DE69332930T2

DE69332930T2 - Peptide mit breiter neoplastischer spezifizität

Info

Publication number: DE69332930T2
Application number: DE69332930T
Authority: DE
Inventors: Fernando J.R. Do Couto; Roberto L. Ceriani; Jerry A. Peterson; Eduardo A. Padlan
Original assignee: Cancer Research Fund of Contra Costa
Current assignee: Cancer Research Fund of Contra Costa
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2013-11-17
Also published as: CA2149529C; JPH09503901A; CA2149529A1; WO1994011509A2; DE69332930D1; WO1994011509A3; AU6396494A; EP0674710A1; EP0674710B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die in vitro-Diagnose von neoplastischen Tumoren, insbesondere von Carcinomen, unter anderem mittels spezifischer zielgerichteter Analog-Peptide, die Aminosäuresequenzen, welche die komplementätsbestimmenden Bereiche ("complementarity determining regions", CDRs) einer anderen Spezies umfassen, und Analoga der variablen (F_v) Region von Anti-Carcinom-Antikörper umfassen. Die Carcinom-spezifischen Peptide zur Verwendung in einer Spezies, z. B. Menschen, werden als einzelne Aminosäurekette bereitgestellt, die die Spezifität von F_v-Regionen besitzen, die aus anderen Spezies gewonnen wurden, z. B. Maus-Antikörper-F_v-Regionen der leichten oder schweren Ketten, oder als gepaarte Ketten. Diese Peptide werden entweder als solche zur Verfügung gestellt, oder gebunden an andere Moleküle, wie beispielsweise synthetische Polymere oder Oligopeptide, was zu Sequenzen aus miteinander vermischten Spezies führt, und insbesondere zu Analoga von humanen/nicht-humanen chimärischen Antikörpern oder anderen polymeren Konstrukten. Die Analog-Peptide umfassen Sequenzen, die von den variablen Regionen heterologer Antikörper, die spezifisch für z. B. humane Carcinom-Antigene sind, abgeleitet, welche eine geringere Immunantwort im Menschen hervorrufen, als die gesamten heterologen Antikörper. Die Anti-Idiotyp-Polypeptide und deren Analoga sind zur Immunisierung von Menschen oder anderen Tieren gegen Carcinome geeignet. Polynucleotid-Segmente, die für das Analog-Peptid und Anti-Idiotyp-Polypeptide codieren, und Hybridvektoren und transfizierte Wirtszellen, die die Segmente tragen, sind für die Herstellung der hierin offenbarten Peptide nützlich.
Beschreibung des wissenschaftlichen Hintergrundes
Carcinome sind eine Folge der carcinogenen Transformation von Zellen unterschiedlicher Epithelien. Zwei der zerstörerischsten Eigenschaften von Carcinomen sind deren unkontrolliertes Wachstum und deren Fähigkeit, Metastasen an unterschiedlichen Stellen des Wirts zu erzeugen, insbesondere bei einem menschlichen Wirt. Üblicherweise sind es diese entfernten Metastasen, die dem Wirt ernste Folgen verursachen, da sehr häufig das primäre Carcinom in den meisten Fällen chirurgisch entfernt werden kann. Die Behandlung von metastasierenden Carcinomen, die nur selten entfernbar sind, beruht auf der Strahlungstherapie und systemischen Therapien unterschiedlicher Naturen. Die systemischen Therapien umfassen sehr häufig Chemotherapie, Strahlung, Hormontherapie, unterschiedliche Immunitätsverstärkende Medikamente und Verfahren, Hyperthermie und systemische monoclonale Antikörper-Behandlung. Letztere können mit radioaktiven Elementen, Immuntoxinen und chemotherapeutischen Arzneimitteln markiert werden.
Radioaktiv markierte monoclonale Antikörper wurden anfänglich mit Erfolg bei Lymphomen und Leukämie, und neuerdings bei einigen Carcinomen verwendet. Das Konzept, das der Verwendung von markierten Antikörpern zugrunde liegt, ist, dass der markierte Antikörper das Carcinom spezifisch suchen und binden wird, und dass das radioaktive Element durch seinen Verfall den Tumor in situ bestrahlen wird. Da radioaktive Strahlung in Tumoren eine gewisse Distanz zurücklegt, ist es nicht notwendig, dass jede Carcinomzelle an den markierten Antikörper bindet. Die Spezifität der monoclonalen Antikörper erlaubt eine selektive Behandlung des Tumors, während die Bestrahlung von unschädlichen benachbarten normalen Geweben, die Dosis-limitierend sein könnte, vermieden wird. Chemotherapie ruft ernste toxische Wirkungen bei normalen Geweben hervor, was die Chemotherapie von Carcinomen weniger wünschenswert macht, und die Verwendung von radioaktiv markierten monoclonalen Antikörpern zu einer wirksamen Alternative macht.
Nicht-humane Antikörper, die gegen humane Epitope gezogen wurden, wurden für die Diagnose und Therapie von Carcinomen verwendet, wie im Stand der Technik bekannt ist. Ebenso bekannt sind die Verfahren zur Herstellung sowohl polyclonaler, als auch monoclonaler Antikörper. Beispiele für Letztere sind BrE-2, BrE-3 und KC-4 (z. B. US-Patente 5 077 220, 5 075 219 und 4 708 930).
Der monoclonale Maus-Antikörper KC-4 ist spezifisch für eine einzige antigenische Determinante, das "Antigen", und bindet selektiv sehr stark an neoplastische Carcinomzellen und nicht an normales humanes Gewebe (US-Patent 4 708 930 von Coulter). Das Antigen tritt bei Carcinomzellen in zwei Formen auf, wobei lediglich die kleinere dieser Formen in der Zellmembran exprimiert ist. Die größere Form tritt nur im Cytoplasma auf und hat ein ungefähres Molekulargewicht von 490 Kilo-Dalton (kD) (im Bereich von 480.000–510.000). Die zweite Form tritt mit höherer Expressionsdichte auf, findet sich sowohl im Cytoplasma, als auch der Membran von Carcinomzellen und hat ein ungefähres Molekulargewicht von 438 kD (im Bereich von 390.000–450.000), bestimmt durch Gelelektrophorese mit Markierungsproteinen bekannten Molekulargewichts. Markierter KC-4 wurde bei der Diagnose und medizinischen Behandlung verschiedener Carcinome, insbesondere Adeno-Carcinomen und Plattenepithel-Carcinomen, angewendet, ungeachtet des menschlichen organischen Ursprungsortes.
Vom BrE-3-Antikörper (Peterson et al., Hybridoma 9 : 221 (1990); US-Patent 5 075 219) wurde gezeigt, dass er an die invertierte Sequenzwiederholung ("tandem repeat") des Polypeptid-Kerns von humanem Brust-Epithel-Mucin bindet. Wenn das Mucin deglykosyliert ist, werden mehr invertierte Sequenzwiederholungen exponiert, und die Bindung des Antikörpers nimmt zu. Daher binden Antikörper, wie BrE-3, bevorzugt an neoplastische Carcinom-Tumoren, da diese eine nicht-glykosylierte Form des Brust-Epithel-Mucins exprimieren, die nicht in normalem epithelialen Gewebe exprimiert wird. Diese bevorzugte Bindung, in Kombination mit einer beobachteten niedrigen Epitop-Konzentration für diese Antikörper im Blutkreislauf von Carcinom-Patienten, wie beispielsweise Brustkrebs-Patienten, macht Antikörper, die eine Spezifität für ein Mucin-Epitop besitzen, sehr wirksam bei der Carcinom-Radioimmuntherapie. Ein ⁹⁰Y-BrE-3-Radioimmunkonjugat erwies sich als sehr effektiv gegen humane Brust-Carcinome, die in Nacktmäuse transplantiert wurden. Humane klinische Studien zeigten, dass das ⁹⁰Y-BrE-3-Radioimmunkonjugat die Größe von Brusttumor-Metastasen erheblich reduzierte, und zwar ohne irgendwelche unmittelbaren toxischen Nebenwirkungen. Außerdem wurde ein ¹¹¹In-BrE-3-Radioimmunkonjugat erfolgreich der in vivo-Diagnostik von 15 Brustkrebs-Patienten verwendet; er sorgte für eine exzellente Zielmarkierung bei 13 von 15 Patienten. von allen Brusttumor-Metastasen, die in einer anderen Studie auftraten, wurden 86% durch ¹¹¹In-BrE-3 detektiert. Unglücklicherweise entwickelten die Patienten 2 bis 3 Wochen nach der Behandlung eine starke Human-anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Reaktion, die eine weitere Verabreichung des Radioimmunkonjugates verhinderte. Die HAMA-Reaktion, welche bei zahlreichen monoclonalen Maus-Antikörpern beobachtet wird, verhindert jegliche Langzeit-Verabreichung von Maus-Antikörpern an humane Patienten. Ganz ähnlich rufen andere heterologe Antikörper ähnliche Antikörper-Reaktionen hervor, wenn sie Menschen verabreicht werden. Die humane anti-heterologe Reaktion ist daher ein wesent- lich begrenzender Faktor, der die erfolgreiche Verwendung heterologer monoclonaler Antikörper als therapeutische Agentien behindert, welche sonst Brust-Carcinome spezifisch zerstören können, wobei wenig oder kein Schaden an normalem Gewebe verursacht wird und welche keine anderen toxischen Wirkungen besitzen.
Chimäre Antikörper sind direkte Fusionen zwischen variablen Domänen einer Spezies und konstanten Domänen einer anderen. Von chimären Maus/Human-Antikörpern, die von anderen Typen von B-Zellen präpariert wurden, welche an andere Typen von antigenischen Determinanten binden, wurde gezeigt, dass sie bei Menschen weniger immunogen sind als ganze Maus-Antikörper. Diese erwiesen sich als weniger immunogen, aber noch immer wird in einigen Fällen eine Immunantwort gegen die Nagetier-Gerüstregion der variablen Region (FR) hervorgerufen. Eine weitere Reduktion der "fremden" Eigenschaft der chimären Antikörper wurde erreicht, indem nur die CDRs von einem monoclonalen Nagetier-Antikörper auf ein humanes Stützungsgerüst aufgepfropft wurde, und zwar vor der nachfolgenden Fusion mit einer geeigneten konstanten Domäne (europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 239 400 von Winter; Riechmann et al., Nature 332: 323–327 (1988)). Die internationale Patentanmeldung No. 92/04380 offenbart einen Antikörper mit aufgepflanztem CDR gegen humanes polymorphes Mucin, einen Brusttumor-Marker, der auch an humanes Milchfettkügelchen ("human milk fat globule", HFMG) bindet. Jedoch führen die verwendeten Verfahren um die CDR-Verpflanzung zu erreichen, oft zu unvollendet "humanisierten" Antikörpern. Das soll heißen, der daraus hervorgehende Antikörper verliert an Avidität (für gewöhnlich bestenfalls 2- bis 3 fach) .
