KR20010015818A - 합성된 가변성 부분 및 변형 특이성을 가지는면역글로불린 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형된 면역글로불린 분자, 특히 항체를 제공하는데, 상기 항체는 하나의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하고, 여기서 면역글로불린은 변이영역을 갖고, 변이영역은 하나 또는 복수의 상보적 결정영역을 보유하고, 상기 결정영역은 결합쌍의 상기 멤버에 대한 결합위치의 아미노산서열을 갖고, 상기 위치는 다른 결합쌍 멤버로부터 유도하고, 자연상태에서 상보성 결정영역에서는 발견되지 않는다. 본 발명은 변형면역글로불린의 치료 및 예방적 용도를 추가로 제공한다.

Description

합성된 가변성 부분 및 변형 특이성을 가지는 면역글로불린 분자{IMMUNOGLOBULIN MOLECULES HAVING A SYNTHETIC VARIABLE REGION AND MODIFIED SPECIFICITY}

2. 발명의 배경

2.1. 항체 및 면역계

항체는 면역글로불린 수퍼페밀리에 속하는 단백질이다. 면역글로불린 수퍼페밀리에는 T세포 수용체, B 세포 수용체, 공-수용체 CD4,CD8,CD19와 같은 세포-표면 흡착 분자, MHC분자의 비변성 도메인이 포함된다. 이들의 가용성 형에서, 항체는 소위 혈장 세포라고 불리는 성숙한 B세포에 의해 생성되는 당단백질이 항체인 것이다. 항체는 혈액 및 다른 세포외 유체로 분비되어, 모든 동물 및 사람에서 온몸으로 순환하면서 외부 항원에 대해 반응한다.

항체는 두가지 기본적인 기능을 가진다. 첫째는 외부 항원을 인지하거나 이에 결합하는 것이다. 둘째는 면역계의 다른 원소를 움직이게 하여, 외부 물질을 파괴시키는 것이다. 면역 효과물질 세포의 표면에 있는 수용체는 다른 세포에 있는 항원 및 세포 표면 표식을 인지하도록 고안되어 있다. 이와 같은 인지 과정은 어느 표식이 자기것이고 어느 표식이 자기것이 아닌지에 대한 정보를 부여하는 것으로, 이는 존재하는 항원에 대해 면역 반응을 조절하는데 관련된 중요한 요소이다.

항체가 결합하는 항원 부분이 항원 결정부위 또는 에피토프라는 것이다. 일부 항원은 면역 반응을 유도할 수 있는 반면에, 다른 항원은 면역계에서의해 자체적으로 인지된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 이뮤노겐이라 하고, 이는 분자량이 적어도 5000 Dalton인 커대 분자 가령, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질과 같은 것이 된다. 더 작은 비-면역원성 분자(이는 헵텐으로 불리는데)는 큰 담체 분자에 결합되었을 때, 면역 반응을 촉진시킬 수 있다.

2.2. 항체의 구조

항체의 기본적인 완전한 단위는 4개의 사슬로 된 Y자모양의 구조를 하는 것이다(도 1). 1970년대 초기에, Wu and Kabat는 상당량의 항체의 아미노산 서열을 모아서, 항체 구조를 설명하였는데, 사실, 모든 면역글로불린 수퍼페밀리는 항상 부분 및 4개의 상대적으로 보존된 반-경직성 베타-쉬트의 골격구조 부분 및 상조성 결정 부분(CDRs)로 알려진 상대적으로 짧은 세 개의 초가변성 서열 부분을 가진다는 것이다(Wu and Kabat, 1970. J. Exp. Med. 132(2):211-250; Wu and Kabat, 1971, Proc. Natl. Acad. Sci. US4 68(7):1501-1506). 이와 같은 예측은 항체 구조를 결정구조 연구를 통하여 확인하였다(Poljak et al., 1973, Proc Natl Acad Sci USA 70(12):3305-3310; Diesenhofer et al., 1976, Hoppe Seylers Z Physiol Chem (Germany, West)357(10):435-445: Diesenhofer et al., 1976, Hoppe Seylers Z Physiol Chem(Germany, West) 357(10):1421-1434).

도 1은 항체의 전반적인 구조를 나타낸 것이다. 항체는 두 개의 짧은 L쇄가 이황화결합에 의해 두 개의 더 긴 H쇄에 연결된 구조를 가진다. 도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 이들 H 및 L쇄 항체 단백질은 다중 도메인으로 구성되어 있는데, 이들 각각은 약 길이가 100개의 아미노산 잔기로 구성된다. 항체의 각 L 및 H 쇄는 이들의 아미노산 말단에 가변성 부분을 가지는데(이들 각각을 V_L및 V_H라 함); 항원-결합 특이성을 부여하는 항체의 가변 부분이 된다. H쇄 가변성 도메인 및 L쇄 가변성 도메인은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성하고, 따라서 기본적인 면역글로불린 단위는 두 개 항원-결합 부위를 가진다.

L 및 H쇄의 가변성 부분에 있는 다양성은 세 개의 "초가변(hypervariable)" 부분 또는 CDRs로 제한된다. 각 항체 분자에는 총 6개의 CDRs이 있는데, 이들 각각의 CDR은 약 5개 내지 10개 아미노산을 포함하고, 내생적으로 재조합되는 경우에는 최고 약 20개 아미노산을 가지는데, 이는 특정 항체 류에서는 흔한 것이다. 각 L 및 H쇄의 가변성 부분의 세 개 CDR은 루프를 형성하고, 이들은 서로 응겨, 가변성 부분의 나머지 4개 부분(항체 분자에서 상대적으로 보존된 골격 구조("FRs")라 불리는)과 연결된다. 항체의 다양성은 CDRs의 서열이 변화되어 일반적으로 만들어진다.

각 항체에서 가변 부분은 독특한 것이고 반면에 항상 부분은 매우 보존된 부분이 된다. L쇄는 한 개의 항상 부분 도메인만을 가지는데 비해 H쇄는 다중 도메인 즉, CH1, CH2, CH3...CHx.으로 불리는 도메인으로 구성된다. 항상 부분 도메인에는 상보체 결합, 임파세포, 과립세포, 단세포 계통 세포, 킬러에 의해 발현되는 Fc 수용체에 결합, B세포를 자극하여, 세포, 비반세포, 및 다른 면역 효과물질 세포의 증식을 자극하는 등의 다양한 항체 효과물질의 기능을 부여한다. 다른 효과물질의 기능은 분화, 상보체 세포 용해 시스템의 활성화, 옵소닌화반응, 대식세포의 유인등이 된다. 상이한 이소타입의 항체는 다른 항상 도메인을 가지고 따라서, 효과물질 기능이 다르다. 가장 잘 연구된 이소타입은 IgG 및 IgM이다.

모든 동물 종은 몇 가지 다른 종류의 항체를 발현시킨다. 구조적 차이를 기초로하여, 다섯가지 항체 종류(IgG, IgA, IgM, IgD, IgB) 및 이들 종류내에 다양한 아류가 확인되었는데, 예를 들면, 단일 항체 분자에서 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위에 있는 이황화결합 다리의 구조, 쇄 길이 및 서열의 차이등을 기초로 하여 확인된다. IgG자가 현재까지 진단 및 치료용 제액학적 용도에 가장 일반적으로 이용되는 것이나, 다른 종류의 항체도 특정 용도에 이용될 수 있다.

2.3. 항체 조작

Kohler 및 Milstein(1975, Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 설명된 단클론 항체 기술 개발로 정확하고, 반복적으로 무한정의 항체를 생산할 수 있게 되었다. Kohler 및 Milstein 과정은 면역화된 동물에서 수득한 비장 세포를 불사화된 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마를 얻는 것이다. 필요한 특이성을 가지는 항체를 생산하는 클론을 이들 하이브리도마에서 분리한다. 하이브리도마는 이들의 성질 및 특이성에서 균일한 단클론 항체를 만든다.

현재까지, 진단 및 치료에 유용한 적절한 항체의 확인 및 생산은 우연에 의존하여왔다. 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성은 항원으로 생쥐를 면역화시키거나 항원을 in vitro에서 비장 세포 준비물에 첨가하는 것이다. 비장 세포 집단 및 특이성을 가지는 특정 단클론 항체는 항원에 대한 동물의 면역 반응에 의존하여왔다.

진단 및 치료용에 이용할 수 있는 항체를 만드는 또 다른 방법이 상기에서 언급한 상당한 노동력을 요하는 면역화 과정의 대체방법으로 개발되어왔다. 한 가지 방법은 바이러스 표면에서 단일 가변성 부분을 발현시킬 수 있는 파아지 바이러스에 항체 유전자를 클로닝하는 것이다(Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Marks et al., 1992, J. Mol. Biol. 222:581; Zeedee et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39:3175; Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576). 파아지 라이브러리 기술을 이용하여, 상당량의 고유 유전적 다양성을 발현시키는 많은 라이브러리를 만들 수 있다. 그러나, 이와 같은 라이브러리도 이들이 유도되는 항체 레파토리에 의해 제한을 받는다. 또 다른 방식은 무작위로 돌연변이생성을 시키고, 발현된 가변성 도메인 유전자를 이용하여 큰 라이브러리를 만들 수 있다(Pack(1997, High Quality Antibody Libraries, Abstracts of the Eighth International Conference of Antibody Engineering)). 이들 두 방법은 상당한 다양성을 만드는데에는 성공적이었으나, 정통적인 면역화 방법과 비교하였을 때 유용한 항체를 확인하는데에는 일반적으로 실패하였다. 그 이유는 이들은 CDR 서열을 무작위로 만들기 때문이다. 또한, 생쥐의 면역화반응을 통하여 만들어진 항체는 사람의 치료에 이용하는데에는 한계가 있다. 생쥐 단클론 항체는 이물질이고, 따라서 사람에 대해 면역원성이 되기 때문에, 이들은 사람 항-생쥐 항체(HAMA) 반응을 유도한다(Shawler et al., 1985, J. Immunol. 135:1530; Chatenaud et al., 1986, J. Immunol. 137:830).

2.4. 분자간 상호작용을 조절한 제약.

제약의 효과는 제약이 다른 분자에 대해 한 분자의 결합 예를 들면, 수용체에 대해 리간드의 결합, 세포 수용체에 병인물질의 결합을 강화, 길항, 모방하여, 질병의 예방 또는 경감에 유용한 특정 생리학적 및 약리학적 활성을 얻는 능력으로 알 수 있다. 현재까지, 제약은 뜻하지 않게 발견된 천연 또는 합성 물질에 한정되었고, 자연 발생 리간드에 결합을 모방하는 작은 분자 효과물질이었다. 리간드 또는 이들의 결합 부위의 구조에 관련된 정보를 이용할 수 있다하더라도, 현재 이용할 수 있는 방법으로 효과적인 제약의 개발을 바로 유도할 수는 없다. 리간드-수용체 결합쌍에 대한 결정 구조 데이터에 기초한 작은 분자 유사체를 고안하는 분자 모델링을 이용하는 방법 또는 펩티드 복합 라이브러리 또는 전연 생성물 추출을 이용하여 수용체에 결합을 스크리닝하는 방법이 신뢰성이 있다고 증명된바 없다. 또한, 이와 같은 합성 또는 자연 생성물이 수용체 서브타입에 대한 결합 친화력 및 특이성을 구별하는 능력을 항상 가지지 않아, 약리학적 효과에 대해 불충분한 기준으로 인하여, 원하지 않는 부작용을 초래할 수 있다.

자연 상호작용의 효과를 좀더 직접적으로 만들거나 또는 저해하는 방법이 필요하고, 특정 결합쌍 멤버와 상호작용할 수 있어, 자연 발생되는 리간드의 거동에 좀더 근접한 특이적인 제약 물질을 고안할 필요가 있다.

여기에서 언급하는 문헌을 본 발명의 선행기술로 인정한다고 해석해서는 안된다.

3. 발명의 요약

본 발명은 결합쌍의 한 멤버에 대해 결합쌍의 다른 한 멤버안에 포함된 결합 부위를 면역글로불린 분자의 적어도 한 개 CDR에 이식하여, 결합쌍의 제 2멤버에 대해 면역글로불린에 특이성을 부여할 수 있다는 본 발명자의 관찰을 기초로한 것이다.

본 발명은 특정 특이성을 가지는 면역글로불린, 특히 항체를 고안하는 것을 목표로 하는데, 방법은 특정 항체를 분리하는데 현재 이용되는 예측불가능한 면역화반응 및 스크리닝 과정을 피한다. 특히, 결합쌍의 한 멤버에 면역특이적으로 결합할 수 있는 합성한 변형 항체를 만들어, 변형 항체의 가변성 부분에는 결합쌍의 멤버에 결합 서열을 포함하는 한 개 이상의 CDRs을 가지고, 결합 서열은 결합쌍의 다른 멤버에서 유도한다. 따라서, 이와 같은 방법은 적절한 항체를 확인하는 방법을 극히 단순화시키고, 면역 내성 및 숨은 발현등으로 접근할 수 없었던 많은 항원에 대해 이용할 수 있는 항체를 만들 수 있다.

따라서, 본 발명은 결합쌍의 제 1 멤버에 면역특이적으로 결합할 수 있는 변형 면역글로불린 특히 항체를 제공하는데, 이때 결합쌍은 제1과 제2 멤버로 구성되고, 항체는 결합쌍의 제1멤버에 대한 결합 부위의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 결합 부위는 결합쌍의 제2멤버에서 유도된 것이다. 본 발명의 적절한 측면에서 결합 부위의 아미노산 서열은 CDR내에 자연적으로 발견되는 것이 아니다.

결합상은 서로 특이적으로 상호작용할 수 있는 임의 두 개 분자가 된다. 특정 구체예에서, 결합쌍의 제1멤버는 암 항원(가령, 암 세포의 표면에서 발현되는 분자), 감염성 질환매체의 항원(가령, 감염성 질환 매체의 표면에 있는 분자) 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체가 된다. 이와 같은 암 항원에는 사람 유지방 구 항원(HMFG), 다형성 상피 점소 항원(PEM)의 에피토프 또는 사람 결장 암종-연합된 단백질 항원을 포함한다. 감염성 질환 매체의 항원으로는 Brambell 수용체(FcRB), HSV-2 항원, 고노코커스(gonococcus), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 또는 사람 파필로마바이러스등을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 결합쌍은 수용체-리간드 결합쌍으로 예를 들면 결합쌍의 제1멤버는 브레디키닌 수용체이다.

본 발명은 본 발명의 변형 면역글로불린을 이용하여 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 암 항원의 결합 부위 또는 감염성 물질의 항원 또는 감염성 물질의 세포 수용체에 대한 결합 부위를 가지는 한 개 이상의 CDRs을 포함하는 변형 항체를 이용하여 암 또는 특정 암 항원, 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체를 발현하는 것과 연관된 감염성 질환의 치료 및 예방할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 변형 면역글로불린을 이용하여 질병의 스크리닝 또는 감지 또는 진단하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 암 항원의 결합 부위 또는 감염성 물질의 항원 또는 감염성 물질의 세포 수용체에 대한 결합 부위를 가지는 한 개 이상의 CDRs을 포함하는 변형 항체를 이용하여 암 또는 특정 암 항원, 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체를 발현하는 것과 연관된 감염성 질환을 스트리닝, 감지, 진단할 수 있다.

본 발명은 또한 발명의 변형 면역글로불린을 포함하는 치료 및 진단 키트, 제약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 합성 변형 면역글로불린을 생산하는 방법을 제공한다.

단락 6에서는 브레디키닌 수용체의 결합 서열을 포함하는 브레드키닌의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 가지는 합성된 변형 항체의 합성에 대해 설명한다. 실시예에서는 이와 같은 합성된 변형 항체가 브레디키닌 수용체에 면역특이적으로 결합하여, 브레디키닌 수용체에 결합하는데 있어써, 브레디키닌과 경쟁한다는 것을 설명한다. 합성된 변형 항체의 활성은 브레디키닌 활성의 길항물질로 길항된다.

관련 출원

본 출원은 본 출원은 1997년 11월 14일 출원된 예비 출원 60/065,716 및 1998년 4월 10일 출원된 예비출원 60/081,403의 장점을 청구한다.

1. 발명의 분야

본 발명은 변형 면역글로불린 분자에 관계하는데, 좀더 구체적으로는 결합쌍의 한 멤버에 결합하고, 결합쌍의 멤버에 대해 결합 부위의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 한 개의 상보성 결정 부분(CDR)을 가지는 항체에 관계한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 변형 항체를 이용하여 결합쌍의 멤버의 발현과 관련된 질병의 치료, 진단 및 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 변형 항체를 포함하는 제약학적 조성물 및 진단 키트를 제공한다.

도 1은 면역글로불린 분자의 L 및 H쇄의 구조를 나타내는 도면으로 각 쇄는 아미노 말단 부분(H₂N-)에 있는 가변 부분 및 카르복시 말단 부분(-COOH)에 있는 항상 부분으로 구성된다.

도 2는 IgG의 구조를 나타내는데, 각 L 및 H 쇄의 가변 부분(V_L,V_H)에 4개의 기본 부분(FR1,FR2,FR3, FR4) 및 3개의 상보성 결정 부분(CDR1,CDR2, CDR3)이 있음을 나타낸다. 항상 부분 도메인은 L쇄 항상 부분은 C_L으로 나타내고, H쇄 항상 부분의 세 개 도메인은 CH_1,CH_2,CH₃으로 나타낸다. FAb는 항체 단편의 일부분으로 나타내는데, 여기에는 L 및 H쇄의 가변성 부분 도메인과 C_L및 CH₁도메인을 포함한다. Fc는 CH₂및 CH₃도메인을 포함하는 항상 부분 단편을 나타낸다.

도 3A-C에서 (A)는 발현벡터 pMRRO10.1의 구조를 나타내는데, 사람의 카파 L쇄 항상 부분 서열을 포함한다. (B)는 사람 IgG1 항상 부분(CH1, CH2, CH3) H쇄 및 힌지 부분 서열을 인코드하는 서열을 포함하는 발현벡터 pGamma1의 구조를 나타낸다. (C)는 L쇄의 카파 항상부분과 H쇄의 항상 부분 및 힌지 부분을 인코드하는 서열을 포함하는 발현벡터 pNEPuDGV의 구조를 나타낸다. 이들 모든 벡터에 대한 정보는 Bebbington et al., 1991, Merhods in Enzymology 2:136-145을 참고로 한다.

도 4A-H에서는 합성 항체의 H 및 L 쇄의 가변성 도메인 콘센선스 서열 및 브래디키닌 서열을 포함하는 CDR을 가지는 H 및 L쇄 가변성 도메인의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 가진다. 이들 모든 서열에는 리더 서열을 포함한다. (A)는 콘센선스 L쇄 가변성 부분 ConVL1의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (B)는 CDR1이 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BKCDR1에 대한 아미노산 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (C)는 CDR2가 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BDCDR2의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (D)는 CDR3가 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BKCDR3의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (E) 콘센선스 L쇄 가변성 부분 ConVH1의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (F) CDR4가 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BKCDR4의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (G) CDR5가 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BKCDR5의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (H) CDR6가 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 BKCDR6의 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 5에는 브래디키닌의 서열을 포함하는 합성된 변형 항체를 인코드하는 조작된 유전자를 어셉블리하는 일반적인 단계를 설명한 것이다. 유전자 어셈블리에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 "oligo1" 내지 "oligo10"으로 나타낸다.

도 6A 및 6B에서 (A)는 도 5에서 나타낸 과정에 의해 콘센선스 L쇄(ConVL1) 및 L쇄 가변 부분을 포함하는 브래디키닌을 어셈블리하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (B)는 (A)는 도 5에서 나타낸 과정에 의해 콘센선스 H쇄(ConVH1) 및 H쇄 가변 부분을 포함하는 브래디키닌을 어셈블리하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 7A-C에서 (A)는 PGE₂합성을 SV-T2 세포에 있는 브래디키닌에 의해 자극하는 것을 나타내는데, 각 처리에서 PGE₂의 양은 웰당 ng을 이용한다. 도면 아래의 범례에서, "-"를 세포를 인자 없이 배양하는 것을 나타내고, "+"sms 인자 존재하에 세포를 배양하는 것을 나타낸다. 이때 인자란 1nM 브래디키닌(윗줄) 또는 1nM HOE 140, 브래디키닌 길항물질(아래줄)을 나타낸다. (B)는 브래디키닌 서열을 포함하는 CDR을 가지는 특정 합성된 변형 항체에 의한 PGE₂합성의 자극을 나타내는데, 이는 pg/PGE₂으로 나타내는데합성 항체 BKCDR3(사각 라인), BKCDR4(삼각라인), BKCDR5(다이아몬드라인), 콘센선스 H쇄 가변성 부분(원형라인), 배지 단독(개방형 원형 라인)의 희석 함수에 대해 나타낸 것이다. (C)는 막대 그래프는 브래디키닌 유무하에서(각각 "+" 또는 "-"로 나타냄) SV-T2 세포에서, PGE₂자극(PGE₂pg/웰)을 나타내는데, 이때 그래프의 막대 아래에 표시한 것과 같이 BKCDR3, BKCDR4, BKCDR5 가변성 도메인 또는 H쇄 콘센선스 가변성 도메인(ConVH)을 가지는 항체로 배양한다.

본 발명은 결합쌍의 제 1멤버에 면역특이적으로 결합하는(이는 단락 5.7에서 설명하는 항원에 항체의 특이적인 결합을 측정하는 당분야에 공지의 방법으로 결정함) 변형 면역글로불린 분자 특히 항체를 제공하는데, 이때 면역 특이적인 결합에는 비-특이적인 결합은 배제하나 결합쌍의 제1멤버에 자연적으로 발생되는 항체에서 볼 수 있는 교차 활성일 필요는 없으며, 결합쌍의 제2멤버의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 한 개의 상보성 결정 부분(CDR)을 가지고, 이때 아미노산 서열은 결합쌍의 제1멤버의 결합 서열이 된다. 결합쌍은 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질등의 서로 상호작용할 수 있는 임의 두 개 분자가 되는데, 적절하게는 결합부위가 유도되는 결합짝은 단백질 분자이다. 적절한 구체예에서, 항체에는 암 항원(암 또는 종양 세포 표면에 있는 분자), 감염성 질환 항원(감염성 질환 매체의 표면에 있는 분자), 병인물질에 대한 세포 수용체, 수용체-리간드(적절하게는 수용체-리간드 결합쌍의 수용체 또는 리간드이고, 이때 리간드는 수용체에 결합하여, 생리학적 반응을 유도함)에 참여하는 수용체 또는 리간드에 대한 세포 수용체에 대한 결합 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 변형 면역글로불린을 이용한 치료 방법을 제공하는데, 예를 들면, 특정 암 항원 또는 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체에 대한 결합 서열을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 포함하는 변형 항체를 이용하여, 특정 수용체에 감염성 질환 매체가 결합하여 특정 항원이 존재하는 것을 특징으로 하는 암 또는 감염성 질환을 치료 및 예방할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 변형 면역글로불린을 이용하여 진단 및 스크리닝 방법을 제공하는데, 예를 들면, 특정 암 항원 또는 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체에 대한 결합 서열을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 포함하는 변형 항체를 이용하여, 특정 수용체에 감염성 질환 매체가 결합하여 특정 항원이 존재하는 것을 특징으로 하는 암 또는 감염성 질환을 감지할 수 있다.

