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CN116348592A - 诱导性多能干细胞的改善的重编程、维持和保存 - Google Patents

诱导性多能干细胞的改善的重编程、维持和保存 Download PDF

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CN116348592A
CN116348592A CN202180072214.8A CN202180072214A CN116348592A CN 116348592 A CN116348592 A CN 116348592A CN 202180072214 A CN202180072214 A CN 202180072214A CN 116348592 A CN116348592 A CN 116348592A
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cell
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ipscs
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赖益信
B·瓦拉马尔
R·阿布贾鲁尔
徐慧婷
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Fate Therapeutics Inc
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Abstract

提供了使用小分子支持的载体系统诱导非多能细胞的重编程的方法和组合物，以高效提供具有期望特性的iPSC。还提供了使用所提供的重编程方法和组合物对细胞和iPSC群体或克隆细胞系进行重编程。进一步提供了用于维持和保存iPSC同时实现该细胞的基因组稳定性的组合物和方法。

Description

诱导性多能干细胞的改善的重编程、维持和保存
相关申请
本申请要求2020年10月2日提交的美国临时申请序列号63/087,119的优先权，其公开内容据此全文以引用方式并入。
技术领域
本公开广泛涉及产生人诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)的领域。更具体地，本公开涉及使用质粒载体的组合来以更高的效率和增加的可靠性获得具有期望特性的无足迹iPSC。
背景技术
最初使用整合病毒系统表达关键转录因子来产生iPSC。逆转录病毒和慢病毒系统(包括多顺反子和诱导型系统)现在已经成功地用于iPSC产生。然而，由于插入诱变和iPSC分化后外源基因再活化的可能性引起的永久基因组变化可能对随后的药物筛选和通过这些方法产生的细胞的治疗应用提出潜在的问题。实际上，已经报道了使用相同病毒系统产生的iPSC克隆之间的显著差异，当作为分化的神经球移植时，啮齿动物中很大百分比的克隆形成肿瘤。研究表明，使用相同病毒方法产生的iPSC一旦分化就可能表现不同。异位基因整合位点的差异可导致转基因表达的不同插入诱变和表观遗传调控。对于包括整合系统的iPSC产生方法，可能需要衍生和筛选许多克隆以鉴定在多能和分化状态中均稳定的那些克隆。
在细胞疗法制造过程中的许多关键方面中，细胞扩增和深低温保藏已经被鉴定为所关注的关键领域，其中细胞活力和功能性在冻-融循环期间受到极大影响，并且来源于iPSC分化的效应细胞的体内细胞功效和存留在iPSC分化后的效应细胞扩增阶段期间受到复杂影响。
发明内容
鉴于上述内容，本领域实质上需要有效产生无足迹iPSC的同质群体，该无足迹iPSC优选地处于多能性的“初始”或“基态”状态，以及优选地处于限定的培养条件。多能性的“初始”或“基态”状态赋予iPSC包括但不限于高克隆性、可持续的自我更新、最小的自发分化和基因组异常，以及作为解离的单细胞的高存活率的质量。根据本公开的实施方案的方法和组合物，以及特别是新的培养基和质粒载体系统解决了这种需要并提供了细胞重编程领域中的其他相关优点。
通过使用使外源基因的存在降至最低以降低宿主基因组整合的可能性的有效但瞬时和暂时表达系统，本公开的目的是提供有效产生iPSC而不包含引入非多能细胞以诱导重编程的外源DNA的方法和组合物。本公开的目的是提供一种组合质粒系统以有效地产生具有多能性和/或高克隆性的“初始”或“基态”状态的iPSC。具有基态多能性的iPSC能够实现单细胞解离的iPSC的长期存活和遗传稳定性，并且因此使得有可能产生适合于建库和操纵(诸如单细胞分选和/或耗竭、克隆iPSC靶向基因组编辑，和iPSC的同质群体的定向再分化)的克隆iPSC系。因此，本公开的另一个目的是提供产生单细胞衍生的iPSC克隆系或由其衍生的细胞的方法和组合物，所述iPSC克隆系或由其衍生的细胞在选择的位点处包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代，并且所述修饰在随后衍生的细胞中在分化、去分化、重编程、扩增、传代和/或移植后保留并保持功能性。
本申请的一个方面提供了一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物(例如，FMM2)，所述组合物包含(i)TGFβ家族蛋白、(ii)ROCK抑制剂和(iii)MEK抑制剂和WNT活化剂，其中所述组合物不包含TGFβ抑制剂，其中所述组合物在长期iPSC维持中有效地改善iPSC多能性和基因组稳定性。在一些实施方案中，所述长期iPSC维持包括一个或多个阶段，所述阶段包括：iPSC集落的单细胞解离、解离的iPSC的单细胞分选、iPSC单细胞克隆扩增、克隆iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、iPSC MCB的解冻和任选地所述iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；或者所述TGFβ家族蛋白任选地在iPSC集落的单细胞解离时，或在iPSC单细胞克隆扩增时，或在其间的任何阶段添加到所述组合物中；或者所述MEK抑制剂和/或所述WNT活化剂的量为用于将非多能细胞重编程为所述iPSC的重编程组合物中使用的量的30％-60％。在一些实施方案中，所述TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、Nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括T细胞；或者所述重编程组合物包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、TGFβ抑制剂和任选的HDAC抑制剂，其中所述TGFβ抑制剂和所述HDAC抑制剂在重编程期间的特定阶段被包含在所述重编程组合物中。
在一些实施方案中，与没有接触所述组合物的iPSC相比，所述改善的长期iPSC多能性通过减少的多能性逆转或减少的自发分化来指示；并且与没有接触所述组合物的iPSC相比，所述改善的基因组稳定性通过更低的基因组异常倾向来指示。在一些实施方案中，所述改善的基因组稳定性包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。在一些实施方案中，所述组合物还包含iPSC，任选地其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑。
在一些实施方案中，所述iPSC维持还包括iPSC基因编辑以获得工程改造的iPSC池、工程改造的iPSC池的单细胞分选、工程改造的iPSC单细胞克隆扩增、克隆工程改造的iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、工程改造的iPSC MCB的解冻和任选地所述工程改造的iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；并且所述工程改造的iPSC包含至少一种基因组编辑。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物(例如，FRM2)，所述组合物包含(i)ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂；(ii)HDAC抑制剂；和(iii)TGFβ抑制剂，其中所述组合物有效地改善非多能细胞的重编程以获得具有建立的多能性和改善的基因组稳定性的iPSC，并且任选地，其中将(i)、(ii)或(iii)添加到所述组合物中在所述非多能细胞的重编程期间对于提高的重编程效率是阶段特异性的。在一些实施方案中，所述非多能细胞的所述重编程包括一个或多个阶段，所述阶段包括：体细胞转染(第0天)、外源基因表达、异染色质增加、体细胞身份丧失和iPSC集落形成；或者所述HDAC抑制剂的所述添加任选地在染色质重组时，或在约第2-3天(转染后)；或者所述TGFβ抑制剂的所述添加任选地在体细胞身份丧失时，或在约第6-8天(转染后)，其中重编程中的所述一个或多个阶段通过细胞形态学变化和/或标记基因谱来指示。
在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包含丙戊酸(VPA)或其功能变体或衍生物；并且/或者所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者其中所述改善的基因组稳定性通过比在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC更低的基因组异常倾向来指示；并且/或者所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的所述iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。
在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括对iPSC群体进行深低温保藏的步骤，其中所述iPSC与如本文所述的组合物(例如，FRM2)接触，并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在深低温保藏期间得以维持；并且任选地，其中包含同质iPSC的所述iPSC群体从克隆iPSC单细胞扩增。
在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法还包括将单细胞iPSC克隆扩增以获得所述克隆iPSC群体的步骤，其中所述iPSC与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触，并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在扩增期间得以维持。
在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法还包括对解离的iPSC进行单细胞分选以获得单细胞iPSC克隆的步骤，其中所述iPSC与如本文所述的组合物(例如，FMM2)接触，并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在单细胞分选期间得以维持。
在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法还包括将iPSC集落解离成单细胞iPSC的步骤，其中所述iPSC与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触，并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在iPSC单细胞解离期间得以维持。
在一些实施方案中，产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法还包括获得至少一个包含由对非多能细胞进行重编程产生的iPSC的集落的步骤。
在产生诱导性多能干细胞的方法的各种实施方案中，所述iPSC从体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程，或者其中所述iPSC从T细胞重编程。在各种实施方案中，所述多能性包括基态多能性；并且/或者所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者所述基因组稳定性包括比在没有接触本文所述的组合物的所述步骤中的iPSC更低的基因组异常倾向。
在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其中所述方法包括(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；以及(ii)使步骤(i)后的所述细胞与本文所述的组合物(例如，FRM2)接触足够长的时间，从而通过对所述非多能细胞进行重编程来产生至少一个包含iPSC的集落。在一些实施方案中，所述转移步骤包括向所述非多能细胞中引入：(i)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码EBNA或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少OCT4，或至少OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及(ii)以下项中的一者：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)EBNA mRNA；和(3)EBNA蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个第一质粒还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者，或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述接触步骤还包括在ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的存在下培养所述细胞。在特定实施方案中，所述接触步骤包括：(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂的组合接触；(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与HDAC抑制剂接触；以及(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与TGFβ抑制剂接触，从而产生至少一个包含iPSC的集落；其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者其中所述iPSC是无足迹的，具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者所述改善的基因组稳定性包括比来自没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程的iPSC更低的基因组异常倾向；并且/或者所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。在一些实施方案中，所述改善的基因组稳定性还包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。
在另一方面，本发明提供了一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其中所述方法包括：(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；(ii)使步骤(i)后的所述细胞与本文所述的组合物(例如，FRM2)接触足够长的时间，从而产生至少一个包含iPSC的集落，其中建立所述iPSC的多能性和基因组稳定性；(iii)将步骤(ii)的所述iPSC集落解离成解离的iPSC，其中所述iPSC与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触；(iv)对解离的iPSC进行分选以获得一个或多个单细胞iPSC克隆，其中所述单细胞iPSC克隆与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触；以及任选地，(v)将所述单细胞iPSC克隆扩增成克隆iPSC群体，其中所述克隆iPSC群体与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触；以及任选地，(vi)对所述克隆iPSC群体进行深低温保藏，其中所深低温保藏的群体与本文所述的组合物(例如，FMM2)接触；其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在所述解离、分选、扩增、深低温保藏或解冻的步骤期间得以维持。在一些实施方案中，所述一种或多种重编程因子包含至少OCT4。
在各种实施方案中，所述转移步骤(i)包括向所述非多能细胞中引入：(a)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码EBNA或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少OCT4，或至少OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及(b)以下项中的一者：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)EBNA mRNA；和(3)EBNA蛋白。在一些实施方案中，所述一个或多个第一质粒还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者，或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述接触步骤(ii)还包括在ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的存在下培养所述细胞。在特定实施方案中，所述接触步骤(ii)还包括：(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂的组合接触；(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与HDAC抑制剂接触；以及(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与TGFβ抑制剂接触，从而产生至少一个包含iPSC的集落；其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者其中所述iPSC具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。在一些实施方案中，所述方法还包括：(1)使所述分选步骤(iv)、扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)的所述细胞与ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂接触，其中所述MEK抑制剂和所述WNT活化剂中的一者或两者的浓度为步骤(ii)中的浓度的30％-60％；以及(2)另外使所述扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)和/或分选步骤(iv)的所述细胞与TGFβ家族蛋白接触；并且其中步骤(iii)、(iv)、(v)和(vi)中的所述细胞不与TGFβ抑制剂或HDAC抑制剂接触。
在各种实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者所述非多能细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述多能性包括基态多能性；并且/或者所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者所述iPSC包含至少一种基因组编辑；并且/或者所述基因组稳定性包括更低的基因组异常倾向。在一些实施方案中，所述基因组稳定性还包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。
在一些实施方案中，所述方法还包括对iPSC进行基因编辑以获得工程改造的iPSC池、工程改造的iPSC池的单细胞分选、工程改造的iPSC单细胞克隆扩增、克隆工程改造的iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、工程改造的iPSC MCB的解冻和任选地所述工程改造的iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；并且其中所述工程改造的iPSC包含至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，基因组编辑导致B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CITTA、RFX5或RFXAP的缺失或减少的表达；或iPSC或iPSC衍生效应细胞中HLA-E、HLA-G、CD16、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、衔接子或衔接子的表面触发受体的引入或增加的表达。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含诱导性多能细胞(iPSC)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其中所述iPSC与ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂和TGFβ家族蛋白的组合接触，并且其中所述iPSC包含增加的初始特异性基因表达，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且任选地，所述iPSC具有以下特性中的至少一者：高克隆性、遗传稳定性和基态多能性。在一些实施方案中，所述TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、Nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。在一些实施方案中，所述iPSC通过对非多能细胞进行重编程来产生。在一些实施方案中，所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者其中所述非多能细胞包括T细胞。在一些实施方案中，所述iPSC包含至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，所述组合物还包含培养基，其中所述培养基是无饲养层的。
在另一方面，本发明提供了一种诱导性多能细胞(iPSC)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其通过本文所述的任何方法产生。在一些实施方案中，所述iPSC包含至少一种基因组编辑。
在另一方面，本发明提供了一种衍生的非天然细胞或其群体，其从本文所述的多能细胞或细胞系的体外分化获得。在一些实施方案中，所述细胞是免疫效应细胞，并且任选地，所述免疫效应细胞包含所述iPSC中包含的至少一种基因组编辑。在一些实施方案中，所述细胞包括CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或免疫调控细胞。在一些实施方案中，所述细胞是包含至少一种以下特性的再生细胞：异染色质的总体增加；改善的线粒体功能；增加的DNA损伤应答；端粒延长和短端粒百分比的降低；衰老细胞的分数降低；以及与其天然细胞对应物相比更高的增殖、存活、存留或记忆样功能的潜力。
在另一方面，本发明提供了一种用于制造应用于基于细胞的疗法的多能细胞的组合物，其中所述组合物包含通过本文所述的方法产生的多能细胞。在一些实施方案中，所述多能细胞是同种异体的或自体的。在另一方面，本发明提供了一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含通过本文所述的方法获得的多能细胞。在另一方面，本发明提供了一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的诱导性多能细胞或本文所述的衍生的非天然细胞。
本申请的再另一个方面提供了一种用于在非多能细胞中启动重编程的体外系统，其中所述系统包括：一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码OCT4、YAP1、SOX2和LTag的多核苷酸；以及任选地以下项中的一者：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸，(2)EBNA mRNA，和(3)EBNA蛋白。在一些实施方案中，所述系统的所述第二质粒具有高丧失率；并且其中所述第二质粒对EBNA的表达是短暂的、瞬时的和暂时的。在一些其他实施方案中，所述系统不在细胞核中提供EBNA复制和/或连续表达。在一个实施方案中，所述系统可以能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行EBNA的瞬时/细胞质表达。在一些实施方案中，所述系统能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行包含在所述第一质粒中的一种或多种重编程因子的瞬时/细胞质表达。