Die Eigenschaften der Ligandenbindung einer Antikörper-Kombinationsstelle werden vornehmlich durch die Struktur und relative Verteilung der CDRs bestimmt, obwohl man he rausfand, dass einige benachbarte Reste ebenfalls in die Antigen-Bindung involviert sind (Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439–473 (1990)).
Die Technologien der Molekularbiologie haben die Nützlichkeit vieler Antikörper erweitert, indem sie die Bildung von Molekülen mit gewechselter Klasse ermöglichen, deren Funktionalität durch die Erlangung oder den Verlust der Komplementfixierung verbessert wurde. Die Größe des bioaktiven Moleküls kann ebenfalls reduziert werden um so die Verfügbarkeit des Antikörpers im Zielgewebe zu erhöhen, indem entweder die Klasse von IgM zu IgG gewechselt wird, oder indem der größte Teil der konstanten Regionen der schweren und leichten Kette unter Bildung eines F_v-Antikörpers entfernt wird. Allen diesen potentiellen therapeutischen Antikörperformen sind die erforderlichen komplementätsbestimmenden Bereiche (CDRs), welche das Molekül zu seinem Liganden leiten, und die Gerüst-Reste ("framework residues", FRs), welche die CDRs stützen und deren Ausrichtung zueinander bestimmen, gemein. Die kristallographische Untersuchung zahlreicher Antikörperstrukturen zeigte, dass die Antigen-Kombinationsstelle fast ausschließlich aus den CDR-Resten, die in einer begrenzten Anzahl von Schleifen-Motiven angeordnet sind, zusammengesetzt ist. die Notwendigkeit für die CDRs, diese Strukturen auszubilden, in Kombination mit der geschätzten Hypervariabilität ihrer Primärsequenz, führt zu einer großen Diversität an der Antigen-Kombinationsstelle, aber zu einer, welche eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten hat. Daher legen die Hypermutabilität und das begrenzte Primärsequenz-Repertoir für jeden CDR nahe, dass die CDRs, die für ein vorgegebenes Antigen von einer Tierart abgeleitet sind, dieselben sind wie die, die von einer anderen Art abgeleitet sind. Daher sollten sie, wenn überhaupt, nur schwach immunogen sein, wenn sie einem Empfängerorganismus präsentiert werden.
Dementsprechend besteht noch immer ein Bedarf für ein Produkt mit hoher Affinität und/oder Spezifität für Carcinom-Antigene, das sich zur Detektion und Therapie von Carcinomen eignet, welches geringere Antikörperreaktion hervorruft, als ganze nicht-humane Antikörper oder chimäre Antikörper, die beispielsweise die gesamte nicht-humane variable Region enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Analog-Peptid und sein glykosyliertes Derivat, welches spezifisch und selektiv an humanes Milchfettkügelchen(HFMG)-Antigen und an ein Antigen bindet, das auf der Oberfläche oder in dem Cytoplasma von Tumorzellen, wie beispielsweise Carcinomzellen, zu finden ist, oder das von diesen Zellen freigesetzt wird, wobei das Analog-Peptid im Wesentlichen aus mindestens einer variablen Region der leichten oder schweren Ketten eines Antikörpers einer ersten Spezies besteht, der Affinität und Spezifität für ein Antigen besitzt, das auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer Carcinomzelle zu finden ist oder von der Zelle freigesetzt wird, wobei Aminosäuren in der FR mit Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren, die in äquivalenten Positionen in Antikörpern einer anderen Spezies als der ersten Spezies vorhanden sind, substituiert sind, oder auf Fragmente davon, die 1 bis 3 CDRs pro Kette oder 1 bis 3 CDRs plus deren flankierende Regionen umfassen, jedes davon mit ungefähr 1 bis mindestens 10 Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Fragment von ungefähr 1 bis mindestens 10 Aminosäuren, Kombinationen daraus oder Kombinationen daraus mit anderen variablen Regionen oder deren Analoga, wobei jedes Analog-Peptid mit mindestens einem anderen Peptid oder dessen Analog operativ verbunden ist, oder Gemische daraus.
Hierin wird ebenfalls ein Fusionsprotein und ein Hybrid-Polymer, das das erfindungsgemäße Analog umfasst, die entsprechenden DNAs, die diese codieren, ein Hybrid-Vektor daraus, transfizierte Wirte und RNA bereitgestellt.
Diese Erfindung umfasst auch eine Methode zur Herstellung eines Analog-Peptids oder eines Hybrid-Analog-Peptids mittels rekombinanter Technik, in vitro-Verfahren der Diagnose und Immunhistochemie von Gewebeschnitten und ex vivo-Verfahren zur Befreiung von neoplastischen Zellen.
Es werden hierin ebenfalls Anti-Idiotyp-Polypeptide offenbart, die polyclonale Antikörper umfassen, die gegen das erfindungsgemäße Analog-Peptid gezogen wurden, deren Analoga, deren monoclonale Antikörper, Fragmente davon, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fab', (Fab')₂, CDRs, variable Regionen und deren Analoga, wie oben beschrieben, Kombinationen daraus, die funktionell miteinander verknüpft sind, ein Anti-Carcinom-Vakzine und ein Vakzinierungs-Kit.
Andere Aufgaben, Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der nachfolgenden Diskussion ersichtlich.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Erfindung entstand aus einem Wunsch der Erfinder, eine Antikörper-Technologie zu verbessern, die zur Verwendung in diagnostischen, prognostischen, Vakzin- und therapeutischen Anwendungen im Gebiet von Neoplasmas und Krebs geeignet ist. Die vorliegende Erfindung wird für die Anwendung bei Menschen beschrieben. Sie ist jedoch auch zur Verwendung in anderen Spezies geeignet. Die monoclonalen Antikörper, die bis zum jetzigen Zeitpunkt hergestellt wurden, wurden hergestellt, indem immortalisierte Zelllinien mit B-Zellen nicht-humaner Herkunft, wie Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege, und ähnliche, fusioniert wurden. Viele dieser Hybridome können große Mengen monoclonaler Antikörper herstellen, die wünschenswerte Bindungseigenschaften, wie hohe Affinität und/oder Spezifität und Selektivität für Carcinom-Antigene einer Spezies, z. B. für humane Carcinom-Antigene, besitzen. Im Allgemeinen können jedoch Antikörper von anderen Spezies, z. B. nicht-humane Antikörper, einem Patienten einer vorbestimmten Art, z. B. Menschen, aufgrund der zerstörerischen Wirkung, die sie hervorrufen, nur einmal verabreicht werden. Dies trifft auf die meisten heterologen Antikörper zu, die Säugetieren verabreicht werden. Zum Beispiel löst die wiederholte Verabreichung von Maus-Antikörpern an einen menschlichen Patienten eine starke humane Anti-Maus-Antikörper(HAMA)-Reaktion hervor, welche deren weitere Verwendung als therapeutische Agentien bei Menschen ausschließt. Diese nicht-humanen Antikörper lösen eine unmittelbare Abwehrreaktion in vielen humanen Patienten aus und werden dadurch für weitere Verabreichung als therapeutisches Agens unwirksam gemacht. In einigen Fällen können nicht-humanhumane chimäre Antikörper und nicht-humane CDR"verpflanzte" humane Antikörper eine niedrigere Affinität und/oder Spezifität für deren Antigene besitzen, als die entsprechenden nicht-humanen Antikörper. Andererseits waren humane monoclonale Hybridom-Zelllinien nicht sehr stabil und waren deswegen nicht geeignet für die wiederholte und Großmaßstabs-Produktion von monoclonalen Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung kann zur Herstellung von Analog-Peptiden mit einer hohen Anzahl von Aminosäuren in den entsprechenden Positionen, die in den endogenen Antikörpern zu finden sind, und wobei mindestens die CDRs von einer anderen xenogenischen Spezies sind, verwendet werden.
Die Erfinder haben daher die Herstellung von nicht-humanen Anti-Tumor-CDRs und nicht-humanen variablen Regionen von Antikörpern unternommen, welche eine hohe Affinität und Spezifität für ein Antigen besitzen, das auf der Oberfläche oder im Cytoplasma von humanen neoplastischen Zellen, wie beispielsweise Carcinomzellen, zu finden ist, oder das von der Zelle freigesetzt wird, wobei ungefähr 1 bis 46 Aminosäuren in der Gerüstregion (FR) pro Kette mit Aminosäuren substituiert sind, die an äquivalenten Positionen in anderen humanen Antikörpern vorhanden sind, oder Fragmente davon, die 1 bis 3 CDRs pro Kette oder 1 bis 3 CDRs pro Kette plus flankierende Regionen, jeweils ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder plus ein N-terminales Fragment von ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, umfassen, um die anti-xenogenische Reaktion zu vermindern oder sogar zu umgehen. Um die wesentliche Bindungsspezifität in den Molekülen, die zur Verwendung bei Menschen vorgesehen waren, zu erhalten, verwendet die vorliegende Erfindung CDRs und/oder Analoga unterschiedlicher Länge der variablen Regionen von leichten und/oder schweren Ketten von Antikörpern anderer Spezies, wie beispielsweise und unter anderem Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege, Pferd, Primaten, Rindern und Meerschweinchen. Heterologe humane CDRs und/oder Analoga von deren variablen Regionen können verwendet werden, sind zur Verwendung in anderen Spezies vorgesehen.
Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass diese Analog-Antikörperfragmente im Wesentlichen die Bindungs-, Spezifitäts- und Selektivitäts-Eigenschaften des gesamten nicht-humanen Antikörpers beibehalten, während sie eine weniger zerstörerische immunologische Reaktion hervorrufen. Jedoch sorgt das einfache Beibehalten der Bindungsregion eines Antikörpers nicht alleine dafür, dass die Bindungseigenschaften des Antikörpers aufrecht erhalten werden. Antikörper sind Glykopolypeptide, die in spezifische Konformationen gefaltet sind. Wenn der Glykosid-Anteil des Moleküls oder Teile der Aminosäuresequenz gestört oder ausgeschnitten werden, kann das Faltungsmuster des Moleküls gestört werden. Daher muss jede Deletion oder Modifikation der Sequenz eines Antikörpers so vorgenommen werden, dass beachtet wird, dass seine Faltungsabhängigen Eigenschaften vermindert oder sogar zerstört werden können, wenn die Faltung wesentlich beeinflusst wird, obwohl die Aminosäuresequenzen, die bei der Bindung des Antigens involviert sind, beibehalten wurden. Die Erfinder wählten die folgende Strategie für die Präparation und Herstellung der Analog- und Hybrid-Peptide dieser Erfindung. Die cDNAs, die für die variablen Ketten eines Antikörpers codieren, können durch Isolation von mRNA von einer Hybridomzelle und reverse Transkription der mRNA, Amplifikation der cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Insertion der DNA in einen Vektor, wahlweise für die Sequenzierung, und zum Schneiden mit Restriktionsenzymen, erhalten werden. Die cDNAs, die für die CDRs oder variable Ketten(F_v)-Region-Fragmente der leichten (V_L) und schweren (V)_H Ketten eines Antikörpers, der Affinität und Spezifität für ein Carcinomzell-Antigen besitzt, codieren, können von isolierter mRNA revers transkribiert werden. Die cDNAs, die für die CDRs codieren, können dann mit anderen Segmenten, die benachbarte Sequenzen codieren, ligiert werden, und die cDNAs der variablen Region können dann mit vorkonstruierten Primern modifiziert werden, welche verwendet werden um sie mit PCR zu amplifizieren oder de novo zu synthetisieren, sie werden in einen Vektor cloniert, der wahlweise DNA-Sequenzen trägt, die z. B. (eine) konstante Region(en) codieren, wahlweise sequenziert, und dann zur Expression des analogen Genprodukts in eine Wirtszelle transfiziert. Die Bindungsspezifitätseigenschaften des Analog-Peptids können dann bestimmt werden und mit jenen des gesamten Antikörpers verglichen werden.
Röntgen-kristallographische Untersuchungen zeigen, dass die Gerüststrukturen der F_v verschiedener Antikörper eine vorschriftsmäßige Struktur einnehmen, und zwar ungeachtet der Herkunftsspezies, der Aminosäuresequenz oder der Ligandenspezifität. Dies wird allgemein als Beweis dafür ge nommen, dass die Liganden-Bindungseigenschaften einer Antikörper-Kombinationsstelle in erster Linie durch die Struktur und die relative Ausrichtung der CDRs bestimmt wird, obwohl einige benachbarte Gerüst-Reste ebenfalls in die Antigen-Bindung involviert sein können. Daher müssen, wenn die feine Spezifität eines Antikörpers gesichert werden soll, seine CDR-Strukturen, und vermutlich einige der benachbarten Reste, deren Wechselwirkung miteinander und mit dem Rest der variablen Domänen, ebenfalls aufrecht erhalten werden. Diese kristallographischen Studien deuten auf die mögliche Notwendigkeit hin, die meisten, wenn nicht sogar alle, der vielen inneren und Zwischen-Domänen-Kontaktreste beizubehalten, da die strukturellen Auswirkungen des Ersatzes von nur einigen von ihnen nicht vorhergesagt werden können.
Während die Notwendigkeit, diese Aminosäuren beizubehalten, zunächst das Ziel, die Immunogenität durch "Humanisierung" herabzusetzen, zu vereiteln scheint, ist jedoch die tatsächliche Anzahl von Aminosäuren, die beibehalten werden muss, im Allgemeinen aufgrund der hervorstechenden Ähnlichkeit zwischen den variablen Regionen von Mensch und Maus klein. Noch dazu besitzen viele, wenn nicht die meisten, der beibehaltenen Aminosäuren Seitenketten, die nicht auf der Oberfläche des Moleküls exponiert werden und daher nicht zu dessen Antigenität beitragen können. Es ist klar, dass es die meisten der exponierten Aminosäuren sind, die gute Kandidaten für die Substitution sind, da es diese Aminosäuren sind, die der immunologischen Umgebung eines Säugers ausgesetzt sind und Epitope von erhöhter Immunogenität bilden können.
Die Herausforderung bei der Humanisierung der variablen Regionen eines nicht-humanen Antikörpers, z. B. eines Maus-Antikörpers, beginnt daher mit der Identifizierung der "wichtigen" xenogenischen Aminosäuren. "Wichtige" Aminosäuren sind jene, die z. B. in die Antigen-Bindung invol viert sind, die mit den CDRs und den gegenüberliegenden Ketten in Kontakt stehen und, und jene, die verborgene Seitenketten besitzen. Idealerweise können diese Reste in einer gut-charakterisierten dreidimensionalen Struktur identifizert werden. Wenn jedoch direkte strukturelle Daten nicht verfügbar sind, ist es glücklicherweise immer noch möglich, die Lage dieser wichtigen Aminosäuren vorherzusagen, indem andere verwandte Antikörperstrukturen analysiert werden, besonders jene, deren variable leichte und schwere Regionen zu derselben Klasse gehören. Die Klassen von variablen Regionen können aufgrund ihrer Aminosäuresequenz bestimmt werden.
Ein Verfahren, mittels dessen diese wichtigen Aminosäuren identifiziert werden, wurde für den Fall der Aminosäuren mit verborgenen Seitenketten von Padlan, E. A., (Padlan, E. A., "A Possible Procedure for Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology, 28: 489–494 (1991)) beschrieben. Im vorliegenden Fall wurden verschiedene Strukturen von variablen Regionen von Antikörpern verglichen, indem ein Computerprogramm verwendet wurde, das die Zugänglichkeit zum Lösungsmittel der Gerüst-Reste sowie deren Kontakt mit der gegenüberliegenden Domäne bestimmt, verwendet wurde, wie beschrieben von Padlan, E. A. (1991), s. o. Überraschenderweise enthüllte eine nähere Untersuchung der fraktionalen Lösungsmittelzugänglichkeit eine sehr große Ähnlichkeit im Expositionsmuster der V_H-und der V_L-Domänen. Einfach ausgedrückt, ungeachtet des jeweiligen fraglichen Antikörpers und dessen Aminosäuresequenz, haben die verborgenen Reste ähnliche relative Positionen in den meisten Antikörpern inne.
Eine ähnliche Untersuchung kann durch Computermodelle durchgeführt werden um zu bestimmen, welche Aminosäuren mit den CDRs in Kontakt stehen und welche die gegenüberliegende Domäne berühren. An diesem Punkt können die Fab- Strukturen, die derzeit in der Protein-Datenbank sind (Bernstein, F. C., et al., J. Mol. Biol. 112: 535–542 (1977)), untersucht werden um zu bestimmen, welche FRs vermutlich zum Aufrechthalten der Struktur der Kombinationsstelle wichtig sind. Somit können nach einer eingehenden Untersuchung vieler hochauflösender dreidimensionaler Strukturen der variablen Regionen die Positionen von allen wichtigen Gerüst-Aminosäuren, d. h. jenen, die mit den CDRs der gegenüberliegenden Domäne in Kontakt stehen und jenen, deren Seitenketten nach innen gerichtet sind, tabellarisiert werden. Das Beibehalten dieser Aminosäuren, sowie jener von den CDRs, und letztlich jener FR-Aminosäuren, die in die Liganden-Bindung involviert sein könnten, sollte zu einem großen Ausmaß die Bewahrung der Affinität sichern. Die präzise Identifizierung von FR-Aminosäuren, die in die Liganden-Bindung involviert sind, kann nicht verallgemeinert werden, da sie für unterschiedliche Antikörper variiert. Nichtsdestotrotz können konservative Entscheidungen getroffen werden um die Aminosäuren, die in FR liegen, die eine hohe Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zum Antigen besitzen, zu bewahren. Diese Regionen liegen unmittelbar neben den CDRs und am N-Terminus beider Ketten, da die Oberflächen dieser Regionen an die CDR-Oberflächen angrenzen.
Überraschenderweise ist es möglich, alle diese wichtigen Aminosäuren in einem heterologen humanisierten Antikörper beizubehalten und immer noch dramatisch die Ähnlichkeit mit einer humanen Konsensussequenz zu erhöhen. D. h., die letztendliche Anzahl von Aminosäuren mit Maus-Identität, die sich von der menschlichen Identität unterscheiden, die beibehalten werden, ist typischerweise klein. Dies ist im Allgemeinen möglich, da humane Gerüste gefunden werden können, die den Maus-Gerüsten ähneln, insbesondere an den Positionen der wichtigen Aminosäuren. Dies rührt daher, dass viele der wichtigen Aminosäuren sowohl bei Maus-, als auch bei humanen Antikörpern, identisch sind.
Alle die Aminosäuren, für die mittels des oben beschriebenen Verfahrens bestimmt wurde, dass sie nicht wichtig sind, können vollständig durch ihre entsprechenden humanen Gegenstücke ersetzt werden. Die Oberfläche der fertigen humanisierten Antikörper sollte der eines humanen Antikörpers sehr ähnlich sehen, mit Ausnahme der Antigenbindenden Oberflächen. Die Originalform dieser bindenden Oberflächen wird jedoch aufrecht erhalten, indem die interne Zusammensetzung des Antikörpers intakt bleibt, Inter-Domänen-Kontakte bewahrt werden und indem einige wenige Schlüssel-Aminosäuren beibehalten werden, die mit den CDRs in Kontakt stehen.
a) Auswahl des besten humanen Gerüsts zur Verwendung bei der "Humanisierung" eines Antikörpers, wenn seine Struktur bekannt ist
Zum derzeitigen Zeitpunkt gibt es 11 Fab-Strukturen, für welche die Atom-Koordinaten bekannt sind, und die in die Protein-Datenbank ("Protein Data Bank") gestellt wurden, wie unten in Tabelle 1 gezeigt, 2 von humanen und 9 von Maus-Antikörpern.
Tabelle 1: Fab-Strukturen, für welche es Koordinatenin der Protein Data Bank gibt
Die Kontakte zwischen Seitenketten in den variablen Domänen der 11 Fabs wurden zusammengestellt und sind in den Tabellen 2 bis 4 unten dargestellt. Die Gerüst(FR)-Aminosäuren (aa's) in den V_L-Domänen, die zu CDRs in Kontakt stehen, sind in Tabelle 2 unten aufgelistet.