설명을 명확하게 하기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 다음과 같이 소단락으로 설명하나 이에 한정시키고자 함은 아니다.

5.1. 변형 면역글로불린 분자

본 발명은 결합쌍의 제 1멤버에 면역특이적으로 결합하는(이는 단락 5.7에서 설명하는 항원에 항체의 특이적인 결합을 측정하는 당분야에 공지의 방법으로 결정함) 변형 면역글로불린 분자 특히 항체를 제공하는데, 이때 항체의 CDR중 적어도 하나에는 결합쌍의 제1멤버에 대한 결합 부위를 포함하고, 결합부위는 결합쌍의 다른 멤버의 아미노산 서열에서 유도된다. 적절한 발명의 측면에서 결합 부위의 아미노산 서열은 CDR내에서 자연적으로는 찾아볼 수 없다.

결합 부위의 아미노산 서열은 당분야에 공지의 임의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 결합쌍의 멤버의 서열은 결합쌍의 다른 멤버의 결합에 직접적으로 관련이 된다는 것이 이미 확인되었다. 이와 같은 경우에, 이러한 서열을 이용하여, 결합쌍의 다른 멤버를 특이적으로 인지하는 합성 항체의 CDR을 작제할 수 있다. 결합쌍의 다른 멤버에 대해 결합쌍의 한 멤버에 결합 부위에 대한 아미노산 서열이 알려지지 않은 경우에, 당분야에 임의 방법을 이용하여 가령, 분자 모델링 방법 또는 경험적인 방법 가령, 다른 멤버에 결합하는 멤버의 부분(가령, 펩티드)를 검사하거나 또는 멤버에 돌연변이를 만들고, 돌연변이가 결합을 방해하는 지를 측정하는 등으로 서열을 결정할 수 있다.

결합쌍은 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질등의 서로 상호작용할 수 있는 임의 두 개 분자가 되는데, 적절하게는 결합부위가 유도되는 결합짝은 단백질 분자이다. 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로불린에는 암 항원, 감염성 질환 항원, 병인물질에 대한 세포 수용체, 수용체-리간드 결합쌍에 참여하는 수용체 또는 리간드에 대한 세포 수용체에 대한 결합 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 결합쌍은 단백질-단백질 상호작용 쌍으로 동질성 상호작용(가령, 동일한 두 개 단백질간에 상호작용) 또는 이형성 상호작용(가령 두 개의 다른 단백질사이에 상호작용)이 된다.

특정 구체예에서, 제1 멤버는 리간드-수용체 결합쌍의 멤버로써, 적절하게는 수용체-리간드 결합쌍의 멤버로 이때 리간드는 수용체에 결합하여 세포내 시그날발생과 같은 생리학적 반응을 유도한다. 예를 들면, 리간드 또는 수용체는 호르몬, 오토코이드, 생장인자, 사이토킨, 신경전달물질 또는 호르몬, 오토코이드, 생장인자, 사이토킨, 신경전달물질의 수용체 또는 시그날 전달에 관계하는 임의 수용체 또는 리간드가 될 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다(signal transduction pathways, see, e.g., Campbell, 1997, J. Pediat, 131:S42-S44; Hamilton, 1997, J. Leukoc. Biol. 62:145-155; Soede-Bobok & Touw, 1997, J. Mol. Med. 75:47-477; Heldin, 1995, Cell 80:213-223; Kishimoto et al., 1994, Cell 76:253-262; Miyajima et al., 1992, Annu, Rev, Immunol. 10:295-331; and Cantley et al, 1991, Cell 64:281-302). 특정 구체예에서, 결합쌍의 한가지 멤버는 콜레사이토키닌, 갈라닌, IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-11, 케모킨, 렙틴, 프로테아제, 신경펩티드 Y, 뉴로키닌-1, 뉴로키닌-2, 뉴로키닌-3, 봄베신, 카스트린, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 엔도테린, 메탈토닌, 스마토스타틴, 혈관활성 내장 펩티드, 상피 생장 인자, 종양 괴사 인자, 도파민, 엔도테린등과 같은 리간드 또는 이들 이간드의 임의 수용체가 되나 이에 국한시키지는 않는다. 한 구체예에서, 결합쌍의 한 멤버에는 오피오이드 수용체, 포도당 운반물질, 글루타메이트 수용체, 오르파닌 수용체, 이리트로포에틴 수용체, 인슐린 수용체, 티로신 카이나제(TK)-수용체, KIT 간 세포 인자 수용체, 신경 생장 인자 수용체, 인슐린-유사 생장 인자 수용체, 과립세포-콜로니 자극 인자 수용체, 소마토트로핀 수용체, 신경교-유도 신경성 인자 수용체 또는 gp39 수용체, G-단백질 수용체 또는 β2-아드네네린 수용체와 같은 수용체 또는 이들 수용체에 결합하는 임의 리간드등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 결합쌍의 멤버중에 하나는 리간드 게이트 이온 채널 가령, 칼슘 체널, 나트륨 체널, 칼륨 체널등이 되나 이에 한정시키지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명은 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형된 면역글로불린을 제공하는데, 이는 수용체에 결합하는 리간드의 길항물질로써 예를 들면, 엔도르핀, 엔케팔린, 노시세핀의 길항물질이 되나 이에 국한시키지는 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형된 항체로 수용체에 길항물질인데, 예를 들면, 엔도르핀, 엔케팔린, 노시세핀의 길항물질이 되나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로불린은 피브로넥틴 수용체에는 결합하지 않는다. 또 다른 적절한 구체예에서는 결합 서열은 Arg-Gly-Asp이 아니고, 다중 결합 서열로 아니고, 바람직하게는 결합 서열은 Arg-Gly-Asp이 아니다.

다른 특정 구체예에서, 변형된 면역글로불린은 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 CDR을 가진다. 적절한 측면에서, 변형된 면역글로불린은 특이적인 DNA 서열에는 결합되지 않는데, 특히 전사 결합 인자에 결합하지 않는다.

적절한 구체예에서는 변형된 면역글로불린에는 암 항원 또는 종양 항원에 결합 부위의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지고(5.3.1의 설명 참고), 좀더 적절하게는 항원은 사람 결장 암종-관련된 항원 또는 상피 점막 항원이 된다. 또 다른 구체예에서, 변형된 면역글로불린의 적어도 한 개의 CDR에는 사람 유지방 구 수용체의 결합 부위에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 면역글로불린에는 유방, 난소, 자궁, 전립선, 방광, 폐, 피부, 췌장, 결장, 위장관, B-임파세포, T-임파세포의 종양 항원의 결합 부위의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, 변형된 항체의 적어도 한 개의 CDR에는 감염성 질환 매체의 항원에 대한 결합 부위(5.3.2. 단락의 설명 참고) 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체의 결합 부위, 적절하게는 결합 부위가 플라스모디늄(Plasmodium) 항원의 아미노산 서열이 아니고, 또는 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro이 아닌 결합 부위의 아미노산 서열을 가진다. 추가 구체예에서, 변형된 항체는 세균성 또는 바이러스성 효소에 대한 결합 부위를 포함하는 CDR을 가진다.

본 발명의변형 면역글로불린 분자는 임의 면역글로불린이 될 수 있는데, T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체, 세포 표현 흡착 분자 가령, 공-수용체 CD4,CD8, CD19 또는 MHC 분자의 비변성-도메인이 된다. 적절한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 항체 분자 점도 적절하게는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA에서 선택된 타입으로, 가장 적절하게는 IgG 분자가 된다. 또 다른 특정 구체예에서, 변형 면역글로불린 분자는 T 세포 수용체가 된다.

변형 면역글로불린을 만들기 위해 변형되는 면역글로불린은 임의 이용할 수 있는 면역글로불린 분자가 되는 데 적절하게는 단클론 항체 또는 합성 항체가 된다. 변형되는 항체는 자연 발생 또는 기존에 존재하는 항체가 될 수 있고, 도 4A또는 B에서 나타낸 L 및 H쇄 가변성 부분의 콘센선스 서열과 같은 공지의 항체 콘센선스에서 합성되거나 또는 임의 다른 항체 콘센선스 또는 생식세포계열(가령, 재조합안된 게놈 서열)(가령, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thedition, NIH Publication No. 91-3242, pp 2147-2172)이 될 수 있다

각 항체 분자는 6개의 CDR 서열을 가지는데, 세 개는 L쇄에 세 개는 H 쇄에 있고, 이들 CDRs중 5개는 생식세포계열 CDRs(가령, 임의 재조합없이 동물의 게놈 서열에서 바로 유도된)이고, CDRs의 하나는 non-생식세포계열 CDR(가령, 동물의 생식세포계열 게놈 서열과는 다르고, 생식세포계열 서열의 재조합에 의해 발생됨)이다. CDR이 생식세포계열 또는 non-생식세포계열 서열인지는 CDR의 서열을 조사하고, 공지의 생식세포계열 서열과 비교하여 결정한다(Kabat et al., (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thedition, NIH Publication No. 91-3242, pp 147-2172)). 공지의 생식세포계열 서열에서 상당한 변화가 있다는 것은 CDR이 비-생식세포계열 CDR이라는 것을 말한다.

따라서, 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하는 CDR은 생식세포계열 CDR이고, 그렇지 않으면, 비-생식세포계열 CDR이다.

항체의 임의 CDRs에 결합 부위 또는 항원 서열을 삽입하고, 항체의 상이한 CDRsd[ 결합 부위를 삽입하는 것은 당분야에 공지된 것이고, 그 다음 결합쌍의 특정 멤버에 결합하는 능력에 대해 생성된 변형 항체(단락 5.5)를 선별하거나 또는 항원 부위에 대해 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 생성된 변형 항체(달락 5.5)를 선별한다. 따라서, 당업자는 CDR에 선택적으로 결합 부위 또는 항원을 포함하는지를 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, H쇄 또는 L쇄의 CDR을 변형시켜, 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하도록 한다. 또 다른 특정 구체예에서, 변형된 항체에는 가변성 도메인을 포함하는데, H쇄의 가변성 부분의 제1, 제2, 제3 CDR 또는 L쇄의 가변성 부분의 제1, 제2, 제3 CDR에는 결합 부위 또는 항원의 아미노산 부분을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 한가지 이상의 CDR에 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하고, 또는 한가지 이상의 CDR에 각각 동일한 분자의 상이한 결합 부위를 포함하거나 또는 다른 분자의 다른 결합 부위를 포함한다. 특히, 2, 3, 4, 5, 6개 CDRs을 조작하여, 결합쌍의 제 1 멤버의 결합부위를 가지도록 한다. 적절한 구체예에서, 한 개 또는 그이상의 CDRs이 결합쌍의 제1멤버에 대한 결합부위를 포함하고, 한 개 또는 그이상의 CDRs에 면역 세포, 가령, T 세포, B 세포, NK 세포, K 세포, TIL 세포의 표면에 있는 분자의 결합 부위를 포함한다. 예를 들면, 암 항원 또는 감염성 질환 항원에 대한 결합 부위 및 면역 세포의 표면에 있는 분자의 결합부위를 가지는 변형된 항체를 이용하여, 면역세포가 암 항원을 가지는 암 세포 또는 감염성 질환 매체를 표적으로 할 수 있도록 한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열은 CDR 자체의 아미노산 서열에 임의 변화없이 CDR내에 삽입시키거나 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열을 CDR의 모두 또는 전부에 대신한다. 특정 구체예에서, 결합 부위 아미노산은 CDR 서열의 1,2,5,8,10,15, 20 아미노산에 대신한다.

CDR에 있는 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열은 결합쌍의 멤버에 결합에 필수적인 또는 항원에 대해 면역반응을 유도 할 수 있는데(임의 공지의 방법으로 결정할 수 있음) 필수적인 최소 결합 부위로써; 또는 서열은 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열은 결합쌍의 멤버에 결합에 필수적인 또는 항원에 대해 면역반응을 유도 할 수 있는데 필요한 최소 결합 부위 또는 항원 서열보다는 크다. 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열은 길이가 적어도 4개 아미노산 또는 길이가 적어도 6,8,10,15, 20개 아미노산이 된다. 다른 구체예에서, 결합 부위 아미노산 서열은 길이가 10,15,20, 25개 아미노산 또는 길이가 5-10,5-15,5-20,10-15,10-20,10-25 아미노산이 된다.

또한, CDR의 총 길이(가령, 결합 부위 서열과 나머지 CDR 서열을 합한 길이)는 항체가 항원에 결합할 수 있도록 적정수의 아미노산이 되어야 한다. CDR은 특정 범위의 아미노산 잔기를 가지는 것을 볼 수 있는데, 파악된 CDRs의 크기(도 2에 약어도 표시됨)는 표 1에 나타낸다.

표 1

많은 CDR H3 부분은 길이가 5-9개의 잔기인데 반해, 특정 CDR H3 부분은 훨씬 더 긴것도 관찰되었다. 특히, 상당수의 항-바이러스 항체는 길이가 17-24개 잔기인 H쇄 CDR H3 부분을 가진다.

따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 부분을 포함하는 CDR은 표 2의 특정 CDR에 제공된 크기 범위에 있는데, 예를 들면, L쇄의 처음 CDR 즉, L1의 경우에 CDR은 10 내지 17개 아미노산 잔기를 가지고, L쇄의 두 번째 CDR즉 L2의 경우에, CDR은 7개 아미노산 잔기를 가지고, L쇄의 세 번째 CDR 즉 L3의 경우에, CDR은 7 내지 11개의 아미노산 잔기를 가진다. H쇄의 처음 CDR 즉, H1의 경우에 CDR은 5 내지 7개 아미노산 잔기를 가지고, H쇄의 두 번째 CDR즉 H2의 경우에, CDR은 9 내지 12개 아미노산 잔기를 가지고, H쇄의 세 번째 CDR 즉 H3의 경우에, CDR은 2 내지 25개의 아미노산 잔기를 가진다. 다른 특정 구체예에서, 결합 부위를 포함하는 CDR은 길이가 5-10,5-15,5-20,11-15,11-20,11-25, 16-25인 아미노산을 가진다. 다른 구체예에서, 결합 부위를 가지는 CDR의 경우에 적어도 5,10,15,20개 아미노산 또는 길이가 10,15,20,25,30개 아미노산을 가진다.

특정 구체예에서, 본 발명의 변형 면역글로불린에는 가변 부분의 일부를 포함하는데, 가령, H 쇄 또는 L쇄에는 골격구조 부분보다 적고, 세 개 CDR을 포함하는데 가변 부분에는 1개 또는 2개의 CDR과 적절하게는 골격구조 사이 부분을 포함한다.

특정 구체예에서, 변형 항체는 브래디키닌 수용체에 면역특이적으로 결합한다(가령, 단락 6에서 설명하는 변형 항체가 되나 이에 국한시키지는 않는다). 특히, 구체예에서는 아미노산 서열 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg을 포함하는 적어도 한 개의 CDRs에 변형 항체를 제공한다.

또 다른 특정 구체예에서, 변형 항체는 사람의 유지방 구 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 변형 항체의 CDR중 적어도 한 개는 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다;

(ⅰ)Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu;

(ⅱ)Glu-Ile-Leu-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly

(ⅲ)Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr;

(ⅳ)Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala

(ⅴ)Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser;and(ⅵ)Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr.

좀더 특이적인 구체예에서, H쇄 가변 부분의 CDR에는 상기 아미노산 서열(i)-(iii)을 포함하고, 반면에 L쇄의 가변성 부분의 CDR에는 상기 (iv)-(vi)의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 사람의 결장 암종-연합된 항원에 결합하는 변형 항체를 제공하고, 다음의 아미노산 서열중 하나를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 부분으로 구성된다;

Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala;

Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr;

Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr;

Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn;

Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly;

Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr.

변형된 CDRs을 포함하는 항체를 작제한 후에, 변형된 항체는 추가 변경시키고, 더 큰 친화력 또는 특이성을 가지는 항체를 선별한다. 표적 항원에 대해 더 큰 친화력 또는 특이성을 가지는 항체가 만들어지고, 이는 당분야에 임의 공지된 방법으로 선별된다. 예를 들면 합성된 변형 항체를 인코드하는 핵산이 무작위로 또는 화학적 또는 부위-직접적인 돌연변이생성에 의해 돌연변이되거나 또는 변형된 항체를 인코드하는 핵산에 특정 위치에 특정 돌연변이생성시키고, 표적이 되는 항원에 결합 친화성을 가지는 돌연변이된 핵산 분자에 노출된 항체를 선별한다. 선별은 발현된 항체 분자를 개별적으로 테스트하거나 또는 상 디스플레이 기술등과 같은 돌연변이된 서열의 라이브러리를 스크린하여 실시한다(U.S.Patent Nos. 5,223,409; 5,403,484; and 5,571,698 all by Ladner et al; PCT Publication WO 92/01047 by McCafferty et al. 및 임의 당분야에 공지된 다른 기술)

따라서, 특정 구체예에서, 변형 항체는 동일한 항원에 면역특이적으로 결합하는 자연 발생 항체보다도 항원에 더 큰 친화력 또는 특이성을 가진다. 또 다른 구체예에서, 변형 항체는 적어도 2x10⁷M의 항원에 대한 결합 상수를 가진다.

본 발명의 변형 항체는 당분야에 공지의 방법을 이용하여 항체를 추가 변형시킬 수 있는데, 이때 추가 변형은 특정 항원에 변형 항체가 결합하는 것을 방해하거나 저해해서는 안된다. 특히, 본 발명의 변형 항체는 결합 서열의 아미노산 서열내에 CDR 서열내에 삽입 또는 치환되는 것 이외에 한 개 이상의 아미노산 치환, 결손, 삽입을 가진다. 이와 같은 아미노산 치환, 결손 또는 삽입은 표적 항원에 변형된 항체의 면역특이적인 결합의 방해 또는 저해하지 않는 임의 치환, 결손 또는 삽입이 될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 다른 아미노산 치환체에는 기능적으로 등가의 아미노산 잔기 치환체를 포함한다. 예를 들면, 한 개 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 등가로 작용하는 유사한 극성을 가지는 또다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 서열내에 아미노산 치환은 아미노산이 속하는 류별의 다른 구성원에서 선택된다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌등이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민등이 포함된다. 양전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성) 아미노산에는 아스파라틱산, 글루타민산이 포함된다.

추가로, 서열내에 한 개 이상의 아미노산 잔기는 비-전통적인 아미노산으로 치환되거나 또는 화학적 아미노산 유사체를 면역글로불린 서열내에 치환 또는 삽입으로 도입할 수 있다. 비-전통적인 아미노산에는 통상적인 아미노산의 D-이성체, α-아미노산 이소부틸산, 4-아미노부틸산, Abu, r-Abu, 2-아미노부틸산, γ-Abu, ε-Ahx, 아미노 헥사논산, Aib, 2-아미노 이소부틸산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루이산, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시투룰린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플로오르-아미노산, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, 일반적인 아미노산 유도체등이 포함되나, 이에 국한시키지는 않는다. 또한, 아미노산은 D 또는 L형이 될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 변형된 면역글로불린은 추가 변형시켜, 항-이디 반응을 유도하는 능력을 강화시킬 수 있다(이는 공동계류중인 미국 특허 출원 "Immunoglobulin Molecules Having A Synthetic Variable Region And Modified Specificity", and Burch, Filed November 13, 1998(attorney docket no. 6750-016)에서 볼 수 있다). 이와 같은 변형은 사슬간 또는 사슬내에 이황화결합을 제거하거나 줄여서 면역글로불린의 가변성 부분에 있는 모양으로 인한 구속을 줄이도록 하는 것이다. 특히, 변형 면역글로불린을 추가로 변형시켜, 이황화결합을 만드는 한 개이상의 가변 부분 시스테인 잔기를 SH기를 포함하지 않는 아미노산 잔기로 치환한다.

당분야에 공지의 방법을 이용하여 특정 항체의 가변성 부분에서 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들면, 사슬내 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기는 항체 종류간에 그리고 종간에 상당히 보존되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이황화결합을 형성하는데 참여하는 시스테인 잔기는 이황화결합을 하는 잔기로 알려진 다른 항체 분가와 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다(예를 들면, 도 4A 및 dp 제공된 콘센선스 서열 또는 Kabat et al., 1991m sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland).

표 1에서는 많은 수의 항체 분자에서 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기의 위치를 제공한다.

표 2

()안에 있는 위치를 나타내는 숫자는 이 위치에서 서열이 확인되지 않은 것으로 단지 공지의 서열과 비교하여 추정한 잔기이다.

주목할 만한 것으로, 표 1에 나열된 모든 항체 분자에서, 사슬내 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기는 L쇄 가변 도메인의 22 및 88 위치와 H쇄 가변 도메인의 22 및 92위치가 된다. 위치를 나타내는 숫자는 Kabat(1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland)에서 설명하는 콘센선스 서열에 있는 잔기에 항응하는 잔기를 말하거나 또는 도 4A 및 E에서 설명한 H 및 L쇄 가변 부분 서열에 나타낸 것과 같은 잔기를 말한다(도 4A 또는 E에서 나타낸 것과 같은 H 및 L쇄 가변성 부분의 서열 또는 콘센선스 서열의 특정 항체 서열과 나란하게 배열하여 결정된 이란 의미를 가진다).

따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 분자는 L쇄의 23 또는 88위치에 있는 잔기가 SH기를 가지지 않은 아미노산 잔기로 치환되었거나 H쇄의 22 또는 92 위치에 있는 잔기가 SH기를 가지지 않는 아미노산 잔기로 치환된 항체를 말한다.

이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기에 대체하는 아미노산은 SH기를 가지지 않는 임의 아미노산 잔기가 되는데 예를 들면, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파라테이트(또는 아스파라틱산), 글루타민, 글루타메이트(또는 글루타민산), 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린이 된다. 특정 구체예에서, 시스테인 잔기는 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라진, 글루타민 잔기로 치환되는데, 가장 바람직하게는 알라닌 잔기로 치환된다.

추가로, 이황화결합을 형성하는 시스테인는 SH기를 포함하지 않는 가령, 일상적인 단백질 합성 방법에 의해 만들어진 비-전통적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체에 의해 치환될 수 있는데, 이에 국한시키지는 않는다.

특정 구체예에서, 이황화결합을 형성하는 잔기 치환은 H쇄 가변성 부분 또는 L쇄 가변성 부분에서 이루어지거나 또는 H 및 L쇄 가변성 부분 모두에서 이루어질 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 특정 이황화결합을 형성하는 잔기중에 하나는 치환되거나(또는 결손되거나) 특정 이황화결합을 형성하는 잔기 모두 치환(결손)된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 변형 면역글로불린의 기능적으로 활성 단편을 제공하는데, 기능적으로 활성이 있는 단편이란, 면역특이적인 결합을 측정하기 위해 임의 공지의 방법으로 결정하였을 때 단편이 면역특이적으로 표적 항원에 결합한다는 것을 의미한다(5.7에서 설명). 예를 들면, 이와 같은 단편에는 F(ab')₂, L쇄 항상 부분 및 H쇄의 CH1 도메인이 항체 분자의 펩신 처리로 만들어진것이고, F(ab')₂의 이황화결합 다리를 환원시켜 만들어지는 Fab 단편(도 1; King et., 1992, Biochem, J. 281:317) 및 Fv 단편, 가령, H 및 L쇄의 가변성 부분 도메인을 모두 포함하는 단편(Reichmann and Winter, 1988, J. Mol. Biol. 203:825; King et al., 1993, Biochem. J. 290:723)등이 있으나 이에 한정하지는 않는다.

