DE29724845U1

DE29724845U1 - Pharmazeutische Zusammensetzung mit Angiogenese-Inhibitoren

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Publication number: DE29724845U1
Application number: DE29724845U
Authority: DE
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2007-02-15

Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Menge mindestens eines Peptids und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Analogon oder ein Fragment einer Troponin-Untereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Untereinheiten C, I und T, ist und die Angiogenese wirksam inhibieren kann.

Description

1. EINLEITUNG
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die eine anormale Angiogenese bedingen.

2. HINTERGRUND

Angiogenese, der Prozess zur Entwicklung und Bildung neuer Blutgefäße, spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen physiologischen Ereignissen, und zwar sowohl bei normalen als auch pathologischen Ereignissen. Die Angiogenese erfolgt in Reaktion auf spezifische Signale und beinhaltet einen komplexen Prozess, der charakterisiert ist durch die Infiltration von Basallamina durch vaskuläre Endothelzellen in Reaktion auf angiogene Wachstumssignale(e), die Wanderung der Endothelzellen zur Quelle von dem oder den Signalen und die anschließende Proliferation und Bildung der Kapillarröhre. Der Blutfluss durch die neu gebildete Kapillare wird begonnen, nachdem die Endothelzellen mit einer vorher existierenden Kapillare in Kontakt gekommen sind und sich mit dieser verbinden.

Bei dem natürlich auftretenden Gleichgewicht zwischen endogenen Stimulatoren und Inhibitoren der Angiogenese überwiegen die inhibitorischen Einflüsse. Rastinejad et al., 1989, Cell 56: 345–355. Bei solch seltenen Fällen, bei denen die Neovaskularisierung unter normalen physiologischen Bedingungen erfolgt, wie Wundheilung, Organregeneration, Embryonalentwicklung und Reproduktionsprozesse bei Frauen, wird die Angiogenese strikt reguliert und räumlich und zeitlich eingeschränkt. Unter den Bedingungen einer pathologischen Angiogenese, wie bspw. eine solche, die das feste Tumorwachstum kennzeichnet, versagen diese regulatorischen Kontrollen.

Die unregulierte Angiogenese wird pathologisch und hält den Fortschritt vieler neoplastischer und nicht-neoplastischer Erkrankungen aufrecht. Eine Reihe schwerer Erkrankungen wird von anormaler Neovaskularisierung dominiert, wie u. a. festem Tumorwachstum und Metastasen, Arthritis, einigen Arten von Augenerkrankungen und Psoriasis. Siehe bspw. die Übersichten von Moses et al., 1991, Biotech. 9: 630-634; Folkman et al., 1995, N. Engl. J. Med. 333: 1757–1763; Auerbach et al., 1985, J. Microvasc. Res 29: 401–411; Folkman, 1985, Advances in Cancer Research, Hrsg. Klein und Weinhouse, Academic Press, New York, S. 175–203; Patz, 1982, Am. J. Ophthalmol. 94: 715–743; und Folkman et al., 1983, Science 221: 719–725. Bei einer Anzahl von pathologischen Bedingungen trägt der Prozess der Angiogenese zum Erkrankungszustand bei. Es gibt bspw. immer mehr Daten, die nahe legen, dass das Wachstum von festen Tumoren von der Angiogenese abhängt. Folkman und Klagsbrun, 1987, Science 235: 442–447.

Die Aufrechterhaltung der Avaskularität der Kornea, der Linse und des Trabekel-Netzwerks ist für das Sehen sowie für die Augenphysiologie entscheidend. Es gibt verschiedene Augenerkrankungen, von denen viele zu Erblindung führen, wobei die Augen-Neovaskularisation in Reaktion auf den erkrankten Zustand erfolgen. Diese Augenerkrankungen umfassen diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Entzündungserkrankungen und Augentumore (bspw. Retinoblastom). Es gibt ebenfalls eine Anzahl von anderen Augenerkrankungen, die mit einer Neovaskularisation einher gehen, einschließlich retrolentaler Fibroplasie, Uveitis, Frühgeborenen-Retinopathie, makuläre Degeneration, und etwa 20 Augenerkrankungen, die mit choroidaler Neovaskularisation einhergehen, und etwa 40 Augenerkrankungen, die mit einer Neovaskularisierung der Iris einher gehen. Siehe bspw. Übersichten von Waltman et al, 1978, Am. J. Ophthal. 85: 704–710 und Gartner et al., 1978, Surv. Ophthal. 85: 704–710 und Gartner et al., 1978, Surv. Ophthal. 22: 291–312. Zur Zeit ist die Behandlung dieser Krankheiten, insbesondere sobald eine Neovaskularisierung erfolgt ist, unangemessen, und oft kommt es zur Erblindung. Untersuchungen haben ergeben, dass vasoinhibitorische Faktoren, die in normalem Augengewebe (Kornea und Glaskörper) vorhanden sind, im Erkrankungszustand verloren gehen.

Ein Inhibitor der Angiogenese kann eine wichtige therapeutische Rolle bei der Einschränkung der Beiträge dieses Prozesses für den pathologischen Fortschritt der zugrundeliegenden Erkrankungszustände haben, sowie bei der Bereitstellung einer wertvollen Maßnahme zur Untersuchung ihrer Ätiologie. Mittel, die bspw. die Tumor-Neovaskularisierung hemmen, können eine wichtige Rolle bei der Hemmung des metastatischen Tumorwachstums spielen.

Die Komponenten der Angiogenese, die die vaskuläre Endothel-Zellproliferation, Wanderung und Eindringung betreffen, werden Befunden zufolge teilweise durch Polypeptid-Wachstumsfaktoren reguliert. Experimente in der Kultur zeigen, dass Endothelzellen, die einem Medium mit geeigneten Wachstumsfaktoren ausgesetzt waren, induziert werden können, damit einige oder alle angiogenen Antworten hervor gerufen werden. Mehrere Polypeptide mit Endothel-Wachstumsfördernder Aktivität in vitro wurden identifiziert. Beispiele umfassen saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren α und β, von Plättchen hergeleiteter Endothelzell-Wachstumsfaktor, Granulocyten-koloniestimulierender Faktor, Interleukin 8, Hepatocyten-Wachstumsfaktor, Proliferin, vaskulärer Endothel- Wachstumsfaktor und Plazenta-Wachstumsfaktor. Siehe bspw. Übersicht von Folkman et al., 1995, N. Engl. J. Med., 333: 1757–1763.

Extrakte aus mehreren verschiedenen Gewebequellen enthalten antiangiogene Aktivität, mehrere Moleküle, wie Plättchen-Faktor-4, Thrombospondin, Protamin, und transformierenden Wachstumsfaktor B, regulieren Befunden zufolge verschiedene Aspekte der Angiogenese negativ, wie Zeltproliferation oder Zellwanderung, es wurde kein einziges von einem Gewebe hergeleitetes Makromolekül im Stand der Technik identifiziert, das die Angiogenese hemmen konnte. Siehe bspw. Übersichten von Folkman, J., 1995, N. Engl., J. Med. 333; 1757–1763 und D'Amore. 1985, Prog. Clin. Biol. Res. 221: 269–283. Es besteht daher ein starker Bedarf für die weitere Identifizierung und Charakterisierung von chemischen Mitteln, die die fortgesetzte deregulierte Verbreitung der Vaskularisation verhindern, und die potentiell eine breite Anwendbarkeit als Therapie für solche Erkrankungen haben, in denen die Neovaskularisation eine Hauptrolle spielt.

Kapillarendothelzellen ("EC") proliferieren in Reaktion auf einen angiogenen Stimulus während der Neovaskularisation. Ausprunk und Folkman 1977, J. Microvasc. Res. 14: 153–65. Ein In-Vitro-Assay, der die Endothel-Zeltproliferation in Reaktion auf bekannte Angiogenese-stimulierende Faktoren bestimmt, wie den sauren oder basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF bzw. bFGF) wurde entwickelt, damit der Neovaskularisierungsprozess in vitro nachgeahmt wird. Dieser Testtyp ist der Test der Wahl, mit dem die Stimulation der Kapillar-EC-Proliferation durch verschiedene angiogene Faktoren gezeigt wird. Shing et al., 1984, Science 223; 1296–1298.

Der Prozess der Kapillar-EC-Wanderung durch die extrazelluläre Matrix zu einem angiogenen Stimulus ist ebenfalls ein entscheidendes Ereignis, das für die Angiogenese erforderlich ist. Siehe bspw. Übersicht von Ausprunk et al., 1977, J. Microvasc. Res. 14: 53–65. Dieser Prozess bietet einen zusätzlichen Test, durch den der Neovaskularisierungsprozess in vitro nachgeahmt wird. Eine Modifikation der Boyden-Kammer-Technik wurde entwickelt, mit der die EC-Wanderung überwacht wurde. Boyden et al., 1962, J. Exptl. Med. 115: 453–456, Beispiel 4. Zur Zeit gibt es nur einige wenige von Gewebe hergeleitete EC-Zell-Wanderungs-Inhibitoren. Siehe bspw. Übersicht von Langer et al., 1976, Science 193: 70–72.

Anfang der 70er Jahre wurde eine Anzahl von In-vivo-Angiogenese-Modell-Biotests weithin verwendet. Diese Modellsysteme umfassten Kaninchen-Corneatasche, Hühnchen-Chorioallantoinmembran ("CAM"), dorsaler Luftsacktest bei Ratten und Kaninchen-Luftkammer-Biotests. Für eine Übersicht siehe Blood et al., 1990, Biochem. et Biophys Acta 1032: 89–118. Die Entwicklung der kontrollierten Freisetzungs polymere, die große Moleküle freisetzen können, wie Angiogenese-Stimulatoren und Inhibitoren, waren für die Verwendung dieser Tests entscheidend. Langer et al., 1976, Nature 263: 797–800.

Bei dem CAM-Biotest werden fertilisierte Hühnerembryos in Peptrischalen gezüchtet. An Tag 6 der Entwicklung wird eine Scheibe eines Freisetzungspolymers, wie Methylcellulose, imprägniert mit der Testprobe oder mit einer geeigneten Kontrollsubstanz, auf der vaskulären Membran an ihrem vorderen Rand untergebracht. An Tag 8 der Entwicklung wird die Fläche um das Implantat beobachtet und bewertet. Avaskuläre Zonen, die das Testimplantat umgeben, zeigen das Vorhandensein eine Inhibitors für die Embryonen-Neovaskularisation an. Moses et al., 1990, Science, 248: 1408–1410 und Taylor et al., 1982, Nature, 297: 307–312. Die beschriebenen Dosen für die vorher beschriebenen Angiogeneseinhibitoren, die allein im CAM-Assay untersucht werden, sind 50 μg Protamin (Taylor et al., (1982)), 200 μg Rinder-Glaskörperextrakt (Lutty et al., 1983, Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 24: 53–56) und 10 μg Plättchenfaktor IV (Taylor et al., (1982). Die niedrigsten beschriebenen Dosen der Angiogenese-Inhibitoren, die als Kombinationen wirksam sind, beinhalten Heparin (50 μg) und Hydrocortison (60 μg) und B-Cyclodextrin-Tetradecasulfat (14 μg) und Hydrocortison (60 μg), beschrieben von Folkman et al., 1989, Science 243: 1490.