Tabelle 2: V_L-Gerüst-Reste, die mit CDR-Resten in Fabsmit bekannter dreidismensionaler Struktur in Kontakt stehen
Jene FR in den V_H-Domänen, die zu CDRs in Kontakt stehen, sind in Tabelle 3 unten aufgelistet.
Tabelle 3: V_H-Gerüst-Reste, die mit CDR-Resten in Fabsmit bekannter dreidimensionaler Struktur in Kontakt stehen
Die FR-Aminosäuren, die mit den gegenüberliegenden Domänen in Kontakt stehen und welche vermutlich diejenigen sind, die hauptsächlich für die Quartär-Struktur der F_v-Domänen verantwortlich sind, sind in Tabelle 4 unten aufgelistet.
Tabelle 4: Gerüst-Reste, die mit Gerüst-Resten in dergegenüberliegenden Domäne in Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur in Kontakt stehen
Die verborgenen, nach innen zeigenden FR-Aminosäuren in den V_L-Domänen, d. h. jene, welche im Domänen-Inneren liegen, sind in Tabelle 5 unten aufgelistet.
Tabelle 5: Nach innen zeigende, verborgene Gerüst-Reste in der V_L von Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur
Jene in der V_H-Domäne sind in Tabelle 6 unten aufgelistet.
Tabelle 6: Nach innen zeigende, verborgene Gerüst-Reste in V_s von Fabs mit bekannter dreidimensionaler Struktur
Aus dem oben Aufgelisteten kann man ersehen, dass

(1) es viele FR-Aminosäuren gibt, die entweder mit den CDRs oder der gegenüberliegenden Domäne in Verbindung stehen, oder die im Inneren der Domäne zu finden sind.
(2) Diese FR-Aminosäuren, welche die Struktur der Kombinationsstelle beeinflussen könnten, und daher die Antigen-Bindungseigenschaften eines Antikörpers, sich von Antikörper zu Antikörper unterscheiden.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass nicht eine Struktur als perfekte und alleinige Basis aller "Animalisierungs"-, oder im vorliegenden Beispiel "Humanisierungs"-Protokolle dienen kann. Tatsächlich müssten, um die 9 Maus-Antikörper, die in Tabelle 1 oben gezeigt sind, durch CDR-Verpflanzung mit Blick darauf, ihre Liganden-Bindungseigenschaften zu bewahren, zu humanisieren, die in Tabelle 2 bis 6 oben aufgelisteten FR-Aminosäuren beibehalten werden.
Eine Suche in den Tabellen von Immunglobulin-Sequenzen (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. Aufl., US Dept. of Health and Human Service, NIH Publication Nr. 91–3242 (1991)) zeigte, dass humane Sequenzen variabler Domänen bekannt sind, die schon die meisten der FR-Aminosäuren haben, die, wie in Tabelle 7 unten gezeigt, bewahrt werden müssen.
Tabelle 7: Humane Antikörper, die in der Sequenz Maus-Antikörpern bekannter dreidimensionaler Strukturen am ähnlichsten sind
Tabelle 7: Humane Antikörper, die in der Sequenz Maus-Antikörpern bekannter dreidimensionaler Strukturen am ähnlichsten sind (Fortsetzung)
Diese humanen Sequenzen sind nicht notwendigerweise jene, welche den Maus-Antikörpern insgesamt oder nur in den Gerüstregionen am ähnlichsten sind, sondern eher jene, die die größte Anzahl wichtiger Aminosäuren gemein haben, wobei letztere Sequenzen in Tabelle 7 oben eingeschlossen sind.
Die Anzahl von Maus-Aminosäuren, die beibehalten werden muss, um alle wichtigen FR-Aminosäuren in den "humanisierten" oder Analog-Versionen der Maus-Antikörper zu haben, wie in Tabelle 7 oben gezeigt, reicht von 21 (für HyHEL-5 : 12 in V_H und 9 in V_L) bis 5 (für B1312 : 2 in V_H und 3 in V_L). Dies sind nicht sehr viele Aminosäuren, wenn man beachtet, dass die daraus hervorgehenden "humanisierten" oder Analog-Moleküle wahrscheinlich die meisten oder alle ihrer Liganden-Bindungseigenschaften behalten. Es ist möglich, dass andere humane Sequenzen existieren, die diesen Maus-Domänen sogar nach ähnlicher sind, die nicht in der Zusammenstellung von Kabat et al. (1991, s. oben) enthalten sind. Wenn mehr Sequenzen verfügbar werden, können diese mit eingebaut werden um die Menge verfügbarer Basisdaten zu verbessern.
b) Auswahl des besten humanen Gerüsts zur Verwendung bei der "Humanisierung" eines Antikörpers, wenn seine Struktur nicht bekannt ist
In Abwesenheit einer dreidimensionalen Struktur ist die Identifizierung der FR-Aminosäuren, die entscheidend sind um die Struktur der Kombinationsstelle aufrecht zu erhalten, nicht einfach vorzunehmen. Dennoch können einige Vorhersagen aus den Daten, die in den Tabellen 2 bis 6 oben gezeigt sind, getroffen werden, die in Tabellen 8 und 9 unten für die V_L- und V_H-Domänen zusammengestellt wurden.
Tabelle 8: Gerüst-Reste in V_L, die wahrscheinlich bewahrt werden müssen um die Liganden-Eigenschaften des Original-Antikörpers zu reproduzieren
Tabelle 9: Gerüst-Reste in V_a, die wahrscheinlich bewahrt werden müssen um die Liganden-Eigenschaften des Original-Antikörpers zu reproduzieren
Aus Tabelle 8 und 9 oben ist ersichtlich, dass viele der wichtigen FR-Aminosäuren die CDRs flankieren. Unter diesen flankierenden Positionen sind die meisten der FR-Aminosäuren, die in den Kontakt mit der gegenüberliegenden Domäne involviert sind, wie in Tabelle 4 oben gezeigt, und viele von jenen, die mit den CDRs in Kontakt stehen, wie in Tabelle 2 und 3 oben gezeigt. Außerdem befinden sich fast alle der FR-Aminosäuren, von denen beobachtet wurde, dass sie an der Bindung an Antigen teilnehmen (Amit, A. G., et al., Science 233: 747–753 (1986); Sheriff, et al., P. N. A. S. (USA) 82: 1104–1107 (1987); Padlan, E. A., et al., P. N. A. S. (USA) 86: 5938–5942 (1989); Tulip, et al., Cold Spring Harbor Symp, Quant. Biol. 54: 257–263 (1989); Bentley, et al., Nature (London) 348: 254–257 (1990)), in diesen flankierenden Regionen. Daher werden während der "Animalisierung" oder "Humanisierung" oder der Bildung der Analog-Peptide nicht nur die CDRs beibehalten, sondern auch einige der den CDRs direkt benachbarten Reste. Dies sorgt für eine bessere Chance bei der Bewahrung von mehr Liganden-Bindungseigenschaften des Original-Antikörpers. Die Wahrscheinlichkeit, die Antigen-Bindungseigenschaften des Original-Antikörpers beizubehalten, ist sogar größer, wenn die ersten paar Aminosäuren im NH₂-Terminus von beiden Ketten ebenfalls beibehalten werden, da man herausgefunden hat, dass einige von ihnen in Kontakt mit CDRs stehen, wie in Tabelle 2 und 3 oben gezeigt. Weiterhin zeigen Tabelle 8 und 9 oben auch viele andere Gerüst-Positionen, die in allen hier untersuchten Fällen für strukturell wichtig gehalten wurden. Die xenogenischen Reste an diesen Positionen sollten wahrscheinlich ebenfalls beibehalten werden.
Alternativ dazu kann es möglich sein, die Immunogenität zu reduzieren, während Antigen-Bindungseigenschaften bewahrt werden, indem ganz einfach jene exponierten Reste in der Gerüstregion, welche sich von jenen unterscheiden, die üblicherweise in humanen Antikörpern gefunden werden, ersetzt werden (Padlan, E. A. (1991), s. oben)). Dies würde die Oberfläche des xenogenischen Antikörpers "humanisieren", während das Innere und die Kontaktreste, welche seine Antigen-Bindungseigenschaften beeinflussen, beibehalten werden. Das vernünftige Ersetzen von äußeren Resten sollte geringe oder keine Wirkung auf das Innere der Domänen oder auf die Interdomänen-Kontakte haben. Man fand z. B. heraus, dass die Lösungsmittel-Zugänglichkeitsmuster der F_vs von J539, einem Maus-IgA (κ), und von KOL, einem humanen IgG1 (λ), sehr ähnlich sind (Padlan, E. A., (1991, s. oben)).
Derzeit wurden mehr als 35 unterschiedliche Fab-Strukturen durch Röntgenbeugungsanalyse ermittelt, obwohl Atomkoordinaten derzeit nur für 11 in der Protein Data Bank stehen, wie in Tabelle 1 oben gezeigt. Die meisten der verfügbaren Strukturen wurden nur bis zu mittlerer Auflösung untersucht, von denen einige lediglich in einem begrenzten Ausmaß verfeinert wurden. Letztendlich werden Atomkoordinaten für mehr und besser verfeinerte Strukturen zur Verfügung gestellt werden, so dass die "wichtigen" FRs einfacher zu untersuchen sein werden. Dies wird die theoretischen vorhersagenden Belege der vorliegenden Methode zur Bestimmung der besten Ausführungsform für die Analog-Peptide verbessern.
Wie schon oben angedeutet, hängt die Spezifität eines Antikörpers von den CDR-Strukturen und manchmal auch von einigen benachbarten Resten ab. Diese Strukturen hängen umgekehrt von Kontakten mit Gerüst-Aminosäuren und von der Wechselwirkung der V_L- und V_H-Domänen ab. Daher müssen, um die Beibehaltung der Bindungsaffinität sicherzustellen, nicht nur die CDR-Reste, sondern auch jene FRs, die entweder mit den CDRs oder der gegenüberliegenden Domäne in Kontakt stehen, sowie auch alle versenkten Reste, die den variablen Domänen Form verleihen, bewahrt werden.
Diese Ausgestaltung der humanisierten Versionen von Maus-Antikörpern wird in Stufen erreicht, und zwar wie folgt.

1- Auswahl eines xenogenischen Modells bekannter Struktur.
2- Auswahl der Ziel-Spezies-FR.
3- Identifizierung von xenogenischen/Ziel-Spezies-Unterschieden.
4- Identifizierung von wichtigen xenogenischen Aminosäuren.

