DE60118769T2

DE60118769T2 - Verwendung von langem pentraxin ptx3 zur behanlung von durch geänderte aktivität des fgf-2 wachstumsfaktors hervorgerufene krankheiten

Info

Publication number: DE60118769T2
Application number: DE60118769T
Authority: DE
Inventors: A. Istituto di Ricerche Farmacologic MANTOVANI; B. Istituto di Ricerche Farmacologic BOTTAZZI; M. Dipt. di Scienze Biomediche e Bio Via Valsabbina PRESTA; M. Dipt. di Scienze Biomediche e Bio Via Valsabbina RUSNATI
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2021-11-09
Also published as: ITRM20000578A1; HUP0400541A2; WO2002038169A1; JP4167061B2; CY1106092T1; CN1304047C; PL365292A1; EP1331940A1; JP2004513151A; SK5622003A3; KR20030061396A; CA2428176A1; BR0115190A; HK1061209A1; DE60118769D1; CZ20031179A3; EP1331940B1; ATE322906T1; CA2428176C; HU229100B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von langem Pentraxin PTX3 (PTX3) oder einem seiner funktionellen Derivate für die Herstellung eines Medikaments für die Prävention und Behandlung von Erkrankungen, die durch eine veränderte Angiogenese und durch eine unkontrollierte Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen ausgelöst werden.
Die erste Verbindung, die mit einer antiangiogenen Aktivität versehen war, wurde im Knorpel von Henry Brem und Judath Folkman 1975 (J. Exp. Med. Feb. 1, 1975; 141(2):427-39) entdeckt. Die Autoren dachten, dass diese Entdeckung zur Kontrolle pathologischer Prozesse, wie dem Tumorwachstum, der Metastase, einer chronischen und akuten Entzündung der Gelenke und einer Diabetesretinopathie verwendet werden könnte, wobei selektive Inhibitoren der pathologischen Neoangiogenese verwendet würden.
Die Angiogenese beim Erwachsenen ruht in der Regel, repräsentiert jedoch eine normale Funktion, z.B. bei der Heilung von Wunden oder bei der Rekonstruktion des Endometriums während des Reproduktionszyklus der Frau.
Die angiogenetische Reaktion wird physiologisch stimuliert, wenn die vaskulären Funktionen reduziert und die Gewebsperfusion inadäquat ist.
Allgemein kann gesagt werden, dass Angiogenese unter physiologischen Bedingungen einen positiven Feedback als Reaktion auf eine inadäquate Perfusion oder eine reduzierte Zufuhr von Sauerstoff und Nährmitteln bildet, wie z.B. eine solche im Fall einer Okklusion einer Arterie, in Situationen eines Massengewebswachstums (z.B. die Neovaskularisierung, die die Bildung von Muskelgewebe begleitet) und im Fall erhöhter Arbeitsbelastung in Assoziation mit erhöhten Sauerstoff- und Nährstoffbedürfnissen auftritt.
Es ist wohlbekannt, dass das Wachstum eines primären Tumors durch eine gute Vaskularisierung im Tumorgewebe begünstigt wird. Eine adäquate Zufuhr von Sauerstoff und Nährmitteln unterstützt das schnelle Wachstum des Tumors selbst.
Es wurde demonstriert, dass das Ausmaß der Angiogenese ein extrem negativer Faktor bei der Prognose von Neoplasmen sein kann (van Hinsbergh VW, Collen A, Koolwijk P; Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:60-3, 1999; Buolamwini J K; Curr., Opin., Chem., Biol., 3(4):500-9, August 1999).
Auf dem Tumorgebiet ist ebenfalls bekannt, dass eine grundlegende Stufe bei der Biologie der Tumorzelle die Akquise einer metastasierenden Fähigkeit ist.
Die Tumorzellen, die metastasieren, sind dazu in der Lage, ihre Adhärenz an die umgebenden Strukturen zu verlieren, in Blut und Lymphgefäße einzudringen und andere Gewebe in einer Entfernung zu kolonisieren, wo sie damit fortfahren können, sich selbst zu reproduzieren.
Das Metastasieren ist auch ein kritisches Ereignis in der klinischen Geschichte der Erkrankung und ist der Hauptgrund eines Tods aufgrund von Krebs. Es ist eng mit der Gegenwart von vaskulärem Gewebe an der Tumorstelle oder in benachbarten Bereichen assoziiert und wird dadurch erleichtert.
