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KR20180015731A - 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정 - Google Patents

캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정 Download PDF

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KR20180015731A
KR20180015731A KR1020187000347A KR20187000347A KR20180015731A KR 20180015731 A KR20180015731 A KR 20180015731A KR 1020187000347 A KR1020187000347 A KR 1020187000347A KR 20187000347 A KR20187000347 A KR 20187000347A KR 20180015731 A KR20180015731 A KR 20180015731A
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KR
South Korea
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sequence
dna
lys
target
leu
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Withdrawn
Application number
KR1020187000347A
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English (en)
Inventor
김은지
김석중
Original Assignee
주식회사 툴젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

캄필로박터 제주니 CRISPR/CAS 시스템 유래 RGEN 및 이의 이용에 관한 것이다.

Description

캄필로박터 제주니 CRISPR/CAS 시스템 유래 RGEN을 이용한 유전체 교정{GENOME EDITING USING CAMPYLOBACTER JEJUNI CRISPR/CAS SYSTEM-DERIVED RGEN}
캄필로박터 제주니 CRISPR/CAS 시스템 유래 RGEN 및 이의 이용에 관한 것이다.
특정한 유전체 위치에 표적화된 절단을 유도할 수 있는 유전자 가위 (engineered nuclease)는 살아있는 세포 및 개체에서 매우 효율적으로 유전체를 조작할 수 있다 (Nat Rev Genet, 2014. 15(5): p. 321-34.). 맞춤 설계된 2 형 제한 효소의 DNA 결합 영역 및 뉴클레아제 영역을 기반으로 하는 유전자 가위는 바이오 의학분야 및 산업의 다양한 측면에서 유전체 조작 기술의 다양한 범위의 적용이 가능함을 보여줬다. 그러나, 더욱 최근에는, 유전자 가위로 더욱 강력한 플랫폼인 박테리아 CRISPR/CAS9 적응 면역계 시스템 유래 RGEN (RNA-guided engineered nuclease)이 개발되었다.
RGEN에 의해 표적화되는 서열은, 이전에는 리프로그래밍 될 수 없었던 CAS9 단백질에 의해 인식되는 작은 모티브 (motif)인 PAM 서열에 제한된다. 현재 널리 사용되는 RGEN은 PAM 서열로 NGG를 가지는 CAS9 단백질을 포함하는 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래 RGEN이며, 따라서 상기 RGEN이 DNA를 인식하기 위해서는 항상 GG 모티브가 필요하다. RGEN에 의해 표적화될 수 있는 서열을 확장하기 위해, PAM 서열의 다양성을 가지는 다른 박테리아 종 유래 RGEN을 분리하고 확인해볼 수 있다. 실제로, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus, PAM: NNAGAAW) 및 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis, PAM: NNNNGATT) 유래 RGEN이 개발되어 RGEN 표적 위치를 선정하는데 선택의 폭이 더욱 넓어진바 있다.
이에, 본 발명자들은 유용성을 지니는 스트렙토코커스 피요게네스 외에 다른 종 유래의 RGEN을 개발하고자 예의 노력한 결과, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni , C. jejuni) 유래의 Cas 단백질이 NNNNRYAC 인 PAM 서열을 인식하는 것을 규명하여, 이를 상기 PAM 서열을 가진 표적 DNA의 타겟팅에 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 가이드 RNA의 구조를 최적화하여, 이들을 유전체 교정, 전사 조절 및 목적 DNA 분리 등을 가져올 수 있는 표적 DNA 타겟팅에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열을 인식하는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 PAM 서열을 가지는 표적 DNA 서열을 타겟팅하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 PAM 서열에 인접한, 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) NNNNRYAC (서열번호 1) 인 PAM 서열에 인접한, 표적 DNA 내 서열과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA, 및 (ii) NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 Cas 단백질을 포함하는, CRISPR-CAS 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) NNNNRYAC (서열번호 1) 인 PAM 서열에 인접한, 표적 DNA 내 서열과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA에 대한 발현 카세트, 및 (ii) NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 Cas 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는, 재조합 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 21 내지 23bp 길이의 서열을 포함하는, 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 13 내지 18bp 의 길이의 줄기 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함하는, 분리된 가이드 RNA 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 5 내지 10bp 의 길이의 루프 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함하는, 분리된 가이드 RNA 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 유전체를 교정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 표적 DNA를 절단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 주어진 서열에서 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM 서열의 존재를 확인하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM 서열이 존재하면 이의 업스트림 (upstream)에 위치한 서열을 가이드 RNA에 의해 인식되는 서열로 결정하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA 의 표적 DNA 인식 서열의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 불활성화된 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하여, 표적 DNA 서열을 포함하는 목적하는 DNA 와 가이드 RNA 및 불활성화된 Cas 단백질이 서로 복합체를 형성하는 단계; 및 (ii) 상기 복합체를 시료로부터 분리하는 단계를 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 DNA를 특이적으로 인식하는 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 전사 효과기 도메인이 결합된 불활성화된 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 표적 DNA 서열을 포함하는 목적하는 DNA에서 Cas 매개 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 유전체 교정, 전사 조절 및 목적 DNA 분리 등을 가져올 수 있는 표적 DNA 타겟팅에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 C. jejuni Cas9 단백질 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다. 인간화된 Cas9 단백질이 CMV 프로모터 하에 발현되고, 핵 위치 신호 (NLS) 및 HA 태그가 C-말단에 존재하도록 구축하였다.
도 2a 및 2b는 내재적 인간 AAVS1 표적 위치에서 C. jejuni RGEN 유도 돌연변이에 대한 실험을 나타낸 것이다. (도 2a) T7E1 어세이를 사용하여 RGEN-매개 염색체 돌연변이 (GEN-driven chromosomal mutation)를 검출하였다. 별표 (*)는 T7E1에 의해 절단될 것으로 예상되는 DNA 밴드를 나타낸다. HEK293 wt gDNA를 음성 대조군 (-)으로 사용하였다. 기 검증된 RGEN을 양성 대조군 (+)으로 사용하였다. (도 2b) hAAVS1 돌연변이 클론의 DNA 서열을 나타내었다. 키메릭 RNA에 상보적인 표적 서열 부위를 볼드체로 나타내었다. 밑줄로 그어진 부분은 CAS9에 의해 인식되는 PAM 서열을 나타낸다. 도 2b에 개시된 WT 서열을 서열번호 4에 (-2, x1)으로 표시한 서열을 서열번호 5에, (-1, x1)으로 표시한 서열을 서열번호 6에 나타내었다.
도 3a 및 3b는 내재적 마우스 ROSA26 (mROSA) 표적 위치에서 C. jejuni RGEN 유도 돌연변이에 대한 실험을 나타낸 것이다. (도 3a) T7E1 어세이를 사용하여 RGEN-매개 염색체 돌연변이 (GEN-driven chromosomal mutation)를 검출하였다. 별표 (*)는 T7E1에 의해 절단될 것으로 예상되는 DNA 밴드를 나타낸다. NIH3T3 wt 세포의 gDNA를 음성 대조군 (-)으로 사용하였다. 기 검증된 RGEN을 양성 대조군 (+)으로 사용하였다. (도 3b) mROSA 돌연변이 클론의 DNA 서열을 나타내었다. 키메릭 RNA에 상보적인 표적 서열 부위를 볼드체로 나타내었다. 밑줄로 그어진 부분은 C.jejuni CAS9에 의해 인식되는 PAM 서열을 나타낸다. 도 3에 개시된 WT 서열은 서열번호 7 (-1, x1)으로 표시한 서열을 서열번호 8에, (+1, x1)으로 표시한 서열을 서열번호 9에 나타내었다.
도 4는 변형된 C. jejuni sgRNA 구조에 의해 유도된, 내재적 AAVS1 표적 위치에서의 돌연변이를 나타낸다. T7E1 어세이를 사용하여 RGEN-매개 염색체 돌연변이 (GEN-driven chromosomal mutation)를 검출하였다. 별표 (*)는 T7E1에 의해 절단될 것으로 예상되는 DNA 밴드를 나타낸다. HEK293 wt gDNA를 음성 대조군 (-)으로 사용하였다. 기 검증된 RGEN을 양성 대조군 (+)으로 사용하였다.
도 5a 내지 도 5c는 sgRNA의 스페이서 길이의 최적화에 관한 것이다.
도 5a 에는 여러가지 sgRNA구조를 나타내었다. 도 5a에서 밑줄로 표시된 부분은 sgRNA의 스페이서의 5' 앞에 존재하는 추가적인 뉴클레오타이드를 나타내고, 소문자는 표적 서열과 매치되지 않는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 박스로 표시한 부분은 PAM 서열을 나타낸다. 도 5a에서 표적 서열은 서열번호 10에, GX19는 서열번호 11에, GX20은 서열번호 12에, GX21은 서열번호 13에, GX22은 서열번호 14에, GX23은 서열번호 15에, GGX20은 서열번호 16에, GGGX20은 서열번호 17에 나타내었다. 도 5b에는 sgRNA의 표적 위치를 나타내었고, hAAVS-CJ1, hAAVS-NRG1, hAAVS-NRG3, 및 hAAVS-NRG5 에 대한 서열 각각을 서열번호 18, 19, 20, 및 21에 나타내었다. 도 5c는 제작한 sgRNA를 이용하여 RGEN 매개 돌연변이 유도 효율을 확인하였다.
