KR20110117982A - Ｎｆａｔ５ 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Ｎｆａｔ５ 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 NFAT5 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NFAT5 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드 또는 NFAT5 단백질에 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환 치료제, 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 본 발명의 조성물을 이용한 혈관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 혈관형성과 관련된 질환의 세포에서 과발현되는 NFAT5 유전자 또는 단백질의 발현 및 활성을 저해하여 혈관형성을 유도하는 내피세포의 증식, 이동 및 튜브 형성과 사이토카인의 생성을 억제하는 효과가 있고, 혈관형성과 관련된 질환의 증상을 감소시키는 효과가 있으므로 과도한 혈관형성으로 인해 유발될 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 제제로 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 NFAT5 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NFAT5 유전자의 발현 또는 NFAT5 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환의 치료제, 상기 치료제를 스크리닝하는 방법 및 혈관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 상처치유와 염증반응과 같은 정상적인 인체 방어 및 생리적 현상과 초기 발생과정에 있어서 아주 중요한 역할을 한다. 이러한 혈관신생은 단백질 분해효소에 의한 혈관 기저막의 분해, 혈관벽을 형성하는 혈관내피세포의 이동, 증식 및 혈관내피세포 분화에 의한 튜브(관)의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 단계를 포함하는 일련의 순차적인 단계를 통해 일어난다.
또한 혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데(Folkman and Cotran., Int . Rev . Exp . Patho., 16, 207~248, 1976), 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증 등 여러 가지 질환들이 야기된다. 특히, 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있는데, 첫째로는 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 역할을 하며, 둘째로는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포가 온 몸에 퍼져 전이가 되도록 하는 역할을 한다.
따라서 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암을 포함하는 여러 질환의 예방 및 치료에 있어서 중요한 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제의 개발에 대한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 또한, 이러한 혈관신생 억제제는 항암 치료법에 있어서 특히 각광을 받고 있는데 이러한 이유로는 첫째, 혈관신생 억제제는 모든 고형성 종양에서 공통적으로 사용할 수 있는 가능성이 있고, 둘째, 기존의 항암 화학요법은 암 세포가 빠르게 성장하는 특징을 이용하여 치료하기 때문에 비교적 세포주기가 빠른 골수세포 및 위장관계 세포에 독성 작용을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 장기 투여하여도 비교적 부작용이 적다는 장점이 있고, 셋째, 하나의 혈관세포는 수백 개의 암세포에 영양분과 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포 억제를 통해 많은 암세포를 억제할 수 있으며, 넷째, 기존의 항암 요법의 경우에는 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 직접적으로 혈관 내피세포에 접촉하여 작용함으로써 약물 전달을 용이하게 할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문이다.
한편, 현재까지 개발된 혈관신생 억제제로는 약 200 여종이 보고되어 있는데, 이러한 혈관신생 억제제로는 특정 혈관 형성촉진인자의 활성을 감소시키는 기전, 혈관내피세포의 성장억제 또는 고사를 유도하는 기전, 혈관형성 촉진인자나 내피세포 생존인자를 조절하는 간접인자들의 작용을 억제하는 기전 및 체내에 존재하는 혈관신생 억제제들의 활성을 증가시키는 기전에 역할을 하는 4가지로 크게 분류할 수 있고, 특히 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), PK5, 프로트롬빈 크링글 2(prothrombin kringle 2)과 같은 혈관형성 억제제들이 잘 알려져 있다(O'Relly, M.S. 등 Cell., 79, 315~328, 1994; Lee. T.H., Biol . Che ., 273, 28805~28812, 1998).
그러나 지금까지 개발된 대부분의 혈관신생 억제제들은 화합물의 형태로서 이들은 우수한 활성을 오랜 시간 동안 유지하기 어려우며, 대량 생산이 어렵고, 제조과정에 있어서도 비용이 많이 든다는 문제점이 있을 뿐만 아니라 약학적 특성이 낮고 쉽게 변성될 수 있는 문제점이 있다.
따라서 최근에는 이러한 문제점을 극복하기 위해 혈관신생을 억제하는 억제제로서 핵산 형태의 억제제를 개발하려는 연구들이 시도되고 있는데, 핵산은 화합물에 비해 생체에 대한 이용성도 높고 친화력도 우수하다는 분자적 특징을 가지고 있어 보다 우수한 혈관신생 억제제로서 사용할 수 있는 장점이 있다.
그러나 아직까지 혈관신생 억제 효과가 우수한 타겟 유전자 및 이러한 유전자에 상보적인 핵산을 이용하여 혈관신생을 억제할 수 있는 억제제에 대한 기술은 미흡한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 과도한 혈관형성으로 인해 유발하는 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환 치료제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물을 혈관형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 과도한 혈관형성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 NFAT5 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드 및 NFAT5 단백질에 특이적인 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NFAT5의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NFAT5 유전자에 특이적인 siRNA는 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환 치료제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
NFAT5 유전자 또는 NFAT5 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시키는 단계;
상기 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
상기 측정 결과로부터 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 시료는 과도한 혈관형성으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 혈관형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 과도한 혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제는 혈관형성과 관련된 질환 세포에서 과발현되는 NFAT5 유전자 또는 단백질의 발현 및 활성을 저해하여 혈관형성을 유도하는 내피세포의 증식, 이동 및 튜브 형성과 사이토카인의 생성을 억제하는 효과가 있고, 혈관형성과 관련된 질환의 증상을 감소시키는 효과가 있으므로 과도한 혈관형성으로 인해 유발될 수 있는 질환들을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 제제로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 혈관형성 관련 질환인 류마티스 관절염 및 골관절염의 활막세포를 대상으로 상기 세포내에서 발현된 NFAT5의 발현 정도를 면역화학염색법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, 도 1a 내지 1e는 류마티스 관절염의 활막세포를 대상으로 관찰한 것이며, 도 1f 내지 1h는 골관절염의 활막세포를 대상으로 관찰한 것이고, 도 1i는 활막세포에 100mM의 NaCl을 처리하여 삼투 스트레스를 유도한 후, 시간에 따른 NFAT5의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 도 1j 및 1k는 사이토카인의 처리에 따른 NFAT5의 발현 정도 및 세포내에서의 이동을 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 NFAT5의 발현을 억제할 경우, 혈관형성 관련 질환의 증상에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 2a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 콜라겐으로 관절염을 유도한 후, 시간에 따른 통증의 정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 2b는 마우스의 발의 부푼 정도를 측정한 것을 나타낸 그래프이며, 도 2c는 상기 마우스들의 관절 조직 부분을 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색하여 염증 정도, 활막세포의 증식 및 관절의 파괴정도를 관찰한 사진이고, 도 2d는 염증성 세포 침투(IFLM), 활막세포의 증식(SF) 및 관절 파괴(JD) 정도의 측정 결과를 계산한 평균 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 NFAT5이 활막세포의 생존과 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 NFAT5 siRNA를 이용한 결과를 나타낸 것으로서, 도 3a는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA가 도입된 활막세포의 세포 생존율 및 형태를 CCK-8 분석 및 현미경 관찰을 통해 확인한 것을 나타낸 것이고, 3b는 세포사멸 정도를 TUNEL 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 3c는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA를 세포에 각각 처리하고 세포증식을 유도하는 TNF-a 및 TGF-β인 사이토카인을 각각 처리한 후, 세포 증식정도를 비교하여 나타낸 그래프이고, 3d는 NFAT5 siRNA에 의한 세포수의 변화를 나타낸 그래프이며, 3e는 NFAT5 siRNA에 의한 세포 증식 인자인 사이클린 D 및 E의 발현 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 NFAT5의 발현 억제에 따른 혈관내피 세포의 증식 및 이동 변화를 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 4a는 혈관내피세포에 NFAT5 siRNA를 처리한 후, 시간에 따른 세포 생존율을 MTT 어세이를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이고. 