Die Wanderung von Tumorzellen über die umgebenden Strukturen ermöglicht es den Zellen, die Intratumorblutgefäße zu erreichen, entweder bereits existierend oder gebildet durch eine Neoangiogenese und so erreichen sie den Blutstrom (Ray J M., Stetler-Stevenson WG; Eur. Respir. J., 7(11):2062-72, 1994; Stetler-Stevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE Jr; FASEB J., 7(15):1434-41, Dezember 1993).
Die Anwesenheit einer Kommunikation zwischen den lymphatischen und Blutgefäßen im vaskulären Bereich des Tumors ermöglicht es den neoplastischen Zellen, sich in beiden vaskulären Systemen zu bewegen.
Kürzliche Studien haben eine direkte Beziehung zwischen der Angiogenese und einer Arthritis gezeigt (Koch AE; Arthritis und Rheumatism 41:951-962, 1998). Insbesondere wurde demonstriert, dass eine Neovaskularisierung des artikulären Knorpels eine Schlüsselrolle bei der Pannusbildung und dem Fortschreiten der Arthritis spielt. Normaler Knorpel besitzt keine Blutgefäße, während die Synovialflüssigkeit von Arthritispatienten einen Angiogenese-stimulierenden Faktor enthält, der durch Endothelzellen erzeugt wird (EASF).
Die Gegenwart dieses Faktors ist mit der Vaskularisierung und dem Abbau des Knorpels assoziiert.
Andere Erkrankungen stehen auch mit einer abnormalen Angiogenese in Beziehung.
Es wurde festgestellt, dass eine Neovaskularisierung der betroffenen Gewebe bei der Diabetesretinopathie [Histol Histopathol. Oktober 1999; 14(4):1287-94], der Psoriasis [Br J Dermatol. Dezember 1999; 141(6):1054-60], einer chronischen Entzündung und Artheriosklerose [Planta Med Dezember 1998; 64(8):686-95] ein erleichternder Faktor ist.
Der Wachstumsfaktor FGF-2 ist ein kationisches Polypeptid mit 18 kDa, das sowohl eine Neoangiogenese in vivo und Zellproliferation, Chemotaxis als auch Produktion von Proteasen in Endothelzellen in Kultur induzieren kann (Basilico und Moscatelli, 1992, Adv. Cancer Res. 59:115-65).
Die Rolle von FGF-2 in der Tumor-Angiogenese ist bereits bekannt (Pathol. Biol. (Paris) April 1999; 47(4):364-7).
In dem J. Pathol. September 1999; 189(1):72-8 wird berichtet, dass eine erhöhte Expression von FGF-2 bei Patienten, die an einem Mesoteliom leiden, mit einer höheren Aggressivität und höheren Mortalität bei Patienten in Beziehung steht, die von einer solchen Tumorerkrankung betroffen sind.
In Oncogene Nov. 18, 1999; 18(48):6719-24 wird berichtet, dass FGF-2 Ratten-Blasen-Karzinomzellen eine Metastaseeigenschaft verleiht.
Int. J. Cancer 05. Mai 1999; 81(3):451-8 berichtet, dass FGF-2 eine stark mitogene Aktivität aufweist und an der Entwicklung menschlicher Tumoren und dem Anstieg ihrer Malignität beteiligt ist.
Zur Heilung von Tumorerkrankungen präsentiert eine antiangiogene Therapie im Vergleich mit üblichen traditionellen Chemotherapien die folgenden Vorteile (Cancer Research 1998, 58, 1408-16):

1. Höhere Spezifität: sie hat als Ziel den Tumor-Neovaskularisierungs-Prozess;
2. Höhere Bioverfügbarkeit: sie hat als Ziel die Endothelzellen, die einfach erreichbar sind, ohne die Probleme, die mit dem traditionellen chemotherapeutischen Ansatz verbunden sind, der direkt auf die Tumorzellen wirkt;
3. Geringfügige Chemoresistenz: dies kann unter Umständen der wichtigste Vorteil dieser Therapie sein; tatsächlich ist das Phänomen einer Arzneimittelresistenz unwahrscheinlich unter Betrachtung der Tatsache, dass die Endothelzellen im Vergleich zu Tumorzellen genetisch stabil sind;
4. Geringe Metastasenbildung: Die Blockierung der Neovaskularisierung limitiert die Propagation der Tumorzellen in andere Körperteile über den Blutstrom;
5. Eine Apoptose wird begünstigt: die Blockierung des vaskulären Netzes im Tumor vermindert die Sauerstoff- und Nährmittelverfügbarkeit für die Tumorzellen, wodurch die Apoptose erhöht wird;
6. Reduktion der systemischen Toxizität: Toxische Wirkungen wie eine Myelosuppression, gastrointestinale Wirkungen und eine transiente Alopecie, die bei einer traditionellen Chemotherapie vorliegen, werden bei der antiangiogenetischen Therapie nicht beobachtet.