구체적으로 표적 DNA를 인식하는데 사용되는 스페이서의 길이 (19~23bp)와 그 앞에 붙이는 추가적인 G (guanine)의 개수를 다양하게 제작하여 테스트하였다. 도 5a에 나타낸 각각의 sgRNA를 인간 AAVS1 locus의 4군데의 표적 위치 (도 5b에 표시)에 대한 것으로 제작하여, 이를 인간 배양 세포인 293 세포에 전달하였다. 그 다음, 상기 세포에서 NHEJ에 의한 돌연변이 도입을 확인하였다. 돌연변이 도입의 확인은, 표적 위치를 PCR 증폭한 다음, miSEQ (illumine)을 이용한 딥 시퀀싱 (deep sequencing)을 이용하였다. 전체적인 패턴으로 보면 기존 다른 종이나 C.jejuni에서 사용되는 GX19또는 GX20의 모양에 비해 인식 서열이 21 내지 23bp인 경우; 또는 인식 서열 앞에 추가적인 G를 2개 또는 3개를 붙이는 경우에 유전체 교정 (돌연변이 도입) 빈도가 향상됨을 확인하였다.
도 6은 AAVS1-CJ1 위치를 surrogate reporter에 삽입하고 C.jejuni CRISPR/Cas9의 활성을 분석한 결과이다. PAM 위치의 서열이 ACAC인 경우의 활성을 100으로 두고 각 위치에 다른 뉴클레오타이드를 도입했을 때의 활성을 비교적으로 계산하였다. 이때 첫 번째 위치에서는 A 이외에도 G의 경우에 활성을 보이며 두 번째 위치에서는 C만이 아니라 T에서도 활성을 보였다. 하지만 3번째와 4번째 위치에서는 각각 A, C에서만 활성을 보였다. 따라서 최적화된 PAM 서열 (optimal PAM sequence) NNNN-A/G-C/T-C-A (또는 NNNNRYAC, 서열번호 1, 여기서 A/G = R, C/T = Y) 로 유추하였다. 상기 N은 IUPAC 표기법에 따라 Any nucleotide를 말하며, 그 예로 A, C, G, 및 T를 포함한다.
도 7은 Digenome-Seq 분석을 통해 발굴된 hAAVS1-CJ1 sgRNA의 잠재적 오프 타겟 서열의 consensus logo 를 나타낸 것이다.
도 8은 C.jejuni Cas9 의 PAM 에 대한 테스트 결과이다. NNNNRYAC (서열번호 1)를 갖는 7개 표적 위치에 대한 돌연변이 도입 효율을 분석하였다.
hAAVS1-RYN1~7: 각 사이트에 대한 sgRNA/Cas9 처리된 세포에서의 돌연변이 비율,
WT1~7: mock-treated 세포의 genomic DNA에서 각 위치에서의 돌연변이 비율
도 9는 C. jejuni CRISPR/Cas9 발현 AAV 벡터 구조 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 Rosa26 locus에 대한 C.jejuni CRISPR/Cas9 AAV (adeno-associated virus)에 의한 유전체 교정 (genome editing)을 나타낸 것이다. 구체적으로, 하나의 벡터에 Rosa26-sgRNA 및 C.jejuni Cas9을 인코딩하는 재조합 AAV를 C2C12 세포에 각각 다른 MOI (multiplicity of infectivity)로 감염하였다. 게노믹 DNA를 감염 후 3일, 5일, 7일, 10일, 및 14일에 분리하였고, 돌연변이 비율을 deep sequencing으로 분석하였다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명의 하나의 양태는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 표적 DNA 서열을 타겟팅하는 방법이다.
보다 구체적으로 본 발명의 하나의 양태는 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열을 인식하는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 PAM 서열을 가지는 표적 DNA 서열을 타겟팅하는 방법을 제공한다.
상기 N은 IUPAC 표기법에 따라 Any nucleotide를 말하며, 그 예로 A, C, G, 및 T를 포함한다. R은 Purine (A/G)을, Y는 피리미딘 (C/T)를 말한다.
상기 단계는 서열번호 1의 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산과, 순차적으로 또는 동시에 서열번호 1의 PAM 서열에 인접한 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는 가이드 RNA를 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
한편, 상기 타겟팅은 표적 DNA 서열의 절단 또는 절단 없이 Cas 단백질이 결합된 것을 모두 포함하는 개념이다.
하기에서 기술될 용어 설명은 본 발명에 기술된 모든 다른 양태에도 적용되고, 조합된다.
상기 Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 Cas 단백질은 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase) 활성을 나타낼 수 있다.
Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다. 또한, 상기 Cas 단백질은 캄필로박터 속 (Campylobacter) 속, 보다 구체적으로 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas 단백질, 보다 구체적으로 Cas9 단백질일 수 있다. 보다 구체적인 예로 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 단백질의 활성을 가지면서도 상동성을 가지는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 상기 서열번호 22와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다 그러나, 상기 기술된 예에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas 단백질은 천연형 단백질 외에도 가이드 RNA와 협동하여 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase로 작용할 수 있는 변이체를 모두 포함하는 개념으로 본 발명에서 사용된다. 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 니카아제인 경우, 표적 DNA 절단을 가져올 수 있고, 이를 이용하여 유전체 교정을 가지고 올 수 있다. 또한, 불활성화된 변이체인 경우, 이를 이용하여 전사 조절 혹은 목적하는 DNA의 분리를 가져올 수 있다.
상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매적 아스파라긴산 잔기 (catalytic aspartate residue) 또는 히스티딘 잔기가 임의의 다른 아미노산으로 변경된 Cas9의 돌연변이 형태일 수 있다. 구체적으로, 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로 상기 Cas 단백질, 구체적으로 C. 제주니 유래의 Cas9 단백질은 8번의 촉매 아스파라긴산(aspartic acid, D), 또는 559번의 히스티딘 잔기(histidine, H)가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 즉 Cas9 뉴클레아제 단백질 중 하나의 활성 부위 (active site)에만 변이를 도입해 만든 Cas9 뉴클레아제 단백질은 가이드 RNA와 결합하였을 때, 니카아제 (nickase)로 작용할 수 있다. 이와 같은 nickase는 두 개를 사용할 경우 양쪽 DNA 가닥을 둘 다 잘라 DSB (double strand breakage)를 일으킬 수 있으므로 RGEN의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, "불활성화된 Cas 단백질"은 뉴클레아제의 기능이 전부 또는 일부 불활성화된 Cas 뉴클레아제 단백질을 의미한다. 상기 불활성화된 Cas는 dCas로도 명명된다. 상기 Cas는 Cas9 단백질일 수 있다. 또한, 캄필로박터 속, 보다 구체적으로 C. 제주니 유래일 수 있다. 불활성화된 Cas9 뉴클레아제 단백질의 제조는 뉴클레아제의 활성이 불활성화되는 방법은 제한 없이 포함된다. 그 예로, 앞서 기술된 Cas9 뉴클레아제의 두 활성부위에 돌연변이를 도입해 만든 dCAS9 단백질은 가이드 DNA와 결합하였을 때 DNA를 절단하지 않는 DNA 결합 복합체로 작용할 수 있다. 구체적으로, 8번의 촉매 아스파라긴산(aspartic acid, D), 및 559번의 히스티딘 잔기(histidine, H)가 다른 아미노산, 구체적으로 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된, 용어 "절단"은 뉴클레오타이드 분자의 공유 결합 백본(covalent backbone)의 파손 (breakage)을 포함한다.
본 발명에서 상기 Cas 단백질은 재조합 단백질일 수 있다.
상기 용어 "재조합"은, 예컨대 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터 등을 언급하며 사용될 때, 이종 (heterologous) 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연형 (native) 핵산 또는 단백질의 변경, 또는 변형된 세포로부터 유래한 세포에 의해 변형된 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터를 나타낸다. 따라서, 예컨대, 재조합 Cas 단백질은 인간 코돈 표 (human codon table)를 이용하여 Cas 단백질을 암호화하는 서열을 재구성함으로써 만들 수 있다.
*상기 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 Cas 단백질이 핵 내에서 작용할 수 있게 하는 형태일 수 있다.
상기 분리된 Cas 단백질은 또한 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 발명에 적용할 수 있다.
상기 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산은 Cas 단백질을 핵 내에 위치시키기 위한 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 추가적으로 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 Cas 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트는 상기 Cas 단백질을 발현시키기 위한 프로모터 서열 등 조절 서열 외에도 NLS 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
Cas 단백질은 분리 및/또는 정제에 유리한 태그와 연결될 수 있다. 그 예로, His 태그, Flag 태그, S 태그 등과 같은 작은 펩타이드 태그, 또는 GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그 등을 목적에 따라 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Cas 단백질은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA와 함께 RGEN (RNA-Guided Engineered Nuclease)으로 명명될 수 있다.
