KR20030061396A

KR20030061396A - 성장 인자 ｆｇｆ-2의 변경된 활성화에 의해 야기된질병의 치료를 위한 긴 펜트락신 ｐｔｘ3의 용도

Info

Publication number: KR20030061396A
Application number: KR10-2003-7006278A
Authority: KR
Inventors: 만토바니알베르토; 보타지바바라; 프레스타마르코; 루스나티마르코
Original assignee: 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이.
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2003-07-18
Also published as: ITRM20000578A1; HUP0400541A2; WO2002038169A1; JP4167061B2; CY1106092T1; CN1304047C; PL365292A1; EP1331940A1; JP2004513151A; SK5622003A3; DE60118769T2; CA2428176A1; BR0115190A; HK1061209A1; DE60118769D1; CZ20031179A3; EP1331940B1; ATE322906T1; CA2428176C; HU229100B1

Abstract

성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 예방 및 치료에 유용한, 상기 성장 인자 FGF-2의 생물학적 활성을 억제하는 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3(PTX3) 또는 그의 작용성 유도체들 중 하나의 용도가 개시되어 있다.

Description

성장 인자 ＦＧＦ-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 치료를 위한 긴 펜트락신 ＰＴＸ3의 용도{USE OF THE LONG PENTRAXIN PTX3 FOR THE TREATMENT OF DISEASES CAUSED BY AN ALTERED ACTIVATION OF THE GROWTH FACTOR FGF-2}

혈관형성 억제 활성이 부여된 첫 번째 화합물은 1975년에 헨리 브렘과 주다스 포크만(Henry Brem and Judath Folkman, J. Exp. Med. 1975 Feb. 1; 141(2):427-39)에 의해 연골 조직에서 발견되었다. 상기 저자들은 이러한 발견을 이용하여 병적인 종양 혈관형성의 선택적인 억제제에 의해 병적인 과정, 예를 들어종양 성장, 전이, 관절의 만성 및 급성 염증, 및 당뇨성 망막병증을 억제시킬 수 있다고 생각 하였다.

성인에서 혈관형성은 통상적으로는 무 활동이나, 예를 들어 상처의 치유 또는 여성의 생식 주기 중의 자궁내막의 재건에서는 정상적인 기능을 나타낸다.

혈관형성 반응은 혈관 기능이 감소되고 조직 관류가 부적합한 경우 생리적으로 자극된다.

보다 일반적으로는, 생리적 조건 하에서 혈관형성은 예를 들어 동맥 폐쇄의 경우, 조직 덩어리 성장의 상황(예를 들어 근육 조직의 형성을 수반하는 혈관신생); 및 산소 및 영양소 요구의 증가와 관련하여 증가된 노동 부하의 경우, 산소 및 영양소의 감소된 공급 또는 부적합한 관류에 반응하여 양의 피드백을 구성함이 주장될 수 있다.

1 차 종양의 성장은 종양 조직의 양호한 혈관화에 의해 촉진되는 것으로 널리 공지되어 있다. 적합한 산소 및 영양소의 공급은 종양 자체의 급속한 성장을 촉진시킨다.

혈관형성의 정도는 종양의 예후에 매우 부정적인 인자일 수 있음이 입증되었다(van Hinsberg VW, Collen A, Koolwijk P; Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:60-3, 1999; Buolamwini JK; Curr. Opin. Chem. Biol., 3(4):500-9, 1999 Aug.).

또한 종양 분야에서, 종양 세포 생물학의 기초 단계는 전이 능력의 획득인 것으로 공지되어 있다.

전이에 의해 주변 구조에의 유착을 상실할 수 있는 종양 세포는 혈액과 림프관을 침범하여 자신을 계속해서 재생시킬 수 있는 거리에서 다른 조직에 군락을 형성한다.

전이는 또한 질병의 임상적인 병력에서 중대한 사건이며, 암으로 인한 사망의 주요 원인이다. 상기는 종양 부위 또는 인접 영역의 혈관 조직의 존재와 밀접한 관련이 있으며 이에 의해 촉진된다.

주변 조직을 통한 종양 세포의 이동은 세포들을, 기존의 것이든지 혹은 혈관신생에 의해 형성된 것이든지 간에 종양 내 혈관에 도달할 수 있게 하며, 따라서 혈류에 도달할 수 있게 한다(Ray JM., Stetler-Stevenson WG; Eur. Respir. J., 7(11):2062-72, 1994; Stetler-Stevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE Jr.; FASEB J., 7(15):1434-41, 1993 Dec.).

종양의 혈관 부분에서 림프관과 혈관간의 연통의 존재는 종양 세포가 상기 두 맥관계를 이동할 수 있게 한다.