Um diese Wirkungen zu bestimmten, reagiert FGF-2 mit zwei unterschiedlichen Rezeptorklassen, die auf Zielzelloberflächen vorliegen: Rezeptoren mit hoher Affinität, versehen mit einer Tyrosinkinaseaktivität (FGFRs) und Rezeptoren, versehen mit niedriger Affinität, repräsentiert durch Proteoglycan-Heparan-Sulfat (HSOGs) (Johnson und Williams, 1993, Adv. Cancer Res. 60:1-41; Moscatelli, 1987, J. Cell. Physiol. 131:123-30).
FGF-2 ist ein potentes Mitogen für Media- glatte Muskelzellen und ist für ihre Proliferation nach Ballon-Katheterverletzung notwendig (J. Biol. Chem. 14. Apr. 2000; 275 (15): 11270-7).
Daher beinhalten Erkrankungen, die durch eine veränderte Aktivierung des Wachstumsfaktors FGF-2 ausgelöst werden, auch die Hyperplasie der muskulären Wand der Arterien, die während einer Restenose nach Angioplastie oder "Koronarstent" auftritt [J. Vasc. Surg. Februar 1997; 25(2):320-5].
Die Kontrolle der FGF-2-abhängigen Neovaskularisierung repräsentiert eines der fundamentalen Elemente für die Kontrolle und die Heilung von Erkrankungen, die mit einer veränderten Angiogenese verbunden sind, wie auch die Kontrolle von FGF-2-abhängiger unkontrollierter Proliferation von Fibroblasten oder SMCs für die Behandlung einer Narbenbildung, verbunden mit einer exzessiven fibroblastischen Reaktion und einer Restenose nach einer Angioplastie ein Schlüsselelement bildet.
Die Verfügbarkeit der neuen therapeutischen Verbindung ist eine Aufgabe von primärer Wichtigkeit für die Prävention und Behandlung von Erkrankungen, die durch eine unkontrollierte Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen und durch eine veränderte Angiogenese vermittelt werden. Die Erkrankungen werden gewählt aus einer Diabetesretinopathie, Artheriosklerose, einer Narbenbildung, die mit exzessiver Fibroblastenreaktion verbunden ist und einer Restenose nach einer Angioplastie.
PTX3 wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert (Bottazzi et al., J., Biol. Chem. 1997, 272:32817-32823), insbesondere in mononukleären Phagozyten und Endothelzellen nach Aussetzung gegenüber den entzündlichen Cytokinen Interleukin 1β (IL-1β) und Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α).
Bis jetzt wurde die biologische Funktion von PTX3 noch nicht vollständig verstanden.
PTX3 besteht aus zwei Strukturdomänen, einer N-terminalen Domäne, die mit keinem bekannten Molekül in Beziehung steht und einer C-terminalen Do mäne, die dem kurzen Pentraxin ähnlich ist, wie dem C-reactiven Protein (CRP) (Breviario F., et al., J. Biol. Chem. 267:22190, 1992).
Ein substanzieller Grad einer Ähnlichkeit wurde zwischen menschlichem PTX3 (hPTX3) und tierischem PTX3 angetroffen. Insbesondere ist das Maus-PTX3 (mPTX3) dem hPTX3 im Hinblick auf DNA-Sequenz und Genorganisation und Stellung sehr ähnlich. Der Grad der Identität zwischen dem menschlichen und murinen PTX3-Gen beträgt 82 % und erreicht 90 %, wenn konservative Substitutionen mit betrachtet werden (Introna M., et al.: Blood 87 (1996) 1862-1872). Das murine PTX3-Gen ist auch dem Chromosom 3 der Maus in einer Region lokalisiert, die der menschlichen 3q-Region ähnlich ist (q24-28), in Übereinstimmung mit der dokumentierten Stellung von hPTX3 in der 3q 25-Region (Introna M., et al.: Blood 87 (1996) 1862-1872).
Der hohe Grad der Ähnlichkeit zwischen hPTX3- und mPTX3-Sequenzen ist ein Zeichen für einen hohen Grad einer Konservierung von Pentraxinen während der Evolution (Pepys M. B., Baltz M. L.: Adv. Immunol. 34:141, 1983).
Für einen Überblick über Pentraxine siehe H. Gewurz et al., Current Opinion in Immunology, 1995, 7:54-64.