(1) Auswahl eines xenogenischen Modells bekannter Struktur
Die V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers der gewünschten Spezifität werden entsprechend Kabat et al. (1991, s. oben) klassifiziert. Dann kann ein Antikörper derselben Spezies ausgewählt werden, dessen Struktur bestimmt wurde, und dessen variable Regionen zu denselben Klassen und Unterklassen gehören. Die Modellierung des fraglichen xenogenischen Antikörpers zu einer solchen Struktur sichert maximale Erfolgschancen. Dies ist jedoch nicht uneingeschränkt notwendig, da die relativen Positionen der wich tigen Aminosäuren nicht wesentlich variieren, sogar in variablen Regionen unterschiedlicher Klassen. Daher kann dieses Verfahren auch mit weniger als einer perfekten Übereinstimmung noch angewandt werden um die erfindungsgemäßen Analoga zu konstruieren. Ist einmal das xenogenische Modell ausgewählt, kann es verwendet werden um die Lage wichtiger Reste im xenogenischen Antikörper, der animalisiert (humanisiert) werden soll, zu identifizieren. Tabellen 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 geben die Positionen der wichtigen Aminosäuren in mehreren Antikörpern an, deren Strukturen bis zu einem hohen Auflösungsgrad bestimmt wurden.
(2) Auswahl der Ziel-Spezies-FR
Das Ziel-Spezies-Gerüst sollte Idealerweise ein Konsensus-Gerüst sein. D. h., eines, das eine maximale Anzahl von Aminosäuren mit allen humanen Gerüsten derselben Klasse gemein hat. Dies ist wichtig, weil das Ziel der Humanisierung ist, eine Immunantwort gegen das konstruierte Analog-Peptid zu vermeiden.
Das Ziel-Spezies-Gerüst, das ausgewählt wird, ist das, welches die größte Anzahl wichtiger Aminosäuren mit dem xenogenischen Original-Antikörper teilt. Daher ist bei der Auswahl der Ziel-Spezies (humanen)-FR die Ähnlichkeit zwischen den wichtigen Aminosäuren wichtiger als die Gesamtähnlichkeit.
In der Praxis werden die Sequenzen der verfügbaren xenogenischen Ketten mit den Konsensussequenzen von allen Klassen der variablen Region der Ziel-Spezies vergleichend angeordnet, und die Anzahl von Unterschieden in den Aminosäuren der xenogenischen Spezies, die beibehalten werden müssen, wird bewertet. Die humane(n) Konsensussequenz(en), die die geringste Anzahl von Unterschieden aufweist(en), wird/werden ausgewählt. Dies sind dann die Kandidaten für das Analog-Peptid. Andere mit geringer Anzahl, die höher ist als die der Obigen, können auch geeignet sein, und sie werden in eine Reservemenge gegeben, usw. Wenn es zu viele Unterschiede im ausgewählten Gerüst (z. B. mehr als 16) gibt, dann kann das gesamte Anordnungs-Verfahren unter Verwendung aller tabellierter humaner Sequenzen wiederholt werden um ein spezifisches humanes Gerüst zu finden, dessen Ähnlichkeit mit der xenogenischen Sequenz an den Positionen der wichtigen Aminosäuren maximiert ist. Daher solte die Ziel-Spezies-FR eine Konsensussequenz sein, was am meisten bevorzugt ist. Als nächstes wäre ein Gerüst bevorzugt von einem gemeinsamen Ziel-Spezies (humanen)-Antikörper, und als Letztes das Gerüst von dem Antikörper von irgendeiner Ziel-Spezies (human).
(3) Identifizierung von xenogenischen Ziel-Spezies-Unterschieden
Die xenogenischen Sequenzen werden dann zusammen mit den Ziel-Spezies-Sequenzen vergleichend angeordnet, und die Positionen aller Aminosäuren, die sich im Maus- und im humanen Gerüst unterscheiden, werden tabelliert. Solch eine Tabelle enthält die maximale Anzahl von Aminosäuren, die zur Gesamt-"Animalisierung" ("-Humanisierung") des xenogenischen Antikörpers verändert werden kann (siehe Tabellen 31 und 32 unten). Wenn alle diese Veränderungen vorgenommen würden, erhielte man einen sogenannten CDR-verpflanzten Antikörper. Das heißt, nur die Original-CDRs würden vom Maus-Antikörper bewahrt. In einigen Fällen können solche CDR-verpflanzten Antikörper möglicherweise die Original-Bindungsaffinität behalten. In den meisten Beispielen wäre die Affinität eines CDR-verpflanzten Antikörpers jedoch erheblich geringer als die des xenogenischen Original-Antikörpers. Um die Chancen für die Konservierung der Original-Affinität zu maximieren, muss die Identität aller wichtigen Aminosäuren bewahrt werden.
(4) Identifikation von wichtigen xenogenischen Aminosäuren
Wenn der skizzierte Ansatz zur Animalisierung (Humanisierung) eines Antikörpers strikt befolgt wird, werden die Aminosäuren, die in dem xenogenischen Modell-Antikörper, der in Schritt 1 ausgewählt wurde, beibehalten. In einem bevorzugteren Ansatz können jedoch ebenfalls die Aminosäuren, von denen gezeigt wurde, dass sie in anderen Antikörpern derselben Spezies oder der Ziel-Spezies wichtige Positionen einnehmen, beibehalten werden und werden deshalb aus der Gruppe von Kandidaten, die zu mutieren sind, ausgenommen. Dieser bevorzugte Ansatz kann besonders geeignet sein, wenn eine Chance besteht, dass die fraglichen Aminosäuren mit den CDRs oder mit den gegenüberliegenden Ketten in Kontakt treten könnten. Sind die wichtigen xenogenischen Aminosäuren einmal identifiziert, kann die DNA-Sequenz mutagenisiert werden um alle anderen Aminosäuren zu verändern, welche zum größten Teil exponierte Positionen einnehmen.
Das vorliegende Verfahren wird beispielhaft für einen Maus-Antikörper dargestellt, der mit der Absicht humanisiert wird, eine HAMA-Reaktion nach dessen Verabreichung an Menschen zu vermindern oder zu vermeiden. Es wurden Maus- und humane Antikörper, deren dreidimensionale Strukturen bis zu einem hohen Auflösungsgrad abgeleitet wurden, als Leitlinie bei der Auswahl der zu substituierenden Aminosäuren verwendet um den bestimmten verwendeten Maus-Antikörper zu humanisieren. Dieses Verfahren kann jedoch allgemeiner angewandt werden um Antikörper einer Spezies in eine weniger immunogenische Form zu verwandeln, die einer zweiten Spezies zu verabreichen ist, vorausgesetzt, dass adäquate dreidimensionale Modelle für Antikörper von jenen Spezies verfügbar sind. Informationen über andere Maus-Antikörper aus einer Datenbank wurden in der unten angegebenen beispielhaften Offenbarung verwendet um die BrE-3 und Anti-KC-4-Maus-humanen Chimär-Antikörper mit humanen Aminosäuren zu modifizieren. Ganz ähnlich können Antikörper von anderen Spezies neben Maus-Antikörpern ebenfalls verwendet werden, deren CDRs und andere Aminosäuren bewahrt werden, und jene Aminosäuren, die nicht für "wichtig" gehalten werden, mit humanen Aminosäuren ersetzt werden. Ganz ähnlich kann der obige Ansatz für die Herstellung von "animalisierten" Antikörpern für jede Tier-Spezies verwendet werden. Dies kann erreicht werden, indem Amionsäuren der Ziel-Antikörper-Spezies in einem Antikörper einer anderen Spezies erfindungsgemäß zur Substitution verwendet werden.
Verschiedene Peptidstrukturen, wie CDRs, und Analog-Antikörper, Fab, Fab', (Fab')₂, und variable Fragmente, die eine gewünschte Spezifität besitzen, können konstruiert werden und wahlweise über einen Linker verbunden werden. Zusätzlich können ein oder mehrere der Peptide an ein oder mehrere Effektor-Agentien angehängt werden oder über einen Linker verbunden werden. Multiple Antikörper, variable Regionen, Fab, Fab', (Fab'), CDRs, und ähnliche, und deren Kombinationen, können ebenfalls konstruiert und über Linker verbunden werden oder an ein oder mehrere Effektor-Agentien angehängt werden, wie unten beschrieben.
Die cDNAs, die die analogen variablen Regionen eines Antikörpers einer gewünschten Spezifität codieren, können in einen Vektor cloniert werden, der wahlweise Sequenzen enthält, die für konstante Regionen oder deren Fragmente, Enzyme, Neuropeptide, andere Peptid-Transmitter, Toxine, Hormone, funktionelle Konjugations-Regionen, Cytokine, Lymphokine, und ähnliche, wahlweise unter demselben Promotor, codieren. Obwohl dies die Clonierungsstrategie ist, die in der beispielhaften Offenbarung dieser Erfindung verwendet wurde, sind andere Verfahren im Stand der Technik bekannt und können ebenfalls angewendet werden, wie z. B. Co-Expression, und ähnliche. In der hierin dargebotenen beispielhaften Offenbarung wurden die Anti-BrE-3- und Anti-KC-4-Maus-humanen chimären Antikörper, die spezifisch an humanes Milchdrüsen-Mucin und Carcinomzellen binden, konstruiert, indem die DNAs der variablen Domäne von Anti-BrE-3 oder Anti-KC-4 von der Maus mit einer humanen konstanten Domäne (einem Effektor-Agens), die in einen Hybridvektor cloniert war, verbunden wurde, und das Produkt exprimiert wurde, indem der Vektor in Myelom-Zellen transfiziert wurde. Die variablen Regionen des chimären Antikörpers wurden auf der DNA-Ebene modifiziert um ein Analog oder "humanisiertes" chimäres Polypeptid zu erhalten. Die Modifikationen an der variablen Region des Peptids können entweder durch PCR-Amplifikation mit Primern, die darauf zugeschnitten sind, die erwünschten Mutationen hervorzurufen, oder durch Gen-Synthese durchgeführt werden.