도 4b는 NFAT5 siRNA가 처리된 혈관내피세포의 증식 정도에 내피세포 성장인자인 VEGF가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이며, 도 4c는 NFAT5 siRNA에 따른 내피세포에 의한 튜브 형성 억제 정도를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 4d 및 4e는 NFAT5 siRNA가 혈관내피세포의 이동 및 주화성을 억제시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 대식세포의 이동 및 사이토카인의 생성에 NFAT5가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 5a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 3% 티오글리콜레이트를 복강내 주사한 후, 상기 마우스로부터 분리된 대식세포에 LPS 및 IL-1β를 처리한 다음, 대식세포의 이동정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 5b는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포에서 TNF-a의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 5c 및 5d는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포를 LPS 또는 IL-1β으로 자극시킨 후, 생성되는 TNF-a 및 IL-12의 양을 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 NFAT5의 발현을 억제할 경우, 혈관형성 관련 질환의 증상에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 2a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 콜라겐으로 관절염을 유도한 후, 시간에 따른 통증의 정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 2b는 마우스의 발의 부푼 정도를 측정한 것을 나타낸 그래프이며, 도 2c는 상기 마우스들의 관절 조직 부분을 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색하여 염증 정도, 활막세포의 증식 및 관절의 파괴정도를 관찰한 사진이고, 도 2d는 염증성 세포 침투(IFLM), 활막세포의 증식(SF) 및 관절 파괴(JD) 정도의 측정 결과를 계산한 평균 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 NFAT5이 활막세포의 생존과 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 NFAT5 siRNA를 이용한 결과를 나타낸 것으로서, 도 3a는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA가 도입된 활막세포의 세포 생존율 및 형태를 CCK-8 분석 및 현미경 관찰을 통해 확인한 것을 나타낸 것이고, 3b는 세포사멸 정도를 TUNEL 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 3c는 스크램블 siRNA(대조군) 및 NFAT5 siRNA를 세포에 각각 처리하고 세포증식을 유도하는 TNF-a 및 TGF-β인 사이토카인을 각각 처리한 후, 세포 증식정도를 비교하여 나타낸 그래프이고, 3d는 NFAT5 siRNA에 의한 세포수의 변화를 나타낸 그래프이며, 3e는 NFAT5 siRNA에 의한 세포 증식 인자인 사이클린 D 및 E의 발현 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 NFAT5의 발현 억제에 따른 혈관내피 세포의 증식 및 이동 변화를 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 4a는 혈관내피세포에 NFAT5 siRNA를 처리한 후, 시간에 따른 세포 생존율을 MTT 어세이를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이고. 도 4b는 NFAT5 siRNA가 처리된 혈관내피세포의 증식 정도에 내피세포 성장인자인 VEGF가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이며, 도 4c는 NFAT5 siRNA에 따른 내피세포에 의한 튜브 형성 억제 정도를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 4d 및 4e는 NFAT5 siRNA가 혈관내피세포의 이동 및 주화성을 억제시킨다는 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 대식세포의 이동 및 사이토카인의 생성에 NFAT5가 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 것으로서, 도 5a는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스를 대상으로 3% 티오글리콜레이트를 복강내 주사한 후, 상기 마우스로부터 분리된 대식세포에 LPS 및 IL-1β를 처리한 다음, 대식세포의 이동정도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 5b는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포에서 TNF-a의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 5c 및 5d는 NFAT5 유전자가 발현되는 대조군 마우스 및 NFAT5 유전자의 발현이 결핍된 마우스의 대식세포를 LPS 또는 IL-1β으로 자극시킨 후, 생성되는 TNF-a 및 IL-12의 양을 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 혈관형성을 억제하는 활성을 갖는 NFAT5의 억제제에 대한 것으로서, 보다 구체적으로는 NFAT5 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드 및 NFAT5 단백질에 특이적인 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서는 혈관형성을 억제하는 새로운 억제제의 타겟으로 NFAT5 유전자에 초점을 두었는데, 전사인자인 상기 NFAT5(nuclear factor of activated T cells 5)는 NFAT 패밀리의 한 종류로서, NFAT 단백질은 IL-2 프로모터에 결합하여 전사를 촉진하는 작용을 하는 것으로 밝혀진 바 있고, 현재까지 5 종류가 확인되었다. 즉, NFAT 패밀리에는 NFAT1(NFATp 또는 NFATc2), NFAT2(NFATc 또는 NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx 또는 NFATc3) 및 NFAT5로 구성되어 있으며, NFAT 단백질의 가장 중요한 기능으로는 면역세포의 분화와 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, T 세포에서 NFAT 단백질은 흉선세포(thymocytes)의 발달, T 세포의 분화, 자가면역내성(self-tolerance) 등의 활성 및 조절에 관여하며, NFAT 패밀칼슘 신호와 다른 신호의 상호작용에 의해 면역반응을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 특히 NFAT 패밀리 중에서 NFAT5는 처음에 TonEBP(tonicity enhancer binding protein)으로 동정되었으며, 삼투 스트레스에 의해 유도되는 유전자의 상부 조절 부위에 존재하는 긴장성 (tonicity) 반응 요소에 결합하며, 최근에는 NFAT5가 림프구의 증식과 생존에 중요한 역할을 하고, CYR61 의존적 경로를 통해 근육의 분화과정에서 근원세포의 이동을 매개한다는 내용이 보고된 바 있다.
한편, 본 발명에서는 과다한 혈관형성으로 유발되는 질환의 경우, 상기 질환의 세포에서 NFAT5 유전자가 과다 발현되고 있다는 사실을 확인하였으며, 나아가 NFAT5 유전자의 발현을 억제하였을 경우, 상기 질환의 중증도가 감소됨을 확인함으로써 NFAT5의 억제제가 혈관형성 관련 질환을 예방 및 치료할 수 있는 치료제로 사용될 수 있음을 최초로 규명하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 과도한 혈관형성으로 인해 유발되는 질환인 류마티스 관절염 및 골관절염의 환자로부터 수득한 활막세포를 대상으로 상기 세포에서 발현된 NFAT5 단백질을 면역화학 염색법을 통해 확인한 결과, 정상인의 활막세포에 비해 류미티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막세포에서는 NFAT5이 과다 발현되고 있다는 사실을 확인하였다(실시예 1 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5가 혈관형성이 정상적으로 조절되지 못하는 경우, 과발현된다는 사실을 알 수 있었다.
일반적으로 혈관형성, 즉 신생혈관은 조직에서 기존의 맥관구조로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정을 말하는데, 병리학적인 혈관형성은 어느 정도의 염증과 거의 일정하게 관련되어 있으며, 따라서 염증을 유발하는 물질에 의해 혈관이 형성 또는 신생될 수 있다.
이에 본 발명자들은 혈관형성 질환에서 과발현되고 있는 NFAT5 유전자가 염증성 사이토카인 및 삼투 스트레스에 의해 발현이 조절되는지를 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 류마티스 관절염 및 골관절염의 환자로부터 수득한 활막세포에 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β와 삼투 스트레스를 유도하는 NaCl을 처리한 다음, 세포내에서의 NFAT5의 발현 및 이동을 웨스턴 블럿 및 공초점 현미경으로 분석한 결과, 염증성 사이토카인 및 삼투 스트레스가 혈관신생 질환에서 NFAT5의 발현을 더욱 증가시킨다는 사실을 알 수 있었으며, 이러한 처리에 의해 발현된 NFAT5 단백질은 세포 내에서 핵으로 이동된다는 사실을 알 수 있었다(실시예 2 참조).