Die internationale Anmeldung WO 99/32516, eingereicht im Namen der Anmelderin, beschreibt die Verwendung des langen Pentraxins PTX3 für die Behandlung infektiöser Erkrankungen, wie auch entzündlicher oder Tumorerkrankungen. Die Anti-Tumor-Aktivität, die von PTX3 gezeigt wird, wie beschrieben in WO 99/32516, wird durch eine Leukozyten-Attraktion vermittelt, d.h. auf immunologischer Basis. In der WO 99/32516 wird nie die Verwendung von PTX3 als nützliches Mittel für die Behandlung von Erkrankungen beschrieben oder nahegelegt, die mit einer veränderten Aktivierung des Wachstumsfaktors FGF-2 assoziiert sind.
Die US 5,767,252 beschreibt einen neuronalen Wachstumsfaktor, der zur Pentraxin-Familie gehört (siehe auch die dort zitierten Referenzen). Dieses Patent betrifft den neurobiologischen Sektor.
Es wurde nun festgestellt, dass das lange Pentraxin PTX3 dazu in der Lage ist, FGF-2 mit hoher Affinität und Spezifität zu binden. Die Bindung von PTX3 an FGF-2 (Kd = 8-16 nM) verhindert die Bindung des letzteren an die Hochaffinitäts-Tyrosin-Kinase-Rezeptoren und die Bindung an der Stelle von niedrig affinen Rezeptoren, repräsentiert durch die Heparan-Sulfat-Proteoglycane, die auf der Zelloberfläche vorliegen. Die Inhibition der Bindung führt zu einer Inhibition der FGF-2-biologischen Aktivität.
Die Wechselwirkung zwischen FGF-2/PTX3 hängt von der korrekten Konformationsstruktur des Wachstumsfaktors ab, nicht nur im Hinblick auf seine grundlegende Natur, da PTX3 nicht das Zytochrom C bindet (ein Protein, das sich mit FGF-2 das Molekulargewicht (18 kDa) und den isoelektrischen Punkt (pH 9,6) teilt).
Weiterhin bindet das C-reaktive Protein, das zu PTX3 homolog ist, nicht an FGF-2.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung des langen Pentraxins PTX3 oder seiner Derivate oder Domäne zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention und Behandlung von Erkrankungen bereitzustellen, die durch eine veränderte Angiogenese vermittelt werden, worin die veränderte Angiogenese durch eine veränderte Aktivierung des Wachstumsfaktors FGF-2 hervorgerufen wird, gewählt aus einer Diabetesretinopathie und einer Artheriosklerose.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des langen Pentraxin PTX3 oder der Derivate von PTX3 oder der Domäne zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen, die mit einer unkontrollierten FGF-2-abhängigen Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen assoziiert sind, wie z.B. einer Narbenbildung, die mit einer exzessiven Fibroblastenreaktion verbunden ist und der Restenose nach Angioplastie.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann für die Inhibition der FGF-2-Aktivität in Zielzellen verwendet werden, nicht nur, wenn sie als rekombinantes Protein verabreicht wird, sondern auch, wenn sie endogen als Konsequenz des Gentransfers der cDNA verabreicht wird.
Daher ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Verwendung der Gesamtlängen-cDNA von menschlichem PTX3 oder seinem Derivat oder seiner Domäne zur Herstellung von Plasmid oder viralen Expressionsvektoren, umfassend die cDNA für die Gentherapie von Erkrankungen, ausgelöst durch eine unkontrollierte Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen, worin die Erkrankungen eine Narbenbildung, verbunden mit exzessiver fibroblastischer Reaktion oder einer Restenose nach Angioplastie sind.
Unter "langem Pentraxin PTX3" wird jedes lange Pentraxin PTX3 verstanden, unabhängig von seinem Ursprung, der natürlich (menschlich oder tierisch) oder synthetisch sein kann.
Unter Derivaten wird jedes funktionelle Analog des langen Pentraxin PTX3, wie oben definiert, verstanden, das mindestens eine Mutation trägt, und sich seine funktionelle Fähigkeit zur selektiven Inhibition von FGF-2 erhält.
Das bevorzugte lange Pentraxin PTX3 ist das menschliche PTX3, dessen Sequenz in WO 99/32516 beschrieben wird.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
Beispiel 1
Fähigkeit von PTX3 zur Bindung an FGF in Lösung.
