KR20030081297A - Ｃ형 간염 바이러스의 ｎｓ3-세린 프로테아제억제제로서의 신규한 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는, HCV 프로테아제 억제활성을 가지는 신규한 펩티드 화합물 및 이의 제조방법을 개시하고 있다. 본 발명의 다른 양태에서는, 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 HCV 프로테아제와 관련된 질환의 치료에 상기 화합물을 사용하는 방법을 개시하고 있다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 ＮＳ3-세린 프로테아제 억제제로서의 신규한 펩티드{Novel peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus}

C형 간염 바이러스 (HCV)는, 비-A형, 비-B형 간염 (NANBH), 특히 혈액-관련 NANBH (BB-NANBH)에서 주요 원인 인자로 생각되는, (+)-센스 단일쇄 RNA 바이러스이다 {참조: 국제공개공보 제WO 89/04669호 및 유럽특허출원공개공보 제EP 381 216}. NANBH는, A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 엡스타인-바르 바이러스(EBV)와 같은 다른 유형의 바이러스-유도 간질환과; 알코올 중독 및 주요 담즙성 간경변과 같은 다른 유형의 간질환과는 차이가 있다.

최근, 폴리펩티드 프로세싱 및 바이러스 복제에 필수적인 HCV 프로테아제가 동정, 클로닝 및 발현되었다 {참조: 예를 들면, 미국특허 제5,712,145호}. 이는,약 3000개의 아미노산으로 이루어진 다단백질(polyprotein)으로서, 아미노 말단에서부터 카복시 말단의 방향으로 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleocapsid protein; C), 엔벨롭 단백질 (envelope protein; E1 및 E2), 및 다수의 비-구조 단백질 (NS1, 2, 3, 4a, 5a 및 5b)을 함유하고 있다. NS3는, 약 68kDa 단백질이며, 약 1893개의 뉴클레오티드의 HCV 게놈에 의해 코드화되며, 2개의 상이한 도메인 (a) 및 (b)를 가진다 - (a) 약 200개의 N-말단 아미노산으로 이루어진 세린 프로테아제 도메인, 및 (b) C-말단에 RNA-의존 ATPase 도메인. NS3 프로테아제는, 단백질 서열, 전체적인 3차원 구조 및 효소 메카니즘에 있어서의 유사성으로 인해, 키모트립신 군(chymotrypsin family)에 속하는 것으로 생각된다. 기타의 다른 키노트립신-유사 효소로는, 엘라스테이즈(elastase), 인자 Xa, 트롬빈, 트립신, 플라스민, 유로키나제, tPA 및 PSA가 있다. HCV NS3 세린 프로테아제는, NS3/NS4a, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a 및 NS5a/NS5b 연결 지점에 있는 폴리펩티드 (다단백질)의 가수분해를 책임지고 있으므로, 바이러스가 복제하는 동안에 4가지의 바이러스 단백질의 생산을 책임진다. 이로 인해, HCV NS3 세린 프로테아제는 항바이러스 화학치료법에 있어서 관심을 끄는 표적이 되고 있다.

약 6kDa의 폴리펩티드인 NS4a 단백질은, NS3의 세린 프로테아제 활성에 있어서 보조인자로 밝혀졌다. NS3/NS4a 세린 프로테아제에 의해 분자내에서 NS3/NS4a 연결이 자가 절단(autocleavage)되는 반면 (즉, 시스), 기타의 다른 절단 부위는 분자 사이에서 프로세싱된다 (즉, 트랜스).

HCV 프로테아제의 천연 절단 부위를 분석한 결과, P1에 시스테인이 존재하고P1'에 세린이 존재함이 밝혀졌으며, 이러한 잔기는 NS4a/NS4b, NS4b/NS5a 및 NS5a/NS5b 연결지점에서 엄격하게 보존됨이 밝혀졌다. NS3/NS4a 연결지점은 P1에 트레오닌을, P1'에는 세린을 함유한다. NS3/NS4a에서 Cys→Thr 치환은, 이 연결지점에서 트랜스 프로세싱(trans processing) 보다는 시스 프로세싱(cis processing)이 필요함을 설명해주는 것으로 생각된다 {참조: 예를 들면, Pizzi 등 (1994) Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 91:888-892; Failla 등 (1996) Folding & Design 1:35-42}. 또한, NS3/NS4a 절단 부위는, 다른 부위에 비해 돌연변이 형성에도 보다 내성을 가지고 있다 {참조: 예를 들면, Kollykhalov 등 (1994) J.Virol.68:7525-7533}. 또한, 상기한 절단 부위의 상부에 위치한 산성 잔기가 효과적인 절단에 필요한 것으로 밝혀졌다 {참조: 예를 들면, Komoda 등 (1994) J.Virol.68:7351-7357}.

현재까지 보고된 HCV 프로테아제 억제제로는, 항산화제 {참조: 국제특허공개공보 제WO 98/14181호}, 소정의 펩티드 및 펩티드 유사체 {참조: 국제특허공개공보 제WO 98/17679호; Landro 등 (1997) Biochem.36:9340-9348; Ingallinella 등 (1998) Biochem.37:8906-8914; Llinas-Brunet 등 (1998) Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1713-1718}, 70개 아미노산-폴리펩티드 에글린 c (eglin c)에 기초한 억제제 {참조: Martin 등 (1998) Biochem.37:11459-11468}, 인간의 췌장분비 트립신 억제제 (hPSTI-C3) 및 소체 레파토리 (minibody repertoires; MBip)로부터 친화성 선택된 억제제 {참조: Dimasi 등 (1997) J.Virol.71:7461-7469},_CV_HE2 ('camelized' 변이성 도메인 항체 단편) {참조: Martin 등 (1997) Protein Eng.10:607-614}, 및 α1-항키모트립신 (ACT) {참조: Elzouki 등 (1997) J.Hepat.27:42-28}이 있다. 최근, C형 간염 바이러스 RNA를 선택적으로 파괴하도록 설계된 리보자임 (ribozyme)이 보고되었다 {참조: BioWorld Today 9(217):4 (1998년 11월 10일)}.

또한, PCT 공보 제WO 98/17679호 (출원인: Vertex Pharmaceuticals Inc.; 공개일: 1998년 4월 30일), 제WO 98/22496호 (출원인: F.Hoffmann-La Roche AG; 공개일: 1998년 5월 28일), 제WO 99/07734호 (출원인: Boehringer Ingelheim Canada Ltd.; 공개일: 1999년 2월 18일)을 참조하라.

HCV는, 간경변 및 간세포 암의 유발에 관여하는 것으로 생각되고 있다. 최근, HCV 감염환자의 예후(prognosis)는 양호하지 않은 편이다. HCV 감염과 관련된 면역성 또는 완화의 결핍으로 인해, HCV 감염은 다른 유형의 간염에 비해 치료가 더 어렵다. 최근의 데이터에 의하면, 간경변 진단을 받은 후 4년 시점에서의 생존율이 50% 미만인 것으로 나타나고 있다. 국부-절제가능한 간세포 암을 가진 것으로 진단된 환자의 5년간 생존할 확률이 10 내지 30%인 데 반해, 국부-절제불가능한 간세포 암을 가진 것으로 진단된 환자의 5년간 생존할 확률은 1% 미만이다.

HCV NS3 프로테아제 억제제의 바이사이클 유사체의 합성에 대해 기술하고 있는, A.Marchetti 등의 문헌을 참조하라 {참조: Synlett, S1, 1000-1002 (1999)}.상기 문헌에 기재된 화합물은 아래의 화학식을 가진다:

또한, 알킬 및 에틸 기능성을 가지는 소정의 α-케토아미드, α-케토에스테르 및 α-디케톤의 제조방법에 대해 기재하고 있는, W.Han 등의 문헌 {참조: Bioorganic & Medicinal Chem.Lett. (2000) 10, 711-713}을 참조하라.

또한, 하기 화학식의 펩티드 유도체 (여기서, 각 요소에 대해서는 문헌에 각각 기재되어 있음)를 기재하고 있는, 제WO 00/09558호 (양수인: Boehringer Ingelheim Limited; 공개일 - 2000년 2월 24일)을 참조하라:

이러한 유형의 예시적인 화합물로는 다음의 화합물이 있다:

또한, 하기 화학식의 펩티드 유도체 (여기서, 각 요소에 대해서는 문헌에 각각 기재되어 있음)를 기재하고 있는, 제WO 00/09543호 (양수인: Boehringer Ingelheim Limited; 공개일 - 2000년 2월 24일)을 참조하라:

이러한 유형의 예시적인 화합물로는 다음의 화합물이 있다:

현재의 C형 간염 치료방법으로는, 인터페론 α(INFα) 와 리바비린 및 인터페론의 병행 치료법이 포함된다 {참조: 예를 들면, Beremguer 등 (1998) Proc.Assoc.Am.Physicians 110(2):98-112}. 이러한 치료법은, 낮은 지속반응률 및 빈번한 부작용의 문제를 가지고 있다 {참조: 예를 들면, Hoofnagle 등 (1997) N.Engl.J.Med.336:347}. 현재로서는, HCV 감염에 사용할 수 있는 백신은 없다.

현재 특허청에 계류중인 US 특허출원 제09/___,___(출원일:________), 제09/___,___(출원일:________), 제09/___,___(출원일:________), 제09/___,___(출원일:________), 제09/___,___(출원일:________), 제09/___,___(출원일:________)에서는, C형 간염 바이러스의 NS-3 세린 프로테아제 억제제로서의 다양한 종류의 펩타이드를 기재하고 있다.

HCV 감염에 대한 새로운 치료법이 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은, C형 간염의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 데 사용할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, C형 간염의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 본원에 기재된 화합물을 사용하여, 세린 프로테아제 (특히, HCV NS3/NS4a 세린 프로테아제)의 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 본원에 기재된 화합물을 사용하여, HCV 폴리펩티드의 프로세싱을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 여러 양태에서, 신규한 HCV 프로테아제 억제제, 하나 이상의 상기 억제제를 포함하는 약제학적 조성물, 하나 이상의 상기 억제제를 포함하는 약제학적 제형을 제조하는 방법, 및 하나 이상의 C형 간염 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 데에 상기 억제제를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에서는, HCV 프로테아제와 HCV 폴리펩티드의 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 화합물 중에서, HCV NS3/NS4a 세린 프로테아제 활성을 억제하는 화합물이 바람직하다. 본원에서는, P3에서 P2'까지의 아미노산 배열을 함유하는 펩티드 화합물을 개시한다.

본 발명의 제1 양태에서는, 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다:

상기식에서,

G, J 및 Y는 H, 알킬, 알킬-아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴-헤테로아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 알킬옥시, 알킬-아릴옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클로알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬-아릴아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 사이클로알킬아미노 또는 헤테로사이클로알킬아미노 잔기로부터 각각 독립적으로 선택되고 {단, Y는 X¹¹및 X¹²로 임의적으로 치환될 수 있다};

X¹¹는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬-알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬 {단, X¹¹는 X¹²로 임의적으로 추가 치환될 수 있다};

X¹²는 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 알킬설폰아미도, 아릴설폰아미도, 카복시, 카브알콕시, 카복스아미도, 알콕시카보닐아미노, 알콕시카보닐옥시, 알킬우레이도, 아릴우레이도, 할로겐, 시아노 또는 니트로 {단, 알킬, 알콕시 및 아릴은, X¹²로부터 선택되는 잔기로 임의적으로 추가 치환될 수 있다};

R¹은 COR⁵또는 B(OR)₂{여기서, R⁵는 H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF₃, C₂F₅, C₃F₇, CF₂R⁶, R⁶또는 COR⁷; R⁷은 H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰또는 NR⁹R¹⁰; R⁶, R⁸, R⁹및 R¹⁰은 H, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')R^', CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONHCH(R^5')COOR¹¹및 CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONHCH(R^5')CONR¹²R¹³로 이루어진 그룹중에서 각각 독립적으로 선택되고; R^1', R^2', R^3', R^4', R^5', R¹¹, R¹², R¹³및 R^'은 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 아릴-알킬 또는 헤테로아르알킬로부터 선택된다};

Z는 O, N 또는 CH로부터 선택되며;

W는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, W가 존재하는 경우에는 W는 C=O, C=S 또는 SO₂이고;

R, R², R³및 R⁴는 H; C1-C10 알킬; C2-C10 알케닐; C3-C8 사이클로알킬; C3-C8 헤테로사이클로알킬, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미도, 에스테르, 카복실산, 카바메이트, 우레아, 케톤, 알데히드, 시아노, 니트로; 산소, 질소, 황 및 인 원자 {산소, 질소, 황 또는 인 원자의 수는 0 내지 6}; (사이클로알킬)알킬 및 (헤테로사이클로알킬)알킬 {여기서, 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소원자와 0 내지 6개의 산소, 질소, 황 또는 인 원자로 이루어지며; 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자로 이루어진다}; 아릴; 헤테로아릴; 알킬-아릴; 및 알킬-헤테로아릴로 이루어진 그룹 중에서 각각 독립적으로 선택되며;

상기한 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬 잔기는 임의적으로 치환될 수 있다 {여기서, 용어 "치환된"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 할로겐, 하이드록시, 티오, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미도, 에스테르, 카복실산, 카바메이트, 우레아, 케톤, 알데히드, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 설폭시드, 설폰, 설포닐우레아, 히드라지드 및 히드록사메이트로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 잔기로 임의적 및 화학적으로 적합하게 치환됨을 의미한다}.

상기 화학식 I의 여러 잔기에 대한 정의 중에서, 바람직한 잔기는 다음과 같다: 바람직하게는, R¹은 COR⁵이고; R⁵는 H, OH, COOR⁸또는 CONR⁹R¹⁰이며; R⁸, R⁹및 R¹⁰은 상기한 바와 같다. R¹에 바람직한 잔기는 COCONR⁹R¹⁰이고; R⁹은 H이며; R¹⁰은 H, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³또는 CH(R^1')CONHCH(R^2')R^'이다. 이 중에서, R¹⁰에 바람직한 잔기는 CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³또는 CH(R^1')CONHCH(R^2')R^'이다 {여기서, R^1'은 H 또는 알킬, 헤테로알킬이고; R^2'는 페닐, 치환된 페닐, 헤테로 원자-치환된 페닐, 티오페닐, 사이클로알킬, 헤테로 원자-치환된 사이클로알킬, 피페리딜 및 피리딜}.

보다 바람직하게는, R^1'는 H; R¹¹는 H 또는 3차 부틸; R^'는 하이드록시메틸; R^2'는 아래의 화합물 중에서 선택되며:

{상기식에서,

U¹및 U²는 동일하거나 상이할 수 있으며; H, F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂CONH₂, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, 아지도, 아미노, 하이드록실, 치환된 아미노, 치환된 하이드록실;

U³및 U⁴는 동일하거나 상이할 수 있으며, O 또는 S;

U⁵는 알킬설포닐, 아릴 설포닐, 헤테로알킬 설포닐, 헤테로아릴 설포닐, 알킬 카보닐, 아릴 카보닐, 헤테로알킬 카보닐, 헤테로아릴 카보닐, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 헤테로아릴옥시카보닐, 알킬아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 헤테로아릴아미노카보닐 또는 이의 조합으로 이루어진 잔기 중에서 선택된다};

NR¹²R¹³은 아래의 화합물 중에서 선택된다 {여기서, U⁶는 H, OH 또는 CH₂OH}:

NH₂, NHMe, N(Me)OMe, NMe₂,

R²에 바람직한 잔기는 다음과 같다:

R³에 바람직한 잔기는 다음과 같다 {여기서, R³¹은 OH 또는 O-알킬}:

추가적으로, R³은 또한 아래의 화학식으로 표현될 수도 있다:

상기식에서, Y¹⁹는 아래의 잔기로부터 선택된다:

또한, 추가적으로, R³은 또한 아래의 화학식으로 표현될 수 있다:

상기식에서, Y²⁰는 아래의 잔기로부터 선택된다:

R³에 가장 바람직한 잔기는 다음과 같다:

추가적으로, 화학식 I에서, R⁴가 없는 경우, 잔기 Z-C-R³은 아래의 구조식으로 표현될 수 있다:

또다른 바람직한 잔기로는, Z는 N; R⁴는 H; W는 C=O 또는 SO₂이다.

Y에 바람직한 잔기는 다음과 같다:

상기식에서,

Y¹¹는 H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)₂, 1-트리아졸릴, 1-이미다졸릴 또는 NHCH₂COOH;

Y¹²는 H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl 또는 Br이다.

또한, Y는 아래의 구조식으로 표현될 수도 있다:

상기식에서,

Y¹³는 아래의 잔기중에서 선택되고:

Y¹⁴는 MeSO₂, Ac, Boc,ⁱBoc, Cbz 또는 Alloc이다.