Gemäß dem Kaninchen-Korneataschentest, werden Polymer-Pellets aus Ethylenvinylacetat-Copolymer ("EVAC") mit Testsubstanz imprägniert und chirurgisch in eine Tasche in die Kaninchenkornea etwa 1 mm vom Limbus implantiert. Langer et al., 1976, Science 193; 707–72. Zur Untersuchung auf einen Angiogeneseinhibitor wird entweder ein Stück Karzinom oder ein anderes angiogenes Stimulans distal zum Polymer 2 mm vom Limbus implantiert. Im jeweils anderen Auge des Kaninchens werden leere Kontrollpolymer-Pellets auf die gleiche Weise in die Nähe eines angiogenen Stimulans implantiert. Bei diesen Kontrollkorneas beginnen die Kapillar-Blutgefäße, in 5–6 Tagen zum Tumorimplantat zu wachsen, und überwachsen schließlich das reine Polymer. In diesen Koreas erfolgt das Richtungswachstum der neuen Kapillaren aus dem limbalen Blutgefäß zum Tumor mit einer reduzierten Geschwindigkeit und wird oft derart gehemmt, dass ein avaskulärer Bereich um das Polymer beobachtet wird. Dieser Test wird durch Messung der maximalen Gefäßlänge mit einem stereospezifischen Mikroskop quantifiziert.

Troponin, ein Komplex aus 3 Polypeptiden, ist ein akzessorisches Protein, das eng mit Aktinfilamenten im Vertebratenmuskel assoziiert ist. Der Troponinkomplex wirkt zusammen mit der Muskelform von Tropomyosin, damit die Ca²⁺-Abhängigkeit der Myosin-ATPase-Aktivität vermittelt wird und dadurch die Muskelkontraktion gesteuert wird. Die Troponin-Polypeptide werden entsprechend ihrer Tropomyosin- Bindungs-, inhibierenden und Calciumbindungs-Aktivitäten mit T, I, und C bezeichnet. Troponin T bindet an Tropomyosin und ist wahrscheinlich für die Positionierung des Troponinkomplexes auf dem dünnen Muskelfilament verantwortlich. Troponin I bindet an Aktin, und der Komplex, der durch Troponin I und T sowie Tropomyosin gebildet wird, hemmt die Wechselwirkung von Aktin und Myosin. Troponin C kann bis zu 4 Calciummoleküle binden. Untersuchungen legen nahe, dass bei der Erhöhung des Calciumspiegels im Muskel Troponin C bewirkt, dass Troponin I seinen Halt am Aktinmolekül verliert, so dass es zu einem Tropomyosin-Molekül-Shift kommt, die Myosin-Bindungsstellen auf dem Aktin frei gelegt werden und die Myosin-ATPase-Aktivität stimuliert wird. Vor dieser Erfindung war nicht bekannt, dass Troponin-Untereinheiten den Prozess der Endothelzellproliferation hemmten.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen mit den Troponin-Untereinheiten C, I oder T oder deren Fragmenten, in therapeutische wirksamen Mengen, die die Endothelzellproliferation hemmen können. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Analoga der Troponin-Untereinheiten C, I oder T und Analoga ihrer Fragmente enthalten, in therapeutisch wirksamen Mengen, die die Endothelzellproliferation hemmen können. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bzw. die therapeutische Verbindung ist geeignet zur Behandlung von neovaskulären Störungen. Diese therapeutischen Verbindungen (hier als "Therapeutika" bezeichnet), umfassen: Troponin-Untereinheiten C, I, und T, und Fragmente und Analoga davon. Das erfindungsgemäße Therapeutikum wird verabreicht zur Behandlung eines kanzerösen Zustands, oder damit ein Fortschreiten von einem präneoplastischen oder prä-malignen Zustand in einen neoplastischen oder malignen Zustand verhindert wird. Man kann das erfindungsgemäße Therapeutikum auch verabreichen, um Augenstörungen, die mit einer Neovaskularisierung einhergehen, zu behandeln.

3.1. Definitionen

Die hier verwendeten Definitionen:

Der Begriff "Troponin-Untereinheit", bedeutet, wenn diesem nicht die Begriffe C, I oder T voranstehen, eine beliebige der Troponin-Untereinheiten C, I oder T.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1. Hemmung der Rinder-Kapillar-Endothelzell-(BCE)-Proliferation durch Troponin C. Die prozentuale Hemmung der bFGF-stimulierten BCE-Proliferation ist als Funktion der Troponin-C-Konzentration (nM) gezeigt. Die prozentuale Hemmung wurde bestimmt, indem die Ergebnisse für Zellen, die mit Stimulus allein behandelt wurden, mit denen, die für Proben erhalten wurden, die sowohl Stimulus als auch Inhibitor ausgesetzt waren, verglichen wurden. Das Probenvolumen betrug 200 μl.

2. Hemmung der Kapillar-BCE-Proliferation durch Troponin I. Die prozentuale Hemmung der bFGF-stimulierten BCE-Proliferation ist als Funktion der Troponin-I-Konzentration (nM) gezeigt. Die prozentuale Hemmung wurde wie in 1 beschrieben bestimmt. Das Probenvolumen betrug 200 μl.

3. Hemmung der Kapillar-BCE-Proliferation durch Troponin T. Die prozentuale Hemmung der bFGF-stimulierten BCE-Proliferation ist als Funktion der Troponin-T-Konzentration (nM) gezeigt. Die prozentuale Hemmung wurde wie in 1 beschrieben bestimmt. Das Probenvolumen betrug 200 μl.

4. Hemmung der BCE-Proliferation durch Troponin C und I. Die prozentuale Hemmung der bFGF-stimulierten BCE-Proliferation ist als Funktion der Troponin-I- und -C-Konzentration (nM) gezeigt. Die prozentuale Hemmung wurde wie in 1 beschrieben bestimmt. Das Probenvolumen betrug 200 μl.

5. Hemmung der Kapillar-BCE-Proliferation durch Troponin C, I und T. Die prozentuale Hemmung der bFGF-stimulierten BCE-Proliferation ist als Funktion der Troponin-C-, -I- und -T-Konzentration (nM) gezeigt. Die prozentuale Hemmung wurde wie in 1 beschrieben bestimmt. Das Probenvolumen betrug 200 μl.

6. Hemmung des Tumorwachstums in SCID-Mäusen.

5. EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die auf Troponin-Untereinheiten beruhen. Die Zusammensetzungen erlauben die Behandlung neovaskulärer Störungen durch Verabreichung einer therapeutischen Menge der erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindung. Die therapeutischen Verbindungen (die hier als "Therapeutika" bezeichnet werden) umfassen: Troponin C, -I- und T-Untereinheiten, Fragmente und Analoga davon (zusammen "erfindungsgemäße Peptide"). Die erfindungsgemäßen Peptide werden durch die Eigenschaft der Hemmung der Rinder-Endothelzellproliferation in Kultur mit einer IC₅₀ von 10 μM oder weniger charakterisiert. Bevorzugt verabreicht man das erfindungsgemäße Therapeutikum, um einen kanzerösen Zustand zu behandeln, oder um das Fortschreiten von einem prä-neoplastischen oder nicht-malignen Zustand in einen neoplastischen oder einen malignen Zustand zu verhindern. Man kann auch das erfindungsgemäße Therapeutikum verabreichen, um eine Augenerkrankung, die mit Neovaskularisation einhergeht, zu behandeln.

In einem bevorzugten Aspekt ist ein erfindungsgemäßes Therapeutikum ein Peptid aus mindestens einem Fragment von Troponin C, Troponin I, Troponin T oder den Troponinen C und I, das die Endothelzellproliferation wirksam hemmen kann.

Beispiele für die Troponin-Untereinheiten, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen die Untereinheiten von Troponin des humanen fast-twitch Skelett-Muskels, deren Sequenzen nachstehend angegeben sind.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Peptide, die homolog zum humanen fast-twitch Skelett-Troponin C (Seq.-ID.-Nr. 1) oder zu deren Fragmenten sind. Bei einer Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptids mindestens 80% Identität, verglichen mit dem Fragment des humanen fast-twitch Skelett-Troponins C, aus dem es hergeleitet ist (das "Prototyp-Fragment"). Bei einer anderen Ausführungsform ist diese Identität größer als 85%. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist diese Identität größer als 90%. Bei einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptides mindestens 95% Identität mit dem Prototypfragment. Fragmente können mindestens 10 Aminosäuren sein und bei bevorzugten Ausführungsformen mindestens 50, 75, 100 bzw. 120 Aminosäuren.

Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung Peptide, die homolog zum humanen fast-twitch Skelett-Troponin I (Seq.-ID.-Nr. 2) oder zu deren Fragmenten sind. Bei einer Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptides mindestens 80% Identität mit dem Prototyp des humanen fast-twitch Skelett-Troponin-I-Fragmentes. Bei einer anderen Ausführungsform ist diese Identität größer als 85%. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist diese Identität größer als 90%. Bei einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptides mindestens 95% Identität mit dem Prototypfragment. Fragmente können mindestens 10 Aminosäuren umfassen, und bei bevorzugten Ausführungsformen mindestens 50, 75, 100 bzw. 120 Aminosäuren.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Peptide, die homolog zum humanen fast-twitch Skelett-Troponin T (Seq.-ID.-Nr. 3) oder deren Fragmenten sind. Bei einer Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptides mindestens 80% Identität mit dem Prototyp des menschlichen fast-twitch Skelett-Beta-Troponin-I. Bei einer anderen Ausführungsform ist diese Identität größer als 85%. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist diese Identität größer als 90%. Bei einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform hat die Aminosäuresequenz des Peptides mindestens 95% Identität mit dem Prototypfragment. Fragmente können mindestens 10 Aminosäuren umfassen, und bei bevorzugten Ausführungsformen mindestens 50, 75, 100, 120 bzw. 200 Aminosäuren.

Bei anderen spezifischen Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Peptide Troponin C, Troponin I- und Troponin-T-Untereinheiten der fast-twitch, slowtwitch und Herz-Isoformen aus anderen Säugetier-Arten, bspw. Mensch, Kaninchen, Ratte, Maus, Rind, Schaf und Schwein.

Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Therapeutikum mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines anderen Moleküls kombiniert, das die Angiogenese negativ reguliert, bspw. aber nicht eingeschränkt auf Plättchenfaktor 4, Thrombospondin-1, Gewebeinhibitoren der Metallproteasen (TIMP1 und TIMP2), Prolactin (16 kd-Fragment), Angiostatin (38-kd-Fragment von Plasminogen), bfGf-löslicher Rezeptor, transformierender Wachstumsfaktor β, Interferon alpha, und Plazenta-Proliferin-verwandtes Protein.