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die PTX3-Bindung an FGF-2 zu bewerten. PTX3 wurde wie von Bottazzi et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823 beschrieben, erzeugt. Menschliches rekombinantes FGF-2 wurde wie von Isacchi A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1991), 88:2628-32 beschrieben, erzeugt. Falls nötig, wurde FGF-2 mit ¹²⁵I folgend dem von Isacchi et al. beschriebenen Verfahren markiert (siehe unten).
Experimentelles Verfahren:
100 μl PBS, enthaltend 1 μg FGF-2 (oder alternativ 1 μg PTX3) wurden auf einer Größenausschluss-Schnellprotein-Flüssigchromatographie-Superose-12-Säule (Pharmacia) chromatographiert; diese Säule ist dazu in der Lage, Proteine abhängig von ihrem Molekulargewicht zu trennen. Die Säule wurde mit PBS mit einer Flussrate entsprechend 1 ml/Minute eluiert und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und durch Dotblot mit spezifischen Antikörpern für die beiden Proteine analysiert. Um die PTX3-Bindung an FGF-2 zu bewerten, wurden die beiden Proteine (5 g bzw. 1 μg) in 100 μl PBS gemischt und vor einer Beladung auf die Säule 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch Dotblot mit Anti-FGF-2-spezifischen Antikörpern analysiert. Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass FGF-2 (18.000 D) von der Säule mit einem Retentionsvolumen von ungefähr 22 ml eluiert wird. Unter denselben Bedingungen wird PTX3 (450.000 D) mit dem Leervolumen der Säule (7 ml) eluiert. Wenn mit PTX3 10 Minuten bei 4°C präinkubiertes FGF-2 auf die Säule geladen wurde, wurde eine Veränderung des chromatographischen Verhaltens beobachtet: unter diesen experimentellen Bedingungen wurde FGF-2 aus der Säule mit einem Retentionsvolumen entsprechend PTX3 allein eluiert.
Beispiel 2
Fähigkeit von biotiayliertem PTX3 zur Bindung an Kunststoff-immobilisiertes FGF-2
100 μl NaHCO₃, pH 9,6, enthaltend 500 ng FGF-2 oder die Komplement-Komponente C1q, wurden 18 Stunden bei 4°C in Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Vertiefungen 3mal mit PBS gewaschen und darauffolgend 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 200 μl PBS, enthaltend 1 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA) inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Vertiefungen wieder 3mal mit PBS gewaschen und mit 30 ng/ml ¹²⁵I-FGF-2 in Gegenwart von ansteigenden Mengen biotinyliertem PTX3 in 100 μl PBS (2 Stunden bei Raumtemperatur) inkubiert. Alternativ wurden Vertiefungen mit ansteigenden Dosen FGF-2 oder C1q adsorbiert und mit 100 ng/ml biotinyliertem PTX3 in 100 μl PBS inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Vertiefungen 3mal mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 100 μl Streptavidin HRP-Konjugat (1/2000) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Chromogen-microwell Peroxidasesubstratsystems ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories) entwickelt. Die Platten wurden in einer automatischen ELISA-Ablesevorrichtung bei 405 nm abgelesen. Die in 2 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass an Kunststoffvertiefungen immobilisiertes FGF-2 dazu in der Lage ist, biotinyliertes PTX3 auf ähnliche Weise wie der physiologische PTX3-Ligand C1q zu binden (Bottazzi B. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32817-32823).
Beispiel 3
Charakterisierung der PTX3-FGF-2-Interaktionen
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden bei 4°C mit 100 μl NaHCO₃, pH 9,6, enthaltend PTX3 oder C-reaktives Protein (200 nM) oder alternativ 2 μg/ml der folgenden Proteine, die als Negativkontrolle verwendet wurden, beschichtet: bovines Serumalbumin, Fibronektin, Gelatine oder Laminin. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen 3mal mit PBS gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 200 μl 1 mg/ml BSA in PBS blockiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Vertiefungen 3mal mit PBS gewaschen und darauffolgend mit 30 ng ¹²⁵I-FGF-2 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden darauffolgend 3mal mit PBS gewaschen und gebundenes ¹²⁵I-FGF-2 wurde durch Waschen jeder Vertiefung zweimal mit 200 μl 2 % SDS in Wasser gewonnen. Die ¹²⁵I-FGF-2-Niveaus wurden in einem Gammazähler gemessen. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass FGF-2 an auf Kunststoff-immobilisiertes PTX3 bindet und dass diese Bindung spezifisch ist, da FGF-2 kaum mit CRP reagiert und mit anderen immobilisierten Proteinen nicht reagiert.