최근의 연구는 혈관형성과 관절염 질환간의 직접적인 상관관계를 입증하였다(Koch AE; Arthritis and Rheumatism 41:951-962, 1998). 특히, 관절 연골의 혈관신생은 판누스의 형성과 관절염의 진행에 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 정상의 연골은 혈관을 갖지 않지만, 관절염 환자의 활액은 내피세포에 의해 생성된 혈관형성 자극 인자(EASF)를 함유한다.

상기 인자의 존재는 혈관화 및 연골의 퇴화와 관련이 있다.

다른 질환들도 또한 비정상적인 혈관형성과 관련된다.

당뇨성 망막병증[Histol. Histopathol. 1999 Oct; 14(4):1287-94], 건선[BrJ.Dermatol. 1999 Dec; 141(6):1054-60], 만성 염증 및 죽상경화증[Planta Med. 1998 Dec; 64(8):686-95]에서, 감염된 조직의 혈관신생은 촉진 인자인 것으로 밝혀졌다.

성장 인자 FGF-2는 생체 내에서 종양 혈관형성을 유발시키고 배양액에서 내피 세포의 세포 증식, 화학 주성 및 프로테아제의 생산을 유발시킬 수 있는 18 kDa의 양이온성 폴리펩티드이다(Basilico and Moscatelli, 1992, Adv. Cancer Res. 59:115-65).

종양의 혈관형성에서 FGF-2의 역할은 이미 공지되어 있다(Pathol. Biol. (Paris) 1999 Apr; 47(4):364-7).

문헌[J. Pathol. 1999 Sept; 189(1):72-8]에는 중피종을 앓고 있는 환자에서 FGF-2의 증가된 발현이 상기와 같은 종양 질병에 걸린 환자의 보다 높은 침습성과 보다 큰 사망률에 관계 있음이 보고되어 있다.

문헌[Oncogene 1999 Nov 18;18(48):6719-24]에는 FGF-2가 래트 방광 암종 세포에 전이 성질을 부여하는 것으로 보고되어 있다.

문헌[Int. J. Cancer 1999 May 5; 81(3):451-8]은 FGF-2가 강한 분열촉진 활성을 가지며 인간 종양의 발생 및 그의 악성의 증가를 수반함을 보고한다.

종양 질환의 치료를 위해서, 전통적인 표준 화학요법에 관한 혈관형성 요법은 하기의 이점들을 나타낸다(Cancer Research 1998, 58, 1408-16):

1. 보다 큰 특이성: 표적으로서 종양 혈관신생 과정을 갖는다;

2. 보다 큰 생체 적합성: 표적으로서, 종양 세포에 직접 작용하는 전통적인화학요법적 접근법에 연계된 문제점 없이 쉽게 도달할 수 있는 내피 세포를 갖는다;

3. 작은 화학 내성: 이는 상기 요법의 가장 중요한 이점일 수 있으며, 실제로 종양 세포에 비해 내피 세포는 유전적으로 안정하고, 약물 내성 현상은 일어날 것 같지 않다;

4. 작은 전이성: 혈관 신생의 봉쇄는 혈류를 통한 신체의 다른 부분에서의 종양 세포의 증식을 제한한다;

5. 세포소멸이 촉진된다: 종양에서 혈관 네트의 봉쇄는 종양 세포의 산소 및 영양소 유용성을 감소시키며, 이러한 방식으로 세포소멸이 증가한다;

6. 전신 독성의 감소: 전통적인 화학요법에 존재하는 독성 효과, 예를 들어 골수억제, 위장 효과 및 일시적 탈모가 혈관형성 억제 요법에서는 관찰되지 않는다.

이러한 효과를 측정하기 위해서, FGF-2를 표적 세포 표면 상에 존재하는 2 개의 상이한 수용체 군, 즉 티로신 키나제 활성(FGFR)이 부여된 높은 친화성을 갖는 수용체 및 프로테오글리칸 에파란 설페이트(HSOG)로 대표되는 친화성이 낮은 수용체와 반응시킨다(Johnson and Williams, 1993, Adv. Cancer Res. 60:1-41; Moscatelli, 1987, J. Cell. Physiol. 131:123-30).

FGF-2는 보통의 평활근 세포에 효능 있는 미토겐이며 풍선 카테터 손상 후 상기 세포의 증식에 필요하다(J. Biol. Chem. 2000 Apr. 14; 275(15):11270-7).

따라서, 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병은 또한 혈관성형술 또는 "관상 동맥 스텐팅" 후 재협착증 중에 일어나는 동맥 근육 벽의 과형성을 포함한다(J. Vasc. Surg. 1997 Feb; 25(2):320-5).

FGF-2 의존성 혈관신생의 억제는 변경된 혈관형성과 연계된 질병의 억제 및 치료에 근본적인 요소들 중 하나를 나타내며, 뿐만 아니라 섬유 아세포 또는 SMC의 FGF-2-의존적인 조절되지 않은 증식에 대한 억제는 과도한 섬유 아세포 반응에 연계된 흉터 및 혈관 성형술 후 재 협착증의 치료에 중요하다.