또한, 본 발명은 단일 쇄 항체(SCAs)를 포함한다(e.g., as described in U.S.Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54). 단일 쇄 항체는 아미노산 다리에 의해 Fv 부분의 H 쇄 및 L 쇄 단편을 연결하여 만들어진다. 또한, 본 발명은 H 쇄 및 L쇄 이량체 및 다이아보디를 제공한다.

본 발명은 또한 키메라 또는 사람화된 변형 항체를 제공한다. 키메라 항체는 뮤린 단클론 항체에서 유도된 가변성 부분을 가지는 것과 사람의 면역글로불린의 항상부분을 가지는 것과 같은 상이한 동물종에서 유도된 상이한 부분을 가지는 분자로 예를 들면, 사람화된 항체를 말한다. "키메라 항체"를 생산하는 기술도 개발되어왔는데(Morrison et al., 1984, Proc. NA시. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608, Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454), 적절한 항원 특이성을 가진 생쥐 항체 분자의 유전자와 적절한 생물학적 활성을 가지는 사람 항체 분자의 유전자를 접합시키는 것이다. 특정 구체예에서, 합성된 변형 항체는 사람이 아닌 항체의 가변성 도메인과 사람 항체의 항상 도메인을 포함하는 키메라 항체이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 변형 항체는 사람화된 항체, 좀더 적절하게는 항체의 CDR(결합 서열을 가지는 한 개 이상의 CDR을 제외)은 사람이 아닌 동물에서 유도하고, 골격구조 부분 및 항상 부분은 사람 항체에서 유도한다(Winter et al. U.S.Patnet No. 5,225,539). CDR-접합된 항체는 다양한 항원에 대해 성공적으로 만들어졌는데, 예를 들면, IL-2 수용체에 대한 항체(Queen et al.,1989(Proc. NA시. Acad. Sci. USA 86:10029); 세포 표면 수용체-CAMPATH에 대한 항체(Riechmann et al.(1988, Nature, 332:323)); 간염 B에 대한 항체(Cole et al.(1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)); 항원-호흡기 합체 바이러스에 대한 항체(Tempest et al.(1991,Bio-Technology 9:267))등이 있다.

CDR 접합은 사람화 항체의 또 다른 방법이다. 이는 뮤린 항체를 다시 만드는 것으로 사람 구조에 전체적인 항원 특이성 및 결합 친화성을 전달하는 것이다(Winter et al. U.S.Patnet No. 5,225,539).

CDR-접합된 가변 부분 유전자는 다양한 방법 가령, 부위-직접적인 돌연변이 생성등의 방법을 이용하여 만들 수 있다in Jones et al., 1986, Nature 321:522; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323; in vitro assembly of entire CDR-grafted variable regions (Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029); and the use of PCR to synthesize CDR-grafted genes (Daugherty et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:2471). CDRs-접합된 항체는 뮤린 단클론 항체의 CDR을 사람 항체의 골격구조에 접합시켜 만든다. 접합후에, 구조 부분에 있는 추가 아미노산 변화로부터 이익을 얻어, 친화력을 유지하는데, 그 이유는 골격구조 잔기가 CDR 모양을 유지하는데 필수적이고, 일부 골격구조잔기는 항원 결합 부위의 일부분인 것으로 알려졌다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, 변형 항체는 가변 부분으로 구성되는데, 이때 골격구조의 적어도 하나는 자연 발생하는 골격구조 부분에 있는 위치의 잔기와는 다른 한 개 이상의 아미노산 잔기를 가진다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 변형 항체는 사람 단클론 항체에서 유도된다. 완전한 사람 단클론 항체는 유전자 전이 생쥐를 이용하면 만들 수 있다. 생쥐 면역글로불린 유전자 위치를 사람 면역글로불린을 생산하기 위한 in vivo 친화력-성숙화 기작에서 제공되는 사람 면역글로불린 위치와 대체시킨다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형 면역글로불린의 융합 단백질을 제공하는데(또는 이의 기능적으로 활성이 있는 단편), 예를 들면 변형 면역글로불린을 공유결합을 통하여, 변형된 면역글로불린이 아닌 또 다른 단백질(또는 이의 일부분, 적어도 단백질의 10,20,50개 아미노산으로된 부분)의 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 융합된 것이다. 적절하게는 변형 면역글로불린 또는 이의 단편은 항상 부분의 N-말단에서 다른 단백질에 공유결합된다. 적절한 구체예에서, 본 발명은 변형된 면역글로불린이 IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12,IL-15, G-CSF, 종양 괴사 인자, 포린, 인터페론-감마, NK 세포 항원, MHC-유도된 펩티드등의 면역 자극 인자의 일부분 또는 세포 생장인자에 공유 결합된다.

본 발명의 변형 면역글로불린에는 변형된 유사체 및 유도체가 포함되는데, 예를 들면, 임의 형태의 분자에 공유결합된 것으로 단, 이와같은 공유적으로 결합되는 것이 항-이디오타입 반응을 유도하는데 있어서, 변형 면역글로불린을 방해하지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명의 변형 면역글로불린의 유도체 및 유사체에는 추가 변형된 것들이 포함되는데, 예를 들면, 글리코실화반응, 아세틸화반응, 페질화반응(pegylation), 포스포릴화반응, 아미데이션, 공지의 보호 및 차단기, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 임의 부분에 연결되는 등의 방법으로 유도된 것들이 포함된다. 임의 다양한 화학적인 변형도 공지 기술을 이용하여 이루어질 수 있는데, 가령, 특정 화학물질을 이용한 절단, 아세틸화반응, 포밀화반응, 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사적 합성등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 추가로, 유사체 또는 유도체에는 이 단락에서 나열한 것과 같은 한 개이상의 비-교유적인 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 변형 면역글로불린(또는 이의 단편)은 종양 또는 암 세포와 같은 특정 세포 형 또는 조직에 치료 분자를 표적으로 하기 위해 치료 분자에 공유적으로 연결된다. 치료 분자는 당분야에 공지된 치료분자의 형태가 되는데, 예를 들면 화학 치료제, 리친과 같은 독소, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 방사능뉴클리드, 항생제, 항-바이러스 또는 항-기생충제등이 될 수 있다.

5.2. 변형된 면역글로불린을 생산하는 방법

본 발명의 변형된 면역글로불린은 면역글로불린 합성을 위해 당분야에 공지된 임의의 방법으로 생산할 수 있는데, 특히, 화학합성이나 제조합발현으로 생산하며, 가급적 제조합 발현기술로 생산한다.

본 발명의 변형된 면역글로불린, 이의 단편의 재조합 발현은 변형면역글로불린을 인코드한 핵산의 작제를 필요로 한다. 변형면역글로불린을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 이런 분리된 핵산은 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 재조합 기술 또는 화학합성(Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W.H.Freeman & Co., N. Y., pp.34-49; and Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Press, N.Y. 참조)을 이용하여, 또는 결합위치를 보유한 CDR 서열을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 가공하기 위한 공지된 면역글로불린 유전자에서 PCR을 이용하여 만들 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 변형 면역글로불린 또는 이의 기능적 활성단편을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산을 제공한다.

가급적, 변형면역글로불린을 인코드한 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드(Kmeier et al., 1994. Biotechniques 17:242)로부터 조합하는데, 여기에는 간단히 말하면, 변형면역글로불린을 인코드한 서열의 일부분을 보유한 중복 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 결찰하고, 이후 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR로 증폭하는 단계가 포함된다.

따라서, 본 발명은 변형면역글로불린을 인코드한 핵산을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 (a) 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하고, 여기서 상기 세트는 인공 변형 면역글로불린을 인코드한 뉴클레오티드서열 일부를 보유한 올리고뉴클레오티드, 변형 면역글로불린을 인코드한 뉴클레오티드서열과 상보적인 뉴클레오티드서열 일부를 보유한 올리고뉴클레오티드로 이루어지고, 각 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 세트와 중복 말단서열을 갖고, 단 예외적으로 이들 올리고뉴클레오티드는 인공변형면역글로불린의 N-말단 및 C-말단을 인코드한 뉴클레오티드를 보유하고; (b) 올리고뉴클레오티드가 서로 혼성화되거나 어닐링되도록하고; (c) 혼성화된 뉴클레오티드를 결찰하여, 인공변형면역글로불린을 인코딩한 뉴클레오티드를 보유한 핵산을 만드는 것으로 이루어진다.

다른 방법으로, 변형면역글로불린을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산은 항체 분자, 또는 항체분자의 적어도 변이영역을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산에서 만든다. 항체 분자를 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산은 기존의 항체분자 또는 변이도메인의 클론에서 또는 적당한 출처로부터 항체분자 또는 변이도메인을 인코드한 핵산을 분리하여 얻을 수 있는데, 이러한 출처는 가급적, cDNA 라이버러리, 예를 들면, 항체분자 또는 인공합성 라이버러리의 반복부위를 발현하는 세포 또는 조직으로부터 만든 항체 DNA 라이버러리 또는 cDNA가 되고(Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:4937 참조), 이들은 특정 항체 분자에 특이적인 프로브를 사용한 혼성화로 또는 서열의 3' 및 5' 말단과 혼성화되는 인공 프라이머를 사용한 PCR 증폭으로 만든다.

일단 항체분자의 적어도 변이영역을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산을 클론한 후에, 결합위치 서열은 하나 또는 복수의 CDR를 코딩한 뉴클레오티드 서열로 삽입할 수 있다. 이런 특정 CDR 코딩서열의 가공은 당분야에 공지된 일상의 재조합 DNA 기술로 성취할 수 있다. 가령, CDR를 인크드한 뉴클레오티드 서열은 특정 결합위치서열을 보유한 CDR을 인코드한 뉴클레오티드에 의해 치환되는데, 여기서는, PCR 기초의 방법, in vitro 특정부위 돌연변이 유발등으로 사용한다. 간편한 제한 효소 위치가 CDR의 뉴클레오티드 서열에 사용할 수 있는 경우, 서열은 제한효소로 절단할 수 있고, 결합위치를 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 핵산단편은 제한위치로 결찰할 수 있다. 결합위치를 보유한 핵산단편은 결합위치를 보유한 단백질 모두 또는 일부를 인코드한 핵산에서 얻거나, 또는 결합위치 및 이의 역상보체를 인코드한 서열은 보유한 인공 올리고뉴클레오티드에서 만들 수 있다.

변형 항체를 인코드한 핵산은 리드서열을 인코드한 뉴클레오티드서열을 선택적으로 보유하는데, 상기 리드 서열은 인공변형항체분자의 분비를 주관한다.

변형 항체의 적어도 변이도메인을 인코드한 핵산을 획득한 경우, 이것은 항체의 일정영역을 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유한 벡터로 삽입한다(PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; and U.S. Patent No. 5,122,464 참조). 완전항체분자의 발현을 가능하게 하는 핵산과의 공동발현을 위한 L 또는 H사슬을 보유한 벡터를 얻을 수 있고, 당분야에 공지된 것으로, 예를 들면, pMRRO10.1, pGammal이다 (Bebbington, 1991, Methods in Enzymology 2:136-145 참조).

발현 벡터는 이후 통상적인 방법으로 숙주세포로 옮기고, 트랜스펙션된 세포는 통상적 기술로서 배양하여 본 발명의 항체를 만들 수 있다. 특히, 변형항체의 핵산변이영역이 만들어지는 경우, 변형항체는 섹션 6에서 예시한 방법으로 발현할 수 있는데(Bebbington, 1991, Methods in Enzymology 2:136-145 참조), 예를 들면, 변형면역글로불린을 인코드한 발현벡터를 COS 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 적당한 시기동안 세포를 배양하여 면역글로불린을 발현시키고, 이후 COS세포의 상청액을 수거하는 것으로, 여기서 상청액은 분비된, 발현 면역글로불린을 보유한다.

본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위하여 사용하는 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아세포, 특히 재조합 항체단편의 발현을 위해, 또는 가급적 진핵세포, 특히 재조합 항체 분자의 발현을 위한 세포가 된다. 특히, 중국 햄스터 난소세포(CHO) 또는 COS와 같은 포유동물세포는 사람시토메갈로바이러스의 주요 중간단계 초기유전자 프로모터 인자와 같은 벡터와 결합시켜 사용하는데, 상기 벡터는 면역글로불린에 대한 유용한 발현계가 된다(Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

다양한 숙주-발현벡터계를 사용하여 본 발명의 항체 코딩서열을 발현한다. 이런 숙주-발현계는 관심있는 코딩서열을 생산되고 연이어 정제되는 담체를 나타내지만, 또한 적당한 뉴클레오티드 코딩서열로 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 경우에 in situ에서 본 발명의 항체산물을 발현하는 세포를 나타내기도 한다. 이들에는 면역글로불린 코딩서열을 보유한 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현벡터에 의해 형질전환된 박테리아(E. coli, B. subtilis); 항체코딩서열을 보유한 재조합 효모 발현벡터에 의해 형질전환된 효모(Saccharomyces, Pichia); 항체 코딩서열을 보유한 재조합 바이러스 발현벡터(예, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충세포; 재조합 바이러스 발현벡터(에, 카룰리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 항체 코딩서열을 보유한 재조합 플라스미드 발현벡터(에, Ti 플라스미드)로 감염된 식물세포계; 또는 포유동물세포의 게놈에서 유도한 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유도한 프로모터(예, 아데노바이러스 후프로모터, 두진 바이러스 7.5K 프로모터)를 보유한 재조합 발현 구성체를 갖는 포유동물세포계(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)가 있다.

박테리아계에서, 다수의 발현벡터는 발현될 항체 분자에 대한 사용목적에 따라 우선적으로 선택된다. 가령, 항체의 제약학적 조성물의 생산을 위해 이런 단백질을 대량으로 생산하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질산물의 고수준발현을 조절하는 벡터가 바람직하다. 이런 벡터에는 대장균(E.coli) 발현벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)을 예를 들 수 있는데, 여기서 항체 코딩 서열은 lac Z 코딩영역을 통해 개별로 벡터프레임으로 결찰되어 융합 단백질이 만들어진다: PIN 벡터(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509. pGEX 벡터를 사용하여 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-전이효소(GST)를 가진 융합단백질로 발현한다. 일반적으로, 이런 융합 단백질은 수용성이고, 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있는데, 이때, 흡수하고 메트릭스 글르타티온-아가로즈 비드에 결합시키고 자유 글루타티온의 존재하에 용출과정을 거친다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단부위를 포함하도록 고안하여, 클론된 표적유전자산물이 GST 부분에서 떨어지도록 한다.

곤충계에서, 오토그래파 칼리포르니카(Autographa californica)핵 다면체 바이러스(AcNPV)를 벡터로 사용하여 외래 유전자를 발현시킨다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 키운다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 부위로 개별클론하고, AcNPV 프로모터(예, 다면체 프로모터)의 조절하에 둔다.

포유동물 숙주세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현계를 사용한다. 아데노바이러스를 발현벡터로 사용하는 경우, 관심있는 항체 코딩서열은 아데노바이러스 전사/해독 컨트롤 복합체(예, 후프로모터, 삼자 리드서열)에 결찰시킨다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합으로 이후 아데노바이러스 게놈에 삽입한다. 바이러스 게놈의 비-필수영역(예, E1 또는 E2 영역)에 삽입하면, 생존하고, 감염된 숙주에서 항체를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 만들어진다(Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). 특정 개시시그널은 삽입된 항체 코딩서열의 효율적인 해독을 위해 필요하다. 이들 시그널에는 ATG 개시코돈 및 인접서열이 포함된다. 또한 개시코돈은 원하는 코딩서열의 해독틀과 보조를 맞추어 전체 삽입체의 해독이 일어나도록 한다. 이들 외인성 해독컨트롤 시그널은 및 개시 코돈은 다양한 출처(자연, 인공)에서 얻을 수 있다. 발현의 효율은 적당한 전사강화인자, 전사종결체등의 삽입으로 강화할 수 있다(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544 참조).

또한, 숙주세포계통은 삽입된 서열의 발현하고, 원하는 특정형식으로 유전자산물을 변형하고 조절하는 것으로 선택한다. 단백질산물의 이런 변형(예, 당부가) 및 가공(예, 절단)은 단백질의 기능에 중요하다. 상이한 숙주세포는 해독후 과정 및 단백질 및 유전자산물의 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖는다. 적당한 세포계 또는 숙주계를 선택하여 외래 발현단백질의 정확한 변형 및 가공을 가능하게 한다. 이런 목적을 위하여, 일차 전사체의 적절한 가공, 당부가, 유전자산물의 인산화를 위한 세포기작을 보유한 진핵숙주세포를 사용한다. 이런 포유동물숙주세포에는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38이 포함되나, 이들에 한정하지 않는다.

재조합 단백질의 장기간, 고-산출율의 생산을 위해, 적당한 발현이 선호된다. 가령, 안정적으로 항체를 발현하는 세포계는 가공한다. 바이러스 기원의 복제를 보유한 발현벡터를 사용하기보다는 숙주세포는 적당한 발현조절인자(예, 프로모터, 증강체, 서열, 전사종결체, 폴리아데닐화 부위등) 및 선택성 마크로 조절한 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입후, 가공한 세포는 완전배지에서 1-2일 생장시키고, 이후 선택성 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드상의 선택성 마크는 선택성에 대한 저항력을 제공하고 세포가 안정적으로 플라스미드를 크로모좀으로 통합하게 하여 병소를 형성하게 하고, 상기 병소는 이후에 클론하고 세포계로 확대할 수 있다. 이 방법은 항체를 발현하는 세포계를 가공하기 위하여 우선적으로 사용한다. 이렇게 가공된 세포계는 특히 항체와 직간접적으로 상호작용하는 화합물의 선별 및 평가에 유용하다.

다수의 선별계를 사용하는데, 이들의 예로 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc. NA시. Acad. Sci. USA 48:202), 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자는 각각 tk^-, hgprt^-또는 aprt^-세포에 사용할 수 있다. 또한, 대사길항물질 저항성은 다음 유전자들의 선별기초로 사용할 수 있다: 메토프렉세이트에 대한 저항성을 공여하는 경우, dhfr(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코피놀산에 대한 저항성을 공여하는 경우, gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 저항성을 공여하는 경우, neo(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 히그로마이신에 저항성을 공여하는 경우, hygro((Santerre et al., 1984, Gene 30:147).

인공변형항체의 발현수준은 벡터증폭으로 증가시킬수 있다(Bebbington and Hentschel, the Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning, Vol.3.(Academic Press, New York, 1987 )참조). 면역글로불린을 발현하는 벡터계상의 마크가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양시 존재하는 억제물질의 수준증가로 의해 마크 유전자의 사본수가 증가한다. 증폭된 영역은 면역글로불린 유전자와 연관하기 때문에, 면역글로불린의 생산 또한 증가한다(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

숙주세포는 본 발명의 두 개의 발현벡터, H 사슬 유도의 폴리펩티드를 인코드한 제 1 벡터 및 L 사슬 유도 폴리펩티드를 인코드한 제 2 서열로 공동트랜스펙션시킨다. 두 개의 벡터는 H 및 L 사슬 폴리펩티드를 동등하게 발현시키는 동일한 선택성 마크를 보유한다. 다른 방법으로, H 및 L 사슬 폴리펩티드를 모두 인코드한 단일벡터를 사용한다. 이런 경우에서, L 사슬은 H 사슬앞에 위치하여, 독성 자유 H사슬이 과도하게 많아지는 것을 피한다(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). H 및 L 사슬에 대한 코딩서열은 cDNA 또는 게놈 DNA로 이루어진다.

본 발명은 인공항체를 인코드한 벡터를 보유한 재조합성 세포를 제공하는데, 상기 항체는 결합쌍 멤버로부터 활성결합위치의 아미노산 서열을 보유한 CDR을 갖는다.

5.3. 인공변형항체의 치료요법상의 용도

본 발명은 개체에 치료제를 투여함으로써 항-이디오타입 항체 및 항-항-이디오타입 항체 생산을 유도하는 방법을 제공한다. 이와 같은 치료제에는 본 발명의 변형 면역글로불린, 기능적으로 활성이 있는 단편, 이의 유사체 및 이의 유도체(단락 5.1참고), 본 발명의 변형 면역글로불린을 인코드하는 핵산, 이의 기능적으로 활성을 가진 단편(단락 5.2참고)을 포함한다.

일반적으로, 개체와 동일한 종인 종기원 또는 종 반응성을 가진 생성물을 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 적절한 구체예에서는 본 발명의 방법은 사람 항체에서 유도된 변형 항체를 이용하고, 또 다른 구체예에서는 키메라 또는 사람화된 항체에서 유도된 변형 항체를 이용한다.

특히, 본 발명의 변형항체(또는 이의 기능적 활성단편)을 보유한 제약학적 조성물은 면역특이적으로 특정 분자에 결합하는데, 이것은 특정분자, 예를 들면, 항원의 발현과 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 특히, 다음의 소단락에서 자세히 설명할 구체예에서, 면역특이적으로 종양 또는 암항원, 감염성 질병병인의 항원, 감염성 질병병인에 대한 세포 수용체에 결합하는 변형항체를 사용하여, 특정항원의 발현과 관련된 종양, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료할 수 있다. 면역특이적으로 리간드 또는 수용체에 결합하는 변형된 면역글로불린을 사용하여 특정 리간드 수용체양의 감소 또는 증가의 부재와 관련된 질병을 치료 또는 예방할 수 있다. 특정 구체예에서, 변형면역글로불린을 사용하여 자가면역질환을 치료 또는 예방할 수 있는데, 상기 자가면역질환의 예로 류마티스성 관절염, 낭창, 궤양성 염증, 건선을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 변형 면역글로불린은 또한 알레르기를 치료하는데 사용한다.

본 발명을 이용할 수 있는 개체는 임의 포유류 종 또는 척추동물종이 되는데, 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 가금류(닭), 염소, 고양이, 개, 헴스터, 생쥐, 들쥐, 원숭이, 토끼, 침팬지 및 사람이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 구체예에서는 개체는 사람이 된다.

5.3.1. 암의 치료 및 예방

본 발명은 결합쌍의 일원이 되는 특정암항원의 존재로 특징지어지는 암의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 치료제, 예를 들면, 특정암항원에 면역특이적으로 결합하는 인공 변형 항체(또는 이의 기능적 활성단편)를 이런 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 것으로 이루어지고, 상기 항체는 암항원에 대한 결합부위의 아미노산서열을 보유한 CDR를 가진 변이도메인으로 이루어진다.

