと、
（ｂ）必要に応じてクロマチン再構築の段階で、又はリプログラミング因子移入後２～３日目頃に、ステップ（ａ）の前記細胞をＨＤＡＣ阻害剤と接触させることと、
（ｃ）必要に応じて体細胞同一性の喪失の段階で、又は６～８日目頃（トランスフェクション後）に、ステップ（ｂ）の前記細胞をＴＧＦβ阻害剤と接触させることと、
それによって、ｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を含み、
前記段階が、細胞形態変化及び／若しくはマーカー遺伝子プロファイリングによって示され、かつ／又は
前記ｉＰＳＣが、フットプリントフリーであり、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有し、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングと比較して、より高い効率で産生される、請求項２１に記載の方法。
（ｉ）前記非多能性細胞が、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は
（ｉｉ）前記非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む、
請求項２１に記載の組成物。
（ｉ）前記確立された多能性が、基底状態多能性を含み、かつ／又は
（ｉｉ）前記確立された多能性が、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は
（ｉｉｉ）前記改善されたゲノム安定性が、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングからのｉＰＳＣよりもゲノム異常における低い傾向を含み、かつ／又は
（ｉｖ）前記増加したリプログラミング効率が、リプログラミング中に前記組成物の接触なしで得られたｉＰＳＣプールのパーセンテージよりも、リプログラミング後のｉＰＳＣプールにおける多能性マーカー遺伝子を発現する細胞の高いパーセンテージによって示される、
請求項２５に記載の方法。
前記改善されたゲノム安定性が、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を更に含む、請求項２６に記載の方法。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生する方法であって、前記方法が、
（ｉ）非多能性細胞に１つ以上のリプログラミング因子を移入して、前記細胞のリプログラミングを開始することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後の前記細胞を請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物と十分な期間接触させ、それによってｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することであって、前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が確立されている、生成することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記ｉＰＳＣコロニーを解離したｉＰＳＣに解離することであって、前記ｉＰＳＣが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触している、解離することと、
（ｉｖ）解離したｉＰＳＣをソーティングして、１つ以上の単一細胞ｉＰＳＣクローンを得ることであって、前記単一細胞ｉＰＳＣクローンが、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触している、得ることと、必要に応じて、
（ｖ）前記単一細胞ｉＰＳＣクローンをクローンｉＰＳＣの集団に増殖させることであって、前記クローンｉＰＳＣの集団が、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触していることと、必要に応じて、
（ｖｉ）前記クローンｉＰＳＣの集団を凍結保存することであって、前記凍結保存された集団が、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物と接触している、凍結保存することと、を含み、
前記ｉＰＳＣの多能性及びゲノム安定性が、解離、ソーティング、増殖、凍結保存、又は解凍のステップ中に維持される、方法。
前記方法が、前記クローンｉＰＳＣの集団を凍結保存することを含む、請求項２９に記載の方法。
前記１つ以上のリプログラミング因子が、少なくともＯＣＴ４を含む、請求項２９に記載の方法。
前記移入するステップ（ｉ）が、前記非多能性細胞に、
（ａ）１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含まず、前記１つ以上の第１のプラスミドが、少なくともＯＣＴ４、又は少なくともＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びラージＴ抗原（ＬＴａｇ）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含み、前記１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、
（ｂ）（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、前記第２のプラスミドが複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を導入することを含む、請求項２９に記載の方法。
前記１つ以上の第１のプラスミドが、ＳＯＸ２及びＫＬＦの一方若しくは両方、又はＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを更に集合的に含む、請求項３２に記載の方法。
接触させるステップ（ｉｉ）が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、ＨＤＡＣ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤の存在下で、前記細胞を培養することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
接触させるステップ（ｉｉ）が
（ａ）ステップ（ｉ）の後の前記細胞を、必要に応じて外因性リプログラミング因子発現の段階で、又はリプログラミング因子移入（０日目）後１～２日目に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子を含む組み合わせと接触させることと、
（ｂ）必要に応じてクロマチン再構築の段階で、又はリプログラミング因子移入後２～３日目頃に、ステップ（ａ）の前記細胞をＨＤＡＣ阻害剤と接触させることと、