在所述系统的一个实施方案中，第一质粒的所述复制起点是选自由多瘤病毒科病毒、乳头瘤病毒科病毒和γ疱疹病毒亚科病毒组成的组的复制起点。在一些实施方案中，所述复制起点是选自由SV40、BK病毒(BKV)、牛乳头瘤病毒(BPV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)组成的组的复制起点。在一个特定实施方案中，所述复制起点对应于或来源于EBV的野生型复制起点。在一些其他实施方案中，所述系统中的所述第二质粒的所述EBNA是基于EBV的。在一些实施方案中，所述系统提供了一个或多个第一质粒共同包含编码重编程因子的多核苷酸，所述重编程因子包含(i)NANOG、KLF、LIN28、MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的一者或多者；或(ii)MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3。在一些实施方案中，所述编码重编程因子的多核苷酸包含在第一质粒中的多顺反子构建体或非多顺反子构建体中。在多顺反子构建体的一个实施方案中，其包含单个开放阅读框或多个开放阅读框。在系统包括两个或更多个第一质粒的实施方案中，每个第一质粒可包含由多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在一些实施方案中，所述系统包括四个第一质粒，每个第一质粒包含由所述多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在系统包括四个第一质粒的实施方案中，每个第一质粒包含分别编码OCT4和YAP1、SOX2和MYC、LIN28和LTag以及ESRRB和ZIC3的多核苷酸的至少一个拷贝。
在所述系统的一些实施方案中，所述第一质粒包含多于一种编码重编程因子的多核苷酸，其中所述相邻多核苷酸通过编码自切割肽或IRES的接头序列能够操作地连接。在一个实施方案中，所述自切割肽是2A肽，选自包含F2A、E2A、P2A和T2A的组。在另一个实施方案中，包含在第一质粒构建体中的所述2A肽能够是相同或不同的。在所述系统的所述质粒包含多个2A的另一实施方案中，相邻位置的两个2A肽是不同的。在所述系统的一些其他实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自包含用于表达重编程因子和EBNA的一个或多个启动子，并且所述一个或多个启动子包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC和组成型、诱导型、内源调控型或时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的其他合适启动子中的至少一者。在一个实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自包含CAG启动子。
在一个方面，本公开提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文公开的一种或多种组合物，诸如(i)用于iPSC产生的第一组合物和用于iPSC产生的第二组合物，和/或(ii)用于iPSC产生的第一组合物和用于iPSC维持的第二组合物。还提供了包含如本文所述的体外系统的试剂盒。
通过结合附图进行的以下描述，本发明方法和组合物的使用的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施方案。
附图说明
图1A和图1B表明，用TGFβ家族成员(诸如激活素A、TGFβ和/或Nodal)补充FMM和/或FMM中MEK和GSK3抑制剂的浓度降低增强iPSC的长期稳定性。图1A.该图表示出了用于测试用于长期iPSC培养的基于FMM的培养基的不同配方的示例性实验设计。图1B.使用图1A的实验设计测试了来源于T细胞供体1的一个工程改造克隆和来源于T细胞供体2的两个非工程改造克隆的ddPCR和核型结果的总结。
图2示出了在E8、FMM或FMM2中维持超过10次传代的三个TiPSC克隆的PCA分析的结果。
图3A和图3B示出了来自图2的三个TiPSC克隆的关键多能标记物的热图，其中共同的多能性标记物在测试的所有条件下表达(图3A)，并且初始特异性标记物的表达通过添加激活素A而进一步升高(图3B)。
图4A至图4C是显示补充有激活素A的FMM防止应激诱导的基因组异常的示意图和图示。图4A示出了用于诱导iPSC克隆的应激(工程改造和/或筛选/扩增)的示例性实验设计。图4B示出了使用FMM和FMM2(FMM+ActA)在所得iPSC群体中异常细胞的比较。图4C示出了使用FMM和FMM2(FMM+ActA)在所得iPSC群体中深低温保藏后异常克隆的比较。
图5A和图5B表明早期在iPSC产生过程中应用新的FMM配方导致iPSC的改善的基因组稳定性。图5A是显示从原代T细胞产生iPSC的示例性实验设计的图。图5B示出了与新的FMM配方相比，用FMM产生的iPSC克隆的基因组稳定性评估结果。
图6是显示用于短暂瞬时和时间重编程(STTR)系统的载体1(1)、载体1(2)…载体1(n)、载体1(n+1)和载体2的示例性DNA构建体的图。
图7A和图7B表明向STTR系统中添加丙戊酸(VPA)提高了STTR的重编程效率。图7A示出了使用STTR2系统在存在或不存在VPA处理的情况下重编程的T细胞中iPSC表面标记物(SSEA4、TRA-1-81和CD30)表达的流式细胞术分析。图7B表明VPA处理加强了来源于三个不同供体的T细胞的STTR2重编程。
图8A至图8C显示了来源于多个供体的T细胞的STTR2诱导的稳定多能培养物。图8A示出了由STTR2系统从2个不同供体的T细胞诱导的iPSC集落的图像。图8B表明iPSC群体的分数在连续传代中增加，指示来源于多个供体的稳定多能培养物。图8C示出了来自两个不同供体的T细胞的重编程池的代表性流式细胞术图谱。
图9是显示使用阶段特异性培养基的改善的重编程和iPSC维持的示例性工作流程的图。
图10A至图10C表明使用STTR2系统对T细胞进行重编程导致无转基因的iPSC克隆的稳健产生。图10A示出了用于检测重编程载体的TaqMan探针(黑条)的位置的图示。图10B示出了来自TaqMan测定的平均Ct值的示例；阳性对照1是具有多个转基因整合(对EBNA1和P2A呈阳性)的iPSC克隆；阳性对照2具有质粒骨架的整合(对KanR呈阳性)；ND：未检出。图10C示出了来源于2个不同供体的T细胞的STTR2克隆的载体清除结果的总结。
图11显示STTR2产生的iPSC克隆的流式细胞术图谱，其显示iPSC表面标记物(SSEA4、TRA-1-81和CD30)的同质表达。
图12A至图12C表明STTR2产生的iPSC克隆保持高的分化成代表所有三个胚层的细胞类型的倾向。图12A示出了所示谱系标记物(内胚层的胰腺祖细胞标记物SOX17、中胚层的间充质标记物CD56和外胚层的神经祖细胞标记物SOX2)的表达。图12B示出了在指定时间点的流式细胞术分析，其证明STTR2产生的iPSC分化成与使用常规游离型系统产生的对照iPSC类似的成熟T细胞。图12C提供了来自在STTR2产生的iPSC畸胎瘤中形成的三个胚层中的每个胚层的组织切片的图像。
图13显示STTR2产生的、CAR工程改造的iPSC的流式细胞术图谱，其显示多能性表面标记物的均质表达。
图14A和图14B显示来源于CAR工程改造的STTR2产生的iPSC的T细胞的表型和功能特性。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。冠词“一个”、“一种”和“该”在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一者或两者。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度相比，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围。
如本文所使用，术语“实质上”或“基本上”是指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度为参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施方案中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“实质上不含”与“基本上不含”可互换地使用，并且当用于描述组合物(例如细胞群或培养基)时，是指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包括任何浓度的这类成分或物质，或(2)所述组合物中包括功能上呈惰性、但呈低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“缺乏”，其是指组合物中物缺乏特定质或其来源。
如本文所用，术语“分离”等是指一种细胞或细胞群，其已与其初始环境中分离，即，分离细胞的环境实质上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包括从一些或所有组分去除的细胞，如同其在其自然环境例如组织、活检中发现。所述术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，如同所述细胞在非天然存在的环境例如培养物、细胞悬浮液中发现。因此，分离细胞部分地或完全地与至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群)分离，如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。分离细胞的具体示例包括部分纯细胞、实质上纯细胞和非天然存在的培养基中培养的细胞。分离细胞可以通过将所期望的细胞或其群体与环境中的其它物质或细胞分离或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群或亚群来获得。
如本文所用，术语“纯化”等是指提高的纯度。举例来说，纯度可以提高到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包括所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
“由…组成”意在包括并且限于短语“由…组成”之后的任何事物。因此，短语“由…组成”指示所列要素是需要或必需的，并且不能存在其他要素。
“基本上由…组成”打算包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中指定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“主要由…组成”指示所列要素是需要或必需的，但其它要素是任选的并且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“一实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“附加实施方案”或“另外实施方案”或它们的组合意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以任何合适方式组合。
术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中，在活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选地其中自然条件的变化最小。在特定实施方案中，“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养，并且通常培养几小时或长达约24小时，但包括长达48小时或72小时或更长，这视情况而定。在某些实施方案中，可以收集和冷冻这类组织或细胞，并且稍后解冻以便进行离体处理。使用活细胞或组织持续时间长于几天的组织培养实验或程序通常被视为“体外”，但在某些实施方案中，这个术语可以与离体互换使用。
术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞多能性或使细胞去分化成较低分化状态的方法或过程。举例来说，具有提高的细胞多能性的细胞具有与非重编程状态下相同细胞相比更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞是与非重编程状态下相同细胞相比分化状态较低的细胞。与重编程细胞相反，“重编程细胞”是指经历重编程/去分化为多能状态的非多能细胞，呈现过渡形态(即，形态变化)但没有多能细胞的标志，包括多能干细胞形态或稳定的内源多能性基因表达，诸如OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA181、CD30和/或CD50。“重编程细胞”的过渡形态将细胞与重编程诱导前的起始非多能细胞以及与具有胚胎干细胞标志形态的重编程细胞区分开。例如，当对成纤维细胞进行重编程时，重编程细胞的形态变化包括MET(间充质向上皮转变)。本领域技术人员容易理解和鉴定用于诱导重编程的各种类型体细胞的这种过渡形态。在一些实施方案中，重编程细胞是已被诱导重编程至少1、2、3、4、5、6、7、8天或更多天，但不超过21、22、24、26、28、30、32、35、40天或其间的任何天数的中间细胞，其中该细胞尚未进入自持或自持多能状态。当用一种或多种重编程因子引入细胞时，诱导非多能细胞重编程。已被诱导重编程1、2、3或4天的重编程细胞是重编程因子转导后1、2、3或4天的细胞(转导日是第0天)。与暴露于重编程因子的外源表达之前的体细胞不同，重编程细胞可在重编程过程中进展以达到稳定的多能状态，并且甚至在不存在外源表达重编程因子的情况下变成重编程细胞，只要给予足够的时间段即可。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”意指由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生的干细胞，所述干细胞已经诱导或改变(即，重编程)为能够分化成所有三种胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献并且不是分化全能的。
如本文所用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化细胞”。多潜能细胞在所属领域中是众所周知的，并且多潜能细胞的示例包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”表示细胞可以形成指定谱系内的许多类型的细胞，而非其他谱系的细胞。举例来说，多潜能造血细胞能够形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指一种细胞状态，其发育潜能的程度低于分化全能和多能。
如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型多能干细胞，其能够形成三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一者的细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
多能性可部分地通过评定细胞的多能性特性确定。多能性特性包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，该标记物包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60、TRA1-81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，并且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上所述的特性，但初始或基础状态进一步表现出：(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活；(ii)在单细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调控基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源性多能性基因引入体细胞中，表达，并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特性。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源性转基因表达(其中观察到基态的特性)，否则此类细胞保持激发状态。
多能性作为连续体存在，并且诱导性多能干细胞似乎以“激发”状态和“初始”状态存在，初始状态的细胞可能具有更大的分化潜能。在常规培养基中产生的诱导性多能干细胞以激发状态存在并且更接近地类似于来源于植入后胚泡的细胞，而初始iPSC显示更接近地类似于小鼠胚胎干细胞或来源于植入前胚泡的细胞的多能性特性。可通过各种差异来定义激发和初始细胞状态，包括集落形态的差异、对关键信号传导路径的抑制或活化的细胞应答、基因表达特征和使与胚外细胞相关的基因再激活的能力。例如，代表激发多能状态的常规iPSC表现出平坦的集落形态，而初始iPSC表现出类似于小鼠胚胎干细胞的紧凑的圆顶集落形态。如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征在于圆形和紧凑的形状，细胞核与细胞质比率高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
“多能性因子”或“重编程因子”是指用于诱导或提高细胞的发育效能的试剂或试剂组合。多能性因子包括但不限于能够提高细胞发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子OCT4和SOX2，以及小分子重编程剂，例如TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂。
如本文所用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导性细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞，其在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。
多能干细胞的分化需要改变培养系统，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略是使用类胚胎体(EB)的形成作为启动谱系特异性分化的共同和关键中间步骤。“类胚胎体”是三维团簇，其已表明可模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，通常为几小时到几天，简单的EB(例如，经过诱发可分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性EB，此时，通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成是通过使多能干细胞彼此紧密接近地形成三维多层细胞团簇来启动，这通常是通过若干种方法之一来实现，所述方法包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞在“U”形底孔板中沉降或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，原因是多能培养维持性培养基中所维持的聚集体不形成适当EB。因而，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，所述分化培养基向所选谱系提供诱发提示。通过在EB细胞团簇内适度增殖，多能干细胞的基于EB的培养通常引起分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实可促进细胞分化，然而，EB产生了分化状态可变的异质细胞，原因是三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示。另外，EB的形成和维持麻烦。此外，通过EB进行的细胞分化伴随着适度细胞扩增，这也导致分化效率降低。
相比之下，与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生细胞群。举例来说，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择可维持增殖和多能性的培养基。细胞增殖通常增加聚集体的尺寸，从而形成更大聚集体，这些聚集体可用常规的机械或酶方式解离成更小聚集体，从而维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数目。不同于EB培养，维持培养的聚集体内所培养的细胞维持多能性标记。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
如本文所用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“类胚胎体”、“EB”或“EB形成”。除了本文公开的其他优点之外，单层分化避免了用于启动分化需要EB形成。由于单层培养不模拟胚胎发育，诸如EB形成，因此与EB中的所有三种胚层分化相比，单层分化根据需要针对特定谱系。
如本文所用，“解离”细胞是指已实质上与其他细胞或表面(例如，培养板表面)分离或纯化的细胞。举例来说，细胞可通过机械或酶方法从动物或组织中解离。可替代地，体外聚集的细胞可以彼此解离，诸如以酶或机械方式解离成团簇、单细胞或单细胞和团簇的混合物的悬浮液。在又另一个替代实施方案中，粘着细胞从培养板或其它表面解离。因此，解离可能涉及破坏与胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的细胞相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文所用，“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可在其中生长的环境的一种类型的细胞的术语，因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供生长因子和营养。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞或永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。饲养细胞在与其它细胞共培养时，可以通常通过照射或用抗有丝分裂剂(例如丝裂霉素(mitomycin))处理来失活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说，多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、朝向某一谱系的定向分化并且促进向特化细胞类型(诸如效应细胞)的成熟。
如本文所用，“无饲养层”(FF)环境是指一种环境，诸如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层，和/或尚未通过培育饲养细胞加以预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞在培养基内已培育一定时段(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有多种介体物质，包括饲养细胞所分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施方案中，无饲养层环境不含饲养细胞，并且也不通过培育饲养细胞进行预调节。饲养细胞包括但不限于基质细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、人成纤维细胞、角质形成细胞和胚胎干细胞。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下，为单数形式“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培育细胞培养物的营养组合物。
“培育”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经过涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)维持、繁殖(生长)和/或分化。“培育”或“维持”可以使用培养基作为有助于细胞繁殖和/或维持的营养、激素和/或其他因子来源。
如本文所用，“传代(passage/passaging)”是指当细胞已增殖至所需程度时，通过将细胞细分并铺板到多个细胞培养表面或容器中而使培养的细胞分裂的行为。在一些实施方案中，“传代(passage/passaging)”是指将细胞细分、稀释和铺板。当细胞从原代培养表面或容器传代到随后的一组表面或容器中时，随后的培养物在本文中可称为“继代培养”或“第一次传代”等。将细分和铺板到新培养容器中的每个行为视为一次传代。在一些实施方案中，培养的细胞每1、2、3、4、5、6、7天或更多天传代一次。在一些实施方案中，在重编程后最初选择的iPSC每3天-7天传代一次。