Die "humanisierten" Analog-Peptide, die hergestellt wurden und unten beispielhaft dargestellt sind, umfassen die "humanisierten" variablen Regionen der Maus-Antikörper Anti-BrE-3 oder Anti-KC-4 (US-Patente 5 075 219 und 4 708 930) und die konstanten Regionen kappa und gamma 1 eines humanen Antikörpers. Diese humanisierten Antikörper wurden durch ihre Molekulargewichte und Bindungsspezifitäten charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie mit den jeweiligen Maus-Ursprungs-Antikörpern und chimären Antikörpern gegen das Antigen mithalten können oder besser sind. Es wurde gezeigt, dass die "humanisierten" Analog-Peptide nur schwach an normales Brust-, Lungen-, Dickdarm- und Endometrium-Gewebe, und stark an Krebs-Gewebeschnitte binden, und zwar mittels des ABC-Immunperoxidase-Verfahrens. Es wurde gezeigt, dass die Teile der CDR- und FR-Regionen der nicht-modifizierten Peptide (Maus-F_v-Regionen) und Effektor-Agentien (humane F_c-Regionen) in beiden Fällen im Wesentlichen identisch mit denen der nicht-humanen und humanen Antikörper, von welchen sie abgeleitet wurden, waren. Die Analog-Peptide und Hybrid-Derivate dieser Erfin dung, denen jegliche Sequenzen einer nicht-humanen konstanten Region fehlen, besitzen weniger fremde antigenische Epitope als der gesamte xenogenische oder chimäre Antikörper, von denen sie abgeleitet sind. Dementsprechend wird von ihnen erwartet, dass sie in Tieren, wie Menschen, eine weniger komplexe immunogenische Reaktion hervorrufen als die entsprechenden gesamten nicht-humanen Antikörper oder sogar als die chimären Antikörper. Jedoch konnte vor dieser Erfindung nicht vorhergesagt werden, zu welchem Ausmaß ein Teil der nicht-humanen FR-Aminosäuren ersetzt werden konnte, ohne die Bindungseigenschaften zu ändern, und zwar aufgrund der wesentlichen Konformationsänderungen in den inneren Regionen, die die Bindung der CDRs an das Antigen beeinflussen, die nach Modifikation von Aminosäuresequenzen auftreten konnten.
Somit bindet das im Wesentlichen reine, isolierte, erfindungsgemäße Analog-Peptid spezifisch und selektiv an ein Antigen, das auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer Carcinomzelle vorhanden ist oder von der Zelle freigesetzt wird. Das Polypeptid besteht im Wesentlichen aus mindestens einer CDR- oder variablen Region der leichten Ketten oder schweren Ketten eines Antikörpers einer esten Spezies, der Affinität und Spezifität für ein Antigen hat, das sich auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer Carcinomzelle einer anderen Spezies befindet oder von der Zelle freigesetzt wird, wobei, wenn die Gerüst-Regionen (FRs) vorhanden sind, ungefähr 1 bis mindestens 46 Aminosäuren in den FRs durch Aminosäuren substituiert sind, z. B. durch solche, die an äquivalenten Positionen in Antikörpern einer anderen Spezies vorkommen, oder ähnliche Aminosäuren, oder deren Fragmenten, die 1 bis 3 CDRs pro Kette oder 1 bis 3 CDRs pro Kette plus deren flankierende Regionen, umfassen, jeweils aus ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Fragment von ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, Kombinationen daraus, wobei jedes Analog-Peptid mit mindes tens einem anderen Analog-Peptid funktionell verbunden ist, Kombinationen daraus und Gemische daraus.
Eine einzelne Einheit des erfindungsgemäßen Analog-Peptids kann so kurz sein wie die kürzeste CDR und so lang wie die längste Kombination variabler Regionen, Antikörper und ähnlichen, einschließlich Nicht-Peptidpolymeren bis zu einem Molekulargewicht von ungefähr 10⁶, und in einigen Beispielen sogar größer. Wenn mehrere Einheiten miteinander verbunden werden oder Kombinationen bereitgestellt werden, erhöht sich die Größe des Analog-Peptids entsprechend. Die Analog-Peptide mit kleinerem Molekulargewicht sind insbesondere geeignet unter anderem für stärkere Durchdringung von Zellen, der Blut-Hirn-Schranke und von Tumoren, und besitzen eine kürzere Halbwertszeit, während die Polypeptide mit größerem Molekulargewicht entweder für in vitro- oder für in vivo-Anwendungen, wie Therapie, in-vivo-Bilddiagnostik und Diagnose, geeignet sind. Leztere werden im Allgemeinen über einen längeren Zeitraum vom Körper ausgeschieden.
Das erfindungsgemäße Analog-Peptid kann Aminosäuresequenzen umfassen, die von leichten und/oder schweren Ketten von Antikörpern einer ersten oder xenogenischen Spezies abgeleitet sind, die gegen eine Vielzahl von Antigenen und/oder Epitopen gezogen sind. Z. B. sind die Maus-Antikörper, die in den Beispielen offenbart sind, gegen humanes Milchfettkügelchen-Mucin (BrE-3) und gegen das "KC-4"-Antigen in humanen Carcinomzellen (KC-4) gezogen. Es können auch andere Antigene, die unterschiedlichste Epitope umfassen, verwendet werden um die xenogenischen Antikörper zu erzeugen, solange der Antikörper, der die variable Region beisteuert, niedrige Affinität und Spezifität für normale Zellen und hohe Affinität und Spezifität für humane Carcinomzellen zeigt, was deren spezifische Bindung an Carcinomzellen, bevorzugt in vielfältigen Geweben, ermöglicht. Ganz ähnlich können die Antikörper in Tieren verschiedener xenogenischer Spezies gezogen werden. Die Antikörper, von denen das erfindungsgemäße Polypeptid abgeleitet ist, können Antikörper sein u. a. aus Maus, Ratte, Ziege, Vögeln, einschließlich Hausgeflügel, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferd, Rind und Primaten, einschließlich Mensch und Affe. Die Herstellung des Antikörpers und von dessen Fragmenten, die von der Erfindung umfasst wird, ist ähnlich, ob nun der Ursprung des Antikörpers menschlich oder nicht-menschlich ist. Die Original-mRNA der variablen Region kann aus Zellen jeder gewünschten xenogenischen Art gewonnen werden, und der Rest der Arbeit ist ähnlich, indem ein Modell-Antikörper derselben xenogenischen Spezies verwendet wird und indem mit Aminosäuren der Ziel-Spezies substituiert wird.
Das Humanisierungs-Verfahren, das hierin beschrieben ist, ist darauf ausgelegt, potentielle Verluste in der Antigen-Bindungsaffinität zu minimieren, die aus den eingefügten Aminosäuren resultieren könnten. Im Falle des unten beispielhaft dargestellten BrE-3-Antikörpers wurden acht Aminosäure-Austausche in der variablen Region der leichten Kette und in der variablen Region der schweren Kette vorgenommen. Im Falle des unten beispielhaft dargestellten Anti-KC-4-Antikörpers wurden sieben Aminosäure-Austausche in der variablen Region der leichten Kette eingeführt und zwölf Aminosäure-Austausche in der variablen Region der schweren Kette vorgenommen. Um die immunologische Reaktion auf den humanisierten Antikörper zu minimieren, wurden außerdem humane Ziel-Aminosäuresequenzen verwendet, die die Konsensus-Sequenzen von allen geeigneten humanen variablen Regionen umfassen. Dennoch sind weder die beispielhaft dargestellten Aminosäure-Austausche, noch die beispielhaft dargestellten humanen Ziel-Sequenzen die einzigen Möglichkeiten, die von dieser Erfindung umfasst werden. Viele andere individuelle Aminosäure-Austausche und deren Permutationen können ohne die Erwartung einer signifikanten Beeinflussung von entweder der Affinität des ent stehenden Antikörpers, oder seiner humanen Immunogenität vorgenommen werden, wie hierin erklärt wird.
Die folgenden Tabellen 10 und 11 zeigen andere mögliche Aminosäure-Austausche für die erfindungsgemäßen BrE-3- und KC-4-Sequenzen. Die Aminosäure-Positionen (oder Nummern) sind wie allgemein akzeptiert angegeben (Kabat et al., 1991, s. oben). Die am meisten bevorzugten Austausche sind unter der Überschrift "Am meisten bevorzugtes Analog" angegeben. Für andere Antikörper als die BrE-3- und Anti-KC-4-Antikörper werden die Aminosäuren, die in den BrE-3- und KC-4-Säulen gezeigt sind, ebenfalls Teil der Gruppe der am meisten bevorzugten Auswahl. Aminosäure-Austausche, die nicht Teil der am meisten bevorzugten Gruppen sind, aber die immer noch Teil dieser Erfindung sind, sind in der nächsten Spalte unter der Überschrift "Bevorzugtes Analog" angegeben. In einigen Fällen sind die "bevorzugtes Analog"-Auswahlen zu zahlreich, und die zumindest akzeptablen Auswahlen sind stattdessen für diese Position angegeben. Es ist klar, dass alle Aminosäuren, außer jenen, die unter "Nicht bevorzugtes Analog" aufgelistet sind, an dieser Position eingesetzt werden können.
Tabelle 10: Alternative Aminosäuren für die V_L-Kette
Tabelle 10: Alternative Aminosäuren für die V_L-Kette (Forts.)
Tabelle 10: Alternative Aminosäuren für die V_L-Kette (Forts.)
Tabelle 11: Alternative Aminosäuren für die V_a-Kette
Tabelle 11: Alternative Aminosäuren für die V_a-Kette (Forts.)
Tabelle 11: Alternative Aminosäuren für die V_H-Kette (Forts.)
Ähnliche Tabellen können für alle erdenklichen Aminosäuresequenzen für andere xenogenische Antikörper konstruiert werden, wie hierin erläutert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das humanisierte Anti-Carcinom-Analog-Peptid die Aminosäuresequenz ID No. 67 bis 73 von Tabelle 47, die Sequenz ID No. 75 bis 81 aus Tabelle 48, die Sequenz ID No. 95 bis 102 von Tabelle 55 und/oder die Sequenz ID No. 103 bis 108 von Tabelle 56, und die Sequenzen, bei denen ungefähr 1 bis 46 oder mehr Aminosäuren in der FR pro Kette mit Aminosäuren, wie jenen, die an äquivalenten Positionen in humanen Antikörpern vorkommen, substituiert sind, oder Fragmente davon, die 1 bis 3 CDRs pro Kette oder 1 bis 3 CDRs pro Kette mit deren flankierenden Regionen, umfassend jeweils aus ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Fragment von ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, oder Kombinationen daraus, wobei jedes Analog-Peptid mit mindestens einem anderen Analog-Peptid funktionell verbunden ist, und Gemische davon.