추가적으로, Y에 바람직한 구조는 다음과 같다 {여기서, Y¹⁵및 Y¹⁶는 동일하거나 상이하며; 알킬, 아릴 또는 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 중에서 각각 독립적으로 선택된다}:

추가적으로, Y는 다음과 같다 {여기서, Y¹⁷는 CF₃, NO₂, CONH₂, OH, COOCH₃, OCH₃, OC₆H₅, C₆H₅, COC₆H₅, NH₂또는 COOH; Y¹⁸는 COOCH₃, NO₂, N(CH₃)₂, F, OCH₃,CH₂COOH, COOH, SO₂NH₂또는 NHCOCH₃}:

J에 대해 바람직한 잔기는 다음과 같다:

G에 대해 바람직한 잔기는 다음과 같다:

달리 정의되지 않은 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해할 수 있는 의미와 동일한 의미를 가진다. 따라서, 예를 들면, 용어 "알킬(알콕시의 알킬 부분을 포함)"은, 1 내지 8개 (바람직하게는, 1 내지 6개)의 탄소원자를 가지는, 단일 원자를 제거함으로써, 직쇄 또는 측쇄 포화 탄화수소에서 유래된 1가 그룹을 지칭한다.

"아릴"은, 6 내지 14개의 탄소원자를 가지며 하나 이상의 벤제노이드 환을 가지는 탄소환 그룹으로서, 탄소환 그룹의 모든 치환가능한 방향족 탄소원자는 가능한 부착지점인, 탄소환 그룹을 나타낸다. 바람직한 아릴 그룹으로는, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸 및 인다닐이 포함되며, 특히 페닐 및 치환된 페닐이 바람직하다.

"아르알킬"은, 저급 알킬을 통해 연결된 아릴 그룹을 함유하는 잔기를 나타낸다.

"알킬아릴"은, 아릴 그룹에 의해 연결된 저급 알킬을 함유하는 잔기를 나타낸다.

"사이클로알킬"은, 3 내지 8개 (바람직하게는, 5 또는 6개)의 탄소원자를 가지며, 임의적으로 치환된, 포화 탄소환을 나타낸다.

"헤테로사이클릭"은, 아래에 정의된 "헤테로아릴" 그룹 뿐만 아니라, 하나의 환 또는 2개의 융합환으로 이루어진 탄소환 구조에 하나 이상의 O, S 및/또는 N 원자가 끼어들어가 있는 포화 및 불포화 유기환 그룹을 나타낸다 {여기서, 각 환은 5원, 6원 또는 7원 환이며, 위치이탈된 pi 전자가 없는 이중결합을 가지거나 가지지 않을 수 있고, 환 구조는 2 내지 8개(바람직하게는, 3 내지 6개)의 탄소원자를 가지는 데, 예를 들면, 2- 또는 3-피페리디닐, 2- 또는 3-피페라지닐, 2- 또는 3-모르폴리닐, 2- 또는 3-티오모르폴리닐이 있다.

"할로겐"은, 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 나타낸다.

"헤테로아릴"은, 하나 이상의 O, S 및/또는 N원자가 탄소환 구조에 끼어들어가 있고 충분한 수의 위치이탈된 pi 전자를 가짐으로써 방향성을 가지는 유기환 그룹으로서, 헤테로사이클 방향족 그룹은 2 내지 14개 (바람직하게는, 4 또는 5개)의 탄소원자를 가지는 데, 예를 들면, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2- 또는 3-푸릴, 2- 또는 3-티에닐, 2-, 4- 또는 5-티아졸릴, 2- 또는 4-이미다졸릴, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-피라지닐, 3- 또는 4-피리다지닐 등이 있다. 바람직한 헤테로아릴 그룹은, 2-, 3- 및 4-피리딜이다. 상기한 헤테로아릴 그룹은, 임의적으로 치환될 수도 있다. 추가적으로, 달리 정의되지 않는 한, 용어 "치환된 또는 치환되지 않은" 또는 "임의적으로 치환된"은, R¹²또는 R¹³에 속하는 잔기로 임의적으로 및 화학적으로 적합하게 치환된 해당 잔기를 지칭한다.

또한, 상기 화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 유도체 뿐만 아니라 이의 토토머, 로타머, 에난티오머 및 기타의 광학 이성체도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 또다른 양태는, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 화학식 I의 화합물(또는 이의 염, 용매화물 또는 이성체)을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물이다.

또한, 본 발명에서는, 상기 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법, 및 HCV 및 관련 질환 등의 치료에 사용하는 방법을 제공한다. 상기한 치료방법은, 상기한 질환을 겪고 있는 환자에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명에서는 HCV 및 관련 질환의 치료용 약제를 제조하는 데에 화학식 I의 화합물을 사용하는 용도를 개시하고 있다.

본 발명은, 신규한 C형 간염 바이러스 (HCV) 프로테아제 억제제, 하나 이상의 상기 억제제를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 억제제를 제조하는 방법, 및 C형 간염 및 관련 질환을 치료하는 데에 상기 억제제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명에서는, HCV NS3/NS4a 세린 프로테아제의 억제제로서 신규한 펩티드를 개시한다.

본 발명의 제1 양태에서는, HCV 프로테아제 (특히, HCV NS3/NS4a 세린 프로테아제)의 억제제로서 화학식 I의 화합물 {여기서, 다양한 정의는 상기한 바와 같다} 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 유도체를 개시한다.

탁월한 HCV 프로테아제 억제 활성을 나타내는 본 발명의 대표적인 화합물은 아래의 표 1에 그 활성(나노몰 nM로서의 K_i ^*수치 범위)과 함께 나열되어 있다.

[표 1]

화합물 및 HCV 프로테아제 연속검정 결과

상기 표의 HCV 연속검정 K_i ^*수치 범위는, A = 0 내지 100nM; B = 101 내지 1000nM; C = 〉1000 nM이다.

화학식 I의 본 발명의 화합물의 소정의 유형 및 이를 합성하는 방법은 아래에 나열되어 있고, 개략적으로 기재되어 있으며, 그 이후에 예시적인 실시예가 기재되어 있다.

본 발명의 화합물은, 그 구조에 따라, 유기산, 무기산, 유기염기 또는 무기염기와 함께 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 이러한 염 형성에 적합한 산의 예로는, 당업자에게 잘 알려져 있는 염산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 말론산, 살리실산, 말산, 푸마르산, 석신산, 아스코르브산, 말레산, 메탄설폰산 및 기타의 광물 및 카복실산이 있다. 염기와 함께 염을 형성하기 위해 적합한 염기의 예로는, NaOH, KOH, NH₄OH, 테트라알킬암모늄 하이드록시드 등이 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로서 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체 희석제, 부형제 또는 담체 (이를 통틀어, "담체 물질"로 지칭한다)를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 이의 HCV 억제 활성에 의해, C형 간염 및 관련 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 또다른 양태에서는, 본 발명의 화합물을 활성성분으로서 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명의 약제학적 조성물 및 방법에서, 활성 성분은 목적하는 투여형태 {즉, 경구 정제, 캡슐 (고체 충진, 반고체 충진 또는 액체 충진), 분말, 경구 젤, 엘릭서, 분산형 과립, 시럽, 현탁제 등}에 따라 적합하게 선택되고, 통상적인 제약관행에 일치하는 적합한 담체 물질과 함께 투여되는 것이 통상적이다. 예를 들면, 정제 또는 캡슐형태로 경구 투여하는 경우, 활성 약제성분은 경구 비-독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체 {예를 들면, 락토스, 전분, 수크로스, 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 탈크, 만니톨, 에틸 알콜 (액체형) 등}와 함께 배합될 수 있다. 또한, 목적하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 상기 혼합물에 혼입될 수도 있다. 분말 및 정제는, 약 5 내지 95%의 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 결합제로는, 전분, 젤라틴, 천연 당, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검 (예를 들면, 아카시아), 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스가 포함된다. 윤활제 중에서, 붕산, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 상기한 투여형태에 사용될 수 있을 것이다. 붕해제로는, 전분, 메틸셀룰로스, 구아 검 등이 포함된다.

적합한 경우, 감미 및 향신제와 방부제가 포함될 수도 있다. 상기한 용어중 몇몇, 즉 붕해제, 희석제, 윤활제, 결합제 등에 대해서는 아래에 좀더 상세히 기재되어 있다.

추가적으로, 본 발명의 조성물은 서방형으로 제형되어 상기 성분 또는 활성 성분 중 하나 이상의 방출속도를 조절하여 치료효과(즉, HCV 억제 활성 등)를 최적화할 수 있다. 서방형으로 적합한 투여형태로는, 다양한 붕해속도를 가지는 층을 함유하는 "층을 이룬 정제(layered tablet)"이거나, 활성 성분이 혼입되고 정제 형태를 가지는 "방출조절되는 폴리머 매트리스(controlled release polymeric matrices)" 또는 상기한 혼입된 또는 캡슐화된 다공성 폴리머 매트리스를 함유하는 캡슐이 포함된다.

액체형 제제로는 용액제, 현탁제 및 에멀젼제가 포함된다. 예를 들면, 비경구 주사용 또는 경구 용액, 현탁액 및 에멀젼용 감미제 및 pacifier 첨가용 물 또는 물-프로필렌 글리콜 용액이다. 또한, 액체형 제제로는 비강내 투여용 용액이 포함된다.

흡입에 적합한 에어로졸 제제로는, 용액 및 분말형태의 고체일 수 있으며, 이는 약제학적으로 허용가능한 담체(예를 들면, 질소와 같은 불활성 압축가스)와 함께 배합될 수 있다.

좌제를 제조하기 위해, 코코아 버터와 같은 지방산 글리세리드의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 융해시킨 후, 교반 또는 이와 유사한 혼합법을 사용하여 활성 성분을 그 내부에 균등하게 분산시킨다. 그리고나서, 이렇게 융해된 균질 혼합물을 간편한 크기의 주형에 부은 후, 냉각시켜 고형화한다.

사용하기 직전에 경구 또는 비경구 투여용 액체형 제제로 전환시키는 고체형 제제도 포함된다. 상기 액체형으로는, 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다.

또한, 본 발명의 화합물은 경피전달될 수도 있다. 이러한 경피용 조성물은, 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀젼 형태를 가질 수 있으며, 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 매트릭스 또는 저장형태의 경피 패치내에 포함될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 화합물은 경구, 정맥내 또는 피하 투여된다.

바람직하게는, 본 발명의 약제학적 제제는 단일 투여형태일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 약제학적 제제는 적합한 양 (예를 들면, 목적하는 효과를 얻기에 유효한 양)의 활성 성분을 함유하는 적합한 크기의 단일 투여형태로 분할된다.

단일 투여형태의 제제내의 본 발명의 활성 조성물의 양은, 각각의 용도에 따라 일반적으로 약 1.0 내지 1000㎎ (바람직하게는 약 1.0 내지 약 950㎎; 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 약 500㎎; 통상적으로는 약 1 내지 약 250㎎)의 범위내에서 조절될 수 있다. 실제 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 치료상태의 심각성 정도에 따라 달라질 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게는 잘 알려져 있다.

일반적으로, 활성 성분을 함유하는 인간 경구 투여형태는 1일 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 투여량 및 횟수는 임상의에 판단에 의해 결정될 것이다. 경구 투여에 일반적으로 권장되는 1일 투여법으로는, 1일 약 1.0 내지 약 1000㎎을 단일 또는 분할 투여할 수 있다.

몇가지 유용한 용어에 대해서는 아래에서 설명한다:

"캡슐"은, 상기 활성성분을 포함하는 조성물을 보유 또는 함유하기 위한 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 또는 변성된 젤라틴 또는 전분으로 제조된 특별한 용기 또는 봉입물을 지칭한다. 경질 캡슐은 상대적으로 젤 강도가 큰 뼈 및 돼지 피부의 젤라틴의 블렌드로 통상적으로 제조된다. 이러한 캡슐 자체는, 소량의 염색제, 불투명제, 가소제 및 방부제를 함유할 수 있다.

"정제"는, 활성 성분 및 적합한 희석제를 함유하는 압축된 또는 주형된 고체투여형태를 지칭한다. 정제는, 습식 과립화, 건식 과립화 또는 꽉 채움 (compaction)으로 수득한 혼합물 또는 과립을 압축하여 제조할 수 있다.

"경구용 젤"은, 친수성 반고체 매트릭스에 분산 또는 용해된 활성 성분을 의미한다.

"조성용 분말(powder for constitution)"은, 물 또는 쥬스에 현탁될 수 있는 적합한 희석제 및 활성성분을 함유하는 분말 블렌드를 지칭한다.

"희석제"는 상기한 조성물 또는 투여형태의 대부분을 차지하는 물질을 지칭한다. 적합한 희석제로는, 당 (예를 들면, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨); 밀, 옥수수, 쌀 및 감자에서 유래한 전분; 및 셀룰로스 (예를 들면, 미세결정 셀룰로스)가 포함된다. 상기 조성물 내의 희석제의 양은, 약 10 내지 약 90 중량% (조성물의 총중량을 기준), 바람직하게는 약 25 내지 약 75중량%, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 60중량%, 보다 더 바람직하게는 약 12 내지 액 60중량%이다.

"붕해제"는, 본 발명의 조성물을 분해하여 약제가 방출되도록 돕기 위해 첨가되는 물질을 지칭한다. 적합한 붕해제로는, 전분; 나트륨 카복시메틸 전분과 같이 "냉수-가용성(cold water soluble)"-개질된 전분; 로커스트 대두 (locust bean), 카라야(karaya), 구아(guar), 트라가칸트 (tragacanth) 및 아가(agar)와 같은 천연 및 합성 검; 메틸셀룰로스 및 나트륨 카복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체; 미세결정 셀룰로스 및 가교연결된 미세결정 셀룰로스 (예를 들면, 나트륨 크로스카르멜로스); 알긴산 및 나트륨 알기네이트와 같은 알기네이트; 벤토나이트와 같은 클레이; 및 포말 혼합물이 포함된다. 본 발명의 조성물내의 붕해제의 양은, 약 2 내지 약 15중량% (조성물의 총중량을 기준), 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 10중량%이다.

"결합제"는, 분말을 서로 결합 또는 "접착"시키고 과립을 형성함으로써 서로 점착성이 있게 하여 상기한 제형에서 "접착제"로서 작용하는 물질을 지칭한다. 결합제는 상기한 희석제 또는 벌크제에서 이미 수득할 수 있는 접착강도를 추가한다. 적합한 결합제로는, 당 (예를 들면, 수크로스); 밀, 옥수수, 쌀 및 감자에서 유래한 전분; 천연 검 (예를 들면, 아카시아, 젤라틴 및 트라가간트); 해초 유도체 (예를 들면, 알긴산, 나트륨 알기네이트 및 암모늄 칼슘 알기네이트); 셀룰로스 물질 (예를 들면, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스); 폴리비닐피롤리돈; 및 무기물 (예를 들면, 마그네슘 알루미늄 실리케이트)가 포함된다. 상기 조성물 내의 결합제의 양은, 약 2 내지 약 20 중량% (조성물의 총중량을 기준), 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 10중량%, 보다 더 바람직하게는 약 3 내지 약 6중량%이다.

"윤활제"는, 상기한 투여형태가 압축된 후, 마찰 또는 마모를 감소시킴으로써 정제, 과립 등이 주형 또는 다이(die)에서 방출될 수 있도록 상기한 투여형태에 첨가되는 물질을 의미한다. 적합한 윤활제로는, 금속성 스테아레이트 (예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 또는 칼륨 스테아레이트); 스테아르산; 고융점 왁스; 및 수용성 윤활제 (예를 들면, 나트륨 클로라이드, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 올레에이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 d'-류신)가 포함된다. 윤활제는 압축되기 이전에 가장 마지막 단계에서 첨가되는 것이 일반적인 데, 이는 과립의 표면상, 과립과 정제 프레스 부품 사이에 존재하여야 하기 때문이다. 상기 조성물 내의 결합제의 양은, 약 0.2 내지 약 5 중량% (조성물의 총중량을 기준), 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2중량%, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 1.5중량%이다.

"활주제(glident)"는, 케이킹(caking)을 방지하고 과립의 유동 특성을 향상시켜 유동이 원활하고 균일하게 해주는 물질을 지칭한다. 적합한 활주제로는, 실리콘 디옥사이드 및 탈크가 포함된다. 상기 조성물 내의 활주제의 양은, 약 0.1 내지 약 5 중량% (조성물의 총중량을 기준), 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2중량%이다.

"착색제"는, 본 발명의 조성물 또는 투여형태에 색깔을 제공하는 부형제를 지칭한다. 이러한 부형제로는, 음식물 등급의 염료 및 적합한 흡수제 (예를 들면, 클레이 또는 알루미늄 옥사이드)에 흡수된 음식물 등급의 염료가 포함될 수 있다. 상기 조성물 내의 착색제의 양은, 약 0.1 내지 약 5 중량% (조성물의 총중량을 기준), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1중량%이다.

"생물학적 이용성(bioavailability)"은, 표준 또는 대조군과 비교한, 활성 약물성분 또는 치료학적 잔기가 투여된 투여형태로부터 전신 혈액순환계로 흡수되는 비율 및 정도를 의미한다.