Beispiel 4
¹²⁵I-FGF-2-Bindung an Kunststoff-immobilisiertes PTX3 in Gegenwart eines Überschusses kaltem FGF-2
In einer zweiten Gruppe von Experimenten wurde die Bindung von ¹²⁵I-FGF-2 an Kunststoff-immobilisiertes PTX3 in Gegenwart eines Überschusses von sowohl nativen als auch wärmedenaturiertem kaltem FGF-2 (100 nM) in Gegenwart von ähnlichen Zytochrom C-Konzentrationen oder in Gegenwart eines Überschusses von löslichem PTX3 (300 nM) getestet. Das Experiment wurde wie oben beschrieben durchgeführt: Die in 4 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass kaltes FGF-2 und lösliches PTX3 die Wechselwirkung zwischen ¹²⁵I-FGF-2 und auf Kunststoff immobilisiertem PTX3 inhibierten. Die Beobachtung, dass wärmeinaktiviertes FGF-2 und Zytochrom C (mit demselben Molekulargewicht und isoelektrischen Punkt wie FGF-2) nicht dazu in der Lage sind, PTX3 zu binden legt nahe, dass eine korrekte Konformation des Wachstumsfaktors anstelle seiner grundlegenden Natur an seiner Fähigkeit für eine Bindung an PTX3 beteiligt ist.
Beispiel 5
Dissoziatioaskoastaate (Kd) der FGF-2/PTX3-Wechselwirkung
Bei diesem Experiment wurde die Dissoziationskonstante (Kd) der FGF-2/PTX3-Wechselwirkung bestimmt. Für diesen Zweck wurden ansteigende Dosierungen ¹²⁵I-FGF-2 mit auf Kunststoff immobilisiertem PTX3 inkubiert und die Bindungsergebnisse wurden durch einen Scatchard-Plot analysiert. Die in 5 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass FGF-2 PTX3 in sättigender Weise bindet und mit erhöhter Affinität (Kd = 8-16 nM). Diese Affinität ähnelt der vorher für die Wechselwirkung von PTX3 mit seinem physiologischen Liganden C1q berechneten.
Beispiel 6
Wirkung von PTX3 auf die FGF-2-Biadiag an Endothelzellen
Transformierte fötale bovine Aorta-Endothelzellen GM7373 wurden mit 80.000 Zellen/cm² in Schalen mit 24 Vertiefungen in Eagle's Minimal-Essenzialmedium (Eagle's-MEM), enthaltend 10 % FCS, ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C wurden die adhärenten Zellen zweimal mit Eagle's-MEM ohne FCS gewaschen und darauffolgend 2 Stunden bei 4°C mit ¹²⁵I-FGF-2 (10 ng/ml) in Eagle's-MEM, enthaltend 0,15 % Gelatine und 20 mM HEPES, pH 7,5 in Abwesenheit oder Gegenwart ansteigender Konzentrationen an PTX3 inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurde die Menge des an niedrig (HSPGs) und hoch affine Rezeptoren (FGFR) gebundenen ¹²⁵I-FGF-2, wie von Moscatelli, 1987 J. Cell. Physiol. 131:123-30 beschrieben, bewertet. Kurz gefasst wurden die Zellen zweimal mit 2 M NaCl in 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) gespült, um ¹²⁵I-FGF-2 zu entfernen, das an die niedrig-affinen Bindungsstellen gebunden hatte und zweimal mit 2 M NaCl in 20 mM Natriumacetat (pH 4,0) um ¹²⁵I-FGF-2 zu entfernen, das an hoch affine Bindungsstellen gebunden hatte. Eine nicht spezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 100fachen molaren Überschusses von nicht markiertem FGF-2 gemessen und von allen Werten abgezogen. Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass PTX3 zur Inhibiti on, in dosisabhängiger Weise, der Bindung von FGF-2 an seine hoch- und niedrig-affinen Rezeptoren auf Endothelzellen fähig ist.