본 발명에서 용어, "RGEN"은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 구성요소로 포함하는 뉴클레아제를 의미한다.
본 발명에서 상기 RGEN은 표적 DNA 특이적 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 및 분리된 Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 세포에 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 DNA와 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 동시에 또는 순차적으로 세포에 적용될 수 있다.
보다 구체적인 양태로서, 본 발명에서 상기 RGEN은 1) 표적 DNA 특이적 가이드 RNA 및 분리된 Cas 단백질, 2) 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 세포에 적용될 수 있다. 상기 1)의 형태로 세포에 전달하는 것을, RNP delivery로도 명명하나, 이에 제한되지 않는다.
분리된 가이드 RNA 형태로 적용할 경우, 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro) 전사된(transcribed) 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 분리된 핵산 자체로 이용될 수도 있지만, 상기 가이드 RNA, 또는/및 Cas 단백질을 발현하기 위한 발현 카세트를 포함하는 벡터 형태로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터의 종류로는 AAV (Adeno-associated virus)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 개별적인 벡터에 각각 존재하거나, 하나의 벡터에 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서 기술된 각 적용 양태는 명세서에 기술된 보다 구체적인 양태에 대해서도 모두 적용될 수 있다. 또한, 하기에서 기술될 적용 양태들도 각 다른 구성요소에 조합되어 적용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 DNA 특이적인 RNA를 의미하며, Cas 단백질과 결합하여 Cas 단백질을 표적 DNA로 인도할 수 있다.
또한. 본 발명에서, 가이드 RNA는 절단하고자 하는 어떠한 표적에 특이적이 되도록 제조될 수 있다.
본 발명에서 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는 제1 부위 및 Cas 단백질과 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 형태, 보다 구체적으로 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 sgRNA (single-chain guide RNA)일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열의 길이는 17 내지 23bp, 18 내지 23bp, 19 내지 23bp, 보다 구체적으로 20 내지 23bp, 보다 더 구체적으로, 21 내지 23bp 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이는 이중 RNA 및 sgRNA에 모두 적용되며, 보다 구체적으로는 sgRNA에 적용될 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열의 5' 부위 앞에 1 내지 3 개의 추가적인 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 상기 뉴클레오타이드의 예로, A, T, G, C를 들 수 있다. 상기 가이드 RNA는 보다 구체적으로 1 개 내지 3개의 구아닌 (guanine, G), 보다 더 구체적으로 2개 또는 3개의 G를 가질 수 있다. 이는 이중 RNA 및 sgRNA에 모두 적용되며, 보다 구체적으로는 sgRNA에 적용될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예들에 제한되는 것은 아니다.
상기 sgRNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5' 에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분 및 표적 DNA의 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화된 것일 수 있다.
RGEN은 Cas 단백질 및 dual RNA로 구성되거나, Cas 단백질 및 sgRNA로 구성될 수 있다. 또한, 상기 RGEN은 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 및 dual RNA를 코딩하는 핵산; 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 및 sgRNA를 코딩하는 핵산을 구성요소로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가이드 RNA, 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 포함하며, crRNA 또는 sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5' 말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대해서는 앞서 설명한 내용이 모두 적용된다.
보다 구체적으로, 상기 가이드 RNA는 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 13 내지 18bp 의 길이의 줄기 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 줄기 구조는 서열번호 2의 염기 서열 (5'-GUUUUAGUCCCUUGUG-3') 및 이와 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 5 내지 10bp 의 길이의 루프 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 루프 구조는 서열번호 3의 염기 서열 (5'-AUAUUCAA-3')의 서열을 가질 수 있다.
상기 기술되거나 후술될 Cas 단백질과 가이드 RNA, 특히 sgRNA는 비자연적으로 발생되고, 조작된 (engineered) 것일 수 있다. 또한, 상기 각각에 기재된 요소들은 모두 조합되어 적용될 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 내 도입은 (1) 박테리아에서 과발현시킨 후 정제한 Cas9 단백질과 특정 HLA 타겟 시퀀스를 인지하는 sgRNA (single guided RNA)를 in vitro 전사에 의해 제조하여 전달해주는 방법일 수도 있다. (2) 혹은 이들 Cas9 단백질과 sgRNA를 발현시키는 플라스미드 DNA들을 세포 안에 전달하여 세포 내에서 발현하도록 하는 방법을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 필요한 단백질, RNA, 혹은 플라스미드 DNA들의 세포 내 전달방법은 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 바이러스벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라 PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등 당업계에 공지된 다양한 방법들을 사용할 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 서열번호 1의 PAM 서열을 가지는 표적 DNA를 절단하기 위해, 보다 구체적으로는 유전체를 교정하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, Cas 단백질은 뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 가지는 활성형일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 Cas 단백질은 불활성화된 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 서열번호 1의 PAM 서열을 포함하는 표적 DNA 서열을 절단하지 않고 이에 Cas 단백질이 결합된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 Cas 단백질, 보다 구체적으로 불활성화된 Cas 단백질은 전사 효과기 도메인 (transcription effector domain)을 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 activator, repressor 등이 접합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이 경우, 상기 방법은 전사 조절 또는 후성학적 조절을 포함하는, Cas 매개 유전자 발현 조절을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 분리된 가이드 RNA이다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
보다 구체적으로, 상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA일 수 있으며, 상기 가이드 RNA의 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열의 길이는 17 내지 23bp, 18 내지 23bp, 19 내지 23bp, 보다 구체적으로 20 내지 23bp, 보다 더 구체적으로, 21 내지 23bp 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열의 5' 부위 앞에 1 내지 3 개의 구아닌 (guanine, G)를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 앞서 추가적인 뉴클레오타이드에 대한 설명이 본 양태에도 적용된다.
본 발명의 또 하나의 양태는 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 조성물은 NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 Cas 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 유전체를 교정하기 위한 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 (i) NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 및 (ii) 불활성화된 Cas 단백질 (dCas) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
여기서, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 전사 효과기 도메인 (transcription effector domain)을 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 표적 DNA 서열을 포함하는 목적하는 DNA를 분리하기 위한 것일 수 있다. 이 때, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 분리 정제를 위한 태그가 접합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 태그에 대해서는 앞서 기술한 내용을 예로서 들 수 있다.
또한, 상기 조성물은 전사 조절 또는 후성학적 조절을 포함하는, Cas 매개 유전자 발현 조절을 위한 것일 수 있다.
상기 표적 DNA는 분리된 세포, 예컨대 진핵 세포에 존재하는 것일 수 있다. 상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보(in vivo) 세포, 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 (i) NNNNRYAC (서열번호 1) 인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 내 서열과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA, 및 (ii) NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 Cas 단백질을 포함하는, CRISPR-CAS 시스템이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 (i) NNNNRYAC (서열번호 1) 인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열에 인접한, 표적 DNA 내 서열과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 가이드 RNA에 대한 발현 카세트, 및 (ii) NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 Cas 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하는, 재조합 바이러스 벡터이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 AAV (Adeno-associated virus)일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 21 내지 23bp 길이의 서열을 포함하는, 분리된 가이드 RNA이다.
이에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는, 조성물이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 조성물은 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM 서열을 인식하는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 NNNNRYAC (서열번호 1) 서열을 인식하는 불활성화된 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 Cas 단백질을 포함할 수 있다.
상기 불활성화된 Cas 단백질은 전사 효과기 도메인을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 13 내지 18bp 의 길이의 줄기 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함하는, 분리된 가이드 RNA이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 줄기 구조는 서열번호 2의 염기 서열 (5'-GUUUUAGUCCCUUGUG-3') 및 이와 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬 (complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 부위; 및 5 내지 10bp 의 길이의 루프 구조인 것을 특징으로 하는, 줄기-루프 구조를 가지는 제2 부위를 포함하는, 분리된 가이드 RNA이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 루프 구조는 서열번호 3의 염기 서열 (5'-AUAUUCAA-3')의 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 가이드 RNA 및 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 기술된 분리된 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 유전체를 교정하는 방법이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 각 구성요소는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 기술된 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 표적 DNA를 절단하는 방법이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 각 구성요소는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 DNA와 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 도입은 동시 또는 순차적으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 (i) 주어진 서열에서 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM 서열의 존재를 확인하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM 서열이 존재하면 이의 업스트림 (upstream)에 위치한 서열을 가이드 RNA에 의해 인식되는 서열로 결정하는 단계를 포함하는, 가이드 RNA 의 표적 DNA 인식 서열의 제조 방법이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 업스트림에 위치한 서열은 17 내지 23bp 길이, 18 내지 23bp, 19 내지 23bp, 보다 구체적으로 20 내지 23bp, 보다 더 구체적으로, 21 내지 23bp 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 (i) 상기 기술된 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 불활성화된 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하여, 표적 DNA 서열을 포함하는 목적하는 DNA 와 가이드 RNA 및 불활성화된 Cas 단백질이 서로 복합체를 형성하는 단계; 및 (ii) 상기 복합체를 시료로부터 분리하는 단계를 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
상기 불활성화된 Cas 단백질은 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열을 인식하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 목적하는 DNA를 분리하는 방법은 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA (gRNA) 및 불활성화된 Cas 단백질 (dCas)이 목적하는 DNA와 dCas-gRNA-목적하는 DNA의 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 상기 시료로부터 분리하는 단계를 포함하는, 목적하는 DNA를 분리하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 목적하는 DNA는 PCR에 의한 증폭, 또는 공지의 방법으로 검출하는 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 분리 방법은 인 비트로 (in vitro)에서 세포-유리 DNA (cell-free DNA)에 적용되는 것일 수 있고, DNA와 gRNA 및 dCas 단백질 간의 가교 공유결합 (cross-link covalent bone)의 형성 없이 수행되는 것일 수 있다.