신형성, 종양, 전이 또는 조절이 안되는 세포 생장을 특징으로 하는 임의 질병을 포함하는 암은 본 발명의 인공변형항체를 투여함으로써 치료 및 예방할 수 있는데, 상기 변형항체는 하나 또는 복수의 항원과 면역특이적으로 결합하고, 상기 항원은 치료 또는 예방할 암의 암세포와 관계한다. 특정 치료요법이 일정형태의 암의 예방 또는 치료에 효과가 있는 가의 여부는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있는데, 이런 방법의 예는 단락 5.6에 제시하였지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

가령, 다음의 암 및 종양항원과 관련된 암 및 종양은 CDR상에 이들 암항원을 인식하는 서열을 보유한 본 발명의 인공항체를 투여하여 치료 또는 예방한다: KS1/4 범-암(종)항원(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:32-37; bumal, 1988 Hybridoma7(4):407-415), 난소암 항원(CA125)(Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):48-475), 전립선산 인산염(Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):4928), 전립선특이적 항원(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230), 흑색종-관련 항원p97(Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44), 흑색종 항원gp75(vijayasardahl et al., 1990. J. Exp. Med. 171(4):1375-1380), 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA)(Natali et al., 1987, Cancer 59:55-3; Mittelman et al., 1990, j. Chin. invest 86:2136-2133). 전립선 특이적 막 항원, 태아성 암(종) 항원(CEA)(Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294), 다형성 내피 무친 항원, 사람 유지방 구체항원, 결장직장암-관련 항원(예, CEA, TAG-72(Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52:3402-3408), C017-1A(Ragnhammar et al., 1993, Int, J. Cancer 53:751-758); GICA 19-9(Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2:135), CTA-1, LEA), 벌키트 림프종 항원 38.13, CD19(Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-1336), 사람 b-림프종 항원-CD20(Reff et al., 1994, Blood 83:435-445), CD33(Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), 흑색종 특이적 항원(예, 강글리시드 GD2(Saleh et al., 1993, J. Immunol. 151,3390-3398), 강글리시드 GD3(Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother, 36:373-380), 강글리시드 GM2(Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), 강글리시드 GM3(Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53:5244-5250)), 종양-특이적 이식 형태의 세포-표면 항원(TSTA)(예, T-항원 DNA 종양 바이러스와 RNA 종양 바이러스의 외피항원을 비롯한 바이러스-유도 종양항원), 신생종양 항원-알파-태아단백질(예, 결장의 CEA), 방광 종양 신생종양 항원(Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2218), 분화항원(예, 사람 폐암(종) 항원 L6,L20(Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923)), 섬유육종의 항원, 사람 백혈병 T 세포 항원-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403), 신당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원(예, EGFR(상피 생장인자 수용체)), HER2 항원(p185^HER2), 다형성 내피 무친(PEM)(Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359), 악성 사람 림프구 항원-APO-I(Bernhard et al., 1989, Science 245:301-304), 분화항원(Feizi, 1985, Nature 314:53-57)(예, 신생 적혈구 및 일차 내배엽에서 발견되는 I 항원), 위 선암종에서 발견되는 I(Ma), 유방 내피에서 발견되는 M18 및 M39, 골수성세포에서 발견되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장직장암에서 발견되는 D₁56-22, TRA-1-85(혈액 그룹 H), 결장 선암(종)에서 발견된 C14, 폐 선암(종)에서 발견된 F3, 위암에서 발견된 AH6, Y 합텐, 태아 암(종)세포에서 발견된 Le^y, TL5(혈액 그룹 A), A431 세포에서 발견된 EGF, 췌장암에서 발견된 E₁시리즈(혈액 그룹 B), 태아 암(종)세포에서 발견된 FC10.2, 위 선암종, 선암(종)에서 발견된 CO-514(혈액 그룹 Le^u), 선암(종)에서 발견된 NS-10, CO-43(혈액 그룹 Le^b), G49, 결장 선암(종)에서 발견된 EGF 수용체(혈액 그룹 ALe^b/Le^y), 결장암에서 발견된 19.9, 위암 무친, 골수세포에서 발견된 T₅A₇, 흑색종에서 발견된 R₂₄, 4.2, G_D3, D1.1, OFA-1, G_M2, OFA-2, G_D2, 태아 암(종)세포에서 발견된 M1:22:25:8, 4-8-세포단계 태아에서 발견된 SSEA-3, SSEA-4. 또 다른 구체예에서, 항원은 피부 T 세포 림프종에서 얻은 T 세포 수용체유도 펩티드이다(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62 참조).

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변형항체로 치료하는 대상은 선택적으로 수술, 방사선치료 또는 화학치료와 같은 다른 암치료법으로 치료한다. 특히, 암을 예방하거나 치료하기 위해 사용하는 본 발명의 치료제는 하나의 화학치료요법 물질 또는 이런 물질의 화합물과 결합하여 투여하는데, 화학치료요법 물질의 예로는 메토트렉세이트, 탁솔, 멀캡토퓨린, 티오구아닌, 수산화요소, 시타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니토로소우레아, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 다카르바진, 프로카비진, 에토포시드, 캠파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 필리카마이신, 미톡산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 팔실리탁셀, 도체탁셀등을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 적절한 구체예에서, 인공변형항체는 화학치료약물, 다른 형태의 독소(예, 리신독소, 방사성핵종), 또는 암이나 종양세포를 죽이거나 암세포생장을 효과적으로 중단시키는 임의의 다른 약물에 결합시킨다. 또 다른 적절한 구체예에서, 변형 면역글로불린은 암항원에 대한 결합위치를 보유한 하나의 CDR, 면역세포의 표면분자에 대한 결합위치를 보유한 또 다른 CDR을 보유하며, 상기 면역세포의 예로 T 세포, B 세포, NK 세포, K 세포, TIL 세포 또는 호중구를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

인공변형항체의 CDR에 아미노산 서열이 포함되고, 상기 아미노산 서열은 결장암(종)-관련 단백질 항원에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 특정 구체예에서, 항체는 다음과 같은 특징을 갖는 것이 바람직하다: (9) 항체는 항원의 단백질성분의 에피토오프를 인식하나, 항원의 탄수화물 성분의 에피토오프는 인식하지 못한다; (ii) 항원은 정상사람조직에서 검출되지 않는다; (iii) 항원은 결장암세포를 제외한 사람 암(종)세포에서 검출되지 않는다. 다른 구체예에서, 인공변형항체의 CDR에는 항원에 면역특이적으로 결합하는 아미노산이 포함되고, 상기 항원은 유방암(종)세포를 제외한 사람 암(종)에서는 검출되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 인공변형항체의 CDR에는 항원에 면역특이적으로 결합하는 아미노산이 포함되고, 상기 항원은 난소암(종)세포를 제외한 사람 암(종)에서는 검출되지 않는다.

5.3.1.1. 악성(종)암

본 발명의 투여로 치료하거나 예방할 수 있는 악성암이나 다른 관련질환은 표3에 제시한 것들을 들 수 있지만, 이들에 한정하지 않는다(fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia 참조)

표3

악성암 및 관련 질환

백혈병

급성 백혈병

급성 림프구성 백혈병

급성 골수성 백혈병

골수아구성

전골수성

골수성단구

단구성

적백혈병

만성 백혈병

만성 골수성 백혈병

만성 림프구성 백혈병

진성 적혈구 증가증

림프종

홉킨스병

비-홉킨스병

다발성 골수종

발렌스트룀의 매크로글로불린 혈증

H 사슬 질병

고형암

육종 및 암(종)

섬유육종

점액육종

지방육종

연골육종

골육종

척(수)삭종

맥관 육종

내피 육종

림프관 육종

림프관내피 육종

활악종

중피종

유잉종양

평활 근육종

결장암(종)

췌장암

유방암

난소암

전립선암

편평 세포암(종)

기저 세포암(종)

선암(종)

한선 육종

피(지)선 육종

유두상암(종)

유두상 선암(종)

낭종암(종)

수양암(종)

기관지 암(종)

직장세포 암종

간(세포)암

담관암(종)

융모암(종)

정상피종

태생암(종)

윌름 종양

경부암

자궁암

고환종양

폐암(종)

소세포폐암(종)

방광암(종)

상피암(종)

신경교종

신경(교) 세포종

수아세포종

두 개 인두(관)종

상의 세포종

송과체종

현관아(세포)종

청신경초종

희<핍>돌기 교종

수막종

흑색종

신경아세포종

망막아세포종

특정 구체예에서, 악성암 또는 이상증식변화(전이 및 형성이상), 또는 초 증식질환은 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장, 자궁, 위장관, B 림프구 또는 T 림프구에서 치료하고 예방한다. 또 다른 구체예에서, 육종, 흑색종 또는 백혈병을 치료하고 예방한다.

5.3.1.2. 전암 질환

본 발명의 치료물질은 전암 질환를 치료하고, 신생종양 또는 악성암상태로 진전되는 것을 예방하기 위하여 투여하는데, 이런 악성암의 예는 표3에 제시하지만, 이들에 예에 한정하지 않는다. 이런 예방 또는 치료요법적 용도는 신생종양 또는 암으로의 진전되는 것으로 공지된 또는 추측되는 질환, 특히, 비-신생종양 세포생장이 과형성, 이형성으로 이루어지는 경우, 이 중에서도 특히 형성장애가 발생하는 경우에 처방된다(비정상적 생장상태의 검토를 위해서는 Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.8-79 참조). 과형성은 조직 또는 장기에서 세포수의 증가를 포함하여 통제된 형태의 세포증식으로 구조 또는 기능에 별다른 변화가 없다. 한가지 예를 제외하고, 자궁내막 과형성은 종종 자궁내막암을 선행한다. 이형성은 통제된 형태의 세포생장으로, 일형의 성숙 또는 완전분화된 세포가 다른 형태의 성숙세포로 치환된다. 과형성은 내피 또는 연결조직세포에 발생할 수 있다. 일반적인 과형성에는 다소의 무질서한 과성 내피세포가 관계한다. 형성장애는 암을 빈번하게 전조하고, 주로 내피에서 발견된다; 이것은 가장 무질서한 형태의 비-신생종양세포 생장으로, 여기에는 개별 세포의 통일성 및 세포의 조직적 방향성 상실이 일어난다. 형성장애 세포는 종종 비정상적으로 크고, 진하게 착색된 핵을 갖고, 다형성을 보인다. 형성장애는 특이적으로 만성적 발적 또는 염증이 있는 곳에 발생하고, 주로 경부, 호흡기, 구강, 담낭에서 발견된다.

과형성, 이형성 또는 형성장애로 특징지어지는 비정상적 세포생장의 존재에 더하여, 환자의 세포샘플에 의해 생체내 및 시험관내에서 드러나는 형질전환된 표현형 또는 악성 표현형의 하나 또는 복수 특징의 존재는 백신조성물의 예방/치료 필요정도의 척도가 된다. 앞에서 언급한 바와 같이, 이런 형질전환된 표현형의 특성에는 형태변화, 느슨해진 기증부착, 접촉억제의 상실, 유지의존의 상실, 프로테아제 방출, 당전달증가, 혈청필요의 감소, 태아항원의 발현, 250,000 달톤의 세포 표면 단백질의 소멸등이 포함된다(형질전환된 또는 악성표현형과 관련된 특성을 검토하려면 상기 동일 자료 pp. 84-90 참조).

특정 구체예에서, 백반증, 내피의 양성-과형성 또는 형성장애 병소, 또는 보우인병(in situ 암종)은 예방 개입 필요성의 기준이 되는 선-종양 병소다.

다른 구체예에서, 섬유세포 질환(포낭 과형성, 유방 형성장애, 특정 선증(양성 내피 과형성)은 예방 개입 필요성의 기준이 된다.

또 다른 구체예에서, 악성암에 대한 하나 또는 복수의 근원인자를 보이는 환자는 본 발명의 치료약물 효과량을 투여하여 치료하는데, 이런 인자에는 악성암과 관련된 크로모좀 전좌(예, 만성 골육종 백혈병에 대한 필라델피아 크로모좀, 여포성 림프종에 대한 t(14;18)), 가족특유의 폴리포시스 또는 가드너 증후군(결장암의 전조), 양성 단클론 갬모패시(다중 흑색종의 전조), 멘델의 유전패턴(예, 가족특유의 결장암 폴리포시스, 가드너 증후군, 유전적 엑소스토시스, 다내분비 선종증, 아밀로이드 생산 및 크롬친화세포종을 가진 골수흉선암(종), 포이츠-제이어 증후군, 본 렉클링그하우젠의 신경교종증, 망막아세포종, 경동맥 체암, 피부 흑색암(종), 망막내 흑색암(종), 피부건조증 색소성, 운동실조 모세관확장증, 체디아크-히가시 신드롬, 피부백변증, 프랑코니 재생불량성빈혈, 블룸증후군)을 보이는 암 또는 전암성 질환에 걸린 사람과의 일차관계가 있다(Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113 참조).

또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 치료제를 사람환자에게 투여하여 난소, 유방, 결장, 폐, 췌장, 피부, 전립선, 위장, B 림프구, T 림프구 또는 자궁의 암, 흑색종 또는 육종으로의 진전을 예방한다.

5.3.2. 감염성 질환의 치료

본 발명은 또한 본 발명의 치료제, 특히, 인공 변형 면역글로불린(또는 이의 기능적 활성단편)을 투여하여 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 면역글로불린 분자는 감염성 질환을 유발하는 병인의 항원, 감염성 질환병인에 대한 세포 수용체, 또는 감염성 질병병인에 의해 발현된 효소에 면역특이적으로 결합한다. 후술한 바와 같이 감염성병인에는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 기생균이 포함되는데, 이들에 한정하지 않는다.

특정 구체예에서, 감염성 질환은 본 발명의 면역글로불린의 변형된 항체(또는 이의 기능적 활성단편)를 투여하여 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 변형항체는 다음의 감염성 질환병인의 항원중 하나를 특이적으로 인식한다: 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Genbank accession no. J02132; Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:739-743; Newton et al., 1983, Virology 128:495-501), 사람 호흡기 합포체성 바이러스 G 당단백질(Genbank accessionno. Z33429; Garcia et al., 1994, J. Virol.; Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:783), 뎅그바이러스의 심부 단백질, 모체 단백질 또는 다른 단백질(Genbank accession no. M19197; Hahn et al., 1988, Virology 12:17-180), 홍역바이러스 헤마글루티닌(Genbank accession no. M81899; Rota et al., 1992, Virology 188:135-142), 단수포진바이러스 2형 당단백질 gB(Genbank accession no. M14923; Bzik et al., 198, Virology 155:322-333), 폴리오바이러스 I VP1(Emini et al., 1983, Nature 304:99), HIV I의 외피 당단백질(예, gp120, Putney et al., 198, Science 234:1392-1395), B형 간염 표면항원(Itoh et al., 198, Nature 308:19; Neurath et al., 198, Vaccine 4:34), 디프테리아 독소(Audibert et al., 1981, Nature 289:543), 스트렙토콕커스(Streptococcus) 24M 에피토오프(Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193), 고노콕커스 필린(Gonococcal pilin)(Rothbard and Schoolnik, 1985, Adv, Exp. Med. Biol. 185:247), 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 g50(gpD), 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 당단백질 H, 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 당단백질 gIII(gpC), 전파가능 위장염 당단백질 195, 전파가능 위장염 모체단백질, 돼지 로타바이러스 당단백질 38, 돼지 파르보바이러스 캡시드 단백질, 설푸리나 히도디센테리아(Serpulina hydodysenteriae)보호 항원, 소 바이러스성 설사 당단백질 55, 뉴캐슬 질환 바이러스 헤마글루티닌-뉴우라미니다제, 돼지 감기 헤마글루티닌, 돼지 감기 뉴우라미니다제, 구제역 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 미코플라스마 히포프뉴모니아(Mycoplasma hypopnemoniae), 감염성 소 비강기관염 바이러스(예, 감염성 소 비강기관염 바이러스 당단백질 E 또는 당단백질 G), 감염성 후두기관염 바이러스(에, 감염성 후두기관염 바이러스 당단백질 G 또는 당단백질 I), 라 크로제(La Crosse)바이러스의 당단백질(Gonzales-scarano et al., 1982, virology 120:42), 태아소 설사 바이러스(Matsuno and Inouye, 1983, Infection and Immunity 39:155), 베네주엘라 말 뇌척수염 바이러스(Mathews and Roehrig, 1982, J. Immunol. 129:273), 푼타 토로 바이러스(Dalrymple et al., 1981, in Replication of Negative Strand Viruses, Bishop and Compans(eds.),Elsevier, NY, p.17), 뮤린 백혈병 바이러스(Steeves et al., 1974, J. Virol. 14:187), 생쥐 유방 종양 바이러스(Massey and Schochetman, 1981, Virology 115:20), B형 간염바이러스 심부 단백질 또는 B형 간염바이러스 표면항원(U.K.Patent Publication No. GB 2034323A published June 4, 1980; Ganerm and Varmus, 1987, Ann, Rev. Biochem. 5:51-93; Tiollais et al., 1985, Nature 317:489-495 참조), 말 인플루엔자 바이러스 또는 말 헤르페스바이러스의 항원(예, A형(말 인플루엔자 바이러스/알래스카 91 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/마이애미 63 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/켄터키 81 뉴우라미니다제, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 B, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 D), 소 호흡기 합포체성 바이러스 또는 소 파라인플루엔자 바이러스(예, 소 호흡기 합포체성 바이러스 부착단백질(BRSV G), 소 호흡기 합포체성 바이러스 융합단백질(BRSV F), 소 호흡기 합포체성 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(BRSV N), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 융합 단백질, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 헤마글루티닌 뉴우라미니다제), 소 바이러스성 설사 바이러스 당단백질 48, 소 설사바이러스 당단백질 53.

세포 수용체에 결합하는 병원균과 함께, 감염성 질병치료의 표적이 되는 세포 수용체의 목록은 표4에서 제시한다.

표4

본 발명 방법으로 치료 또는 예방할 수 있는 바이러스 질병에는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진바이러스 I형(HSV-I), 단순포진 II형(HSV-II), 우역, 코감기바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 합포체성 바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노 바이러스, 아르보바이러스, 한탄바이러스, 콕사키 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 폴리오바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 I형(HIV-I), 사람 면역결핍 바이러스 II형(HIV-II), 피코르나바이러스, 엔테로바이러스, 칼리시비리드아(caliciviridae), 노르워크 바이러스 그룹, 토가바이러스(에, 덩그바이러스), 알파바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라비즈 바이러스, 마르버그 바이러스, 에볼라바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 I형, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 II형, 유인원 면역결핍 바이러스, 렌티바이러스, 폴로오마바이러스, 파르보바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 사람 헤르페스바이러스-6, 원숭이 헤르페스바이러스 1(B 바이러스), 팍스바이러스에 의해 유발된 질병이 포함되지만, 이들에 한정하지 않는다.

본 발명의 방법으로 치료 또는 예방할 수 있는 박테리아 질병에는 미코박테리아 릭케차(Mycobateria rickettsia), 미코플라스마(Mycoplasma), 네이세리아종(예, Neisseria mennigitidis, neisseria gonorrhoeae), 레지오넬라(legionella), 시겔라종(Shigella spp.,), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 스트렙토콕커스속(예, Streptococcus pneumoniae), 코르네박테리아 디프테리아(Cornebacteria diphtheriae), 파상풍균(Clostridium tetani), 보르데텔라 펄투시스(Bordetella pertussis), 해모필러스종(Haemophilus spp.,), 클라미디아종(Chlamydia spp.,), 장관 독원성 대장균(Escherichia coli)을 포함하나 이들에 한정하지 않는 박테리아에 의해 유발된다.

본 발명의 방법에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 원생동물 질환에는 말라리아, 아이메리아, 레시마니아, 코크지디오아, 트리마노소마, 곰팡이(예, 캔디다)를포함하나 이에 한정하지 않는 원생동물에 의해 야기된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 치료약물은 적당한 항생제, 항-진균제, 항-바이러스제 또는 감염의 질병의 치료 또는 예방에 유용한 다른 약물과 결합하여 투여한다. 적절한 구체예에서, 인공변형항체는 인공변형항체가 목표로 하는 감염성 질환병인에 대해 효과적인 화합물과 접합되는데, 이런 화합물에는 항생제, 항진균제 또는 항-바이러스제가 있다. 또 다른 적절한 구체예에서, 변형면역글로불린은 감염성 질병병인의 항원에 대한 결합위치를 보유한 하나의 CDR, 면역세포의 표면분자에 대한 결합위치를 보유한 또 다른 CDR로 이루어지고, 상기 면역세포의 예로 T 세포, B 세포, NK 세포, K 세포 또는 호중구를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

5.3. 3 유전자 치료법

특정 구체예에서, 본 발명의 인공변형항체를 인코드한 서열로 이루어진 핵산을 투여하여 인공변형항체가 면역특이적으로 결합하는 분자의 발현과 관련된 질환 및 이상을 치료 또는 예방한다.

본 발명의 구체예에서, 치료핵산은 본 발명의 변형면역글로불린을 세포내(리드서열 없음) 또는 세포사이(리드서열 있음)에 만드는 서열을 인크드한다.

당분야에 사용가능한 유전자치료법중 임의의 방법을 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 전형적인 방법은 아래에 제시한다.

유전자 치료방법의 일반적 검토를 위해, Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu 1991, Biocherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217을 참조한다. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술분야에서 일반적으로 공지된 방법은 Ausubel et al., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY에서 제시한다.

한 측면에서, 치료핵산은 적당한 숙주에서 변형된 면역글로불린 분자를 발현하는 발현벡터를 포함한다. 특히, 이런 핵산은 변형된 인공항체에 대한 코딩서열과 선택적으로 결합하는 프로모터를 갖고, 상기 프로모터는 유도되거나 작제되고, 선택적으로 조직특이적이다. 또 다른 구체예에서, 항체코딩서열 및 임의의 다른 원하는 서열이 게놈상의 원하는 위치에 상동성 재조합을 촉진하는 영역과 측면에 서 접하는 핵산을 사용하여 변형항체를 크로모좀내에서 발현시킨다(Koller and Smithies, 1989, Proc. Nat'l. Acad. Sci. Usa 86:8932-8935; Zijistra et al., 1989, Nature 342:435-438).

핵산의 환자로의 전달은 직접적일 수 도 있고, 이 경우, 환자는 핵산 또는 핵산-전달 벡터, 또는 전달복합체에 직접 노출되고, 간접적일 수도 있는데, 이 경우 세포는 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환되고, 이후 환자로 이식된다. 이들 두 방식은 각각, 공지된 생체내 또는 탈체 유전자치료법이다.