如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的上下文中所用的“功能”是指(1)在基因层面—成功的敲入、敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达，诸如期望的细胞发育阶段处的诱导性或暂时表达，这通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”，经由最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程来实现；或者(2)在细胞层面—成功的去除、添加或改变细胞功能/特性，这经由以下实现：(i)在所述细胞中通过直接基因组编辑而获得的基因表达修饰，(ii)在所述细胞中通过“传递”，经由从最初进行基因组工程改造的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达修饰；(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控，该基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或者(iv)成熟细胞产物内所呈现的增强的或新获得的细胞功能或属性，该成熟细胞产物最初来源于在iPSC、祖细胞或去分化细胞来源处进行的基因组编辑或修饰。
如本文所用，术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优选治疗属性有贡献的遗传或表观遗传信息，并且能保留于源细胞衍生iPSC和/或iPSC衍生非天然造血谱系细胞中。如本文所用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生iPSC可以进一步分化成特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。视上下文而定，源细胞衍生的iPSC和其分化细胞有时统称为“衍生的细胞”。如本文所用，赋予优选治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模式引入iPSC来并入iPSC中。在从特别选择的供体、疾病或治疗背景所获得的源细胞的方面中，对优选治疗属性有贡献的遗传印记可以包括任何背景特有的基因或表观基因修饰，其显现能保留的表型，即优选的治疗属性，该表型传递到所选源细胞的衍生细胞，无论潜在分子事件得到鉴别或未得到鉴别。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可以包括可保留在iPSC和衍生造血谱系细胞中的遗传印记，该遗传印记包括但不限于预排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞；可跟踪和期望的遗传多态性，例如对编码所选供体中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型；和预定的HLA需求，即，所选的HLA匹配供体细胞随着群增大而表现出单倍型。如本文所用，优选治疗属性包括衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性改善。优先治疗属性还可涉及抗原靶向受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；对诸如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，“遗传修饰”是指基因编辑，包括(1)天然衍生自细胞中或细胞发育中发生的重排、突变、遗传印记和/或表观遗传修饰的那些，或(2)通过细胞操作通过基因组工程改造获得的那些，该细胞操作包括但不限于细胞基因组中的插入、缺失或取代。如本文所用，遗传修饰还包括供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留的治疗属性。基因修饰的细胞是与不具有此类遗传修饰的相应野生型细胞相比包含遗传修饰(例如，基因编辑)的细胞。
如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指细胞的治疗特性与相同一般细胞类型的典型细胞相比增强。在免疫细胞的上下文中，例如，与典型的、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现：抗原靶向受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；对诸如化学疗法等治疗的抗性。
所谓“整合”意指构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”意指构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”插入细胞染色体或线粒体DNA中。如本文所用，术语“整合”进一步是指一种过程，其涉及在内源序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点插入构建体的一个或多个外源序列或核苷酸。在插入位点存在缺失的情况下，“整合”还可包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源序列或核苷酸。
“构建体”是指包含待体外或体内传递给宿主细胞中的多核苷酸的大分子或分子复合体。如本文所用，“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体，在靶细胞中，所述核酸构建体能够复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或环形分子。载体可以是整合或非整合载体。载体的主要类型包括但不限于质粒、游离型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体(Sendai virusvector)等。
如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸中的核苷酸的特异性序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列和由其获得的生物特性。因此，如果与一种基因对应的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中产生一种蛋白质，那么所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致并且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文所用，术语“外源性”旨在意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中。所述分子可以通过例如将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入，例如整合于宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质，例如质粒。因此，所述术语当关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，所述术语当关于编码核酸的表达使用时，是指细胞内所含而非外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时体内转录成RNA并且在一些情况下转译成多肽的DNA序列。所关注基因或多核苷酸可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如，所关注基因可以编码miRNA、shRNA、原生多肽(即，自然界中发现的多肽)或它们的片段；变体多肽(即，与原生多肽具有小于100％的序列同一性的原生多肽的突变体)或其片段；工程改造的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标记物、可选标记物等。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式或其类似物。多核苷酸序列由四个核苷酸碱基构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还指双链和单链分子。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用并且是指氨基酸残基通过肽键共价连接的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，并且多肽的氨基酸最大数目不受限制。如本文所用，所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、经过修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其它。所述多肽包括自然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
如本文所用，“可操作地连接(Operably linked/operatively linked)”是指单一核酸片段上的核酸序列的结合，以使得一者的功能受另一者影响。举例来说，当启动子能够影响编码序列或功能RNA表达(即，所述编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向可操作地连接到调控序列。
如本文所用，术语“衔接子”是指分子，例如融合多肽，其能够使免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；并且激活免疫细胞。衔接子的示例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子或多特异性杀伤细胞衔接子，或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
如本文所用，术语“表面触发受体”是指一种能够触发或启动免疫反应(例如，细胞毒性反应)的受体。表面触发受体可以加以工程改造，并且可以在效应细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)上表达。在一些实施方案中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞(例如肿瘤细胞)之间发生双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的自然受体和细胞类型。使用这种方法，可以产生包含通用表面触发受体的iPSC，并且然后使这类iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群。“通用”意指表面触发受体可表达于任何效应细胞中并且激活任何效应细胞(不论细胞类型)并且表达通用受体的所有效应细胞可与表面触发受体可识别的具有相同抗原决定基的衔接子偶联或连接(不论衔接子的肿瘤结合特异性)。在一些实施方案中，具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施方案中，具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。因而，可使一种或多种效应细胞类型接合，从而在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞激活的共刺激域和对衔接子的抗原决定基具有特异性的抗抗原决定基。双特异性衔接子对位于一端的表面触发受体的抗抗原决定基具有特异性，并且对位于另一端的肿瘤抗原具有特异性。
如本文所用，术语“安全开关蛋白质”是指一种工程改造的蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其他方式防止副作用。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的工程改造的细胞的安全问题，该细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的并且可能包括通过小分子介导的转译后激活和组织特异性和/或时间转录调控来进行控制。安全开关可以介导对凋亡的诱导、对蛋白合成或DNA复制的抑制、生长阻滞、转录和转录后遗传调节和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白由外源分子例如前药激活，该外源分子在被激活时触发了治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的示例包括但不限于自杀基因，诸如半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR以及它们的任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时施用的前药由自杀基因产物激活并且杀死转导的细胞。
如本文所用，术语“医药学活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。医药学活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，并且可以施用以改善、缓解、减缓、逆转或减轻疾病严重程度。医药学活性蛋白质还具有预防特性并且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理病况在其显现时的严重强度。医药学活性蛋白质包括完整蛋白质或肽或其医药学活性片段。其还包括所述蛋白质或肽的医药学活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语医药学活性蛋白质还指以协作或协同方式发挥作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。医药学活性蛋白质或肽的示例包括但不限于受体、结合性蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、激活、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指分子信号以化学修饰形式传递，其通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合体来实现。信号转导路径在所属领域中是众所周知的，并且包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、TG点信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导路径、Wnt信号传导路径、cAMP依赖性路径和IP3/DAG信号传导路径。
如本文所用，术语“靶向模式”是指分子(例如，多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或抗原决定基特异性，其包括但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时)；ii)衔接子特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性衔接子时)；iii)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞，和v)在缺乏特异性抗原或表面分子的情况下的其他靶向策略。
如本文所用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如，受体或衔接子)能够选择性地结合到靶分子。
“HLA缺乏”，包括HLA I类缺乏，或HLA II类缺乏，或两者，是指缺乏或不再维持包含HLA I类蛋白质异源二聚体和/或HLA II类异源二聚体的完整MHC复合体的表面表达或所述表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于被其他细胞天然可检测到的或被合成方法可检测到的水平。HLA I类缺乏可以通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域发生功能缺失或使HLA I类相关基因(包括不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和TAP相关蛋白)缺失或表达水平降低来实现。HLA II类缺乏可以通过使HLA-II相关基因(包括不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)发生功能缺失或降低来实现。先前不清楚HLA复合物缺乏或改变的iPSC是否具有进入发育、成熟和产生功能性分化细胞同时保持调节活性的能力。此外，先前不清楚HLA复合物缺乏的分化细胞是否可以重编程为iPSC并维持为多能干细胞，同时具有HLA复合物缺乏。细胞重编程期间的意外失败、多能性和分化的维持可能涉及以下方面，包括但不限于发育阶段特异性基因表达或其缺乏、HLA复合物呈递的要求、引入的表面表达模式的蛋白质脱落、对适当和有效的克隆重编程的需要，以及对分化方案的重构的需要。
如本文所用，“缺乏HLA的已修饰的iPSC”是指缺乏HLA的iPSC，其另外通过引入基因表达蛋白质而被修饰，该蛋白质与以下有关但不限于：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、存留、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，诸如非经典HLA I类蛋白质(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、4-1BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3z、4-1BBL、CD47、CD113和PDL1。“缺乏HLA的已修饰的”细胞还包括除iPSC之外的细胞。
“Fc受体”(缩写为FcR)是基于其识别的抗体类型而分类。举例来说，结合最常见类别的抗体(IgG)的受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)并且结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别也通过表达其(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)的细胞和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括若干成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)，其因其分子结构不同而对其抗体具有不同亲和力。
CD16已鉴别为两种同工型：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以激活NK细胞和促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可切割的CD16”或“高亲和力不可切割的CD16”是指CD16的变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外域脱落，这是一种蛋白分解裂解过程，其在NK细胞激活后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16变体；而S197P变体是CD16的不可切割型式的示例。
如本文所用，术语“过继性细胞疗法”是指基于细胞的免疫疗法，其如本文所用涉及输注自体或同种异体淋巴细胞，诸如CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或免疫调控细胞，无论是否经过基因修饰，其在所述输注之前已经离体扩增。
如本文所用，“治疗上足够的量”在其含义内包含无毒但足够和/或有效量的其所指代的用于提供期望的治疗效果的特定治疗和/或药物组合物。所需精确量将随各受试者而变化，这取决于诸如患者总体健康状况、患者年龄和病况分期和严重强度等因素。在特定实施方案中，治疗上足量足以和/或有效地使与所治疗的受试者的疾病或病况相关的至少一种症状改善、减少和/或好转。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选地是人类患者、牲畜或其他驯养动物。
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment)”等，当用于指需要治疗性治疗的受试者时，是指获得期望的药理学和/或生理学效果，包括但不限于实现疾病症状的改善或消除。对于疾病和/或可归因于该疾病的不良作用，该作用就完全或部分预防疾病或其症状来说，可以是防治性的，和/或就实现症状的改善或消除，或提供部分或完全治愈来说，可以是治疗性的。术语“治疗”包括哺乳动物，特别是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病、但尚未被诊断患有其的受试者出现该疾病；(b)抑制该疾病，或阻滞其发展；(c)缓解该疾病，或使该疾病消退，或完全或部分消除该疾病的症状；以及(d)使个体恢复至疾病前状态，诸如重构造血系统。
I.用于产生诱导性多能干细胞的组合物
先前开发的FMM(命运维持培养基)已经实现了从不是T细胞的各种体细胞重编程的iPSC的令人满意的长期稳定性。因此，进行FMM的各种修饰以增强长期稳定性和保存，并降低从所有细胞来源，特别是从T细胞重编程的iPSC的核型异常的频率，已经表明该T细胞是用于多能细胞产生(TiPSC)和谱系特异性和功能性效应细胞从其分化的困难细胞类型。已经观察到，应激物(包括但不限于单细胞解离、克隆扩增、冻-融循环、载体转染和电穿孔以及基因组编辑)引起细胞的基因组不稳定性并损害多能细胞的多能性、活力和分化潜能。
本文所考虑的组合物可包括化学限定的储备基础培养基和小分子的各种组合，包括小分子和其功能变体，其在无饲养层环境中使用最小重编程因子支持高效且有效的重编程；并且即使当经受一种或多种应激物时，也能够在长期(即，超过25、30、35或50次或更多次传代)维持同质且基因组稳定的多能群体的同时进行单细胞培养和多能细胞的扩增。此外，本文提供的组合物提供将多能细胞(包括TiPSC)培养至自发分化减少的状态和基态多能性(也称为初始多能性)，而不考虑非多能细胞的遗传背景或产生多能细胞的重编程过程。
本文所考虑的组合物部分地可用于产生工业级或临床级多能细胞，该多能细胞与在不存在组合物的情况下产生或培养的细胞相比具有减少的自发分化。在一个实施方案中，将非多能细胞诱导成为多能细胞并培养以长期维持多能性。在另一个实施方案中，将非多能细胞诱导成为多能细胞并培养以实现和/或维持与在不存在组合物的情况下培养的细胞相比减少的自发分化。在另一个实施方案中，将非多能细胞诱导成为多能细胞并培养以实现和/或维持基态多能性。
在各种实施方案中，与没有接触组合物产生或维持的iPSC相比，本文提供的组合物减少或预防iPSC，特别是从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的核型异常，包括三体性。因此，在各种实施方案中，该组合物使一种或多种多能性细胞的基态多能性、正常核型和基因组稳定性维持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100次或更多次传代，包括任何中间数目的传代。在其他实施方案中，本文提供的组合物在一种或多种多能性细胞中使减少的自发分化维持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100次或更多次传代，包括任何中间数目的传代。
在各种实施方案中，用于本发明的培养基中的化学上限定的储备基础培养基可以是适于支持干细胞的维持和/或生长的任何限定的基础培养基，诸如常规的人胚胎干细胞培养基。可根据本发明的实施方案使用的限定基础培养基的示例包括但不限于：杜尔贝科改良伊格尔培养基(“DMEM”)、基础伊格尔培养基(BME)、DMEM/F-12(1:1DMEM和F-12，体积：体积)；培养基199；F-12(Ham)营养混合物；F-10(Ham)营养混合物；最小必需培养基(MEM)，威廉斯培养基E；和RPMI 1640，它们所有都可购自Gibco-BRL/Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,Md.等。可获得许多这些培养基的几个版本，包括但不限于：DMEM 11966、DMEM 10314、MEM 11095、威廉斯培养基E 12251、Ham F12 11059、MEM-α12561和培养基-19911151(Gibco-BRL/Life Technologies)。培养基可以包括例如以下中的一者或多者：氨基酸、维生素、有机盐、无机盐、微量元素、缓冲盐、糖、ATP等。
用于根据本发明的实施方案的细胞培养基中的小分子及其种类在下文更充分地描述。在一个实施方案中，组合物包含细胞培养基和TGFβ家族蛋白、Rho激酶(ROCK)抑制剂(ROCKi)，以及MEK抑制剂(MEKi)和WNT活化剂。在各种实施方案中，组合物不包含TGFβ抑制剂(TGFβi)。在各种实施方案中，TGFβ家族蛋白、ROCKi、MEKi和WNT活化剂中的一者或多者可以在iPSC产生和维持预定持续时间期间的一个或多个特定阶段添加。iPSC维持期间的此类特定阶段包括但不限于iPSC集落的单细胞解离、解离的iPSC的单细胞分选、iPSC单细胞克隆扩增、克隆iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、iPSC MCB的解冻和任选地iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环。例如，在各种实施方案中，TGFβ家族蛋白可任选地在iPSC集落的单细胞解离时，或在iPSC单细胞克隆扩增时，或在其间的任何阶段添加到组合物中。在各种实施方案中，与用于将非多能细胞重编程为iPSC的MEK抑制剂和/或WNT活化剂的浓度相比，iPSC维持期间MEK抑制剂和/或WNT活化剂的浓度降低。在一些实施方案中，MEK抑制剂和/或WNT活化剂的浓度为可用于将非多能细胞重编程为iPSC的MEK抑制剂和/或WNT活化剂的浓度的约30％-60％，例如约35％-55％，优选地约40％-50％的量。