（ｃ）必要に応じて体細胞同一性の喪失の段階で、又は６～８日目頃（移入後）に、ステップ（ｂ）の前記細胞をＴＧＦβ阻害剤と接触させることと、
それによって、ｉＰＳＣを含む少なくとも１つのコロニーを生成することと、を更に含み、
前記段階が、細胞形態変化及び／若しくはマーカー遺伝子プロファイリングによって示され、かつ／又は
前記ｉＰＳＣが、確立された多能性及び改善されたゲノム安定性を有し、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）なしのリプログラミングと比較して、より高い効率で産生される、請求項２９に記載の方法。
（１）前記ソーティングステップ（ｉｖ）、前記増殖ステップ（ｖ）、及び前記凍結保存ステップ（ｖｉ）、並びに必要に応じて前記解離ステップ（ｉｉｉ）の前記細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＷＮＴ活性化因子と接触させることであって、前記ＭＥＫ阻害剤及び前記ＷＮＴ活性化因子の一方又は両方の濃度が、ステップ（ｉｉ）における濃度の３０％～６０％である、接触させることと、
（２）追加的に、前記増殖ステップ（ｖ）及び前記凍結保存ステップ（ｖｉ）、並びに必要に応じて前記解離ステップ（ｉｉｉ）及び／又は前記ソーティングステップ（ｉｖ）の細胞を、ＴＧＦβファミリータンパク質と接触させることと、を更に含み、
ステップ（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）における前記細胞が、ＴＧＦβ阻害剤又はＨＤＡＣ阻害剤のいずれとも接触していない、請求項２９に記載の方法。
（ｉ）前記非多能性細胞が、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は
（ｉｉ）前記非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む、
請求項２９に記載の方法。
（ｉ）前記多能性が、基底状態多能性を含み、かつ／又は
（ｉｉ）前記多能性が、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加によって表され、かつ／又は
（ｉｉｉ）前記ｉＰＳＣが、少なくとも１つのゲノム編集を含み、かつ／又は
（ｉｖ）前記ゲノム安定性が、ゲノム異常における低い傾向を含む、
請求項２９に記載の方法。
前記ゲノム安定性が、Ｔ細胞のリプログラミングから得られたｉＰＳＣにおけるトリソミー又は核型異常の低減又は予防を更に含む、請求項３８に記載の方法。
前記方法が、操作されたｉＰＳＣプールを得るためのｉＰＳＣの遺伝子編集と、操作されたｉＰＳＣプールの単一細胞ソーティングと、操作されたｉＰＳＣ単一細胞クローン増殖と、クローン操作されたｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）凍結保存と、操作されたｉＰＳＣＭＣＢの解凍と、必要に応じて前記操作されたｉＰＳＣＭＣＢの更なる凍結保存－解凍サイクルと、を更に含み、前記操作されたｉＰＳＣが、少なくとも１つのゲノム編集を含む、請求項２９に記載の方法。
人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、細胞株、クローン集団、又はそのマスター細胞バンクを含む組成物であって、前記ｉＰＳＣが、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＷＮＴ活性化因子、及びＴＧＦβファミリータンパク質の組み合わせと接触し、前記ｉＰＳＣが、ＭＡＥＬ、ＫＬＦ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＰＰＡ５、ＰＲＤＭ１４、ＦＧＦ４、ＵＴＦ１、ＴＦＣＰ２Ｌ１、及びＴＢＸ３のうちの１つ以上を含むナイーブ特異的遺伝子発現の増加を含み、必要に応じて、前記ｉＰＳＣが、次の特性：高クローン性、遺伝的安定性、及び基底状態多能性のうちの少なくとも１つを有する、組成物。
前記ＴＧＦβファミリータンパク質が、アクチビンＡ、ＴＧＦβ、Ｎｏｄａｌ、及びそれらの機能的バリアント若しくは断片のうちの少なくとも１つを含み、かつ／又は前記ＷＮＴ活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項４１に記載の組成物。
前記ｉＰＳＣが、非多能性細胞のリプログラミングから生成される、請求項４１に記載の組成物。
前記非多能性細胞が、体細胞、前駆細胞、若しくは多分化能細胞を含むか、又は前記非多能性細胞が、Ｔ細胞を含む、請求項４３に記載の組成物。
前記ｉＰＳＣが、ゲノム編集を少なくとも含む、請求項４４に記載の組成物。
培地を更に含み、前記培地がフィーダーフリーである、請求項４１に記載の組成物。
前記ｉＰＳＣが、次の特性：高いクローン性、遺伝的安定性、及び基底状態多能性のうちの少なくとも１つを有する、請求項４１に記載の組成物。
請求項１４～４０のいずれか一項に記載の方法によって産生された、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、細胞株、クローン集団又はそのマスター細胞バンク。
前記ｉＰＳＣが、ゲノム編集を少なくとも含む、請求項４８に記載の人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、細胞株、クローン集団又はそのマスター細胞バンク。
請求項４８又は４９に記載の多能性細胞又は細胞株のインビトロ分化から得られた、誘導された非天然細胞又はその集団。
前記細胞が、免疫エフェクター細胞であり、必要に応じて、前記免疫エフェクター細胞が、前記ｉＰＳＣに含まれたゲノム編集を少なくとも含む、請求項５０に記載の誘導された非天然細胞又はその集団。
前記細胞が、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、造血性幹細胞若しくは造血性前駆細胞、造血性多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又は免疫調節細胞を含む、請求項５０に記載の誘導された非天然細胞又はその集団。
前記細胞が、その天然細胞対応物と比較して、以下の特性：ヘテロクロマチンの全体的な増加、ミトコンドリア機能の改善、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメア伸長及び短いテロメアのパーセンテージの減少、老化細胞の割合の減少、並びに増殖、生存率、持続、又は記憶様機能のより高い潜在能力、のうちの少なくとも１つを含む若返り細胞である、請求項５０に記載の誘導された非天然細胞又はその集団。
細胞ベースの療法における適用のための多能性細胞の製造における使用のための組成物であって、請求項１４～４０のいずれか一項に記載の方法によって産生された多能性細胞を含む、組成物。
前記多能性細胞が、同種異系又は自己由来である、請求項５４に記載の組成物。