Paradoxerweise reduziert die Neovaskularisierung allmählich die Zugänglichkeit der Tumore gegenüber Chemotherapie-Medikamenten aufgrund eine gesteigerten Interstitialdrucks innerhalb des Tumors, der bewirkt, dass eine vaskuläre Kompression und eine Zentralneurose bewirkt wird. In-vivo-Ergebnisse haben gezeigt, dass Neger, die eine angiogene Therapie erhalten, eine gesteigerte Abgabe der Chemotherapie an einen Tumor zeigen. Teicher et al., 1994, Int. J. Cancer 57: 920-925. Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in Kombination mit einem Chemotherapeutikum bereit.

Bei einem bevorzugten Aspekt wird ein erfindungsgemäßes Therapeutikum mit Chemotherapeutika oder mit dem Aussetzen gegenüber einem radioaktiven Isotop kombiniert.

Die Erfindung wird mittels Beispielen, siehe unten, veranschaulicht, die unter anderem die Hemmung der Kapillar-Endothelzellproliferation durch die Troponin-Untereinheiten C, I und T und die Maßnahmen zur Bestimmung der Hemmung der Kapillar-Endothelzellewanderung und Hemmung der Neovskularisation in vivo durch Troponin-Untereinheiten offenbaren.

Die eingehende Beschreibung der Erfindung ist zur Verdeutlichung der Offenbarung und nicht als Einschränkung in die nachstehenden Unterabschnitte aufgeteilt.

5.1. TROPONIN-UNTEREINHEITEN, FRAGMENTE UND ANALOGA

Die Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Troponin-Untereinheiten, deren Fragmente und Analoga umfassen. Bei bestimmten Aspekten stammen die Untereinheiten, Fragmente oder Analoga von Troponin-Untereinheiten von Fliege, Frosch, Maus, Ratte, Kaninchen, Schwein, Kuh, Hund, Affe oder Mensch.

Man strebt an, dass die Troponin-Untereinheit-Fragmente hergestellt werden können, indem die Troponin-Sequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen verändert werden können, die somit funktionell äquivalente Moleküle bereitstellen. Diese beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf, Troponin-Untereinheiten, Fragmente oder Analoga, die als primäre Aminosäuresequenz die gesamte Aminosäuresequenz einer Troponin-Untereinheit oder einen Teil davon enthalten, einschließlich der veränderten Sequenzen, in denen die funktionell äquivalenten Aminosäurereste gegen Reste in der Sequenz ausgetauscht sind, die zu einer stummen Änderung führen. Bspw. können eine oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz gegen eine andere Aminosäure mit ähnlicher Polarität ausgetauscht werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stummen Änderung führt. Austausche für eine Aminosäure in der Sequenz können ausgewählt werden aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört. Bspw. umfassen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Eine Ausführungsform der Erfindung stellt Moleküle bereit, die ein Fragment mit mindestens 10 (kontinuierlichen) Aminosäuren einer Troponin-Untereinheit umfassen oder daraus bestehen, welche die Endothelzellproliferation hemmen können. Bei anderen Ausführungsformen besteht dieses Molekül aus mindestens 20 oder 50 Aminosäuren der Troponin-Untereinheit. In spezifischen Ausführungsformen bestehen diese Fragmente aus einer Troponin-Untereinheit mit mindestens 75, 120 oder 200 Aminosäuren oder umfassen diese.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein eine Troponin-Untereinheit aus einem Säugetier. Bei alternativen Ausführungsformen handelt es sich um eine Troponin-C-, -I- oder -T-Untereinheit aus einem Säugetier.

Die erfindungsgemäßen Troponin-Untereinheit-Fragmente und -Analoga können von Gewebe hergeleitet werden (siehe bspw. Beispiel 1, Ebashi et al., 1968, J. Biochem. 64: 465; Yasui et al., 1968, J. Biol. Chem. 243: 735; Hartshorne et al., 1968, Biochem. Biophys. Res. Commun. 31: 647; Shaub et al., 1969, Biochem. J. 115: 993; Greaser et al., 1971, J. Biol. Chem. 246: 4226–4733; Brekke et al., 1976, J. Biol. Chem. 251: 866–871 und Yates et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 5770–5774) oder durch verschiedene Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden. Die Behandlungen, die zu ihrer Produktion führen, können auf Gen- oder Protein-Niveau erfolgen. Eine klonierte Troponin-Gensequenz, die die Troponin-Untereinheiten C, I oder T codiert, kann bspw. durch eine von vielen Strategien des Standes der Technik modifiziert werden. Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen gespalten werden, gefolgt von einer weiteren enzymatischen Modifikation, wenn gewünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein Derivat oder Analogon einer Troponin-Untereinheit codiert, sollte man darauf achten, dass das modifizierte Gen sicher im gleichen Leseraster für die Translation bleibt wie das Gen für die Troponin-Untereinheit, und nicht in dem Genbereich, in dem die gewünschte Troponinaktivität codiert ist, durch Translations-Stopsignale unterbrochen wird.

Die die Troponin-Untereinheit codierende Nukleinsäuresequenz kann in vitro oder in vivo mutiert werden, so dass Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen erzeugt und/oder zerstört werden, oder damit Variationen der codierenden Bereiche erzeugt werden und/oder neue Restriktionsendonukleasestellen gebildet oder vorher existierende zerstört werden, damit eine In-vitro-Modifikation weiter vereinfacht wird. Jede Technik zur Mutagenese des Standes der Technik kann verwendet werden, einschließlich aber nicht eingeschränkt auf stellenerichtete Mutagenese in-vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia) usw.

Behandlungen der Sequenz für die Troponin-Untereinheit C, I oder T können ebenfalls auf dem Proteinniveau erfolgen. Im Rahmen der Erfindung eingeschlossen sind Fragmente der Troponin-Untereinheit oder andere Fragmente oder Anaologa, die während oder nach der Translation differentiell modifiziert werden, bspw. durch Acetylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekann te Schutz- bzw. Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder anderen Zellliganden, usw. Beliebige von zahlreichen chemischen Modifikationen können mittels bekannter Techniken durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf spezifische Spaltung durch Cyanogenbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH₄, Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion, usw.

Zudem können Fragmente und Analoga von Troponin-Untereinheiten chemisch synthetisiert werden. Bspw. kann ein Peptid, das einem Abschnitt einer Troponin-Untereinheit entspricht, und das die gewünschte Domäne umfasst oder die gewünschte Aktivität in vitro vermittelt, durch Verwendung eines Peptidsynthesegerätes synthetisiert werden. Zudem können wenn gewünscht nicht-klassische Aminosäuren oder chemische Aminosäure-Analoga als Substitution oder Addition in die Sequenz der Troponin-Untereinheit eingebracht werden. Nicht-klassische Aminosäuren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die D-Isomere der üblichen Aminosäuren α-Aminobuttersäure, 4-Aminobuttersäure, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren, wie β-Methylaminosäuren, Cα-Methyl-Aminosäuren, und Nα-Methyl-Aminosäuren.

Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein chimäres oder Fusions-Protein, umfassend eine Troponin-Untereinheit oder ein Fragment davon (das aus mindestens einer Domäne oder einem Motiv der Troponin-Untereinheit besteht, die für die Hemmung der Endothelzellproliferation verantwortlich ist), das an seinem Amino- oder Carboxy-Terminus über eine Peptidbindung an eine Aminosäuresequenz eines anderen Proteins gebunden ist. Eis solches chimäres Produkt kann hergestellt werden, indem man die geeigneten Nukleinsäuresequenzen, die die gewünschten Aminosäuresequenzen codieren, mittels Verfahren des Standes der Technik im richtigen Leseraster aneinander ligiert, und das chimäre Produkt durch Verfahren des Standes der Technik exprimiert. Alternativ kann ein solches chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken, bspw. durch Verwendung eines Peptidsynthesegerätes, hergestellt werden.

5.2. ASSAYS VON TROPONINPROTEINEN, FRAGMENTEN UND ANA-LOGA

Die funktionelle Aktivität und/oder therapeutisch wirksame Dosis von Troponin-Untereinheiten, Fragmenten und Analoga lässt sich in vitro durch verschiedene Verfahren untersuchen. Diese Verfahren beruhen auf den physiologischen Prozessen, die an der Angiogenese beteiligt sind. Sie sind zwar im Rahmen der Erfindung, jedoch ist nicht beabsichtigt, dass sie die Verfahren, durch die die Troponin-Untereinheiten, Fragmente und Analoga, die die die Angiogenese hemmen, definiert sind und/oder durch die eine therapeutisch wirksame Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmt wird, einschränken.

Bei der Untersuchung auf die Fähigkeit von Troponin-Untereinheiten, Fragmenten und Analoga zur Hemmung oder Wechselwirkung mit der Proliferation der Kapillarendothelzellen (EC) in vitro, können verschiedene Bioassays des Standes der Technik verwendet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Einbau radioaktiver Substanzen in Nukleinsäuren, kolorimetrische Tests und das Zählen von Zellen.

Die Hemmung der Endothelzellproliferation kann durch kolorimetrische Bestimmung der zellulären sauren Phosphatase-Aktivität oder elektronisches Zellzählen gemessen werden. Diese Verfahren bieten eine schnelle und empfindliche Durchmusterung zur Bestimmung der Zahl der Endothelzellen in Kultur nach der Behandlung mit der erfindungsgemäßen Troponin-Untereinheit, dem Derivat oder Analogon und einem die Angiogenese stimulierenden Faktor, wie aFGF. Die kolorimetrische Bestimmung der zellulären sauren Phosphataseaktivität ist von Connolly et al., 1986, J. Anal. Biochem. 152: 136–140 beschrieben. Gemäß diesem Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, werden die Kapillarendothelzellen mit angiogenesestimulierenden Faktoren, wie aFGF, und einem Bereich von potentiellen Inhibitorkonzentrationen behandelt. Diese Proben werden inkubiert, damit das Wachstum ermöglicht wird, und dann geerntet, gewaschen, in einem Puffer, der ein Phosphatasesubstrat enthält, lysiert, und dann ein zweites Mal inkubiert. Eine basische Lösung wird zugegeben, damit die Reaktion gestoppt wird, und die Farbentwicklung wird bei 405 λ bestimmt. Gemäß Connolly et al. wird eine lineare Beziehung zwischen der Aktivität der sauren Phosphatase und Endothelzellzahl bis zu 10000 Zellen/Probe erhalten. Standard-Kurven für die Aktivität der sauren Phosphatase werden ebenfalls aus bekannten Zellzahlen erzeugt, damit bestätigt wird, dass die Enzymmengen die tatsächlichen EC-Zahlen widerspiegeln. Die prozentuale Hemmung wird bestimmt, indem man die Zellzahl der Proben, die dem Stimulus ausgesetzt waren, mit denjenigen vergleicht, die sowohl Stimulus als auch Inhibitor ausgesetzt waren.