나아가 본 발명자들은 상기 결과를 통해 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제한다면 혈관형성 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 예상을 하였고, 이러한 예상을 규명하기 위해, 본 발명의 일실시예에서는 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스인 NFAT5+/- 및 대조군으로 NFAT5+/+ 마우스를 사용하여 항-타입 II 콜라겐 항체를 정맥 주사하여 혈관형성 관련 질환인 관절염을 유도한 후, 시간에 따른 마우스들의 통증 정도를 분석한 결과, 대조군인 NFAT5+/+ 마우스에 비해 NFAT5+/- 마우스의 경우, 질환의 중증도가 현저히 감소된 것으로 나타났고, 염증의 정도, 활막의 증식정도 및 관절 파괴 정도도 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(실시예 3 참조).
따라서 상기 결과를 통해 혈관형성 관련 질환 세포에서 NFAT5 유전자의 부분적인 결함만으로도 상기 질환의 중증도를 경감시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, NFAT5 유전자의 발현 억제를 위해 NFAT5 siRNA를 류바티스 관절염 및 골관절염의 활막세포에 형질도입한 후, NFAT5 siRNA에 따른 활막 세포의 세포 생존율 및 세포 증식정도를 측정하였는데, 그 결과, NFAT5 siRNA가 도입된 활막 세포의 경우, 대조군에 비해 아폽토시스가 증가하여 세포생존율은 감소되고 반면 세포 사멸은 증가된 것으로 나타났으며, 세포 증식에 영향을 주는 인자들인 사이클린 D 및 E의 발현도 감소되는 것으로 나타났다(실시예 4 참조). 그러므로 NFAT5의 발현 또는 활성을 억제하는 것은 병리 세포인 관절염 활막세포의 세포증식을 억제하고 반면 세포사멸을 유도함을 통해 치료학적 효과가 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명에 따른 NFAT5의 발현 또는 활성 억제는 혈관내피세포의 증식 및 이동을 억제하는 특징이 있다.
한편, 혈관형성 이상으로 초래되는 질환 중 암의 경우, 암 조직이 커지기 위해서는 산소 및 영양분의 공급이 요구되며, 이러한 공급통로를 만들기 위해 혈관신생(angiogenesis)이 수반된다. 암 조직에서 혈관신생 과정을 보면, 먼저 암세포가 혈관신생 유도인자를 분비하고 이러한 유도인자가 내피세포에 존재하는 수용체와 결합을 하면서 새로운 혈관의 형성과정이 시작된다. 자극된 내피세포는 성장하기 시작하면서 단백질 가수분해 효소를 분비하게 되고 이러한 단백질 가수분해 효소에 의해 기저막(base membrane)의 분해가 일어나 내피세포가 혈관신생 유도인자가 나오는 곳으로 향하여 움직이게 되는데 이러한 현상을 세포 이동이라고 한다. 이렇게 이동한 내피세포는 혈관 사이에 붙은 후(세포 부착) 침투할 장소로 이동한 다음, 기저막을 뚫고 들어가(세포 침투) 서로 연결되어 튜브를 형성하며, 마지막으로 속이 빈 스프라우트(sprouts)의 끝이 결합하면서 루프가 형성되고 이곳으로 혈액이 들어오게 된다. 즉 이러한 일련의 과정 중 어느 하나가 차단되면 혈관신생을 감소시킬 수 있어 암을 포함하는 혈관신생으로 인해 유도되는 질환을 치료할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
이에 본 발명자들은 NFAT5의 발현 또는 활성 억제가 내피세포의 증식 및 이동을 억제할 수 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA를 도입한 후, 시간별로 내피세포의 세포사멸 및 세포증식 정도를 확인하였는데, 그 결과, NFAT5 siRNA로 형질도입된 내피세포의 경우, 스크램블 siRNA가 도입된 대조군에 비해 세포생존율 및 세포증식이 감소된 것으로 나타났으며, 세포이동 및 튜브형성과 함께 세포 주화성도 감소된 것으로 나타났다(실시예 5 참조).
따라서 NFAT5의 발현 또는 활성 억제는 내피세포의 증식, 이동 및 튜브형성을 감소키는 효과가 있으므로 암을 비롯한 혈관형성으로 인한 질환들을 치료할 수 있는 효과가 있다.
그러므로 본 발명은 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제는 서열번호 1로 표시되는 NFAT5 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA 또는 shRNA일 수 있으며, 또는 NFAT5 단백질에 대한 특이적인 항체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 NFAT5 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.
본 발명에서 상기 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 NFAT5 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, NFAT5 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine),스퍼민(spermine),폴리실아잔(polysilazane),폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine),폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium),폴리알리라민(polyallylamine),키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
바람직하게 상기 NFAT5 유전자에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA는 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 NFAT5 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 혈관형성 관련 질환 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 타겟 세포 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 상기 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물은 혈관신생 또는 혈관형성 억제를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 혈관형성 억제용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제, 즉, NFAT5 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드 또는 NFAT5 단백질에 특이적인 항체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 약학적으로 유효한 양이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.
비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의에 따른 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 저해제의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제의 혈관신생 억제제 또는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않는다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명의 혈관형성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관형성에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 혈관신생 억제용 약제, 즉 혈관형성 관련 질환 치료제를 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 조성물을 혈관신생 형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 과도한 혈관형성 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 혈관형성에 의해 유발되는 질환 또는 혈관신생 형성이 비정상적인 질환은 이에 제한되지는 않으나, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 NFAT5를 이용하여 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있으며, 바람직하게는, NFAT5 유전자 또는 NFAT5 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 분석하고자 하는 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과로부터 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성이 상기 시료를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 시료는 과도한 혈관형성으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 NFAT5 유전자의 발현양 또는 NFAT5 단백질의 양은 NFAT5 유전자의 mRNA양 일 수 있으며, 또는 상기 mRNA로부터 번역(translation) 과정을 거쳐 생성된 폴리펩티드일 수 있다.
상기에서 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성을 측정하는 방법은 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행할 수 있다.
상기에서 “생물학적 시료”란 혈관형성 관련 질환이 발생 또는 진행 정도에 따른 환자 또는 상기 질환으로 의심되는 환자로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 세포일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1>
혈관형성 관련 질환의 세포에서
NFAT5
의 발현 양상 분석
본 발명자들은 과도한 혈관신생으로 인해 발생하는 질환의 세포내에서 NFAT5 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 FLS(fibroblast-like synoviocytes)을 각각 수득한 후(Yoo, S.A et. al., Calcineurin is expressed and plays acritical role in inflammatory arthritis.JImmunol 177,2681-2690, 2006 참조), FCS(fetal calf serum) 또는 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITSA)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 또한, 혈관내피세포인 HUVEC 세포는 정상의 제대혈 정맥으로부터 분리하였고 20% FCS가 함유된 M199 배지에서 배양하였다. 이후, 상기 세포내에서 발현된 NFAT5의 양은 면역화학 염색법을 통해 확인하였는데, 즉, 상기 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 수득한 활막을 5um로 절단한 후, 30분 동안 펩신으로 처리하고 상온에서 30분 동안 BSA(bovine serum albumin)로 블록킹하였다. 그런 뒤, 4℃에서 밤새도록 NFAT5에 대한 항체(Maryland 대학으로부터 구입)를 반응시켰고, 이때 대조군으로 시그마사로부터 구입한 비특이성 마우스의 IgG을 사용하였다. 이후, 각 절편들이 포함된 슬라이드(silde)는 TBS 버퍼로 3번 세척한 후, 습기 있는 챔버에서 바이오틴이 결합된 항-마우스 IgG와 반응시켰다. 그런 뒤, NFAT5 양성 세포들을 3‘3- 디아미노-벤디딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)에 의한 퍼옥시다제-결합형 스트렙타비딘을 이용하여 검출하였고, 상기 슬라이드는 헤마토크실렌으로 염색하였다.