특정 구체예에서, 핵산은 집적 생체내로 투여하는데, 이 경우, 이것은 발현되어 항체를 생산한다. 이것은 당분야에 공지된 수많은 방법중 임의의 방법으로 성취할 수 있는데, 예를 들면, 이것을 적당한 핵산 발현벡터의 일부로 작제하고 이를 투여하여 세포내에 위치하도록 하여, 결함성 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용하여(U.S.Patnet No. 4,980,286 참조), 나체 DNA를 직접주사하여, 미세입자 폭발(예, 유전자 총: Biolistic, Dupont)을 사용하여, 지질, 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션 약물로 코팅하여, 생중합체(예, poly-β-1->4-N-아세틸글로코사민 폴리사카라이드; U.S. Patent No. 5,635,493 참조)형태의 캡슐화, 리포좀형태의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 핵에 들어가는 것으로 알려진 펩티드에 이것을 연결하여 투여하거나, 또는 수용체-매개의 엔도사이토시스의 표적리간드에 이것을 연결하여 투여한다(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 또 다른 구체예에서, 핵산-리간드 복합체를 만들 수 있는데, 여기서 리간드는 엔도좀을 교란하는 융합원성 바이러스 펩티드를 포함하여 핵산이 리포좀 분해를 피하도록 한다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 특정 수용체를 사용하여 세포 특이적 흡착 및 발현에 대한 생체내 표적화 할 수 있다(PCT Publications WO92/06180 dated April 16, 1992(Wu et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992(Wilson et al.); WO92/20316 dated November 26, 1992(Findeis et al.); WO93/14188 dated July 22, 1993(Young) 참조). 다른 방법으로, 핵산은 상동성 재조합으로, 세포내에 도입하고 발현용 숙주 세포 DNA 사이에 삽입할 수 있다(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

다른 방법으로, 단일사슬항체는 당분야에 공지된 기술을 사용하여 표적세포개체군내 단일사슬항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현하여 투여할 수 있다(Marasco et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893). 아데노바이러스는 유전자치료법에 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터다. 아데노바이러스는 특히 호흡기 에피텔리아에 유전자를 전달할 수 있는 매력적인 운반체로, 이들은 호흡기 상피에서 경미한 질병을 유발한다. 아데노바이러스-기초 전달계에 대한 다른 표적은 간, 중추신경게, 내피 세포, 근육이 된다. 아데노바이러스는 비-분열세포를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. Kozarsky 및 Wilson (1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503)은 아데노바이러스-기초 유전자 치료법의 개관을 제시한다. Bout등(1994, Human Gene Therapy 5:3-10)은 레서스 원숭이의 호흡기 에피텔리아로 유전자를 전달하는 방법을 밝힌다. 유전자치료법에 아데노바이러스의 다른 사용예는 Rosenfeld et al., 1991, Science 252:432-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234에서 발견할 수 있다. 아데노-관련 바이러스(AAV) 또한 유전자치료법에 사용이 고려되고 있다(Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 204:289-300).

사용하기 위한 치료핵산의 형태와 양은 질병의 형태, 원하는 효과의 정도, 환자상태에 따라 달라지며, 당업자가 결정할 수 있다.

5.3.4. 백신면역화

본 발명의 변형항체는 개체에 백신으로 사용하는데, 여기서 특정 분자 또는 항원의 결합위치에 대한 면역화가 바람직하다. 본 발명의 백신 및 방법은 질환을 예방하거나 또는 특정 질환 또는 이상을 치료하는데 하는데 사용하는데, 이때, 특정 인공항체에 대한 항-유전형 반응은 치료 또는 예방적으로 유용하다.

본 발명의 방법 및 조성물은 개체에 백신의 인공항체에 대한 체액 또는 세포-매개 반응의 유도에 사용한다. 특정 구체예에서, 상기 방법 및 조성물은 개체에서 투여된 인공항체에 대한 체액반응을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법 및 조성물은 개체에서 투여된 인공항체에 대한 세포-매개반응을 유도한다. 또 적절한 구체예에서, 상기 방법 및 조성물은 체액 및 세포-매개 반응 모두를 유도한다.

5.4. 제약학적 조성물 및 투여방법

5.4. 1. 조성물 및 투여

본 발명의 따른 용도에서 변형된 면역글로불린을 함유한 치료조성물은 하나 또는 복수의 생리적으로 수용가능한 담체 또는 부형체를 사용한 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.

따라서, 변형된 면역글로불린(또는 이의 기능적 활성단편, 항체를 인코드한 핵산), 이의 생리적으로 수용가능한 염, 용매는 흡입 또는 취입(입 또는 코를 통해)에 의한 투여, 또는 경구, 구강, 장관외 또는 직장투여용으로 만들 수 있다.

경구 투여의 경우, 치료제는 정제 또는 캡슐의 형태를 취하고 소결제(예, 선젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필 메틸셀를로즈); 필터(예, 락토오즈, 미크로크리스틸린 셀룰로즈 또는 수소인산화칼슘); 윤활제(예, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 정제분해물질(예, 감자전분 또는 전분글리콜산나트륨); 또는 습윤제(예, 라울황산나트륨)와 같은 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, 통상적인 방법으로 만들어진다. 경구 투여용 액체제제는 용액, 시럽 또는 현탁액 형태를 취하거나, 또는 이들은 사용전에 물 또는 다른 적절한 운반체와 구성되는 건조산물로 만들어질 수 있다. 이런 액체 제제는 현탁물질(예, 소비톨 시럽, 셀룰로즈 유도체 또는 수소첨가된 식용지방); 유화제(예, 렉틴 또는 아카시아); 비-수용성 담체 (예, 알몬드 기름, 유성 에스테르 또는 분류된 야채기름); 방부제(예, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 제제는 완충염, 조미료, 착색제, 감미료를 적당히 포함할 수 있다.

경구 투여용 제제는 활성화합물의 조절방출되도록 적절히 조제한다.

구강 투여의 경우, 치료제는 통상적인 방법으로 조제된 정제 또는 (마름모꼴)정제형태를 취한다.

흡입 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하는 치료제는 적당한 산화제(예, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로디플루오르메탄, 디클로로테트라플루오르에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체)를 사용하여 일정 기압이 유지되는 팩 또는 자동판매기에서 에어로졸 스프레이 형태로 용이하게 전달한다. 압력을 일정하게 유지한 에어로졸의 경우에, 약량단위는 미터단위로 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정한다. 흡입기 또는 취입기에 사용하는 젤라틴의 캡슐 또는 약포는 화합물 및 락토오스 또는 자당과 같은 적당한 분말의 혼합분말을 함유하도록 제조한다.

화합물은 주사, 예를 들면, 거환주사 또는 연속주입하여 장관외 투여용으로 제조한다. 주사용 조성물은 첨가된 방부제로 단위 약량으로, 예를 들면, 앰플 또는 다중약량 용기형태에 담아 제조한다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성이나 수용성 담체에 녹인 유제와 같은 형태를 취하고, 현탁약물, 안정화약물 및/또는 확산제와 같은 조성약물을 함유한다. 다른 방법으로, 활성성분은 사용전 적당한 담체, 예를 들면, 피로겐-무(無) 멸균수와 함께 구성되는 분말형태로 존재한다.

치료제는 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약염기를 함유한 좌약 또는 보유관장제와 같은 직장 조성물로 만들 수 있다.

이전에 밝힌 조성물을 비롯하여, 치료제는 저장제제로 만들 수 있다. 이런 장기간 작용 조성물은 주입(예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사하여 투여할 수 있다. 따라서, 화합물은 적당한 공중합성 또는 소수성 물질(가령 수용가능한 기름에 녹인 유제) 또는 이온 교환 레신을 가지고 만들거나, 또는 난분해성 유도체, 가령 난분해성 염으로 만들 수 있다.

본 발명의 변형 면역글로불린은 개별 조성물 또는 통상의 화학적 또는 분자생물학적 방법을 연결한 하나이상의 항체를 가진 단일 조성물로 투여한다. 또한, 본 발명의 항체의 진단 및 치료가치는 방사성핵종, 리신과 같은 독소, 또는 메토트렉세이트와 같은 화학치료약물과 병용하여 사용함으로써 확장된다.

원하는 경우 조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충제 소량을 함유할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유제, 정제, 알약, 캡슐, 연속방출제제 또는 분말이 된다. 경구 조성물은 제약학적 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘, 스테아르산염, 소디움 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘과 같은 표준 담체가 포함할 수 있다.

일반적으로, 성분은 단위약량형태로 개별적으로 또는 혼합하여 제공하는데, 이들의 형태는 밀봉된 용기상의 동결건조 분말 또는 무수 농축물이 되고, 상기 용기의 예로는 활성성분의 양을 지시하는 앰플 또는 사키트를 들 수 있다. 조성물을 주사투여하는 경우, 멸균희석액의 앰플을 제공하여 투여전 성분을 혼합한다.

본 발명은 또한 제약학적 팩 또는 키트를 제공하는데, 이들은 하나 또는 복수의 본 발명 백신조성물 성분으로 채워진 하나 또는 복수용기로 이루어진다. 이런 용기는 제약물 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절에 관한 정부당국의 지침을 따르며, 사람에게 투여시 제조, 사용 또는 판매를 주관하는 당국의 승인을 받아야 한다.

원하는 경우, 조성물은 팩 또는 자동판매장치로 제공하는데, 이들은 활성성분을 함유한 하나 또는 복수 단위약량을 보유한다. 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 조각으로 이루어진다. 픽 또는 자동판매장치는 투여지침을 따른다. 상보적인 제약학적 담체형태로 만들어진 본 발명화합물을 포함한 조성물을 또한 만들어, 적당한 용기에 담고, 지정된 질환치료용으로 표지한다.

많은 방법을 사용하여 본 발명의 백신조성물을 도입할 수 있다; 이런 방법의 예로는 경구, 대뇌내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내 경로, 방혈(두 갈래로 나눠진 바늘을 사용하여 피부 최상층 긁기), 또는 다른 임의의 면역화 경로를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

조성물 형태로 사용하는 변형 면역글로불린 분자의 정확한 일일약량은 투여의 경로, 환자의 상태에 따라 달라지는데, 표준임상기술에 따라 의사 및 각 환자의 여건을 고려하여 결정한다. 효과적인 면역량은 백신제제를 투여할 숙주에 변형면역글로불린에 대해 면역반응을 유발하기에 충분한 양이 된다. 효과적 일일약량은 동물모델시험장치에서 얻은 약량-반응곡선으로부터 추정할 수도 있다.

5.4.2. 효과량

이 글에서 밝힌 화합물 및 핵산서열의 제약학적 효과량을 환자에게 투여하여 암 또는 감염성 질병과 같은 특정 질환 또는 이상을 치료할 수 있다. 치료효과량은 처리된 개체의 건강에 유익한 결과를 보이는 화합물의 충분량을 의미한다.

화합물의 독성 및 치료효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준방법, 예를 들면, LD₅₀(50% 개체군의 치사량) 및 ED₅₀(50% 개체군에서 효과적인 약량)을 결정하여 정할 수 있다. 독성과 치료효과사이의 약량비율은 치료지표가 되며, IC₅₀/ED₅₀으로 표현할 수 있다. 독성부작용을 보이는 화합물을 사용할 수 있는데, 이 경우 이런 화합물이 영향을 받는 조직위치를 표적으로 하도록 하는 전달계를 고안하여 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 줄이도록 노력한다

세포배양분석 및 동물연구로부터 얻은 결과를 이용하여 사람에서 사용할 약량범위를 만들 수 있다. 이런 화합물의 약량은 가급적 독성없이 ED₅₀을 포함하는 순화농도범위내에 존재한다. 약량은 이용한 투여형태, 투여경로에 따라 상기 범위내에서 변한다. 본 발명 방법에 사용한 임의의 화합물의 경우, 치료효과량은 초기에 세포배양분석에서 평가할 수 있다. 1회분량은 세포배양에서 결정한 바와 같이 IC50을 포함하여 순환혈장 농도범위를 성취하도록 동물모델에서 제조한다. 이런 정보는 사람에서 유용한 1회분량을 좀더 정확하게 결정하는데 사용한다. 혈장수준은 고성능액체크로마토그래피로 측정할 수 있다.

5.4.3. 백신 조성물 및 투여

본 발명은 또한 본 발명의 치료제을 함유한 백신조성물을 제공하는데, 상기 백신조성물은 특정 항원에 대한 보호면역(체액 및/또는 세포 매개)반응을 유도하기 위한 투여에 적절하다.

이런 백신의 적당한 제제는 주사가능물질(액체용액 또는 현탁액)이 포함된다; 주사하기 전에 용해 또는 현탁에 적당한 고형형태로 만들 수도 있다. 제제는 유화시키거나 또는 펩티드는 리포좀형태로 캡슐로 만든다. 활성면역원성 성분은 종종 부형제와 혼합하는데, 상기 부형제는 제약학적으로 수용가능하고, 활성성분과 상보적이다. 적당한 담체에는 물, 식염수, 완충식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장 수용성버퍼, 이들의 화합물이 있다. 또한, 원하는 경우, 백신제제에는 또한 소량의 첨가물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유제, pH 완화제, 백신의 효능을 증가시키는 항항원체가 포함된다.

효과적인 항항원체의 예로는 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-누-글리세로-3-이드록시포스포릴옥시)-에틸아민을 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다.

항항원체의 효능은 특정 항항원체로 만들어진 주사 면역글로불린에 대한 항-유전형 항체의 유도를 측정하여 결정한다.

조성물은 액체용액, 현탁액, 유제, 정제, 알약, 캡슐, 지속방출 제제 또는 분말이 될 수 있다. 경구 조성물에는 제약학적 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘, 스테아르산염, 소디움 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘과 같은 표준 담체가 포함될 수 있다.

일반적으로, 성분은 단위약량형태로 개별적으로 또는 혼합하여 제공하는데, 이들의 형태는 밀봉된 용기상의 동결건조 분말 또는 무수 농축물이 되고, 상기 용기의 예로는 활성성분의 양을 지시하는 앰플 또는 사키트를 들 수 있다. 조성물을 주사투여하는 경우, 멸균희석액의 앰플을 제공하여 투여전 성분을 혼합한다.

특정 구체예에서, 동결건조된 본 발명의 변형 면역글로불린은 제 1 용기로 제공하고; 제 2 용기에는 50% 글리세린, 0.25% 페놀, 방부제(예, 0.005% 브릴런트 그린)의 수용성 용액으로 이루어진 희석액이 담겨진다.

본 발명은 또한 제약학적 팩 또는 키트를 제공하는데, 이들은 하나 또는 복수의 본 발명 백신조성물 성분으로 채워진 하나 또는 복수용기로 이루어진다. 이런 용기는 제약물 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절에 관한 정부당국의 지침을 따르며, 사람에게 투여시 제조, 사용 또는 판매를 주관하는 당국의 승인을 받아야 한다.

원하는 경우, 조성물은 팩 또는 자동판매장치로 제공하는데, 이들은 활성성분을 함유한 하나 또는 복수 단위약량을 보유한다. 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 조각으로 이루어진다. 픽 또는 자동판매장치는 투여지침을 따른다. 상보적인 제약학적 담체형태로 만들어진 본 발명화합물을 포함한 조성물을 또한 만들어, 적당한 용기에 담고, 지정된 질환치료용 표지한다.

백신을 투여하는 개체는 가급적 포유동물, 가장 적절하게는 사람이지만, 사람이외의 동물이 될 수 있는데, 예로는 소, 말, 양, 돼지, 닭(예, 병아리), 염소, 고양이, 강아지, 햄스터, 생쥐 또는 쥐를 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다.

다양한 방법을 이용하여 본 발명의 백신 조성물을 도입시키는데, 예를 들면, 구강, 뇌, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 통하여 또는 난자법(양쪽으로 갈라진 바늘을 이용하여 피부의 윗층으로부터 긁어냄) 또는 면역화과정의 표준 경로에 이용되는 다른 방법을 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 난자법이 이용되었다.

조제에 이용되는 변형된 면역글로불린 분자의 정확한 약량은 투여 경우, 환자의 특징에 따라 달라지고, 이는 표준 임상 기술에 따라 의사가 판단해야 한다. 효과적인 면역화 양은 백신 조제물을 투여하는 숙주에서 변형된 면역글로불린에 대한 면역 반응(가령, 항-이디오타입 반응)을 만들 수 있는 충분한 양이 되어야 한다. 동물 모텔 시험에서 유도한 약향 반응 곡선에서 외삽에 의해 효과적인 약량을 구할 수 있다.

5.5. 진단 방법

여기에서 설명하는 것과 같이 결합쌍의 함 멤버인 특정 분자에 결합하는 변형 면역글로불린 특히 항체( 및 이의 기능적으로 활성이 있는 단편)을 이용하여 진단 및 예후를 할 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명은 결합쌍 멤버의 측정 및 이와 같은 측정을 임상 응용에서 이용할 수 있는 용도를 제공한다. 본 발명의 변형 면역글로불린은 생물학적 시료에서 항원을 감지하는데 이용하는데, 환자는 변형 면역글로불린이 결합하는 분자가 비정상적으로 많은지 또는 이와 같은 비정상적인 형태의 분자가 존재하는지에 대해 테스트를 받는다. 비정상적인 수준("aberrant levels")은 질병이 없는 개체 또는 신체의 일부에서 수득한 유사한 샘플에 존재하는 표준 수준에 대해 증가 또는 감소된 수준을 말한다. 본 발명의 변형 항체는 진단 또는 예후 기술에 이용되는 키트에 시약으로 포함될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 암 또는 종양 항원 또는 감염성 질환 매체에 면역 특이적으로 결합하는 본 발명의 변형 항체를 이용하여, 암 또는 종양의 항원 또는 감염성 질환 매체의 항원 발현과 관련된 암, 종양 또는 감염성 질환의 진단, 예후 또는 스크리닝을 할 수 있다. 적절한 측면에서, 본 발명은 암 항원이 증가된 것을 특징으로 하는 암이 있는가를 진단, 스크리닝 또는 이를 예측하는 방법을 제공하는데, 이때 암 항원은 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 이 방법은 개체에서 유도된 샘플에 변형 항체의 면역 특이적인 결합 수준을 개체에서 측정하는 것으로 구성되는데, 이때 변형 항체는 암 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 변형 항체는 제2멤버의 적어도 한 개의 CDR을 포함하는 부분을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 이부분에는 암 항원의 결합 부위는 포함되나, CDR내에 자연 발생되는 것은 아니고, 암이 없는 또는 암 발생 성향이 없는 개체에서 수득한 유사한 샘플에 있는 면역 특이적인 결합 수준과 비교하였을 때, 면역 특이적인 결합의 수준이 증가되었다는 것은 개체에 암이 존재하거나 또는 암에 걸릴 성향이 있다는 것을 나타내는 것이다.

또 다른 적절한 구체예에서, 본 발명은 감염성 질환 물질의 항원이 존재하는 것을 특징으로 하는 감염성 질환 매체가 존재하는 지를 스크리닝하거나 진단하는 방법을 제공하는데, 이때 항원은 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 이 방법은 개체에서 유도된 샘플에 변형 항체의 면역 특이적인 결합 수준을 개체에서 측정하는 것으로 구성되는데, 이때 변형 항체는 암 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 변형 항체는 제2멤버의 적어도 네 개 아미모산 부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 포함하는 부분을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 이 부분에는 암 항원의 결합 부위는 포함되나, CDR내에 자연 발생되는 것은 아니고, 감염성 질환을 가지지 않는 개체에서 수득한 유사한 샘플에 있는 면역 특이적인 결합 수준과 비교하였을 때, 면역 특이적인 결합의 수준이 증가되었다는 것은 개체에 감염성 질환 매체가 존재한다는 것을 나타내는 것이다.

또 다른 적절한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 유도된 샘플에 특정 리간드 또는 수용체가 비정상적인 수준으로 존재하는지를 감지하는 방법을 제공하는데, 이때 방법은 정상적인 리간드 또는 수용체 수준을 가지는 샘플에 변형 항체의 면역 특이적인 결합과 특정 리간드 또는 수용체에 결합하는 변형된 항체가 샘플에 면역 특이적인 결합을 비교하여 이루어진다.

변형 항체에 결합되는 분자를 측정하는 것은 개체에 있는 분자와 관련된 질병을 감지하고, 질병의 단계를 파악하는데 가치가 있고, 집단에서 이와 같은 질병을 스크리닝하고, 개체의 생리학적 조건하에 차등적인 진단 및 개체에서 치료의 효과를 모니터하는데 가치가 있다.

다음의 검사는 변형 항체가 면역 특이적으로 결합하는 분자를 감지하는 것으로 고안된 것이다.

특정 구체예에서, 이와 같은 진단 방법을 이용하여, 유전자 발현 수준의 비정상 또는 구조의 이상 또는 검사할 특정 분자의 조직, 세포 또는 세포하부 위치에서의 비정상을 감지한다.

분석할 조직 또는 세포형에는 특정 분자를 발현하는 것으로 알려진 또는 발현할 것으로 보이는 것들이 포함된다. 여기에서 이용되는 단백질 분리 방법은 Harlow and Lane(Harlow, E. and Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)에서 설명하는 것과 같다. 환자 또는 세포 배양물에서 분리된 세포를 유도할 수 있다. 본 발명에 유용한 변형 항체(또는 기능적으로 활성이 있는 이의 단편)은 추가로 조직학에 이용될 수 있는데, 예를 들면 분자를 in situ감지하기 위한 면역형광 또는 면역전자 현미경에 이용된다. in situ감지는 환자로부터 조직학적 견본을 떼어내는데, 가령 질병이 있는 조직을 파라핀에 묻고, 여기에 본 발명의 라벨된 변형 항체를 제공하여 실시한다. 변형 항체(또는 이의 기능적으로 활성이 있는 단편)은 생물학적 샘플위에 얹어서 사용한다. 항체가 결합하는 분자가 세포질에 존재하는 경우에, 세포 내로 침투할 수 있도록 만들어서, 세포내로 변형 항체를 도입시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 과정을 통하여, 특정 분자가 존재하는지 그리고, 검사된 조직에서 이의 분포를 결정할 수 있다. 본 발명을 이용하여, 당업자는 임의 다양한 조직학적 방법(착색 과정)중 임의의 것을 변형시켜, in situ감지를 할 수 있다.

특정 분자의 면역 감사는 일반적으로 생물학적 유체, 조직 추출물, 새로 수득한 세포 또는 배양된 세포 용해물질과 같은 샘플을 감지가능하도록 라벨한 변형 항체 존재하에서 배양시키고, 당분야에 공지된 기술중 안하기를 이용하여 결합된 항체를 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료는 고형 상 서포트 또는 담체 예를 들면 니트로셀룰로오즈 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고형 서포트에 고정시키면 된다. 그 다음 서포트는 적절한 완충액으로 세척시키고, 감지가능한 라벨된 변형 항체로 처리한다. 고형 상 서포트는 그 다음 완충액으로 2회 세척시켜, 결합안된 항체를 제거한다. 고형 상 서포트에 결합된 라벨의 양은 통상적인 수단을 이용하여 측정할 수 있다.

"고형 상 서포트 또는 운반체"는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의 서포트를 말한다. 공지의 서포트 또는 담체에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암, 자석등이 포함된다. 단체의 성질은 본 발명의 목적에 맞게 어느 정도 가용성을 가지거나 불용성이 될 수 있다. 서포트 물질은 실제 결합된 분자가 항원 또는 항체에 결합할 수 있다면, 임의 가능한 구조적 형상을 할 수 있다. 따라서, 서포트의 모양은 비드와 같은 구형, 테스트 관의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면과 같은 실린더형이 될 수 있다. 또는, 표면은 쉬트, 테스트 스트립등과 같이 평편할 수 있다. 적절한 서포트에는 폴리스티렌 비드가 된다. 당업자는 항체 또는 항원에 결합할 수 있는 많은 다른 적절한 담체를 알고 있을 것이고, 일상적인 실험을 통하여 이의 적합성을 확인할 수 있을 것이다.