정제를 제조하는 통상적인 방법은 이미 공지되어 있다. 이러한 방법으로는, 건식 방법 (예를 들면, 직접 압착 및 압축생성된 과립의 압착), 습식 방법 또는 기타의 특별한 방법들이 포함된다. 예를 들면, 캡슐제, 좌제 등의 기타 투여형태를 제조하는 통상의 방법들도 잘 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, C형 간염 등의 질환의 치료에 상기 기재된 약제학적 조성물의 사용하는 방법에 대해 기재하고 있다. 이 방법에서는, 상기한 질환을 가지고 있는 치료가 필요한 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 양태에서 본 발명의 화합물은, 인간의 HCV 치료에 있어서 단일 형태로 사용되거나 항바이러스 제제 (예를 들면, 리바비린 및/또는 α-인터페론과 같은 인터페론)과 함께 병행하여 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 상기한 화합물의 토토머, 로타머, 에난티오머 및 기타의 입체 이성체가 포함된다. 따라서, 본 발명의 일부 화합물은 적합한 이성체 형태로 존재할 수 있다는 것은 당업자들은 이해할 것이다. 이러한 변형체들도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

본 발명의 다른 양태에서는 본원에 개시된 화합물의 제조방법을 개시하고 있다. 본원에 개시된 화합물은, 당해 분야에 공지된 일부 기술을 사용하여 제조될수 있다. 대표적인 예시적 공정의 개요는 아래의 반응식에 기재되어 있다. 아래의 예시적인 반응식에서는 몇몇 대표적인 본 발명의 화합물의 제조방법에 대해서 기재하고 있지만, 천연 및 비-천연 아미노산의 적합한 치환으로 목적하는 화합물을 형성하게 될 것이다. 이러한 변형체들도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.

아래의 반응식, 제조방법 및 실시예의 기재에 사용된 약어는 다음과 같다:

THF: 테트라하이드로푸란

DMF:N,N-디메틸포름아미드

EtOAc: 에틸 아세테이트

AcOH: 아세트산

HOOBt: 3-하이드록시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온

EDCl: 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드

DEC: 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드

NMM:N-메틸모르폴린

ADDP: 1,1'-(아조디카보빌)디피페리딘

DEAD: 디에틸아조디카복실레이트

MeOH: 메탄올

EtOH: 에탄올

Et₂O: 디에틸 에테르

DMSO: 디메틸설폭시드

HOBt:N-하이드록시벤조트리아졸

PyBrOP: 브로모-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

Bn: 벤질

Bzl: 벤질

Et: 에틸

Ph: 페닐

iBoc: 이소부톡시카보닐

iPr: 이소프로필

^tBu 또는 Bu^t: 3차-부틸

Boc: 3차-부틸옥시카보닐

Cbz: 벤질옥시카보닐

Cp: 사이클로펜틸디에닐

Ts: p-톨루엔설포닐

Me: 메틸

THP: 테트라하이드로피라닐

iBoc: 이소부틸옥시카보닐

Chg: 사이클로헥실글리신

일반적인 제조 반응식:

아래의 반응식에서는 중간체(intermediate building blocks)의 합성방법을 기재하고 있다:

중간체의 제조:

제조 실시예 1

단계 A: 화합물 1.1

-20℃에서, DMF (15ml) 및 CH₂Cl₂(15ml) 중의 화합물 1.08 {3.00g, 12.0mmol; Harbeson, S.L; Abelleira, S.M.; Akiyama, A.; Barrett, R.; Carroll, R.M. 등; J.Med.Chem.;37(18) 1994; 2918-2929}의 용액에, HOOBt (1.97g, 12.0mmol), N-메틸 모르폴린 (4.0ml, 36.0mmol) 및 EDCl (2.79g, 14.5mmol)을 첨가한 후에 10분간 교반하고 나서, HClㆍH₂N-Gly-OBn (2.56g, 13.0mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 2시간 동안 교반한 후, 밤새 냉장시키고나서, 농축 건조시킨 후, EtOAc (150ml)로 희석시켰다. 상기 EtOAc 용액을 포화 NaHCO₃, H₂O, 5% H₃PO₄, 염수로 2회 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고 나서, 여과 및 농축 건조시켜, 화합물 1.09 (4.5g, 94%)를 수득하였다: LRMSm/zMH⁺= 395.1

단계 B: 화합물 1.1

Pd-C (300mg, 10%) 존재하에 수소 대기하에서 실온에서, 무수 에탄올 (300ml) 중의 화합물 1.09 (7.00g, 17.8mmol)의 용액을 교반하였다. 반응 공정은 TLC로 모니터링하였다. 2시간 경과후, 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통과시켜 여과시켜 얻은 용액을 진공 농축시켜, 화합물 1.1 (5.40g, 정량)을 수득하였다:LRMSm/zMH⁺= 305.1

제조 실시예 2

단계 A: 화합물 1.3

제조 실시예 1, 단계 B의 화합물 1.1 (1 당량), 화합물 1.2 (Novabiochem, No.04-12-5147) (1.03 당량), HOOBt (1.03 당량), N-메틸모르폴린 (2.2 당량) 및 디메틸포름아미드 (70ml/g)을 -20℃에서 교반하였다. EDCl (1.04 당량)을 첨가한 후, 반응 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 5% 수성 KH₂PO₄에 부은 후, 에틸 아세테이트 (2×)로 추출하였다. 상기 배합된 유기물을 차가운 5% 수성 K₂CO₃로 세척한 후, 5% 수성 KH₂PO₄로 세척하고, 염수로 세척한 후, 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과시킨 후에 증발시키고, 여과물을 진공하에 건조시키고, 잔류물을 Et₂O-헥산으로 분쇄한 후에 여과시켜, 본 제목의 화합물 1.3 (수율: 86%)을 수득하였다: C₂₅H₃₉N₃O₇(493.60), 질량 스펙트럼 (FAB) M⁺= 494.3.

단계 B: 화합물 1.4

제조 실시예 2, 단계 A의 화합물 1.3 (3.0g)에 4N HCl/디옥산 (36ml)을 처리한 후, 실온에서 7분간 교반하였다. 상기 혼합물을 1.5L 차가운(5℃) 헥산에 부은 후에 교반하고 나서, 0℃에서 0.5시간 동안 방치하였다. 상기 혼합물을 건조 대기에서 흡입 여과시키고, 수집된 고체를 추가로 건조시켜, 본 제목의 화합물 1.4 (2.3g, 수율 88%)를 수득하였다: C₂₀H₃₁N₃O₅ㆍHCl, H¹NMR (DMSO-d₆/NaOD) δ7.38 (m, 5H), 5.25 (m, 1H), 4.3-4.1 (m, 1H), 3.8 (m, 2H), 3.4-3.3 (m, HDO에 의해 색깔이 거무스름함), 1.7-1.1 (m, 4H), 1.35 (s, 9H), 0.83 (m, 3H).

제조 실시예 3: 화합물 1.5

제조 실시예 2, 단계 A의 화합물 1.3을 제조 실시예 7, 단계 A에서와 본질적으로 동일한 방식으로 처리하여, 화합물 1.5를 수득하였다.

제조 실시예 4: 화합물 1.6

제조 실시예 3의 화합물 1.5를 제조 실시예 2, 단계 B에서와 본질적으로 동일한 방식으로 처리하여, 화합물 1.6을 수득하였다.

제조 실시예 5

단계 A: 화합물 2.09

-20℃에서, 무수 DMF (200ml) 및 CH₂Cl₂(150ml) 중의 디메틸아민 하이드로클로라이드 (1.61g, 19.7mmol), N-Boc-페닐글리신 화합물 2.08 (4.50g, 17.9mmol, Bachem Co. #A-2225), HOOBt (3.07g, 18.8mmol) 및 EDCl (4.12g, 21.5mmol)의 용액에 NMM (5.90ml, 53.7mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 동일 온도에서 30분간 교반한 후, 밤새(18시간) 냉동기내에 보관하였다. 그리고나서, 실온이 되도록 한 후, EtOAc (450ml), 염수 (100ml) 및 5% H₃PO₄(100ml)를 첨가하였다. 상기 층을 분리시킨 후, 유기층을 5% H₃PO₄(100ml), 중탄산 나트륨 포화 수용액(2×150ml), 물 (150ml) 및 염수 (150ml)로 세척하고 나서, 건조시키고 (Mg₂SO₄), 여과 및 진공 농축시켜, 백색 고체로서의 화합물 2.09 (4.86g)을 수득하여 추가 정제없이 사용하였다.

단계 B: 화합물 2.1

제조 실시예 5, 단계 A의 화합물 2.09 (4.70g, 조 화합물)를 4N HCl (60ml, 240mmol) 중에 용해시켜 수득한 용액을 실온에서 교반하였다. 반응 공정은 TLC로 모니터링하였다. 4시간 경과후, 상기 용액을 진공 농축시켜, 백색고체로서의 화합물 2.1을 수득하였으며, 이는 추가 정제없이 후속 반응에서 사용되었다: LRMSm/zMH⁺= 179.0

제조 실시예 6

단계 A: 화합물 2.2

제조 실시예 2, 단계 A에서와 본질적으로 동일한 방식으로, 페닐글리신 t-부틸 에스테르 하이드로클로라이드 대신에 페닐글리신 N,N-디메틸아미드 하이드로클로라이드를 사용하여, 화합물 2.2를 제조하였다: 질량 스펙트럼 (FAB) M⁺¹= 465.3

단계 B: 화합물 2.3

실온에서 1시간 동안, 단계 A의 화합물 2.2 (1.85g)를 4N HCl/디옥산 (50ml)과 반응시켰다. 20℃ 수조에서 상기 혼합물을 진공 증발시키고, 이소프로필 에테르로 분쇄한 후, 여과 및 건조시켜, 화합물 2.3 (1.57g, 수율 98%)을 수득하였다: C₁₈H₂₈N₄O₄ㆍHCl, 질량 스펙트럼(FAB) M⁺¹= 365.3

제조 실시예 7

단계 A: 화합물 2.4

디클로로메탄 (60ml) 중의 제조 실시예 5, 단계 A의 화합물 2.2 (2.0g)의 용액을 디메틸설폭시드 (3.0ml) 및 2,2-디클로로아세트산 (0.70ml)에 처리하였다. 상기 교반된 혼합물을 5℃로 냉각시킨 후, 1M 디사이클로헥실카보디이미드/디클로로메탄 용액 (8.5ml)을 첨가하였다. 상기 냉조를 제거한 후, 상기 혼합물을 22시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 2-프로판올(0.5ml)을 첨가한 후, 1시간동안 추가로 교반하였다. 상기 혼합물을 여과시키고 나서, 빙냉 0.1N NaOH (50ml)로 세척한 후, 빙냉 0.1N HCl (50ml)으로 세척하고, 5% 수성 KH₂PO₄로 세척한 후, 포화 염수로 세척하였다. 상기 유기 용액을 무수 황산 마그네슘상에서 건조시킨 후, 여과시켰다. 여과물을 증발시킨 후, 실리카 겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 (에틸 아세테이트로 용출), 화합물 2.3 (1.87g, 수율 94%)을 수득하였다: C₂₃H₃₄N₄O₆ㆍHCl, 질량 스펙트럼(FAB) M⁺¹= 463.3

단계 B: 화합물 2.5

제조 실시예 2, 단계 B에서와 본질적으로 동일한 방식으로, 화합물 2.5을 수득하였다.

제조 실시예 8

단계 A: 화합물 3.3

단계 A-1 : 화합물 3.02

DMF (150ml) 중의 화합물 3.01 (4.6g, N-Boc-S-메틸시스테인으로부터 제조, Bachem Biosciences Inc., Boger,J.Org.Chem., 1988, 53(3), 487)의 용액을 Cs₂CO₃(6.1g)로 처리하고, 벤질 브로마이드 (2.3ml)로 처리한 후, 이 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 진공 농축시킨 후, 잔류물을 EtOAc (200ml) 중에 현탁시켰다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 수성 5% KH₂PO₄로 세척한 후, 염수로 세척하고, 유기 추출물을 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 상기 혼합물을 여과시킨 후, 여과물을 증발시켜, 생성물 3.02 (6.2g)를 수득하였다: 〔α〕_D-33.7 (c 1.3, CHCl₃)

단계 A-2: 화합물 3.03

U. Larsson 등의 문헌 {참조:Acta Chem. Scan., 1994, 48(6), 517-525}에기재된 공정에 따라, 0℃에서 물 (90ml) 중의 옥손(16.4g, Aldrich Chemical Co.)의 용액을 MeOH (150ml) 중의 화합물 3.02 (6.1g)의 용액에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 회전 증발기상에서 체적을 1/2로 농축시키고나서, 냉수 (100ml)를 첨가한 후, 상기 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 상기 추출물을 염수로 세척한 후, 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 상기 혼합물을 여과한 후, 여과물을 증발시켜, 생성물 3.03 (5.9g)을 수득하였다: 〔α〕_D-26.3 (c 0.9, CHCl₃)

단계 A-3: 화합물 3.2

앞선 단계의 생성물 3.03에 4N HCl/디옥산을 0.5시간 동안 처리하여, 생성물 3.2를 수득하였다: C₁₂H₁₇NO₄SㆍHCl (307.79), 질량 스펙트럼 (FAB) M⁺¹= 272.0

화합물 3.3의 제조

화합물 3.2 (S-메틸 시스테인 설폰 벤질 에스테르 하이드로클로라이드) 및 화합물 3.1 (N-Boc-사이클로헥실글리신)을 제조 실시예 2, 단계 A와 본질적으로 동일한 방식으로 반응시켜, 화합물 3.3 [ C₂₅H₃₈N₂O₇S (510.64)]을 수득하였다.

단계 B: 화합물 3.4

단계 A의 화합물 3.3 (0.7g), 10% Pd/C (0.05g) 및 EtOH-디옥산 (100ml)의 혼합물을 3기압의 H₂하에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과 및 진공 증발시켜, 화합물 3.4 (0.56g, 수율 97%)를 수득하였다: C₁₈H₃₂N₂O₇S (420.52), 질량 스펙트럼 (FAB) M⁺¹= 421.2

단계 C: 화합물 3.5

제조 실시예 2, 단계 A와 본질적으로 동일한 방식으로, 단계 B의 화합물 3.4를 제조 실시예 2, 단계 B의 화합물 1.4와 반응시켜, 화합물 3.5를 수득하였다:C₃₈H₆₁N₅O₁₁S (795.98), 질량 스펙트럼 (FAB) M⁺¹= 796.3

제조 실시예 9: 화합물 4.1

제조 실시예 2, 단계 B와 본질적으로 동일한 방식으로, 제조 실시예 8, 단계 C의 화합물 3.5을 반응시켜, 화합물 4.1를 수득하였다: C₃₃H₅₃N₅O₉SㆍHCl (732.33)

제조 실시예 10: 화합물 4.2

5℃에서, 제조 실시예 9의 화합물 4.1 (0.7g), 디메틸포름아미드 (15ml) 및 디이소프로필에틸아민 (0.38ml)의 용액에 이소부틸 클로로포르메이트 (0.15ml)를 처리하였다. 냉조를 제거하고, 6시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 5% 수성 KH₂PO₄(100ml)에 부은 후, 에틸 아세테이트 (2×100ml)로 추출하였다. 상기 배합 유기물을 차가운 5% 수성 K₂CO₃로 세척한 후, 5% 수성 KH₂PO₄로 세척하고나서, 염수로 세척한 후, 상기 유기물을 무수 MgSO₄상에서 건조시켰다. 상기 혼합물을 여과시킨 후, 여과물을 진공 증발시키고, 잔류물을 Et₂O-헥산으로 분쇄한 후 여과시켜, 화합물 4.2를 수득하였다.

제조 실시예 11: 화합물 4.3

아래의 제조 실시예 14, 단계 H에서와 본질적으로 동일한 방식으로 화합물 4.2를 반응시켜, 화합물 4.3을 수득한다.

제조 실시예 12: 화합물 4.4

약 2시간 동안, 제조 실시예 11의 화합물 4.3 (약 0.10g)을 무수 트리플루오로아세트산-디클로로메탄 용액 (1:1, 약 10ml)에 처리한다. 상기 용액을 크실렌 (약 50ml)으로 희석시키고, 진공 증발시킨다. 잔류물을 Et₂O로 분쇄시키고, 여과시켜, 화합물 4.4를 수득한다.

제조 실시예 13: 화합물 4.5

제조 실시예 2,단계 A에서와 본질적으로 동일한 방식으로, 제조 실시예 12의 화합물 4.4를 디메틸 아민과 반응시켜, 화합물 4.5를 수득한다.

제조 실시예 14

단계 A: 화합물 5.2

0℃에서, 무수 DMF (10ml) 및 무수 CH₂Cl₂(10ml) 중의 화합물 5.01 (1.11g, 7.0mmol)의 교반된 냉각 용액에, HOBT (1.19g, 7.25mmol), N-메틸 모르폴린 (2.3ml, 21.0mmol) 및 DEC (1.6g, 8.4mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 0℃에서 15분간 교반한 후, H-Val-O-^tBu (1.54g, 7.35mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 냉동기내에 밤새 보관하였다. 다량의 침전물을 관찰하였으며, 상기 용액을 농축건조시키고, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 배합된 유기층을 5% H₃PO₄용액, H₂O, 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조하고 여과시켜, 조생성물 5.1(2.4g, 수율 98%)을 수득하였다.

4N HCl/디옥산 중의 상기 수득한 조생성물의 용액을 실온에서 7시간 동안 교반한 후, 농축건조시켜 화합물 5.2를 수득하였다.