또한, 본 발명자들은 NFAT5가 주위의 삼투성에 의해 발현이 조절된다는 내용이 보고된 바 있어, 상기 FLS 세포에 NaCl를 처리한 후, 웨스턴 블럿을 통해 NFAT5의 발현 양상을 분석하였는데, 이때 상기 웨스턴 블럿은 100mM의 농도로 NaCl이 처리된 FLS세포를 당업계에 공지된 통상적인 용해 버퍼를 이용하여 용해시킨 후, 불용성 물질들을 12000g에서 20분간 4℃에서 원심분리하여 제거하였다. 이후 수득한 최종 단백질의 농도를 브래드포드 분석을 통해 정량한 다음, SDS-PAGE로 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 전기 이동시킨 후, NFAT5에 대한 항체(Maryland 대학으로부터 구입)를 이용하여 반응시키고 ECL 용액을 사용하여 필름에 가시화 시켰다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막 조직에서 NFAT5는 매우 많은 양이 발현된 것으로 나타났고, 특히 류마티스 관절염의 활막 조직의 경우 골관절염 보다 NFAT5가 더 많이 발현되어 있는 것을 알 수 있었다(도 1a 내지 1h 참조).
또한, 상기 세포에 NaCl을 각 농도별로 처리한 후 NFAT5의 발현정도를 측정한 결과, 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 활막 세포 모두에서 NaCl 농도 의존적으로 NFAT5의 발현은 증가하는 것으로 나타났다(도 1i 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 과다 혈관생성 질환에서 NFAT5 유전자는 과발현되고 있다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 주위의 삼투압 환경이 조성될 경우, 그 발현양은 더 증가한다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
2>
염증성 사이토카인에 의한
NFAT5
의 발현 양상 분석
염증성 사이토카인에 의해 NFAT5의 발현양상이 변화되는지를 조사하기 위해, 상기 류마티스 관절염 및 골관절염 환자로부터 수득한 활막 세포를 대상으로 전 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β를 각각 10ng/ml의 양으로 처리하고 12시간 배양한 다음, NFAT5에 대한 항체를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 TNF-a, IL-1β 및 NaCl의 처리에 따른 NFAT5 단백질의 세포내에서의 이동을 관찰하기 위해 TNF-a 및 IL-1β를 각각 10ng/ml으로 처리하고, 100mM의 농도로 NaCl를 처리한 세포들을 각각 글래스 챔버 슬라이드에 분주한 후, 차가운 메탄올로 고정시키고, 0.25% Triton X-100이 함유된 PBS 용액으로 처리한 다음, NFAT5에 대한 항체를 사용하여 4℃에서 반응시켰다. 이후 Alexa 488-결합된 항 래빗 IgG를 30분 동안 반응시키고 공초점 현미경을 통해 세포내에서의 NFAT5 단백질의 위치를 확인하였으며, 이때 핵은 4,6-디아미노-2-페닐리돌(DAPI)을 사용하여 염색하였다.
그 결과, 도 1j에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 TNF-a 및 IL-1β을 처리한 경우, NFAT5의 발현은 처리하지 않은 대조군에 비해 월등히 증가하는 것으로 나타났으며, 발현의 증가 정도는 골관절염에 비해 류마티스 관절염의 경우 더 현저히 증가된 것으로 나타났다. 또한, 공초점 현미경으로 NFAT5 단백질의 위치를 확인한 결과, TNF-a, IL-1β 및 NaCl을 처리한 경우, NFAT5 단백질이 핵으로 이동되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1k 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 염증성 사이토카인 및 삼투성 환경이 혈관신생 질환에서 NFAT5의 발현을 증가시키는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었고, 발현된 NFAT5는 세포 내에서 핵으로 이동되어 있다는 사실을 알 수 있었다.
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실시예
3>
NFAT5
유전자 결핍에 따른 혈관형성 질환의 중증도 경감 효과
상기 실시예들을 통해 혈관형성 질환의 경우 NFAT5가 과발현되어 있다는 사실을 확인함으로써 NFAT5 유전자가 결핍되어 NFAT5 단백질이 발현되지 못할 경우, 혈관형성 질환의 중증도가 감소될 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, 미국 메릴랜드 대학교 의과대학으로부터 수득한 NFAT5 유전자가 결핍된 8주령의 heterozygous 마우스 NFAT5+/- 및 대조군으로 NFAT5+/+ 마우스를 대상으로 관절염을 유도할 수 있는 항-타입 II 콜라겐 항체(5mg)를 정맥 주사한 후, 3일 후에는 50ug의 LPS를 복강내 투여하였다. 이후, 마우스들을 매일 주시하여 관찰하였고, 통증의 정도는 마우스의 팔다리를 관찰하여 통증의 정도에 따라 0~4점을 부여하도록 하였고, 각 마우스당 최대 점수는 16점이 될 수 있도록 하였다. 또한 통증의 정도는 마우스의 발 두께를 측정함을 통해 분석하였는데, 즉 앞발과 뒷발을 매일 마이크로캘리퍼를 사용하여 두께를 측정하였으며, 특정 시간에 발목의 직경을 항체 주입 후 0일째의 두께 측정치로 나눈 값을 발두께 색인으로 사용하였으며, %로 표시하였다. 중증도의 점수는 0~3점으로 측정하였는데, 0은 통증이 없는 것을, 1은 약한 정도의 통증을 2는 보통, 3은 심각한 통증으로 하였다.
나아가 본 발명자들은 NFAT5+/- 및 NFAT5+/+ 마우스를 대상으로 관절 부분의 조직을 당업계에 공지된 헤마토크실렌 및 에오신 염색법을 사용하여 염증 정도, 활막의 증식 및 관절 파괴정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 콜라겐으로 유도된 관절염의 증상은 NFAT5 유전자가 정상적으로 발현되는 NFAT5+/+ 마우스에 비해 NFAT5+/-의 경우, 중증도가 감소한 것으로 나타났으며(도 2a), 마우스의 발 두께를 측정하여 관절의 이상정도를 분석한 결과, 관절 발목의 두께 또한 NFAT5+/+ 마우스에 비해 NFAT5+/-가 현저히 얇은 것으로 나타났고(도 2b 참조), 면역학적 염색을 통해서도 NFAT5+/-의 경우 염증 정도, 활막의 증식 및 관절 파괴정도가 NFAT5+/+ 마우스에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5 유전자의 부분적인 결함만으로도 관절염을 포함하는 혈관형성 질환의 증상을 현저하게 감소시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
4>
NFAT5
의
활막세포에서의
역할 분석
상기 결과를 통해 NFAT5 유전자의 결함이 혈관형성 질환의 증상을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인하였는데, 본 발명자들은 NFAT5 유전자가 실제적으로 활막세포에서 세포의 생존 및 증식에 어떠한 역할을 하는지 조사하였다. 이를 위해, NFAT5의 발현을 억제할 수 있는 siRNA로서 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 NFAT5 siRNA 및 대조군으로 사용하기 위한 컨트롤 NFAT5 siRNA를 각각 제조하였다. 이후, 류마티스 관절염 또는 골관절염의 활막세포에 NFAT5 siRNA(서열번호 2~7 및 서열번호 12~17)를 각각 주입시킨 후, 72시간 배양한 다음, 세포의 생존율 및 형태를 관찰하였다. 이때 대조군으로는 하기 표 1에 기재된 콘트롤 siRNA(서열번호 8~11)를 세포에 각각 주입한 것을 사용하였으며, 서열번호 2~5 및 서열번호 12~17의 NFAT5 siRNA에 대한 대조군 siRNA는 서열번호 8 및 9의 siRNA을 사용하였고, 서열번호 6 및 7의 NFAT5 siRNA에 대한 대조군으로는 서열번호 10 및 11의 siRNA를 사용하였다. 세포 형태는 현미경을 통해 관찰하였고, 세포 생존율은 당업계에 공지된 MTT 분석 방법 또는 세포 카운팅 키트-8(cck-8)를 사용하여 수행하였고, 아폽토시스는 TUNEL 분석을 통해 수행하였다. TUNEL 분석은 Apotag 퍼옥시다제를 사용하여 수행하는 방법으로서, 관절염의 활막 세포를 4개의 챔버 슬라이드에서 배양한 후, NFAT5 siRNA를 상기 세포에 형질도입 시키고 24시간 후에 PBS로 세척한 다음, 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정시켰다. 이후, 고정된 세포들은 digoxigenin- 결합된 dUTP와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하여 TdT 카탈라제 반응시켰다. 이후 상온에서 반응 정지 용액을 처리하였고, 30분동안 퍼옥시다제가 결합된 항- digoxigenin 항체와 반응시킨 다음, 아폽토시스에 의해 절단된 DNA 절편을 퍼옥시다제의 기질인 DAB를 이용하여 염색하여 측정하였다.