FGF-2의 생물학적 활성을 특이적으로 저해하는 새로운 치료 화합물에 대한 유용성은 상기 성장 인자의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 예방 및 치료에 1 차적으로 중요한 목적이다. 상기와 같은 질병으로는 관절염 질환, 종양, 종양 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증, 죽상 경화증, 과도한 섬유 아세포 반응에 연계된 흉터 및 혈관 성형술 후 재 협착증이 있다.

PTX3는 염증성 시토킨인 인터류킨 1β(IL-1β) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)에 노출 후에 다양한 세포 유형(Bottazzi et al., J., Biol. Chem. 1997, 272:32817-32823), 특히 단핵성 식세포 및 내피 세포에서 발현된다.

지금까지, PTX3의 생물학적 기능은 아직 충분히 이해되지 않고 있다.

PTX3는 2 개의 구성 도메인들, 즉 임의의 공지된 분자와 관계가 없는 N-말단 도메인 및 짧은 펜트락신과 유사한 C-말단 도메인, 예를 들어 C-반응성 단백질(CRP)로 이루어진다(Breviario F., et al., J. Biol. Chem. 267:22190, 1992).

인간 PTX3(hPTX3)와 동물 PTX3간에 상당한 정도의 유사성이 발견되었다. 특히 마우스 PTX3(mPTX3)는 DNA 서열 및 유전자 조직 및 위치의 면에서 hPTX3와 매우 유사하다. 인간과 쥐 PTX3 유전자간의 일치 정도는 82%이며, 보존적 치환을 고려한다면 90%에 달한다(Introna M., et al.: Blood 87(1996) 1862-1872). 쥐 PTX3 유전자는 인간 3q 영역(q24-28)과 유사한 영역의 마우스의 염색체 3 상에 위치하며, 이는 3q 25 영역의 hPTX3의 문헌보고 위치와 일치한다(Introna M., et al.: Blood 87(1996) 1862-1872).

hPTX3와 mPTX3 서열간의 고도의 유사성은 진화하는 동안 펜트락신이 고도로 보존되었다는 표시이다(Pepys M.B., Baltz M.L.; Adv. Immunol. 34:141, 1983).

펜트락신에 대한 고찰을 위해 문헌[H. Gewurz et al, Current Opinion in Immunology, 1995, 7:54-64]을 참조하시오.

본 출원인의 이름으로 출원된 국제 출원 WO99/32516에는 감염성 질환, 염증 또는 종양의 치료를 위한 긴 펜트락신 PTX3의 용도가 개시되어 있다. WO99/32516에 개시된, PTX3에 의해 입증된 종양 억제 활성은 백혈구 신규 보충에 의해, 즉 면역학적 토대를 매개로 한다. WO99/32516에는 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화와 관련된 질병의 치료에 유용한 약제로서의 PTX3의 용도가 개시되지도 제안되지도 않았다.

US 5767252에는 펜트락신 계열에 속하는 신경 세포의 성장 인자가 개시되어 있다(또한 인용된 참고 문헌들을 참조하시오). 상기 특허는 신경생물학 분야에 관한 것이다.

본 발명은 성장 인자 FGF-2의 생물학적 활성을 저해하는 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX(PTX3) 또는 그의 작용성 유도체들 중 하나의 용도에 관한 것으로, 이때 상기 약제는 상기 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 예방 및 치료에 유용하다.

성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병들 중에는 변경된 혈관형성 및 섬유 아세포 또는 평활근 세포의 조절되지 않은 증식에 의해 자극되는 질병들이 포함된다.

본 발명에 이르러 긴 펜트락신 PTX3는 FGF-2와 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있음이 밝혀졌다. PTX3와 FGF-2와의 결합(K_d=8-16 nM)은 상기 FGF-2의 친화성이 높은 티로신-카니제 수용체에 대한 결합, 및 세포 표면상에 존재하는, 에파란-설페이트 프로테오글리칸으로 대표되는 저 친화성 수용체 부위에서의 결합을 방지한다. 상기 결합의 억제는 상기 FGF-2의 생물학적 활성의 억제를 야기시킨다.

FGF-2/PTX3 간의 상호작용은 단지 성장인자의 기본적인 성질에만 의존하는 것이 아니라, 상기 인자의 정확한 형태적 구조에 따라 변하며, 따라서 PTX3는 시토크롬 C(FGF-2와 분자량(18 kDa) 및 등전점(pH 9.6)을 공유하는 단백질)와 결합하지 않는다.

더욱이, PTX3와 동족체인 C-반응성 단백질은 FGF-2와 결합하지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 성장 인자 FGF-2의 생물학적 활성의 억제에 의해 저지되는 질병의 예방 및 치료용 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 용도이다.