상기 분리 방법은 상기 복합체로부터 목적하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
목적하는 DNA를 분리하기 위해, 상기 불활성화된 Cas 단백질은 분리를 위한 친화성 태그 (tag)를 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 친화성 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그, CBP (chitin binding protein) 태그, Avi 태그, 칼모듈린 (calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트 (polyglutamate) 태그, E 태그, HA 태그, myc 태그, SBP 태그, 소프태그 1 (softag 1), 소프태그 3 (softag 3), 스트렙 (strep) 태그, TC 태그, Xpress 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein) 태그, 또는 GFP (green fluorescent protein) 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 불활성화된 Cas 단백질은 Cas 단백질의 DNA 절단 활성이 결여된 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 태그에 결합하는 친화성 컬럼 또는 자성 비드 (magnetic bead)를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 분리를 위한 친화성 태그는 His 태그로서, 상기 His 태그에 결합하는 금속 친화성 컬럼 (metal affinity column) 또는 자성 비드를 이용하여 목적하는 DNA를 분리하는 것일 수 있고, 상기 자성 비드는 예를 들어, Ni-NTA 자성 비드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 복합체로부터 목적하는 DNA의 분리는 RNase 및 단백질 가수분해효소를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 목적하는 DNA를 분리하는 방법을 이용하여, 두 종류 이상의 유전자형 DNA가 혼합된 분리된 시료에서 특정 유전자형 DNA를 분리할 수 있으며, 두 가지 이상의 목적하는 DNA를 분리할 수도 있다. 두 가지 이상의 목적하는 DNA를 분리하는 경우, 두 가지 이상의 목적하는 DNA 각각에 특이적인 가이드 RNA를 이용하여 목적하는 DNA를 분리할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있고, crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중RNA (dualRNA)일 수 있다. 또한, 상기 가이드 RNA는 분리된 RNA 형태이거나, 플라스미드에 코딩되어 있는 형태일 수 있다.
상기 방법은 목적하는 DNA에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA (gRNA) 및 불활성화된 Cas 단백질 (dCas)이 목적하는 DNA와 dCas-gRNA-목적하는 DNA의 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 상기 시료로부터 분리하는 단계를 포함하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 표적 DNA를 특이적으로 인식하는 상기 분리된 가이드 RNA, 또는 이를 코딩하는 DNA, 및 전사 효과기 도메인이 결합된 불활성화된 Cas 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 표적 DNA 서열을 포함하는 목적하는 DNA에서 Cas 매개 유전자 발현을 조절하는 방법이다.
각각에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다. 이는 비자연적으로 발생되거나, 조작된 것일 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
C. jejuni CRISPR / Cas9 시스템
실시예 1. C. jejuni CRISPR / Cas9을 이용한 유전체 교정
본 발명자들은 C. jejuni로부터 RGEN을 성공적으로 분리하였다. C. jejuni CRISPR/CAS9 시스템의 활성이 생체 외에서 재구성될 수 있다는 것이 보고된바 있으나, 현재까지 상기 시스템을 이용하여 세포 내에서 유전체 조작을 한 사례는 없었다.
유전체 조작에 대한 C. jejuni CRISPR/CAS9 유래 RGEN의 특성을 확인하기 위해, 먼저 인간 코돈에 최적화된 C. jejuni CAS9 유전자를 합성하였고 (표 1), 상기 유전자를 포유류 발현 벡터에 삽입하여 CMV 프로모터 하에 HA 에피토프가 태깅되고 NLS가 부착된 C. jejuni CAS9 단백질 발현 카세트를 제조하였다 (도 1).
C. jejuni Cas9 단백질의 아미노산 서열
아미노산 서열 사이즈 서열번호
MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKKSGPPKKKRKVYPYDVPDYA- 1003a.a 22
C. jejuni CRISPR/CAS9 시스템의 천연 가이드 RNA는 tracrRNA 및 표적 특이적-crRNA로 구성된다. 가이드 RNA는 천연 상태로 두 RNA 분자로 이용될 수도 있고, crRNA 및 tracrRNA의 융합된 형태인 단일 사슬 가이드 RNA (sgRNA)로 이용될 수 있음이 보고되었으므로, 본 발명자들은 C. jejuni sgRNA에 대한 발현 플라스미드를 설계하고 제작하였다 (표 2).
sgRNAs sgRNA 서열 서열번호
C.jejuni_sgRNA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGTCCCT GAAA AGGGACTAAAAT AAAGAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTTTT 23
그 다음, C. jejuni CRISPR/CAS9 시스템의 PAM 서열 (NNNACA)을 기반으로, 인간 AAVS1 위치 및 마우스 Rosa-26 위치의 잠재적 표적 위치를 선발하였다 (표 3).
sgRNAs 표적 서열 서열번호
Human AAVS1_C.Jejuni ATATAAGGTGGTCCCAGCTCGGGGACA 24
Mouse Rosa26_C.Jejuni ATTCCCCTGCAGGACAACGCCCACACA 25
그 다음, C. jejuni RGEN이 포유류 세포에서 내재적 유전자의 표적 파괴에 이용될 수 있는지 확인하기 위해, 야생형 및 변이 DNA 서열의 혼성화에 의해 형성되는 헤테로듀플렉스 (heteroduplexes)를 특이적으로 인식하고 절단할 수 있는 미스매치 (mismatch) 민감성 엔도뉴클레아제인 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E1)을 이용하여 형질전환된 세포에서 분리한 유전체 DNA를 분석하였다. 이때, 사용된 프라이머 서열은 하기와 같았다 (표 4).
프라이머 서열 서열번호
Human AAVS1-F TGCTTCTCCTCTTGGGAAGT 26
Human AAVS1-R CCCCGTTCTCCTGTGGATTC 27
Mouse Rosa26-F ACGTTTCCGACTTGAGTTGC 28
Mouse Rosa26-R CCCAGCTACAGCCTCGATTT 29
그 결과 CAS9 단백질 및 가이드 RNA를 함께 세포에 도입한 경우에만 변이가 유도되는 것을 확인하였다. 관련 DNA 밴드의 강도로 확인되는 변이 빈도는 RNA 농도 의존적으로 확인되었다 (도 2a). 또한, PCR 산물의 DNA 서열분석 결과로 내재적 유전자 위치에 RGEN-매개 변이가 유도된 것을 확인하였다. 오류발생이 쉬운 (error-prone) 비상동 말단 결합 (non homologous end joining, NHEJ)의 특성인, 인델 (Indel) 및 미세상동성 (microhomology)이 표적 위치에서 관찰되었다 (도 2b). 직접 시퀀싱을 통해 측정된 변이 빈도는 16.7 %였다 (= 2 변이 클론 / 12 클론).
이와 유사하게, 마우스 NIH3T3 세포에 마우스 Rosa26 C. jejuni RGEN를 도입하였을 때, 마우스 Rosa26 위치에 효과적으로 변이가 유도된 것을 T7E1 분석을 이용하여 확인하였다 (도 3a). 또한, PCR 산물의 DNA 서열 분석으로 내재적 유전자 위치에 C. jejuni RGEN 매개 변이가 유도된 것을 확인하였다 (도 3b). 직접 시퀀싱을 통해 측정된 변이 빈도는 22.2 %였다 (2 변이 클론 / 9 클론).
실시예 2. sgRNA 구조의 변형
C. jejuni crRNA 및 tracrRNA의 복합체가 다른 박테리아 종 유래의 crRNA:tracrRNA 복합체에 비해 짧은 루프 (loop) 구조를 가지는 것으로 예측하고, 상기 실시예 1에서 제조된 C. jejuni RGEN sgRNA의 구조가 안정될 수 있도록 변형된 줄기 (stem) 또는 루프 구조를 설계하였다 (표 5).
sgRNAs sgRNA 서열 서열번호
C.jejuni_sgRNA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGTCCCT GAAA AGGGACTAAAAT AAAGAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTTTT 23
C.jejuni_sgRNA_stem modified NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGTCCCT TGTGGAAATATA AGGGACTAAAAT AAAGAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTTTT 30
C.jejuni_sgRNA_loop modified NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGTCCCT ATATTCAA AGGGACTAAAAT AAAGAGTTTGCGGGACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTTTT 31
상기 표에서 볼드체 및 밑줄로 표시한 부분이 기존의 줄기 (stem) 부분에 해당한다.