| NFAT5 siRNA 종류 | 염기서열 | 서열번호 |
| 297R NFAT5 siRNA(S) | 5‘-augcccucggacuucaucucauu-3' | 2 |
| 297R NFAT5 siRNA(AS) | 5'-ugagaugaaguccgagggcauuu-3' | 3 |
| 569R NFAT5 siRNA(S) | 5'-augggcggugcuugcagcuccuu-3' | 4 |
| 569R NFAT5 siRNA(AS) | 5'-ggagcugcaagcaccgcccauuu-3' | 5 |
| Control inv569R(S) | 5'-ccucgacguucguggcggguauu-3' | 8 |
| Control inv569R(AS) | 5'-uacccgccacgaacgucgagguu-3' | 9 |
| NFAT5 siRNA(S) | 5′-cccucucagcaaggguuau(dtdt)-3′ | 6 |
| NFAT5 siRNA(AS) | 5′-auaacccuugcugagaggg(dtdt)-3′ | 7 |
| Control siRNA(S) | 5′-uucuccgaacgugucacgu(tt)-3′ | 10 |
| Control siRNA(AS) | 5′-acgugacacguucggagaa(tt)-3′ | 11 |
| A_NFAT5 siRNA(S) | 5′-GCAAAGAAGUGGACAUUGA(tt)-3′ | 12 |
| A_NFAT5 siRNA(AS) | 5′-UCAAUGUCCACUUCUUUGC(tt)-3′ | 13 |
| B_NFAT5 siRNA(S) | 5′-GCAUAGCUGUUCAGUGAAA(tt)-3′ | 14 |
| B_NFAT5 siRN(AS) | 5′-UUUCACUGAACAGCUAUGC(tt)-3′ | 15 |
| C_NFAT5 siRNA(S) | 5′-GCAAGUAACUCUCUUCUUA(tt)-3′ | 16 |
| C_NFAT5 siRNA(AS) | 5′-UAAGAAGAGAGUUACUUGC(tt)-3′ | 17 |
또한, 세포 증식 정도는 NFAT5 siRNA를 세포에 형질도입 시킨 후, 10ng/ml의 TNF-a 또는 TNF-β를 각각 처리한 후, 당업계에 공지된 일반적인 방법인 [3H] 티미딘 도입 방법을 사용하여 측정하였는데, 증식 정도는 c.p.m으로 나타내었으며, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였고, 상기 분석은 3번씩 동일한 방법으로 수행하여 얻은 평균값으로 계산하였다. 아울러 세포 증식에 관여하는 인자인 사이클린 D, E의 발현정도도 웨스턴 블럿을 통해 확인하였으며 웨스턴 블럿은 사이클린 D 및 E의 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예에서 기술한 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 관절염의 활막세포에 서열번호 2~7 및 서열번호 12~17의 NFAT5 siRNA를 형질 도입한 경우, 대조군에 비해 활막 세포의 세포생존율이 감소되는 것으로 나타났으며(도 3a 참조), 반면, TUNEL 분석 결과 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포의 경우, 아무것도 처리하지 않은 세포 및 스크랩블 siRNA를 처리한 군에 비해 아폽토시스가 현저히 증가한 것으로 나타났다(도 3b). 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 NFAT5가 활막세포의 세포사멸을 조절하는 역할을 한다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 NFAT5 유전자의 발현을 억제할 경우, 관절염 질환의 활막 세포에서 세포사멸이 유도됨을 알 수 있었다.
나아가 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포에서는 염증성 사이토카인의 처리에도 불구하고 활막 세포의 세포증식이 억제되는 것으로 나타났고(도 3c 및 3d 참조), 세포증식에 영향을 주는 인자들인 사이클린 D 및 E의 발현 또한 NFAT5 siRNA가 처리된 활막 세포에서는 감소되는 것으로 나타났다(도 3e 참조).
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실시예
5>
NFAT5
의 내피세포의 증식 및 이동에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 NFAT5가 활막 세포 이외에도 혈관형성에 중요한 역할을 하는 내피세포의 증식 및 이동에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 대해 상기 실시예 4에서 사용한 NFAT5 siRNA를 형질도입 시킨 후, 각 시간별로 세포사멸 정도 및 세포증식 정도를 조사하였는데, 세포사멸 및 세포증식은 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. 또한, 이 외에도 HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA를 도입한 후, HUVEC 세포의 이동 및 튜브 형성을 조사하였는데, 먼저 세포이동 측정은 60mm 세포배양 디쉬에 NFAT5 siRNA이 도입된 HUVEC 세포 및 siRNA를 처리하지 않은 세포를 분주하여 디쉬에 가득 차도록 배양한 후, pipette tips을 이용하여 디쉬를 긁은 후, 1mM 티미딘 및 1% FBS가 첨가된 M199 배지에 VEGF162(20ng/ml)을 처리하고 12시간 배양하였다. 이후, 세포수를 카운팅 하여 세포의 이동정도를 측정하였다. 또한, 튜브 형성은 HUVEC 세포를 VEGF162(20ng/ml)가 첨가된 폴리머화된 마트리겔(BD Bioscience, CA)에 분주한 후, 12시간 배양한 다음 형성된 튜브의 길이를 측정함으로써 분석하였고, 이미지-Pro Plus v4.5를 이용하여 관찰하였다.
또한, 본 발명자들은 HUVEC 세포에서 NFAT5에 의한 세포 주화성(chemotaxis)을 조사하였는데, 주화성 조사는 직경 6.5mm 폴리카보네이트 필터(8um 기공크기)가 구비된 트랜스웰 챔버를 이용하여 분석하였다. 즉,1% FBS가 함유된 DMEM 배지로 준비된 VEGF(50ng/ml)을 하부 웰에 첨가하고, 상부 웰에는 1% FBS가 함유된 DMEM으로 현탁된 5 x 104세포수/ml의 세포를 첨가한 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 필터 상부 표면에서 이동되지 않은 세포들은 면봉을 이용하여 제거하였고, 이동된 세포들은 Diff-Quik 키트를 이용하여 고정 및 염색하였다. 주화성 분석은 현미경을 이용하여 x 200 배율에서 이동된 세포의 수를 카운팅 함으로써 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17의 NFAT5 siRNA을 형질도입한 경우, 대조군에 비해 세포 생존율 및 새포 증식정도가 감소한 것으로 나타났으며, 세포 증식 분석에서 성장인자인 VEGF의 존재 여부와 관계없이 NFAT5 siRNA의 처리에 의해 세포의 증식이 감소되는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b 참조). 또한, 혈관내피세포의 튜브 형성도 상기 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17의 NFAT5 siRNA을 처리한 군의 경우, 대조군에 비해 튜브 형성 정도가 감소하는 것으로 나타났으며(도 4c 참조), 세포의 이동 분석에서도 본 발명에 따른 NFAT5 siRNA을 처리한 경우, VEGF에 의한 세포 이동이 억제되는 것으로 나타났다(도 4d 참조). 세포 주화성 분석 결과, HUVEC 세포에 NFAT5 siRNA을 형질 도입한 경우, VEGF162에 의한 혈관내피세포의 주화성도 현저히 감소되는 것으로 나타났다(도 4e 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 NFAT5의 억제제인 NFAT5 siRNA를 혈관내피세포에 처리하였을 경우, 혈관내피세포의 세포증식, 튜브형성, 세포이동 및 세포 주화성이 모두 억제되는 것으로 나타난 반면, 세포 사멸은 증가하는 것으로 나타났다.