본 발명의 추가의 목적은 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 예방 및 치료용 약제의 제조를 위한, 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 용도이다. 본 발명의 추가의 목적은 변경된 혈관형성에 의해 야기된 질병의 예방 및 치료용 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 용도로, 여기에서 상기 변경된 혈관형성은 성장 인자FGF-2의 변경된 활성화에 의해 자극되며, 이러한 질병의 예로는 관절염 질환, 종양 전이, 당뇨성 망막 병증, 건선, 만성 염증, 죽상 경화증, 또는 종양(예를 들어 육종, 암종, 암양종, 골 종양 또는 신경 내분비 종양)이 있다.

본 발명의 추가의 목적은 섬유 아세포 또는 평활근 세포의 조절되지 않은 FGF-2-의존적 증식과 관련된 질환, 예를 들어 과도한 섬유 아세포 반응과 연계된 흉터 및 혈관 성형술 후의 재 협착증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 용도이다.

본 발명에 따른 화합물은 상기를 재조합 단백질로서 투여할 때뿐만 아니라, 상기를 그의 cDNA의 유전자 전달의 결과로서 내생적으로 투여할 때 표적 세포의 FGF-2 활성의 억제에 사용하기 적합하다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병(예를 들어 종양, 종양 전이, 과도한 섬유 아세포 반응과 연계된 흉터 또는 혈관 성형술 후 재 협착증)의 유전자 요법을 위한, 인간 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 완전한 길이의 cDNA를 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터의 제조를 위한 상기 cDNA의 용도이다.

"긴 펜트락신 PTX3"는 그의 기원(인간 또는 동물)이나 합성과 무관하게, 임의의 긴 펜트락신 PTX3를 의미한다.

유도체는 FGF-2를 선택적으로 억제하는 작용 능력을 유지하는, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 상기 정의된 바와 같은 긴 펜트락신 PTX3의 임의의 작용성 동족체를 의미한다.

바람직한 긴 펜트락신 PTX3는 인간 PTX3로, 이의 서열이 WO99/32516에 개시되어 있다.

본 원에 개시된 긴 펜트락신 PTX3를 또한, FGF-2의 증가된 발현이 종양 질환의 보다 큰 침습성 또는 보다 큰 전이성을 자극하는 종양 질환의 치료를 위한 하나 이상의 항암 약물과 함께 사용할 수 있다.

실제로, 동일한 치료 효능을 유지하면서 원치않는 부작용을 피하기 위해서, 대부분의 종양 환자들을 단일의 항암 약물로 치료하는 것이 아니라, 다수의 항암제들을 함께 또는 항암제와 혈관형성 억제 화합물을 함께 사용하여 치료한다.

보다 통상적인 항암 약물의 작용 기전은 본 발명에 따른 화합물의 작용 기전과 완전히 상이하며, 실제로, 상기 통상적인 항암 약물은 종양 세포에 대해 세포독성이다.

상이한 작용 기전을 갖는 본 발명에 따른 화합물은 제휴된 항 종양 약물에 의해 발휘되는 효과에 더하여 치료 효과(보조 효과)를 발휘한다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 긴 펜트락신 PTX3와 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 조합이다.

본 발명의 추가의 목적은 긴 펜트락신 PTX3를 하나 이상의 공지된 항암 약물, 예를 들어 알킬화제, 국소이성화효소 억제제, 튜불린 억제제, 중격 화합물, 대사길항물질, 천연 산물, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 효소, 탁산 및 세포 분화성 화합물, 및 생리학적으로 허용 가능한 하나 이상의 부형제 또는 비히클과 함께 함유하는 약학 조성물이다.

본 발명의 추가의 목적은 FGF-2의 증가된 발현이 종양의 보다 큰 침습성을 자극하는 종양의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 하나 이상의 공지된 항 종양 화합물과 배합된 긴 펜트락신 PTX3의 용도이다.

본 발명의 추가의 목적은 FGF-2의 증가된 발현이 보다 큰 전이성을 자극하는 종양 전이의 개시의 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 하나 이상의 공지된 항 종양 화합물과 배합된 긴 펜트락신 PTX3의 용도이다.

본 발명의 추가의 목적은 긴 펜트락신 PTX3가 항암 화합물의 보조제로서 존재함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제의 제조를 위한, 하나 이상의 공지된 항 종양 화합물과 배합된 긴 펜트락신 PTX3의 용도이다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시한다.

실시예 1

용액에서 FGF와 결합하는 PTX3의 능력

본 실험을 FGF-2에 결합하는 PTX3를 평가하기 위해서 수행하였다. PTX3를 문헌[Bottazzi et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823]에 개시된 바와 같이 제조하였다. 인간 재조합 FGF-2를 문헌[Isacchi A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1991), 88:2628-32]에 개시된 바와 같이 제조하였다. 경우에 따라, FGF-2를 이사치(Isacchi) 등에 의해 개시된 방법에 따라¹²⁵I로 표지하였다(하기 참조).