단계 B: 화합물 5.4

50% MeOH/50% H₂O (300ml) 중의 화합물 5.3 (17.5g, 0.086mmol) {참조: F.L.Bach, Jr. 등, J.Amer.Chem.Soc.,(1995)77,6049}의 교반 용액에 Boc 무수물 (47.0g, 0.215mol)을 첨가하였다. 그리고 나서, 50% 농축-NaOH 용액을 적가하여 상기 용액의 pH를 5로 조정하였다. 이렇게 수득한 용액을 밤새 실온에서 교반하고나서, 농축 HCl를 사용하여 pH를 8로 중화시킨 후, 시트르산을 이용하여 pH를 2.94로 산성화하고나서, CH₂Cl₂로 추출하였다. 이렇게 배합된 유기층을 MgSO₄상에서 건조시켜, 화합물 5.4 (27.16g, 수율 95%)를 수득하였다.

단계 C: 화합물 5.5

0℃에서, DMF (3.59ml, 0.046mol) 중의 티오닐 클로라이드 (3.37ml, 0.046mol)의 용액의 온도가 실온이 되도록 하고나서, 35분간 교반하였다. 그리고나서, 상기 용액을 0℃로 냉각시킨 후, CH₃CN (150ml) 및 피리딘 (3.73ml, 0.046mol) 중의 상기 단계 B의 화합물 5.4 (15.0g, 0.045mol)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액의 온도를 실온이 되도록 하고나서, 밤새 교반하였다. 그리고나서, 상기 용액을 냉수 (700ml)에 부은 후, EtOAc (150ml)로 3회 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 염수로 세척하고나서, Na₂SO₄상에서 건조한 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 5.5 (10.8g)를 수득하였다.

단계 D: 화합물 1.08

CH₂Cl₂(130ml) 중의 제조 실시예 14, 단계 D의 화합물 6.6 (6.5g,0.044mol)의 교반 용액에, Boc 무수물 (9.65g, 0.044mol) 및 DMF (50ml)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 주말 동안 실온에서 교반한 후, 농축건조시키고 나서, H₂O (120ml) 및 50% NaOH를 첨가하여 pH를 10 내지 11로 조정하였다. 그리고나서, 상기 용액을 2시간 동안 교반하고나서, 추가의 Boc 무수물 (1.93g, 8.8mmol)을 첨가한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 그리고나서, 상기 용액을 CH₂Cl₂로 추출하고 나서, 0℃에서 수성층을 1N HCl을 사용하여 pH를 4로 산성화한 후, CH₂Cl₂로 3회 추출하였다. 그리고나서, 배합된 유기층을 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조하고, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 1.08 (4.50g, 수율 41%, M-3차 부틸 + = 192)을 수득하였다.

단계 E: 화합물 5.7

DMF (22ml) 및 CH₂Cl₂(22ml) 중의 상기 화합물 1.08 (4.5g, 0.018mol)의 교반 용액에, HOBT (2.7g, 0.02mol), N-메틸 모르폴린 (6ml, 0.054mol), DEC (4.17g, 0.022mol) 및 알릴 글리신 TsOH (6.1g, 0.02mol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 주말 동안 교반한 후, 농축건조시키고, EtOAc-포화된 NaHCO₃로 추출하였다. 배합된 유기층을 10% H₃PO₄용액, 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조하고 여과시켜, 조생성물 (5.7g)을 수득하였다. 4N HCl/디옥산 (50ml) 중의 상기 조생성물의 용액을 실온에서 50분간 교반하고 나서, 농축건조시켜, 화합물 5.7 (4.79g, 수율 94%, MH⁺= 245.1)을 수득하였다.

단계 F: 화합물 5.8

무수 CH₂Cl₂(55ml) 중의 단계 E의 화합물 5.7 (3.1g, 0.011mol)의 교반 용액에, TEA (1.69ml, 0.012mol)를 13분 동안 적가하고, 무수 CH₂Cl₂(55ml) 중의 단계 C의 화합물 5.5 (2.83g, 0.011mol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 그리고나서, 유기층을 포화 NaHCO₃, 염수로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조하고 여과시켜, 화합물 5.8 (4.67g, MH⁺= 457.2)을 수득하였다.

단계 G: 화합물 5.9

0℃에서, DMF (5ml) 및 CH₂Cl₂(5ml) 중의 상기 단계 A의 화합물 5.2 (0.34g, 1.31mmol)의 교반 용액에, HOBT (0.214g, 1.31mmol), N-메틸 모르폴린 (0.43ml, 3.9mmol) 및 DEC (0.5g, 1.09mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15분간 교반한 후, 단계 F의 화합물 5.8 (0.5g, 1.09mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 냉동기내에 밤새 보관한 후, 농축건조시킨 후, EtOAc-H₂O로 추출하였다. 배합된 유기층을 포화 NaHCO₃, 5% H₃PO₄, 염수로 2회 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조하고 여과 및 농축건조시켜, 화합물 5.9 (0.65g, MH⁺= 697.4)을 수득하였다.

단계 H: 화합물 5.10

무수 CH₂Cl₂(8ml) 중의 단계 G의 화합물 5.9 (0.6g, 0.8mmol)의 교반 용액에, Dess-Martin 시약 (0.732g, 1.72mmol)을 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 교반하고 나서, CH₂Cl₂(12ml) 중의 Dess-Marin 시약 (0.373g, 0.86mmol) 및 H₂O (0.031ml)을 적가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 2.5시간 동안 교반한 후, 50%-포화 NaHCO₃/50%-포화 Na₂SO₄(20ml) 용액을 첨가하고 나서, 실온에서 1.5시간 동안 신속하게 교반시켰다. 그리고나서, 상기 용액을 H₂O, 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조하고 농축건조시켜, 화합물 5.10 (0.588g, 수율 100%, MH⁺= 695.2)을 수득하였다.

제조 실시예 15

단계 A: 화합물 6.2

-20℃에서, CH₂Cl₂(20ml) 및 DMF (10ml) 중의 화합물 6.1 (5.0g, 19.89mmol)의 교반 용액에 HOBT (3.25g, 19.89mmol), EDCl (4.58g, 23.87mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (6.56ml, 59.69mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 10분간 교반한 후, NH₄Cl (1.38g)을 첨가하고 나서, 0℃에서 밤새 보관하였다. 그리고나서, 상기 용액을 농축시킨 후, EtOAc-H₂O로 추출하였다. 배합된 유기층을NaHCO₃, H₃PO₄및 염수로 2회 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시키고 여과 및 농축건조시켰다. 조생성물을 칼럼 크로마토그래피로 정제한 후, 2.5% MeOH/97.5% CH₂Cl₂로 용출하여 화합물 6.2 (1.95g, MH⁺= 251.1)를 수득하였다.

단계 B: 화합물 6.3

4N HCl/디옥산 (270ml, 43.08mmol) 중의 단계 A의 화합물 6.2의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후에 농축건조시켜, 화합물 6.3 (8.40g, 수율 100%)을 수득하였다.

단계 C: 화합물 1.08 (대안적인 합성법)

0 내지 5℃에서, MeOH (122ml) 중의 글리옥실산ㆍH₂O (28.1g, 0.305mol) 및 1-니트로부탄 (16.5g, 0.16mol)의 교반 용액에 트리에틸 아민 (93ml, 0.667mol)을 2시간에 걸쳐 적가하였다. 상기 용액을 실온으로 가열한 후, 밤새 교반하고 나서농축건조시켜, 오일을 수득하였다. 그리고나서, 상기 오일을 H₂O과 혼합한 후, 10% HCl을 사용하여 pH를 1로 한 후, EtOAc로 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.5 (28.1g, 수율 99%)를 수득하였다.

단계 D: 화합물 6.6

아세트산 (1.25ℓ) 중의 단계 C의 화합물 6.5 (240g, 1.35mmol)의 교반용액에 10% Pd/C (37g)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 59psi에서 3시간 동안 수소화한 후, 60psi에서 밤새 수소화하였다. 그리고나서, 아세트산을 증발시키고, 잔류물을 톨루엔으로 3회 공비혼합시키고, MeOH 및 에테르로 분쇄하였다. 그리고나서, 상기 용액을 여과하고, 톨루엔으로 2회 공비혼합시켜, 화합물 6.6 (131g, 수율 66%)을 수득하였다.

단계 E: 화합물 1.08

0℃에서, 디옥산 (10ml) 및 H₂O (5ml) 중의 단계 D의 화합물 6.6 (2.0g, 0.0136mol)의 교반 용액에 1N NaOH (수성) 용액 (4.3ml, 0.014mol)을 첨가하였다. 수득한 용액을 10분간 교반하고 나서, Boc 무수물 (0.11g, 0.014mol)을 첨가한 후, 0℃에서 15분간 교반하였다. 상기 용액을 실온으로 가열한 후, 45분간 교반하고 나서, 냉장고에 밤새 보관한 후, 농축건조시켜, 조 물질을 수득하였다. EtOAc 및 얼음 중의 상기 조 물질의 용액에 KHSO₄(3.36g) 및 H₂O (32ml)를 첨가한 후, 4 내지 6분간 교반하였다. 그리고나서, 상기 유기층을 분리한 후, 수성층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 물, 염수로 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고 여과 및 농축건조시켜, 화합물 1.08 (3.0g, 수율 89.2%)를 수득하였다.

단계 F: 화합물 1.09

-20℃에서, DMF (15ml) 및 CH₂Cl₂(15ml) 중의 단계 E의 화합물 1.08 (3.0g, 0.012mol)의 교반용액에 HOBT (1.97g, 0.012mol), N-메틸 모르폴린 (4.0ml, 0.036mol) 및 EDCl (2.79g, 0.0145mol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 10분간 교반한 후, H-Gly-OBZㆍHCl (2.56g, 0.013mol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 2시간 동안 교반한 후, 밤새 냉장고 내에 보관하고 나서, 농축건조시키고, EtOAc로 희석시켰다. 상기 EtOAc 용액을 포화 NaHCO₃, H₂O, 5% H₃PO₄, 염수로 2회 세척한 후, Na₂SO₄상에서 건조시키고 나서, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 1.09 (4.5g, 수율 94%, MH⁺= 395.1)를 수득하였다.

단계 G: 화합물 6.9

4N HCl/디옥산 (45ml) 중의 단계 F의 화합물 1.09 (4.5g, 0.0114mol)의 용액을 실온에서 45분간 교반한 후 농축건조시켜, 화합물 6.9 (4.5g, MH⁺= 295.1)를 수득하였다.

단계 H: 화합물 6.11

-20℃에서, 바닥이 둥근 100ml-플라스크내의 CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 Boc-페닐-글리신 화합물 6.1 (0.398g, 1.58mmol)의 교반 용액에 HOBT (0.258g,1.58mmol), EDCl (0.364g, 1.903mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.523ml, 4.759mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 5분간 교반한 후, 단계 G의 화합물 6.9 (0.5g, 1.51mmol) 및 CH₂Cl₂(5ml)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 밤새 냉동고내에 보관하였다. 상기 반응물을 농축건조시키고나서, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 2회 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.11 (0.75g, 수율 94%, MH⁺= 528.1)을 수득하였다.

단계 J: 화합물 6.12

4N HCl/디옥산 (21ml) 중의 단계 H의 화합물 6.11 (0.75g, 1.423mmol)의 용액을 실온에서 3시간 교반한 후 농축건조시켜, 화합물 6.12 (0.68g, 수율 100%)를 수득하였다.

단계 K: 화합물 6.14

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 화합물 6.13 (0.44g, 1.725mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.39g, 2.07mmol), HOBT (0.18g, 1.725mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.523ml, 4.76mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분간 교반한 후, CH₂Cl₂(7ml) 중의 단계 J의 화합물 6.12 (0.68g, 1.64mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 밤새 냉동고내에 보관하고나서, 농축건조시키고나서, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 2회 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.14 (0.59g, 수율 54%, MH⁺= 667.3)을 수득하였다.

단계 L: 화합물 6.15

CH₂Cl₂(20ml) 중의 단계 K의 화합물 6.14 (0.593g, 0.89mmol)의 교반용액에 데스-마틴 페리오디난 (Dess-Martin periodinane; 0.76g, 1.784mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, H₂O/CH₂Cl₂의 혼합물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 45분간 교반한 후, 50% 포화-NaHCO₃/50% Na₂S₂O₃(10ml)를 첨가하고나서, 1.5시간동안 추가로 교반하였다. 추가의 CH₂Cl₂을 상기 용액에 첨가한 후, 유기층을 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조한 후, 여과 및 농축건조시키고나서, 2.5% MeOH/97.5% CH₂Cl₂로 용출하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제하여, 화합물 6.15 (0.48g, 수율 82%)을 수득하였다.

단계 M: 화합물 6.16

무수 EtOH (10ml) 중의 단계 L의 화합물 6.15 (0.16g, 0.24mmol)의 교반 용액에 Pd/C (40.8mg)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 격렬하게 교반한 후, 1방울의 AcOH를 첨가하였다. 그리고나서, 상기 용액을 H₂가스하에 2시간 동안 교반하고나서, 셀라이트를 통과시켜 여과시킴으로써, 화합물 6.16 (0.133g, 수율 95%, MH⁺= 575.3)을 수득하였다.

단계 N: 화합물 6.18

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 화합물 6.17 (0.5g, 1.59mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.366g, 1.91mmol), HOBT (0.259g, 1.59mmol) 및 NMM (0.48g, 4.77mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분간 교반한 후, CH₂Cl₂(5ml) 및 단계 G의 화합물 6.9 (0.5g, 1.51mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 밤새 냉동고내에 보관하고나서, 농축건조시키고나서, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 2회 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.18 (0.95g, MH⁺= 592.1)을 수득하였다.

단계 O: 화합물 6.19

4N HCl/디옥산 (26ml) 중의 단계 N의 화합물 6.18 (0.93g, 1.58mmol)의 용액을 실온에서 2시간 교반한 후 농축건조시켜, 화합물 6.19 (0.96g, 수율 100%, MH⁺= 492.1)를 수득하였다.

단계 P: 화합물 6.20

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 화합물 6.13 (0.51g, 2.02mmol)의 교반 냉각 용액에 EDCl (0.46g, 2.42mmol), HOBT (0.33g, 2.02mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.61ml, 6.06mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분간 교반한 후, 단계 O의 화합물 6.19 (0.94g, 1.92mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 밤새 냉동고내에 보관하고나서, 농축건조시키고나서, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.20 (1.29g, 수율 87%)을 수득하였다.

단계 Q: 화합물 6.21

무수 EtOH (50ml) 중의 단계 P의 화합물 6.20 (1.27g, 1.74mmol)의 교반 용액에 Pd/C (100mg)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 격렬하게 교반한 후, 2방울의 AcOH를 첨가하였다. 그리고나서, 상기 용액을 2시간 동안 수소화하고, 셀라이트를 통과시켜 여과시킴으로써, 화합물 6.21 (1.07g, 수율 96%, MH⁺= 641.1)을 수득하였다.

단계 R: 화합물 6.22

-25℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 단계 Q의 화합물 6.21 (0.25g, 0.39mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.089g, 0.469mmol), HOBT (0.06g, 0.39mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.12g, 1.17mmol)을 첨가하고, 10분간 교반한 후, 단계 B의 화합물 6.3 (0.069g, 0.37mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -25℃에서 15분간 교반한 후, 밤새 냉장고내에 보관하고나서, 농축건조시키고나서, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 6.22를 수득하였다.

단계 S: 화합물 6.23

CH₂Cl₂(10ml) 중의 단계 R의 화합물 6.22 (0.23g, 0.302mmol)의 교반용액에 데스-마틴 페리오디난 (Dess-Martin periodinane; 0.256g, 0.60mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, H₂O/CH₂Cl₂의 혼합물을 첨가하고, 45분간 추가로 교반하였다. 상기 반응물에 50% 포화-NaHCO₃/50% Na₂S₂O₃(10ml)를 첨가하고나서, 1.5시간 교반하였다. 추가의 CH₂Cl₂을 상기 용액에 첨가한 후, 유기층을 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조한 후, 여과 및 농축건조시키고나서, 1 내지 3% MeOH/99 내지 97% CH₂Cl₂로 용출하는 실리카 겔상에서의 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제하여, 화합물 6.23 (0.08g, 수율 34%, MH⁺= 771.2)을 수득하였다.

제조 실시예 16

단계 A: 화합물 7.2

-20℃에서, CH₂Cl₂(60ml) 및 DMF (60ml) 중의 화합물 7.1 (0.476g, 1.51mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.351g, 1.81mmol), HOBT (0.246g, 1.51mmol) 및N-메틸 모르폴린 (0.458g, 4.53mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분간 교반한 후, 제조 실시예 15의 단계 F의 화합물 6.8 (0.5g, 1.51mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 3시간 동안 교반한 후, 밤새 냉장고내에 보관하고나서, 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄및 염수로 2회 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 7.2 (0.82g, 수율 94%, MH⁺= 592.1)를 수득하였다.