在一个实施方案中，包含细胞培养基的组合物还包含TGFβ家族蛋白、ROCKi、MEKi和WNT活化剂，以及任选的LIF和/或bFGF，而该组合物不包含TGFβ抑制剂；并且任选地，将TGFβ家族蛋白、ROCKi、MEKi和WNT活化剂中的任一者添加到组合物中在iPSC维持期间是阶段特异性的。
在另外的实施方案中，组合物中包含的细胞培养基基本上不含细胞因子和/或生长因子，并且任选地为无饲养层环境。在其他实施方案中，细胞培养基含有补充剂，诸如血清、提取物、生长因子、激素、细胞因子等。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于诱导性多能干细胞产生的组合物，该组合物包含细胞培养基，该细胞培养基包含ROCKi、MEKi和WNT活化剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和TGFβ抑制剂，并且任选地其中与使用先前组合物的重编程相比，ROCKi、MEKi和WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂中的任一者的添加在将非多能细胞重编程为具有提高的重编程效率的iPSC的过程期间是阶段特异性的。iPSC重编程期间的此类特定阶段包括但不限于体细胞转染(第0天)、外源基因表达、异染色质增加、体细胞身份丧失和iPSC集落形成。例如，在各种实施方案中，HDAC抑制剂可任选地在染色质重组时，或在约第2-3天(转染后)添加，并且/或者TGFβ抑制剂可任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)添加。在转染后约第13-15天，通常使用本文公开的方法和组合物形成iPSC集落。
在一个实施方案中，用于诱导性多能干细胞产生的组合物包含细胞培养基，该细胞培养基包含ROCKi、MEKi和WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂以及任选的LIF和/或bFGF，并且任选地其中添加HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂中的任一者在iPSC重编程期间是阶段特异性的。在一些实施方案中，HDAC抑制剂是丙戊酸(VPA)或其功能变体或衍生物。
ROCK抑制剂
Rho相关激酶(ROCK)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其用作Rho激酶(其中存在三种同工型--RhoA、RhoB和RhoC)的下游效应子。适用于本文所考虑的组合物的ROCK抑制剂包括但不限于多核苷酸、多肽和小分子。本文所考虑的ROCK抑制剂可降低ROCK表达和/或ROCK活性。示例性ROCK抑制剂包括但不限于针对ROCK的抗体、显性失活的ROCK变体以及抑制ROCK表达的siRNA和反义核酸。其他示例性ROCK抑制剂包括但不限于：噻唑烷、Y27632、法舒地尔(Fasudil)、AR122-86、Y27632 H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚和(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺。
用于根据本发明的实施方案的细胞培养基中的示例性ROCK抑制剂包括噻唑烷、Y27632、吡啶整联蛋白(pyrintegrin)、布雷他汀(Blebbistatin)和其功能变体或衍生物。在某些实施方案中，ROCK抑制剂是噻唑烷。
ERK/MEK抑制剂
ERK/MEK路径的示例性抑制剂包括但不限于针对MEK或ERK的抗体、显性失活的MEK或ERK变体以及抑制MEK和/或ERK表达的siRNA和反义核酸。其他示例性ERK/MEK抑制剂包括但不限于PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、凡德他尼(Vandetanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、阿昔替尼(Axitinib)、GSKl 120212、ARRY-438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl 19、AZD6244、FR180204、PTK787和其功能变体或片段。
MEK/ERK抑制剂的其他说明性示例包括以下化合物：6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2,3-二羟基-丙氧基)-酰胺；6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢-吡喃-2-基甲基)-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、1-[6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基]-2-羟基-乙酮、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-1,1-二甲基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢-呋喃-2-基甲基)-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氟-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(2,4-二氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-甲酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺，下文称为MEK抑制剂1；2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺；下文称为MEK抑制剂2；和4-(4-溴-2-氟苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，MEK/ERK抑制剂是PD0325901。
Wnt活化剂
如本文所用，术语“Wnt信号促进剂”、“Wnt路径活化剂”、“Wnt活化剂”或“Wnt路径激动剂”是指Wnt信号传导路径的激动剂，包括但不限于Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wntl0b、Wnt11、Wnt14、Wnt15或Wnt16中的一者或多者的激动剂。Wnt路径激动剂还包括但不限于以下多肽或其片段中的一者或多者：Dkk多肽、新月多肽、守门狗多肽(cerberuspolypeptide)、轴蛋白多肽、Frzb多肽、T细胞因子多肽或显性失活杂乱多肽。
Wnt路径激动剂的非限制性示例还包括以下的一者或多者：包含编码Wnt多肽的核苷酸序列的核酸；包含Wnt多肽的氨基酸序列的多肽；包含编码活化的Wnt受体的核苷酸序列的核酸；包含活化的Wnt受体的氨基酸序列的多肽；促进Wnt/β-联蛋白信号传导的有机小分子；抑制Wnt拮抗剂的表达或活性的有机小分子；抑制Wnt拮抗剂的表达的反义寡核苷酸；抑制Wnt拮抗剂的表达的核酶；抑制Wnt拮抗剂的表达的RNAi构建体、siRNA或shRNA；结合Wnt拮抗剂并抑制其活性的抗体；包含编码β-联蛋白多肽的核苷酸序列的核酸；包含β-联蛋白多肽的氨基酸序列的多肽；包含编码Lef-1多肽的核苷酸序列的核酸；包含Lef-1多肽的氨基酸序列的多肽；和其功能变体或片段。
GSK-3β抑制剂
GSK-3β抑制剂是适用于本文所考虑的组合物的特定示例性Wnt路径激动剂，并且可以包括但不限于结合GSK-3β的抗体、显性失活的GSK-3β变体以及靶向GSK-3β的siRNA和反义核酸。其他示例性GSK-3β抑制剂包括但不限于肯帕罗酮(Kenpaullone)、l-氮杂肯帕罗酮、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418、CT 99021、CT 20026、SB216763、AR-A014418、锂、SB415286、TDZD-8、BIO、BIO-丙酮肟、(5-甲基-lH-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌络合物、TDZD-8、4-苄基-2-甲基-l,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮、2-硫代(3-碘苄基)-5-(l-吡啶基)-[l,3,4]-噁二唑、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、AR-AO 144-18、3-(l-(3-羟丙基)-lH-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮；TWSl 19吡咯并嘧啶化合物、L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其豆蔻酰化形式；2-氯-l-(4,5-二溴-苯硫-2-基)-乙酮，SB216763、SB415286和其功能变体或片段。用于根据本发明的实施方案的细胞培养基中的示例性GSK3抑制剂包括CHIR99021、BIO和肯帕罗酮。在一些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021。
TGFβ受体/ALK5抑制剂
TGFβ受体(例如，ALK5)抑制剂可包括针对TGFβ受体(例如，ALK5)的抗体、其显性失活的变体和抑制其表达的反义核酸。TGFβ受体/ALK5抑制剂的示例包括但不限于SB431542、A-83-01、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、Wnt3a/BIO、BMP4、GW788388(-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)、SM16、IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)、GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)和嘧啶衍生物。此外，虽然“ALK5抑制剂”不旨在涵盖非特异性激酶抑制剂，但“ALK5抑制剂”应理解为涵盖除抑制ALK5以外还抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如SB-431542。不旨在限制本发明的范围，据信ALK5抑制剂影响间充质向上皮转化/转变(MET)的过程。TGFβ/激活素路径是上皮向间充质转变(EMT)的驱动因子。因此，抑制TGFβ/激活素路径可促进MET(即，重编程)过程。
已经显示TGFβ/激活素路径的抑制具有抑制ALK5的类似作用。因此，TGFβ/激活素路径的任何抑制剂(例如，上游或下游)可与如本文各段中所述的ALK5抑制剂组合使用或代替ALK5抑制剂。示例性TGFβ/激活素路径抑制剂包括但不限于：TGFβ受体抑制剂、SMAD 2/3磷酸化抑制剂、SMAD 2/3和SMAD 4相互作用抑制剂以及SMAD 6和SMAD 7的活化剂/激动剂。此外，下文描述的分类仅出于组织目的并且本领域技术人员将知道，化合物可以影响路径内的一个或多个点，并且因此化合物可以在超过一个所定义类别中起作用。
TGFβ受体抑制剂的具体示例包括但不限于SU5416；2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐(SB-505124)；乐德木单抗(lerdelimumb)(CAT-152)；美替木单抗(metelimumab)(CAT-192)；GC-1008；ID11；AP-12009；AP-11014；LY550410；LY580276；LY364947；LY2109761；SB-505124；SB-431542；SD-208；SM16；NPC-30345；Ki26894；SB-203580；SD-093；格列卫(Gleevec)；3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(桑色素)；激活素-M108A；P144；可溶性TBR2-Fc；和靶向TGFβ受体的反义转染肿瘤细胞。
SMAD 2/3磷酸化抑制剂可包括针对SMAD2或SMAD3的抗体、SMAD2或SMAD3的显性失活变体和靶向SMAD2或SMAD3的反义核酸。抑制剂的具体示例包括PD169316；SB203580；SB-431542；LY364947；A77-01；和3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(桑色素)。SMAD 2/3和SMAD4相互作用抑制剂可包括针对SMAD2、SMAD3和/或SMAD4的抗体、SMAD2、SMAD3和/或SMAD4的显性失活变体和靶向SMAD2、SMAD3和/或SMAD4的反义核酸。SMAD 2/3和SMAD4相互作用抑制剂的具体示例包括但不限于Trx-SARA、Trx-xFoxH1b和Trx-Lef1。SMAD 6和SMAD 7的活化剂/激动剂包括但不限于针对SMAD 6或SMAD 7的抗体、SMAD 6或SMAD 7的显性失活变体和靶向SMAD 6或SMAD 7的反义核酸。
HDAC抑制剂
示例性HDAC(组蛋白脱乙酰基酶)抑制剂可包括结合HDAC的抗体、HDAC的显性失活变体以及靶向HDAC的siRNA和反义核酸。组蛋白乙酰化参与组蛋白和DNA甲基化调节。一般来说，在整体水平上，多能细胞具有更多的组蛋白乙酰化，并且分化细胞具有更少的组蛋白乙酰化。HDAC抑制剂促进沉默多能性基因的活化。HDAC抑制剂包括但不限于TSA(曲古抑菌素A)、VPA(丙戊酸)、丁酸钠(NaB)、SAHA(辛二酰苯胺异羟肟酸或伏立诺他(vorinostat))、苯丁酸钠、缩酚酸肽(FR901228、FK228)、曲帕辛(trapoxin)(TPX)、含20环异羟肟酸的肽1(CHAP I)、MS-275、LBH589和PXDIOI。
细胞因子和生长因子
在特定实施方案中，本发明的组合物和/或细胞培养基基本上不含细胞因子和/或生长因子。在某些实施方案中，细胞培养基含有一种或多种补充剂，包括但不限于血清、提取物、生长因子、激素、细胞因子等，它们可以阶段特异性方式添加以改善重编程和/或维持过程的质量和效率。
各种生长因子和其在培养基中的用途是已知的，包括例如ECM蛋白、层粘连蛋白1、纤连蛋白、胶原IV同种型、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、细胞表面粘附蛋白、细胞信号传导蛋白、钙粘蛋白、氯离子胞内通道1、跨膜受体PTK7、胰岛素样生长因子、抑制素βA、TGFβ/激活素/nodal信号传导路径的诱导剂和激活素A。在培养基中使用的细胞因子可包括例如以下项中的一者或多者：生长因子诸如表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转铁蛋白、各种白细胞介素(诸如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(诸如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(诸如IFN-γ)和其他对干细胞有作用的细胞因子，诸如干细胞因子(SCF)和红细胞生成素(Epo)。
在特定实施方案中，组合物和/或培养基可包括TGFβ家族的蛋白质作为组合物的细胞因子/生长因子组分。TGFβ家族蛋白的示例包括但不限于激活素A、TGFβ、nodal和其功能变体或片段。这些细胞因子/生长因子可以商购获得，并且可以是天然的或重组的。在一些实施方案中，为了培养多种哺乳动物细胞，基础培养基将含有浓度为约0.01ng/ml-100ng/ml、约0.2ng/ml-20ng/ml并且在特定实施方案中为约0.5ng/ml-10ng/ml的FGF。其他细胞因子，如果使用的话，可以凭经验确定的浓度或由已建立的细胞因子技术指导的浓度添加。
II.改善的重编程和维持系统以及由其产生的细胞
一般来说，本公开提供了通过使非多能细胞与至少一种重编程因子接触，并且任选地在ROCK抑制剂、MEK抑制剂和Wnt活化剂以及任选的TGFβ抑制剂和/或HDAC抑制剂的组合的存在下引发的改善的重编程过程，其中在重编程的一个或多个所选阶段添加TGFβ抑制剂和HDAC抑制剂中的一者或两者(例如FRM2；表1和表2；也参见图9)。本公开还提供了用于经受一种或多种应激物的iPSC的改善的维持过程，其中细胞任选地在一个或多个所选阶段以与ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂以及TGFβ家族蛋白的组合接触提供，其中该组合物不包含TGFβ抑制剂(例如，FMM2；表1和表2；也参见图9)。
表1-用于iPSC重编程和维持的常规培养基和命运两阶段培养基
Figure BDA0004191132720000371
表2-用于iPSC重编程和维持的改善的命运阶段特异性培养基
Figure BDA0004191132720000372
Figure BDA0004191132720000381
细胞的重编程
获得无足迹的iPSC(即，iPSC不保留任何外源重编程因子多核苷酸)的一种方法是使用介导瞬时和暂时转基因表达的质粒系统。用于重编程的一个示例性质粒系统包含携带复制起点和编码重编程因子但不编码EBNA的多核苷酸的一个或多个第一质粒，和包含编码EBNA的多核苷酸但不含复制起点或重编程因子编码序列的第二质粒(参见例如，美国申请公布20200270581中的“STTR系统”，其相关公开内容以引用方式并入本文)。
质粒的组合使得转基因(EBNA和外源重编程因子)能够在转导后在细胞中暂时细胞质表达，并产生无EBNA的中间细胞群(也称为重编程细胞)，其呈现过渡形态或形态变化(例如间充质向上皮转变(MET))，但缺乏任何多能细胞形态或内源多能性基因表达，诸如OCT4，但能够进入稳定的自持多能状态。如本文所述，重编程细胞与引入重编程因子之前的体细胞不仅在形态上而且在功能上也不同，因为其能够在支持重编程过程继续的培养条件(例如，常规hES培养基、FRM或FRM2)下在给定足够的时间段重编程为多能状态。在一些实施方案中，无EBNA的重编程细胞是无转基因的，并且因此所得iPSC是无足迹的，而不需要针对EBNA进行选择，或不需要为了消除EBNA和转基因而连续传代，如在游离型重编程中经常需要的。
除了使用上述质粒系统之外，还可通过腺病毒转导(Zhou等人，Stem Cells(2009)；27:2667-2674)、仙台病毒载体(Fusaki等人，Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci.(2009)；85:348-362；Seki等人，Cell Stem Cell(2010)；7:11-14；Ban等人，PNAS(2011)；108:14234-14239)、小环DNA载体(Okita等人，Science(2008)；322:949-953)，和/或oriP/EBNA游离型载体(Malik等人，Methods Mol Biol.(2013)；997:23-33)来引入外源重编程因子。
本领域中已知用于干细胞重编程的重编程因子均可与本重编程系统和方法一起使用。在一个实施方案中，重编程因子包括但不限于OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)。附加重编程因子包括但不限于NANOG、KLF、LIN28、MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1。在另一个实施方案中，重编程因子包括但不限于用于体细胞重编程和用于不使用KLF的T细胞重编程的OCT4、YAP1、SOX2、大T抗原、MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3。编码这些重编程因子的多核苷酸可包含在含有oriP但不含有EBNA的相同质粒构建体(即，相同的第一质粒)中。编码这些重编程因子的多核苷酸可包含在至少两个各自含有oriP但不含有EBNA的质粒构建体(即，多个第一质粒)中。在各种实施方案中，编码这些重编程因子的多核苷酸包含在四个各自含有oriP但不含有EBNA的质粒构建体(即，四个第一质粒)中。
编码这些重编程因子的多核苷酸可包含在多顺反子构建体(即，由一个启动子控制的多个编码序列)或非多顺反子构建体(具有一些由一个启动子控制和一些由不同启动子控制的多个编码序列)中。启动子可以是例如CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC和组成型、诱导型、内源调控型或时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的其他合适启动子。在一个实施方案中，启动子是CAG。在另一个实施方案中，启动子是EF1α。在一些实施方案中，多顺反子构建体可提供单个开放阅读框(例如，多个编码序列通过自切割肽编码序列诸如2A可操作地连接)或多个开放阅读框(例如，通过内部核糖体进入位点或IRES连接的多个编码序列)。
在本发明的质粒系统的一些实施方案中，一个或多个质粒构建体(第一质粒)共同包含编码一种或多种选自由OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)组成的组的重编程因子的多核苷酸。在另外的实施方案中，一个或多个质粒构建体(第一质粒)还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者，或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。在一些实施方案中，系统中仅存在一个第一质粒构建体并提供所有选择的重编程因子。在一些其他实施方案中，系统中存在两个或更多个提供一种或多种重编程因子的第一质粒构建体，每个构建体包含由多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在一些实施方案中，一个或多个第一质粒构建体共同包含至少两种编码OCT4的多核苷酸和一种或多种编码YAP1、SOX2、LTag、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的至少一者的多核苷酸。
当第一质粒构建体包含多于一种编码多于一种重编程因子的多核苷酸时，相邻多核苷酸通过编码自切割肽或IRES的接头序列可操作地连接。自切割肽可以是2A肽。2A肽可衍生自FMDV(口蹄疫病毒)、ERAV(马鼻炎A病毒)、PTV-1(猪捷申病毒1)或TaV(明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus))，它们分别被称为F2A、E2A、P2A和T2A。第一质粒构建体中的多个2A肽可以是相同或不同的。在一些实施方案中，两个最接近的相邻2A肽是不同的，例如：RF-2A1-RF-2A2-RF-2A1，其中2A1和2A2是不同的。
可以预先构建第一质粒构建体的文库，每个构建体含有一个或多个编码不同数、类型和/或组合的重编程因子的多核苷酸。已知重编程是具有长等待时间的低效且随机的过程。重编程因子的表达时间和水平以及化学计量在重编程的不同阶段和经历重编程的细胞的中间状态中驱动重编程动力学，并确定重编程的完成。重编程因子化学计量也影响重编程效率，并产生具有不同质量的iPSC，诸如激发状态与基态多能性，以及相关的生物学特性，包括iPSC的克隆性、自我更新、同质性和多能性维持(与自发分化相反)。化学计量测量反应过程中试剂之间的定量关系，并用于确定给定反应中所需的试剂的量，并且有时确定所产生的产物的量。化学计量考虑试剂的化学计量的量或试剂的化学计量比，其为完成反应的试剂的最佳量或比率。本申请的一个方面提供了通过允许从文库方便地选择一个或多个第一质粒、混合和匹配、剂量调节和共转染来评估或利用重编程因子化学计量的系统和方法。
本重编程系统的第二质粒提供了包含启动子和编码EBNA的多核苷酸的表达盒，其中表达盒和第二质粒都不包含任何编码重编程因子的多核苷酸。包含在第二质粒中的启动子可以是例如CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC和组成型、诱导型、内源调控型或时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的其他合适启动子。在一个实施方案中，启动子是CAG。在另一个实施方案中，启动子是EF1α。通过用至少一个第一质粒和第二质粒的上述组合对非多能细胞进行共转染，将独立的EBNA和oriP与至少一种重编程因子一起引入非多能细胞中以启动重编程。
在一些实施方案中，重编程在包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的小分子化合物的组合的存在下启动，并且iPSC在足够的时间段后产生。在一些实施方案中，重编程在包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂的小分子化合物的组合的存在下，任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移后约第1-2天启动；然后，任选地在染色质重组阶段或在重编程因子转移后约第2-3天添加HDAC抑制剂；并且然后，任选地在体细胞身份丧失阶段或在转染后约第6-8天添加TGFβ抑制剂，以建立iPSC的多能性和基因组稳定性。在一些实施方案中，如本文所公开的，优化的重编程组合物和方法，包括在重编程期间的一个或多个所选阶段期间使用第一载体和第二载体、重编程因子的组合，和/或小分子处理，导致可靠地以更高效率产生的无足迹iPSC，并且与先前的系统相比具有建立的多能性(包括初始多能性)和改善的基因组稳定性。此外，使用所公开的优化的重编程组合物和方法从T细胞重编程的iPSC具有低得多的具有核型异常(包括三体性)的倾向。