기존의 sgRNA 구조를 통해 성공적으로 변이가 유도된 인간 AAVS1 C. jejuni RGEN 표적 위치를 표적으로 하여 상기 변형된 sgRNA를 도입하였을 때, 유사한 변이 빈도를 확인하였다 (도 4). 이때, 사용된 프라이머 서열은 상기 표 4에 나타낸 바와 같았다.
실시예 3. sgRNA의 스페이서 (spacer) 길이의 최적화
문헌 상에서 보고 된 바 있는 표적 서열을 인식하는 C. jejuni의 crRNA 내 스페이서 서열의 길이는 20 bp 였다. 이에 본 발명자들은 최적화된 spacer 길이를 테스트하기 위해 표 6에 나타낸 인간 AAVS1 locus상 Cj Cas9의 target site 4개 위치에 대해 다양한 길이의 스페이서 및 5'에 추가된 뉴클레오타이드를 갖는 sgRNA 변이체 구조를 이용하여 유전체 교정 테스트 (genome editing test)를 하였다 (도 5a 내지 c). 본 실험은 Genome Res. 2014 Jan;24(1):132-41 에 기술된 방법을 이용하였다.
표적 위치
sgRNA Sequence (20bp-SPACERnnnnACA) 서열번호
Human AAVS1-CJ1 ATATAAGGTGGTCCCAGCTCggggACA 32
Human AAVS1-NRG1 GTAGAGGCGGCCACGACCTGgtgaACA 33
Human AAVS1-NRG3 TCACAAAGGGAGTTTTCCACacggACA 34
Human AAVS1-NRG5 TAGGCAGATTCCTTATCTGGtgacACA 35
293 세포에 각 sgRNA구조를 발현시키는 sgRNA 발현 벡터를 전달하고 3일 후 genomic DNA를 분리하고 딥 시퀀싱 방법으로 돌연변이 도입 효율을 분석하였고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다. 여기에 나타낸 바와 같이, 21 내지 23bp 스페이서에서 높은 효율이 관찰되었다. 또한 20bp의 스페이서의 sgRNA의 5'에 2~3개의 additional G를 붙였을 때에도 향상된 유전체 교정 효율이 관찰되었다.
　 NGS-primer-F* Sequences NGS-primer-R** Sequences Target sgRNA
Human AAVS1 AS-AV-F1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGAGGAGGCCTAAGGATGG(서열번호 36) AS-AV-R1 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTCATGGCATCTTCCAGGG(서열번호 39) CJ1
AS-AV-F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTCTGGGCGGAGGAATATG(서열번호 37) AS-AV-R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCGTGCGTCAGTTTTACCT(서열번호 40) NRG1,NRG3
AS-AV-F4 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCCTCTCTGGCTCCATCGT(서열번호 38) AS-AV-R4 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGGTTAATGTGGCTCTGGT(서열번호 41) NRG5
여기서, F*는 정방향 프라이머, R**은 역방향 프라이머를 나타낸다.
실시예 4. C. jejuni Cas9 PAM 서열 분석
본 발명에서는, 기존 논문에 의해 보고된 결과로부터 C. jejuni Cas9의 PAM 서열이 "NNNNACA"인 것으로 유추하고 실험을 수행하였다. 5 가지 유전체 위치에 대한 34개의 C. jejuni CRISPR/Cas9을 제작하여 확인한 결과 3개의 CRISPR/Cas9 만이 활성을 보였다. 특히, 활성을 보인 위치의 서열을 추가 분석해 본 결과 상기 3개 모두의 위치에서 PAM 서열 (NNNNACA) 바로 뒤의 뉴클레오티드가 "C"임을 확인하였다 (표 8).
sgRNA 이름 활성 (T7E1 assay) 서열 서열번호
Human
AAVS1 hAAVS1 -CJ1 O ATATAAGGTGGTCCCAGCTCGGGGACA C 42
hAAVS1-CJ2 X TGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGACAG 43
hAAVS1-CJ3 X CACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAG 44
CCR5 CCR5-CJ1 X CTAGCAGCAAACCTTCCCTTCACTACAA 45
CCR5-CJ2 X CTCCATGAATGCAAACTGTTTTATACAT 46
CCR5-CJ3 X TGCATTCATGGAGGGCAACTAAATACAT 47
CCR5-CJ4 X ATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACAT 48
CCR5-CJ5 X CCAATCTATGACATCAATTATTATACAT 49
CCR5-CJ6 X GCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACAT 50
CCR5-CJ7 X GCAGCATAGTGAGCCCAGAAGGGGACAG 51
CCR5-CJ8 X GCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAA 52
Mouse
Rosa26 ROSA26-CJ1 X TCCACTGCAGCTCCCTTACTGATAACAA 53
ROSA26 -CJ2* O ATTCCCCTGCAGGACAACGCCCACACA C 54
ROSA26-CJ3 X ACACCTGTTCAATTCCCCTGCAGGACAA 55
ROSA26-CJ4 X TTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAA 56
ROSA26-CJ5 X TTGCCCCTATTAAAAAACTTCCCGACAA 57
ROSA26-CJ6 X AGATCCTTACTACAGTATGAAATTACAG 58
ROSA26-CJ7 X AGCCTTATCAAAAGGTATTTTAGAACAC 59
TP53 TP53-CJ1 X CGGGGCCCACTCACCGTGCACATAACAG 60
TP53-CJ2 X GCCGTGTCCGCGCCATGGCCATCTACAA 61
TP53-CJ3 X TGGCCATCTACAAGAAGTCACAGCACAT 62
TP53-CJ4 X CCGAGTGTCAGGAGCTCCTGCAGCACAG 63
TP53-CJ5 X CTCCCCGGGGCCCACTCACCGTGCACAT 64
TP53-CJ6 X CCTGTGCAGTTGTGGGTCAGCGCCACAC 65
TP53-CJ7 X GGTGTGGCGCTGACCCACAACTGCACAG 66
TP53-CJ8 O TTCTTGTAGATGGCCATGGCGCGGACA C 67
TP53-CJ9 X CGCCATGGCCATCTACAAGAAGTCACAG 68
PTEN mPTEN-CJ1 X ACATCATCAATATTGTTCCTGTATACAC 69
mPTEN-CJ2 X TGAATCCAAAAACCTTAAAACAAAACAA 70
mPTEN-CJ3 X TGCTTTGAATCCAAAAACCTTAAAACAA 71
mPTEN-CJ4 X AGCATAAAAACCATTACAAGATATACAA 72
mPTEN-CJ5 X GTAGATGTGCTGAGAGACATTATGACAC 73
mPTEN-CJ6 X GGCGGTGTCATAATGTCTCTCAGCACAT 74
mPTEN-CJ7 X ATTTAACTGCAGAGGTATGTATAAACAT 75
이를 바탕으로 PAM 서열을 "NNNNACAC"로 유추하고 ACAC 4 가지 위치에 대해 각각 A/T/G/C로 변화시키면서 C. jejuni Cas9의 활성을 분석하여, C. jejuni RGEN의 PAM 서열을 확인하고자 하였다. 이를 위해 대리 리포터 분석 (Surrogate reporter assay)을 이용하였다. 그 결과 C. jejuni의 PAM 서열은 "NNNNRYAC (서열번호 1)"인 것을 확인하였다 (도 6, R은 퓨린(A또는 G) Y는 피리미딘(C/T)를 지칭함). 본 실험은 Nat Methods. 2011 Oct 9;8(11):941-3.에 기술된 Surrogate reporter assay 방법을 이용하여 수행되었다.
실시예 5. C. jejuni CRISPR / Cas9의 특이성 분석 및 PAM 서열 분석
논문/특허로 출원한 CRISPR/Cas9의 off-target 분석방법인 Digenome-seq을 통해 AAVS1-CJ1위치에 대한 C.jejuni CRISPR/CAS9의 절단 위치를 유전체 수준으로 분석하였다. 본 실험은 Nat Methods. 2015 Mar;12(3):237-43에 기술된 방법을 이용하여 수행하였다.
Digenome-Seq을 이용하여 AAVS1-CJ1 CRISPR/Cas9에 의해 절단이 일어나는 것으로 보여진 41 개 위치를 발굴하였다 (표 9의 Genomic location). 41개 위치의 cleavage site sequence를 align하여 consensus sequence를 구했을 때 도 8에 나타난 것과 같이, 실시예 4에서 확인한 것과 합치하는 PAM을 확인하였다.
또한 Digenome-Seq을 통해 확보한 잠재 off-target에 실제 off-target mutation이 도입 되는지 알아보기 위해 AAVS1-CJ1 CRISPR 유전자가위가 전달된 293세포의 genomic DNA에서 40개 잠재 off-target site의 서열을 딥 시퀀싱을 통해 분석하였으며 그 결과는 하기 표 9에서와 같이 유의미한 돌연변이가 관찰되지 않았다.