그러므로 본 발명자들은 본 발명에 따른 NFAT5의 억제제, 특히 NFAT5 siRNA는 혈관내피세포의 증식을 억제할 수 있으며, 신생혈관 또는 혈관형성으로 인해 유발될 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
NFAT5
가
마크로파지의
이동 및 사이토카인 생성에 미치는 영향 분석
나아가 본 발명자들은 NFAT5가 마크로파지 이동 및 사이토카인 생성에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, 3%의 티오글리콜레이트를 NFAT5+/- 및 NFAT5+/+ 마우스에 복강내로 주사한 후, 4일 이후에 Lavage fluid로부터 분리한 복강내 대식세포(Kreckler, L.M., Wan, T.C., Ge, Z.D. & Auchampach, J.A. Adenosine inhibits tumor necrosis factor-alpha release from mouse peritoneal macrophages via A2A and A2B but not the A3 adenosine receptor. JPharmacolExpTher 317,172-180, 2006 참조).를 대상으로 상기 대식세포에 LPS(1ug/ml) 또는 IL-1β(10ng/ml)을 12시간 처리한 다음, 세포의 수를 카운팅 하여 마크로파지 즉 대식세포의 이동 정도를 조사하였다.
또한, 사이토카인의 생성은 상기 방법으로 분리된 복강내 대식세포(3X104 cell/ml)를 LPS(1ug/ml) 또는 IL-1β(10ng/ml)로 12시간 처리한 다음, 배지의 상층액을 수집한 후, ELISA를 이용하여 LPS 또는 IL-12의 생성량을 측정하였다. 또한 상기 배양된 세포는 FITC-표지된 항-TNF-a 항체로 30분간 반응시킨 후, 0.1% FBS 및 0.01% NaN3를 포함하는 PBS 버퍼로 희석한 후, FACS 캘리버(Becton dickinson, mountain view, CA)기기를 사용하여 생성된 TNF-a의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 혈관형성 및 혈관염증에 관여하는 대식세포의 이동에 있어서 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스의 경우에는 염증성 사이토카인의 처리에 의한 대식세포의 이동이 NFAT5 유전자가 정상적으로 발현되는 마우스 군에 비해 감소된 것으로 나타났다(도 5a 참조).
또한, 생성되는 사이토카인의 양을 비교 분석한 결과, IL-12 및 TNF-a의 생성량은 NFAT5 유전자가 결핍된 마우스의 경우, NFAT5 유전자가 존재하는 마우스에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 5b 내지 도 5d 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 세포, 특히 혈관이 과다 형성된 세포에서 NFAT5 유전자의 발현을 억제할 경우, 혈관형성을 자극하는 사이토카인의 생성을 억제함과 동시에 혈관형성에 관여하는 대식세포의 이동을 억제함을 통해 혈관형성을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 NFAT5의 억제제를 혈관형성에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
또한, 본 발명에 대한 연구는 보건복지가족부 보건의료기술진흥사업의 지원에 의해 수행되었다(과제고유번호:A84948).
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University
<120> Compositions comprising NFAT5 inhibitor as an active ingredient
for preventing or treating of angiogenesis-related diseases
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 14174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFAT5 gene sequence(transcript varient 6)
<400> 1
tgcaacggaa acttttggct ccacgaacag aaaagcaaga gcaaaaactc agttaaatgc 60
gttcttcctc catctttgcc tagtccaaaa ggaaaaaaaa agaaacagaa aaaagaaaaa 120
ctgtttggaa gagtagcgtt gaggtttgct ttttacctgt ttttcctcta gaacagccag 180
gtggattcac atgatccaat tttttaattg tcttctatgt cccactccga ataacccgga 240
tgccccagca caatcagaga gatcgttttt tttaaaaaaa atttcagcct ccaaaggtag 300
gaggggagtg ttaggggaga aagtacttta attaaaaatc aataactcga ggtttttggg 360
atacggtttg ccatttccta attaagaaat gggtttgaca gtccctttgt acacactgct 420
atgcaaaccc caaagggttg gcggctgtcc gggcgatgac actccggtcc cctgcgagac 480
cccgggccag ccaggcccgt ccgccgccgg cctctggggt ccgtccccgg ctcgcgcaga 540
cctctcgctt ctctcggctc tgtctcctgc gctcagctct gctcggggcc ggccgcctca 600
ggctcgccgc caccaggtcg ttgcaaatac cttttccctc cccggggccc cagcgcgcgg 660
ccacctccca gcctcccccc ctcccaccct ggcagcgggg ccctttcccg gctcaggaac 720
agcagcagcc cgggccgcgc cggcaggaag cgaggcccat gttgctgctg ttccctggcg 780
cgcctccccg ccctccgggg gccgccacgg ctcttccgcg ctcccgggca cccccctccg 840
cgcctgcgct gtgccccacg ggggcggggc tcagattcct gtcagcggcg gcggcggtgg 900
cggcgaccgt cagttttcgc tgaggagaaa cacgaaacgg accctttggc tctccccctt 960
ccccttcccc gtcctgaacc cctctcctgg tcaccgagaa tcagtccccg tggagttccc 1020
cctccacctc gccatcgttt cctcggtcct cggcccagtg gaagtcacta ccctcgagga 1080
ggaggcagcg gcagccgccc tcgcgtcgcc gcccccggtt cggtgcccgc ggtcccggag 1140
aggaggtgcc gccgccaccg ccgctccccc cctcccgctg ccctcgggcc gggctgggtc 1200
gagctgcgat gccctcggac ttcatctcat tgctcagcgc ggacctagac ctggaatcgc 1260
ccaagtccct ctactcgcga gattctctga agttacaccc atcacagaat tttcatagag 1320
ctggactatt ggaagaatct gtctatgatc ttctcccaaa ggagttacag ttacctccat 1380
ctagagaaac atctgtagca tcaatgagtc agacaagcgg tggtgaggca ggctcgcctc 1440
ctccagctgt tgttgctgct gatgcttctt cagctccctc ctcttcctcc atgggcggtg 1500
cttgcagctc ctttaccacc tcttccagcc ctaccattta ttctacctca gtcaccgaca 1560
gcaaggctat gcaagtggag agctgctcct cagccgtggg ggtaagtaac agaggggtaa 1620
gtgaaaagca gttaaccagt aacacagttc agcagcatcc atcaacaccg aagaggcaca 1680
cagtcttgta catctcacca ccacctgagg acttgctgga taacagtcgg atgtcctgcc 1740
aggatgaggg gtgtggattg gaatctgagc agagctgcag tatgtggatg gaggattccc 1800
cctccaactt cagtaacatg agcaccagtt cctacaatga taacactgag gtacctcgta 1860
aatcacgaaa acgaaatcca aagcagaggc cgggggtcaa acgacgagat tgtgaagaat 1920
ctaatatgga tatatttgat gccgacagtg ccaaagcacc tcactatgtg ctttctcagc 1980
ttaccacgga caacaaaggc aactcaaaag cgggaaatgg aacattggaa aaccaaaaag 2040
gaactggagt aaagaagagc cctatgttgt gtggacaata tcctgttaaa agtgagggaa 2100
aggagctgaa gatagttgta caacctgaga cacagcaccg agctcggtac ctgactgagg 2160
gcagccgtgg ctcagtgaaa gatagaacac agcaaggctt tcctacagta aagctggaag 2220
gccataatga acctgtagtg ttgcaagtgt ttgtgggcaa cgactctgga cgagtgaaac 2280
cacatggatt ttatcaggcc tgcagagtaa ctggacgaaa tacaactcct tgcaaagaag 2340
tggacattga aggcactact gttatagaag tcggccttga tcctagcaac aacatgacac 2400
tggcggtgga ctgcgtaggg atattgaaat tgaggaatgc tgatgtcgaa gccagaatag 2460
gaattgctgg ttccaagaag aaaagcactc gtgccagatt ggtttttcga gttaatatca 2520
tgaggaaaga tggctccact ttgacactgc aaacaccctc ttctccaatt ttgtgtactc 2580
agccagcagg agtgccagaa atcttaaaga aaagcttgca tagctgttca gtgaaaggag 2640