在一些实施方案中，重编程在无饲养层条件下。在特定实施方案中，无饲养层环境基本上不含人饲养细胞并且不被饲养细胞预处理，该饲养细胞包括但不限于小鼠胚胎成纤维细胞、人成纤维细胞、角质形成细胞和胚胎干细胞。
细胞的维持
在细胞疗法制造过程中的许多关键方面中，细胞扩增和深低温保藏已经被鉴定为所关注的关键领域，其中细胞活力和功能性在冻-融循环期间受到极大影响，并且来源于iPSC分化的效应细胞的体内细胞功效和存留在iPSC分化后的效应细胞扩增阶段期间受到复杂影响。因此，本发明的另一方面涉及诱导性多能干细胞(iPSC)的长期保存，特别是在无饲养细胞的条件下，当细胞经历一种或多种应激物(包括但不限于单细胞解离、克隆扩增、冻-融循环、载体转染和电穿孔以及基因组编辑)时。在一些实施方案中，iPSC的基因组编辑是多重编辑。
因此，在一些实施方案中，在诱导约7天至35天、约10天至32天、约15天至31天、约17天至29天、约19天至27天或约21天至约25天之后，任选地对细胞进行解离，使得细胞通过酶或机械方式解离成单细胞悬浮液。可将解离的细胞重悬于任何合适的溶液或培养基中以维持细胞或进行细胞分选。在一些实施方案中，解离的单细胞悬浮液包含TGFβ家族蛋白、ROCK抑制剂和MEK抑制剂以及WNT活化剂。在一些实施方案中，TGFβ家族蛋白任选地在iPSC集落的单细胞解离时或在iPSC单细胞扩增时或在其间的任何阶段添加。在特定实施方案中，WNT活化剂包括GSK3抑制剂并且/或者TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、nodal和其功能变体或片段中的至少一者。在某些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021，MEK抑制剂是PD0325901，并且/或者Rock抑制剂是噻唑烷。
在一些实施方案中，可对解离的单细胞悬浮液进行进一步分选。在各种实施方案中，富集提供了在相对短的时间内使克隆iPSC集落衍生的方法，从而提高iPSC产生的效率。富集可包括通过鉴定和获得表达多能性标记物的细胞来对细胞群进行分选，从而获得富集的多能细胞群。附加富集方法包括耗尽表达分化标记物的细胞、非重编程或非多能细胞。在一些实施方案中，用于分选的细胞是多能细胞。在一些实施方案中，用于分选的细胞是重编程细胞。在一些实施方案中，用于分选的细胞已被诱导重编程至少1、2、3、4、5、6、7、8天或更多天，但不超过25、26、28、30、32、35、40天或其间的任何天数。在一些实施方案中，用于分选的细胞已被诱导重编程约21天至25天、约19天至23天、约17天至21天、约15天至约19天或约16天至约18天。
可通过任何合适的分选细胞的方法，诸如通过磁珠或流式细胞术(FACS)分选来对细胞进行分选。可基于一种或多种多能性标记物来对细胞进行分选，包括但不限于SSEA3/4、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、SSEA1(小鼠)、CD30、SSEA5、CD90和/或CD50的表达。在各种实施方案中，基于至少两种、至少三种或至少四种多能性标记物分选来对细胞进行分选。在某些实施方案中，基于SSEA4的表达来对细胞进行分选，并且在某些特定实施方案中，基于SSEA4与TRA1-81和/或TRA1-60组合表达来对细胞进行分选。在某些实施方案中，基于SSEA4、TRA1-81或TRA1-60和/或CD30表达来对细胞进行分选。在一个实施方案中，基于SSEA4、TRA1-81和CD30来对细胞进行分选。在另一个实施方案中，基于SSEA4、TRA1-60和CD30来对细胞进行分选。在某些实施方案中，最初使用分化细胞的一种或多种表面标记物(包括但不限于CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46和CD7)耗尽细胞中的非重编程细胞，并且然后富集多能标记物，诸如SSEA4、TRA1-81和/或CD30。
在重编程之后，iPSC被维持、传代、扩增和/或深低温保藏。在一些实施方案中，将iPSC作为单细胞在维持培养基(例如，如表2中所示的FMM2)中培养(即维持、传代、扩增和深低温保藏)延长的时间段。FMM2中培养的iPSC已表明继续维持其未分化和基础或初始轮廓；基因组稳定性，而不需要培养物清洁或选择；并且经由体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)；以及体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。参见例如国际公布WO2015/134652和美国申请公布20170073643，这两篇中的每一篇的公开内容以引用方式并入本文。在各种实施方案中，FMM2中培养的iPSC显示与先前系统的表达相比，一种或多种初始特异性标记物的表达增加，该初始特异性标记物包括但不限于TBX3(T盒转录因子；UniProt登录号O15119)、TFCP2L1(转录因子CP2样蛋白1；UniProt登录号Q9NZI6)、UTF1(未分化胚胎细胞转录因子1；UniProt登录号Q5T230)、FGF4(成纤维细胞生长因子受体4；UniProt登录号P22455)、TFCP2L1(转录因子CP2样蛋白1；UniProt登录号Q9NZI6)、PRDM14(PR结构域锌指蛋白14；UniProt登录号Q9GZV8)、DPPA5(发育多能性相关5蛋白；UniProt登录号A6NC42)、DNMT3L(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3样；UniProt登录号Q9UJW3)、KLF4(Krueppel样因子4；UniProt登录号O43474)和MAEL(蛋白质漩涡同系物；UniProt登录号Q96JY0)。适于使用本重编程系统和方法进行重编程的细胞通常包括任何非多能细胞。非多能细胞包括但不限于终末分化细胞；或多潜能细胞或祖细胞，其不能产生所有三种类型的胚层谱系细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是原代细胞，即直接从人或动物组织分离的细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是来源特异性细胞，例如供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞本身来源于多能细胞，包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是衍生免疫效应细胞，例如，iPSC衍生非天然T样或NK样细胞。
在一些其他实施方案中，用于重编程的非多能细胞是基因组修饰的原代细胞或衍生细胞。包含在非多能细胞中的遗传修饰包括基因组中的插入、缺失或取代，其导致基因表达的敲入、敲除或敲低。在用于重编程的非多能细胞中的修饰表达可以是组成型或诱导型的(例如，发育阶段特异性、组织特异性、细胞特异性或诱导物特异性的)。在一些实施方案中，插入或取代是基因座特异性靶向整合。在一些实施方案中，用于整合的所选基因座是安全港基因座或所关注的内源基因座。安全港基因座可包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，以及满足基因组安全港准则的其他基因座。为了使整合位点成为潜在的安全港基因座，理想地需要满足包括但不限于以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录激活子与相邻基因(特别是癌症相关和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；并且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达模式所反映的，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特点对于多能细胞特别重要，其中在分化期间，染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适于外源插入的区域内，选用于插入的确切基因座应所述不含重复元件和保守序列并且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。在一个示例中，使用本系统和方法重编程的非多能细胞是在内源TCR基因座处包含CAR的T细胞，并且TCR表达由于CAR整合而被破坏。
在一个实施方案中，基因修饰的非多能细胞的重编程是获得包含相同遗传修饰的基因组工程改造的iPSC。因此，在一些其他实施方案中，可在重编程之后将一个或多个此类基因组编辑引入iPSC以获得基因组工程改造的iPSC。在一个实施方案中，用于基因组编辑的iPSC是克隆系或克隆iPS细胞群。
在一些实施方案中，将包含一种或多种靶向基因编辑的基因组工程改造的iPSC在包含TGFβ家族蛋白、ROCKi，以及MEKi和WNT活化剂，并且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代、扩增和/或深低温保藏，其中iPSC在所选位点保留完整和功能性靶向编辑。在一些实施方案中，在iPSC维持期间的特定阶段添加TGFβ家族蛋白、ROCKi和/或MEKi和WNT活化剂。在一些实施方案中，iPSC维持包括但不限于一个或多个连续阶段，该连续阶段包括：iPSC集落的单细胞解离、解离的iPSC的单细胞分选、iPSC单细胞克隆扩增、克隆iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、iPSC/MCB的解冻和任选地iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环。在一些实施方案中，TGFβ家族蛋白的添加任选地在iPSC集落的单细胞解离时，在iPSC单细胞克隆扩增时或其间的任何阶段发生。在一些实施方案中，MEKi和/或WNT活化剂以用于对非多能细胞进行重编程的约30％-60％的量存在。
在一些实施方案中，基因编辑引入安全开关蛋白、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白或肽、药物标靶候选物和促进多能细胞和/或其衍生细胞的移入、运输、归巢、肿瘤浸润、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质中的一者或多者。在一个实施方案中，基因组工程改造的iPSC包含一个或多个自杀基因介导的安全开关，包括但不限于半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR以及它们的任何组合。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC具有至少一种基因组修饰，该基因组修饰包括引入或增加嵌合受体、归巢受体、抗炎分子、免疫检查点蛋白、细胞因子/趋化因子诱饵受体、生长因子、改变的促炎细胞因子受体、CAR或用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体的表达；或降低或沉默共刺激基因的表达。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC包含高亲和力和/或不可切割的CD16作为靶向模式。在一些其他实施方案中，包含在基因组工程改造的iPSC中的靶向模式是嵌合抗原受体(CAR)，其是T细胞特异性的，或NK细胞特异性的，或与T细胞和NK细胞两者相容。
在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC在一个或多个内源基因中包含一个或多个外源多核苷酸或插入/缺失。在一些实施方案中，包含在内源基因中的插入/缺失导致基因表达的破坏。在一些实施方案中，包含在内源基因中的插入/缺失导致所编辑的基因的敲除。在一些实施方案中，包含在内源基因中的插入/缺失导致所编辑的基因的敲低。在一些实施方案中，在所选位点包含一种或多种外源多核苷酸的基因组工程改造的iPSC还可包含在所选位点包含插入/缺失的一种或多种靶向编辑。在一些实施方案中，插入/缺失包含在与免疫应答调控和介导相关的一个或多个内源基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源检查点基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源T细胞受体基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在一个或多个内源MHC I类抑制基因中。在一些实施方案中，插入/缺失包含在与主要组织相容性复合体相关的一个或多个内源基因中。在一个实施方案中，修饰的iPSC细胞包含B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP和染色体6p21区域中的任何HLA基因中的至少一者中的缺失、破坏或降低的表达。在另一个实施方案中，修饰的iPS细胞包含HLA-E或HLA-G的引入。在又一些其他实施方案中，基因组工程改造的iPS细胞包含中断的TCR基因座。
iPSC的各种靶向基因编辑方法，特别是用于在单细胞水平上有效地对具有多基因座靶向策略的多基因的iPSC进行工程改造的方法包括例如国际公布WO 2017/079673中描述的那些，该公布的公开内容以引用方式并入本文。
III.体外获得的iPSC衍生细胞
在一些实施方案中，本发明还提供来源于了使用如本文所公开的系统和方法获得的iPSC的非多能细胞。在一些实施方案中，用于产生衍生非多能细胞的iPSC是基因组工程改造的，通过iPSC的靶向编辑，或通过对具有位点特异性整合或插入/缺失的基因组工程改造的非多能细胞进行重编程。在一些实施方案中，iPSC衍生非多能细胞是祖细胞或完全分化细胞。在一些实施方案中，iPSC衍生非多能细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，保留基因组工程改造的iPSC中包含的相同靶向编辑的iPSC衍生细胞是非天然中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、免疫调控细胞或任何胚层谱系的任何期望的细胞。在一些实施方案中，iPSC衍生非天然免疫调控细胞包括骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞，它们是NK细胞、B细胞和T细胞的有效免疫调节剂。
除了产生难以从供体来源分离的无限数量的特定类型或亚型的细胞之外，已经表明人iPSC衍生谱系表现出胎儿阶段细胞的特性，使得重编程过程不仅重置细胞命运(从特定/分化到多能)，而且重置与初始体细胞供体的年龄无关的供体细胞群的实足年龄特征。除了在iPSC衍生谱系(包括神经、心脏或胰腺细胞)中观察到的胎儿样特性之外，衰老的细胞标志已经显示出可测量的变化，指示在重编程过程之后来自iPSC的再分化细胞的复原。在iPSC诱导和分化成iPSC衍生成纤维细胞样细胞之后，在老龄供体成纤维细胞群中表达的年龄相关参数被重置(Miller等人，2013)。与原始T细胞克隆中的那些相比，从由T细胞克隆重编程的iPSC分化的iPSC衍生抗原特异性T细胞表现出通过延长的端粒的复原。指示复原过程的完全分化细胞中的附加变化包括但不限于异染色质的总体增加、改善的线粒体功能(ROS减少、减少的mtDNA突变、超微结构的存在)、增加的DNA损伤应答、端粒延长和短端粒百分比的降低以及衰老细胞的分数降低。(Nishimura等人，2013)。在这些不同年龄相关方面中的积极重置导致非天然细胞具有更高的增殖、存活、持久性和记忆样功能的潜力。因此，重编程和再分化介导的复原赋予完全分化的iPSC衍生细胞许多分子、表型和功能特性，该非天然特性使其与其原代细胞对应物区分开，尽管它们在细胞谱系中相似。
适用于获得iPSC衍生造血细胞谱系的分化方法和组合物包括例如国际公布WO2017/078807中描绘的分化方法和组合物，该公布的公开内容以引用方式并入本文。如本文所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需EB形成的情况下通过衍生自多能干细胞(包括iPSC)的永久性生血内皮细胞(HE)。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是多能干细胞到专门化为特定终末分化细胞和转分化细胞的祖细胞、直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，由干细胞分化产生的细胞的范围是多潜能干细胞或祖细胞到终末分化干细胞，和所有中间造血细胞谱系。
用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包含使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选的bFGF接触。如所提供，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久性生血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而无需由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选存在的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触，具有永久性HE潜能的中胚层细胞分化成永久性HE细胞，在分化期间，所述永久性HE细胞还得以扩增。
本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用来说是重要的；并且费力并且效率低。
所提供的单层分化平台促进向永久性生血内皮细胞分化，从而导致造血干细胞和分化后代，诸如T细胞、B细胞、NKT细胞、NK样细胞和调控细胞的衍生。单层分化策略实现了增强的分化效率与大规模扩增的组合，从而能够在不同治疗应用中递送治疗上相关数目个多能干细胞衍生造血效应细胞。此外，使用本文所提供的方法进行的单层培养产生了功能造血谱系细胞，其实现了全范围的试管内分化、体外调节和体内长期造血自我更新、重构和移植。如所提供的，iPSC衍生造血谱系细胞包括但不限于永久性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞以及具有T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞、间充质基质细胞或它们的任何组合的功能的免疫效应细胞。
用于引导多能干细胞分化成永久性造血谱系细胞的方法，其中该方法包括：(i)使多能干细胞与包含BMP活化剂和任选bFGF的组合物接触，以启动从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)使中胚层细胞与包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，以启动从中胚层细胞分化和扩增具有永久性HE潜能的中胚层细胞，其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(iii)使具有永久性HE潜能的中胚层细胞与组合物接触，以启动从具有永久性生血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生中胚层细胞分化和扩增永久性生血内皮细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选Wnt路径活化剂，其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在一些实施方案中，该方法还包括使多能干细胞与包含ROCK抑制剂、和MEK抑制剂和WNT活化剂以及任选的TGFβ家族蛋白的组合物接触，其中该组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以对与不与该组合物接触的多能干细胞相比具有更低的基因组异常倾向的多能干细胞进行接种和扩增。在一些实施方案中，多能干细胞是iPSC、或初始iPSC、或包含一个或多个遗传印记的iPSC；并且iPSC中包含的一种或多种遗传印记保留在由其分化的造血细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的一些实施方案中，多能干细胞分化成造血谱系细胞缺乏产生类胚胎体，并且呈单层培养形式。
在上述方法的一些实施方案中，所得多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施方案中，所得永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD43-CD93-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD93-。在一些实施方案中，永久性生血内皮细胞是CD34+CD93-CD73-。
在上述方法的一些实施方案中，该方法还包括(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂；以及任选地，(ii)使前T细胞祖细胞与组合物接触以启动前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞，该组合物包含选自由SCF、Flt3L和IL7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD34+CD45+CD7+。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生T细胞祖细胞是CD45+CD7+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生T细胞包含比从供体来源分离的原代T细胞高得多的γδT细胞级分。
在用于引导多能干细胞分化成具有改善的基因组稳定性的造血谱系细胞的上述方法的又一些实施方案中，该方法还包括：(i)使多能干细胞衍生永久性生血内皮细胞与组合物接触以启动永久性生血内皮细胞分化成前NK细胞祖细胞，该组合物包含ROCK抑制剂；选自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选BMP活化剂；以及任选地，(ii)使多能干细胞衍生前NK细胞祖细胞与组合物接触以启动前NK细胞祖细胞分化成NK细胞祖细胞或NK细胞，该组合物包含选自由SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多能干细胞衍生NK祖细胞是CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生NK细胞是CD3-CD45+CD56+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生NK细胞任选地进一步由NKp46(CD335)、NKp30(CD337)、DNAM-1(CD226)、2B4(CD244)、CD57和CD16中的一者或多者限定。
在该方法的另一个实施方案中，该方法能够通过使多能干细胞衍生永久性HE与包含ROCK抑制剂、MCSF、GMCSF和一种或多种选自由IL1b、IL3、IL6、IL4、IL10、IL13、TGFβ、bFGF、VEGF、SCF和FLT3L组成的组的生长因子和细胞因子以及任选的AhR拮抗剂和前列腺素路径激动剂中的一者或两者的培养基接触来产生免疫调控细胞。
在一些实施方案中，衍生免疫调控细胞包括骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一个实施方案中，衍生免疫调控细胞群包含CD45+CD33+细胞。在一些实施方案中，衍生免疫调控细胞群包含单核细胞。在一些实施方案中，单核细胞包括CD45+CD33+CD14+细胞。在又一些其他实施方案中，衍生免疫调控细胞群包含CD45+CD33+PDL1+细胞。本发明的一个方面提供了包含CD45+CD33+、CD45+CD33+CD14+或CD45+CD33+PDL1+细胞的iPSC衍生免疫调控细胞的富集细胞群或亚群。在一些其他实施方案中，衍生免疫调控细胞群包含CD33+CD15+CD14-CD11b-细胞。在一些实施方案中，包含iMDSC的衍生免疫调控细胞群包含小于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约2％、约1％、约0.1％的红细胞、淋巴细胞、粒细胞、CD45-CD235+细胞、CD45+CD7+细胞或CD45+CD33+CD66b+细胞。在一些实施方案中，衍生免疫调控细胞群基本上不含红细胞、淋巴细胞、粒细胞、CD45-CD235+细胞、CD45+CD7+细胞或CD45+CD33+CD66b+细胞。
III.iPSC和其衍生免疫细胞的治疗用途