단계 B: 화합물 7.3

4N HCl/디옥산 (20ml) 중의 단계 A의 화합물 7.2 (0.82g, 1.39mmol)의 용액을 실온에서 2시간 교반한 후, 농축건조시켜 화합물 7.3 (0.84g, 수율 100%, MH⁺= 492.3)를 수득하였다.

단계 C: 화합물 7.4

-20℃에서, CH₂Cl₂(60ml) 및 DMF (60ml) 중의 화합물 6.13 (0.36g, 1.40mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.322g, 1.68mmol), HOBT (0.228g, 1.40mmol) 및 NMM (0.425g, 4.20mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 5분간 교반한 후, 단계 B의 화합물 7.3 (0.84g, 1.40mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 -20℃에서 3시간 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하고나서, 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 5% H₃PO₄, H₂O 및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 7.4 (0.57g, 수율 57%, MH⁺= 731.3)를 수득하였다.

단계 D: 화합물 7.5

CH₂Cl₂(5ml) 중의 단계 C의 화합물 7.4 (0.55g, 0.75mmol)의 교반용액에 데스-마틴 페리오디난 (0.64g, 1.50mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, H₂O/CH₂Cl₂의 혼합물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 45분간 교반하고, 50% 포화 NaHCO₃/50% Na₂S₂O₃를 첨가한 후에 1.5시간동안 추가로 교반시켰다. 추가의 CH₂Cl₂을 상기 용액에 첨가한 후, 유기층을 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조한 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 7.5 (0.24g, 수율 44%, MH⁺= 729.5)을 수득하였다.

단계 E: 화합물 7.6

무수 EtOH (20ml) 중의 단계 D의 화합물 7.5 (0.10g, 0.14mmol)의 교반 용액에 Pd/C (20mg)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 바닥이 둥근 100ml-플라스크내에서 격렬하게 교반한 후, H₂로 퍼지(purge)시킨 후, H₂대기하에 밤새 교반하였다. 상기 용액을 셀라이트를 통과시켜 여과시키고, EtOH로 세척하고 농축시켜, 화합물 7.6 (93mg, 수율 100%, MH⁺= 639.1)을 수득하였다.

제조 실시예 17

제조 실시예 16의 단계 A 내지 E와 본질적으로 동일한 방식으로, 단계 A의 화합물 7.1 대신에 화합물 8.1을 사용하여, 화합물 8.2 및 8.3을 제조하였다.

제조 실시예 18

단계 A: 화합물 9.2

벤젠 (350ml) 중의 (S)(+)-2-페닐 글리신 9.1 (15.0g, 0.099mol)의 교반 용액에 p-톨루엔 설폰산ㆍH₂O (20.76g, 0.116mol) 및 벤질 알코올 (30ml, 0.29mol)을 첨가하였다. 이렇게 수득된 용액을 밤새 가열 환류시켜, 상기 용액이 슬러리가 되었다. 그리고나서, 상기 용액을 실온으로 냉각시키고, 에테르를 첨가시켰다. 상기 고체를 소결된 깔때기 (funnel)을 통해 여과시키고, Et₂O로 2회 세척한 후, 질소 대기하에 건조시켜, 고체 (35.4g)를 수득하였다. 그리고나서, 상기 고체를 CH₂Cl₂중에 용해시키고, 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 상기 배합된 유기층을 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 농축 건조시켜, 자유 아민 (18.1g, 수율 75.7%)을 수득하였다. 그리고나서, 상기 자유 아민을 에테르 중에 용해시키고, 1N HCl을 포말시켜 백색 침전물을 형성하였다. 상기 침전물을 여과시키고, 에테르로 세척한 후, 진공 건조시켜, 화합물 9.2 (15.2g)를 수득하였다.

단계 B: 화합물 9.4

-20℃에서, 무수 CH₂Cl₂(100ml) 및 무수 DMF (100ml) 중의 Boc-gly-OH (9.3) (11.35g, 0.0648mol)의 교반 용액에 EDCl (13.6g, 0.0712mol), HOBT (10.5g, 0.065mol) 및 N-메틸 모르폴린 (21.3ml, 0.194mol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 단계 A의 화합물 9.2 (18.0g, 0.065mol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 -20℃에서 45분 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다. 상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O 및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축건조시켜, 화합물 9.4 (26.48g, 수율 100%, MH⁺= 399.2)를 수득하였다.

단계 C: 화합물 9.5

4N HCl/디옥산 (100ml) 중의 단계 B의 화합물 9.4 (26.4g, 0.065mol)의 용액을 실온에서 1시간 교반한 후 농축건조시켜, 화합물 9.5 (22.69g, 수율 100%, MH⁺= 299.1)를 수득하였다.

단계 D: 화합물 9.6

-20℃에서, CH₂Cl₂(150ml) 및 DMF (150ml) 중의 제조 실시예 15의 단계 E의화합물 1.08 (15.5g, 0.0627mol)의 교반 용액에 EDCl (13.2g, 0.069mol), HOBT (10.22g, 0.0626mol) 및 NMM (20.67g, 0.188mol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 단계 C의 화합물 9.5 (21.0g, 0.063mol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다. 상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O, 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축건조시켜, 화합물 9.6 (30.3g, 수율 92%, MH⁺= 528.1)를 수득하였다.

단계 E: 화합물 9.7

제조 실시예 18의 단계 C와 본질적으로 동일한 방식으로, 화합물 9.7 (30.0g, 수율 100%, MH⁺= 428.1)을 제조하였다.

단계 F: 화합물 9.9

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 Boc-His(Z)-OH (9.8) (0.5g, 1.28mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.27g, 1.41mmol), HOBT (0.209g, 1.28mmol) 및 NMM (0.42ml, 3.85mmol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 단계 E의 화합물 9.7 (0.673g, 1.28mmol)을 첨가하고, -20℃에서 2시간 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다. 상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O, 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축시켜, 화합물 9.9 (0.858g, 수율 84%, MH⁺= 799)를 수득하였다.

단계 G: 화합물 9.11

제조 실시예 18, 단계 C에서와 본질적으로 동일한 방식으로, 화합물 9.11 (0.76g, 수율 100%, MH⁺= 699.2)을 제조하였다.

단계 H: 화합물 9.12

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 N-Boc-사이클로헥실글리신 (0.263g, 1.026mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.216g, 1.13mmol), HOBT (0.167g, 1.026mmol) 및 NMM (0.338g, 3.078mmol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 단계 G의 화합물 9.11 (0.754g, 1.03mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다.상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O, 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축시켜, 화합물 9.12 (0.735g, MH⁺= 938.4)를 수득하였다.

단계 I: 화합물 9.13

무수 CH₂Cl₂(10ml) 중의 단계 H의 화합물 9.12 (0.367g, 0.377mmol)의 교반용액에 데스-마틴 페리오디난 (0.32g, 0.75mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 CH₂Cl₂, 포화 Na₂S₂O₄및 포화 NaHCO₃를 첨가하고, 이 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 물 및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조한 후, 여과 및 농축건조시켜, 조 생성물 (340mg)을 수득하였다. 그리고나서, 상기 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (CH₂Cl₂로 용출한 후, 4% MeOH/CH₂Cl₂로 용출)를 수행하여 정제하여, 화합물 9.13 (150mg, MH⁺= 936.3)을 수득하였다.

단계 J: 화합물 9.14

무수 EtOH (40ml) 중의 단계 I의 화합물 9.13 (0.15g, 1.6mmol)의 교반 용액에 50% H₂O 중의 10% Pd/C (w/w)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 N₂로 퍼지(purge)시킨 후, H₂ballon 하에 45분간 교반하였다. 상기 촉매를 셀라이트를 통과시켜 여과시키고, EtOH/CH₂Cl₂로 세척하고 농축시켜, 화합물 9.14 (0.116g, MH⁺= 712.2)을 수득하였다.

제조 실시예 19

단계 A: 화합물 10.2

무수 EtOH (200ml) 중의 L-3-(1-나프틸)알라닌 (2.0g, 9.34mmol)의 현탁액을 500ml-플라스크에 충진시켰다. 그리고나서, 상기 용액에 무수 농축 HCl (2ml)을첨가하여 모든 고체를 용해시켰다. 상기 용액을 45분간에 걸쳐 실온으로 냉각시킨 후, 농축 건조시키고, EtOH (50ml), 10% Pd/C (300mg) 및 5% Rh/C (300mg)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 parr 교반기에 위치시킨 후, 60 psi에서 수소화시켰다. 그리고나서, 상기 반응물을 셀라이트를 통과시켜 여과한 후, EtOH로 세척하고, 농축건조시켜, 조 물질 (2.4g, MH⁺= 254.2)을 수득하였다. 상기 조생성물을 CH₂Cl₂중에 용해시킨 후, 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 상기 배합된 유기층을 농축건조시키고, 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (5 내지 20% EtOH/CH₂Cl₂를 이용하여 용출)를 수행하여, 화합물 10.2 (0.65g)을 수득하였다.

단계 B: 화합물 10.3

-20℃에서, CH₂Cl₂(5ml) 및 DMF (5ml) 중의 N-Boc-사이클로헥실글리신 (0.643g, 2.5mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.527g, 2.75mmol), HOBT (0.407g, 2.5mmol) 및 NMM (0.825ml, 7.5mmol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 단계 A의 화합물 10.2 및 CH₂Cl₂(3ml)을 첨가한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다. 상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O, 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축시켜, 화합물 10.3 (1.12g, 수율 92%)를 수득하였다.

단계 C: 화합물 10.4

MeOH (30ml) 및 H₂O (7.5ml) 중의 단계 B의 화합물 10.3 (1.1g, 2.25mmol)의 교반 용액에 LiOH (0.283g, 6.75mmol)를 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액에 실온에서 밤새 교반한 후, 5% H₃PO₄를 첨가하였다. 침전물이 생성되고, 상기 용액을 증발시켜 대부분의 MeOH를 제거하였다. 추가의 CH₂Cl₂을 첨가하고나서, CH₂Cl₂층을 분리한 후에 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후, 여과 및 농축건조시켜, 화합물 10.4 (1.068g, 수율 100%, MH⁺= 459.1)를 수득하였다.

단계 D: 화합물 10.5

CH₂Cl₂(10ml) 및 DMF (10ml) 중의 단계 C의 화합물 10.4 (1.0g, 2.17mmol)의 교반 용액에 EDCl (0.457g, 2.38mmol), HOBT (0.353g, 2.17mmol) 및 NMM (0.715ml, 6.51mmol)을 첨가하였다. 상기 수득한 용액을 -20℃에서 10분간 교반한 후, 제조 실시예 18의 단계 E의 화합물 9.7 (1.13g, 2.17mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 -20℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, 밤새 냉동고 내에 보관하였다. 상기 용액을 농축건조시킨 후, EtOAc-포화 NaHCO₃로 추출하였다. 그리고나서, 상기 배합 유기층을 H₂O, 5% H₃PO₄및 염수로 세척하고 나서, Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 농축시켜, 화합물 10.5 (1.8g, M⁺Na = 890.4)를 수득하였다.

단계 E: 화합물 10.6

무수 CH₂Cl₂(40ml) 중의 단계 D의 화합물 10.5 (1.8g, 2.07mmol)의 교반용액에 데스-마틴 페리오디난 (1.76g, 4.15mmol)을 첨가하였다. 이렇게 수득한 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 무수 CH₂Cl₂(40ml) 및 H₂O (0.074ml)를 1.5시간에 걸쳐 적가한 후에 2시간 동안 교반하였다. 그리고나서, 상기 용액에 50%-포화 Na₂S₂O₄/50%-포화 NaHCO₃(40ml)를 첨가하고, 이 용액을 30분간 격렬하게 교반하였다. 유기층을 분리하고, 물로 세척하였다. 상기 배합된 유기층을 농축건조시키고, 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (2 내지 3% MeOH/CH₂Cl₂로 용출)를 수행하여 정제하여, 화합물 10.6 (0.95g, MH⁺= 866.2)을 수득하였다.

단계 F: 화합물 10.7

제조 실시예 18, 단계 K에서와 본질적으로 동일한 방식으로, 화합물 10.7을 제조하였다.

실시예

커플링의 경우에는 제조 실시예 1의 단계 A, 제조 실시예 2의 단계 F의 공정을 이용하고; 에스테르 탈보호의 경우에는 제조 실시예 1의 단계 B, 제조 실시예 1의 단계 F, 제조 실시예 2의 단계 D 및 제조 실시예 4의 단계 J를 이용하며; 아민 탈보호에 경우에는 제조 실시예 2의 단계 E 및 제조 실시예 4의 단계 J를 이용하고; 하이드록시아미드를 케토아미드로 산성화하는 데에는 제조 실시예 4의 단계 H를 이용하며, 상기 실시예 또는 상업적으로 입수가능하거나 문헌에 기재된 알파-아미노산과 함께, 필수적인 다양한 배합을 통해, 아래의 표 2에 나열된 화합물을 제조하였다.

고체상 합성

고체상 커플링 반응을 위한 일반적인 공정

바닥에 폴리프로필렌 프릿 (frit)으로 적정화된 폴리프로필렌 시린지 카트리지로부터 작제된 반응 용기내에서 본 합성공정이 수행되었다. Fmoc-보호된 아미노산을 표준 고체상 기법하에서 커플링하였다. 각 반응 용기에 Fmoc-Sieber 수지 100mg (약 0.035mmol)을 부하하였다. 상기 수지를 DMF 2ml 부로 세척(2회)하였다. DMF 중의 피페리딘 20% v/v 용액 2ml으로 20분간 처리하여 상기 Fmoc-보호 그룹을 제거하였다. 상기 수지를 DMF 2ml 부로 세척(4회)하였다. 상기 커플링은, Fmoc-아미노산 12mmol, HATU [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트] 0.12mmol, 및 DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민) 0.24mmol을 사용하여, DMF (2ml) 중에서 수행되었다. 상기 반응 용기를 2시간 동안 흔든 후 배수시키고, 상기 수지를 DMF 2ml 부로 세척 (4회)하였다. 후속 Fmoc-아미노산 또는 캡핑 그룹(capping group)을 이용하여 상기 커플링 사이클을 반복하였다.

고체상 데스-마틴 산성화의 일반적인 공정

바닥에 폴리프로필렌 프릿으로 적정화된 폴리프로필렌 시린지 카트리지로부터 작제된 반응 용기내에서 본 합성공정이 수행되었다. 수지-부착된 하이드록시 화합물 (약 0.035mmol)을 DCM 2ml 중의 t-BuOH 0.14mmol 및 데스-마틴 페리오디난 0.14mmol의 용액으로 4시간 동안 처리하였다. 상기 수지를 DCM 중의 iPrOH의 20% v/v 용액, THF, 물 (4회), THF (4회) 및 DCM (4회) 중의 THF의 50% v/v 용액의 2ml 부로 세척하였다.

제조 실시예 20: N-Fmoc-2',3'-디메톡시페닐글리신 화합물 901

물 (15ml) 중의 암모늄 카보네이트 (5.045g, 52.5mmol) 및 칼륨 시아나이드 (1.465g, 22.5mmol)의 용액에 에탄올 (15ml) 중의 2,3-디메톡시벤즈알데히드 901A (2.5g, 15mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 24시간에 걸쳐 40℃에서 가열하였다. 상기 용액을 감압하에서 증발시킴으로써, 상기 용액의 부피를 10ml로 감소시켰다. 농축 염산 (15ml)을 첨가한 후, 백색 침전물로서의 화합물 901B를 수득하였다. 화합물 901B (2.2g, 9.3mmol)를 여과 분리하였다. 화합물 901B를 10% w/w 나트륨 하이드록시드 수용액 (15ml)에 용해시키고, 이렇게 수득한 용액을 24시간 동안 환류 가열시켰다. 농축 염산을 첨가하여 pH를 중성 (pH = 7)로 조정하였다. 화합물 901C를 함유하는 상기 용액을 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 5% w/w 중탄산나트륨 용액 (150ml)에 용해시켰다. 상기 용액을 빙조내에서 0℃로 냉각시키고, 1,4-디옥산 (30ml)과 1,4-디옥산 (30ml) 중의 9-플루오레닐메틸 석신이미딜 카보네이트 (2.7g, 8mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 방치한 후, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 1,4-디옥산을 감압하에 증발시켰다. 상기 수용액을 디에틸 에테르로 세척하였다. 농축 염산을 첨가하여, pH를 산성 (pH = 1)으로 조정하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고, 유기층을 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 상기 용매를 감압하에 증발시켜, 백색 포말 고체로서의 목적하는 화합물 901 (3.44g, 7.9mmol)을 수득하였다: MS(LCMS-전자분무) 434.1 MH⁺

제조 실시예 21: 화합물 801

무수 아세톤 빙조내에서 -30℃로 냉각된 무수 DCM (22ml) 중의 N-Fmoc-페닐알라닌 801A (5g, 12.9mmol)의 용액에 N-메틸피롤리딘 (1.96ml, 16.1mmol) 및 메틸 클로로포르메이트 (1.2ml, 15.5mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 -30℃에서 1시간 동안 교반한 후, 무수 DCM (8ml) 중의 N-메틸피롤리딘 (1.96ml, 16.1mmol) 및 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드 (1.51g, 15.5mol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온이 되도록 한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 톨루엔을 첨가하고, 유기층을 희석 염산, 중탄산 나트륨 수용액 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시켰다. 상기 용매를 감압하에 증발시켜, 화합물 801B (4g, 9.29mmol)를 수득하였다.