aagaagaagt gtttttaatc ggcaagaact ttctgaaagg aactaaagtt attttccaag 2700
aaaatgtttc tgatgaaaac tcttggaagt cagaagctga aattgatatg gaactatttc 2760
atcagaatca tcttattgtg aaggttcctc cctatcatga ccaacatata actttgcctg 2820
tgtcagtggg aatatatgta gtgacaaatg ctggaagatc tcatgatgtt caaccattca 2880
cttacactcc agacccagca gctggtgctt tgaatgtaaa tgtgaagaag gaaatatcta 2940
gtccagcaag accttgctct tttgaagagg ccatgaaagc aatgaaaact actggatgta 3000
atttagataa ggtaaatatt atccctaatg ccctgatgac tccactcata ccaagcagta 3060
tgattaagag tgaagatgtt actccaatgg aagtaacagc agaaaaaaga tcttccacta 3120
tttttaagac tacaaagtct gttggatcaa ctcagcaaac attagaaaac atctcaaaca 3180
tagcaggaaa tggctctttt tcatcaccat catcttccca cctaccttct gaaaatgaaa 3240
aacagcagca gattcagccc aaggcataca acccagagac cctgacaact attcaaaccc 3300
aggacatctc acagcctggt acttttccag cagtttctgc ttctagtcag ctgcccaaca 3360
gcgatgcact attgcagcag gctacacagt ttcagacaag agaaactcag tctagagaga 3420
tattacagtc agatggtaca gtggttaatt tgtcacaact gactgaggca tcacaacaac 3480
agcagcagtc accactacaa gaacaagcac agactttaca gcagcagatt tcatcaaata 3540
tttttccatc accaaatagt gtgagtcagc ttcagaatac tattcagcag ctgcaagcag 3600
ggagtttcac aggcagtact gctagtggca gcagtggaag tgttgacttg gtccaacaag 3660
ttttagaggc acagcagcag ttatcttcag ttttattttc tgctccagat ggtaatgaga 3720
atgttcaaga gcagcttagt gcagatattt ttcaacaagt cagtcaaatt cagagtggtg 3780
taagccctgg aatgttttcc tcaacagagc caacagtcca taccagacca gataatttat 3840
tacctggaag agctgaaagt gttcatccac agtctgaaaa cacgttatct aatcaacagc 3900
agcagcagca gcagcaacag caagtgatgg aatcttcagc cgcaatggtg atggagatgc 3960
aacagagtat ctgccaggca gctgcccaga ttcagtcaga gttattccct tcaactgctt 4020
cagcaaatgg aaaccttcag caatcgccag tttaccagca gacttctcac atgatgagtg 4080
cattgtctac caatgaggat atgcaaatgc agtgtgaatt gttttcttct cctcctgcag 4140
tttctggaaa tgaaacttct acaactacca cacagcaggt tgcaacccct ggcactacca 4200
tgtttcagac atcaagttca ggagatggag aagaaactgg aacacaagca aaacagattc 4260
agaacagtgt ctttcagacc atggtccaaa tgcaacatag tggggacaat caacctcaag 4320
ttaacctttt ttcatccaca aaaagtatga tgagtgttca gaatagtggt acccaacaac 4380
aaggtaatgg tttattccag caagggaatg agatgatgtc acttcaatct ggaaattttt 4440
tgcagcagtc ttctcattca caggcccaac tttttcatcc tcaaaatcct attgccgatg 4500
ctcagaacct ttcccaggaa actcaaggtt ctctctttca tagtccaaat cctattgtcc 4560
acagtcagac ttctacaacc tcctctgaac aaatgcagcc tccaatgttt cactctcaaa 4620
gtaccattgc tgtgttacag ggctcttcag ttcctcaaga ccagcagtca accaacatat 4680
ttctttccca gagtcccatg aataatcttc agactaacac agtagcccaa gaagcatttt 4740
ttgcagcacc gaactcaatt tctccacttc agtcaacatc aaacagtgaa caacaagctg 4800
ctttccaaca gcaagctcca atatcacaca tccagactcc tatgctttcc caagaacagg 4860
cacaaccccc gcagcagggt ttatttcagc ctcaggtggc cctgggctcc cttccaccta 4920
atccaatgcc tcaaagccaa caaggaacca tgttccagtc acagcactca atagttgcca 4980
tgcagagtaa ctctccatcc caggaacagc agcagcagca gcaacagcag cagcaacagc 5040
agcagcaaca acaacagagc attttattca gtaatcagaa taccatggct acaatggcgt 5100
ctccaaagca accaccacca aacatgatat tcaacccaaa tcaaaatcca atggctaatc 5160
aggagcaaca gaaccagtca atttttcacc aacaaagtaa catggcccca atgaatcaag 5220
agcaacagcc catgcaattt cagagtcagt ccacagtttc ctcacttcag aacccaggtc 5280
ctacccagtc ggaatcatca cagaccccct tgttccatag ctctcctcag attcagttgg 5340
tacaagggtc acctagttct caagagcagc aagtaactct cttcttatct ccagcatcca 5400
tgtctgcctt gcagaccagt ataaatcaac aagatatgca acagtctcct ctttattccc 5460
ctcagaacaa catgcctgga attcaaggag ccacatcttc gcctcaacca caggctactt 5520
tatttcacaa cacagcagga ggcacaatga accaactgca gaattctcct ggctcatctc 5580
agcagacatc aggaatgttc ttatttggca ttcaaaataa ctgtagtcag cttttaacct 5640
ctggaccagc tacattgcct gatcagttga tggccataag tcagccaggc caaccacaaa 5700
acgagggcca gccacctgtg acaacacttc tttctcagca aatgccagag aattctccac 5760
tggcatcctc tataaacacc aaccagaaca tcgaaaagat tgatttgctt gtttcattgc 5820
aaaaccaagg gaacaacttg actggctcct tttaactgga tataaattcc acgaagaaaa 5880
tcctgattcc aagatgtcct gagatcttgt ggttccatga gaattattac tttaaaaaca 5940
aaacaaaata taaaaaactg tgtttgagta aactgataga ttttactctg actgcaaaag 6000
agcacaccta tgctgcttgt tgcagtaact aaccaccaat gttaacatct tcatatttta 6060
tattcctaat aacagtgatg actgagaatc tatttgagtt tccagctggc agaattaatt 6120
gttattattt tcctaggcgc aatttcctta aacgtacagt ttaaattcaa ggctggacca 6180
ctcagttatt attgctatta gaaaataata tatcatgttt acttttgttc ttcattattt 6240
tctttcctgc attgttttag tcaagtaatg gcttttgaaa aagtaaagtt caataataac 6300
taaggctgtg atttttttca atataaaagg cacagctgtt ggccaaagtg aaggaatctt 6360
ttttcagttt tattggagaa actgaagggt aacattctaa caagtaaact gtatgtgcag 6420
ataaaagtac tcttgattta acacaaaggc agatgataca cttataaaac tgggaacagc 6480
tggaatgctt cttgatttta ttttttcaga gagttgttag ttctctgggt ttctactaag 6540
gggtttagcc ataactgtgc atagaaaaat aattatctgt aaaaaatgaa ggggataata 6600
tatgataaat tatgttctga tatcctccta cagtagttta aattgacaga aaaatttgaa 6660
tgttttcttc ttaacccagt cttaggctgg tattcccttt ttatatatat ctatattact 6720
tttcacctct ttttcacttt actttagaga actattaata tactactggc ttcatgaccc 6780
tgtagcatct ttggccactt taatctaggg tgacctagca atcctgcagc acagggcaga 6840
gagtactgtc ttaggaatta ttaggagttg attcctgaga aacaacacat ttttccccat 6900
gaacggtgct gttctgaagt cttcaaattt ttccctctaa taggaaacag tataaatttt 6960
aattaaaaaa aaaaggcaaa ctaaaatttc ttgaaatatc acttctccct gatctgcagt 7020