在一些实施方案中，本发明提供了包含iPSC和/或免疫细胞的分离的群体或亚群体的组合物，该免疫细胞使用所公开的方法和组合物衍生自所述iPSC。在一些实施方案中，iPSC包含一种或多种可保留在iPSC衍生免疫效应细胞中的靶向基因编辑，其中基因工程改造的iPSC和其衍生细胞适用于基于细胞的过继性疗法。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生HSC细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生HSC细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生proT细胞或T样细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生proNK细胞或NK样细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含iPSC衍生免疫调控细胞或骨髓衍生抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，iPSC衍生基因工程改造的免疫细胞进一步离体调节以改善治疗潜能。在一个实施方案中，已衍生自iPSC的基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的初始T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在一个实施方案中，已衍生自iPSC的基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的I型NKT细胞。在另一个实施方案中，已衍生自iPSC的基因工程改造的免疫细胞的分离的群体或亚群包含增加的数目或比例的适应性NK细胞。在一些实施方案中，衍生自iPSC的基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或骨髓衍生抑制细胞的分离的群体或亚群是同种异体的。在一些其他实施方案中，衍生自iPSC的基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或MDSC的分离的群体或亚群是自体的。
在一些实施方案中，用于分化的iPSC包含在效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记，该遗传印记在衍生自所述iPSC的分化的造血细胞中保留并且起作用。
在一些实施方案中，多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模式；或者(ii)对供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性，并且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中iPSC保留来源治疗属性，iPSC衍生的造血谱系细胞中也包含该来源治疗属性。
在一些实施方案中，基因修饰模式包含以下中的一者或多者：安全开关蛋白质、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、医药学活性蛋白质和肽、药物标靶候选物；或者促进iPSC或其衍生细胞的移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留、免疫反应调控和调节和/或存活的蛋白质。在一些其他实施方案中，基因修饰模式包含以下中的一者或多者：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP和染色体6p21区域中的任何基因的缺失、破坏或降低的表达；(ii)HLA-E、HLA-G、CD16、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体或用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体的引入。
在又一些其他实施方案中，造血谱系细胞包含与以下中的一者或多者相关的来源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)抗原靶向受体表达；(ii)HLA呈递或其缺乏；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；(v)随着肿瘤外效应降低，靶上特异性改善；(vi)对诸如化学疗法等治疗的抗性；和(vii)改善的归巢、存留和细胞毒性。
在一些实施方案中，iPSC和其衍生造血细胞包含B2M无效或低、HLA-E/G、PDL1、A2AR、CD47、LAG3无效或低、TIM3无效或低、TAP1无效或低、TAP2无效或低、TAP相关蛋白无效或低、NLRC5无效或低、PD1无效或低、RFKANK无效或低、CIITA无效或低、RFX5无效或低和RFXAP无效或低中的一者或多者。这些具有修饰的HLA I类和/或II类的细胞具有增加的对免疫检测的抗性，并且因此呈现改善的体内存留。此外，此类细胞可以避免在过继性细胞治疗中对HLA匹配的需要，并且因此提供通用的、现成的治疗方案的来源。
在一些实施方案中，iPSC和其衍生造血细胞包含一种或多种CD16或其变体，包括hnCD16(高亲和力不可切割的CD16)、HLA-E、HLA-G、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、衔接子，或衔接子的表面触发受体。此类细胞具有改善的免疫效应能力。
在一些实施方案中，iPSC和其衍生造血细胞是抗原特异性的。
多种疾病可以通过向适于过继性细胞疗法的受试者引入根据本发明的实施方案的免疫细胞而得到改善。包括多种自身免疫病症的疾病的示例包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、薛格连氏综合症(
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syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener’s))；血液系统恶性肿瘤，包括但不限于急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征；实体瘤，包括但不限于脑肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、子宫肿瘤、皮肤肿瘤、肝肿瘤、骨肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、头肿瘤、颈肿瘤、胃肿瘤、子宫颈肿瘤、直肠肿瘤、喉肿瘤或食道肿瘤；和感染，包括但不限于HIV(人免疫缺陷病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)、CMV(巨细胞病毒)、腺病毒和BK多瘤病毒相关病症。
根据一些实施方案，本发明还提供了用于治疗用途的组合物，其包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生造血谱系细胞，其中药物组合物还包含药学上可接受的介质。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生T细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生NK细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生CD34+HE细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生HSC。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生MDSC。
另外，在一些实施方案中，本发明通过以下方式提供了上述治疗组合物的治疗用途：将组合物引入适于过继性细胞疗法的受试者，其中受试者患有自身免疫病症；血液系统恶性肿瘤；实体瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关联的感染。
分离的多能干细胞衍生造血谱系细胞可具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中，分离的多能干细胞衍生造血谱系细胞具有约95％至约100％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中，本发明提供了具有纯化的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞、proT细胞、proNK细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞的治疗组合物，诸如具有约95％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞的分离群体的组合物，以治疗需要细胞治疗的受试者。
使用本文所公开的实施方案的衍生造血谱系细胞的治疗可在症状后进行或用于防止复发。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的不期望的临床症状。在特定实施方案中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以治疗、改善和/或好转的疾病、病况和/或损伤。某些实施方案预期需要细胞疗法的受试者包括但不限于骨髓或干细胞移植候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有或处于产生过度增殖病症或癌症(例如过度增殖病症或造血系统癌症)的风险下的受试者、患有肿瘤(例如实体瘤)或处于罹患肿瘤的风险下的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或处于患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险下的受试者。
可以在其他治疗之前、期间和/或之后向受试者施用包含如所公开的衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此，组合疗法的方法可涉及在使用附加治疗剂之前、期间和/或之后施用或制备iPSC衍生免疫细胞。如上文所提供，一种或多种附加治疗剂包含肽、细胞因子、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。施用iPSC衍生免疫细胞与施用附加治疗剂可以在时间上间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地，施用可与其它生物活性剂或模式组合，所述生物活性剂或模式例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法，例如手术。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于病毒抗原。在其它实施方案中，抗体或抗体片段特异性结合于肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤或病毒特异性抗原激活所施用的iPSC衍生造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中，适用于作为附加治疗剂与所施用的iPSC衍生造血谱系细胞的组合疗法的抗体包括但不限于抗CD20(利妥昔单抗(retuximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab))、抗Her2(曲妥珠单抗(trastuzumab))、抗CD52(阿仑单抗(alemtuzumab))、抗EGFR(西妥昔单抗(cetuximab))和抗CD38(达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202)以及它们的人源化变体和Fc修饰的变体。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含一种或多种化学治疗剂或放射性部分。术语“化学治疗剂”是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀死肿瘤细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环，或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上使用其以预防或减少肿瘤细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗肿瘤或细胞毒性药物或药剂，并且在所属领域中是众所周知的。
在一些实施方案中，化学治疗剂包含蒽环霉素、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白细胞介素。示例性化学治疗剂包括但不限于烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲胺喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposideorthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽D(gramicidine D))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。附加药剂包括氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二甲睾酮calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基雌二醇、依西美坦(exemestane)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、异贝莫单抗(ibritumomab)、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥、甲地孕酮(megestrol)、马法兰、巯基嘌呤、甲胺喋呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的药剂，包括将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的药剂。这类药剂可由多个标准医师和肿瘤学家参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》，第9版，McGraw-Hill,N.Y.,1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用，两者都会不时更新。
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供，IMiD可与iPSC衍生治疗性免疫细胞一起用于癌症治疗。
如所属领域的普通技术人员将理解，基于本文中的方法和组合物的源自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞两者可在如上所述的细胞疗法中使用。对于自体移植来说，衍生造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施方案中，衍生造血谱系细胞与受试者不是HLA匹配的。
在一些实施方案中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是每剂量至少0.1×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少5×106个细胞、至少1×107个细胞、至少5×107个细胞、至少1×108个细胞、至少5×108个细胞、至少1×109个细胞或至少5×109个细胞。在一些实施方案中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目为每剂量约0.1×105个细胞至约1×106个细胞；每剂量约0.5×106个细胞至约1×107个细胞；每剂量约0.5×107个细胞至约1×108个细胞；每剂量约0.5×108个细胞至约1×109个细胞；每剂量约1×109个细胞至约5×109个细胞；每剂量约0.5×109个细胞至约8×109个细胞；每剂量约3×109个细胞至约3×1010个细胞，或其间的任何范围。一般来说，1×108个细胞/剂量转化为对于60kg的患者1.67×106个细胞/千克。
在一个实施方案中，治疗组合物中衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血中的免疫细胞数目，或是至少0.1×105个细胞/千克体重、至少0.5×105个细胞/千克体重、至少1×105个细胞/千克体重、至少5×105个细胞/千克体重、至少10×105个细胞/千克体重、至少0.75×106个细胞/千克体重、至少1.25×106个细胞/千克体重、至少1.5×106个细胞/千克体重、至少1.75×106个细胞/千克体重、至少2×106个细胞/千克体重、至少2.5×106个细胞/千克体重、至少3×106个细胞/千克体重、至少4×106个细胞/千克体重、至少5×106个细胞/千克体重、至少10×106个细胞/千克体重、至少15×106个细胞/千克体重、至少20×106个细胞/千克体重、至少25×106个细胞/千克体重、至少30×106个细胞/千克体重、1×108个细胞/千克体重、5×108个细胞/千克体重或1×109个细胞/千克体重。
在一个实施方案中，向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个说明性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是至少2×106个细胞/千克、至少3×106个细胞/千克、至少4×106个细胞/千克、至少5×106个细胞/千克、至少6×106个细胞/千克、至少7×106个细胞/千克、至少8×106个细胞/千克、至少9×106个细胞/千克或至少10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克、约6×106个细胞/千克、约7×106个细胞/千克、约8×106个细胞/千克、约9×106个细胞/千克或约10×106个细胞/千克或更多个个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施方案中，向受试者提供的细胞的有效量是约2×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克或6×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克，包括所有介于中间的细胞剂量。
剂量必然会出现一些变化，这取决于所治疗受试者的病况。负责施用的人员将在任何情况下确定单独的受试者的合适剂量。
在一些实施方案中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施方案中，衍生造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施方案中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或期间任何天数一次剂量。
包含根据本发明的实施方案的衍生造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的，并且可以适于施用和备好施用(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下施用)给人类患者。准备好用于施用的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或施用到受试者之前不需要任何另外的处理或操纵。在其他实施方案中，本发明提供在与一种或多种药剂一起施用之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。对于被基因工程改造以表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞，可使用如例如美国专利6,352,694中所述的方法激活和扩增细胞，该专利的公开内容以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，可以利用不同方案向衍生造血谱系细胞提供主要刺激信号和共刺激信号。举例来说，提供每种信号的试剂可以存在于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，所述试剂可以与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。可替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂存在于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供主要激活信号的试剂存在于溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中，两种试剂都可以存在于溶液中。在另一个实施方案中，试剂可呈可溶形式，并且然后交联到表面，诸如表达Fc受体的细胞或抗体或其他粘合剂，其将结合于诸如美国申请公布2004/0101519和2006/0034810(其公开内容据此以引用方式并入)中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期在本发明的实施方案中用于激活和扩增T淋巴细胞。
适于向患者施用的治疗组合物可包括一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如，药学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其他药学上可接受的组分。药学上可接受的载体和/或稀释剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用治疗组合物的特定方法决定。因此，根据本发明的实施方案的治疗组合物存在多种合适的配方(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第17版，1985年，其公开内容据此全文以引用方式并入)。
在特定实施方案中，具有iPSC衍生造血谱系细胞的分离的群体的治疗性细胞组合物还具有药学上可接受的细胞培养基或药学上可接受的载体和/或稀释剂。可以通过静脉内、腹膜内、肠内或气管施用方法分开施用或与其他合适的化合物组合施用包含如本文所公开的iPSC衍生造血谱系细胞的群体的治疗组合物以实现所期望的治疗目标。
这些药学上可接受的载体和/或稀释剂可以按照足以使治疗组合物的pH维持在约3与约10之间的量存在。因此，缓冲剂可以占总组合物的高达约5％(重量/重量)。治疗组合物中还可以包括电解质，例如但不限于氯化钠和氯化钾。在一个方面中，治疗组合物的pH在约4到约10的范围内。可替代地，治疗组合物的pH在约5到约9的范围内、在约6到约9的范围内或在约6.5到约8的范围内。在另一个实施方案中，治疗组合物包括pH在所述pH范围中的一种的缓冲液。在另一个实施方案中，治疗组合物的pH是约7。可替代地，治疗组合物的pH在约6.8到约7.4的范围内。在再另一个实施方案中，治疗组合物的pH是约7.4。
本发明还部分地提供药学上可接受的细胞培养基在根据本发明的实施方案的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适于向人类受试者施用。一般来说，支持根据本发明的实施方案的iPSC衍生免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适用作医药学细胞培养基。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施方案中，无血清培养基是无动物成分的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物医药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的原生动物蛋白质并且营养是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，无蛋白质培养基定义为实质上不含蛋白质。本领域普通技术人员将了解，上述培养基示例具有说明性并且决不限制适用于本发明的实施方案的培养基的配方。
实施例
以下实施例是为了说明，而非为了限制而提供。
实施例1–材料和方法
单细胞解离在转染后约第14天将所有重编程培养物转换为FMM或FMM2。一旦在FMM/FMM2中，使用Accutase维持并解离所有重编程培养物。然后将单细胞在基质胶或玻连蛋白包被的表面上传代。然后将单细胞解离的细胞在FMM或FMM2中扩增并维持直到流式细胞术分选。
流式细胞术分析和分选将单细胞解离的重编程池重悬于冷却的染色缓冲液中。将缀合的一级抗体(包括SSEA4-FITC、TRA181-Alexa Fluor-647和CD30-PE(BDBiosciences))添加到细胞溶液中并在冰上孵育15min。所有抗体在每百万个细胞100μL染色缓冲液中以7μL-10μL使用。将在染色缓冲液中重悬的解离的单细胞离心并重悬于现在含有ROCK抑制剂的染色缓冲液中，并维持在冰上用于流式细胞术分选。对FACS Aria II(BDBiosciences)进行流式细胞术分选。将分选的细胞以每孔3个和9个事件的浓度直接喷射到96孔板中。每个孔用FMM2预填充。完成分选后，将96孔板孵育用于集落形成和扩增。分选后七天至十天，将细胞传代。FMM2中的后续传代在75％-90％汇合时常规进行。在GuavaEasyCyte 8HT(Millipore)上进行流式细胞术分析并且使用FCS Express 4(De NovoSoftware)分析。
检测转基因的存在使用
Figure BDA0004191132720000621