실험 과정:

1 ㎍의 FGF-2(또는 한편으로 1 ㎍의 PTX3)를 함유하는 PBS 100 ㎕를 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피 수퍼로즈 12 컬럼(Pharmacia) 상에서 크로마토그래피시켰다(상기 컬럼은 단백질을 그의 분자량에 따라 분리시킬 수 있다). 상기 컬럼을 PBS로 1 ㎖/분의 유속으로 용출시키고, 1 ㎖ 분획을 모으고 상기 2 개의 단백질에 대해 특이적인 항체들을 사용하여 도트 블럿에 의해 분석하였다. FGF-2에 결합하는 PTX3를 평가하기 위해서 상기 2 개의 단백질(각각 5 g 및 1 ㎍)을 PBS 100 ㎕ 중에서 혼합하고 4 ℃에서 10 분간 배양한 후에 컬럼에 걸었다. 분획들을 모으고 항 FGF-2 특이적인 항체들을 사용하여 도트 블럿에 의해 분석하였다. 도 1에 보고된 결과들은 FGF-2(18.000 D)가 대략 22 ㎖의 체류 부피로 컬럼으로부터 용출됨을 보인다. 동일한 조건에서 PTX3(450.000 D)는 컬럼의 공극 부피(7 ㎖)로 용출된다. 4 ℃에서 10 분간 PTX3와 예비 배양시킨 FGF-2를 컬럼에 걸었을 때, 그의 크로마토그래피적 양상의 변화가 관찰되었으며: 이러한 실험 조건에서 FGF-2는 단독의 PTX3와 동일한 체류 부피로 컬럼으로부터 용출되었다.

실시예 2

플라스틱 고정화된 FGF-2에 결합하는 비오틴화된 PTX3의 능력

500 ng의 FGF-2 또는 보충 성분 Clq를 함유하는 NaHCO₃(pH 9.6) 100 ㎕를 4℃에서 96 웰 플라스틱 플레이트 중에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양의 끝에서 웰들을 PBS로 3 회 세척하고 후속적으로 실온에서 1 ㎎/㎖의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS 200 ㎕와 함께 2 시간 배양하였다. 배양의 끝에서 웰들을 PBS로 다시 3 회 세척하고 PBS 100 ㎕ 중의 증가량의 비오틴화된 PTX3의 존재 하에서 30 ng/㎖의¹²⁵I-FGF-2와 배양하였다(실온에서 2 시간). 한편으로 웰들을 증가 용량의 FGF-2 또는 Clq로 흡착시키고 PBS 100 ㎕ 중의 100 ng/㎖의 비오틴화된 PTX3와 배양하였다. 상기 배양 후에 웰들을 PBS로 3 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 100 ㎕의 스트렙트아비딘 HRP 공액물(1/2000)과 배양하였다. 반응을 색원체 마이크로웰 페록시다제 기질 시스템 ABTS(Kirkegaard & Perry Laboratories)를 가하여 진행시켰다. 플레이트를 405 ㎚에서 자동 ELISA 판독기로 판독하였다. 도 2에 보고된 결과는 플라스틱 웰상에 고정화된 FGF-2가 생리적인 PTX3 리간드 C1q와 유사한 방식(Bottazzi B. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823)으로 비오틴화된 PTX3와 결합할 수 있음을 입증한다.

실시예 3

PTX-3-FGF-2 상호작용의 특성화

96 웰 플레이트를 4 ℃에서 PTX3 또는 C 반응성 단백질(200 nM), 또는 한편으로 음성 대조군으로서 사용된 하기 단백질 2 ㎍/㎖을 함유하는 NaHCO₃(pH 9.6) 100 ㎕로 코팅하였다: 소 혈청 알부민, 피브로넥틴, 젤라틴 또는 라미닌. 배양후에, 웰들을 PBS로 3 회 세척하고 실온에서 PBS 중의 1 ㎎/㎖의 BSA 200 ㎕로 2 시간 차단시켰다. 배양의 끝에서 웰들을 PBS로 3 회 세척하고 후속적으로 실온에서 2 시간 동안¹²⁵I-FGF-2 30 ng과 배양하였다. 웰들을 후속적으로 PBS로 3 회 세척하고 결합된¹²⁵I-FGF-2를, 각 웰을 수 중의 2% SDS 200 ㎕로 세척하여 회수하였다.¹²⁵I-FGF-2의 수준을 감마 카운터로 측정하였다. 도 3에 보고된 결과는 FGF-2가 플라스틱 고정화된 PTX3에 결합하며 이러한 결합은 FGF-2가 CRP와 불충분하게 반응하고 다른 고정화된 단백질들과는 반응하지 않으므로 특이적인 것임을 보인다.