무수 아세톤 빙조내에서 -20℃로 냉각된 무수 톨루엔 (8ml) 중의 Red-Al (6.28ml, 21.4mmol)의 용액에 무수 톨루엔 (12ml) 중의 화합물 801B (4g, 9.29mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 -20℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 유기층을 희석 염산, 중탄산나트륨 수용액 및 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시키고, 조 생성물 801C를 추가 정제없이 후속 반응에서 사용하였다.

헥산 (15ml) 중의 화합물 801C (약 9.29mmol)의 용액에, 물 (4ml) 중의 테트라부틸암모늄 요오다이드 (34mg, 0.092mmol) 및 칼륨 시아나이드 (24mg, 0.37mmol)의 용액과 아세톤 시아노히드린 (1.27ml, 13.9mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고, 유기층을 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜, 화합물 801D (2.4g, 6.03mmol)를 수득하였다.

1,4-디옥산 (11ml) 중의 화합물 801D (2.4g, 6.03mmol)의 용액에 농축 염산 (11ml)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 가열하였다. 에틸 아세테이트 (25ml) 및 물 (25ml)을 첨가하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜, 백색 포말 고체로서의 목적하는 화합물 801 (2g, 4.8mmol)을 수득하였다: MS (LCMS-전자분무) 418.1 MH⁺

실시예 101J: 화합물 101J

Fmoc-Sieber 수지 (0.035mmol) 100mg으로 시작된 고체상 커플링 반응을 위한 일반적인 공정에 따라, 수지-부착된 화합물 101B, 101C, 101D, 101E, 101F 및 101G를 제조하였다. 고체상 데스-마틴 산화를 위한 일반적인 공정에 따라, 수지-부착된 화합물 101G를 수지-부착된 화합물 101H로 산화시켰다. DCM 중의 TFA 2% v/v 용액 4ml를 5분에 걸쳐 수지-부착된 화합물 101H에 처리하였다. 여과물을 AcOH 1ml에 첨가하고, 상기 용액을 진공원심분리로 농축시켜 화합물 101J (0.011g, 수율 45%)를 수득하였다: MS (LCMS-전자분무) 703.2 MH⁺

상기 정의된 고체상 합성기법을 사용하여, 아래 구조식의 잔기를 제조 및 사용하였다:

P1a 및 P1b 중 하나는 -H이고, 다른 하나는 아래의 화합물 중에서 선택되고:

상기 기술한 공정을 이용하여, 아래의기 표 3에 기재된 활성 데이터를 갖는 화합물을 제조하였다.

또한, 아래의 표 4에 기재된 활성 데이터를 갖는 화합물을 추가로 제조하였다. 이 제조방법은 아래에 기재되어 있다.

표 4에 기재된 화합물을 고체 지지체상에서 제조하는 일반적인 공정

고체상 합성법은 본 발명의 소정의 화합물을 소량 제조하는 데에 유용하다. 기존의 펩티드 고체상 합성법에서와 같이, 펩티딜 케토아미드의 고체상 합성법을 위한 반응기는 용매 및 용해된 시약에 침투가능하지만 선택된 메쉬 크기의 합성 수지에는 침투 불가능한 하나 이상의 표면을 가진 반응기 용기를 포함한다. 이러한 반응기에는, 소결된 유리 프릿을 가진 유리 고체상 반응 용기, 프릿을 가진 폴리프로필렌 튜브 또는 칼럼, 반응기 Kans^TM(미국 캘리포니아주 샌디아고 소재의 Irori Inc.에서 제조)가 포함된다. 선택되는 반응기 유형은 필요한 고체상 수지의 부피에 따라 결정되며, 상이한 유형의 반응기가 상이한 합성 단계에서 사용되게 된다. 아래의 공정은 추후 실시예에서 인용될 것이다:

공정 A (커플링 반응):

N-메틸피롤리딘 (NMP) (10-15ml/수지 g) 중에 현탁된 수지에 N-Fmoc 또는 N-Boc-아미노산 (2당량), HOAt (2당량), HATU (2당량) 및 디이소프로필에틸아민 (4당량)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 4 내지 48시간 동안 반응하도록 하였다. 상기 반응물을 배출시키고, 상기 수지를 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 메탄올, 디클로로메탄 및 디에틸에테르 (용매 10 내지 15ml/수지 g을 사용)로 순차적으로 세척하였다. 그리고나서, 상기 수지를 진공건조시켰다.

공정 B (Fmoc 탈보호):

30분에 걸쳐 상기 Fmoc-보호된 수지를 디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘 (시약 10ml/수지 g)에 처리하였다. 상기 시약을 배출시키고, 상기 수지를 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 메탄올, 디클로로메탄 및 디에틸에테르 (용매 10ml/수지 g을 사용)로 순차적으로 세척하였다.

공정 C (Boc 탈보호):

20 내지 60분에 걸쳐, Boc-보호된 수지에 디클로로메탄과 트리플루오로아세트산의 1:1 혼합물을 처리하였다 (용매 10ml/수지 g을 사용). 상기 시약을 배출시키고, 상기 수지를 디클로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸포름아미드 중의 5% 디이소프로필에틸아민, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 디메틸포름아미드 (용매 10ml/수지 g을 사용)로 순차적으로 세척하였다.

공정 D (세미카바존 가수분해):

2시간에 걸쳐, 트리플루오로아세트산:피루브산:디클로로메탄:물 (9:2:2:1)로 이루어진 절단 칵테일 (10ml/수지 g) 주에 상기 수지를 현탁시켰다. 상기 반응물을 배출시키고, 상기 공정을 3회 추가로 반복하였다. 상기 수지를 디클로로메탄, 물 및 디클로로메탄으로 순차적으로 세척하고나서, 진공건조시켰다.

공정 E (HF 절단):

작은 교반 막대를 가진 HF 용기내에, 건조시킨 펩티드-nVal(CO)-G-O-PAM 수지 (50mg)을 위치시켰다. 아니솔 (총부피의 10%)을 스캐빈저(scavenger)로서 첨가시켰다. 글루탐산 및 시스테인 아미노산의 존재하에, 티오아니솔 (10%) 및 1,2-에탄디티올 (0.2%)을 첨가시켰다. 그리고나서, HF 용기를 HF 장치 (Immuno Dynamics)에 연결하고, 5분에 걸쳐 상기 시스템에 질소를 듬뿍 첨가하였다. 그리고나서, 드라이아이스/이소프로판올 조를 사용하여 -78℃로 냉각시켰다. 20분 경과후, HF를 목적하는 부피(HF 10ml/수지 g)로 증류시켰다. 0℃에서 1.5시간 동안 상기 반응이 지속되도록 하였다. 질소를 사용하여 모든 HF를 제거하는 공정을 거쳤다. 그리고나서, 디클로로메탄을 상기 수지에 첨가하고, 상기 혼합물을 5분간 교반시켰다. 그리고나서, 물 (4ml) 중의 20% 아세트산을 첨가하였다. 20분간 교반한 후, 프릿된 깔때기를 사용하여 상기 수지를 여과시킨 후, 디클로로메탄을 감압하에 제거하였다. 상기 스케빈저를 제거하기 위해, 잔류하는 용액을 헥산 (3×)으로 세척하였다. 그 동안, 상기 수지는 1ml 메탄올내에 침지시켰다. 수성층 (20% HOAc)을 상기 수지에 다시 첨가한 후, 혼합물을 5분간 교반하고나서 여과시켰다. 메탄올을 감압하에 제거하고, 수성층을 동결건조시켰다. 그리고나서, 상기 펩티드를 10 내지 25% 메탄올 (0.1% 트리플루오로아세트산을 함유) 중에 용해시키고, 역상 HPLC로 정제하였다.

II) 중간체의 합성:

실시예 1: Boc-3-알킬설피닐알라닌의 합성

0℃에서, 10분에 걸쳐 테트라하이드로푸란 (30ml) 중의 나트륨 하이드리드 (20mmol, 오일 중 60% 800mg, 헥산으로 세척)의 혼합물에 알킬티올 (20mmol, R = Ph, R = 1-나프틸, R = 2-나프틸, R = PhCH₂CH₂또는 R = Et)을 첨가하였다. 냉조를 제거하고, 10분간 계속 교반하면서 Boc-2S-아미노프로피오닐 락톤 (3.74g, 20mmol) {참조: Synthetic Communications, 1995, 25(16), 2475-2482}을 첨가하였다. 빙조를 사용하여 온도가 30℃가 넘지 않도록 하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 농축시키고나서, 1M 수성 칼륨 바이설페이트 (200ml) 및 1M HCl (40ml) 중에 용해시켰다. 상기 혼합물을 디클로로메탄 (2×200ml)으로 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 건조시키고 (황산나트륨), 여과 농축시켰다. 잔류물을 물 (200ml), 메탄올 (30ml) 및 탄산칼륨 (40mmol, 5.5g) 중에 용해시켰다. 실온을 유지하도록 냉각시키면서 옥손 (21mmol, 13.0g)을 부 단위로 첨가하였다. 상기 혼합물을 18시간 동안 교반한 후, 진공농축시켜 메탄올을 제거하였다. 상기 용액을 2M 칼륨 바이설페이트 (pH = 1)로 산성화하고나서, 에틸 아세테이트 (2×100ml)로 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 건조시키고 (황산나트륨), 여과 농축시켰다. 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제 후, 상기 생성물을 산염기 추출법을 통해 추가 정제하여 데-보실화된 물질을 제거하고나서, 디이소프로필에틸 암모늄염으로서 저장하여 추가의 분해(Boc 그룹의 상실)를 방지하였다.

실시예 2: 2-(1-메틸에틸)-7-메틸-옥트-4-에온산의 합성

공개된 공정 {참조: Wuts, P.G.M.; Ritter, A.R.; Pruitt, L.E., J.Org.Chem.(1992) 57, 6696-6700}에 따라 상기 중간체를 합성하였다.

실시예 3: Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH의 합성 (아래의 단계 1 내지 7)

단계 1: 알릴 이소시아노아세테이트의 합성 (아래의 단계 a 내지 b)

a) 이소시아노아세트산 칼륨염의 합성

에탄올 (1.5ℓ) 및 칼륨 하이드록시드 (59.52g, 1.0mol)의 냉용액에 에틸 이소시아노아세테이트 (96.9ml, 0.88mol)를 첨가하였다. 상기 반응물을 실온으로 천천히 가열하였다. 2시간 경과후, 상기 침전물을 여과 수집하고, 냉(chilled) 에탄올 몇 부(portion)로 세척하였다. 이렇게 수득한 이소시아노아세트산의 칼륨염을 진공건조시켜 금갈색 고체 (99.92g, 91.8%)를 수득하였다.

b) 알릴 이소시아노아세테이트의 합성

아세토니트릴 (810ml) 중에 용해된 상기 a)의 생성물 (99.92g, 0.81mol)에 알릴 브로마이드 (92ml, 1.05mol)를 첨가하였다. 4시간 동안 환류가열하여, 진한 갈색의 용액을 수득하였다. 상기 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 에테르 (1.5ℓ)에 용해시키고, 물 (3×500ml)로 세척하였다. 유기층을 건조, 여과 및 농축시켜, 진한 갈색의 시럽을 수득하였다. 조 생성물을 7mm Hg (98℃)에서 진공증류시켜 투명 오일 (78.92g, 78%)을 수득하였다. NMR ppm(CDCl₃): 5.9(m, 1H), 5.3(m, 2H), 4.7(d, 2H), 4.25(s, 2H).

단계 2: 9-플루오레닐메톡시카보닐-노르발리날의 합성 (아래의 단계 a 내지 c)

a) 9-플루오레닐메톡시카보닐-L-노르발린 메틸 에스테르 (Fmoc-nVal-OMe)의 합성

1시간에 걸쳐, 무수 메탄올 (469ml) 중의 상업적으로 입수가능한 Fmoc-L-노르발린 (25g, 73.75mmol)의 냉용액에 티에닐 클로라이드 (53.76ml, 737.5mmol)를 첨가하였다. 1시간 이후에 수행된 에틸아세테이트 중에서의 TLC를 통해 반응 종료 (R_f= 0.85)를 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 에틸아세테이트 중에 용해시켰다. 상기 유기층을 포화 중탄산나트륨 (3×200ml)으로 세척한 후에 염수 (200ml)로 세척하였다. 상기 유기층을 건조, 여과 및 농축시켜, 정량 수율의 백색 고체로서의 Fmoc-norVal-OMe (26.03g)를 수득하였다. NMR ppm(CD₃OD): 7.7(m, 2H), 7.6(m, 2H), 7.4(m, 2H), 7.3(m, 2H), 4.3(m, 2H), 4.1(m, 2H), 3.7(s, 3H), 1.7(m, 1H), 1.6(m, 1H), 1.4(m, 2H), 0.95(t, 3H)

b) 9-플루오레닐메톡시카보닐-노르발리놀 (Fmoc-nValinol)의 합성

테트라하이드로푸란 (123ml) 및 메탄올 (246ml) 중의 Fmoc-nVal-OMe (26.03g, 73.75mmol)에 칼슘 클로라이드 (16.37g, 147.49mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 나트륨 보로하이드리드 (11.16g, 294.98mmol)를 몇몇 배치 (batch)에 첨가하였다. 수득한 상기 진한 페이스트에 메탄올 500ml를 첨가하고, 반응물을 실온에서 90분간 교반시켰다. 에틸아세테이트:헥산 (2:3) 중에서의 TLC를 통해 반응 종료 (R_f= 0.25)를 확인하였다. 0℃에서 상기 반응물에 물 100ml를 서서히 첨가하며 급냉시켰다. 상기 메탄올을 감압하에 제거하고, 남은 수성상을 에틸아세테이트로 희석시켰다. 상기 유기층을 물 (3×500ml), 포화 중탄산 나트륨 (3×500ml) 및 염수 (500ml)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜, 백색 고체 (21.70g, 90.5%)를 수득하였다. NMR ppm(CD₃OD): 7.8(m, 2H), 7.7(m, 2H), 7.4(m, 2H), 7.3(m, 2H), 4.3-4.5(m, 2H), 4.2(m, 1H), 3.6(s, 1H), 3.5(s, 2H), 1.5(m, 1H), 1.3-1.4(m, 3H), 0.99(m, 3H)

c) 9-플루오레닐메톡시카보닐-노르발리날 (Fmoc-nVal-CHO)의 합성

디클로로메탄 (668ml) 중의 Fmoc-norValinol (21.70g, 66.77mmol)의 용액에 트리에틸아민(37.23ml, 267mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 0℃로 냉각시켰다. 디메틸설폭시드 (96ml) 중의 피리딘 황 트리옥시드 복합체 (42.51g, 267mmol)의 현탁액을 상기 냉용액에 첨가하였다. 1시간 경과후, 에틸아세테이트:헥산 (2:3) 중에서의 TLC를 통해 반응 종료를 확인하였다. 상기 디클로로메탄을 감압하에 제거하고, 잔류물을 에틸아세테이트 중에 용해시킨 후, 물 (2×50ml), 1N 포화 중탄산나트륨 (2×50ml), 포화 중탄산 나트륨 (2×50ml) 및 염수 (50ml)로 세척하였다. 유기층을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 이론적인 수율 (21.57g)을 가정하였으며, 상기 반응물을 추가 정제없이 후속 단계에서 사용하였다.