DNA Mini Kit和蛋白酶K消化(Qiagen)分离基因组DNA。使用Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen)，使用对转基因具有特异性的引物组(包括重编程因子和EBNA1)来扩增100ng基因组DNA。PCR反应如下运行35个循环：94℃持续30秒(变性)，60℃-64℃持续30秒(退火)和72℃持续1min(延伸)。来自使用慢病毒方法产生的成纤维细胞、T细胞和hiPSC的基因组DNA用作阴性对照。游离型构建体的DNA用作阳性对照。
核型分析由WiCell Research Institute(Madison,WI)对G带中期细胞进行细胞遗传学分析。每个核型分析包括最少20个扩散计数，当在前20个中鉴定出非克隆畸变时，分析扩展到40个扩散计数。
统计学分析进行至少三个独立的实验。值以平均值+SEM报告。用ANOVA进行统计学分析，p<0.05被认为是显著的。
培养基常规hESC培养物含有补充有20％敲除血清替代物、0.1mM(或1％v/v)非必需氨基酸、1mM-2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和10ng/ml-100ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基。相比之下，多级培养基另外包含HDAC抑制剂、ROCK抑制剂、GSK3抑制剂/WNT活化剂、MEK抑制剂和TGFβ抑制剂中的一者或多者。该阶段特异性培养平台还支持无饲养层重编程和维持。
在某些应用中，除了用于常规培养的成分之外，重编程培养基(例如，FRM)含有SMC4：ROCK抑制剂、GSK3抑制剂/WNT活化剂、MEK抑制剂和TGFβ抑制剂的组合。对于STTR2重编程系统，增强的重编程培养基(例如，FRM2)不包含TGFβ抑制剂，直到细胞在约第6-8天丧失其体细胞身份(例如，细胞类型特异性基因表达的丧失)，并且包含任选地在ROCKi、MEKi和GSK3i之后添加的HDAC抑制剂。在某些应用中，维持培养基(FMM)含有SMC3：ROCK抑制剂、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的组合。对于STTR2重编程，增强的维持培养基(FMM2)含有转化生长因子β超家族的成员(其示例包括但不限于激活素A、TGFβ和Nodal)，任选地GSK3抑制剂和MEK抑制剂中的一者或两者的浓度与FRM2中的浓度相比降低30％-60％。Nodal是属于TGFb超家族的分泌蛋白，并且由位于人染色体10q22.1上的NODAL基因编码。TGFβ是属于TGFb超家族的多功能细胞因子。激活素A是与TGFβ密切相关的TGFβ超家族细胞因子。
实施例2–使用FMM2增强长期稳定性和保存
诱导性多能干细胞(iPSC)的长期保存，特别是在无饲养细胞的条件下，受到细胞操作过程中的各种应激物的影响，该应激物包括但不限于单细胞解离和分选、克隆扩增、冻-融循环、载体转染和电穿孔以及基因组编辑，这导致细胞的基因组不稳定性，如可通过G带核型分析、微滴式数字PCR(包括各种核型异常)所检测到的。在染色体缺失、重复、易位或倒位中，在从T细胞重编程的iPSC(TiPSC)中比在其他体细胞类型诸如成纤维细胞中更频繁地观察到某些染色体的三体性。此外，这些应激物损害所获得的多能细胞的多能性、活力和分化潜能，该多能细胞通常在延长的时间段内用深低温保藏来建库。
先前开发的FMM(命运维持培养基)已经实现了从不是T细胞的各种体细胞重编程的iPSC的令人满意的长期稳定性。除了一些基础成分之外，FMM还包含小分子，诸如ROCK抑制剂、WNT活化剂和MEK抑制剂。为了增强长期稳定性和保存并降低从所有细胞来源，以及特别是从T细胞重编程的iPSC的核型异常的频率，如图1A中公开和举例说明的那样进行FMM的各种修饰，并且修饰和增强的iPSC维持培养基在本申请中有时称为FMM2。使用非整合STTR质粒和FRM(命运重编程培养基)或称为FRM2的修饰和增强的FRM来启动T细胞重编程，并且所得细胞用介导基因座特异性靶向插入或缺失的CRISPR核糖核蛋白(RNP)复合物转染(工程改造)或直接进行单细胞分选(非工程改造)以产生单细胞分选、工程改造或非工程改造的iPSC克隆。为了测试FMM2对长期iPSC保存的影响，以及特别是对经历冻-融循环的iPSC库的影响，将单细胞分选的iPSC克隆在FMM中扩增，并且然后也在FMM中深低温保藏(第1库)。将来自第1库的iPSC克隆解冻，在FMM或FMM2中扩增，并在各自的FMM或FMM2中深低温保藏以制备二级库(第2库)。FMM修饰主要针对FMM的小分子组成，并且测试的修饰包括补充激活素A(Act A)、TGFβ和福斯高林(Forskolin)中的至少一者；与FMM相比，与或不与MEK抑制剂(MEKi)和/或GSK3抑制剂(GSKi)的浓度降低约40％-60％联合。在此，出于说明的目的，使用MEKi或GSK3i中50％的浓度降低。
进行第2库解冻后测试以测试用不同培养基处理的iPSC克隆的长期稳定性。通过两种独立的方法检查基因组稳定性：通过ddPCR测定染色体12的拷贝数，以及通过指定传代的G带核型分析测定全基因组稳定性。G带核型分析显示出微观基因组异常(>5Mb)，包括倒位、重复/缺失、平衡和不平衡易位，和敏感性>10％嵌合体的非整倍体。
如图1B所示，如上所述测试了来自T细胞供体1的一个iPSC克隆和来自T细胞供体2的两个iPSC克隆。核型结果表示为“正常核型”(即，46，XY或46，XX)和“异常核型”。使用ddPCR进一步分析具有异常核型的克隆以确定三体性12的存在。ddPCR结果表示为“正常12”(即，拷贝数<2.3)和“三体性12”(即，拷贝数>2.3)。不考虑来自各种FMM修饰的不同程度的益处，并且考虑到供体和克隆差异，发现在存在或不存在FMM中的MEK和GSK3抑制剂的浓度降低的组合的情况下用TGFβ家族成员(诸如激活素A、TGFβ或Nodal)来补充FMM改善并增强iPSC(包括TiPSC)的长期稳定性，如与在FMM中培养而没有暴露于上述对FMM的修饰的益处的TiPSC相比，在延长的传代中和通过多个冻-融循环(并且可能在解冻和冷冻之间进行扩增、基因组工程改造和分选)，通过染色体12三体性的降低和正常核型的维持所指示。
E8是用于iPSC维持和保存的商业培养基，并且已知其促进iPSC中的激发多能性。使用所述重编程平台产生的TiPSC各自在E8、FMM或FMM2中维持超过10次传代，并收获用于基因表达谱和主成分分析(PCA)。如图2所示，维持在E8、FMM或FMM2中的TiPSC克隆形成三个不同的团簇，每个团簇与细胞所暴露的培养基相关。
进一步制备E8、FMM或FMM2培养的TiPSC克隆用于多能性标记物的RNA-seq分析。包括DPPA3、TDGF1、SALL4、NANOG、OCT4、MYC、LIN28和SOX2的常见多能性标记物在所有测试的培养条件下表达而不成簇。值得注意的是，在E8条件下，激发多能性特异性基因诸如THY1、OTX2、DUSP6和ZIC2在TiPSC中上调。克隆显示激发特异性标记物的低水平表达和初始特异性标记物的中等水平表达，例如，TBX3、TFCP2L1、UTF1、FGF4、PRDM14、DPPA5、DNMT3L、KLF4和MAEL。在本实施例中，在添加激活素A的情况下，在FMM2中培养的TiPSC克隆中所有那些初始特异性标记物的表达进一步升高。此外，FMM2培养的iPSC还最明显地表达非常高水平的PRDM14、DPPA5、DNMT3L、KLF4和MAEL，这是一组额外的初始多能性特异性基因，其大部分在E8或FMM条件下维持的iPSC中沉默(参见图3A和图3B)，证明了FMM2在使iPSC的多能性水平在多能性的谱或连续区(例如，从激发的到初始的，从低初始的到较高初始的)上加深的能力，以及其在适应较低多能性水平的iPSC中的应用，不考虑使用的重编程过程，在多能性谱上达到更高水平。
实施例3–FMM2预防iPSC中应激诱导的基因组异常
为了测试向FMM中添加TGFβ超家族成员是否改善了先前建库的iPSC的应激诱导基因工程改造和深低温保藏后的基因组稳定性，将上文所述的第1库的克隆iPSC样品解冻、工程改造、分选、扩增并分别在FMM中或补充有约10ng/mL-30ng/mL激活素A的FMM中再次深低温保藏以产生二级库，如图4A所示。如上所述，通过用CRISPR RNP复合物对iPSC进行电穿孔来进行工程改造，该CRISPR RNP复合物介导所需转基因靶向插入到特定基因组基因座中。
收获转染群体的样品(工程改造的iPSC池，并且iPSC来自第1深低温保藏库)用于核型分析，而其余细胞用于单细胞分选以产生克隆工程改造的iPSC。在转染后对工程改造的iPSC池和在FMM或FMM+激活素A中培养的分选和扩增的克隆iPSC群体进行核型分析。如图4B所示，对于通过基因工程改造操作的细胞群，在FMM中培养的工程改造的细胞群仅80％呈现正常核型(46+XY)，而在FMM2中培养的工程改造的细胞中100％呈现正常核型。
在进一步进行单细胞分选的转染群体中，筛选单个克隆的确定属性，包括成功和精确的工程改造。将接受的克隆扩增并深低温保藏为单个克隆群体(图4A)以产生二级(第2)iPSC深低温保藏库。然后从第2库中取出iPSC并解冻，并维持在FMM或FMM2培养基中。图4C中示出了对第2深低温保藏库的iPSC克隆群体进行深低温保藏/解冻后通过SNP微阵列测定进行的核型分析和拷贝数变异分析的结果：在FMM中产生的三个克隆中仅一个(33％)呈现正常核型(46+XY)，而在FMM2中产生的克隆中100％呈现正常核型(46+XY)。尽管有多轮冷冻和解冻过程，但通过SNP微阵列分析显示在FMM2中产生的所有克隆没有可报告的拷贝数变化，也没有可报告的杂合性丧失/缺失区域。因此，涉及工程改造、单细胞分选、筛选、扩增以及冷冻和解冻的多个循环的iPSC制造过程中的多种应激物对iPSC基因组稳定性具有累积的负面影响，然而，这可通过包含添加TGFb超家族成员(包括至少激活素A、TGFb和Nodal)的FMM2来减少或预防。
实施例4–FMM2导致从T细胞重编程的iPSC的改善的基因组稳定性
为了产生从T细胞重编程的iPSC(TiPSC)，用重编程质粒转染原代T细胞以产生本质上异质的iPSC池。进行单细胞分选以建立iPSC克隆。如图5A所示，将分选后的TiPSC克隆在FMM或各种形式的FMM2中扩增：FMM+ActA；FMM+ActA，GSK3抑制剂浓度比在FMM中使用的浓度降低50％(FMM+ActA–50％ CHIR)，FMM+ActA，MEK抑制剂浓度降低50％(FMM+ActA–50％PD)；或FMM+ActA，GSK3抑制剂和MEK抑制剂浓度均降低50％(FMM+ActA–50％ CHIR/PD)。
完全重编程的TiPSC克隆的筛选准则包括形态学和多能标记物表达。将接受的克隆扩增并在上述每种培养基中深低温保藏。首先通过在深低温保藏前通过微滴式数字PCR(ddPCR)测定染色体12拷贝数来检查基因组稳定性，并且然后在深低温保藏后通过G带核型分析检测所选克隆的全基因组稳定性。如图5B所示，通过ddPCR和核型分析的拷贝数测定显示出与在T细胞重编程的情况下的FMM相比，使用各种FMM2配方的基因组畸变显著减少。即使没有工程改造或多次冻-融循环，在FMM条件下TiPSC的基因组畸变率也为约75％，接近于经历多次冻-融循环和额外应激细胞操作的FiPSC所观察到的畸变率，反映了T细胞重编程的困难。相反，在FMM2条件下TiPSC的基因组畸变率显著较低：在FMM+ActA–50％ PD下为0％，以及在FMM+ActA–50％ CHIR/PD、FMM+ActA和FMM+ActA–50％ CHIR下分别为约8％、15％和20％。
实施例5–除了FMM2 iPSC维持之外，还使用增强的瞬时和时间重编程系统进行重 编程
图6示出了瞬时和时间重编程系统(STTR)中所需的载体。载体1是含有oriP、启动子的质粒载体，该启动子驱动一种或多种可操作连接的所选择的重编程因子(RF)的表达。载体1也称为oriP/RF质粒。当在一个载体1质粒中存在两种或更多种RF时，相邻的RF被2A肽或IRES分开。载体1不具有EBNA编码序列，并且结果缩短了在宿主细胞中的保留时间。根据用于重编程的RF的总数，可使用多个载体1质粒，它们根据需要以不同的组合共同含有所有所选择的RF。此外，期望使用多个载体1质粒进行共转染，其中通过控制多个载体1质粒的组合中每种重编程因子的相对拷贝数来精确重编程因子的化学计量。载体2是含有启动子和EBNA编码序列的质粒，其表达由启动子驱动。更重要的是，载体2缺乏oriP，这导致载体2在转染的宿主细胞群中的保留时间显著减少。EBNA和oriP序列在单独的构建体中的分离确保了转基因的瞬时表达和当细胞分裂时重编程载体的更快和更早的自发丧失，从而产生无足迹iPSC。载体2也可用EBNA mRNA或蛋白质/肽代替。
为了说明，如表3和图6中所示制备一系列载体1构建体和载体2构建体。在该示例性系统中使用的重编程因子包括四个载体1质粒，各自分别含有OCT4和YAP1、SOX2和MYC、LIN28和大T抗原(LTag)，以及ESRRB和ZIC3。然而，应当理解，可以使用任何数目的载体1质粒，并且一个载体1质粒中的RF的顺序也可以变化，前提条件是多个载体1质粒共同包含编码至少OCT4、YAP1、SOX2和LTag的多核苷酸。
表3—载体构建
Figure BDA0004191132720000671
在第0天，用上述重编程质粒转染来自三个不同供体的人T细胞。为了确定与未经相同处理的重编程培养物相比，HDAC抑制剂是否改善重编程效率，或特别是T细胞重编程效率，在转染后约第2-3天，用丙戊酸(VPA)处理重编程培养物直到产生异质iPSC群体。通过流式细胞术分析iPSC表面标记物(SSEA4、TRA-1-81和CD30)的表达。如图7A和图7B所示，发现VPA处理显著增加不同T细胞供体的群体中SSEA4+TRA-1-81+CD30+iPSC细胞的百分比，从而证明VPA在增强T细胞重编程方面具有改善的效率的优势。
进行从使用上述重编程系统产生的iPSC集落解离的单细胞的克隆扩增(图8A)以诱导应激，并且在不同供体之间确定扩增的多能培养物的稳定性。如图8B所示，iPSC群体的分数在连续传代中增加，表明来源于多个供体的稳定和自我更新的多能培养物。传代的重编程池的流式细胞术分析证实了iPSC多能性标记物的表达，表明扩增后持续的多能性(图8C)。
先前的包含ROCK抑制剂、WNT活化剂、MEK抑制剂和TGFβ抑制剂的FRM(命运重编程培养基)已经用于体细胞重编程，并且通常在转染后不久应用。重编程系统中的细胞从约第1天开始处于FRM的存在下直到产生iPSC池，过程为12-16天。发现将用STTR质粒转染的体细胞以阶段特异性方式暴露于小分子(包括VPA和TGFβ抑制剂)可进一步改善在12-16天过程期间重编程过程的质量和效率，如图9所示，并且该STTR加上包含阶段特异性HDACi和TGFβi的FRM在本申请中也称为“STTR2重编程”。
在STTR2方法和组合物中，除了如上所述的丙戊酸(VPA)处理之外，大约在载体质粒中外源基因表达的时间到iPSC集落出现的时间(从转染后约第2-3天到第12-16天)，当转染的体细胞失去T细胞身份直到在约第12-16天iPSC集落形成时，TGFβ抑制剂的暴露从STTR方法中的约第1天延迟到STTR2方法中的约第6-8天。ROCK抑制剂、WNT活化剂和MEK抑制剂在重编程后保留在培养基中，使细胞通过单细胞解离、单细胞分选来建立iPSC克隆。完全重编程的iPSC克隆的筛选准则包括形态学、多能标记物表达和重编程质粒的清除。使用如上所述的FMM2，即在分选后或在iPSC集落形成后添加激活素A，以及任选地将MEK抑制剂和WNT活化中的一者或两者浓度降低约30％-60％，将接受的克隆扩增并深低温保藏为包含高纯度克隆iPS细胞(>99％)的主细胞库(MCB)。核型分析和多能性基因谱用于确定iPSC克隆的深低温保藏后稳定性。
TaqMan探针(图10A；黑条)用于检测iPSC克隆中的重编程载体。观察到使用STTR2系统对不同供体T细胞进行重编程导致iPSC克隆的稳健产生，该iPSC克隆是100％无转基因的，具有完全的载体清除(图10B和图10C)，表明与先前系统相比更高的量和更可靠的无足迹结果。此外，STTR2产生的iPSC克隆的流式细胞仪分析显示iPSC表面标记物(SSEA4、TRA-1-81和CD30)的同质表达(图11)。与亲本T细胞相比，所有iPSC克隆的基因表达谱相同且明显不同，证实STTR2系统导致衍生自终末分化T细胞的高质量多能细胞的产生，例如，与成纤维细胞或角质形成细胞相比，其对于重编程尤其具有挑战性。
此外，发现由STTR2产生的iPSC克隆保持高的分化成代表所有三个胚层的细胞类型的倾向。通过测试由STTR2产生的iPSC的三谱系分化潜能来评估其多能性。使用STEMdiffTM三谱系分化试剂盒(Stem Cell Technologies)进行iPSC分化。在指定培养基中培养以诱导谱系特异性分化后一周，收获分化的细胞，并通过流式细胞术评估指定谱系标记物(内胚层的胰腺祖细胞标记物SOX17、中胚层的间充质标记物CD56和外胚层的神经祖细胞标记物SOX2)的表达(图12A)。
通过测试由STTR2产生的iPSC向终末分化细胞如T淋巴细胞分化的能力来评估其多能性。iPSC在阶段特异性培养基中培养以诱导造血特化和T细胞分化。如图12B所示，在指定时间点的流式细胞术分析表明，由STTR2产生的iPSC分化成与使用常规游离型系统产生的对照iPSC类似的成熟T细胞。
在单独的实验中，通过体内畸胎瘤形成测定来评估使用STTR2获得的iPSC的多能性。通过皮下注射将50-200万个由STTR2产生的iPSC植入免疫缺陷NSG小鼠。注射后6周-10周，收获畸胎瘤组织，处理，并进行组织学分析，包括用苏木精和伊红对石蜡包埋的组织切片染色。如图12C所示，使用STTR2系统产生的iPSC克隆的多能性被证实，因为畸胎瘤含有来源于每个胚胎胚层：内胚层、中胚层和外胚层的组织。
总之，数据表明，通过使用增强的STTR2系统瞬时和暂时表达重编程基因可以容易地产生无足迹iPSC，该系统除了FMM的ROCKi、MEKi和GSK3i之外还包含重编程阶段特异性小分子诸如HDACi和TGFβi。增强的平台支持有效且快速地产生基本上均质的无足迹iPSC群体，包括TiPSC，其在广泛传代中维持多能性。
实施例6–使用STTR2获得的iPSC在顺序工程改造后维持基因组稳定性并产生功能 性T细胞
如实施例2中所述将iPSC克隆解冻并扩增。在该实验中，通过用CRISPR RNP复合物对iPSC进行电穿孔来进行工程改造，该CRISPR RNP复合物介导嵌合抗原受体(CAR)表达盒靶向插入到特定基因组基因座中。对工程改造的细胞群进行单细胞分选并扩增以筛选期望的遗传模式。将在测试的最后一代(即，iPSC解冻后第10代)时表现出正常核型(46，XX)的所选克隆扩增并在FMM2中深低温保藏，并在深低温保藏后通过核型分析来测试基因组稳定性。如图13所示，STTR2产生的，CAR工程改造的iPSC克隆的流式细胞术图谱显示iPSC表面标记物(SSEA4、TRA-1-81和CD30)的同质表达。
在单独的实验中，将iPSC在阶段特异性培养基中培养以诱导造血特化和T细胞分化。在T细胞扩增结束时，通过流式细胞术和体外杀伤测定来分析iPSC衍生T细胞。如图14A所示，从STTR2产生的，CAR工程改造的iPSC克隆产生的T细胞的流式细胞术图谱显示T身份标记物(CD3ic和CD7)的同质表达。在>90％的iPSC衍生T细胞中显示CAR表达。TCR表达的缺乏证实了T细胞受体α恒定(TRAC)基因在iPSC阶段被CRISPR工程改造破坏。
使用基于流式细胞术的体外细胞毒性测定评估从STTR2产生的，CAR工程改造的iPSC分化的T细胞识别和杀死肿瘤靶细胞的能力。原代CAR-T细胞包括在测定中用于比较。将效应细胞(原代CAR-T细胞和iPSC CAR-T细胞)与具有CAR特异性抗原表达(阳性抗原肿瘤)和不具有CAR特异性抗原表达(阴性抗原肿瘤)的癌细胞系以指定的效应物与标靶(E:T)比率共培养约4小时，并通过流式细胞术进行分析。如图14B所示，根据下式计算每种效应物与标靶(E:T)比率的细胞毒性百分比：细胞毒性百分比＝100-(含有测试制品的剩余活靶细胞的％/没有测试制品的剩余活靶细胞的％×100)。总之，数据表明，与CAR工程改造的原代T细胞相比，从STTR2产生的，CAR工程改造的iPSC克隆分化的T细胞显示类似的抗原特异性杀伤功能。
实施例7--用于产生单细胞衍生iPSC库作为用于治疗用途的衍生细胞的来源的瞬 时和时间重编程系统
在本申请中，STTR2重编程和FMM2维持组合物和方法已被一前一后使用以产生克隆主iPSC系，用作现成免疫疗法的可再生和可靠的细胞来源。用所公开的质粒组合转染供体同意的成纤维细胞或T细胞。将重编程细胞以克隆密度分选到96孔板中，并且将单细胞衍生iPSC克隆扩增并筛选期望的属性，包括多能性、重编程质粒的丢失、基因组稳定性和分化潜能。将所选择的克隆iPSC系在严格的制造和工艺质量控制下制造和深低温保藏，并且对该系进一步进行广泛的表征和测试，以便根据相关法规要求鉴定为“主细胞库”。制造的iPSC库的iPSC按照目前的良好制造规范分化成临床相关规模的天然杀伤(NK)谱系或T谱系细胞。对衍生细胞进一步进行广泛的表征和测试，以便根据相关法规要求鉴定为“药物物质和药物产品”。将iPSC衍生NK或T谱系细胞深低温保藏以产生约例如1×108个细胞/剂量的大量剂量，用于血液和实体癌的过继性细胞疗法中作为单一疗法或与免疫检查点抑制剂联合使用。一般来说，1×108个细胞/剂量转化为对于60kg的患者1.67×106个细胞/千克。根据来自GLP(良好实验室规范)和非GLP体外和体内研究的临床前数据设计和确定每种适应症的剂型、施用途径和给药方案。
除了支持iPSC衍生免疫细胞治疗癌症和免疫疾病之外，由STTR2重编程平台和/或FMM2维持培养基产生的无足迹和无饲养细胞的主iPSC系还具有实现从黄斑变性、糖尿病、帕金森氏病、血液病症到心血管疾病范围内的退行性病症的现成细胞疗法的潜力。
所属领域技术人员将容易地了解，本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施方案，并且不预期限制本发明的范围。对于所属领域的技术人员显而易见的是，可以对本文所公开的本公开进行各种取代和修改而不脱离本发明的范围和实质。
本说明书中提到的所有专利和公开案都指示本公开所属领域的技术人员的技能水平。所有专利和公开案以引用的方式并入，其程度如同每一个别公开案专门并且单独指定为以引用的方式并入。
本文说明性描述的本公开可以在本文未特别公开的任何成分、限制不存在的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中的每一种情况下，术语“包含”、“主要由…组成”和“由…组成”中的任一个可由其它两个术语中的任一个替换。已使用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用，并且使用这类术语和表述时，不希望排除所示和所述特点的任何等效物或其一部分，而是应认识到，在所要求的本公开的范围内可以存在各种修改。因此，应理解，虽然本公开已通过优选实施方案和任选存在的特点进行特别地公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的观点进行修改和变化形式，且这类修改和变化形式被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。

Claims (79)

1.一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物，所述组合物包含：
(i)TGFβ家族蛋白，
(ii)ROCK抑制剂，和
(iii)MEK抑制剂和WNT活化剂，
其中所述组合物不包含TGFβ抑制剂，
其中所述组合物在长期iPSC维持中有效地改善iPSC多能性和基因组稳定性。
2.根据权利要求1所述的组合物，
(a)其中所述长期iPSC维持包括一个或多个阶段，所述阶段包括：
iPSC集落的单细胞解离、解离的iPSC的单细胞分选、iPSC单细胞克隆扩增、克隆iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、iPSCMCB的解冻和任选地所述iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；或者
(b)其中所述TGFβ家族蛋白任选地在iPSC集落的单细胞解离时，或在iPSC单细胞克隆扩增时，或在其间的任何阶段添加到所述组合物中；或者
(c)其中所述MEK抑制剂和/或所述WNT活化剂的量为用于将非多能细胞重编程为所述iPSC的重编程组合物中使用的量的30％-60％。
3.根据权利要求1所述的组合物，
(i)其中所述TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、Nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者
(ii)其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。
4.根据权利要求2所述的组合物，
(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者
(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞；或者
(iii)其中所述重编程组合物包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、TGFβ抑制剂和任选的HDAC抑制剂，其中所述TGFβ抑制剂和所述HDAC抑制剂在重编程期间的特定阶段被包含在所述重编程组合物中。
5.根据权利要求1所述的组合物，
(i)其中与没有接触所述组合物的iPSC相比，所述改善的长期iPSC多能性通过减少的多能性逆转或减少的自发分化来指示；并且
(ii)其中与没有接触所述组合物的iPSC相比，所述改善的基因组稳定性通过更低的基因组异常倾向来指示。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述改善的基因组稳定性包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。