Das vorliegende Analog-Peptid wird entweder als nacktes Peptid oder in glykosylierter Form bereitgestellt. Wenn es in glykosylierter Form bereitgestellt wird, kann das Analog-Peptid funktionll mit Glykosyl-Rest(en) verbunden sein, die von der eukaryontischen Zelle, in der es exprimiert wird, bereitgestellt werden, oder es kann cloniert und in einer prokaryontischen Zelle als nacktes Polypeptid exprimiert werden und der/die Glykosyl-Rest(e) später hinzugefügt werden, beispielsweise mittels der Glykosyl-Transferase, wie im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele von Glykosyl-Rest(en), die dem erfindungsgemäßen Analog-Peptid angefügt werden können, sind unter anderem N-glykosylierte und O-glykosylierte Reste. Die Glykosyl-Reste, die an das nackte Analog-Peptid angefügt werden, können ein Molekulargewicht von ungefähr 20 bis 50.000 Dalton, bevorzugter ungefähr 100 bis 20.000 Dalton oder größer, haben, abhängig von der Größe und vom Molekulargewicht des Peptids, an das sie angefügt werden. Es können jedoch auch andere Typen von Polysacchariden und Molekulargewichten vorkommen. Die Glykosyl-Reste können auch mittels chemischer Mittel an das nackte erfindungsgemäße Analog-Peptid angefügt werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Eine einzelne CDR ist der kleinste Teil eines Antikörpers, von dem bekannt ist, dass er fähig ist, ein Antigen zu binden. Die Sequenzen der V_L- und V_H-CDRs von dem Beispiel-Analog BrE-3 sind in Tabellen 47 und 48 unten gezeigt. Somit können kleine Peptide, die die Sequenz einer einzelnen CDR besitzen, Antigen binden und sind daher zur in vivo-Bilddiagnostik von Tumoren geeignet. Eine CDR, die an ein Effektor-Peptid angehängt ist, kann chemisch synthetisiert werden oder rekombinant in einem DNA-Segment codiert werden. Solche kleinen Moleküle besitzen eine große Tumor-Durchdringung und extrem schnelle Ausscheidungs-Eigenschaften, verglichen mit größeren Antikörper-Fragmenten. In einigen Fällen ist es bequemer, diese kleinen Moleküle eher durch chemische Synthese als durch Fermentation herzustellen, wie im Stand der Technik bekannt ist. In vielen Fällen sind diese kleinen Peptide vollständig nichtimmunogen, und eine Immunreaktion, wie die HAMA-Reaktion, wird insgesamt vermieden. Ebenfalls sind Einheiten mit 2 und 3 CDRs pro Kette, die miteinander durch 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren funktionell verbunden sind und bis zur Gesamtlänge des Inter-CDR-Segmentes lang sind, wie in den variablen Regionen positioniert, bevorzugt.
Analoge variable Regionen der schweren und leichten Kette können einzeln oder in V_H/V_L-Paaren, oder an ein Effektor-Peptid, wie (eine) konstante Region(en) oder Teile davon, ein Arzneimittel, ein Enzym, ein Toxin, einen gesamten Antikörper oder an irgendein anderes Molekül oder Radioisotop angehängt, gewonnen werden. Die Fragmente der analogen variablen Regionen können, wie im Stand der Technik bekannt ist, chemisch synthetisiert werden oder von DNA-Segmenten, die die nicht-humanen variablen Regionen codieren. Dies kann durch PCR-Amplifikation der DNA mit Primern, die so synthetisiert wurden, dass sie die gewünschte(n) Mutation(en) enthalten, erreicht werden, wie im Stand der Technik bekannt ist. Ganz ähnlich können die Fragmente, die die analogen variablen Regionen codieren, chemisch synthetisiert werden oder mittels etablierter Clonierungsmethoden des Restriktionsverdaus, der Ligation, der Mutagenese, und ähnlicher Verfahren, erhalten werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Es gibt Vorteile bei der Verwendung unterschiedlicher molekularer Varianten des Analog-Peptids, abhängig von den spezifischen Anwendungen, für welche sie vorgesehen sind, von denen einige unten aufgelistet sind.

a) Kleine Moleküle durchdringen Ziel-Gewebe effektiver und werden viel schneller vom Körper ausgeschieden als große Moleküle.
b) Einzelne Kettenmoleküle können effizienter manipuliert und synthetisiert werden als vielkettige Moleküle.
c) Viele dieser Varianten können effektiv und kostengünstig in Bakterien synthetisiert werden, einschließlich der nicht-glykosylierten Analoga.
d) Bi-funktionelle oder multifunktionelle Moleküle können Polypeptid-Effektoren, wie Enzyme, Toxine, Radioisotope, Arzneimittel und andere Moleküle, zu Ziel-Geweben tragen.

Die folgende Liste umfasst beispielhafte erfindungsgemäße Analog-Peptide, die mit Molekülen hergestellt wurden, die von Antikörpern oder Antikörper-Fragmenten abgeleitet sind. Diese Analog-Peptide sind unter anderem für die Anwendung dieser Erfindung geeignet. Eine ausgiebigere Liste von Polypeptid-Konstrukten kann in O'Kennedy, R., und Roben, P. (O'Kennedy, R., und Roben, P., "Antibody Engineering: an Overview", Essays Biochem. (England) 26: 59–75 (1991)) gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen Analog-Peptide und Hybrid-Peptide umfassen CDRs und/oder analoge variable Regionen, monoclonale Antikörper, Antikörper-Fragmente, wie Fab, Fab', (Fab')₂ und deren Fragmente, CDRs, konstante Regionen, einzelne oder Multi-Domänen und katalytische Fragmente, bifunktionelle oder multifunktionelle Kombinationen daraus, Enzyme, Peptid-Hormone, Moleküle, wie Arzneimittel und Linker, Transmitter und Toxine. Diese sind für die in vivo-Bilddiagnostik, Therapie und Diagnostik geeignet.
Einzelkettige Antigen-bindende Polypeptide
Ein Verfahren zur Konstruktion einzelkettiger Antigenbindender Polypeptide wurde von Bird et al. (Bird, R. E., et al., Science 242: 243–246 (1988); Bird, R. E., et al., Science 244: 409 (1989)) beschrieben. Einzelketten-F_v (scF_v oder sF_v) sind einzelkettige Analog-Peptide, die sowohl V_L, als auch V_H zusammen mit einem Linker, wie einem Peptid, das die zwei Ketten verbindet (V_L-Linker-V_H), enthalten. Die Herstellung kann auf der DNA-Ebene vorgenommen werden; in diesem Fall ist die Kenntnis der Sequenz erforderlich. Diese Analog-Peptide besitzen die Konformations-Stabilität, Faltung und Liganden-Bindungsaffinität von einzelkettigen Immunglobulin-Fragmenten der variablen Region und können in E. coli exprimiert werden (Pantoliano, M. V., et al., Biochem. (US) 30: 10117–25 (1991)). Der Peptid-Linker, der die zwei Ketten verbindet, kann von unterschiedlicher Länge sein, z. B. ungefähr 2 bis 50 Aminosäurereste, und bevorzugter ungefähr 12 bis 25 Reste, und er kann in E. coli exprimiert werden (Pantoliano, M. V., et al. (1991), s. oben)). Ein Analog-Peptid, wie ein scF_v, kann von E. coli exprimiert und präpariert werden und für zielgerichtete Tumortherapie verwendet werden. Die Ausscheidungs-Profile für scF_v sind in einigen Situationen gegenüber jenen von normalen Antikörpern, Fab-, Fab'- oder (Fab')₂-Fragmenten, überlegen. (Colcher, D., et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1191–7 (1990)). Ein anderer Typ eines Analog-Peptids umfasst V_H-Linker-V_L und kann ungefähr 230 bis 260 Aminosäuren umfassen. Ein synthetisches Gen unter Verwendung von E. coli-Kodons kann für die Expression in E. coli verwendet werden. Ein Leit-Peptid von ungefähr 20 Aminosäuren, wie das von Trp LE kann verwendet werden um die Proteinsekretion in den periplasmatischen Zwischenraum oder in das Medium zu dirigieren. Wenn dieses Leit-Peptid nicht natürlicherweise abgeschnitten wird, kann das sF_v-Analog-Peptid durch Säure-Spaltung der nur einmal vorkommenden Asp-Pro-Peptidbindung, die zwischen dem Leit-Peptid und der sF_v-codierenden Region liegt, erhalten werden. (Houston, J. S., et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain F_v Analogue Produced in E. coli", PNAS (USA) 85 (16): 5879–83 (1988)). Die Konstruktion, Bindungseigenschaften, der Stoffwechsel und die Tumor-Zielausrichtung der einzelkettigen F_v-Analog-Peptide, die von monoclonalen Antikörpern abgeleitet sind, können wie zuvor beschrieben ausgeführt werden. (Milenic, D. E., et al., Cancer Res. (US) 51 (23 ptl): 6363–71 (1991); Yokota, et al., "Rapid Tumor Penetration of a single-chain F_v and Comparison with Other Immunoglobulin Forms", Cancer Res. (US) 52(12): 3402–8 (1992)). Dieser Typ von Analog-Peptid bietet extrem schnelle Tumor-Durchdringung und sogar Verteilung innerhalb der Tumor-Masse im Vergleich zu IgG oder Ig-Fragmenten Fab und F(ab')₂.