단계 3: 디페닐메틸 세미카바지드 (dpsc) 트리플루오로아세테이트염의 합성(아래의 단계 a 및 b)

a) Boc-세미카바지드-4-일 디페닐메탄의 합성

디메틸포름아미드 (225ml) 중의 카보닐디이미다졸 (16.2g, 0.10mol)의 용액에 디메틸포름아미드 (225ml) 중의 3차 부틸 카바제이트 (13.2g, 0.100mol)를 30분에 걸쳐 적가하였다. 디페닐메틸아민 (18.3g, 0.10mol)을 30분에 걸쳐 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (10ml)을 첨가하고, 이 혼합물을 감압하에 농축시켜 약 150ml가 되도록 하였다. 이 용액을 물 (500ml)에 부은 후, 에틸 아세테이트 (400ml)로 추출하였다. 상기 에틸아세테이트 상을 1N HCl (2×75ml), H₂O (2×75ml), 포화 중탄산나트륨 용액 (2×75ml), 및 나트륨 클로라이드 (2×75ml)로 세척하고, 마그네슘 설페이트로 건조시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 상기 용액을 농축시켜, 백색 포말 29.5g (수율 85%)을 수득하였다. 이 물질을 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정하여 정제할 수 있으며, 이는 후속 단계에서 직접 사용할 수 있을 정도로 정제된 것이다: mp = 142-143℃. 1H NMR (CDCl₃) d 1.45(s, 9H), 6.10(dd, 2H), 6.42(s, 1H), 6.67(bs, 1H), 7.21-7.31(m, 10H). C₁₉H₂₃N₃O₃의 분석치: C 66.84, H 6.79, N 12.31; 실측치: C 66.46, H 6.75, N 12.90

b) 디페닐메틸 세미카바지드 (dpsc) 트리플루오로아세테이트염의 합성

실온에서 디클로로메탄 (12.5ml) 중의 Boc-세미카바지드-4-일 디페닐메탄 (3.43g, 10mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (12.5ml)을 처리하고, 30분간 교반하였다. 상기 용액을 에테르 75ml에 적가하고나서, 수득한 고체 (2.7g, 80%)를 여과 수집하였다. mp = 182-184℃.¹H NMR (CD₃OD) d 6.05(s, 1H), 7.21-7.35(m, 10H).¹³C NMR (CD₃OD) d 57.6, 118.3(q, CF₃), 126.7, 127.9, 141.6, 156.9, 160.9 (q, CF₃CO₂H)

단계 4: Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O 알릴의 합성

디클로로메탄 (170ml) 중의 Fmoc-nVal-CHO (실시예 3, 단계 2c)(5.47g, 16.90mmol)의 용액에 알릴 이소시아노아세테이트 (실시예 3, 단계 1b)(2.46ml, 20.28mmol) 및 피리딘 (5.47ml, 67.61mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 0℃로 냉각시키고, 트리플루오로아세트산 (3.38ml, 33.80mmol)을 적가하였다. 상기 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 중에서 수행된 TLC를 통해 반응 종료를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 헥산 중의 20 내지 70% 에틸 아세테이트를 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 수집하여 농축시켜 백색 포말 (6.88g, 87.3%)을 수득하였다. 에틸아세테이트:헥산 (1:1) 중에서의 TLC는 하나의 점 (R_f= 0.37)을 나타내었다. NMR ppm(CD₃OD): 7.8(m, 2H), 7.65(m, 2H), 7.4(m, 2H), 7.3(m, 2H), 5.9(m, 1H), 5.1-5.4(m, 2H), 4.55-4.65(m, 2H), 4.3-4.4(m, 2H), 4.15-4.25(m, 1H), 4.01(s, 1H), 3.9-4.0(m, 3H), 1.5-1.6(m, 2H), 1.35-1.45(m, 3H), 0.9(m, 3H)

단계 5: Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O 알릴의 합성

디메틸설폭시드 (100ml) 및 톨루엔 (100ml) 중의 Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O알릴 (단계 4) (5.01g, 10.77mmol)의 용액에 EDC (20.6g, 107.7mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후, 디클로로아세트산 (4.44ml, 53.83mmol)을 적가하였다. 반응물을 0℃에서 15분간 교반한 후, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (70ml)을 0℃에서 첨가한 후, 톨루엔을 감압하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 포화 중탄산나트륨 용액으로 수회 세척한 후에 1N 나트륨 바이설페이트 및 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 이론적인 수율 (4.99g)을 가정하였으며, 상기 반응물을 추가 정제없이 후속 단계에서 사용하였다. 에틸아세테이트/헥산 (1:1) 중에서의 TLC는 하나의 점 (R_f= 0.73)을 나타낸다.

단계 6: Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O알릴의 합성

에탄올 (130ml) 및 물 (42ml) 중의 Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O알릴 (단계 5)(4.99g, 10.75mmol)의 용액에 디페닐메틸세미카바지드(dpsc) 트리플루오로아세테이트 염 (실시예 3, 단계 3b)(7.6g, 21.5mmol) 및 나트륨 아세테이트ㆍ3H₂O (1.76g, 12.9mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 90분동안 환류하에 가열하였다. 에틸아세테이트:헥산(1:1) 중에서 수행한 TLC에 의해 반응 종료를 확인하였다. 에탄올을 감압하에 제거하고, 잔류물을 에틸아세테이트 중에서 용해시킨 후, 1N 나트륨 바이설페이트 (2×10ml), 포화 중탄산나트륨 (2×10ml) 및 염수 (2×10ml)로 세척하였다. 유기층을 건조, 여과 및 농축시켰다. 수득한 잔류물을 헥산 중의 20 내지 50% 에틸아세테이트 중에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체 (5.76g, 78%)를 수득하였다. 에틸아세테이트/헥산 (1:1) 중에서의 TLC에서는 2개의 점 (시스 및 트랜스 이성체; R_f= 0.42 및 0.50)을 나타내었다.

단계 7: Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH의 합성

테트라하이드로푸란 (300ml) 중의 Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O알릴(실시예 3, 단계 6) (4.53g, 6.59mmol)의 용액에 디메돈 (4.62g, 32.97mmol)을 첨가한 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 촉매 (0.76g, 0.66mmol)를 첨가하였다. 90분 후, TLC (9:1 디클로로메탄:메탄올)를 통해 반응종료를 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 에틸아세테이트에 용해시키고나서, 0.1M 칼륨 바이포스페이트 (3×50ml)로 세척하였다. 그리고나서, 유기층에 나트륨 바이설파이트 50ml을 처리하고, 상기 2가지의 상 시스템을 15분간 교반하였다. 상기 상을 분리하고, 상기 공정을 2회 추가로 반복하였다. 상기 유기층을 건조, 여과 및 농축시키고, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (헥산 중의 20 내지 100% 에틸아세테이트, 그리고나서 9:1 디클로로메탄:메탄올)를 수행하여 백색 고체 (3.99g, 94%)를 수득하였다. TLC (9:1 디클로로메탄:메탄올)에서는 2개의 점 (시스 및 트랜스 이성체)을 나타낸다. NMR δppm(CD₃OD): 7.75(m, 2H), 7.6(m, 3H), 7.2-7.4(m, 14H), 6.1-6.2(m, 1H), 4.25-4.4(m, 2H), 4.1-4.2(m, 2H), 3.85(s, 2H), 1.6-1.8(m, 2H), 1.3-1.5(m, 2H), 0.95(t, 3H)

실시예 4: H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성 (아래의 단계 1 및 2)

단계 1: H-Phg-MBHA 수지의 합성

상업적으로 입수가능한 MBHA 수지 (2.6g, 1.12mmol/g, 2.91mmol)를, 질소 출입구를 갖춘 250ml-프릿된(fritted) 고체상 반응 용기로 옮겼다. 그리고나서, 이를 30ml 부의 디클로로메탄, 메탄올, 디메틸포름아미드 및 디클로로메탄으로 완전히 세척하고나서, 공정 A에 따라 상업적으로 입수가능한 Fmoc-Phg-OH (2.17g, 5.82mmol)에 18시간에 걸쳐 99.82%의 효율로 커플링시켰다. 공정 B에 따라, 상기 수지를 Fmoc 탈보호시켰다. 소량의 검체(aliquot)에 대한 닌히드린 정성분석에서 진한 청색의 수지 및 용액을 얻음으로써 반응이 성공적이었음을 알 수 있었다.

단계 2: H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

공정 A에 따라, 상기 단계 1에서 얻은 수지 (2.6g, 0.8mmol/g, 2.91mmol)를 Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH (실시예 3, 단계 7)(5.82mmol, 3.77g)와 반응시켰다. 18시간 경과후, 닌히드린 정량분석에서 커플링 효율이 99.91%임을 나타내었다. 공정 B에 따라, 상기 수지에 대해 Fmoc 탈보호시켰다. 소량의 검체에 대한 닌히드린 정성분석에서 진한 청색의 수지 및 용액을 얻음으로써 반응이 성공적이었음을 알 수 있었다.

III) 대표적인 C형 간염 표적의 고체상 어셈블리

실시예 5: 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH ₂ 의 고체상 합성 (아래의 단계 1 내지 5)

단계 1: Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

화합물 H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지 (실시예 4, 단계 2) (1.5g, 1.12mmol/g, 1.68mmol)을 프릿된 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, 공정 A에 따라 N-Fmoc-Leu-OH (890mg, 2.52mmol)에 커플링시켰다. 18시간 경과후, 닌히드린 정성분석에서 무색 비드 및 용액을 나타내었다.

단계 2: Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

공정 B에 따라, 실시예 5, 단계 1에서 수득한 수지 Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA (1.68mmol)을 Fmoc 탈보호시켰다. 그리고나서, 상업적으로 입수가능한 Fmoc-G(Chx)-OH (0.956g, 0.252mmol)를 공정 A에 따라 커플링시켰다. 18시간 경과후, 닌히드린 정량분석에서 98%의 커플링 효율을 나타내었다.

단계 3: 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal

(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

공정 B에 따라, 실시예 5, 단계 2에서 수득한 수지 Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA를 Fmoc 탈보호시켰다. 소량의 검체에 대한 닌히드린 분석을 통해 진한 청색의 수지 및 용액을 수득하여, 반응이 성공적임을 알 수 있었다. NMP 1ml에 현탁시킨 상기 수지 (150mg, 0.168mmol)에 3,6-디플루오로프탈 무수물 (91mg, 0.42mmol)을 첨가한 후, 디이소프로필에틸아민 (0.146ml, 84mmol)을 첨가하고나서, 상기 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 흔들었다. 닌히드린 정량분석에서 97.8%의 커플링 효율을 나타내었다.

단계 4: 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

실시예 5, 단계 3의 화합물인 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지 (200mg)을 세미카바존 (semicarbazone) 가수분해 공정 D를 거치게 하였다.

단계 5: 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-NH ₂ 의 합성

실시예 5, 단계 4의 2,5-디플루오로-6-하이드록시카보닐페닐카보닐-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA 수지 (100mg)를 HF 절단 조건 (공정 E)을 거치게 하여 목적하는 조 생성물을 수득하였다. 상기 물질을 HPLC {세공 크기 300Å인 10 마이크론 크기의 젤 입자를 포함하는 C-18 수지를 함유하는 2.2×25cm 역상 칼럼을 사용; 물 중의 20-50% 아세토니트릴을 이용한 농도 구배로 용출시킴}를 통해 정제하였다. 분석 HPLC {세공 크기 300Å인 5 마이크론 크기의 젤 입자를 포함하는 C-18 수지를 함유하는 4.6×250mm 역상 칼럼을 사용; 물 중의 10-60% 아세토니트릴 (0.1% 트리플루오로아세트산을 함유)을 이용한 농도 구배로 용출시킴}에서는 17.2분에서 하나의 피크를 나타내었다. 저해상도 질량스펙트럼을 통해, 목적하는 질량(MH⁺771.5)임을 확인하였다.

실시예 6: iBoc-G(Chx)-Cys((O ₂ )Et)-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH ₂ 의 고체상 합성 (아래의 단계 1 내지 5)

단계 1: Fmoc-Cys((O ₂ )Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

화합물 H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지 (실시예 4, 단계 2)(0.17g, 0.8mmol/g, 0.19mmol)를 프릿된 폴리프로필렌 튜브에 옮기고나서, 공정 A에 따라Boc-Cys((O₂)Et)-OH (실시예 1) (160mg, 0.38mmol)에 커플링시켰다. 18시간 경과후, 닌히드린 정량분석에서 99.98%의 커플링이 완료되었음을 나타내었다.

단계 2: Fmoc-G(Chx)-Cys((O ₂ )Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

전단계 (실시예 6, 단계 1)에서 수득한 수지인 Boc-Cys((O₂)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA (0.19mmol)를 공정 C에 따른 Boc 탈보호 공정을 거치게 하였다. 그리고나서, Fmoc-G(Chx)-OH (0.170g, 0.45mmol)를 공정 A에 따라 커플링시켰다. 18시간 경과후, 닌히드린 정량분석에서 99.92%의 커플링 효율을 나타내었다.

단계 3: iBoc-G(Chx)-Cys((O ₂ )Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

전단계 (실시예 6, 단계 2)에서 수득한 수지인 Fmoc-G(Chx)-Cys((O₂)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA를 공정 B에 따른 Fmoc 탈보호시켰다. 소량의 검체에 대한 닌히드린 분석을 통해 진한 청색의 수지 및 용액을 수득하여, 반응이 성공적임을 알 수 있었다. NMP 1ml에 현탁시킨 상기 수지 (170mg, 0.19mmol)에 이소부틸 클로로포르메이트 (0.06ml/mg, 0.045mmol)을 첨가한 후, 디이소프로필에틸아민 (0.16ml, 0.90mmol)을 첨가하고나서, 상기 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 흔들었다. 닌히드린 정량분석에서 99.35%의 커플링 효율을 나타내었다.

단계 4: iBoc-G(Chx)-Cys((O ₂ )Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA 수지의 합성

전단계 (실시예 6, 단계 3)의 화합물인 iBoc-G(Chx)-Cys((O₂)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA 수지 (170mg)을 세미카바존 가수분해 공정 D를 거치게 하였다.

단계 5: iBoc-G(Chx)-Cys((O ₂ )Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH ₂ 의 합성

전단계(실시예 6, 단계 4)의 수지인 iBoc-G(Chx)-Cys((O₂)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA 수지 (170mg)를 HF 절단 조건 (공정 E)을 거치게 하여 목적하는 조 생성물을 수득하였다. 상기 물질을 HPLC {세공 크기 300Å인 10 마이크론 크기의 젤 입자를 포함하는 C-18 수지를 함유하는 2.2×25cm 역상 칼럼을 사용; 물 중의 20-50% 아세토니트릴을 이용한 농도 구배로 용출시킴}를 통해 정제하였다. 분석 HPLC {세공 크기 300Å인 5 마이크론 크기의 젤 입자를 포함하는 C-18 수지를 함유하는 4.6×250mm 역상 칼럼을 사용; 물 중의 10-60% 아세토니트릴 (0.1% 트리플루오로아세트산을 함유)을 이용한 농도 구배로 용출시킴}에서는 16.94분에서 하나의 피크를 나타내었다. 저해상도 질량스펙트럼을 통해, 목적하는 질량(MH⁺737.5)임을 확인하였다.

HCV 프로테아제 억제 활성의 검정

분광 측광 검정:

본원에 참조문헌으로 포함된 하기 문헌에 기재된 공정에 따라 {참조: R.Zhang 등, Analytical Biochemistry, 270(1999) 268-275}, 본 발명의 화합물에 대해 HCV 세린 프로테아제에 대한 분광측광검정을 수행하였다. 발색단 에스테르 기질의 단백질분해에 기초한 상기 검정은, HCV NS3 프로테아제 활성을 연속적으로 모니터링하는 데에 적합하다. 상기 기질은 NS5A-NS5B 연결 서열의 P측 {Ac-DTEDVVX(NVa), 여기서 X는 A 또는 P}에서 유래한 것으로서, 이의 C 말단 카복실 그룹은 4개의 상이한 발색(chromophoric) 알코올 (3- 또는 4-니트로페놀, 7-하이드록시-4-메틸-쿠마린, 또는 4-페닐아조페놀) 중의 하나로 에스테르화된 것이다. 아래에서는, 이러한 신규의 분광측광 에스테르 기질의 합성, 특성분석 및 대량(high throughput) 스크리닝에의 적용과 HCV NS3 프로테아제 억제제의 상세한 동적 평가를 기재하였다.

재료 및 방법:

분석-관련 버퍼용 화학 시약은 Sigma Chemical Company (미국 미주리 세인트루이스 소재)에서 입수하였으며, 펩티드 합성용 시약은 Aldrich Chemicals사, Novabiochem (미국 캘리포니아 샌디애고 소재), Applied Biosystems (미국 캘리포니아 포스터 시티 소재) 및 Perseptive Biosystems (미국 매사추세츠 프래밍엄 소재)에서 입수하였다. 펩티드는 수작업으로 합성하거나 자동 합성기 ABI 모델 431A(Applied Biosystems에서 입수)에서 합성하였다. UV/VIS 분광기 (모델 LAMBDA 12)는 Perkin Elmer (미국 코넥티컷 노르웍 소재)에서 입수하였으며, 96웰 UV 플레이트는 Corning (미국 뉴욕 코닝 소재)에서 입수하였다. 예비가열 블락 (prewarming block)은 USA Scientific (미국 플로리다 오칼라 소재)에서 입수하였으며, 96웰 플레이트 교반기는 Labline Instruments (미국 일리노이 멜로즈 파크 소재)에서 입수하였다. 모노크로미터(monochrometer)가 장착된 Spectramax Plus 미량역가 플레이트 판독기는 Molecular Devices (미국 캘리포니아 써니베일 소재)에서 입수하였다.

효소 제조:

재조합 헤테로다이머 HCV NS3/NS4A 프로테아제 (1a 균주)는 예전에 공지된 공정에 따라 제조하였다 {참조: D.L. Sali 등, Biochemistry, 37(1998)3392-3401}. 단백질 농도는, 아미노산 분석에 의해 이미 정량화된 재조합 HCV 프로테아제 표준을 사용하는 Biorad 염색법에 의해 측정하였다. 검정을 시작하기 이전에, 효소 저장 버퍼 (50mM 나트륨 포스페이트 pH 8.0, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.05% 라우릴 말토시드, 및 10mM DTT)를 미리 패킹된 Biorad Bio-Spin P-6 칼럼을 이용한 검정 버퍼 (25mM MOPS pH 6.5, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.05% 라우릴 말토시드, 5μM EDTA, 및 5μM DTT)로 교환하였다.