Kolorimetrische Tests zur Bestimmung der Wirkung der Troponin-Untereinheiten C, I und T auf die Endothelzellproliferation zeigen, dass alle 3 Troponin-Untereinheiten die bFGF-stimulierte Endothelzellproliferation stören.

Troponin C hemmte die bFGF-stimulierte Endothelzellproliferation in einer dosisbahängigen Weise bei sämtlichen untersuchten Konzentrationen (1). Die pro zentuale Hemmung von Rinder-Endothelzellproliferation ("BCE") betrug 54%, 86%, 83% und 100% bei Konzentrationen von 280 nm, 1,4 μM, 2,8 μM bzw. 5,6 μM. Eine Hemmung von 100% wurde bei einer Konzentration von 20 μg/Vertiefung (5,6 μM) beobachtet. Die IC₅₀ stellt die Konzentration dar, bei der eine 50%ige Hemmung einer aFGF-Wachstumsfaktorinduzierten Stimulation beobachtet wurde. Die IC₅₀ von Troponin C betrug Bestimmungen zufolge 278 nM.

Troponin I hemmte die bFGF-stimulierte BCE-Proliferation bei Konzentrationen von 1 und 5 μg/Vertiefung, jedoch wurde keine Hemmung bei der mit 10 μg/Vertiefung getesteten Probe beobachtet (2). Die prozentuale Hemmung von BCE war 33% und 46% bei Konzentrationen von 240 nM bzw. 1,2 μM. Die IC₅₀ von Troponin I betrug Bestimmungen zufolge 1,14 μM.

Troponin T hemmte die bFGF-stimulierte EC-Proliferation bei Konzentrationen von 10 und 20 μg/Vertiefung, jedoch nicht bei Konzentrationen von 1 und 5 μg/Vertiefung (3). Die BCE-Proliferation wurde um 23% und 62% bei 1,6 μM bzw. 3,3 μM, gehemmt. Die IC₅₀ von Troponin T betrug Bestimmungen zufolge 2,14 μM.

Die Kombination der Troponin-Untereinheiten C und I hemmte EC bei sämtlichen untersuchten Konzentrationen (4). Die prozentuale Hemmung von BCE betrug 52%, 54%, 73% und 47% bei 130 nM, 645 nM, 1,3 μM bzw. 2,6 μM. Die IC₅₀ dieser Kombination betrug Bestimmungen zufolge 110 nM.

Die Kombination der Troponin-Untereinheiten C, I und T hemmte Beobachtungen zufolge die aFGF-stimulierte BCE-Proliferation um 16% bei einer Konzentration von 360 nM (5 μg/Vertiefung, 5).

Die untersuchten Troponinproben hatten keine nachweisbare Wirkung auf das Wachstum von Balb/c 3T3-Zellen, einem Nicht-Endothelzelltyp.

Der Einbau von radioaktivem Thymidin durch Kapillar-Endothelzellen stellt eine weitere Maßnahme dar, mit der man die Hemmung der Endothelzellproliferation durch einen potentiellen Angiogeneseinhibitor untersucht. Gemäß diesem Verfahren wird eine vorbestimmte Anzahl von Kapillarendothelzellen in Gegenwart von ³H-Thymidin-Stammlösung, einem Angiogenese-Stimulator, wie bspw. bFGF und einem Bereich des zu untersuchenden Angiogeneseinhibitors gezüchtet. Nach der Inkubation werden die Zellen geerntet, und das Ausmaß des Thymidineinbaus wird bestimmt. Siehe Beispiel 2.

Die Fähigkeit verschiedener Konzentrationen an Troponin-Untereinheiten, Fragmenten oder Analoga, den Prozess der Kapillar-Endothelzellwanderung in Reak tion auf einen angiogenen Stimulus zu stören, kann mit der modifizierten Boyden-Kammer-Technik untersucht werden. Siehe Abschnitt 2 und Beispiel 4, siehe unten.

Eine weitere Maßnahme, durch die die funktionelle Aktivität der Troponin-Untereinheiten, Fragmente und Analoga untersucht werden, beinhaltet die Fähigkeit der Verbindungen zur Hemmung der gerichteten Wanderung von Kapillarendothelzellen, was schließlich zur Kapillarröhrenbildung führt. Diese Fähigkeit kann bspw. mit einem Test bestimmt werden, bei dem auf Kollagengele plattierte Kapillarendothelzellen mit dem Inhibitor herausgefordert werden, und indem bestimmt wird, ob kapillarartige Röhrenstrukturen durch gezüchtete Endothelzellen entstanden sind.

Tests auf die Fähigkeit zur Hemmung der Angiogenese in vivo umfassen den Hühnchen Chorionallantoin-Membran-Test (siehe Abschnitt 2 und Beispiel 5, siehe unten) und Ratten- oder Kaninchen-Korneataschentests. Siehe Polverini et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 440–450. Gemäß den Korneataschentests wird ein Tumor der Wahl in die Kornea des Testtieres in der Form einer KOrneatasche implantiert. Der potentielle Angiogeneseinhibitor wird auf die Korneatasche aufgebracht, und die Korneatasche wird routinemäßig auf Neovaskularisierung untersucht. Siehe Abschnitt 2 und Beispiel 6, unten.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform bietet die Kombination der erfindungsgemäßen Troponin-Untereinheiten, Fragmente oder Analoga zur Hemmung der Angiogenese. Eine weitere Ausführungsform bietet die Kombination von Troponin-Untereinheit, Fragmenten, oder Analoga mit anderen angiogenesehemmenden Faktoren. Diese angiogenesehemmenden Faktoren beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf: angiostatische Steroide, Thrombospondin, Plättchenfaktor IV, transformierenden Wachstumsfaktor β, Interferone, Tumornekrosefaktor α, Rinderglaskörperextrakt. Protamin, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMP-1 und TIMP-2), Prolactin (16-kd-Fragment), Angiostatin (38-kd-Fragment von Plasminogen), bFGFlöslicher Rezeptor, und Plazenta-Proliferin-verwandtes Protein. Siehe bspw. Übersichten von Folkman et al., 1995, N. Engl. J. Med. 333: 1757–1763 und Klagsbrun et al., 1991, Annu. Rev. Physiol. 53: 217–239.

Die therapeutisch wirksame Dosierung zur Hemmung der Angiogenese in vivo, definiert als Hemmung der kapillaren Endothelzellproliferation, Wanderung und/oder Einwachsen von Blutgefäßen, kann von In-vitro-Hemmungstests mit den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oder in Kombination mit anderen angiogenesehemmenden Faktoren extrapoliert werden. Die effektive Dosierung hängt ebenfalls vom Verfahren und den Maßnahmen der Zufuhr ab. Bei einigen Anwendungen, wie bei der Behandlung von Psoriasis oder diabetischer Retinopathie, wird der Inhibitor in einem topisch-ophthalmischen Träger abgegeben. Bei anderen Anwendungen, wie bei der Behandlung von festen Tumoren, wird der Inhibitor mit einem biologisch abbaubaren Polymerimplantat zugeführt. Das Protein kann ebenfalls durch Polyethylenglycol-Behandlung modifiziert werden.

5.3. THERAPIEVERWENDUNGEN

Die Erfindung erlaubt die Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die mit einer Neovaskularisierung einhergehen, durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindung. Diese therapeutischen Verbindungen, (die hier als "Therapeutika" bezeichnet werden) beinhalten Troponin-Untereinheiten und deren Fragmente und Analoga (bspw. wie nachstehend beschrieben).

5.3.1 MALIGNITÄTEN

Maligne und metastatische Zustände, die sich mit den erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen behandeln lassen, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die in der Tabelle 1 aufgeführten festen Tumore (für eine Übersicht dieser Störungen, siehe Fishman et al., 1985, Medicine, 2. Auflage, J.B. Lippincott Co., Philadelphia):

TABELLE 1

MALIGNITÄTEN UND DAMIT EINHERGEHENDE STÖRUNGEN

Feste Tumore

Sarkome und Karzinome

Fibrosarkom
Myxosarkom
Liposarkom
Chondrosarkom
osteogenes Sarkom
Chordom
Angiosarkom
Endotheliosarkom
Lymphangiosarkom
Lymphangioendotheliosarkom
Synoviom
Mesotheliom
Ewing's Tumor
Leiomyosarkom
Rhabdomyosarkom
Kolonkarzinom
Pankreaskrebs
Brustkrebs
Ovarkrebs
Prostatakrebs
Plattenzellkarzinom
Basalzellkarzinom
Adenokarzinom
Schweißdrüsenkarzinom
Talgdrüsenkarzinom
Papillarkarzinom
Papillaradenokarzinome
Cystadenokarzinom
medulläres Karzinom
bronchogenes Karzinom
Nierenzellkarzinom
Hepatom
Gallengangkarzinom
Choriokarzinom
Seminom
Embryonalkarzinom
Wilms' Tumor
Cervixkrebs
Hodentumor
Lungenkarzinom
Kleinzelllungenkarzinom
Blasenkarzinom
sEpithelkarzinom
sGliom
Astrocytom
Medulloblastom
Craniopharyngiom
Ependymom
sKaposi's Sarkom
Pinealom
Hämangioblastom
akustisches Neurom
Oligodendrogliom
Menangiom
Melanom
Neuroblastom
Retinoblastom

5.3.2. AUGENSTÖRUNGEN

Augenstörungen, die mit einer Neovaskularisierung einhergehen, können mit den erfindungsgemäßen Therapeutika behandelt werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf

neovaskuläres Glaukom
diabetische Retinopathie
Retinoblastom
retrolentale Fibroplasie
Uveitis
Frühgeborenen-Retinopathie
makulöse Degeneration
Hornhauttransplantat-Neovaskularisation

sowie anderen Augenentzündungserkrankungen, Augentumoren und Erkrankungen, die mit einer Chorion- oder Iris-Neovaskularisierung einhergehen. Siehe bspw. Übersichten von Waltman et al., 1978, Am. J. Ophthal. 85: 704–714 und Gartner et al., 1978, Surv. Opthal. 22: 291–312.

5.3.3. Andere Störungen

Andere Störungen, die sich mit den erfindungsgemäßen Therapeutika behandeln lassen, beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf Hämangiom, Arthritis, Psoriasis, Angiofibrom, Atherosklerose-Plaques, verzögerte Wundheilung, Granulationen, hämophile Gelenke, hypertrophe Narben, nichteinheitliche Brüche, Osler-Weber-Syndrom, pyogenes Granulom, Skleroderma, Trachom und Gefäßadhäsionen.