請求項１４～４０のいずれか一項に記載の方法によって得られた多能性細胞を含む、医薬用キット。
請求項４８に記載の人工多能性細胞又は請求項５０～５３のいずれか一項に記載の誘導された非天然細胞を含む、医薬用キット。
非多能性細胞においてリプログラミングを開始するためのインビトロシステムであって、前記システムが、
１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドのそれぞれが、複製起点、及び１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、ＥＢＮＡ又はその誘導体をコードせず、前記１つ以上の第１のプラスミドが、ＯＣＴ４、ＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びＬＴａｇをコードするポリヌクレオチドを集合的に含む、１つ以上の第１のプラスミドと、必要に応じて、
（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、前記第２のプラスミドが複製起点又はリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、
（２）ＥＢＮＡｍＲＮＡ、及び
（３）ＥＢＮＡタンパク質のうちの１つと、を含む、インビトロシステム。
前記第２のプラスミドが、高率の損失を有し、前記ＥＢＮＡの発現が、一過性かつ一時的である、請求項５８に記載のシステム。
核におけるＥＢＮＡ複製及び／又は連続発現を提供しない、請求項５８又は５９に記載のシステム。
前記システムが、短期間、かつ多能性細胞形態の出現及び内因性多能性遺伝子の誘導発現の前に、ＥＢＮＡの一過性／細胞質発現を可能にする、請求項５８～６０のいずれか一項に記載のシステム。
前記システムが、短期間、かつ前記多能性細胞形態の出現及び前記内因性多能性遺伝子の誘導発現の前に、前記第１のプラスミドに含まれた１つ以上のリプログラミング因子の一過性／細胞質発現を可能にする、請求項５８～６１のいずれか一項に記載のシステム。
前記複製起点が、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、及びＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスからなる群から選択される、請求項５８～６２のいずれか一項に記載のシステム。
前記複製起点が、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、及びエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるものである、請求項５８～６３のいずれか一項に記載のシステム。
前記複製起点が、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、又はそれに由来する、請求項５８～６４のいずれか一項に記載のシステム。
前記ＥＢＮＡが、ＥＢＶベースである、請求項５８～６５のいずれか一項に記載のシステム。
前記１つ以上の第１のプラスミドが、（ｉ）ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、及びＬ１ＴＤ１のうちの１つ以上、又は（ｉｉ）ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ、及びＺＩＣ３、を含むリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを更に集合的に含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載のシステム。
リプログラミング因子をコードする前記ポリヌクレオチドが、ポリシストロニック構築物又は非ポリシストロニック構築物に含まれる、請求項５８～６７のいずれか一項に記載のシステム。
前記ポリシストロニック構築物が、単一のオープンリーディングフレーム又は複数のオープンリーディングフレームを含む、請求項６８に記載のシステム。
前記システムが、２つ以上の第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドが、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによってコードされた同じ又は異なるリプログラミング因子を含む、請求項５８～６９のいずれか一項に記載のシステム。
前記システムが、４つの第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドが、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによってコードされた同じ又は異なるリプログラミング因子を含む、請求項５８～７０のいずれか一項に記載のシステム。
前記システムが、４つの第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドが、それぞれＯＣＴ４及びＹＡＰ１、ＳＯＸ２及びＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＬＴａｇ、並びにＥＳＲＲＢ及びＺＩＣ３をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含む、請求項５８～７１のいずれか一項に記載のシステム。
前記第１のプラスミドが、リプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記隣接するポリヌクレオチドが、自己切断ペプチド又はＩＲＥＳをコードするリンカー配列によって作動可能に接続されている、請求項５８～７２のいずれか一項に記載のシステム。
前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドであり、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａを含む群から選択される、請求項７３に記載のシステム。
第１のプラスミド構築物に含まれた前記２Ａペプチドが、同じであっても異なっていてもよい、請求項７４に記載のシステム。
隣接する位置の２つの２Ａペプチドが異なる、請求項７４又は７５に記載のシステム。
前記第１及び前記第２のプラスミドがそれぞれ、リプログラミング因子及びＥＢＮＡの発現のための１つ以上のプロモーターを含み、前記１つ以上のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、及び構成的、誘導的、内因的に調節される、又は一時的、組織、若しくは細胞型特異的である他の適切なプロモーターのうちの少なくとも１つを含む、請求項５８～７６のいずれか一項に記載のシステム。
前記第１及び前記第２のプラスミドがそれぞれＣＡＧプロモーターを含む、請求項５８～７７のいずれか一項に記載のシステム。
請求項５８～７８のいずれか一項に記載のシステムを含む、キット。