주어진 변형 항체의 결합 활성은 공지의 방법을 이용하여 결정한다. 당업자는 일상적인 실험과정을 통하여, 적절한 검사 조건을 결정할 수 있을 것이다.

변형 항체가 감지가능하게 라벨시키는 한 가지 방법은 이를 효소 면역검사(EIA)의 이용되는 효소에 연결시키는 것이다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520; Butler, 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523: Maggio. E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL,; Ishikawa et al., (eds,), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo)). 변형 항체에 결합된 효소는 적절한 기질, 바람직하게는 발색성 기질과 반응하여, 분광광도계, 형광측정 또는 눈으로 확인할 수 있는 화학적 부분을 만들게 된다. 변형 항체를 감지가능하게 라벨하는데 이용되는 효소에는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소메라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, 아스파라지나제, 포도당 산화효소, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 포도당-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린에스테라제등이 포함된나, 이에 국한시키지는 않는다. 효소에 대한 발색성 기질을 이용하는 발색 방법을 이용하여 감지할 수 있다. 유사하게 준비된 표준과 비교하여, 기질에서 효소 반응 정도를 시각적으로 비교하여 감지할 수도 있다.

다양한 다른 면역검사를 이용하여 감지할 수도 있다. 예를 들면, 합성 항체 또는 단편을 방사능 활성으로 라벨시켜, 방사능면역검사를 이용하여 단백질을 감지한다(Weintraub, 1986, Principles of Radioimmunoassays, Senventh Traning Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society). 방사능활성 동위원소는 감마 카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사사진등의 수단으로 감지할 수 있다.

형광 화합물로 변형 항체를 라벨할 수도 있다. 형광으로 라벨된 항체는 적절한 파장의 빛에 노출시키면, 형광으로 인하여 이의 존재를 확인할 수 있다. 가장 흔히 이용되는 형광 라벨링 화합물중에는 플로레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈레알데히드 및 플로에스카민등이 있다.

¹⁵²Eu 또는 다른 란탄아미드 시리즈와 같은 형광을 발생시키는 금속을 이용하여 변형 항체를 감지가능하게 라벨시킬 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트 기를 이용하여 항체에 결합시킨다.

변형된 항체는 화학적 발광 화합물에 결합시켜 감지가능하게 라벨시킬 수 있다. 화학적발광물질이 붙은 항체가 존재하는지는 화학반응 동안에 발생하는 발광이 존재하는지를 감지하여 결정한다. 특히 유용한 화학적 발광 라벨링 화합물의 예를 들면, 루미놀, 이소루미놀, 트로메틱 아크리디움 에스테르, 이미다졸, 아크리디움 염, 옥살레이트 에스테르등이 있다.

유사하게, 생물학적 발광 화합물을 이용하여 본 발명의 합성된 변형 항체를 라벨시킨다. 생물학적 발광은 생물학계에서 볼 수 있는 화학적발광형태로 촉매 단백질이 화학적 발광 반응 효과를 증가시킨다. 생물학적 발광 단백질이 존재하는지는 발광을 감지하여 결정한다. 라벨을 목적으로 하는 중요한 생물학적 발광 화합물에는 루시페린, 루시페라제, 아퀴오린등이 있다.

5.6. 치료요법적 용도의 설명

본 발명의 치료요법적 이용은 사람에 사용하기 전에 원하는 치료학적 또는 예방적인 활성이 있는지에 대해 in vitro 및 in vivo에서 테스트한다. 예를 들면, in vivo 검사에는 특정 질환을 가지는 개체의 세포주 또는 배양된 세포에서 취한 적절한 세포를 체료제에 노출시키거나 또는 치료제를 투여하고, 세포에서 치료제의 효과를 관찰하는 것이 포함된다.

치료제가 암 또는 종양 항원을 인지하는 변형 면역글로불린인 경우에, 변형 면역글로불린의 가능한 효과는 배양된 세포(환자 또는 배양된 세포주에서 취한)에 치료제를 접촉시키고, 공지의 수단을 이용하여 세포 생존 또는 생장을 검사하여 검사하는데, 세포 증식은³H-티미딘 결합을 측정하거나, 직접 세포를 헤아리거나 또는 프로토-온코겐 가령, fos, myc 또는 세포 주기 표식과 같은 공지의 유전자의 전사 활성에 변화를 감지하여 검사할 수 있고; 세포 생존능력은 트립판 블루 착색을 통하여 감사할 수 있고, 분화는 형태상의 변화를 기초하여 눈으로 확인할 수 있다.

치료제가 감염성 질환 매체 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체를 인지하는 변형 면역글로불린인 경우에, 항체의 가능한 효과는 감염성 질환 매체에 감염된 세포(환자 또는 배양된 세포주에서 취한)에 치료제를 접촉시키고, 감염성 질환 메체의 감소 또는 감염성 질환 매체의 감염을 나타내는 생리학적 지시물질의 감소에 대해 세포를 검사한다. 또는, 치료제를 감염성 매체에 감염되기 쉬우나, 실제 감염성 매체에 감염되지는 않은 세포에 접촉시키고(환자에서 배양된 또는 배양된 세포주에서 취한), 세포를 감염성 매체에 노출시키고, 치료제와 접촉된 세포의 감염 속도가 치료제가 접촉되지 않은 세포의 감염 속도보다 낮은지를 확인하는 것으로 그 효과를 검사할 수 있다. 감염성 질환 매체에 세포가 감염된 것은 공지의 방법으로 검사할 수 있다.

치료제가 특정 리간드 또는 수용체에 특이적인 변형 면역글로불린인 경우에, 변형 면역글로불린의 가능한 효과는 결합쌍의 수용체 멤버를 발현시키는 세포(환자 또는 배양된 세포주에서 취한)에 치료제를 접촉시키고, 치료제가 수용체에 리간드가 결합하는 것을 방해하거나 또는 수용체 시그날 발생을 방해하거나 또는 치료제가 수용체의 시그날 발생을 자극시키는지를 결정한다. 이와 같은 지시물질은 리간드-수용체 결합 및 수용체 시그날 발생을 측정하는 당분야에 공지의 임의 방법을 이용하여 측정할 수 있다(단락 6참고).

치료제는 적절한 동물 모델에서 그 효과를 평가하거나 사람에서 임상적으로 시험할 수 있다. 치료제의 효과는 당분야에 임의 공지의 방법으로 결장할 수 있는데, 동물 모델 또는 사람 개체에 치료제를 투여한 후에, 동물 또는 사람에서 치료제로 치료하고자 하는 질병의 임의 지시물질에 대해 평가한다. 예를 들면, 치료제의 효과는 치료전후, 치료동안에 적잘한 시간을 두고, 동물 모델 또는 사람에서 변형된 항체가 직접 반응하는 분자의 수준을 측정하여 평가할 수 있다. 분자의 양의 임의 변화 또는 변화가 없는지를 확인할 수 있고, 이는 개체에서 치료효과와 관련된다. 분자의 수준은 당분야에 공지의 방법을 이용하여 결정할 수 있는데, 예를 들면 5.5. 및 5.7에 있는 면역검사 방법을 이용할 수 있다.

또 다른 측면에서, 변형 항체는 합성된 변형 항체가 대항하는 분자와 관련된 특정 질환으로부터 개체가 회복 또는 질병의 개선이 있는 지를 모니터하여 그 효과를 테스트할 수 있다. 변형된 항체가 종양 또는 암 항원에 관계할 때, 특정 종양 또는 암의 진행은 암 또는 종양을 모니터하는 공지의 진단 또는 스크리닝 방법에 준하여 실시한다. 예를 들면, 암 또는 종양의 진행은 개체의 혈청에 있는 특정 암 또는 종양 항원(또는 특정 암 또는 종양과 연결된 또 다른 항원)의 수준을 검사하거나 항원에 특이적인 라벨된 항체를 주사하여 모니터할 수 있다. 또한, 다른 이미지 기술 가령, CT 스캔 또는 소노그랩 또는 다른 상 방법을 이용하여 암 또는 종양의 진행을 모니터할 수 있다. 생검을 실시할 수도 있다. 사람에서는 이와 같은 시도를 하기전에, 특정 암 또는 종양이 있는 동물 모델에서 변형된 면역글로불린의 효과를 테스트하는 것이 바람직하다.

치료제가 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체의 항원에 특이적인 경우에, 변형 항체의 효과는 개체에 변형 항체를 투여하고(사람 또는 질병을 가진 동물), 특정 감염성 질환의 수준 또는 증후를 모니터하여 실시한다. 감염성 질환 매체의 수분은 당분야에 임의 공지 방법으로 검사하는데, 감염성 질환 매체의 수준을 검사하는데 가령, 바이러스의 경우에는 바이러스 역가, 박테리아 역가를 모니터한다. 감염성 질환 매체의 수준은 변형 면역글로불린이 반응하는 항원의 수준을 측정하여 결정한다. 감염성 질환 매체 수준의 감소 또는 감염성 질환 매체의 증후가 경감되었다는 것은 변형 항체가 효과가 있다는 것을 말한다.

치료제가 백신으로 투여되는 경우에, 본 발명의 변형 항체를 포함하는 백신 조성물의 면역효과는 백신으로 면역화시킨 후에 테스트 동물의 항-이디오타입 반응을 모니터하여 결정한다. 체액 반응이 발생되는 것은 전신 면역 반응이 있다는 것을 나타내고, 특히 세포-중개된 면역반응의 다른 성분은 질병에 대한 보호에 중요하다. 테스트 동물에는 생쥐, 토끼, 침팬지, 실제 사람도 포함될 수 있다. 본 발명에서 만든 백신으로 실험을 위해 침팬지에 감염시킨다. 그러나, 침팬지는 보호된 종이기 때문에, 본 발명의 백신에 대한 항체 반응은 실제 더 작은 값이 싼 동물에서 연구하여, 침팬지 연구에 효과적으로 이용될 수 있는 한 개 또는 두 개의 최적 면역글로불린 분자 또는 최적의 면역글로불린 복합 분자를 확인한다.

시험 개체에서 면역 반응은 공지의 기술을 이용하여 검사하는 것과 같이 항체에 대한 생성된 면역 혈청의 반응성 및 면역화된 숙주에서 질병의 징후의 감쇠 또는 감염으로부터 보호등을 다양한 방법으로 검사하는데, 그 방법을 예를 들면, 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISA), 면역블랏, 방사능면역침전등이 있다.

적절한 동물 테스트의 한 실시예로써, 본 발명의 백신 조성물을 토끼에서 테스트하여, 변형된 면역글로불린 분자에 대해 항-이디오타입 반응을 유도하는 능력이 있는지를 확인한다. 예를 들면, 특이적인-병인물질-없는(SPF) 갖 어른이 된 New Zealand White 토끼 수컷을 이용한다. 토끼의 테스트 집단은 각각 효과량의 백신을 제공받는다. 기준 토끼 집단에는 자연 발생 항체를 포함하는 백신 Tris-HCl pH 9.0 1mM을 주사하였다. 매 1주 또는 2주마다 혈액을 뽑고, 변형된 면역글로불린 분자에 대한 항-이디오타입 항체에 대해 혈청을 분석하고, 변형 항체가 반응아흔 항원에 특이적인 항-항-이디오타입 항체에 대해 검사한다(방사능면역검사; Abbott Laboratories). 항-이디오타입 항체가 존재하는지에 대해서는 ELISA를 이용하여 검사하였다. 토끼는 이들의 다양한 생장 특징으로 인하여 다양한 반응을 제공하기 때문에 생쥐에서 백신을 테스트하는 것이 유익하다.

5.7. 변형 면역글로불린의 검사

특정 분자에 결합 부위를 포함하는 한 개이상의 CDR을 가지는 면역글로불린을 작제한 후에, 당분야에 공지된 임의 결합 검사를 이용하여 생성된 변형 항체와 특정 분자사이에 결합을 평가한다. 이와 같은 검사를 실행하여 특정 항원에 더 큰 친화성 또는 특이성을 나타내는 항체를 선별할 수 있다.

예를 들면, 당분야에 공지된 다양한 면역검사법을 이용하여 특정 분자에 대해 변형 항체의 결합을 검사할 수 있는데, 이용될 수 있는 방법으로는 방사능면역검사, ELISA(효소 연결된 면역흡착 검사), "샌드위치" 면역검사, 면역방사능측정 감사, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검사, in situ 면역검사(콜로이드성 금, 효소 또는 방사능동위원소 라벨등을 이용), 웨스턴 블랏, 침전 반응, 응집 검사(가령, 겔 응집 검사, 헤마토글루티닌 검사), 상보체 고정 검사, 면역형광 검사, 단백질 A, 면역전기영동 검사등이 있다. 한 구체예에서, 1차 항체에 라벨을 감지하여 항체 결합을 감지한다. 또 다른 구체예에서, 1차 항체에 대해 2차 항체 또는 시약의 결합을 감지하여 1차 항체를 감지할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 2차 항체를 라벨할 수도 있다. 면역검사에서 결합을 감지하는데 이용되는 많은 방법이 알려져 있고, 이 또한 본 발명의 범위내에 있다.

표적 분자에 변형 항체의 결합을 평가하는데 유용한 in vitro검사 시스템은 하기에서 설명한다. 간단하게 설명하면, 두 성분이 서로 상호작용하여(가령, 서로 결합하여, 일시적이지만 복합체를 형성할 수 있는 조건 및 충분한 시간동안 변형 항체 및 테스트 샘플의 반응 혼합물을 배양시키고, 이때 복합물은 반응 혼합물에서 제거되거나 감지된다. 이와 같은 검사는 다양한 방식으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 검사를 실행하는 한 가지 방법은 고형 상체 변형 항체 또는 테스트 물질을 고정시키고, 반응 종료시에 고형 상에서 고정된 항체/분자 복합체를 감지하는 것이다. 이와 같은 방법의 한 구체예에서, 변형 항체는 직접 또는 간접적으로 라벨할 수 있고, 테스트 샘플은 고형 표면에 고정시킨다. 실제, 미량 적정 플레이트를 고형상으로 이용하는 것이 편리하다. 고정된 성분은 비-공유 또는 공유적으로 접착시켜 고정시킬 수 있다. 비-공유 접착이란 테스트 샘플 용액을 간단하게 고형 상체 피복하고, 건조시키면 만들어진다.

검사를 실행하기 위해, 고정안된 성분을 고정된 성분을 포함하는 피복된 표면에 첨가한다. 반응이 완료된 후에, 형성된 임의 복합체가 고형상에 고정되어 남아 있을 수 있는 조건하에서 반응안된 성분을 제거한다. 고형 상에 고정된 복합체는 다양한 방법으로 감지할 수 있다. 기존의 고정안된 성분을 사전에 라벨하는 경우에 표면에 고정된 라벨이 감지된다는 것은 복합체가 형성되었다는 것을 말한다. 기존의 고정안된 성분이 사전에 라벨안된 경우에, 간접적인 라벨을 이용하여 표면에 고정된 복합체를 감지할 수 있다.

또는, 액상에서 반응을 실행할 수도 있는데, 반응 생성물은 반응안된 성분과 분리되고, 복합체를 감지한다.

5.8. 형질전이 동물

본 발명은 또한, 본 발명의 변형 면역글로불린(또는 이의 기능적 활성을 가지는 단편)에 대해 형질전이된(가령 변형 면역글로불린을 인코드하는 핵산을 포함) 동물을 제공한다. 임의 종의 동물 가령, 생쥐, 들쥐, 토끼, 기니아피그, 양, 돼지, 마이크로-피그, 염소등이 포함되나 이에 국한시키지는 않으며, 사람이 아닌 영장류(가령, 비비, 원숭이, 침팬지)를 이용하여 본 발명의 형질전이 동물을 만들 수 있다.

따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 재조합 사람이 아닌 동물을 제공하는데, 특히 암 또는 종양 항원에 면역 특이적으로 결합하는 변형된 항체를 인코드하는 핵산에 대해 형질전이된 재조합 사람이 아닌 동물을 제공하거나 또는 감염성 질환 매체의 항원 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형 항체를 인코드하는 핵산에 대해 형질전이된 재조합 사람이 아닌 동물을 제공한다.

당분야에 공지의 임의 기술을 이용하여 동물에 항체 형질전이 유전자를 도입하여, 형질전이 동물의 설립 라인을 만든다. 이와 같은 기술에는 프로 뉴클리어 마이크로인젝션(Hoppe and Wagner, 1989, U.S.Pat. No. 4,873,191); 생식세포계열로 중개 레트로바이러스 중개 유전자 전달(Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152); 배 간 세포에 유전자 표적화(Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321); 배의 전기 천공(Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); 정자-중개된 유전자 전달(Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723)등이 있고, 이와 같은 기술은 Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229을 참고한다.

본 발명에는 이들 세포에 전이유전자로 변형된 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 운반하는 형질전이 동물 및 이들 모든 세포가 아닌 일부 세포에 전이유전자를 옮기는 동물 가령, 모자이크 동물을 제공한다. 전이유전자는 단일 전이유전자 또는 콘카타머 가령, 머리-머리 배열 또는 머리-꼬리 배열로 결합될 수 있다. 전이유전자를 선택적으로 특정 세포형에 도입시켜 활성화시킬 수 있다(Lasko et al. (Lasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236)). 세포형-특이적인 활성화반응에 요구되는 조절 서열은 관심이 있는 특정 세포형에 따라 달라지고, 이는 당업자에게 공지의 것이다. 합성된 항체 전이유전자를 인코드하는 뉴클레오티드가 내생 면역글로불린의 염색체 부위로 삽입될 경우에, 유전자 표적화가 바람직하다. 간단하게 설명하면, 이와 같은 기술이 이용되는 경우에, 내생 면역글로불린에 상동성인 일부 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 염색체 유전자와 상동 재조합을 통하여 내생 면역글로불린 유전자의 뉴클레오티드 서열에 삽입되어, 이 서열의 기능을 파괴하기 위해 삽입용으로 고안된 것이다. 전이유전자는 선택적으로 특정 세포형에 도입되어, 그 세포형에서만 내생 면역글로불린을 비활성화시킬 수 있다(Gu et al.(Gu et al., 1994, Science 265:103-106)). 이와 같은 세포-형 특이적인 비활성화에 필요한 조절 서열은 원하는 특정 세포형에 따라 달라지고, 이는 당업자에게는 공지의 것이다.

선택된 부위에 결합된 단일-복사체 형질전이 동물을 만드는 방법은 당분야에 공지의 것이다(가령, Bronson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9067-9072)).

일단, 형질전이 동물이 만들어진 경우에, 표준 기술을 이용하여 재조합 항체 유전자의 발현을 검사한다. 서든 블랏 분석을 이용하여 초기 스크리닝하고, 전이유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위해 동물 조직을 분석하는데에는 PCR 기술이 이용된다. 형질전이 동물의 조직에서 전이유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하는데 이때 이용되는 기술은 동물에서 수득한 조직 샘플의 노던 블랏 분석, in situ 하이브리드화 반응 분석, RT-PCR등이 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 유전자를 발현시키는 조직 샘플에서 항체 전이유전자 생성물에 특이적인 항체를 이용하여 면역세포화학적으로 평가한다.

6. 실시예; 브래디키닌을 포함하는 합성된 변형 항체

본 실시예에서는 브래디키닌 수용체(BR)에 면역특이적으로 결합하는 합성된 변형 항체를 작제하는 것에 대해 설명한다. 브래디키닌 수용체는 브래디키닌이라고 불리는 고유 리간드에 결합한다. BR-브래디키닌 상호작용은 본 발명의 방법에 이용되는 결합쌍의 한 가지 예가 된다. 브래디키닌에 있는 아미노산 즉 결합 부위로 공지된 아미노산이 브래디키닌 수용체에 접촉하는 경우에 BR-브래디키닌 상호작용이 일어난다. 본 실시예의 합성된 변형 항체에는 브래디키닌 결합 부위에서 유도된 아미노산을 포함한다. 따라서, 이와 같은 합성된 변형 항체는 브래디키닌 리간드를 모방하고, 브래디키닌 수용체(BR)에 결합하는 것을 예측할 수 있다. 브래디키닌 서열을 포함하는 6가지 합성된 변형 항체를 작제하고, 하기에서 처럼 BR에 결합을 설명한다.

브래디키닌 결합 서열을 포함하는 합성된 변형 항체를 생산하는 방법은 다음과 같이 나타낼 수 있다;

1) 올리고뉴클레오티드를 이용하여 가변 부분 유전자를 브래디키닌 결합 서열과 CDR을 가지도록 조작하고;

2) 그 다음 조작된 가변 부분 유전자를 적절한 항상 부분을 가지는 포유류 발현벡터에 삽입하고;

3) L 및 H쇄를 포함하는 벡터를 포유류 세포에 감염시키고, 합성된 변형 항체를 발현시키고; 그리고

4) BR 결합에 대해 합성된 변형 항체를 검사한다.

6.1. 브래디키닌 결합 부위를 포함하는 가변성 부분 유전자의 작제

브래디키닌 결합 부위를 포함하는 CDR을 인코드하는 가변 부분 유전자를 작제하기 위해 다음의 전략으로 실시한다.

우선, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여, 돌출말단을 가지는 이중 가닥 DNA 단편을 만든다(as diagramed in Figure 5, Step 1; see also, Kutemeier et al., 1994 BioTechniques 17:242). 특히, GenoSys Biotech Inc의 자동화된 기술을 이용하여, 20개 염기의 겹쳐지는 부분을 가지는 관심이 있는 서열에 상응하는 길이가 액 80개 염기의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드의 특정 서열은 도 6A 및 6B에 나타내었다(이는 각각 L 및 H쇄의 가변 부분을 작제하기 위함). 도 6A에서는 브래디키닌 결합 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분 유전자를 조작하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 6B는 브래디키닌 결합 서열을 포함하는 H쇄 가변성 부분 유전자를 작제하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 6개 브래디키닌 CDR(BKCDR1, BKCDR2, BKCDR3, BKCDR4, BKCDR5, BKCDR6)을 조작하는데 이용되는 올리고 복합물 및 두 개의 콘센선스 부분(ConVL1 및 ConVH1)은 다음의 표 5에 나타내었다.

표 5

원하는 유전자에 oligo를 복합시키기 위해, 10 또는 12개 oligo 군을 이용하여 하기에서 설명하는 것과 같이 가변성 부분 유전자를 조작한다. 각 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 5' 포스포릴화시킨다; 각 oligo 25㎕를 T4 폴리뉴클레오티드 카이나제, 50mM ATP 존재하에서 37℃ 1시간동안 배양시킨다. 반응은 70℃에서 5분간 열을 가하여 중단시키고, 그 다음 에탄올 침전시킨다. 일단 포스포릴화되면, 도 5에서 볼 수 있는 것과 같은 상보성 올리고뉴클레오티드(oligo1 + oligo10, oligo2 + oligo9, oligo3 + oligo8, oligo4 + oligo7, oligo5 + oligo6)를 멸균된 작원 원심분리 튜브에서 혼합시키고, 5분간 65℃에서 수조에서 튜브를 가열시켜 어닐링시키고, 실론에서 30분간 냉각시킨다. 어닐링시키면, 접착성 말단을 가지는 짧은 이중 가닥 DNA를 만들게 된다.