5.4. NACHWEIS DER NÜTZLICHKEIT FÜR THERAPIE UND PROPHY-LAXE

Die erfindungsgemäßen Therapeutika können in vivo auf die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Aktivität sowie auf die Bestimmung der therapeutisch wirksamen Dosierung untersucht werden. Diese Verbindungen können bspw. vor dem Testen in Menschen in geeigneten Tiermodellsystemen untersucht werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Ratten, Mäuse, Hühnchen, Kühe, Affen, Kaninchen, usw. Zur In-vivo-Untersuchung kann vor der Verabreichung an Menschen jedes Tiermodellsystem des Standes der Technik verwendet werden.

5.5. THERAPEUTISCHE BZW. PROPHYLAKTISCHE VERABREICHUNG UND ZUSAMMENSETZUNGEN

Die Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung (und Propyhlaxe) durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Therapeutikums an ein Individuum bereit. Bei einem bevorzugten Aspekt wird das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt, wie es in Beispiel 1 veranschaulicht ist. Das Individuum ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Tiere, wie Kühe, Schweine, Hühner usw. und es ist vorzugsweise ein Säugetier, und am stärksten bevorzugt ein Mensch.

Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Behandlung durch Verabreichung an ein Individuum einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Therapeutikums im Kombination mit einem Chemotherapeutikum und/oder mit dem Aussetzen gegenüber einem radioaktiven Isotop bereit.

Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Behandlung von Patienten, die in die Remission eingetreten sind, mit einem erfindungsgemäßen Therapeutikum bereit, damit ein inaktiver Zustand erhalten wird.

Es gibt verschiedene Abgabesysteme , die sich zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums verwenden lassen, bspw. Einkapselung in Liposomen, Mikroteilchen, Mikrokapseln, Rezeptor-vermittelte Endocytose (siehe bspw. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432). Einbringungsverfahren beinhalten, sind aber nicht eingeschränkt auf topische, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale, ophthalmische und orale Wege. Die Verbindungen lassen sich durch einen beliebigen geeigneten Weg verabreichen, bspw. durch Infusion oder Bolus-Injektion, durch Absorption durch Epithel- oder Schleimhaut-Auskleidungen (bspw. orale Mucosa, rektale und intestinale Mucosa, usw.) und können zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht wer den. Die Verabreichung ist vorzugsweise lokal, sie kann aber auch systemisch erfolgen. Zudem kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wünschenswerterweise über einen geeigneten Weg in das Zentralnervensystem eingebracht werden, wie u. a. intraventrikuläre und intrathekale Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter, bspw. an einem Reservoir befestigt, wie einem Ommaya-Reservoir, erleichtert werden. Die pulmonäre Verabreichung kann ebenfalls eingesetzt werden, bspw. durch Verwendung eines Inhalators oder eines Zerstäubers, und durch Formulierung mit einem aerosolbildenden Mittels.

Bei einer bestimmten Ausführungsform, kann man wünschenswerterweise die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal an die Stelle verabreichen, die eine Behandlung benötigt; dies kann bspw. erzielt werden durch lokale Infusion bei der Operation, topische Anwendung, bspw. im Zusammenhang mit einem Wunddressing nach der Operation, durch ein Katheter, mit einem Zäpfchen, oder mittels eines Implantates, wobei das Implantat ein poröses, nicht-poröses oder gelatineartiges Material ist, einschließlich Membranen, wie Silikonkautschukmembranen oder Fasern, ist aber nicht darauf eingeschränkt. Bei einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an der Stelle (oder früheren Stelle) eines malignen Tumors oder neoplastischen oder prä-neoplastischen Gewebes erfolgen.

Für die topische Anwendung wird die gereinigte Troponin-Untereinheit mit einem Träger vereinigt, so dass eine wirksame Dosierung abgegeben wird, auf der Basis der gewünschten Aktivität (d.h. im Bereich von einer wirksamen Dosierung, bspw. von 1,0 μM bis 1,0 mM), damit eine lokale Angiogenese, Endothezellwanderung und/oder Hemmung der Kapillar-Endothelzellproliferation verhindert wird. Bei einer Ausführungsform wird eine topische Troponin-Untereinheit, ein Fragment oder Analogon zur Behandlung von Erkrankungen, wie Psoriasis, auf die Haut aufgebracht. Der Träger kann in der Form von bspw. Salbe, Creme, Gel, Paste, Schaum, Aerosol, Zäpfchen, Pflaster oder Gelstift vorliegen, ist aber nicht darauf eingeschränkt.

Ein topisches Therapeutikum zur Behandlung von einigen der Augenstörungen, die unten diskutiert sind, besteht aus einer wirksamen Menge einer Troponin-Untereinheit, eines Fragmentes oder Analogons in einem opthalmologisch verträglichen Exzipienten, wie gepufferter Salzlösung, Mineralöl, Pflanzenölen, wie Mais- oder Erdnussöl-, Rohöl-Gel, Miglyol 182, Alkohol-Lösungen, oder Liposomen oder liposomenartige Produkte. Jede dieser Zusammensetzungen kann ebenfalls Konservierungsmittel, Antioxidantien, Antibiotika, Immunsuppressiva und andere biologisch oder pharmazeutisch wirksame Mittel beinhalten, die keine schädliche Wirkung auf die Troponin-Untereinheit haben.

Für gerichtete interne topische Anwendungen, bspw. zur Behandlung von Ulzera oder Hämorrhoiden, kann die Troponin-Untereinheit, das Fragment oder die Analogon-Zusammensetzung in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegen, die jeden der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen mit einer ähnlichen Beschaffenheit enthalten können: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie Stärke oder Lactose, ein Sprengmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Sterote; oder ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliciumdioxid. Ist die Einheitsdosierungsform eine Kapsel, kann diese neben dem Material des vorhergehenden Typs eine flüssigen Träger, wie Fettsäureöl, enthalten. Zudem kann die Einheitsdosierungsformen ebenfalls verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, bspw. Beschichtungen aus Zucker, Schellack oder anderen enterischen Mitteln.

Zäpfchen enthalten gewöhnlich den Wirkstoff im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.%; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10 bis 95 Wirkstoff.

Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Therapeutikum in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, abgegeben werden. Siehe Langer, et al., 1990, Science 249: 1527–1533, Treat et al., 1989, in "Liposomes and in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer", Lopez-Berestein and Fidler (hrsg), Liss., New York, S. 363–365; Lopez-Berestein, ibid., S. 317–327.

Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Therapeutikum in einem System zur kontrollierten Freisetzung abgegeben werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Infusionspumpe zur Verabreichung der Troponin-Untereinheit, wie bspw. diejenige, die für die Abgabe von Insulin verwendet wird, oder Chemotherapie für spezifische Organe oder Tumore verwendet werden (siehe Langer, siehe oben; Sefton CRC Crit. Ref. Biomed., 1987, Eng. 14: 2301; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Eng. J. Med. 321: 574.

Bei einer bevorzugten Form wird die Troponin-Untereinheit, das Fragment oder Analogon in Kombinatin mit einem biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymerimplantat verabreicht, das die Troponin-Untereinheit, das Fragment oder Analogon über einen kontrollierten Zeitraum an einer ausgewählten Stelle freisetzt. Beispiele für bevorzugte Polymermaterialien umfassen Polyanhydride, Polyorthoester, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyethylenvinylacetat und deren Copolymere und Gemische. Siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (Hrsg.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (Hrsg.), 1984, Wiley, New York; Raner and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci, Rev. Macromol. Chem. 23: 61; siehe ebenfalls Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105. Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein System zur kontrollierten Freisetzung in die Nähe eines therapeutischen Ziels untergebracht werden, d.h. des Gehirns, so dass nur ein Teil der syntemischen Dosis erforderlich ist (siehe bspw. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 1989, siehe oben, Bd. 2, S. 115–138).

Andere Systeme zur kontrollierten Freisetzung werden in der Übersicht von Langer erörtert (1990, Science, 249: 1527–1523).

Die Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen bereit. Diese Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eine Therapeutikums, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen lassen sich als neutrale oder Salzformen formulieren. Pharmazeutisch verträgliche Salze beinhalten solche, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie sie von Salz-, Phsophor-, Essig-, Oxal-, Weinsäuren usw. hergeleitet sind, und solche die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie sie von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Eisenhydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain usw. hergeleitet sind.

Bei einer spezifischen Ausführungsform bedeutet der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" genehmigt von der Regulierungsbehörde der Bundes- oder Staatsregierung, oder aufgeführt in der US-Pharmakopieia oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopoiea zur Verwendung in Tieren, und insbesondere in Menschen. Der Begriff "Träger" betrifft ein Verdünnungsmittel, Hilfsstoff, Exzipient, oder Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können steile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, sein, bspw. solche von Rohöl, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl, und dergleichen, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können ebenfalls als Flüssigkeitsträger, insbesondere für injizierbare Lösungen, eingesetzt werden. Geeignete pharamzeutische Exzipienten umfassen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silikagel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, Trockenmagermilch, Glycerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Die Zusammensetzung kann wenn gewünscht ebenfalls geringe Mengen Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren oder pH-Wert-Puffermittel, wie Acetate, Citrate oder Phos phate enthalten. Antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure; und Mittel zum Einstellen der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose lassen sich ebenfalls einsetzen. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Wegwerfspritzen oder Mehrfachdosisgefäßen aus Glas oder Kunststoff eingeschlossen werden.

Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen zur verzögerten Freisetzung und dergleichen haben. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit herkömmlichen Bindemitteln und Trägern, wie Triglyceriden, mikrokristalliner Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine formuliert werden. Die orale Formulierung kann Standard-Träger enthalten, wie pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat, usw. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences" von E.W. Martin beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge Therapeutikum, vorzugsweise in gereinigter Form zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, so dass die Form für eine richtige Verabreichung an den Patienten bereitgestellt wird. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsweg geeignet sein.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung gemäß Routine-Verfahren als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die für eine inravenöse Verabreichung an Menschen angepasst ist. Die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung sind gewöhnlich Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Die Zusammensetzung kann nötigenfalls auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum enthalten, wie Lignocain, damit der Schmerz an der Injektionsstelle gelindert wird. Die Inhaltsstoffe werden gewöhnlich entweder getrennt oder zusammen gemischt in Einheitsdosierungsform zugeführt, bspw. als trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Sachet, die die Menge Wirkstoff anzeigen. Soll die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden, kann diese mit einer Infusionsflasche verteilt werden, die steriles Wasser oder sterile Salzlösung mit pharmazeutischer Qualität enthält. Wird die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden.