실시예 4

과잉의 저온 FGF-2의 존재 하에서 플라스틱 고정화된 PTX3에 결합하는 ¹²⁵ I-FGF-2

두 번째 세트의 실험에서 플라스틱 고정화된 PTX3에 대한¹²⁵I-FGF-2의 결합을 유사한 시토크롬 C 농도의 존재 하에 또는 과잉의 가용성 PTX3(300 nM)의 존재 하에 과잉의 고유 또는 열 변성된 저온 FGF-2(100 nM) 모두의 존재 하에서 시험하였다. 상기 실험을 상술한 바와 같이 수행하였다: 도 4에 보고된 결과는 저온 FGF-2와 가용성 PTX3가¹²⁵I-FGF-2와 플라스틱 고정화된 PTX3간의 상호작용을 억제하였음을 입증한다. 열-불활성화된 FGF-2 및 시토크롬 C(FGF-2와 동일한 분자량 및 등전점을 갖는다)가 PTX3와 결합할 수 없다는 관찰은 성장 인자의 기본적인 성질이라기 보다는 그의 정확한 형태가 PTX3와의 결합 능력에 관련 있음을 시사한다.

실시예 5

FGF-2/PTX3 상호작용의 해리 상수(Kd)

본 실험에 의해 FGF-2/PTX3 상호작용의 해리 상수(Kd)를 측정하였다. 이를 위해서 증가 용량의¹²⁵I-FGF-2를 플라스틱 고정화된 PTX3와 배양하고 결합 결과를 스캐차드(Scatchard) 플롯에 의해 분석하였다. 도 5에 보고된 결과는 FGF-2가 포화시킬 수 있는 방식으로, 증가된 친화성(Kd=8-16 nM)으로 PTX3와 결합함을 입증한다. 이러한 친화성은 PTX3의 그의 생리적 리간드 Clq와의 상호작용에 대해 앞서 산출된 친화성과 유사하다.

실시예 6

내피 세포에의 FGF-2 결합에 대한 PTX3의 효과

형질전환된 소 태아 대동맥 내피 세포 GM7373을 10% FCS를 함유하는 이글스 최소 필수 배지(Eagle's MEM)의 24-웰 접시에서 80,000 세포/㎠로 시딩하였다. 37 ℃에서 24 시간 후에, 유착 세포들을 FCS가 없는 이글스 MEM으로 2 회 세척하고 후속적으로 증가 농도의 PTX3의 존재 또는 부재 하에 0.15% 젤라틴 및 20 mMHEPES(pH 7.5)를 함유하는 이글스 MEM 중에서¹²⁵I-FGF-2(10 ng/㎖)와 함께 4 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양의 끝에서 저(HSPG) 및 고 친화성 수용체(FGFR)에 결합된¹²⁵I-FGF-2의 양을 문헌[Moscatelli, 1987 J. Cell. Physiol. 131:123-30]에 개시된 바와 같이 평가하였다. 간단히 세포를 20 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중의 2M NaCl로 2 회 세척하여 저 친화성 결합 부위에 결합된¹²⁵I-FGF-2를 제거하고 20 mM 아세트산 나트륨(pH 4.0) 중의 2M NaCl로 2 회 세척하여 고 친화성 결합 부위에 결합된¹²⁵I-FGF-2를 제거하였다. 비-특이적인 결합을 100 배 몰 과잉의 비 표지된 FGF-2의 존재 하에서 측정하고 모든 값으로부터 감하였다. 도 6에 보고된 결과는 PTX3가 용량 의존적인 방식으로 내피 세포 상의 고- 및 저-친화성 수용체에 대한 FGF-2의 결합을 억제할 수 있음을 입증하였다.

실시예 7

내피 세포상의 FGF-2에 의해 발휘된 미토겐 활성에 대한 PTX3의 효과

GM 7373 세포를 10% FCS를 함유하는 이글스 MEM의 48-웰 플레이트에서 75,000 세포/㎠로 시딩하였다. 37 ℃에서 24 시간 후에 유착 세포들을 FCS가 없는 이글스 MEM으로 2 회 세척하고 후속적으로 FGF-2(10 ng/㎖) 및 증가 농도의 PTX3의 존재 또는 부재 하에 0.4% FCS를 함유하는 이글스 MEM에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양의 끝에서 세포를 트립신 처리하고 카운트하였다. 다른 세트의 실험에서 GM 7373 세포를 상이한 미토겐 자극: 10% FCS; 5 ㎍/㎖의 디아실-글리세롤(DAG); 10 ng/㎖의 포르볼 에스테르(TPA); 30 ng/㎖의 상피 성장 인자(EGF) 또는 30 ng/㎖의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 존재 하에서 상술한 바와 같이 처리하였다. 도 7에 보고된 결과는 PTX3가 30 nM과 동등한 ID₅₀으로 용량-의존적인 방식으로 FGF-2에 의해 내피 세포에 대해 발휘된 미토겐 활성을 억제함을 입증하였다. 이 값은 FGF-2-PTX3 상호작용에 대해 산출된 Kd와 유사하다. 상기 결과는 PTX3에 의한 FGF-2 생물 활성의 억제가 세포 외 부위에서 그의 격리로 인한 것임을 시사한다. FGF-2에 대한 PTX3의 억제 활성은 다른 미토겐들을 사용하여 세포 증식을 유도하는 경우에는 탐지될 수 없기 때문에 특이적인 것이다.