gagtataaat tcacttgtca cctcagtgct ttacagtttg aagtggtcac ttacctgatg 7080
gttcccacaa gccttaggct ttacagggtt gtatcattga cttaaaatga agaattaact 7140
tgtgttacat ctataaagag caaaataaca cactccagaa cttggcagtt gtagcattag 7200
ttatacagtt ttgggtgttc ttgccacccg tgggatgcct gcttctcact accacctgtg 7260
tctggacaca tgcttatgtc tcattttcct tttggcatgt ggaaagctgt caatgcagtg 7320
taaggccaac gtgtgtgtgg cttctatgtg ttgagataat gttttggtat ccttgtccgt 7380
ttcatttatt ttttaagtgt acaaaaaata acctgttaat tgttgaaggc tacttttctg 7440
ttcttttttt tttttttttt ctatcctgta catttagttg aactgtgcgg aattgtggtg 7500
ttggttttgt ttacacagcc agatttttcc ttctttttgt tttgtgatga tcttcctttg 7560
ttctttgaat gtgctctttt gtctttttct cttttttctc atgttttctt ccctccacct 7620
ccaccccttt ctttctttct ctctctgatt gagaggcatt gaattacgtt ttcagtagta 7680
caggcttctt gccgatatga agggaacttt tcagaaagag acctactctg ggtcatttaa 7740
ttttgaatac agttttcaat cgttcaagtt ttggatggtt tatatctaat gtgtgtttca 7800
tttttttgga aagctatatt ttgtatttag gaaatggtat actattttgc tatttgtact 7860
gagtgagtac attggcataa atatagaaat ttatatatat acatatatat aaactattct 7920
tttttgccac acatttttgt ggtaaatttg tgagtttgtc tgatgttcta ccacaacgtg 7980
gcgtctgata acagtgaggg ggggtggggt ttgttatgtc tttattgagt atttaagtat 8040
cttttgaaac aaatgacctg ttcatctgtg gccattccat caggcagtta gttccttgat 8100
gtcagtagtg ggctaaaggc agcttactgt gtgtttgctg gagctttcac tcagccaagt 8160
gttagagtca ggaaacccat tgaggcaatg gcgtcaaatg gtgtttcaca agaatgagcc 8220
attcagtctt tgctcactat atatttaata ttttattatt gttgttattg ttattattaa 8280
ttggctttct gtattctatg ccttttattt ataaagacac taagaaaacc catgtttgta 8340
attttaataa catttttccc atcttgtaat atccagagct actttataaa ttctctgaac 8400
caaaagtatt ttcctcagtg tatctcttct cccccagccc ctattgggaa aaattaccca 8460
gtatagttca ggttatgagg aggatcagcc acacaatcca gtgcttcagt ttgaaaatgt 8520
aaaattctaa ccctaaagta gggttggttg aaatttcaga caaagcaaac ccagcaggta 8580
taaaaagtag tataaataca aatctgtaag ttatttttga attttctgaa cttttttcta 8640
agagattaca taggagacta aagaaatcta tctgttcaag ttctaattag gatgattgtt 8700
aatactgcac tgtggatgaa gtggcgactg gcttgtgtgc tgacttctgt ggtttagcaa 8760
gaggtttatt gttatcaaat gctaattggc aatgccaagt cactgggacc aattttctgt 8820
tttataatat ctaagtttag aacagaatat atacctgaac tgtagtggtt tgatcggatg 8880
gagacagaaa acccgatttt tattctcata aattttgtgg ttatttatac aagggctgtg 8940
ctatgctacc atattcttgt tcaataataa taggtttgtt gtttttttta cattgttaaa 9000
tgttccttac ccctaaaggt caatgttaag tacaacattc tgaaaataca atttggctac 9060
gaagagtatt catcttcttt gaagctcagt ggttgatatt tgtgctaata atgcaatttc 9120
ctgattactg ttacaagtta tagctacata tgggagagac tcagtgagcc agcaaaggcc 9180
atagaaacaa caatttatta aatgtattta tggcagaagg acctaaataa actgtgagcc 9240
accttttctt ctttatattg ttacatttaa gtgttcttgc tttcagcaac tcacattaat 9300
gcttggagct tatctctttc tctctctctc tctctctctc tgtgtgtgtg tgtgtatgtg 9360
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tccttattgt cattccatta tatatccaca ccaacatggg 9420
tgacgataat tcaaagtcat attttgcctc taagcttgat catgttacct ttatgattaa 9480
agtatcatgt tatttagcca atgcaaatct gttttaaaac aaatagttta aaaaaagaac 9540
aagtttttaa gggctttatt atagaagaag tattaatgaa ggactttcct tcctccctcc 9600
ctttcctccc ctccctgcct cccttcttcc cttccatctc cccctcctcc ctgccttctt 9660
tgtttctcct tcccttattc ctccctccct cctttctccc ttccttcctt tcttccattc 9720
atccttcctt gccttttatt tttatttttt gtaatatcac atgtgctgta gtttggaatt 9780
ttattctagt gcatttcttg ctcatcagaa cctcagctaa tctacctagg aaaaatagta 9840
tcaaaggaaa tgagaaagtt gtatctgagt ccctccagaa ctaagataat tctttttgac 9900
catttaagcc tttataaatg cgttttgacc atttaagcct ttataaatgc ttgttttagg 9960
aaagtgaatc tgttagatgc atcaacaaat aatgaccagg acaaaacgat ttaataatta 10020
aagtctcaaa tcaccatggt tatacatttt caccagaaat agtaatctta caatttttca 10080
tttttctgat gaagatttct gttccaatat ctgtttccta atagattttt taaattaatt 10140
agctttcctc tgctttatga ccacaggttt tatccctaac cgagacagct gtcttatatc 10200
tgcatgcctt agactgtgtg gagggactcc atgaagaaag accataggtt agaaaaataa 10260
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aaaaaaaaaa aaaa 14174
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C_NFAT5 siRNA(AS)
<400> 17
uaagaagaga guuacuugc 19
Claims (8)
- NFAT5 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드 및 NFAT5 단백질에 특이적인 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 NFAT5의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 NFAT5의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 혈관형성 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 NFAT5 유전자에 특이적인 siRNA는 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 12 내지 17로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 혈관형성 억제용 조성물. - 제1항에 따른 조성물을 포함하는 혈관형성 관련 질환 치료제.
- 제4항에 있어서,
상기 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관형성 관련 질환 치료제. - NFAT5 유전자 또는 NFAT5 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시키는 단계;
상기 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
상기 측정 결과로부터 NFAT5 유전자의 발현양, NFAT5 단백질의 양 또는 NFAT5 단백질의 활성이 상기 후보물질을 접촉시키지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 시료는 과도한 혈관형성으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관형성 관련 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 혈관형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 과도한 혈관형성을 억제하는 방법.
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