Die Menge des erfindungsgemäßen Therapeutikums, die sich für die Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustands eignet, hängt von der Beschaffenheit der Störung oder des Zustands ab, und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. In-vitro-Assays, wie solche, die in Abschnitt 5.2. erörtert werden, können gegebenenfalls eingesetzt werden, damit optimale Dosierungsbereiche gefunden werden können. Die genaue Dosis, die in der Formulierung eingesetzt werden soll, hängt auch von dem Verabreichungsweg und der Schwere der Erkrankung oder Störung ab, und sollte je nach der Beurteilung des praktizierenden Arztes und den jeweiligen Umständen des Patienten entschieden werden. Geeignete Dosierungsbereiche für die intravenöse Verabreichung liegen jedoch gewöhnlich bei etwa 20–500 μg Wirkstoff pro kg Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche für die intranasale Verabreichung liegen gewöhnlich bei etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht zu 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosisreaktionskurven extrapoliert werden, die von Modelltest-Bioassays oder -Systemen in vitro oder im Tier hergeleitet sind.

Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Packung oder ein Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, die mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gefüllt sind. Einem oder mehreren solcher Behälter kann gegebenenfalls ein Beipackzettel beiliegen, und zwar in der Form wie er von der Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf pharmazeutischer oder biologischer Produkte reguliert, wobei der Beipackzettel die Genehmigung durch die Herstellungsbehörde zur Herstellung, Verwendung oder den Verkauf zur Verabreichung an den Menschen widerspiegelt.

Modifikationen und Abwandlungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung werden dem Fachmann aus der voranstehenden eingehenden Beschreibung ersichtlich. Diese Modifikationen und Abwandlungen sollen im Rahmen der beiliegenden Patentansprüche liegen.

Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele zeigen die Entdeckung der Hemmung durch die Troponin-Untereinheit der durch einen angiogenen Stimulus induzierten Endothelzellproliferation und Maßnahmen zur Bestimmung der effizienten Dosierung der Troponinunereinheit, Fragment oder Analogon zu Hemmung der Angiogenese, sowie zu Identifizierung von Fragmenten und Analoga der Troponin-Untereinheit (d.h. solchen Fragmenten oder Analoga der Troponin-Untereinheit, die die Angiogenese hemmen können). Die in den Beispielen verwendete Troponin-Untereinheit ist wie unten beschrieben gereinigt.