실시예 8

형질전환된 소 태아 대동맥 내피 세포의 증식에 대한 PTX3의 효과

본 실험에서 FGF-2를 암호화하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시킨 쥐의 대동맥 내피 세포 주 MAE3F2T의 증식에 대한 PTX3의 효과를 조사하였다(Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). 상기 세포들은 내생 FGF-2에 의해 유도된 자가 분비 자극 루프에 반응하여 증식할 수 있다(Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). MAE3F2T 세포를 10% FCS가 첨가된 둘베코 배지(DMEM)의 48-웰 플레이트에서 10,000/㎠로 시딩하였다. 37 ℃에서 24 시간 후에 유착 세포들을 FCS가 없는 DMEM으로 2 회 세척하고 PTX3(70 nM), 항 FGF-2 특이적인 항체 또는 슈라민(50 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에 0.4% FCS를 함유하는 DMEM 중에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 슈라민은 세포 외 FGF-2를 격리시키는 능력이 공지되어 있으며 그의 생물학적 활성을 억제한다(Rusnati et al., 1996, Mol. Biol. Cell. 7:369-381). 배양의 끝에서 세포들을 트립신 처리하고 버커(Burker) 챔버에서 카운트하였다. 도 8에 보고된 결과는 PTX3가 MAE3F2T세포에서 FGF-2에 의해 유도된 자가 분비 자극 루프를 차단하여 항 FGF-2 항체 및 슈라민에 의해 발휘된 것과 유사한 방식으로 FGF-2 의존적인 증식을 억제할 수 있음을 입증한다.

실시예 9

FGF-2에 의해 생체 내에서 유도된 혈관신생에 대한 PTX3의 효과

PTX3의 혈관형성 억제 능력을 생체 내에서 병아리 배 융모요막(CAM) 분석으로 평가하였다. 간단히, 3 일 된 병아리 수정란의 달걀 껍질에 창을 내었다. 8 일 째에 젤라틴 스펀지를 상기 CAM에 이식하고 PTX3(5 ㎍/스펀지)의 존재 또는 부재 하에(그룹 당 5 내지 6 개의 배) PBS 단독 또는 FGF-2(500 ng/스펀지)를 함유하는 PBS 10 ㎕를 흡착시켰다. 4 일 후에, CAM을 자이스 SR 입체 현미경 하에서 알 중에서 관찰하고 혈관형성 반응을 시험 샘플에 대해 알고 있지 않은 2 명의 연구자에 의해 0에서 4+의 임의적인 등급으로 등급을 매기게 하였으며, 이때 0은 혈관형성 반응이 없음을 나타내고, 4+는 가장 강한 활성을 나타낸다.

도 9에 보고된 결과는 PTX3가 FGF-2에 의해 생체 내에서 유도된 혈관신생을차단할 수 있음을 입증하였다.

실시예 10

PTX3에 의한 유전자 요법

FGF-2를 과 발현하는 쥐의 내피 세포(FGF2MAE3F2T라 명명함)(Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60)를 상업적인 발현 벡터 pLXSH(Clontech)에 서브 클로닝시킨 인간 PTX3 완전 길이 cDNA로 형질감염시켰다.

생체 외 연구에서 수득된 상기 형질감염된 세포 주에 대해 FGF2MAE3F2T 세포의 FGF-2 의존적인 증식에 대한 PTX3 과 발현 효과 및 3 차원 피브린 겔 상의 그의 침습 양상을 연구하였다.

상세히, 상이한 수준의 PTX3를 발현하는 다수의 FGF2MAE3F2T 클론 및 FGF2MAE3F2T 모 세포(PTX3를 생산하지 않음)를 10% FCS가 첨가된 둘베코 배지(DMEM)의 48-웰 플레이트에서 10,000/㎠로 시딩하였다. 37 ℃에서 24 시간 후에 유착 세포를 FCS가 없는 DMEM으로 2 회 세척하고 37 ℃에서 0.4% FCS를 함유하는 DMEM에서 상이한 기간 동안 배양하였다. 배양의 끝에서 세포를 트립신 처리하고 버커 챔버에서 카운트하였다. 도 10에 보고된 결과는 PTX3 과 발현이 FGF2MAE3F2T 세포 증식을 억제하고 이러한 억제의 정도는 시험된 상이한 클론들에 의해 생산된 PTX3의 양과 상관이 있음을 입증하였다.