그 다음, 접착성 말단이 있는 이중 가닥 DNA 단편을 더 긴 가닥에 결찰시켜(도 5, 단계2-4), 조적된 가변성 부분 유전자가 어셈블리되도록 한다. 특히, 접착성 말단이 있는 DNA 단편은 T4 DNA ligase 및 10mM ATP 존재하에 2시간 동안 수조(16℃로 유지딤)에서 결찰시킨다. 어닐된 oligo 1/10는 어닐된 oligo2/9와 혼합시키고, 어닐된 oligo3/8은 어닐된 oligo4/7와 혼합시킨다. 생성된 oligo는 oligo1/10/2/9 및 oligo3/8/4/7로 라벨한다. 그 다음, oligo3/8/4/7는 oligo5/6에 결찰시킨다. 생성된 oligo3/8/4/7/5/6은 oligo1/10/2/9에 결찰시켜, 전체 길이의 가변성 부분 유전자를 만든다.

또는, 12개 oligos 집단을 이용할 경우에, 첨가 순서는 oligo 번호로 나타낸다;1+12=1/12,2+11=2/11,3+10=3/10,4+9=4/9,5+8=5/8,6+7=6/7,1/12+2/11=1/12/2/11,3/10+4/9=3/10/4/9,5/8+6/7=5/8/6/7,1/12/2/11+3/10/4/9=1/12/2/11/3/10/4/9,1/12/2/11/3/10/4/9+5/8/6/7=전체 길이의 가변성 부분 유전자. 8개 가변성 부분 유전자는 이와 같은 방법으로 작제한다. 4개 유전자는 L쇄 가변성 부분이 되고, 4개 유전자는 H쇄 가변성 부분이 된다. 조작된 L쇄 유전자에는 ConVL1, 즉, 브래디키닌 서열이 없는 콘센선스 L쇄 가변성 부분; BKCDR1, 즉, CDR1에서 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분; BKCDR2, 즉 CDR2에서 에서 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분; BKCDR3, 즉, CDR3에서 브래디키닌 서열을 포함하는 L쇄 가변성 부분을 포함한다. 조작된 H쇄 유전자에는 ConVH1, 즉, 브래디키닌 서열이 없는 콘센선스 H쇄 가변성 부분; BKCDR4, 즉 CDR4에서 브래디키닌 서열을 포함하는 H쇄 가변성 부분; BKCDR5, 즉 CDR5에서 브래디키닌 서열을 포함하는 H쇄 가변성 부분; BKCDR6, 즉, CDR6에서 브래디키닌 서열을 포함하는 H쇄 가변성 부분을 포함한다. 도 4A 내지 4F에서 8개 조작된 가변성 부분 유전자의 서열을 나타내었다.

올리고뉴클레오티드를 복합하여 만든 조작된 유전자 각각은 다음과 같이 처리한다;

생성된 조작된 가변성 부분 유전자는 겔 전기영동을 통하여 정제한다. 결찰안된 과량의 올리고뉴클레오티드 및 다른 불완전한 DNA 단편을 제거하기 위해 결찰된 생성물은 110V에서 2시간동안 1% 저 용융 아가로즈 겔에 얹는다. 전체 길이의 DNA 생성물을 포함하는 주요 밴드를 잘라내고, 멸균 1.5㎖ 원심불리 관에 둔다. 아가로즈로부터 DNA를 방출시키기 위해, 겔 절단물은 40℃에서 3시간동안 f3-AgraseI으로 절단시킨다. 0.3M MaOAc와 이소프로판올로 -20℃에서 1시간 동안 침전시키고, 15분간 12,000rpm에서 원심분리시키면 DNA를 회수할 수 있다. 정제된 DNA 펠렛은 TE 완충액, pH 8.0 50㎕]에 재현탁시킨다. 조작된 가변 부분 유전자는 PCR을 이용하여 증폭시킨다. 특히, 조작된 가변성 부분 유전자 100ng을 25mM dNTPs, 200ng 프라이머, 5U 충실성이 큰 열안정성 Pfu DNA 폴리메라제와 함께 완충액에서 혼합시킨다. DNA는 28회 증폭시킨다. 생성된 PCR 생성물은 1% 아가로즈 겔에서 분석하였다.

조작된 가변성 부분 유전자에 상응하는 각 정제된 DNA는 연속하여, pUC19 박테리아 벡터에 삽입한다. pUC19는 2686개 염기쌍으로 lacZ 및 Amp 선택성 표식에 54개 염기쌍 폴리링커를 포함하는 대장균(E. coli) 플라스미드 벡터이다. 조작된 가변성 부분 유전자를 섭입하기 위해 벡터를 준비하도록, 10㎍ pUC19는 37℃에서 3시간동안 HincI1(50 U)로 선형화시켜, 뭉뚱한 말단과 5'GTC를 가지게 된다. 자체- 재 결찰되는 것을 방지하기 위해, 선형 벡터 DNA는 25U 송아지 내장 알칼리 포스포타제(CIP)를 이용하여 1시간동안 37℃에서 처리하여 포스포릴화반응을 제거한다. 조작된 가변성 부분 유전자를 pUC19 벡터내 삽입시키기 위해 약 0.5㎍ 디포스포릴화된 선형 벡터 DNA를 3㎍ 포스포릴화된 가변성 부분 유전자와 혼합시키는데, 이때 T4 DNA 결찰효소(1000U)존재하에, 16℃에서 20시간 배양시킨다.

조작된 가변성 부분 유전자를 포함하는 세균성 벡터를 이용하여 세균 세포를 형질변환시킨다. 특히, 새로 준비된 컴피턴트 DH5-α세포, 50㎕는 조작된 가변 부분 유전자를 포함하는 1㎍ pUC19와 혼합시키고, 이를 전기천공 큐벡(0.2cm gap; Bio-Rad)에 옮긴다. 각 큐빅에는 2.5kV/200ohm/25 μF에서 전기천공기(Bio-Rad Gene Pulser)로 펄스를 제공한다. 그 다음 바로 1㎖ SOC 배지를 각 큐빅에 첨가시키고, 세포는 1시간동안 37℃에서 원심불리 관에서 회수한다. 각 형질변환에서 한 방출의 세포를 떼내어, 1:100으로 희석시키고, 100㎕를 암피실린(Amp 40㎍/㎖)을 포함하는 LB플레이트에 도말한다. 각 플레이트는 Amp 표식이 존재하기 때문에 하룻밤동안 37℃에서 배양시킨다. pUC19 벡터를 포함하는 형질변화체만이 LB/Amp 배지에서 생장할 수 있다.

한 개의 형질변환된 콜로니를 선택하고, 3㎖ LB/Amp 멸균 유리 관에서 37℃에서 일정하게 교반시키면서 하룻밤동안 생장시킨다. Easy Prep columns(Pharmacia Biotech)을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리시키고, 100㎕ TE 완충액, pH 7.5에 현탁시킨다. pUC19에 유전자 삽입체가 존재하는지를 확인하기 위해, 각 콜로니에서 25㎕ 플라스미드 DNA를 HincI1 제한 엔도뉴클레아제로 37℃에서 1시간동안 처리하고, 1% 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 이 방법으로 삽입된 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA는 제한부위(5'..GTCGAC.. 3')를 상실하였기 때문에 효소의 절단되지 않고, 겔상에서 완전히 닫힌(CC)DNA로 이동되고, 삽입체가 없는 플라스미드는 절단되어, 선형(L) 이중 가닥 DNA 단편으로 이동된다.

조작된 가변 부분 유전자의 정확한 유전자 서열을 확인하기 위해, 그리고, 작제 과정동안에 발생되는 원하지 않는 돌연변이 발생 가능성을 제거하기 위해, 자동화된 ABI 377 DNA Sequencer에서, DNA 서열화를 M13/pUC 역상(5'AACAGCTATGACCATG 3')을 클론으로 이용하고, 5' 말단 20게 염시 프라이머(5' GAATTCATGGCTTG GGTGTG 3')를 이용하여 PCR 유전자 생성물을 만든다. 모든 클론은 정확한 서열을 포함하는 것으로 확인되었다.

브래디키닌 서열을 포함하는 6개의 조작된 가변성 부분 유전자는 이 실시예 방법을 통하여 만들 수 있다. 표 6에 나타낸 것은 가변성 부분 유전자내에 합성된 변형 항체의 이름 및 브래디키닌 결합 서열에 상응하는 위치를 나타낸다. 예를 들면, 합성된 항체 즉, hAbBKCDR1이름의 항체에는 가변성 부분 L쇄 유전자(V_L)의 CDR1에 브래디키닌 결합 서열(BK)을 포함한다. 이와 같은 합성된 항체에는 가변성 부분 H쇄 유전자(V_H)에 콘센선스 서열(con)을 가진다.

표 6

이 실시예의 6개 합성된 변형 항체 각각의 가변성 부분에 상응하는 아미노산 서열을 표 7에 나타내었다. CDRs은 굵게 나타내었다. 브래디키닌 결합 아미노산은 ArgProProGlyPheSerProPheArg으로 이는 밑줄로 CDR에서 표시하였다. 또한 표 5에서는 사람의 카파 L쇄 V_L소단위 및 사람 H쇄 V_H소단위 I 유전자의 콘센선스 서열을 설명한다. 콘센선스 CDR이 너무 짧아서, 완전한 브래디키닌 결합 부위 서열을 포함하지 못하는 경우에, 브래디키닌 결합 부위의 아미노 말단부위가 결손되는데, 그 이유는 카르복시말단 잔기는 수용체 결합에 좀더 중료한 것으로 알려져 있기 때문이다(Stewart and Vavrek, Chemistry of peptide B2 bradykinin antagonists, pp. 5196, Burch, R.M., editor, Bradykinin Antagonists, Basic and Clinical Research, New York: Marcel Dekker, 1991; hereby incorporated by reference).

표 7

6.2. 포유류 발현벡터내로 조작된 가변성 유전자의 삽입

완전한 항체 L쇄에는 가변 부분 및 항상 부분을 모두 포함한다. 완전한 항체의 H쇄에는 가변 부분, 항상 부분 및 힌지 부분을 포함한다. 완전한 L쇄 및 H쇄를 작제하기 위해, 상기 변형된 가변성 부분 유전자를 적절한 항상 부분을 포함하는 벡터에 삽입한다. L쇄 CDR내에 삽입된 브래디키닌 서열을 가지는 조작된 가변성 부분 유전자는 pMRRO10.1 벡터(도 3A)에 삽입하는데, 이때 이 벡터에는 사람의 카파 L쇄 항상 부분을 포함한다. 이 벡터에 조작된 L쇄 가변 부분을 삽입시키면 완전한 L쇄 서열을 제공하게 된다. 또는 H쇄 CDR내에 삽입된 브래디키닌 서열을 가지는 조작된 가변성 부분 유전자를 pGAMMA1 벡터(도 3B)에 삽입하는데, 이때 이 벡터네응 사람 IgG1 항상 부분 및 인지 부분 서열을 포함한다. 이와 같은 벡터에 조작된 H쇄 가변성 부분 유전자를 삽입시킵면 완전한 H쇄 서열을 가진다.

완전한 항체를 인코드하는 포류유 벡터를 조작하기 위해, 완전한 H쇄 서열 및 L쇄 서열을 단일 포유류 발현 벡터에 삽입한다(Bebbington, C.R., 1991, in METHODS: Methods in Enzymology, vol. 2, pp. 136-145). 생성된 벡터에는 항체의 L쇄 및 H쇄를 모두 인코드하고, 이를 pNEPuDGV이라고 한다(도 3C).

6.3. 포유류 세포에서 합성된 변형 항체의 발현

어셈블리된 항체의 생산을 확인하기 위해, pNEPuDGV 벡터를 COS 세포에 전이감염시킨다. COS 세포(아프리카 원숭이 신장 세포주, CV-1, 오리진-결손된 SV40 바이러스로 형질변환됨)를 ld용하여, 합성된 항체의 단시간 일시적으로 발현시키는데, 그 이유는 복제 원점을 포함하는 원형 플라스미드를 복제하여 매우 많은 수의 복사체를 만드는 능력이 있기 때문이다. 항체 발현 벡터는 COS7 세포(the American Type Culture Collection에서 구함)로 칼슘 친전을 이용하여 전이감염시킨다(Sullivan et al., FEBS Lett. 285:120-123). 전이감염된 세포는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 72시간 동안 배양시키고, 브래디키닌을 포함하는 항체를 가지는 상청액을 수득한다. 전이감염된 COS 세포의 상청액은 어셈블리된 IgG를 위한 ELISA 방법을 이용하여 검사하였다. ELISA 방법은 항-사람 IgG Fc로 피복된 96-웰 플레이트상에 샘플 및 표준을 포집하는 것이다. 결합된 어셈블리된 IgG는 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 연결된 항-사람 카파 쇄와 기질 테르타메틸벤지딘(TMB)로 감지한다. 색 발생은 샘플에 있는 어셈블리된 항체의 양에 비례한다.

6.4. 브래디키닌을 포함하는 합성된 변형 항체는 브래디키닌 리간드를 모방하여 브래디키닌 수용체에 결합한다.

브래디키닌 결합 서열을 포함하도록 조작된 합성된 변형 항체는 브래디키닌 리간드를 모방하여 브래디키닌 수용체(BR)에 결합한다는 것을 예측할 수 있다. 이와 같은 합성된 변형 항체가 BR에 결합한다는 것을 확인하기 위해, 합성 항체는 브래디키닌 수용체 결합 검서에서 검사한다. BR에 합성 항체 결합을 검사하는 것은 다음의 방식으로 실시한다. SV-T2 세포는 세포당 약 3,000개 브래디키닌 수용체(BR)를 발현시키는 섬유아세포로 형질변환시킨다. SV-T2 세포에서 브래디키닌 수용체를 자극시키면, 브래디키닌 결합에 비례하여 PGE2 합성이 신속하게 증가된다. 따라서, 배지로 방출되는 PGE2는 수용체 결합을 나타낸다.

도 7A에서 볼 수 있는 것과 같이 PGE2 합성은 1nM브래디키닌(리간드)를 추가하면 약 4배이상 자극을 받는다. PGE2 합성은 ELISA로 정량화할 수 있다. 도 7A에서 수용체 길항물질 HOE-140을 검사하였다. HOE-140 및 브래디키닌 또는 HOE-140을 추가해도 PGE2 합성이 유도되지 않는다.

또한, 도 7B에서 볼 수 있는 것과 같은 발현된 변형 항체는 브래디키닌 수용체에 결합 및 자극할 수 있는 능력에 대해 검사하였다. hABBKCDR3, hABBKCDR4, hABBKCDR5, 또는 콘센선스를 인코드하는 항체 발현 벡터 pNEPuDGV1로 형질감염된 COS 세포의 배지를 이용하여 SV-T2 세포에서 브래디키닌 수용체를 자극시킨다. 가변 쇄 부분 BKCDR3 및 BKCDR5을 가지는 합성 항체는 약량 의존성 방식에서 PGE2 합성을 자극하였다. BKCDR4, ConVH 배지 단독, HOE-140은 PGE2 합성을 자극하지 못하였다(도 7B). BKCDR4에 노출되는 세포는 PGE2 합성이 부족하기 때문에 CDR4 콘센선스 서열이 너무 짧아 전체 브래디키닌 결합 서열을 수용하지못하였다는 것을 알 수 있다. 표 6에서는 콘센선스 CDR 아미노산 서열 및 BKCDR 서열을 비교하였다. 합성된 변형 항체 BKCDR3 및 BKCDR5은 고유 리간드 브래디키닌에 대해 수용체 결합이 완전한 것으로 설명된다. 도 7C에서 볼 수 있는 바와 같이, 브래디키닌을 첨가하면, 4배 정도 PGE2 합성이 촉진된다(좌측의 두 번째 막대). 사전에 고유 브래디키닌으로 자극을 받은 세포에 BKCDR3 또는 BKCDR5을 첨가하면, 브래디키닌에 의해 자극을 받은 PGE2 합성이 저해된다.

표 8

이와 함께 이와 같은 결과로 브래디키닌 결합 부위를 포함하는 변형 항체는 브래디키닌 수용체에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예에 한정시키지 않는다. 또한, 여기에서 설명하는 것에 추가하여, 본 발명의 다양한 변형이 가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 변형 또한 첨부된 청구범위의 영역에 속한다.

여기에서 언급하는 다양한 문헌은 참고문헌으로 첨부한다.

Claims (122)

1. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 면역글로불린은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖는 변이영역을 포함하고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하지만, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않고, 상기 제 1 멤버는 암 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
2. 제 1항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
3. 제 1항에 있어서, 제 1 멤버는 종양항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
4. 제 3항에 있어서, 상기 종양 항원은 다형성 상피 무친 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
5. 제 3항에 있어서, 상기 종양 항원은 사람 결장암(종)-관련 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
6. 제 5항에 있어서, 상기 영역은 Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn- Asp-Val-Ala, Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr, Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr- Ser-Ser-Pro-Leu-Thr, Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn, Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr- Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly, Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly- Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 특징으로 하는 변형면역글로불린.
7. 제 3항에 있어서, 종양항원은 사람 결장암(종)-관련 단백질 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
8. 제 3항에 있어서, 종양항원은 사람 유지방 구체 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
9. 제 8항에 있어서, 상기 영역은 Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu, Glu-Ile-Leu-Pro-Gly- Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly, Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr- Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr, Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu- Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala, Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser, Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr에서 선택되는 아미노산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
10. 제 8항에 있어서, 추가로 Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu, Glu-Ile-Leu-Pro-Gly- Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly, Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr- Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr, Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu- Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala, Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser, Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr에서 선택되는 아미노산서열을 갖는 제 2 멤버의 일부를 보유한 제 2 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
11. 제 3항에 있어서, 종양항원은 유방, 난소, 자궁, 전립선, 방광, 폐, 피부, 결장, 췌장, 위장관, B 림프구 또는 T 림프구의 암에 대한 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
12. 제 1항에 있어서, 암항원은 KS 1/4 범-암종항원, 난소 암종항원, 전립선산 인산염, 전립선 특이적 항원, 흑색종-관련 항원 P97, 흑색종 항원 GP75, 고분자량 흑색종 항원, 절립선 특이적 막항원, 태아성 암종항원, 다형성 내피 무친 항원, 사람 유지방 구체항원, 결장직장종양-관련 항원 TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1, LEA, 벌키트(Burkitt) 림프종 항원-38.13, CD19, 사람 B-림프종 항원-CD20, CD33, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2, 강글리오시드GM3, 종양-특이적 이식형 세포-표면항원, 신생종양 항원-알파-태아단백질 L6, 사람 폐 암종항원 L20, 사람 백혈병 T 세포항원-GP37, 신당단백질, 스핑고지질, EGFR, HER2 항원, 다형성 내피 무친, 악성 사람 림프구 항원-APO-1, 항원 M18, M39, SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, D56-22, TRA-1-85, C14, F3, AH6, Y 합텐, Le^y, TL5, FC10.2, 위 선암종항원, C0-514, NS-10, CO-43, MH2, 결장암에서 발견된 19.9, 위암 무친, T5A7, R24, 4.2, GP3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, G_P2, M1:22:25:8, SSEA-3, SSEA-4, T-세포 수용체 유도펩티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
13. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 면역글로불린은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖는 변이영역을 포함하고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하지만, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않고, 상기 제 1 멤버는 감염성 질병병인의 항원인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
14. 제 13항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
15. 제 13항에 있어서, 감염성 병인은 박테리아인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
16. 제 13항에 있어서, 감염성 병인은 바이러스아인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
17. 제 13항에 있어서, 감염성 병인은 기생균인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
18. 제 13항에 있어서, 감염성 질병병인에 대한 항원은 브람벨 수용체, HSV-2 항원, 임균(Gonnococcus)의 항원, 매독트레포네마(Treponema Pallidum)의 항원, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 항원, 또는 사람 파릴로마바이러스(Papillomavirus)의 항원에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
19. 제 13항에 있어서, 감염성 질병병인에 대한 항원은 인플루엔자바이러스 헤마글루티닌, 사람 호흡기 합포체성 바이러스 G 당단백질, 뎅그바이러스의 심부 단백질, 뎅그바이러스의 모체 단백질, 홍역바이러스 헤마글루티닌, 단수포진바이러스 2형 당단백질 gB, 폴리오바이러스 I VP1, HIV I의 외피 당단백질, B형 간염 표면항원, 디프테리아 독소, 스트렙토콕커스(Streptococcus) 24M 에피토오프, 고노콕커스 필린(Gonococcal pilin), 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 g50, 슈도라비즈 바이러스 당단백질 H, 슈도라비즈 바이러스 당단백질 E, 전파가능 위장염 당단백질 195, 전파가능 위장염 모체단백질, 돼지 로타바이러스 당단백질 38, 돼지 파르보바이러스 캡시드 단백질, 설푸릴나 히도디센테리아(Serpulina hydodysenteriae)보호 항원, 소 바이러스성 설사 당단백질 55, 뉴캐슬 질환 바이러스 헤마글루티닌-뉴우라미니다제, 돼지 감기 헤마글루티닌, 돼지 감기 뉴우라미니다제, 감염성 소 비강기관염 바이러스 당단백질 E, 감염성 후두기관염 바이러스 당단백질 G 또는 당단백질 I, 라 크로제(La Crosse)바이러스의 당단백질, 태아소 설사 바이러스, B형 간염바이러스 심부 단백질, B형 간염바이러스 표면항원, 말 인플루엔자 바이러스 A형/알래스카 91 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/마이애미 63 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/켄터키 81 뉴우라미니다제, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 B, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 D, 소 호흡기 합포체성 바이러스 부착단백질, 소 호흡기 합포체성 바이러스 융합단백질, 소 호흡기 합포체성 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 융합 단백질, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 헤마글루티닌 뉴우라미니다제, 소 바이러스성 설사 바이러스 당단백질 48, 소 설사바이러스 당단백질 53에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
20. 제 15항에 있어서, 감염성 질병병인은 미코박테리아 릭케차(Mycobateria rickettsia), 미코플라스마(Mycoplasma), 네이세리아종(Neisseria spp.,) 레지오넬라(legionella), 시겔라종(Shigella spp.,), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 스트렙토콕커스(Streptococci), 코르네박테리아 디프테리아(Cornebacteria diphtheriae), 파상풍균(Clostridium tetani), 보르데텔라 펄투시스(Bordetella pertussis), 해모필러스종(Haemophilus spp.,), 클라미디아종(Chlamydia spp.,), 대장균(Escherichia coli)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
21. 제 16항에 있어서, 감염성 질병병인은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진바이러스 I형, 단순포진 II형, 우역, 코감기바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 합포체성 바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노 바이러스, 아르보바이러스, 한탄바이러스, 콕사키 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 폴리오바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 I형, 사람 면역결핍 바이러스 II형, 피코르나바이러스, 엔테로바이러스, 칼리시비리디아, 노르워크 바이러스 그룹, 토가바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라비즈 바이러스, 마르버그 바이러스, 에볼라바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 I형, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 II형, 유인원 면역결핍 바이러스, 렌티바이러스, 폴로오마바이러스, 파르보바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 사람 헤르페스바이러스-6, 원숭이 헤르페스바이러스 1, 팍스바이러스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
22. 제 17항에 있어서, 감염성 질병병인은 말라리아, 아이메리아, 레시마니아, 코크지디오아, 트리마노소마, 곰팡이에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
23. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 면역글로불린은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖는 변이영역을 포함하고, 상기 영역은 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro 서열을 보유하지 않고, 또한 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않으며, 상기 제 1 멤버는 감염성 질병병인에 대한 세포내 수용체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
24. 제 23항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
25. 제 23항에 있어서, 감염성 질병병인은 박테리아인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
26. 제 23항에 있어서, 감염성 질병병인은 바이러스인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
27. 제 23항에 있어서, 감염성 질병병인은 기생균인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
28. 제 23항에 있어서, 세포 수용체는 LPV 수용체, 아데닐fp이트 사일클라제, BDV 표면 당단백질, N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산 수용체, CD4+, 고도 황산염화형 헤파린 황산염, p65, Gal 알파 1-4-Gal-포함 등수용체, CD16b, 인테그린 VLA-2 수용체, EV 수용체, CD14, 당접합 수용체, 알파/베타 T-세포 수용체, 부식-가속화 인자 수용체, 세포외 외피 당단백질 수용체, 면역글로불린 Fc 수용체, 팍스바이러스 M-77, GALV 수용체, CD14 수용체, 루이스(b) 혈액그룹항원 수용체, T-세포 수용체, 헤파린 황산염 당아미노글리칸 수용체, 섬유아세포 생장인자 수용체, CD11a, CD2, G-단백질 결합 수용체, CD4, 헤파린 황산염 프로테오글리칸, 아넥신 II, CD13(아미노펩티다제 N), 사람 아미노펩티다제 N 수용체, 헤마글루티닌 수용체, CR3 수용체, 단백질 키나아제 수용체, 갈락토즈 N-아세틸갈락토사민-저해성 렉틴 수용체, 케모킨 수용체, 아넥신 I, actA 단백질, CD46 수용체, 메닝고코커스 독성 관련 opa 수용체, CD46 수용체, 태아성 암종항원 페밀리 수용체, 태아성 암종항원 페밀리 Bgla 수용체, 감마 인터페론 수용체, 당단백질 gp70, rmc-1 수용체, 사람 인테그린 수용체 알파 v 베타 3, 헤파린 황산염 플로테오글리칸 수용체, CD66 수용체, 인테그린 수용체, 막 보조인자 단백질, CD46, GM1, GM2, GM3, CD3, 세라미드, 헤마글루티닌-뉴우라미니다제 단백질, 적혈구 P 항원 수용체, CD36 수용체, 글리코포린 A 수용체, 인터페론 감마 수용체, KDEL 수용체, 점막 호밍 알파4베타7 수용체, 내피 성장인자 수용체, 알파5베타1 인테그린 단백질, 비-당부가된 J774 수용체, CXCR1-4 수용체, CCR1-5 수용체, CXCR3 수용체, CCR5 수용체, 헤46 포면 당단백질, TNFR P55 수용체, TNFp75 수용체, 수용성 인터루킨-1 베타 수용체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
29. 제 1 멤버의 리간드-수용체 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 면역글로불린은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖는 변이영역을 포함하고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하지만, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
30. 제 29항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
31. 제 29항에 있어서, 제 1 멤버는 수용체인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
32. 제 29항에 있어서, 제 1 멤버는 리간드인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
33. 제 29항에 있어서, 제 1 멤버는 수용체 작용제인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
34. 제 29항에 있어서, 제 1 멤버는 수용체 길항물질인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
35. 제 29항에 있어서, 제 1 멤버는 브라드키닌 리간드인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
36. 제 35항에 있어서, 영역은 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
37. 제 31항에 있어서, 수용체는 오피오이드 수용체, 글루코스 전달체, 글루타민산염 수용체, 오파닌 수용체, 적혈구생성촉진인자 수용체, 인슐린 수용체, lx로신 키나아제 수용체, KIT 과립백혈구-집락 자극인자 수용체, 소마트로핀 수용체, 신경교-유도 신경향성 인자 수용체, gp39 수용체, G-단백질 수용체 종류, β2-아드레날린 수용체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
38. 제 30항에 있어서, 리간드는 콜레시스토키닌, 갈라닌, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 케모틴, 렙틴, 프로테아제, 뉴우로펩티드 Y, 뉴우로키닌-1, 뉴우로키닌-2, 뉴우로키닌-3, 밤베신, 가스트린, 콜티코트로핀 방출 호르몬, 엔도텔린, 멜라토닌, 소마토스타틴, 혈관확장작용 내장 펩티드, 상피 생장인자, 종양괴사인자, 도파민, 엔도텔린에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
39. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 항체는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
40. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 단편은 제 1 멤버와 면역특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
41. 제 40항에 있어서, 단편은 Fab, (Fab')2, H 사슬 이합체, L 사슬 이합체, Fv 단편에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
42. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 영역은 CDR내 삽입인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
43. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 영역은 CDR의 하나 또는 복수 아미노산을 대체하는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
44. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 생식세포계 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
45. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 비-생식세포계 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
46. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 영역은 4개이상의 아미노산이 되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
47. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 영역은 10-20개사이의 아미노산 이 되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
48. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 25개 정도의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
49. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 H 사슬변이영역의 제 1 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
50. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 H 사슬변이영역의 제 2 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
51. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 H 사슬변이영역의 제 3 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
52. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 L 사슬변이영역의 제 1 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
53. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 H 사슬변이영역의 제 2 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
54. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 상기 영역을 보유한 CDR은 H 사슬변이영역의 제 3 CDR인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
55. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 하나이상의 CDR이 결합위치 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
56. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 제 2 CDR은 제 1 멤버를 제외한 분자에 대한 제 2 결합위치를 갖는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
57. 제 56항에 있어서, 상기 멤버를 제외한 분자는 면역세포의 표면상에 위치하는 분자인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
58. 제 57항에 있어서, 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, K 세포, TIL 세포 또는 호중구인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
59. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 제 1 멤버에 면역특이적으로 결합하는 자연발생 항체보다 1 멤버에 대한 특이성이 훨신 높은 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
60. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 제 1 멤버에 면역특이적으로 결합하는 자연발생 항체보다 1 멤버에 대한 친화성이 훨신 높은 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
61. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 제 1 멤버에 대해 2x10⁷M이상의 결합상수를 보이는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
62. 제 2항, 14항, 24항 또는 30항에 있어서, 항체는 제 1 멤버에 대해 2x10⁷M이상의 친화상수를 갖는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
63. 제 1항, 13항, 23항 또는 29항에 있어서, 이황화결합을 형성하는 면역글로불린의 변이영역에 하나 또는 복수 시스테인 잔기가 SH기를 갖지 않는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
64. 제 63항에 있어서, 하나 또는 복수 시스테인 잔기중 적어도 하나는 L 사슬 변이영역의 23 또는 88위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
65. 제 63항에 있어서, 하나 또는 복수 시스테인 잔기중 적어도 하나는 H 사슬 변이영역의 23 또는 92위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
66. 제 63항에 있어서, SH기를 갖지 않는 아미노산 잔기중 적어도 하나는 알라닌인 것을 특징으로 하는 변형면역글로불린.
67. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변이도메인으로 이루어진 분자에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 변이도메인은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하지만, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않고, 상기 제 1 멤버는 암 항원인 것을 특징으로 하는 분자.
68. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변이도메인으로 이루어진 분자에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 변이도메인은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖고, 자연상태에서 CDP에서 발견되지 않고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하고, 상기 제 1 멤버는 감염성 질병병인의 항원인 것을 특징으로 하는 분자.
69. 제 1 멤버의 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변이도메인으로 이루어진 분자에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 변이도메인은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖고, 상기 영역은 결합위치가 ASn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro 서열을 갖지 않는 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하고, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않고, 상기 제 1 멤버는 감염성 질병병인에 대한 세포 수용체인 것을 특징으로 하는 분자.
70. 제 1 멤버의 리간드-수용체 결합쌍과 면역특이적으로 결합하는 변이도메인으로 이루어진 분자에 있어서, 상기 결합쌍은 제 1 멤버와 제 2 멤버로 이루어지고, 상기 변이도메인은 제 2 멤버의 일부영역을 보유한 하나이상의 CDR을 갖고, 상기 영역은 제 1 멤버에 대한 결합위치를 보유하지만, 자연상태에서 CDR에는 발견되지 않는 것을 특징으로 하는 분자.
71. 제 67항, 68항, 69항 또는 70항에 있어서, 분자는 단일사슬항체인 것을 특징으로 하는 분자.
72. 제 67항, 68항, 69항 또는 70항에 있어서, 추가로 일정도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
73. 제 72항에 있어서, 상기 영역 포함 CDR을 제외하고, 변이도메인은 생쥐항체로부터 얻은 것이고, 일정영역은 사람항체에서 얻은 것을 특징으로 하는 분자.
74. 제 72항에 있어서, 상기 영역 포함 CDR을 제외하고, 변이도메인은 사람 항체에서 얻은 골격영역과 생쥐에서 얻은 CDR을 갖고, 여기서, 일정영역은 사람항체에서 얻은 것을 특징으로 하는 분자.
75. 제 74항에 있어서, 변이영역은 자연발생 골격영역의 측면에서, 하나이상의 아미노산 변화가 일어난 골격영역을 갖는 것을 특징으로 하는 분자.
76. 제 67항, 68항, 69항 또는 70항에 있어서, 공유결합을 통해서, 면역자극인자, 생장강화인자, 또는 이들의 기능적 단편과 융합되는 것을 특징으로 하는 분자.
77. 제 76항에 있어서, 면역자극인자는 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-10, 인터루킨-12, 인터루킨-15, G-집락 자극인자, 종양괴사인자, 포린, 인터페론-감마, NK 세포 항원에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분자.
78. 제 1항, 13항, 23항, 29항의 변형면역글로불린을 인코드한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
79. 제 67항, 68항, 69항, 70항의 분자를 인코드한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
80. 제 78항에 있어서, 핵산은 벡터인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
81. 제 79항에 있어서, 핵산은 벡터인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
82. 제 78항에 있어서, 핵산은 재조합성인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
83. 제 79항에 있어서, 핵산은 재조합성인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
84. 제 78항의 핵산을 보유한 것을 특징으로 하는 재조합 비-사람 동물,
85. 제 79항의 핵산을 보유한 것을 특징으로 하는 재조합 비-사람 동물,
86. 제 1항, 13항, 23항 또는 29항의 변형된 면역글로불린의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
87. 제 67항, 68항, 69항 또는 70항의 변형된 면역글로불린의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
88. 제 78항의 핵산의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
89. 제 79항의 핵산의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
90. 제 82항의 재조합 세포의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
91. 제 83항의 재조합 세포의 치료 또는 예방적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
92. 제 1항, 13항, 23항 또는 29항의 변형면역글로불린의 면역반응 유도에 충분양 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 백신조성물.
93. 제 67항, 68항, 69항 또는 70항의 분자의 면역반응 유도에 충분양 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 백신조성물.
94. 제 63항의 변형면역글로불린의 면역반응 유도에 충분양 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 백신조성물.
95. 테스트할 샘플에 있는 암 항원을 확인하고, 이를 측정하거나 감지하는 방법에 있어서, 암 항원은 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제 1 멤버이고, 이때 방법은

    (a) 샘플에 있는 임의 암 항원에 변형 면역글로불린이 면역 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에서 암 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린과 테스트할 샘플을 접촉시키는데, 이때 변형된 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 제2멤버의 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 암 항원에 결합 부분을 포함하고;

    (b) 암 항원에 변형된 면역글로불린의 임의 결합이 일어났는지를 감지하고,

    이때 암 항원에 변형된 면역글로불린의 결합이 있는 경우는 샘플에 암 항원이 존재한다는 것을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
96. 테스트할 샘플에 있는 감염성 질환 매체의 항원을 확인하고, 이를 측정하거나 감지하는 방법에 있어서, 항원은 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제 1 멤버이고, 이때 방법은

    (a) 샘플에 있는 임의 항원에 변형 면역글로불린이 면역 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에서 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린과 테스트할 샘플을 접촉시키는데, 이때 변형된 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 제2멤버의 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 항원에 결합 부분을 포함하고;

    (b) 항원에 변형된 면역글로불린의 임의 결합이 일어났는지를 감지하고

    이때 항원에 변형된 면역글로불린의 결합이 있는 경우는 샘플에 항원이 존재한다는 것을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
97. 테스트할 샘플에 있는 리간드를 확인하고, 이를 측정하거나 감지하는 방법에 있어서, 리간드는 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제 1 멤버이고, 이때 방법은

    (a) 샘플에 있는 임의 리간드에 변형 면역글로불린이 면역 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에서 리간드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린과 테스트할 샘플을 접촉시키는데, 이때 변형된 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 제2멤버의 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 리간드에 결합 부분을 포함하고;

    (b) 리간드에 변형된 면역글로불린의 임의 결합이 일어났는지를 감지하고

    이때 리간드에 변형된 면역글로불린의 결합이 있는 경우는 샘플에 리간드가 존재한다는 것을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
98. 테스트할 샘플에 있는 수용체를 확인하고, 이를 측정하거나 감지하는 방법에 있어서, 수용체는 제 1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제 1 멤버이고, 이때 방법은

    (a) 샘플에 있는 임의 수용체에 변형 면역글로불린이 면역 특이적으로 결합할 수 있는 조건하에서 수용체에 면역특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린과 테스트할 샘플을 접촉시키는데, 이때 변형된 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 도메인으로 구성되고, 이때 제2멤버의 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 수용체에 결합 부분을 포함하고;

    (b) 수용체에 변형된 면역글로불린의 임의 결합이 일어났는지를 감지하고

    이때 수용체에 변형된 면역글로불린의 결합이 있는 경우는 샘플에 수용체가 존재한다는 것을 나타내는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
99. 암 항원을 감지하는 키트에 있어서, 암 항원은 제1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 키트의 용기에는

    (a) 암 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린; 이때 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 부분으로 구성되고, 이때 제2부분의 일부는 CDR에 자연상태에서는 발견되지 않는 암 항원에 결합 부위를 포함하는 부분이고, 그리고

    (b) 면역글로불린에 암 항원의 결합을 감지할 수 있는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
100. 감염성 질환 매체의 항원을 감지하는 키트에 있어서, 항원은 제1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 키트의 용기에는

     (a) 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린; 이때 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 부분으로 구성되고, 이때 제2부분의 일부는 CDR에 자연상태에서는 발견되지 않는 항원에 결합 부위를 포함하는 부분이고, 그리고

     (b) 면역글로불린에 항원의 결합을 감지할 수 있는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
101. 감염성 질환 매체의 세포 수용체를 감지하는 키트에 있어서, 세포 수용체는 제1 멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 키트의 용기에는

     (a) 세포 수용체에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린; 이때 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 부분으로 구성되고, 이때 제2부분의 일부는 CDR에 자연상태에서는 발견되지 않고, 서열이 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro가 아닌 세포 수용체에 결합 부위를 포함하는 부분이고, 그리고

     (b) 면역글로불린에 세포 수용체의 결합을 감지할 수 있는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
102. 리간드를 감지하는 키트에 있어서, 리간드는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 키트의 용기에는

     (a) 리간드에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린; 이때 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 부분으로 구성되고, 이때 제2부분의 일부는 CDR에 자연상태에서는 발견되지 않는 리간드에 결합 부위를 포함하는 부분이고, 그리고

     (b) 면역글로불린에 리간드의 결합을 감지할 수 있는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
103. 수용체를 감지하는 키트에 있어서, 수용체는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 키트의 용기에는

     (a) 수용체에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 면역글로불린; 이때 면역글로불린은 제2멤버의 일부를 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변 부분으로 구성되고, 이때 제2부분의 일부는 CDR에 자연상태에서는 발견되지 않는 수용체에 결합 부위를 포함하는 부분이고, 그리고

     (b) 면역글로불린에 수용체의 결합을 감지할 수 있는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
104. 암 항원이 증가된 것을 특징으로 하는 암을 진단 또는 암이 존재하는지를 스크리닝 또는 암 발생 가능성을 예측하는 방법에 있어서, 암 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 이때 방법은

     개체에서 유도된 샘플에 변형된 면역글로불린의 면역특이적인 결합 수준을 개체에서 측정하고, 이때, 변형된 면역글로불린은 암 항원에 면역특이적으로 결합하고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 암 항원에 결합부위를 가지고;

     암이 없거나 암에 걸릴 성향이 없는 개체에서 구한 유사한 샘플에서 면역 특이적인 결합수준과 비교하였을 때 면역특이적인 결합 수준이 증가되었다는 것은 암이 존재하거나 암이 발생될 성향이 있다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
105. 감염성 질환 매체의 항원이 증가된 것을 특징으로 하는 감염성 질환 매체를 진단 또는 스크리닝하는 방법에 있어서, 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 이때 방법은

     개체에서 유도된 샘플에 변형된 면역글로불린의 면역특이적인 결합 수준을 개체에서 측정하고, 이때, 변형된 면역글로불린은 항원에 면역특이적으로 결합하고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 항원에 결합부위를 가지고;

     감염성 질환 매체가 없는 개체에서 구한 유사한 샘플에서 면역 특이적인 결합수준과 비교하였을 때 면역특이적인 결합 수준이 증가되었다는 것은 감염성 질환 매체가 존재한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
106. 암 항원이 있는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 암 항원은 변형 면역글로불린에 면역특이적으로 결합하고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 항원에 결합부위를 가지고; 이 방법은 변형된 면역글로불린의 치료요법적 또는 예방학적 효과량을 개체에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
107. 감염성 질환 매체가 있는 것을 특징으로 하는 감염성 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 감염성 질환의 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 항원은 변형 면역글로불린에 면역특이적으로 결합하고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 항원에 결합부위를 가지고; 이 방법은 변형된 면역글로불린의 치료요법적 또는 예방학적 효과량을 개체에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
108. 세포 수용체에 결합하는 감염성 질환 매체에 의한 질병의 치료 또는 예방이 필료한 개체에서 질병 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 세포 수용체는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 세포 수용체는 변형 면역글로불린에 면역특이적으로 결합하고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 결합 부위는 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro의 서열을 가지지 않고, CDR에서 자연상태에서 발견되지 않는 세포 수용체에 대한 결합 부분을 포함하고, 이 방법은 변형된 면역글로불린의 치료요법적 또는 예방학적 효과량을 개체에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
109. 결합쌍의 제 1 멤버의 활성을 조절하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1과 제2 멤버로 구성되고, 이 방법은 청구항 1, 13, 23 또는 29에 따른 변형 면역글로불린을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
110. 암 항원에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 만드는 방법에 있어서, 암 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 암 항원에 결합부위를 가지고; 생산하는 방법은 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 면역글로불린을 발현시키도록 하고, 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법.
111. 감염성 질환 매체의 항원에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 만드는 방법에 있어서, 항원은 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 항원에 결합부위를 가지고; 생산하는 방법은 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 면역글로불린을 발현시키도록 하고, 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법.
112. 감염성 질환 매체의 세포 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 만드는 방법에 있어서, 세포 수용체는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro 서열이 아닌, CDR에서 자연 발생되지 않는 세포 수용체의 결합 부위를 포함하고; 생산하는 방법은 변형 면역글로불린을 인코드하는 핵산 서열로 구성된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 면역글로불린을 발현시키도록 하고, 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법.
113. 리간드에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 만드는 방법에 있어서, 리간드는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 리간드에 대한 결합부위를 가지고; 생산하는 방법은 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 면역글로불린을 발현시키도록 하고, 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법.
114. 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 만드는 방법에 있어서, 수용체는 제1멤버와 제2멤버로 구성된 결합쌍의 제1멤버이고, 변형 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 수용체에 대한 결합부위를 가지고; 생산하는 방법은 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 면역글로불린을 발현시키도록 하고, 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법.
115. 청구항 1, 15, 23, 또는 29항에 따른 변형 면역글로불린을 인코드하는 핵산을 만드는 방법에 있어서,

     (a) 한 세트의 올리고뉴클레오티드를 합성하고; 이때 세트는 변형 면역글로불린을 인코드는 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 일부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 단 변형된 면역글로불린의 N-말단 및 C-말단 부분을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제외하고는 각 올리고뉴클레오티드는 세트의 또다른 올리고뉴클레오티드와 겹쳐지는 말단 서열을 가지고,

     (b) 올리고뉴클레오티드가 서로 하이브리드될 수 있도록 하고; 그리고

     (c) 하이브리드된 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜, 변형 면역글로불린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 만들어지도록 하는 과정으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산을 생산하는 방법.
116. 결합쌍의 제1멤버에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1멤버와 제2멤버로 구성되고, 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 제1멤버에 대한 결합부위를 가지고; 제1멤버는 암 항원이고;

     이때 방법은

     (a) 청구항 115항에 따른 방법으로 생산된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 뉴클레오티드를 발현시키도록 하고; 그리고

     (b) 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
117. 결합쌍의 제1멤버에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1멤버와 제2멤버로 구성되고, 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 제1멤버에 대한 결합부위를 가지고; 제1멤버는 감염성 질환 매체의 항원이고;

     이때 방법은

     (a) 청구항 115항에 따른 방법으로 생산된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 뉴클레오티드를 발현시키도록 하고; 그리고

     (b) 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
118. 결합쌍의 제1멤버에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1멤버와 제2멤버로 구성되고, 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않고, Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro 서열이 아닌 제1멤버에 대한 결합 부위를 가지고, 제1멤버는 감염성 질환 매체에 대한 세포 수용체이고;

     이때 방법은

     (a) 청구항 115항에 따른 방법으로 생산된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 뉴클레오티드를 발현시키도록 하고; 그리고

     (b) 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
119. 결합쌍의 제1멤버에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1멤버와 제2멤버로 구성되고, 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 제1멤버에 대한 결합부위를 가지고; 제1멤버는 리간드이고;

     이때 방법은

     (a) 청구항 115항에 따른 방법으로 생산된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 뉴클레오티드를 발현시키도록 하고; 그리고

     (b) 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
120. 결합쌍의 제1멤버에 면역특이적으로 결합하는 변형 면역글로불린을 생산하는 방법에 있어서, 결합쌍은 제1멤버와 제2멤버로 구성되고, 면역글로불린은 제2멤버의 일부분을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지는 가변성 도메인으로 구성되고, 이때 일부분은 CDR에서 자연 발생되지 않는 제1멤버에 대한 결합부위를 가지고; 제1멤버는 수용체이고;

     이때 방법은

     (a) 청구항 115항에 따른 방법으로 생산된 핵산을 포함하는 재조합 세포를 생장시켜, 세포가 인코드된 변형 뉴클레오티드를 발현시키도록 하고; 그리고

     (b) 발현된 변형 면역글로불린을 회수하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
121. 청구항 115항의 방법에 의해 생산된 것을 특징으로 한 분리된 핵산.
122. 제 121항에 있어서, 핵산이 벡터인 것을 특징으로 한 분리된 핵산.