Beispiel 1: Aufreinigung der Komponenten der Troponin-Unfereinheit
Herz-Troponin-Isolation aus Gewebe
Die Verfahren von Ebashi et al., 1968, J. Biochem. 64: 465–477; Yasui et al., 1968, J. Biol., Chem. 243: 735–742; Hartshorne et al., 1969, Biochim. Biophys. Acta, 175: 30; Schaub et al., 1969, Biochem. J. 115: 993–1004; Greaser et al., 1971, J. Biol. Chem. 246: 4226–4233 und Greaser et al., 1973, J. Biol. Chem. 248: 2125–2133 zum Reinigen von Troponin kann verwendet werden. Rücken- und Beinmuskeln von Kaninchen werden entnommen, von Fett und Bindegewebe gereinigt und gemahlen. Der gemahlene Muskel (1 kg) wird 5 min in 2 l einer Lösung mit 20 mM KCl, 1 mM KHCO₃, 0,1 mM CaCl₂, und 0,1 mM DTT gerührt. Die Suspension wird durch Gaze filtriert, und das Waschen des Rückstands wird viermal wiederholt. Zwei Liter 95% Ethanol werden dann zu dem gewaschenen Rückstand gegeben, und die Lösung nach 10 min filtriert. Die Ethanolextraktion wird zweimal wiederholt. Der Rückstand wird dann dreimal mit 2 Litern Diethylether 10 min gewaschen. Schließlich wird der Rückstand 2 bis 3 Std. bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Das getrocknete Pulver (aus 1 kg Muskel) wird über Nacht bei 22° mit 2 Liter einer Lösung mit 1 M KCl, 25 mM Tris (pH-Wert 8,0), 0,1 mM CaCl₂ und 1 mM DTT extrahiert. Nach der Filtration durch Gaze wird der Rückstand nochmals mit 1 Liter 1 M KCl extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und auf 4°C gekühlt. Festes Ammoniumsulfat wird zugegeben, so dass etwa 40% Sättigung (230 g pro Liter) erzeugt wird. Nach 30 min wird die Lösung zentrifugiert und 125 g Ammoniumsulfat wird dann pro Liter Überstand dazu gegeben (60%ige Sättigung). Nach der Zentrifugation wird der Niederschlag in 500 ml einer Lösung, die 5 mM Tris (pH-Wert 7,5), 0,1 mM CaCl₂, und 0,1 mM DTT enthielt, gelöst, und gegen 15 Liter der gleichen Lösung 6 Std. und gegen eine frische Lösung über Nacht dialysiert.
Festes KCl wird zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben, und 1 M KCl-Lösung wird dazugegeben, so dass das Volumen auf 1 Liter gebracht wurde. Der pH-Wert wird dann durch Zugabe von HCl auf 4,6 eingestellt, und der Tropomyosin-Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt. Der pH-Wert des Überstandes wird mit KOH auf 7,0 eingestellt, und 450 g Ammoniumsulfat wurden pro Liter (70% Sättigung) dazu gegeben. Der Niederschlag wird in einer Lösung mit 5 mM Tris (pH-Wert 7,5, 0,1 mM CaCl₂ und 0,1 mM DTT gelöst, und über Nacht gegen die gleiche Lösung dialysiert. Festes KCl wird dazu gegeben, um seine Konzentration auf 1 M zu bringen, der pH-Wert auf 4,6 eingestellt, und der entstandene Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Der neutralisierte Überstand wird gegen 2 mM Tris (pH-Wert 7,5) dialysiert, bis die Nessler-Reaktion negativ ist. Die Endausbeute von Troponin beträgt gewöhnlich 2,5 bis 3,0 g pro kg frischem Muskel.
Herz-Troponin-Isolation aus Gewebe
Rinderherzen werden etwa 30 min nach dem Tod entnommen, sofort aufgeschnitten, und nach Abspülen des Blutes in Eis getaucht. Der linke Ventrikel wird entnommen, und nach Entfernen von überschüssigem Fett und Bindegewebe gemahlen. Sämtliche nachfolgenden Extraktions- und Präparationsschritte werden wenn nicht anders angegeben bei 0 bis 3° durchgeführt. Der gemahlene Muskel (500 g) wird in einem Waning-Blender 1 min in 2,5 Liter einer Lösung mit 0,09 M KH₂PO₄, 0,06 M K₂HPO₄, 0,3 M KCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, pH-Wert 6,8 homogenisiert. Die homogenisierte Muskelsuspension wird dann 30 min gerührt, und bei 1000 × g 20 min zentrifugiert. Der Niederschlag wird 30 min reextrahiert und zentrifugiert. Der Rückstand wird dann mit 2,5 Litern 5 mM 2-Mercaptoethanolgewaschen und 10 min bei 1000 × g zentrifugiert, gefolgt von 2 aufeinanderfolgenden Wäschen und Zentrifugationen mit 1,5 Litern 50 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1) 5 mM 2-Mercaptoethanol. Der Rückstand wird dann gewaschen und zweimal mit 1,5 Litern 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1) und 5 mM 2-Mercaptoethanol zentrifugiert. Der Volumen des Rückstands wird gemessen, und der Rückstand wird mit 0,5 Volumen 3 M KCl, 50 mM Tris-HCl (ph 8,1) und 5 mM 2-Mercaptoethanol gemischt. Nach einer 16- bis 20 Std. Extraktion bei 0° wird die Suspension bei 15000 × g 10 min zentrifugiert. Das Sediment wird verworfen, und der Überstand wird mit 0,05 N HCl auf pH-Wert 7,6 eingestellt. Der faserförmige Niederschlag, der sich bei der pH-Wert-Einstellung bildet, wird durch Filtration des Extraktes durch Nylon-Gaze entfernt. Das Protein, das zwischen 30 und 50% Ammoniumsulfat-Sättigung ausfällt, wird gesammelt, in einer Lösung mit 1 M KCl und 1 mM Kaliumphosphat (pH-Wert 6,8) und 5 mM 2-Mercaptoethanol gelöst und gegen die gleiche Lösung 4 Std. und gegen eine frische Lösung über Nacht dialysiert. Die Proteinlösung wird durch Zentrifugation bei 105000 × g 30 min geklärt. Das Troponin wird dann durch Chromatographie auf einer Hydroxyapatit-Säule gereinigt, wobei das Protein zwischen 0,08 und 0,10 M Phosphat eluiert wird. Greaser et al., 1972 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:235–244. Kaninchen-Herz-Troponin wird auf ähnliche Weise mit einem vereinigten Ansatz von Herzen hergestellt, der vor der Extraktion bei –20°C aufbewahrt wurde.
Die Troponin-Untereinheiten werden durch DEAE-Sephadex-Chromatographie in 6 M Harnstoff getrennt. Rinder-Herz-Tropomyosin wird hergestellt aus dem 50% Ammoniumsulfat-Sättigungs-Überstand aus dem Troponinextraktionsschema (siehe oben). Ammoniumsulfat wird zur 65% Sättigung zugegeben, und der Niederschlag wird in 1 M KCl, 1 mM Kaliumphosphat (pH-Wert 7,0) und 5 mM 2-Mercaptoethanol gelöst und dagegen dialysiert. Das Protein wird dann durch Hydroxylapatit-Chromatographie gereinigt.
Proteinbestimmung – Die Proteinkonzentrationen werden durch das Biuret-Verfahren von Gornall et al. mittels Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Gornall et al., 1949, J. Biol. Chem. 177: 751–766.
Trennung der Komponenten – Eine Folge von SP-Sephadex und DEAE-Sephadex-Chromatographie ergibt eine vollständige Trennung der drei Herz-Troponinkomponenten.
Rekombinante Troponin-Isolations- und Rekonstitutionsprotokolle für Troponin I und T
DNA, die verschiedene Troponin-Untereinheiten und Isoformen codiert, gibt es im Stand der Technik. Siehe bspw. Wu et al., 1994, DNA Cell. Biol. 13: 217–233; Schreier et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 21247–21253; und Gahlmann et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 12520–12528.
Zur Expression der Troponin-Untereinheit wird DNA, die die Untereinheit codiert, in ein Expressionsplasmid mit hoher Kopienzahl, wie KP3998, mittels Rekombinationstechniken des Standes der Technik subkloniert.
Zur Expression der klonierten cDNA wird E.coli, das mit dem Insert enthaltenden pKP1500-Vektor transformiert wurde, über Nacht bei 37°C gezüchtet, dann in 4 Liter Luria-Bertani-Brühe (LB)-Medium überimpft, und dann bis zur mittleren Log-Phase bei 42°C gezüchtet. Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wird dann zu 0,5 mM zugegeben, und die Kultur über Nacht bei 42°C wachsen gelassen. Die Reinigung der exprimierten Troponin-Untereinheit, des Fragmentes oder des Analogons kann entsprechend den veröffentlichten Verfahren angepasst werden (Reinach et al., 1988, J. Biol. Chem. 250: 4628–4633 und Xu et al. 1988, J. Biol. Chem. 263: 13962-13969). Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 20 ml 20 mM Tris, 20% Saccharose, 1 mM EDTA, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mg/ml Lysozym, pH-Wert 7,5, suspendiert. Nach der Inkubation auf Eis für 30 min werden 80 ml 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,5 mM DTT zugegeben, und die Zellen in einer French Press (SLM Instruments) aufgebrochen. Die Zelltrümmer werden pelletiert; der Überstand wird mit gesättigtem (NH₄ ₂SO₄ auf 35% eingestellt und 30 min auf Eis gerührt. Nach der Sedimentation wird der Überstand auf 50 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT eingestellt und dann auf eine 1,5 × 25 cm Phenyl-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)-Säule geladen. Die Säule wird zuerst mit 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, pH-Wert 7,5, dann mit 50 mM Tris, 1 mM NaCl, 0,1 mM CaCl₂, 1 mM DTT, pH-Wert 7,5 gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert. Die rohe Troponin-Untereinheit wird dann mit 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH-Wert 7,5 eluiert. Fraktionen, die Troponin-Untereinheit, Fragment, oder Analoga enthalten, werden vereinigt, gegen 25 mM Tris, 6 M Harnstoff (United Staters Biochemical Corp.), 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, pH-Wert 8,0, dialysiert und auf eine 1,5 × 25 cm-DE52 (Whatman)-Säule geladen. Die Säule wird mit einem linearen 0–0,6 M NaCl-Gradient eluiert. Die Troponin-Untereinheit, Fragment oder das Analogon, das von der Säule eluiert, wird gegen 0,1 mM NH₄HCO₄, 1 mM β-Mercaptoethanol dialysiert, lyophilisiert und aufbewahrt. Die Reinheit wird mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und UV-Spektralphotometrie bestimmt. Typische Ausbeuten von 6 mg gereinigter rekombinanter Troponin-Untereinheit, Fragment oder Analogon/Liter Bakterienkultur werden erwartet.
Das lyophilisierte rekombinante Protein wird in einem Aufnahmepuffer resuspendiert, der aus 6 M Harnstoff, 20 mM Hepes (pH-Wert 7,5), 0,5 M NaCl, 2 mM EDTA und 5 mM DTT besteht. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Std. geschwenkt. Die Lösung wird dann 6 Std. mit 1 Austausch gegen einen Dialysepuffer, bestehend aus 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes (pH-Wert 7,5) und 0,5 mM DTT, dialysiert.
Die Proteinkonzentration wird für jede Untereinheit bei 280 λ bestimmt. Der Extensionskoeffizient von Troponin I ist 0,40 und von Troponin T 0,50.
Troponin C
Das lyophilisierte rekombinante Protein wird in einem Aufnahmepuffer, bestehend aus 0,1 M NaCl, 20 mM Hepes (pH-Wert 7,5), 2 mM EDTA, und 5 mM DTT, resuspendiert. Diese Lösung wird 6 Std. bei 4°C mit einem Austausch gegen einen Dialysepuffer aus 0,1 M NaCl, 20 mM Hepes (pH-Wert 7,5) und 0,5 mM DTT dialysiert.
Die Proteinkonzentration wird bestimmt durch Messen der Extinktion bei 280 λ. Der Extensionskoeffizient für Troponin C ist 0,18.
Rekonstitution der vereinigten Untereinheiten:
Proteinkonzentrationen mit den gleichen Rekonstitutions-Molverhältnissen der Troponin-Untereinheiten C, I und T werden für sämtliche unterschiedlichen Kombinationen aufrecht gehalten. Diese Konzentrationen der jeweiligen Proteine werden in einem Rekonstitutionspuffer mit 0,1 M NaCl, 0,1 M CaCl₂, 5 mM DTT, 5 mM Hepes (pH-Wert 7,5) vereinigt. Die Dialyse erfolgt für 20 bis 24 Std. bei 4°C mit drei Austau schen gegen einen Dialysepuffer, bestehend aus 0,1 M NaCl, 0,1 mM CaCl₂, 0,5 mM DTT und 5 mM Hepes (pH-Wert 7,5).
Die Proteinkonzentration wird durch Messen der Absorption bei 278 λ angenähert. Das Troponin-Trimer hat einen Extensionskoeffizient von 0,45 bei 278 λ.
Beispiel 2: Hemmung der Endothelzell-Proliferation, gemessen durch DNA-Synthese
Die inhibitorische Wirkung der Troponin-Untereinheit, des Fragmentes oder des Analogons auf die Proliferation der bFGF-stimulierten EC kann gemäß dem folgenden Verfahren Verfahren gemessen werden.
Endothelzell-DNA-Synthese:
An Tag 1 werden 5000 Rinder-Kapillar-Endothelzellen in DMEM/10% CS/1 % GPS auf jede Vertiefung einer vorgelatinierten Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen plattiert. An Tag 2 wird das Medium zu DMEM, 2% CS, 1% GPS, 0,5% BSA (Komplett-Medium), das mit 10 μl 1 mg/ml "Kaltem" Thymidin pro 50 ml Medium supplementiert ist, gewechselt. An Tag 3 werden die Testproben in Komplett-Medium im Doppelansatz dazu gegeben. Zusätzlich wird bFGF in jede Vertiefung zugegeben, außer für die geeigneten Kontrollen in einer Endkonzentration von 0,2 ng/Vertiefung. An Tag 4 werden 5 μl 1:13 verdünnte ³H-Thymidin-Stammlösung in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wird 5 bis 6 Std. inkubiert. Nach der Inkubation wird das Medium abgesaugt, und der Rückstand wird einmal mit PBS gespült, dann zweimal für 5 min jeweils mit Methanol, gefolgt von zweimaligem Spülen mit 5% TCA für 10 min. Die Zell-Inhalte der Vertiefungen werden dann dreimal mit Wasser gespült, bis zur Platte getrocknet, und 100 μl 0,3 N NaOH werden in jede Vertiefung gegeben. Der Inhalt der Vertiefung wird dann in Szintillations-Zählgefäße überführt, und 3 ml Ecolume in jedes Gefäß gegeben. Die Proben werden dann im Szintillationszähler gezählt.
3T3-Zell-DNA-Synthese
Die DNA-Snythese in bFGF-stimulierten 3T3-Zellen schafft eine Kontrolle, mit der man die Ergebnisse bewertet, die man für bFGF-stimulierte Endothelzellproliferation erwartet. DNA-Synthese in den 3T3-Zellen können gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt werden.