　　 　 Genomic Location Indel 빈도
Mock C. Jejuni CRISPR
On-target chr19 55627221 0.02 5.123
CJ_AAVS1_1 chr1 24521012 0.019 0.034
CJ_AAVS1_2 chr1 29848565 0.157 0.136
CJ_AAVS1_3 chr1 30381084 0.041 0.035
CJ_AAVS1_4 chr1 37283269 0.016 0.016
CJ_AAVS1_5 chr2 55333369 0.079 0.091
CJ_AAVS1_6 chr4 153532801 0.003 0.003
CJ_AAVS1_7 chr4 153926891 0 0
CJ_AAVS1_8 chr4 183304101 0.033 0.046
CJ_AAVS1_9 chr6 51746466 0.41 0.43
CJ_AAVS1_10 chr7 11346020 0.02 0.038
CJ_AAVS1_11 chr7 128481430 0.024 0.036
CJ_AAVS1_12 chr7 142878579 0.024 0.028
CJ_AAVS1_13 chr8 25979587 0.138 0.155
CJ_AAVS1_14 chr8 80240626 0.043 0.049
CJ_AAVS1_15 chr8 141347249 0.028 0.024
CJ_AAVS1_16 chr8 141688584 0.088 0.092
CJ_AAVS1_17 chr8 143120119 0.016 0.013
CJ_AAVS1_18 chr9 83960768 0.032 0.037
CJ_AAVS1_19 chr9 102650644 0.029 0.034
CJ_AAVS1_20 chr9 129141695 0.014 0.009
CJ_AAVS1_21 chr10 103862556 0.053 0.073
CJ_AAVS1_22 chr12 9085293 0.21 0.277
CJ_AAVS1_23 chr14 70581187 0.013 0.025
CJ_AAVS1_24 chr14 95327446 0.046 0.041
CJ_AAVS1_25 chr14 102331176 0.015 0.028
CJ_AAVS1_26 chr14 104753692 0.035 0.041
CJ_AAVS1_27 chr15 67686972 0.061 0.096
CJ_AAVS1_28 chr16 85565862 0.028 0.028
CJ_AAVS1_29 chr17 17270109 0.003 0
CJ_AAVS1_30 chr17 79782954 0.03 0.043
CJ_AAVS1_31 chr18 42305670 0.035 0.043
CJ_AAVS1_32 chr19 12826405 0.024 0.039
CJ_AAVS1_33 chr19 32268337 0.043 0.042
CJ_AAVS1_35 chr20 40758976 0 0
CJ_AAVS1_36 chr21 41295936 0.011 0.007
CJ_AAVS1_37 chr22 20990738 0.004 0.004
CJ_AAVS1_38 chr22 46402289 0.006 0.011
CJ_AAVS1_39 chr22 46426607 0.003 0
CJ_AAVS1_40 chrX 27472673 0.279 0.318
또한 in vitro에서 cleavage를 보인 41개 위치의 서열을 전체적으로 alignment하였을 때 consensus sequence를 구성할 수 있었으며 실제로 PAM위치가 NNNNRYAC (서열번호 1)로 관찰되어 앞선 결과와 같은 경향성을 보였다.
실시예 6. PAM의 첫 두 위치의 축중 (degeneracy)에 대한 확인
상기 실시예 5를 통해 C. jejuni의 PAM 서열이 "NNNNACAC"뿐만이 아니라 "NNNNRYAC"로 첫 두 위치에 축중 (degeneracy)이 있는 것으로 관찰되었다. 이를 확인하기 위해 인간 AAVS1 위치에서 C.jejuni의 표적서열로 PAM의 첫 두 뉴클레오티드가 각각 G 또는 T인 7 개 위치에 대해 sgRNA를 제작하고 (표 10), 인간 배양세포 HEK293에서의 돌연변이 도입 효율을 확인하였다.
sgRNA Direction PAM 표적 서열 서열번호
hAAVS1-RYN1 + NNNNRYAC gCCACGACCTGGTGAACACCTAGGACGCAC 76
hAAVS1-RYN2 + gGCCTTATCTCACAGGTAAAACTGACGCAC 77
hAAVS1-RYN3 + cTCTTGGGAAGTGTAAGGAAGCTGCAGCAC 78
hAAVS1-RYN4 + aGCTGCAGCACCAGGATCAGTGAAACGCAC 79
hAAVS1-RYN5 + cTGTGGGGTGGAGGGGACAGATAAAAGTAC 80
hAAVS1-RYN6 - gCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTAC 81
hAAVS1-RYN7 + gCCATGACAGGGGGCTGGAAGAGCTAGCAC 82
그 결과, 7 개 중 6 개에서 돌연변이 도입이 확인되어 실제로 PAM 서열의 첫 두 위치에 축중(degeneracy)이 있음을 확인하였다 (도 8). 이러한 축중 (degeneracy)은 PAM 서열의 빈도를 높여 C. jejuni에 의한 유전체 교정의 정교성을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 7. AAV를 이용한 C. jejuni CRISPR / CAS9 전달을 통한 유전체 교정
유전체 조작을 적용할 수 있는 가장 중요한 분야 중 하나는 유전자 치료 및 유전체 교정 세포 치료이다. 유전체 교정을 실제 치료에 적용하는 것은 생체 외 또는 생체 내에서 표적 세포에 유전자 가위 (engineered nuclease) 및 공여 DNA를 전달하기 위한 효율적이고 임상적으로 적용 가능한 유전자 전달 벡터를 필요로 한다. 현재 가장 널리 사용되는 두 종류의 유전자 가위 플랫폼인 TALENs 및 RGEN는 이들의 큰 크기 때문에 확립된 유전자 치료용 벡터에 적용하는데 한계를 가지고 있다. 반면, C. jejuni RGEN은 현재까지 개발된 RGEN 중에서 가장 작은 CAS9 단백질 및 sgRNA를 가지고 있다. C. jejuni RGEN의 크기가 작기 때문에 유전체 조작에 사용될 수 있는 유전자 치료용 벡터의 범위를 확장시킬 수 있다. 예를 들어, 현재 가장 중요한 유전자 치료용 벡터 중 하나로 사용되고 있는 AAV (Adeno-associated virus)는 전달할 수 있는 DNA의 크기가 엄격히 제한되기 때문에 S. pyogenes , S.thermophilus 및 N. meningitidis 유래 RGEN 또는 현재 사용되고 있는 다른 유전자 가위 플랫폼인 TALEN에 적용하기 어려웠다. 그러나, C . jejuni RGEN은 AAV 벡터에 적용 가능하다.
본 발명에서는 실제 AAV전달을 통해 C.jejuni Cas9이 작동할 수 있음을 보이기 위해 AAV 벡터를 C. jejuni Cas9 발현 카세트와 sgRNA 발현 카세트를 모두 포함하는 형태로 제작하고 (도 9), 이로부터 AAV를 생산하여 쥐 배양세포 C2C12에 감염시켰다. 이때 AAV 농도 및 시간 의존적으로 C2C12 세포에서 표적 위치에 대한 돌연변이를 유도할 수 있음을 확인하였다. 특히 높은 MOI (100)에서 14일이 지났을 때는 표적 위치에 90 % 이상의 효율로 돌연변이가 유도되었다 (도 10).
결론적으로, 본 발명자들은 C. jejuni RGEN이 배양된 세포에서 효율적으로 유전체 교정을 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 종래 연구에서 제안되었던 C. jejuni CRISPR/Cas9 시스템의 PAM 서열이 불완전한 것을 확인하고 실질적인 C. jejuni의 PAM 서열을 확인하였다. 마지막으로, C. jejuni RGEN은 각 구성 요소의 크기가 작아 단일 바이러스에 탑재될 수 있으며 아주 효율적으로 유전제 교정을 할 수 있음을 확인하였다.
dCAS9:gRNA 복합체를 이용한 표적 DNA의 농축
또한, 본 발명자들은 스트렙토코커스 피요젠스 (streptococcus pyogens) 유래이며, 불활성화된 Cas9 단백질 및 가이드 RNA로 이루어진 불활성화된 RGEN (dCas9:gRNA 복합체)를 이용하여 표적 DNA의 분리 및 농축을 가지고 올 수 있음을 확인하였다.
상기 dCas9 단백질에는 정제를 위한 히스티딘 태그 (His tag)가 달려 있어, His tag과 선택적으로 결합하는 Ni-NTA 자석 비드를 이용하여 dCas9 단백질만을 선택적으로 정제할 수 있다. 또한, DNA의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레아제 활성이 없는 dCas9-단백질-sgRNA 복합체의 성질을 이용하여 원하는 표적 DNA만을 선택적으로 정제할 수 있다.
본 발명자들은 가이드 RNA 및 불활성화된 Cas9 뉴클레아제 단백질로 이루어진 불활성화된 RGEN (dCas9:gRNA 복합체)을 통해서 원하는 표적 DNA만 분리 가능한지를 확인하기 위하여, 먼저 플라스미드 (Plasmid, pUC19)를 크기로 구분이 가능하도록 제한효소 (SpeI, XmaI, XhoI)로 잘라, 각각 4134 bp, 2570 bp, 및 1263 bp 크기의 플라스미드 DNA 단편을 제조하였다.