기질 합성 및 정제:

기질의 합성은, 상기 R.Zhang 등의 문헌에 기재된 바와 같이 수행되었으며, 표준 프로토콜 {참조: K.Barlos 등, Int.J.Pept.Protein Res., 37(1991), 513-520}을 사용하여 Fmoc-Nva-OH를 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 결합시킴으로써 시작하였다. 그리고 나서, Fmoc 화학을 이용하여, 수작업 또는 ABI 모델 431 펩티드 자동 합성기를 이용하여 상기 펩티드를 어셈블링하였다. 30분간 디클로로메탄 (DCM) 중의 10% 트리플루오로에탄올 (TFE) 및 10% 아세트산 (HOAc)을 이용하거나, 10분간 DCM 중의 2% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 이용하여, N-아세틸화되고 완전히 보호된 펩티드 단편을 상기 수지로부터 절단제거하였다. 배합된 여과물 및 DCM 세척물을 공비 증발시켜 (또는, Na₂CO₃수용액으로 반복 추출), 절단 제거에 사용된 상기 산을 제거하였다. DCM 상은 Na₂SO₄상에서 건조시켜 증발시켰다.

상기 에스테르 기질은, 표준 산-알코올 커플링 공정 {참조: K.Holmber 등, Acta Chem. Scand., B33 (1979)410-412}을 사용하여 어셈블링하였다. 펩티드 단편은, 발색단(chromophore) 10 몰당량 및 파라-톨루엔설폰산 (pTSA)의 효소량(0.1 당량)이 첨가된 무수 피리딘 (30-60mg/ml) 중에 용해시켰다.

디사이클로헥실카보디이미드 (DCC, 3 당량)을 첨가하여 커플링 반응이 시작되게 하였다. 생성물 형성은, HPLC에 의해 모니터링되었으며, 실온에서 12 내지 72시간 반응을 거쳐 완료되었다. 피리딘 용매는, 진공증발시켰으며, 톨루엔으로 공비 증발시켜 추가 제거하였다. 상기 펩티드 에스테르는, 2시간 동안 DCM 중의 95% TFA로 탈보호되었으며, 무수 에틸 에테르로 3회 추출되어, 과량의 발색단을 제거하였다. 상기 탈보호된 기질은, 30% 및 60% 아세토니트릴 구배를 가진 C3 또는 C8 칼럼 (6 칼럼 체적을 이용) 상에서 역상 HPLC로 정제하였다. HPLC 정제를 통한전체 수율은 약 20-30%였다. 전자분무 이온화 질량스펙트럼 분석에 의해 분자량을 확인하였다. 상기 기질은, 건조 보존(desiccation)하에 건조분말 형태로 저장되었다.

기질 및 생성물의 스펙트럼:

기질 및 이에 상응하는 발색단 생성물의 스펙트럼은 pH 6.5 검정 버퍼에서 수득하였다. 소멸 계수 (extinction coefficient)는, 수회 희석을 이용하여 1cm 커빗 (cuvette)에서 최적 오프-피크(off-peak) 파장 (3-Np 및 HMC를 위해서는 340nm, PAP를 위해서는 370mm, 4-Np를 위해서는 400nm)에서 측정하였다. 상기한 최적 오프-피크 파장은, 기질과 생성물간의 흡수도의 최적 분별차 (fractional difference)를 나타내는 파장으로 정의된다 (생성물 OD - 기질 OD/기질 OD).

프로테아제 검정:

HCV 프로테아제 검정은, 96웰 미량역가 플레이트내의 200㎕ 반응 믹스를 이용하여 30℃에서 수행되었다. NS3/NS4A 헤테로다이머에 대한 검정 버퍼 조건 (25mM MOPS pH 6.5, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.05% 라우릴 말토시드, 5μM EDTA 및 5μM DTT)을 최적화하였다 {참조: 상기한 D.L.Sali 등}. 통상적으로, 버퍼, 기질 및 억제제의 150㎕ 혼합물을 웰 (DMSO의 최종 농도 4% v/v)에 위치시키고, 약 3분간 30℃에서 예비 인큐베이션시켰다. 그리고나서, 검정 버퍼내의 예비가열된 프로테아제 50㎕ (12nM, 30℃)를 사용하여 상기 반응이 시작되게 하였다 (최종 체적 200㎕). 검정 시간 (60분) 동안, 상기 플레이트에 대해 모노크로미터가 장착된 Spectromax Plus 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 적합한 파장(3-Np 및 HMC를위해서는 340nm, PAP를 위해서는 370mm, 4-Np를 위해서는 400nm)에서 흡수도 변화를 모니터링하였다 (수용가능한 결과는 컷-오프 필터를 이용하는 플레이트 판독기로 얻을 수 있다). Nva와 발색단 사이의 에스테르 결합의 단백질분해 절단에 대해서는, 비-효소 가수분해에 대한 대조군으로서 비-효소 블랭크에 대해 적합한 파장에서 모니터링하였다. 기질 농도 30배 범위 (~ 6 내지 200μM)에 걸쳐 기질의 운동 파라미터를 평가하였다. 최초 속도는 선형회귀법을 이용하여 결정하였으며, 운동 상수는 비선형 회귀분석법을 이용한 Michaelis-Menten 방정식에 상기 데이터를 적정화시킴으로써 수득하였다 {참조: Mac Curve Fit 1.1, K.Raner}. 턴오버 수 (K_cat)는, 상기 효소가 완전히 활성을 가지는 것으로 가정하고 계산하였다.

억제제 및 불활성제의 평가:

경쟁적인 억제제 Ac-D-(D-Gal)-L-I-(Cha)-C-OH (27), Ac-DTEDVVA(Nva)-OH 및 Ac-DTEDVVP(Nva)-OH에 대한 억제 상수 (K_i)는, 경쟁적인 억제 운동방정식을 위해 재정리된 Michaelis-Menten 방정식에 따라 V_o/V_i:억제제 농도 ([I]_o)를 플랏팅(plotting)함으로써 효소 및 기질의 고정된 농도에서 실험적으로 결정되었다: V_o/V_i= 1 + [I]_o/(K_i(1+[S]_o/K_m) {여기서, V_o는 비-억제된 최초 속도; V_i는 소정의 억제제 농도 ([I]_o)에서 억제제 존재하의 최초 속도; [S]_o는 사용된 기질의 농도}. 수득한 데이터는 선형 회귀법을 통해 적정하였으며, 수득한 기울기인 1/(K_i(1+[S]_o/K_m)를 사용하여 K_i ^*수치를 계산하였다.

본 발명의 여러 화합물의 K_i ^*수치는, 화합물의 K_i ^*수치의 범위로 배열된 상기한 표에 기재되어 있다. 이러한 테스트 결과로부터, 본 발명의 화합물은 NS3-세린 프로테아제 억제제로서 탁월한 유용성을 가짐이 당업자에게는 명백할 것이다.

본 발명은 상기한 특정 양태에 따라 기술되어 있으나, 여러 대안, 변형 및 변이체 또한 당업자에게는 명백할 것이다. 이러한 모든 대안, 변형 및 변이체들은 본 발명의 정신 및 범위내에 포함된다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

Claims (40)

1. 하기 화학식 I의 화합물 (이의 에난티오머, 입체이성체, 로타머 및 토토머를 포함) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:

   화학식 I

   상기 식에서,

   G, J 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있으며, H, 알킬, 알킬-아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴-헤테로아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 알킬옥시, 알킬-아릴옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클로알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬-아릴아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 사이클로알킬아미노 또는 헤테로사이클로알킬아미노로 이루어진 잔기로부터 각각 독립적으로 선택되고 {단, Y는 X¹¹및 X¹²로 임의적으로 추가 치환될 수 있다};

   X¹¹는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알킬-알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬 {단, X¹¹는 X¹²로 임의적으로 추가 치환될 수 있다};

   X¹²는 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 티오, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 알킬설폰아미도, 아릴설폰아미도, 카복시, 카브알콕시, 카복스아미도, 알콕시카보닐아미노, 알콕시카보닐옥시, 알킬우레이도, 아릴우레이도, 할로겐, 시아노 또는 니트로 {단, 알킬, 알콕시 및 아릴은, X¹²로부터 독립적으로 선택되는 잔기로 임의적으로 추가 치환될 수 있다};

   R¹은 COR⁵또는 B(OR)₂{여기서, R⁵는 H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF₃, C₂F₅, C₃F₇, CF₂R⁶, R⁶또는 COR⁷; R⁷은 H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰또는 NR⁹R¹⁰; R⁶, R⁸, R⁹및 R¹⁰은 동일하거나 상이할 수 있으며, H, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알킬, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')R^', CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONHCH(R^5')COOR¹¹및 CH(R^1')CONHCH(R^2')CONHCH(R^3')CONHCH(R^4')CONHCH(R^5')CONR¹²R¹³로 이루어진 그룹중에서각각 독립적으로 선택되고; R^1', R^2', R^3', R^4', R^5', R¹¹, R¹², R¹³및 R^'은 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 아릴-알킬 또는 헤테로아르알킬로부터 선택된다};

   Z는 O, N 또는 CH로부터 선택되며;

   W는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, W가 존재하는 경우에는 W는 C=O, C=S 또는 SO₂이고;

   R, R^', R², R³및 R⁴는 각각 독립적으로 H; C1-C10 알킬; C2-C10 알케닐; C3-C8 사이클로알킬; C3-C8 헤테로사이클로알킬, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미도, 에스테르, 카복실산, 카바메이트, 우레아, 케톤, 알데히드, 시아노, 니트로; 산소, 질소, 황 및 인 원자 {산소, 질소, 황 또는 인 원자의 수는 0 내지 6}; (사이클로알킬)알킬 및 (헤테로사이클로알킬)알킬 {여기서, 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소원자와 0 내지 6개의 산소, 질소, 황 또는 인 원자로 이루어지며; 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자로 이루어진다}; 아릴; 헤테로아릴; 알킬-아릴; 및 알킬-헤테로아릴;

   상기한 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 헤테로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬 잔기는 임의적으로 치환될 수 있다 {여기서, 용어 "치환된"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 할로겐, 하이드록시, 티오, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미도, 에스테르, 카복실산, 카바메이트, 우레아, 케톤, 알데히드, 시아노, 니트로, 설폰아미드, 설폭시드, 설폰, 설포닐우레아, 히드라지드 및 히드록사메이트로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 잔기로 임의적 및 화학적으로 적합하게 치환됨을 의미한다}.
2. 제1항에 있어서, R¹은 COR⁵이고; R⁵은 H, OH, COOR⁸또는 CONR⁹R¹⁰인 화합물.
3. 제2항에 있어서, R¹은 COCONR⁹R¹⁰이고; R⁹은 H; R¹⁰은 H, CH(R^1')COOR¹¹, CH(R^1')CONR¹²R¹³, CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³또는 CH(R^1')CONHCH(R^2')R^'인 화합물.
4. 제3항에 있어서, R¹⁰은 CH(R^1')CONHCH(R^2')COOR¹¹, CH(R^1')CONHCH(R^2')CONR¹²R¹³또는 CH(R^1')CONHCH(R^2')R^'인 화합물 {여기서, R^1'은 H 또는 알킬, 헤테로알킬이고; R^2'는 페닐, 치환된 페닐, 헤테로 원자-치환된 페닐, 티오페닐, 사이클로알킬, 피페리딜 및 피리딜}.
5. 제4항에 있어서, R^1'은 H인 화합물.
6. 제5항에 있어서,

   R¹¹은 H 또는 3차 부틸; R^'은 하이드록시메틸;

   R^2'는 아래 그룹 중에서 선택되며

   {상기 식에서,

   U¹및 U²는 동일하거나 상이할 수 있으며; H, F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂CONH₂, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, 아지도, 아미노, 하이드록실, 치환된 아미노, 및 치환된 하이드록실로 이루어진 그룹 중에서 각각 독립적으로 선택되며;

   U³및 U⁴는 동일하거나 상이할 수 있으며, O 또는 S;

   U⁵는 알킬설포닐, 아릴 설포닐, 헤테로알킬 설포닐, 헤테로아릴 설포닐, 알킬 카보닐, 아릴 카보닐, 헤테로알킬 카보닐, 헤테로아릴 카보닐, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 헤테로아릴옥시카보닐, 알킬아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 헤테로아릴아미노카보닐 또는 이의 조합으로 이루어진 잔기 중에서 선택된다};

   NR¹²R¹³은 아래의 화합물 중에서 선택되는 화합물 {여기서, U⁶는 H, OH 또는 CH₂OH}:
7. 제2항에 있어서, R²가 아래의 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물:
8. 제7항에 있어서, R³이 아래의 그룹 중에서 선택되는 화합물:

   및

   상기 식에서,

   R³¹은 OH 또는 O-알킬;

   Y¹⁹는 아래의 잔기 중에서 선택되며:

   Y²⁰는 아래의 잔기 중에서 선택된다:
9. 제8항에 있어서, R³이 아래 잔기 중에서 선택되는 화합물:
10. 제9항에 있어서, Z는 N이고, R⁴는 H인 화합물.
11. 제10항에 있어서, W는 C=O 또는 SO₂인 화합물.
12. 제11항에 있어서, Y는 아래의 잔기 중에서 선택되는 화합물:

    상기 식에서,

    Y¹¹는 H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)₂, 1-트리아졸릴, 1-이미다졸릴 또는 NHCH₂COOH;

    Y¹²는 H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl 또는 Br;

    Y¹³는 아래의 잔기중에서 선택되고:

    Y¹⁴는 MeSO₂, Ac, Boc,ⁱBoc, Cbz 또는 Alloc;

    Y¹⁵및 Y¹⁶는 동일하거나 상이할 수 있으며; 알킬, 아릴 또는 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 중에서 독립적으로 선택되며;

    Y¹⁷는 CF₃, NO₂, CONH₂, OH, COOCH₃, OCH₃, OC₆H₅, C₆H₅, COC₆H₅, NH₂또는 COOH;

    Y¹⁸는 COOCH₃, NO₂, N(CH₃)₂, F, OCH₃, CH₂COOH, COOH, SO₂NH₂또는 NHCOCH₃.
13. 제12항에 있어서, Y는 아래의 그룹 중에서 선택되는 화합물:

    상기 식에서,

    Y¹⁷는 CF₃, NO₂, CONH₂, OH, NH₂또는 COOH;

    Y¹⁸는 F 또는 COOH.
14. 제13항에 있어서, J는 아래의 그룹 중에서 선택되는 화합물:
15. 제14항에 있어서, J는 H, CH₃또는 Bn인 화합물.
16. 제15항에 있어서, G는 아래의 잔기 중에서 선택되는 화합물:
17. 제16항에 있어서, G는 아래의 그룹 중에서 선택되는 화합물:
18. 제1항의 화합물을 활성 성분으로 포함하는, 약제학적 조성물.
19. 제18항에 있어서, C형 간염 바이러스와 관련된 질환의 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
20. 제18항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
21. 치료학적 유효량의 제1항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, HCV 프로테아제와 관련된 질환의 치료방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 투여가 경피투여인 치료방법.
23. HCV 프로테아제와 관련된 질환을 치료하는 데에 사용되는 약제의 제조에 사용되는 제1항의 화합물의 용도.
24. 제1항의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 밀착시키는 것을 포함하는, HCV 프로테아제와 관련된 질환을 치료하는 데에 사용되는 약제학적 조성물의 제조방법.
25. 하기 구조를 갖는 그룹 중에서 선택되는, HCV 프로테아제 억제 활성을 나타내는 화합물 (이의 에난티오머, 입체이성체, 로타머 및 토토머를 포함) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
26. 치료학적 유효량의 하나 이상의 제25항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 프로테아제와 관련된 질환의 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
27. 제26항에 있어서, 항바이러스 제제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 인터페론을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
29. 제28항에 있어서, 상기 항바이러스 제제가 리바비린이고, 상기 인터페론이 알파-인터페론인 약제학적 조성물.
30. 아래의 그룹 중에서 선택되는 HCV 억제 활성을 나타내는 화합물 (이의 에난티오머, 입체이성체, 로타머 및 토토머를 포함) 및 이의 약제학적으로 허용가능한염 또는 용매화물:
31. 제30항의 화합물을 하나 이상 포함하는 약제학적 조성물.
32. 유효량의 제30항의 화합물을 하나 이상 투여하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스-관련 질환의 치료방법.
33. 하나 이상의 제30항의 화합물을 HCV 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함하여, C형 간염 바이러스 (HCV) 프로테아제의 활성을 조절하는 방법.
34. 유효량의 제30항의 화합물을 하나 이상 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 C형 간염 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법.
35. 제33항에 있어서, HCV 프로테아제가 NS3/NS4a 프로테아제인 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 화합물 (또는 화합물들)이 HCV NS3/NS4a 프로테아제를 억제하는 방법.
37. C형 간염 바이러스(HCV) 폴리펩티드를 하나 이상의 제30항의 화합물로 프로세싱되는 조건하에서 HCV 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 접촉하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스(HCV) 폴리펩티드의 프로세싱을 조절하는 방법.
38. 제7항에 있어서, R³이 사이클로헥실인 화합물.
39. 제11항에 있어서, Y는 2-카복시-3-하이드록시페닐, 3-테트라하이드로푸릴메톡시 및 2-설포페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
40. 제15항에 있어서, G는 에틸설포닐메틸, 페닐설포닐메틸, 2-페닐에틸설포닐메틸 및 1-나프틸설포닐메틸인 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.