BALB/c-3T3-Zellen werden bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/ml trypsinisiert und resuspendiert. Aliquote von 200 μl werden in 0,3 cm²-Mikrotiter-Vertiefungen (Microtest II-GewebeKulturplatten, Falcon) plattiert. Nach dem Erreichen von Konfluenz in einem Zeitraum von 2 bis 3 Tagen werden die Zellen mindestens 5 Tage weiter inkubiert, damit die Medien in Bezug auf wachstumsfördernde Faktoren abgereichert wird. Diese Wachstumsbedingungen ergeben konfluente Monoschichten nicht-teilender Balb/c-3T3-Zellen. Testproben werden in 50 μl 0,15 M NaCl gelöst und in Mikrotiter-Vertiefungen zusammen mit [³H]TdR gegeben. Nach einer Inkubation von mindestens 24 Std. wird das Medium entfernt und die Zellen werden in PBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen und die Entfernung von nicht-eingebautem [³H]-TdR erfolgt durch die folgenden nacheinander erfolgenden Schritte; zweimalige Zugabe von Methanol für Zeiträume von 5 min, 4 Wäschen mit H₂O, Zugabe von kaltem 5% TCA zweimal für Zeiträume von 10 min, und 4 Wäschen mit H₂O. Die DNA-Synthese wird entweder durch Flüssigkeitsszintillationszählung oder durch Autoradiographie mit einer Modifikation des Verfahrens, beschrieben von Haudenschild et al., 1976, M. Exp. Cell Res. 98: 175 gemessen. Für das Szintillationszählen werden die Zellen in 150 μl 0,3 N NaOH lysiert und in 5 ml Insta-Gel-Flüssigkeitsszintillations-Cocktail (Packard) mit einem Packard-Tri-Carb-Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Alternativ kann man Autoradiographie zur Quantifizierung der DNA-Syntehse verwenden, indem die Böden der Mikrotiter-Vertiefungen ausgestanzt werden und diese mit Silikonkautschukkleber auf Objektträgern aus Glas befestigt werden. Die Objektträger werden in eine 1 g/ml Lösung aus NTB2-Kern-Aufspürungs-Emulsion (Kodak) getaucht und 3 bis 4 Tage exponiert. Die Emulsion wird mit Microdol-X-Lösung (Kodak) 10 min entwickelt, mit destilliertem H₂O gespült, und mit Rapid Fixer (Kodak) 3 min fixiert. Die Autoradiogramme werden mit einer modifizierten Giemsa-Färbung gefärbt. Mindestens 1000 Kerne werden in jeder Vertiefung gezählt, und die DNA-Synthese als Prozentsatz der markierten Kerne ausgedrückt. Die Zellteilung wird gemessen durch Zählen der Anzahl von Zellen in Mikrotiter-Vertiefungen mit der Hilfe eines Gitters nach 40 bis 48 Std. Inkubationen mit Testproben.
Beispiel 3: Hemmung der Endothelzell-Proliferation, gemessen durch kolorimetrische Bestimmung der Aktivität der zellulären sauren Phosphatase und elektronisches Zellzählen.
Eine rasche und empfindliche Durchmusterung auf die Hemmung der EC-Proliferation in Reaktion auf die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Troponin-Untereinheit, Analogon oder Derivat beinhaltet das Inkubieren der Zellen in Gegenwart verschiedener Konnzentrationen Inhibitor und Bestimmen der Zahl von Endothelzellen in Kultur auf der Basis der kolorimetrischen Bestimmung der Aktivität der zellulären sauren Phosphatase, beschrieben von Connolly et al., 1986, J. Anal. Biochem. 152: 136–140.
Die Erfinder maßen die Wirkung von Troponin auf die Proliferation der Kapillarendothelzellen (EC) in einem Test, der die Fähigkeit dieses Proteins zur Störung der Stimulation der Endothelzellproliferation durch einen bekannten Angiogenesefaktor (bFGF) misst.
Kapillarendothelzellen und Balb/c-3T3-Zellen wurden gesondert auf gelatinebeschichtete Gewebekulturplatten an Tag 1 plattiert (2 × 10³/0,2 ml). An Tag 2 wurden die Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (Gibco) mit 5% Kalbsserum (Hyclone) (DMEM/5) und bFGF (10 ng/ml) (FGF Co.) und steigenden Konzentrationen der Troponin-Untereinheit resuspendiert. Diese Substanzen wurden gleichzeitig in Volumen zugegeben, die 10% des Endvolumens nicht überschreiten. Vertiefungen, die phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (Gibco) und PBS + bFGF allein enthielten wurden als Kontrollen verwendet. An Tag 5 wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in 100 μl Puffer mit 0,1 M Natriumacetat (pH-Wert 5,5), 0,1% Triton X–100^TM und 100 mM p-Nitrophenylphosphat (Sigma 104 Phosphatase-Substrat) lysiert. Nach der Inkubation für 2 Std. bei 37°C wurde die Reaktion mit der Zugabe von 10 μl 1 N NaOH gestoppt. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm mit einem schnellen Mikroplattenlesegerät (Bio-Tek) bestimmt.
Die prozentuale Hemmung wurde bestimmt durch Vergleichen der Zellzahl der Vertiefungen, die einem Stimulus ausgesetzt waren, mit denen, die einem Stimulus und Troponin-Einheiten ausgesetzt waren.
Alle 3 Troponin-Untereinheiten hemmten die bFGF-stimulierte EC-Proliferation, wie es durch den kolorimetrischen Test bestimmt wurde.
Troponin C hemmte die bFGF-stimulierte Endothelzellproliferation in einer dosisabhängigen Weise in sämtlichen untersuchten Konzentrationen (1). Die prozentuale Hemmung der Rinder-Endothelzellproliferation ("BCE") war 54%, 86%, 83% und 100% bei Konzentrationen von 280 nm, 1,4 μM, 2,8 μM bzw. 5,6 μM. Eine Hemmung von 100% wurde bei einer Konzentration von 20 μg/Vertiefung (5,6 μM) beobachtet. Die IC₅₀ stellt die Konzentration dar, bei der eine 50%ige Hemmung der bFGF-Wachstumsfaktor-induzierten Stimulation beobachtet wurde. Die IC₅₀ von Troponin C betrug der Bestimmung zufolge 278 nM.
Troponin I hemmte die bFGF-stimulierte BCE-Proliferation bei Konzentrationen von 1 und 5 μg/Vertiefung, jedoch wurde keine Hemmung in der Probe beobachtet, die bei 10 μg/Vertiefung untersucht wurde (2). Die prozentuale Hemmung von BCE betrug 33% und 46% bei Konnzentrationen von 240 nM bzw. 1,3 μM. Die IC₅₀ von Troponin I betrug Bestimmungen zufolge 1,14 μM.
Troponin T hemmte die bFGF-stimulierte EC-Proliferation bei Konzentrationen von 10 und 20 μg/Vertiefung, jedoch nicht bei Konzentrationen von 1 und 5 μg/Vertiefung (3). Die BCE-Proliferation wurde 23% und 62% bei 1,6 μM bzw. 3,3 μM gehemmt. Die IC₅₀ von Troponin betrug Bestimmungen zufolge 2,14 μM.
Die Kombination aus den Troponin-Untereinheiten C und I hemmte EC bei sämtlichen untersuchten Konzentrationen (4). Die prozentuale Hemmung der Proliferation von BCE betrug 52%, 54%, 73% und 47% bei 130 nM, 645 nM, 1,3 μM bzw. 2,6 μM. Die IC₅₀ dieser Kombination betrug Bestimmungen zufolge 110 nM.
Die Kombination der Troponin-Untereinheiten C, I und T hemmte Beobachtungen zufolge die bFGF-stimulierte BCE-Proliferation um 16% bei einer Konzentation von 360 nM (5 μg/Vertiefung, 5).
Die untersuchten Troponinproben hatten keine nachweisbare Hemmwirkung auf das Wachstum von Balb/c-3T3-Zellen, einem Nichtendothelzelltyp.
Beispiel 4: Hemmung der Kapillar-Endothelzellwanderung durch Troponin
Die Bestimmung der Fähigkeit der Troponin-Untereinheit, des Derivates oder Analogons zur Hemmung des angiogenen Prozesse der kapillaren EC-Wanderung in Reaktion auf einen angiogenen Stimulus kann mit einer Modifikation der Boyden-Kammer-Technik bestimmt werden, die zu Untersuchung der Wirkung der Troponin-Untereinheit, des Derivates oder des Analogons auf die Kapillar-EC-Wanderung verwendet wird. Falk et al., 1980, J. Immunol. 118: 239–247 (1980). Eine Blindvertiefungs-Boyden-Kammer besteht aus zwei Vertiefungen (einer oberen und einer unteren), die durch eine poröse Membran getrennt sind. J. Exp. Med. 115: 453–456 (1962). Eine bekannte Konzentration an Wachstumsfaktor wird in den unteren Vertiefungen untergebracht, und eine vorbestimmte Anzahl von Zellen und Troponin-Untereinheit, Derivat oder Analogon wird in den oberen Vertiefungen untergebracht. Zellen binden an der oberen Oberfläche der Membran, wandern durch die untere Membranoberfläche und haften an ihr. Die Membran kann dann fixiert werden und zum Zählen gefärbt werden, wobei das Verfahren von Glaser et al., 1980 Nature 288: 483–484 verwendet wird.
Die Wanderung wird mit Blind-Vertiefungs-Kammern (Neuroprobe, Nr. 025-187) und Polycarbonat-Membranen mit 8 Mikron Poren (Nucleopore), die mit Fibronectin (6,67 μg/ml in PBS) (Mensch, Cooper) vorbeschichtet waren, gemessen. Basisches FGF (Takeda Co.), verdünnt in DMEM mit 1 % Kälberserum (DMEM/1 ), wird zu der unteren Vertiefung bei einer Konzentration von 10 ng/ml gegeben. Die oberen Vertiefungen erhalten 5 × 10⁵ Kapillar-EC/ml, und steigende Konzentrationen an ge reinigter Troponin-Untereinheit, Derivat oder Analogon wird innerhalb von 24 Std. Reinigung verwendet. Kontrollvertiefungen erhalten DMEM/1, entweder mit oder ohne bFGF. Die Migrationskammern werden 4 Std. bei 37°C in 10% CO₂ inkubiert. Die Zellen auf der oberen Oberfläche der Membran werden dann durch Ziehen der Membran über eine Wischerklinge (Neuroprobe) abgewischt. Die Zellen, die durch die Membran auf die untere Oberfläche gewandert waren, werden in 2% Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von Methanol (4°C), und mit Hämatoxilin gefärbt. Die Wanderung wird durch Zählen der Anzahl der Zellen auf der unteren Oberfläche in 16 Ölimmersionsfeldern und Vergleichen dieser Zahl mit der für die Kontrolle quantifiziert.
Beispiel 5: Hemmung des Tumorwachstums, bestimmt durch ein SCID-Maus-Modellsystem.
Die Wirkungen von rekombinantem Troponin I auf das Wachstum von menschlichen PC-3-Prostatakarzinomzellen wurden in immundefizienten (SCID)-Mäusen in einer Behandlungs- und Kontrollgruppe von jeweils 4 Mäusen bestimmt. Eine dorsale subkutane Implantation von 10⁶ PC-3-Zellen wurde gemacht und beobachtet, bis ein Volumen von 100 bis 400 mm³ erzielt wurde. Nachdem der Tumor ein Schwellenvolumen erreicht hatte, wurden zweimal täglich subkutane Injektionen von 50 mg/kg rekombinantem Troponin I in der Behandlungsgruppe begonnen.
6 zeigt, dass 28 Tage Behandlung zu einer etwa 50%igen Reduktion des Tumorvolumens in der Behandlungsgruppe verglichen mit dem Tumorvolumen der Kontrollgruppe führten.
Beispiel 6: In vivo-Hemmung der Neovaskularisation durch Troponin, bestimmt durch den Maus-Cornea-Taschentest
Ein Pellet aus Saccharoseoctasulfat, Hydron^TM und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (40 ng/Pellet) wurde in einer Kornea-Mikrotasche einer Maus untergebracht. Die Maus erhielt subkutane Injektionen von rekombinantem Troponin I, 50 mg/kg alle 12 Std., beginnend 48 Std. vor der Implantation
Die Kornea-Angiogenese wurde durch Schlitzlampen-Mikroskopie bestimmt. Bis Tag 6 führt die Angiogenese in Kontrollaugen zu Gefäßen, die am Tag 6 in das Pellet reichten. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine 50%ige Reduktion der Blutgefäßdichte und eine 30%ige Hemmung der Blutgefäßlänge in den behandelten Tieren beobachtet.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Menge mindestens eines Peptids und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Analogon oder ein Fragment einer Troponin-Untereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Untereinheiten C, I und T, ist und die Angiogenese wirksam inhibieren kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zusätzlich eine wirksame Menge eines von dem Analogon oder dem Fragment der Troponin-Untereinheit verschiedenen Moleküls, welches die Angiogenese negativ reguliert, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid a. ein Inhibitor der bFGF-stimulierten Rinderendothelzellproliferation mit einer IC₅₀ von kleiner oder gleich 10 μM ist; b. eine Länge zwischen 10 und 120 Aminosäuren aufweist; und ' c. eine Homologie von mehr als 80% zu einem entsprechenden Fragment einer Untereinheit, ausgewählt aus der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit C (Seq.-ID.-Nr. 1), der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit I (Seq.-ID.-Nr. 2) und der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit T (Seq.-ID.-Nr. 3) aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Analogon oder ein Fragment einer Troponin-Untereinheit aus einem Säuger ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Troponin-Untereinheiten aus Mensch, Rind, Kaninchen, Maus und Ratte.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Homologie von mehr als 80% zu einem entsprechenden Fragment der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit C oder der humanen fast-twitch-Troponin-Untereinheit I aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Homologie von mehr als 95% zu einer humanen Troponin-Untereinheit aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass, die humane Troponin-Untereinheit die humane fast-twitch Troponin-Untereinheit C oder die humane fast-twitch Troponin-Untereinheit I ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment aus mindestens 10 Aminosäuren ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment von mindestens 50 Aminosäuren ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment von mindestens 75 Aminosäuren ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger für topisches Aufbringen auf das Auge oder die Haut akzeptabel ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Angiogenese-Inhibitor in einer biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymer-Abgabevorrichtung ist.
Peptid zur Verwendung als Arzneimittel zur Inhibierung der Angiogenese, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Analogon oder Fragment einer Troponin-Untereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Untereinheiten C, I und T, ist, und es zur Inhibition der Angiogenese wirksam ist.
Peptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid a. ein Inhibitor der bFGF-stimulierten Rinderendothelzellproliferation mit einer IC₅₀ von kleiner oder gleich 10 μM ist; b. eine Länge zwischen 10 und 120 Aminosäuren aufweist; und c. eine Homologie von mehr als 80% zu einem entsprechenden Fragment einer Untereinheit, ausgewählt aus der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit C (Seq.-ID.-Nr. 1), der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit I (Seq.-ID.-Nr. 2) und der humanen fast-twitch Troponin-Untereinheit T (Seq.-ID.-Nr. 3) aufweist.
Peptid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment von mindestens 10 Aminosäuren ist.
Peptid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment von mindestens 50 Aminosäuren ist.
Peptid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Fragment von mindestens 75 Aminosäuren ist.