Beispiel 7
Wirkung von PTX3 auf die mitogene Aktivität, die von FGF-2 auf Endothelzellan ausgeübt wird
GM 7373-Zellen wurden mit 75.000 Zellen/cm² auf Platten mit 48-Vertiefungen in Eagle's-MEM, enthaltend 10 % FCS, ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C wurden adhärente Zellen zweimal mit Eagle's-MEM ohne FCS gewaschen und darauffolgend 24 Stunden bei 37°C in Eagle's-MEM, enthaltend 0,4 % FCS in Gegenwart oder Abwesenheit von FGF-2 (10 ng/ml) und steigenden Konzentrationen von PTX3 inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und gezählt. In einer unterschiedlichen Gruppe von Experimenten wurden die GM 7373-Zellen, wie oben beschrieben, in Gegenwart unterschiedlicher mitogener Stimuli behandelt: 10 & FCS; 5 μg/ml Diacylglycerin (DAG); 10 ng/ml Phorbolester (TPA), 30 ng/ml vaskulärer epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) oder 30 ng/ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF). Die in 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass PTX3 die mitogene Aktivität inhibiert, die von FGF-2 auf Endothelzellen ausgeübt wird und zwar in dosisabhängiger Weise mit einem ID₅₀ der 30 nM entspricht. Dieser Wert ist ähnlich dem für die Wechselwirkung FGF-2-PTX3 berechneten Kd. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Inhibition der biologischen FGF-2-Aktivität durch PTX3 einer Sequestration an extrazellulären Stellen zuzuschreiben ist. Die inhibitorische Aktivität von PTX3 auf FGF-2 ist spezifisch, da sie nicht nachweisbar ist, wenn andere Mitogene zur Induktion der zellulären Proliferation verwendet werden.
Beispiel 8
Wirkung von PTX3 auf die Proliferation von transformierten fötalen bovinen Aorta-Endothelzellen
In diesem Experiment haben wir die Wirkung von PTX3 auf die Proliferation der murinen Aorta-Endothelzellinie MAE3F2T untersucht, die stabil mit einem Expressionsvektor transfiziert war, der für FGF-2 kodierte (Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). Diese Zellen können als Reaktion auf eine autokrine Stimulationsschleife proliferieren, die durch endogenes FGF-2 induziert wird (Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60). MAE3F2T-Zellen wurden mit 10.000/cm² auf Platten mit 48 Vertiefungen in Dulbecco's-Medium (DMEM), versetzt mit 10 % FCS, ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C wurden die adhärenten Zellen zweimal mit DMEM ohne FCS gewaschen und 72 Stunden bei 37°C in DMEM, enthaltend 0,4 % FCS, in Gegen wart oder Abwesenheit von PTX3 (70 nM), anti-FGF-2-spezifischen Antikörpern oder Suramin (50 μg/ml), inkubiert. Suramin ist für seine Fähigkeit zur Sequestration von extrazellulärem FGF-2 bekannt und inhibiert seine biologischen Aktivitäten (Rusnati et al., 1996, Mol. Biol. Cell. 7:369-381). Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in einer Burker-Kammer gezählt. Die in 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass PTX3 zur Blockierung der autokrinen Stimulierungsschleife in der Lage ist, die durch FGF-2 in MAE3F2T-Zellen induziert wird, was ihre FGF-2-abhängige Proliferation auf ähnliche Weise inhibiert, wie die von anti-FGF-2-Antikörpern und Suramin ausgeübte Inhibition.
Beispiel 9
Wirkung von PTX3 auf die in vivo durch FGF-2 induzierte Neovaskularisierung
Das anti-angiogene Potenzial von PTX3 wurde in vivo in dem Hühner-Embryo-Chorioallantoinsäuremembran (CAM) -Assay untersucht. Kurz gefasst wurde ein Fenster in einer Eischale bei einem 3 Tage alten befruchteten Hühnerei geöffnet. Am Tag 8 wurden Gelatineschwämme auf die CAMs implantiert und mit 10 μl PBS allein oder enthaltend FGF-2 (mit 500 ng/Schwamm) in Abwesenheit oder Gegenwart von PTX3 (5 μg/Schwamm) (5 bis 6 Embryos pro Gruppe) implantiert. Nach 4 Tagen wurden die CAMs in ovo unter einem Zeiss SR Stereomikroskop beobachtet und die angiogene Reaktion wurde durch zwei Untersucher bewertet, ohne Kenntnis der getesteten Proben und auf einer willkürlichen Skala von 0 bis 4+ eingeteilt, wobei 0 keine angiogene Reaktion und 4+ die stärkste Aktivität darstellte. Die in 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass PTX3 dazu in der Lage ist, die in vivo durch FGF-2 induzierte Neovaskularisierung zu blockieren.
Beispiel 10
Gentherapie mit PTX3
Murine Endothelzellen, die FGF-2 überexprimieren, und die FGF2MAE3F2T genannt werden (Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60) wurden mit menschlicher Gesamtlängen-PTX3-cDNA transfiziert, subkloniert in den kommerziellen Expressionsvektor pLXSH (Clontech).