그 다음, 상기 과정에서 제한효소로 잘린 각각의 플라스미드 DNA 단편에 대한 sgRNA를 2 개씩 제작하고 (4134bp_sg#1, 4134bp_sg#2, 2570bp_sg#1, 2570bp_sg#2, 1263bp_sg#1, 및 1263bp_sg#2), 각 표적 DNA에 대응하는 각각의 sgRNA 또는 이들의 조합 (4134bp_sg#1+2, 2570bp_sg#1+2, 및 1263bp_sg#1+2)을 이용하여 정제 과정을 수행하였다. 각각의 sgRNA 염기 서열은 하기 표 11과 같다.
sgRNA 표적 염기서열 PAM 염기서열
4134bp_sg#1 GAGAACCAGACCACCCAGAA(서열번호 83) GGG
4134bp_sg#2 GGCAGCCCCGCCATCAAGAA(서열번호 84) GGG
2570bp_sg#1 GTAAGATGCTTTTCTGTGAC(서열번호 85) TGG
2570bp_sg#2 GATCCTTTGATCTTTTCTAC(서열번호 86) GGG
1270bp_sg#1 GCCTCCAAAAAAGAAGAGAA(서열번호 87) AGG
1270bp_sg#2 TGACATCAATTATTATACAT(서열번호 88) CGG
* sgRNA 서열은 표적 염기서열과 동일하며, 다만, T는 U임.
그 다음, DNA : dCas9 단백질 : sgRNA = 1 : 20 : 100의 몰 농도 비율로 총 200 ㎕의 혼합 용액을 제조하고 섞어준 뒤, 37℃ 에서 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 그 다음 상기 용액을 히스티딘 태그와 특이적으로 결합할 수 있는 Ni-NTA 자석 비드 50 ㎕와 섞어주고, 200 ㎕ 세척 완충액으로 2 회 세척한 뒤 200 ㎕ 용출 완충액 (Bioneer, K-7200)을 이용하여 dCas9-sgRNA-표적 DNA 복합체를 정제하였다.
그 다음, RNase A (Amresco, E866)를 0.2 mg/㎖ 농도로 첨가하여 37℃ 에서 2 시간 동안 반응시키고, 분해단백질 가수 분해효소 K (Bioneer, 1304G)를 0.2 mg/㎖ 농도로 첨가하여 55℃ 에서 45 분 동안 반응시켜 sgRNA 및 dCas9 단백질을 제거한 후, 에탄올 정제를 통해 표적 DNA만을 정제하였다.
그 결과, sgRNA 각각 또는 표적 단백질에 대한 sgRNA 2 종류를 혼합하여 사용한 경우 모두에서, 3 개의 DNA 단편으로부터, 각 크기별로 원하는 표적 DNA 단편만 분리되어 나오는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 2 종류의 표적 DNA에 대하여 sgRNA를 각각 2 개씩 사용, 총 4 개의 sgRNA를 이용하여 한 번에 여러 표적 DNA를 정제하였을 때, 사용된 sgRNA에 대한 표적 DNA들이 혼합되어 정제되는 것을 확인하였다. 이를 통해 각각의 표적 DNA가 95 % 이상 순수한 상태로 정제되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 기술은 또한, 본 발명의 NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열을 인식하는 Cas 단백질에도 적용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> TOOLGEN INCORPORATED <120> Genome editing with RNA-Guided Engineered Nucleases (RGENs) derived from Campylobacter jejuni CRISPR/CAS system <130> OPA15185-PCT <150> US 62/033,852 <151> 2014-08-06 <160> 88 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAM sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n = any nucleotide <400> 1 nnnnryac 8 <210> 2 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stem sequence in guideRNA <400> 2 guuuuagucc cuugug 16 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop sequence in guideRNA <400> 3 auauucaa 8 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 cacattaacc ggccctggga atataaggtg gtcccagctc ggggacacag gatccctgga 60 60 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAAVS1 mutant clone (-2, x1) <400> 5 cacattaacc ggccctggga atataaggtg gtcccagcgg ggacacagga tccctgga 58 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAAVS mutant clone (-1, x1) <400> 6 cacattaacc ggccctggga atataaggtg gtcccagtcg gggacacagg atccctgga 59 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> mus musculus <400> 7 cttaaaggct aacctggtgt gtgggcgttg tcctgcaggg gaattgaaca ggtgtaaaa 59 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Rosa26 (-1, X1) <400> 8 cttaaaggct aacctggtgt gtgggcttgt cctgcagggg aattgaacag gtgtaaaa 58 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Rosa26 (+1, X1) <400> 9 cttaaaggct aacctggtgt gtgggcgttt gtcctgcagg ggaattgaac aggtgtaaaa 60 60 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 10 ggccctggga atataaggtg gtcccagctc ggggacac 38 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX19 <400> 11 gtataaggtg gtcccagctc ggggacac 28 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX20 <400> 12 gatataaggt ggtcccagct cggggacac 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX21 <400> 13 gaatataagg tggtcccagc tcggggacac 30 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX22 <400> 14 ggaatataag gtggtcccag ctcggggaca c 31 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX23 <400> 15 gggaatataa ggtggtccca gctcggggac ac 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGX20 <400> 16 ggatataagg tggtcccagc tcggggacac 30 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGGX20 <400> 17 gggatataag gtggtcccag ctcggggaca c 31 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of hAAVS-CJ1 <400> 18 ggccctggga atataaggtg gtcccagctc ggggacac 38 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of hAAVS-NRG1 <400> 19 gagaaaggga gtagaggcgg ccacgacctg gtgaacac 38 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of hAAVS-NRG3 <400> 20 cgcaccattc tcacaaaggg agttttccac acggacac 38 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target site of hAAVS-NRG5 <400> 21 cacctcctgt taggcagatt ccttatctgg tgacacac 38 <210> 22 <211> 1003 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni <400> 22 Met Ala Arg Ile Leu Ala Phe Asp Ile Gly Ile Ser Ser Ile Gly Trp 1 5 10 15 Ala Phe Ser Glu Asn Asp Glu Leu Lys Asp Cys Gly Val Arg Ile Phe 20 25 30 Thr Lys Val Glu Asn Pro Lys Thr Gly Glu Ser Leu Ala Leu Pro Arg 35 40 45 Arg Leu Ala Arg Ser Ala Arg Lys Arg Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg 50 55 60 Leu Asn His Leu Lys His Leu Ile Ala Asn Glu Phe Lys Leu Asn Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Ser Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Gly 85 90 95 Ser Leu Ile Ser Pro Tyr Glu Leu Arg Phe Arg Ala Leu Asn Glu Leu 100 105 110 Leu Ser Lys Gln Asp Phe Ala Arg Val Ile Leu His Ile Ala Lys Arg 115 120 125 Arg Gly Tyr Asp Asp Ile Lys Asn Ser Asp Asp Lys Glu Lys Gly Ala 130 135 140 Ile Leu Lys Ala Ile Lys Gln Asn Glu Glu Lys Leu Ala Asn Tyr Gln 145 150 155 160 Ser Val Gly Glu Tyr Leu Tyr Lys Glu Tyr Phe Gln Lys Phe Lys Glu 165 170 175 Asn Ser Lys Glu Phe Thr Asn Val Arg Asn Lys Lys Glu Ser Tyr Glu 180 185 190 Arg Cys Ile Ala Gln Ser Phe Leu Lys Asp Glu Leu Lys Leu Ile Phe 195 200 205 Lys Lys Gln Arg Glu Phe Gly Phe Ser Phe Ser Lys Lys Phe Glu Glu 210 215 220 Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr Lys Arg Ala Leu Lys Asp Phe Ser 225 230 235 240 His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Asp Glu Lys Arg Ala Pro 245 250 255 Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met Phe Val Ala Leu Thr Arg Ile Ile 260 265 270 Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn Thr Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Lys 275 280 285 Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn Glu Val Leu Lys Asn Gly Thr Leu 290 295 300 Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Glu 305 310 315 320 Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr Phe Ile Glu Phe Lys Lys Tyr Lys 325 330 335 Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu His Asn Leu Ser Gln Asp Asp Leu 340 345 350 Asn Glu Ile Ala Lys Asp Ile Thr Leu Ile Lys Asp Glu Ile Lys Leu 355 360 365 Lys Lys Ala Leu Ala Lys Tyr Asp Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asp Ser 370 375 380 Leu Ser Lys Leu Glu Phe Lys Asp His Leu Asn Ile Ser Phe Lys Ala 385 390 395 400 Leu Lys Leu Val Thr Pro Leu Met Leu Glu Gly Lys Lys Tyr Asp Glu 405 410 415 Ala Cys Asn Glu Leu Asn Leu Lys Val Ala Ile Asn Glu Asp Lys Lys 420 425 430 Asp Phe Leu Pro Ala Phe Asn Glu Thr Tyr Tyr Lys Asp Glu Val Thr 435 440 445 Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ile Lys Glu Tyr Arg Lys Val Leu Asn 450 455 460 Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Lys Val His Lys Ile Asn Ile Glu Leu 465 470 475 480 Ala Arg Glu Val Gly Lys Asn His Ser Gln Arg Ala Lys Ile Glu Lys 485 490 495 Glu Gln Asn Glu Asn Tyr Lys Ala Lys Lys Asp Ala Glu Leu Glu Cys 500 505 510 Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Asn Ser Lys Asn Ile Leu Lys Leu Arg 515 520 525 Leu Phe Lys Glu Gln Lys Glu Phe Cys Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Ile 530 535 540 Lys Ile Ser Asp Leu Gln Asp Glu Lys Met Leu Glu Ile Asp His Ile 545 550 555 560 Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp Asp Ser Tyr Met Asn Lys Val Leu 565 570 575 Val Phe Thr Lys Gln Asn Gln Glu Lys Leu Asn Gln Thr Pro Phe Glu 580 585 590 Ala Phe Gly Asn Asp Ser Ala Lys Trp Gln Lys Ile Glu Val Leu Ala 595 600 605 Lys Asn Leu Pro Thr Lys Lys Gln Lys Arg Ile Leu Asp Lys Asn Tyr 610 615 620 Lys Asp Lys Glu Gln Lys Asn Phe Lys Asp Arg Asn Leu Asn Asp Thr 625 630 635 640 Arg Tyr Ile Ala Arg Leu Val Leu Asn Tyr Thr Lys Asp Tyr Leu Asp 645 650 655 Phe Leu Pro Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr Lys Leu Asn Asp Thr Gln 660 665 670 Lys Gly Ser Lys Val His Val Glu Ala Lys Ser Gly Met Leu Thr Ser 675 680 685 Ala Leu Arg His Thr Trp Gly Phe Ser Ala Lys Asp Arg Asn Asn His 690 695 700 Leu His His Ala Ile Asp Ala Val Ile Ile Ala Tyr Ala Asn Asn Ser 705 710 715 720 Ile Val Lys Ala Phe Ser Asp Phe Lys Lys Glu Gln Glu Ser Asn Ser 725 730 735 Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Tyr Lys Asn Lys 740 745 750 Arg Lys Phe Phe Glu Pro Phe Ser Gly Phe Arg Gln Lys Val Leu Asp 755 760 765 Lys Ile Asp Glu Ile Phe Val Ser Lys Pro Glu Arg Lys Lys Pro Ser 770 775 780 Gly Ala Leu His Glu Glu Thr Phe Arg Lys Glu Glu Glu Phe Tyr Gln 785 790 795 800 Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Gly