3 차원 피브린 겔 상에서 PTX3를 과 발현하는 FGF2MAE3F2T 클론의 침습적인 양상을 평가하기 위해서, 세포 응집체를 문헌[Gualandris et al., 1996, CellGrowth Diff. 7:147-60]에 개시된 바와 정확히 같게 아가로스-코팅된 플레이트 상에서 제조하였다. 상기 응집체들을 피브린-코팅된 48-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 시딩 직후, 피브리노겐(2.5 ㎎/㎖) 및 트롬빈(250 mU/㎖)을 함유하는 칼슘 비 함유 배지 250 ℓ를 각 웰에 가하고 37 ℃에서 5 분간 겔화시켰다. 이어서, 500 ℓ의 배양 배지를 상기 겔의 상부에 가하였다. 모든 실험에서, 피브린 용해 억제제인 트라실올을 상기 겔 및 상기 배양 배지에 200 KIU/㎖로 가하여 기질의 용해를 방지하였다. 방사상으로 성장하는 세포 싹들의 형성을 컴퓨터화된 상 분석에 의해 2 일 후에 평가하였다.

도 11에 보고된 결과는 FGF2MAE3F2T 클론을 과 발현하는 PTX3의 침습적인 능력이 FGF2MAE3F2T 모 세포의 능력보다 현저하게 더 낮음을 입증한다.

수득된 결과는 PTX3가 cDNA의 유전자 전달 후에 내생적으로 생산될 때 내피 세포에서 FGF-2 활성을 억제함을 입증한다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물을 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기된 질병의 치료를 위해 공지된 방법(In Vivo. 1998 Jan-Feb; 12(1):59-67; In Vivo. 1998 Jan-Feb; 12(1): 35-41; In Vivo. 1994 Nov-Dec; 8(5):771-80)에 따라 유전자 요법 프로토콜에 사용할 수 있다.

Claims

성장 인자 FGF-2의 생물학적 활성의 억제에 의해 저지되는 질병의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인의 용도.
제 1 항에 있어서, 질병이 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기되는 용도.
제 2 항에 있어서, 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화가 섬유 아세포 또는 평활근 세포의 조절되지 않은 증식과 연계된 질병을 자극하는 용도.
제 3 항에 있어서, 질병이 과도한 섬유 아세포 반응과 연계된 흉터 및 혈관 성형술 후 재 협착증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
제 2 항에 있어서, 성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화가 변경된 혈관형성을자극하는 용도.
제 5 항에 있어서, 변경된 혈관형성에 의해 자극되는 질병이 관절염 질환, 종양, 종양 전이, 당뇨성 망막 병증, 건선, 만성 염증 및 죽상경화증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
제 6 항에 있어서, 종양이 육종, 암종, 암양종, 골 종양 및 신경 내분비 종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 긴 펜트락신 PTX3가 천연으로 존재하는 PTX3인 용도.
제 8 항에 있어서, 긴 펜트락신 PTX3가 인간 PTX3인 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 긴 펜트락신 PTX3가 합성 기원의 PTX3인 용도.
성장 인자 FGF-2의 변경된 활성화에 의해 야기되는 질병의 유전자 요법을 위해, 긴 펜트락신 PTX3 또는 그의 유도체 또는 그의 도메인을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 제조하기 위한 상기 cDNA의 용도.
제 11 항에 있어서, PTX3 또는 그의 유도체를 암호화하는 유전자를 함유하는 cDNA가 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 운반되는 용도.
제 11 항에 있어서, 질병이 종양, 종양 전이, 과도한 섬유 아세포 반응과 연계된 흉터 및 혈관 성형술 후 재 협착증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
긴 펜트락신 PTX3와 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 조합.
유효 성분으로서 제 14 항의 조합, 및 하나 이상의 약리학적으로 허용 가능한 부형제 또는 비히클을 함유하는 약학 조성물.
제 15 항에 있어서, 항암 약물이 알킬화제, 국소이성화효소 억제제, 튜불린 억제제, 중격 화합물, 대사길항물질, 천연 산물, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 효소, 탁산 및 세포 분화성 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
FGF-2의 증가된 발현이 종양의 보다 큰 침습성을 자극하는, 상기 종양을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 긴 펜트락신 PTX3의 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도.
FGF-2의 증가된 발현이 보다 큰 전이성을 자극하는 종양 전이 개시를 예방하기 위한 약제의 제조를 위한, 긴 펜트락신 PTX3의 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 긴 펜트락신 PTX3가 항암 약물의 보조제로서 존재함을 특징으로 하는 용도.