In vitro-Studien an den erhaltenen transfizierten Zelllinien wurden durchgeführt, um die Wirkung der PTX3-Überexpression auf die FGF-2-abhängige Proliferation von FGF2MAE3F2T-Zellen zu untersuchen wie auch ihr invasives Verhalten auf dreidimensionalen Fibringels.
Im Detail wurden etliche FGF2MAE3F2T-Klone, die unterschiedliche Niveaus an PTX3 exprimierten und parentale FGF2MAE3F2T-Zellen (die PTX3 nicht produzierten) mit 10.000 Zellen pro cm² in Platten mit 48 Vertiefungen in Dulbecco's-Medium (DMEM), versetzt mit 10 % FCS, ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C wurden die adhärenten Zellen zweimal mit DMEM ohne FCS gewaschen und für unterschiedliche Zeitspannen bei 37°C in DMEM, enthaltend 0,4 % FCS, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationen wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in einer Burker-Kammer gezählt. Die in 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die PTX3-Überexpression die FGF2MAE3F2T-Zellproliferation inhibiert und dass das Ausmaß dieser Inhibition mit der Menge an PTX3 korreliert, die von den unterschiedlichen getesteten Klonen produziert wird.
Um das invasive Verhalten von FGF2MAE3F2T-Klonen, die PTX3 überexprimieren, auf dreidimensionalen Fibringels zu bewerten, wurden Zellaggregate auf Agarose-beschichteten Platten genau wie beschrieben (Gualandris et al. 1996, Cell Growth Diff. 7:147-60), hergestellt. Diese Aggregate wurden auf fibrinbeschichtete Platten mit 48 Vertiefungen ausgesät. Direkt nach dem Aussäen wurden 250 1 calciumfreies Medium, enthaltend Fibrinogen (2,5 mg/ml) und Thrombin (250 mU/ml) jeder Vertiefungen zugefügt und man ließ dies 5 Minuten bei 37°C gelieren. Dann wurden 500 1 Kulturmedium auf das Gel zugefügt. Bei allen Experimenten wurde der fibrinolytische Inhibitor Trasylol dem Gel und dem Kulturmedium mit 200 KIU/ml zugefügt, um die Auflösung des Substrats zu verhindern. Die Bildung radial wachsender Zellsprosse wurde nach 2 Tagen durch computerisierte Bildanalyse bewertet.
Die in 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die invasive Fähigkeit von PTX3 überexprimierenden FGF2MAE3F2T-Klonen signifikant niedriger ist als diejenige der Eltern-FGF2MAE3F2T-Zellen.
Die erhaltenen Ergebnisse demonstrieren, dass PTX3 die FGF-2-Aktivität in Endothelzellen inhibiert, wenn es endogen nach Gentransfer seiner cDNA erzeugt wird.
So kann die Verbindung gemäß der Erfindung für Gentherapie-Protokolle gemäß bekannten Verfahren verwendet werden (In Vivo. Jan.-Febr. 1998; 12(1):59-67; In Vivo. Jan.-Febr. 1998; 12(1):35-41; In Vivo. Nov.-Dez. 1994; 8(5):771-80), zur Behandlung von Erkrankungen, die durch eine veränderte Aktivierung des Wachstumsfaktors FGF-2 ausgelöst werden.

Claims

Verwendung des langen Pentraxins PTX3 oder eines funktionellen Derivats davon oder seiner Domäne zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention und Heilung von Erkrankungen, die durch eine unkontrollierte Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen vermittelt werden, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Narbenbildung, verbunden mit exzessiver Fibroblastenreaktion und Restenose nach einer Angioplastie, oder vermittelt wird durch eine veränderte Angiogenese, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Diabetesretinopathie und einer Atherosklerose.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das lange Pentraxin PTX3 das in der Natur vorhandene PTX3 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das lange Pentraxin PTX3 menschliches PTX3 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das lange Pentraxin PTX3 ein PTX3 aus synthetischem Ursprung ist.
Verwendung der cDNA, die das lange Pentraxin PTX3 oder sein funktionelles Derivat oder seine Domäne codiert, zur Herstellung von Expressionsvektoren umfassend die cDNA für die Gentherapie von Erkrankungen, die durch eine unkontrollierte Proliferation von Fibroblasten oder glatten Muskelzellen vermittelt werden, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Narbenbildung, verbunden mit einer exzessiven Fibroblastenreaktion und Restenose nach einer Angioplastie, oder die durch eine veränderte Angiogenese vermittelt werden, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Diabetesretinopathie und einer Atherosklerose.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin die cDNA, enthaltend das Gen codierend für PTX3 oder sein Derivat, durch einen Plasmid- oder viralen Vektor getragen wird.