Val Leu Lys Ala Leu Glu Leu Gly Lys 805 810 815 Ile Arg Lys Val Asn Gly Lys Ile Val Lys Asn Gly Asp Met Phe Arg 820 825 830 Val Asp Ile Phe Lys His Lys Lys Thr Asn Lys Phe Tyr Ala Val Pro 835 840 845 Ile Tyr Thr Met Asp Phe Ala Leu Lys Val Leu Pro Asn Lys Ala Val 850 855 860 Ala Arg Ser Lys Lys Gly Glu Ile Lys Asp Trp Ile Leu Met Asp Glu 865 870 875 880 Asn Tyr Glu Phe Cys Phe Ser Leu Tyr Lys Asp Ser Leu Ile Leu Ile 885 890 895 Gln Thr Lys Asp Met Gln Glu Pro Glu Phe Val Tyr Tyr Asn Ala Phe 900 905 910 Thr Ser Ser Thr Val Ser Leu Ile Val Ser Lys His Asp Asn Lys Phe 915 920 925 Glu Thr Leu Ser Lys Asn Gln Lys Ile Leu Phe Lys Asn Ala Asn Glu 930 935 940 Lys Glu Val Ile Ala Lys Ser Ile Gly Ile Gln Asn Leu Lys Val Phe 945 950 955 960 Glu Lys Tyr Ile Val Ser Ala Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala Glu Phe 965 970 975 Arg Gln Arg Glu Asp Phe Lys Lys Ser Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg 980 985 990 Lys Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 995 1000 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C.jejuni_sgRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = any nucleotide <400> 23 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagtcc ctgaaaaggg actaaaataa agagtttgcg 60 ggactctgcg gggttacaat cccctaaaac cgcttttttt 100 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of Human AAVS1 <400> 24 atataaggtg gtcccagctc ggggaca 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence of Mouse Rosa26 <400> 25 attcccctgc aggacaacgc ccacaca 27 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-F <400> 26 tgcttctcct cttgggaagt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-R <400> 27 ccccgttctc ctgtggattc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Rosa26-F <400> 28 acgtttccga cttgagttgc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Rosa26-R <400> 29 cccagctaca gcctcgattt 20 <210> 30 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C.jejuni_sgRNA_stem modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = any nucleotide <400> 30 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagtcc cttgtggaaa tataagggac taaaataaag 60 agtttgcggg actctgcggg gttacaatcc cctaaaaccg cttttttt 108 <210> 31 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C.jejuni_sgRNA_loop modified <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = any nucleotide <400> 31 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagtcc ctatattcaa agggactaaa ataaagagtt 60 tgcgggactc tgcggggtta caatccccta aaaccgcttt tttt 104 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-CJ1 <400> 32 atataaggtg gtcccagctc ggggaca 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-NRG1 <400> 33 gtagaggcgg ccacgacctg gtgaaca 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-NRG3 <400> 34 tcacaaaggg agttttccac acggaca 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AAVS1-NRG5 <400> 35 taggcagatt ccttatctgg tgacaca 27 <210> 36 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-F1 <400> 36 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaggagga ggcctaagga tgg 53 <210> 37 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-F2 <400> 37 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgctctgg gcggaggaat atg 53 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-F4 <400> 38 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatcctct ctggctccat cgt 53 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-R1 <400> 39 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgtcat ggcatcttcc aggg 54 <210> 40 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-R2 <400> 40 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccgtg cgtcagtttt acct 54 <210> 41 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS-AV-R4 <400> 41 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccggtt aatgtggctc tggt 54 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 42 atataaggtg gtcccagctc ggggacac 28 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 43 tggccccact gtggggtgga ggggacag 28 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 44 caccccacag tggggccact agggacag 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 45 ctagcagcaa accttccctt cactacaa 28 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 46 ctccatgaat gcaaactgtt ttatacat 28 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 47 tgcattcatg gagggcaact aaatacat 28 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 48 atcaagtgtc aagtccaatc tatgacat 28 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 49 ccaatctatg acatcaatta ttatacat 28 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 50 gcaaaaggct gaagagcatg actgacat 28 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 51 gcagcatagt gagcccagaa ggggacag 28 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 52 gccgcccagt gggactttgg aaatacaa 28 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 53 tccactgcag ctcccttact gataacaa 28 <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 54 attcccctgc aggacaacgc ccacacac 28 <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 55 acacctgttc aattcccctg caggacaa 28 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 56 ttgaacaggt gtaaaattgg agggacaa 28 <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 57 ttgcccctat taaaaaactt cccgacaa 28 <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 58 agatccttac tacagtatga aattacag 28 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 59 agccttatca aaaggtattt tagaacac 28 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 60 cggggcccac tcaccgtgca cataacag 28 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 61 gccgtgtccg cgccatggcc atctacaa 28 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 62 tggccatcta caagaagtca cagcacat 28 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 63 ccgagtgtca ggagctcctg cagcacag 28 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 64 ctccccgggg cccactcacc gtgcacat 28 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 65 cctgtgcagt tgtgggtcag cgccacac 28 <210> 66 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 66 ggtgtggcgc tgacccacaa ctgcacag 28 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 67 ttcttgtaga tggccatggc gcggacac 28 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 68 cgccatggcc atctacaaga agtcacag 28 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 69 acatcatcaa tattgttcct gtatacac 28 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 70 tgaatccaaa aaccttaaaa caaaacaa 28 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 71 tgctttgaat ccaaaaacct taaaacaa 28 <210> 72 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 72 agcataaaaa ccattacaag atatacaa 28 <210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 73 gtagatgtgc tgagagacat tatgacac 28 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 74 ggcggtgtca taatgtctct cagcacat 28 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test sequence <400> 75 atttaactgc agaggtatgt ataaacat 28 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 76 gccacgacct ggtgaacacc taggacgcac 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 77 ggccttatct cacaggtaaa actgacgcac 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 78 ctcttgggaa gtgtaaggaa gctgcagcac 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 79 agctgcagca ccaggatcag tgaaacgcac 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 80 ctgtggggtg gaggggacag ataaaagtac 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 81 gccggttaat gtggctctgg ttctgggtac 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 82 gccatgacag ggggctggaa gagctagcac 30 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 83 gagaaccaga ccacccagaa 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 84 ggcagccccg ccatcaagaa 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 85 gtaagatgct tttctgtgac 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 86 gatcctttga tcttttctac 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 87 gcctccaaaa aagaagagaa 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence <400> 88 tgacatcaat tattatacat 20

Claims (6)

  1. NNNNRYAC (서열번호 1)인 PAM (proto-spacer-adjacent Motif) 서열을 인식하는 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는,
    서열번호 1의 PAM 서열에 인접한 표적 DNA 서열을 타겟팅하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Cas 단백질을 핵 내에 위치시키기 위한 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Cas 단백질은 캄필로박터 속 (genus Campylobacter) 미생물 유래인 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 캄필로박터 속 미생물은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 인 방법.
  5. 제1 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 서열번호 22의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.

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