7.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含iPSC，任选地其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑。
8.根据权利要求2所述的组合物，
(i)其中所述iPSC维持还包括iPSC基因编辑以获得工程改造的iPSC池、工程改造的iPSC池的单细胞分选、工程改造的iPSC单细胞克隆扩增、克隆工程改造的iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、工程改造的iPSC MCB的解冻和任选地所述工程改造的iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；并且
(ii)其中所述工程改造的iPSC包含至少一种基因组编辑。
9.一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物，所述组合物包含：
(i)ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂；
(ii)HDAC抑制剂；和
(iii)TGFβ抑制剂，
其中所述组合物有效地改善非多能细胞的重编程以获得具有建立的多能性和改善的基因组稳定性的iPSC，并且任选地，
其中，将(i)、(ii)或(iii)添加到所述组合物中在所述非多能细胞的重编程期间对于提高的重编程效率是阶段特异性的。
10.根据权利要求9所述的组合物，
(a)其中所述非多能细胞的所述重编程包括一个或多个阶段，所述阶段包括：体细胞转染(第0天)、外源基因表达、异染色质增加、体细胞身份丧失和iPSC集落形成；或者
(b)其中所述HDAC抑制剂的所述添加任选地在染色质重组时，或在约第2-3天(转染后)；或者
(c)其中所述TGFβ抑制剂的所述添加任选地在体细胞身份丧失时，或在约第6-8天(转染后)，
其中重编程中的所述一个或多个阶段通过细胞形态学变化和/或标记基因谱来指示。
11.根据权利要求9所述的组合物，
(i)其中所述HDAC抑制剂包含丙戊酸(VPA)或其功能变体或衍生物；并且/或者
(ii)其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。
12.根据权利要求9所述的组合物，
(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者
(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞。
13.根据权利要求9所述的组合物，
(i)其中所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者
(ii)其中所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：
MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者
(iii)其中所述改善的基因组稳定性通过比在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC更低的基因组异常倾向来指示；并且/或者
(iv)其中所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的所述iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。
14.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括对iPSC群体进行深低温保藏的步骤，
其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触，并且
其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在深低温保藏期间得以维持；并且任选地，
其中包含同质iPSC的所述iPSC群体从克隆iPSC单细胞扩增。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括将单细胞iPSC克隆扩增以获得所述克隆iPSC群体的步骤，
其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触，并且
其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在扩增期间得以维持。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括对解离的iPSC进行单细胞分选以获得单细胞iPSC克隆的步骤，
其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触，并且
其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在单细胞分选期间得以维持。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括将iPSC集落解离成单细胞iPSC的步骤，
其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触，并且
其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在iPSC单细胞解离期间得以维持。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括获得至少一个包含由对非多能细胞进行重编程产生的iPSC的集落的步骤。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述iPSC从体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程，或者其中所述iPSC从T细胞重编程。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，
(i)其中所述多能性包括基态多能性；并且/或者
(ii)其中所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者
(iii)其中所述基因组稳定性包括比在没有接触所述组合物的所述步骤中的iPSC更低的基因组异常倾向。
21.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其中所述方法包括：
(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；以及
(ii)使步骤(i)后的所述细胞与根据权利要求9至13中任一项所述的组合物接触足够长的时间，从而通过对所述非多能细胞进行重编程来产生至少一个包含iPSC的集落。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转移步骤包括向所述非多能细胞中引入：
(i)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码EBNA或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少OCT4，或至少OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及
(ii)以下项中的一者：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)EBNA mRNA；和(3)EBNA蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一个或多个第一质粒还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者，或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触步骤还包括在ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的存在下培养所述细胞。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触步骤包括：
(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂的组合接触；
(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与HDAC抑制剂接触；以及
(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与TGFβ抑制剂接触，
从而产生至少一个包含iPSC的集落；
其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者
其中所述iPSC是无足迹的，具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。
26.根据权利要求21所述的方法，
(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者
(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，
(i)其中所述建立的多能性包括基态多能性；并且/或者
(ii)其中所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：
MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者
(iii)其中所述改善的基因组稳定性包括比来自没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程的iPSC更低的基因组异常倾向；并且/或者
(iv)其中所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述改善的基因组稳定性还包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。
29.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其中所述方法包括：
(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程；
(ii)使步骤(i)后的所述细胞与根据权利要求9至13中任一项所述的组合物接触足够长的时间，从而产生至少一个包含iPSC的集落，其中建立所述iPSC的多能性和基因组稳定性；
(iii)将步骤(ii)的所述iPSC集落解离成解离的iPSC，其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触；
(iv)对解离的iPSC进行分选以获得一个或多个单细胞iPSC克隆，其中所述单细胞iPSC克隆与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触；以及任选地，
(v)将所述单细胞iPSC克隆扩增成克隆iPSC群体，其中所述克隆iPSC群体与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触；
以及任选地
(vi)对所述克隆iPSC群体进行深低温保藏，其中所深低温保藏的群体与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触；
其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在所述解离、分选、扩增、深低温保藏或解冻的步骤期间得以维持。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法包括对所述克隆iPSC群体进行深低温保藏。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述一种或多种重编程因子包含至少OCT4。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述转移步骤(i)包括向所述非多能细胞中引入：
(a)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸，但不包含编码EBNA或其变体的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少OCT4，或至少OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程；以及
(b)以下项中的一者：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)EBNA mRNA；和(3)EBNA蛋白。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个第一质粒还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者，或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述接触步骤(ii)还包括在ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的存在下培养所述细胞。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述接触步骤(ii)还包括：
(a)任选地在外源重编程因子表达阶段，或在重编程因子转移(第0天)后第1-2天使步骤(i)后的所述细胞与包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂的组合接触；
(b)任选地在染色质重组阶段，或在重编程因子转移后约第2-3天使步骤(a)的所述细胞与HDAC抑制剂接触；以及
(c)任选地在体细胞身份丧失阶段，或在约第6-8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与TGFβ抑制剂接触，
从而产生至少一个包含iPSC的集落；
其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示；并且/或者
其中所述iPSC具有建立的多能性和改善的基因组稳定性，并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。
36.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括：
(1)使所述分选步骤(iv)、扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)的所述细胞与ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂接触，其中所述MEK抑制剂和所述WNT活化剂中的一者或两者的浓度为步骤(ii)中的浓度的30％-60％；以及
(2)另外使所述扩增步骤(v)和深低温保藏步骤(vi)以及任选的所述解离步骤(iii)和/或分选步骤(iv)的所述细胞与TGFβ家族蛋白接触；并且
其中步骤(iii)、(iv)、(v)和(vi)中的所述细胞不与TGFβ抑制剂或HDAC抑制剂接触。
37.根据权利要求29所述的方法，
(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者
(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞。
38.根据权利要求29所述的方法，
(i)其中所述多能性包括基态多能性；并且/或者
(ii)其中所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且/或者
(iii)其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑；并且/或者
(iv)其中所述基因组稳定性包括更低的基因组异常倾向。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述基因组稳定性还包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。
40.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法还包括对iPSC进行基因编辑以获得工程改造的iPSC池、工程改造的iPSC池的单细胞分选、工程改造的iPSC单细胞克隆扩增、克隆工程改造的iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、工程改造的iPSC MCB的解冻和任选地所述工程改造的iPSC MCB的附加深低温保藏-解冻循环；并且其中所述工程改造的iPSC包含至少一种基因组编辑。
41.一种组合物，所述组合物包含诱导性多能细胞(iPSC)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其中所述iPSC与ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂和TGFβ家族蛋白的组合接触，并且其中所述iPSC包含增加的初始特异性基因表达，所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者：MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3；并且任选地，所述iPSC具有以下特性中的至少一者：高克隆性、遗传稳定性和基态多能性。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、Nodal和其功能变体或片段中的至少一者；并且/或者
其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述iPSC通过对非多能细胞进行重编程来产生。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞；或者其中所述非多能细胞包括T细胞。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑。
46.根据权利要求41所述的组合物，所述组合物还包含培养基，其中所述培养基是无饲养层的。
47.根据权利要求41所述的组合物，其中所述iPSC具有以下特性中的至少一者：高克隆性、遗传稳定性和基态多能性。
48.一种诱导性多能细胞(iPSC)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其通过根据权利要求14至40中任一项所述的方法产生。
49.根据权利要求48所述的诱导性多能细胞(iPSC)、其细胞系、克隆群体或主细胞库，其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑。
50.一种衍生的非天然细胞或其群体，其从根据权利要求48或49所述的多能细胞或细胞系的体外分化获得。
51.根据权利要求50所述的衍生的非天然细胞或其群体，其中所述细胞是免疫效应细胞，并且任选地，所述免疫效应细胞包含所述iPSC中包含的至少一种基因组编辑。
52.根据权利要求50所述的衍生的非天然细胞或其群体，其中所述细胞包括CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或免疫调控细胞。
53.根据权利要求50所述的衍生的非天然细胞或其群体，其中所述细胞是包含至少一种以下特性的再生细胞：异染色质的总体增加；改善的线粒体功能；增加的DNA损伤应答；端粒延长和短端粒百分比的降低；衰老细胞的分数降低；以及与其天然细胞对应物相比更高的增殖、存活、存留或记忆样功能的潜力。
54.一种用于制造应用于基于细胞的疗法的多能细胞的组合物，其中所述组合物包含通过根据权利要求14至40中任一项所述的方法产生的多能细胞。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述多能细胞是同种异体的或自体的。
56.一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含通过根据权利要求14至40中任一项所述的方法获得的多能细胞。
57.一种用于药物用途的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求48所述的诱导性多能细胞或根据权利要求50至53中任一项所述的衍生的非天然细胞。
58.一种用于在非多能细胞中启动重编程的体外系统，其中所述系统包括：
一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码OCT4、YAP1、SOX2和LTag的多核苷酸；以及任选地以下项中的一者：
(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；
(2)EBNA mRNA；和
(3)EBNA蛋白。
59.根据权利要求58所述的系统，其中所述第二质粒具有高丧失率；并且其中EBNA的所述表达是瞬时的和暂时的。
60.根据权利要求58或59所述的系统，其中所述系统不在细胞核中提供EBNA复制和/或连续表达。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的系统，其中所述系统能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行EBNA的瞬时/细胞质表达。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的系统，其中所述系统能够在短时间内并且在出现多能性细胞形态和诱导性内源多能性基因表达之前进行包含在所述第一质粒中的一种或多种重编程因子的瞬时/细胞质表达。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的系统，其中所述复制起点选自由多瘤病毒科病毒、乳头瘤病毒科病毒和γ疱疹病毒亚科病毒组成的组。
64.根据权利要求58至63中任一项所述的系统，其中所述复制起点是选自由SV40、BK病毒(BKV)、牛乳头瘤病毒(BPV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)组成的组的复制起点。
65.根据权利要求58至64中任一项所述的系统，其中所述复制起点对应于或来源于EBV的野生型复制起点。
66.根据权利要求58至65中任一项所述的系统，其中所述EBNA是基于EBV的。
67.根据权利要求58至66中任一项所述的系统，其中所述一个或多个第一质粒还共同包含编码重编程因子的多核苷酸，所述重编程因子包含(i)NANOG、KLF、LIN28、MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的一者或多者；或(ii)MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3。
68.根据权利要求58至67中任一项所述的系统，其中所述编码重编程因子的多核苷酸包含在多顺反子构建体或非多顺反子构建体中。
69.根据权利要求68所述的系统，其中所述多顺反子构建体包含单个开放阅读框或多个开放阅读框。
70.根据权利要求58至69中任一项所述的系统，其中所述系统包括两个或更多个第一质粒，每个第一质粒包含由所述多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。
71.根据权利要求58至70中任一项所述的系统，其中所述系统包括四个第一质粒，每个第一质粒包含由所述多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。
72.根据权利要求58至71中任一项所述的系统，其中所述系统包括四个第一质粒，每个第一质粒包含分别编码OCT4和YAP1、SOX2和MYC、LIN28和LTag以及ESRRB和ZIC3的多核苷酸的至少一个拷贝。
73.根据权利要求58至72中任一项所述的系统，其中所述第一质粒包含多于一种编码重编程因子的多核苷酸，其中所述相邻多核苷酸通过编码自切割肽或IRES的接头序列能够操作地连接。
74.根据权利要求73所述的系统，其中所述自切割肽是2A肽，并且选自包含F2A、E2A、P2A和T2A的组。
75.根据权利要求74所述的系统，其中包含在所述第一质粒构建体中的所述2A肽能够是相同或不同的。
76.根据权利要求74或75所述的系统，其中相邻位置的两个2A肽是不同的。
77.根据权利要求58至76中任一项所述的系统，其中所述第一质粒和所述第二质粒各自包含用于表达重编程因子和EBNA的一个或多个启动子，并且其中所述一个或多个启动子包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC和组成型、诱导型、内源调控型或时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的其他合适启动子中的至少一者。
78.根据权利要求58至77中任一项所述的系统，其中所述第一质粒和所述第二质粒各自包含CAG启动子。
79.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求58至78中任一项所述的系统。
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