Bifunktionelle scF_v-Fxn oder Fxn-scF_v
Ein Beispiel dieses Typs von Analog-Peptid ist ein V_L-Linker-V_H mit einem Effektor-Peptid, wie einem Hormon, Enzym, Transmitter, und ähnlichen. Diese Hybrid-Analog-Peptide können, wie von McCarney et al. (McCarney J. E., et al., "Biosynthetic Antibody Binding Sites: Development of a Single-Chain F_v Model Based on Antidinitrophenol IgA Myeloma MOPC 315", J. Protein Chem. (US) 10 (6): 669–83 (1991)) beschrieben, präpariert werden. Ein bifunktionelles Hybrid-Analog-Peptid, das ein F_c-Bindefragment B vom Aminoterminus von Protein A von Staphylococcus enthält, ist ebenfalls umfasst und kann wie zuvor beschrieben präpariert werden. (Tai, M. S., et al., Biochem. 29 (35): 8024-30 (1990)). Dieses Beispiel eines erfindungsgemäßen Hybrid-Analog-Peptids ist ein Staph. A-Fragment B (anti F_c)-scF_v-Polypeptid. Die Reihenfolge ist umgekehrt zu der von normalen Fällen. Dieses FB-sF_v kann von einem einzelnen synthetischen Gen codiert sein und als Peptid in E. coli exprimiert werden. Dieses Analog-Peptid ist ein gutes Beispiel für ein nützliches, multifunktionelles, auf ein Ziel richtbares, einzelkettiges Polypeptid. Ein Hybrid-Analog-Peptid, das auch Antikörper gegen einen humanen Carcinom-Rezeptor und Angiogenin umfasst, ist ebenfalls Teil dieser Erfindung. Angiogenin ist ein humanes Homolog von Pankreas-RNAse. Dies ist ein (Fab')₂-ähnlicher Antikörper-Enzym-Peptid-Effektor. Ein anderes Hybrid-Analog-Peptid, das V_H-CH1-schwere Kette-RNAse umfasst, kann in einer Zelle exprimiert werden, die eine chimäre leichte Kette desselben Antikörpers sezerniert. Von einem sezernierten Antikörper ähnlicher Struktur wurde gezeigt, dass er die Wachstumsinhibition und die Inhibition der Proteinsynthese von K562-Zellen, die den humanen Transferin-Rezeptor exprimieren, verursacht (Rybak, S. M., et al., "Humanization of Tmmunotoxins", PNAS 89: 3165–3169 (1992)).
Bi-spezifische Antikörper
Ein monoclonaler Antikörper oder ein Antikörper-Fragment kann in ein bi-spezifisches Analog-Peptid eingebaut werden, wie z. B. von Greenman et al. (Greenman, J., et al., Mol. Immunol. (England) 28(11): 1243–54 (1991)) beschrieben. In diesem Beispiel wurde ein bi-spezifischer F(ab')₂, der zwei (Fab'-(Thioether-Verknüpfung)-Fab') umfasst, konstruiert. Bi-spezifische Antikörper kann man auch erhalten, wenn zwei ganze Antikörper verbunden werden. Ein anderer Weg, bi-spezifische Antikörper zu erhalten, ist die Mischung von Ketten von verschiedenen Antikörpern oder dessen Fragmenten. Auf diese Weise besitzt der "linke" Arm des bi-spezifischen Antikörpers eine Funktion, während der "rechte" Arm eine andere besitzt.
Phagen-Display-Bibliotheken
Die erfindungsgemäßen Analog-Peptide können mit einem System filamentöser Phagen durchgemustert werden. Dieses System kann auch zur Expression von Genen von Antikörpern oder deren Fragmenten sowie für die Durchmusterung von mutagenisierten Antikörper-Varianten verwendet werden, wie beschrieben von Marks et al. (Marks, J. D., et al., "Molecular Evolution of Proteins on Filamentous Phage.
Mimicking the Strategy of the Immune System" , J. Mol . Biol. (England) 267 (23): 1607–10 (1992)). Eine Bibliothek von V_H- und V_κ-Genen oder deren Analoga kann cloniert werden und auf der Oberfläche eines Phagen dargeboten werden. Antikörper-Fragmente, die spezifisch an einige Antigene binden, können wie von Marks berichtet (Marks, J. D., "By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage", J. Mol. Biol. (England) 222 (3): 581–97 (1991)) isoliert werden.
Rovalente Oligosaccharid-Modifikationen
Die vorliegenden Analog-Peptide, alleine oder als Hybrid-Peptide, die Antikörper und deren Fragmente umfassen, können z. B. kovalent modifiziert werden, indem oxidierte Oligosaccharid-Gruppierungen verwendet werden. Die Hybrid-Analog-Peptide können am Oligosaccharid-Rest entweder mit einem Peptid, das mit einem Radioisotop, wie ¹²⁵I, markiert ist, oder mit einem Chelat, wie einem Diethylentriaminpentaessigsäure-Chelat mit ¹¹¹In, modifiziert sein. Die Verwendung von Oligosacchariden sorgt für eine effizientere Lokalisierung bei einem Ziel als die, die mit Antikörpern, die entweder an den Aminosäureketten Lysinen oder den Tyrosinen radioaktiv markiert sind, erreicht wird (Rodwell, J. D., et al., "Site-Specific Covalent Modification of Monoclonal Antibodies: In Vitro and In Vivo Evaluations", PNAS (USA) 83: 2632–6 (1986)). Von den Analog-Peptiden dieser Erfindung sind jene bevorzugt, die die Sequenzen ID NO. 67 bis 73, 75 bis 81, 95 und 96 haben, deren Analoga, wobei ungefähr 1 bis 42 Aminosäuren in der FR pro Kette mit Aminosäuren, wie jenen, die in äquivalenten Positionen in Antikörpern der Spezies, für die das Analogon vorgesehen ist, wie Menschen, vorkommen, substituiert sind, oder deren Fragmente, die 1 bis 3 CDRs pro Kette und deren flankierende Regionen umfassen, mit jeweils ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Framgent von ungefähr 1 bis 10 Aminosäuren, oder mit bis zu der vollständigen N-terminalen Region, oder Kombinationen daraus. Beispiele möglicher Substitutions-Aminosäuren in allen Positionen, einschließlich der wichtigsten Positionen, sind in Tabellen 10 und 11 oben gezeigt, und sie sind in den Spalten, die BrE-3 und KC-4, "am meisten bevorzugte Analoge und bevorzugte Analoge"-Aminosäure-Substituenten überschrieben sind, angegeben. Ebenso sind andere geeignet, wie von der hierin beschriebenen Methode abgeleitet werden kann. Diese Aminosäuresequenzen können durch ein Peptid oder Nicht-Peptid-Linker verbunden werden, wie im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele von Peptid-Linkem sind unter anderem Polylysine, Leucin-Zipper, EGKSSGSGSEJKVD und (GGGGS)x3, und Nicht-Peptid-Polymere. Effektor-Agentien, wie Peptide und Nicht-Peptide, können ebenfalls an die Analog-Peptide dieser Erfindung angehängt werden. Diese umfassen Nicht-Peptid-Polymere, Monomere, Atome, etc., welche unten diskutiert werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst ein bifunktionelles Analog-Peptid, das ein Paar von leichten und schweren Ketten derselben Spezifität umfasst, die miteinander über einen Linker verbunden sind, wie jene, die oben bereitgestellt wurden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein bifunktionelles Analog-Peptid einen Satz von leichten und schweren Ketten, der mindestens eine xenogenische CDR oder variable Region umfasst, z. B. die Aminosäuresequenz ID No. 11 oder 13 aus Tabellen 15 und 16, Sequenz ID No. 95 oder 96 aus Tabellen 55 und 56 unten, oder die entsprechenden CDRs alleine oder getrennt durch 1 bis 10 Aminosäuren und bis zu gesamten Aminosäure-Segmenten von deren flankierenden Sequenzen, und wahlweise mit 1 bis 10 Aminosäuren von jeder N-terminalen Region, Sequenz ID No. 68, 70 und/oder 72, alleine oder mit flankierenden Sequenzen verschiedener Länge, oder 76, 78 und/oder 80, alleine oder mit flankierenden Sequenzen verschiedener Länge, mit den unten gezeigten Modifikationen, wobei ungefähr 1 bis 42 Aminosäuren in der FR pro Kette mit Aminosäuren, wie jenen, die in äquivalenten Positionen in Antikörpern der Ziel-Spezies vorkommen, substituiert sind, oder deren Fragmente, die 1 bis 3 CDRs pro Kette und deren flankierende Regionen umfassen, mit jeweils ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Fragment von ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, und einen Satz von leichten und schweren Ketten, der mindestens eine xenogenische CDR oder ein variables Region-Analog umfasst, z. B. Aminosäuresequenz ID No. 11, 13, 95 oder 96, mit einem unterschiedlichen Satz von substituierten Aminosäuren, wobei ungefähr 1 bis 46 oder mehr Aminosäuren in der FR pro Kette mit Aminosäuren, wie jenen, die in äquivalenten Positionen in Antikörpern der Ziel-Sequenz vorkommen, substituiert sind, oder Fragmenten, die 1 bis 3 CDRs pro Kette und deren flankierende Regionen umfassen, mit jeweils ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Framgent von ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, oder Fragmenten davon oder Kombinationen daraus. Multifunktionale Hybrid-Analog-Peptide können mehrere identische Einheiten oder Kombinationen der obigen bifunktionellen Analog-Peptide mit denselben oder unterschiedlichen Spezifitäten oder xenogenischen Spezies umfassen. Bevorzugte Analog-Peptide sind jene, die Maus-CDRs und andere Regionen umfassen, die mit humanen Aminosäuren substituiert sind.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung ein Hybrid-Analog-Polymer zur Verfügung, das zumindest ein Anti-Tumor-Analog-Peptid und mindestens ein Effektor-Agens, das funktionell mit dem Peptid verbunden ist, umfasst, Kombinationen daraus oder Gemische davon. Das Effektor-Agens, das in dieser Erfindung verwendet wird, umfasst andere Peptid-Polymere als die konstante Region eines Antikörpers derselben Spezies, wie die CDRs, Nicht-Peptid-Polymere, Monomere und Atome, wie Metalle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann das Effektor-Agens ein Atom, wie ein Radioisotop, ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff umfassen. Diese Effektor-Peptide sind für in vivo- und in vitro-Assays geeignet, weil sie die Identifizierung von Komplexen, die von den erfindungsgemäßen Peptiden gebildet werden, erlauben. Radioisotope sind für die in vivo-Bild-Diagnostik besonders bevorzugt. Die Polypeptid-Markierung ist im Stand der Technik bekannt (Greenwood, F. C., et al., Biochem. J. 89: 114–123 (1963)). Wenn ein glykosyliertes Polypeptid verwendet wird, kann die radioaktive Markierung an den Glykosylrest angehängt werden, wie im Stand der Technik bekannt ist (Hay, G. W., et al., in Methods in Carbohydrate Chemistry, Bd. 5: 357, Whistler, R. L., Herausg., Academic Press, NY und London (1965)). Effektor-Agentien, die ein Monomer umfassen, können unter anderem therapeutische, immunogenische oder diagnostische Agentien, Radioisotope, DNA- oder RNA-Monomere, chemische Linker, chemische Chelatoren, Transmitter-Moleküle, Kombinationen daraus, oder Kombinationen daraus mit Peptid- oder Nicht-Peptid-Polymeren oder Copolymeren und Atomen sein. Beispiele für therapeutische Agentien sind unter anderem anti-neoplastische Arzneimittel, wie Vincristin, interkalierende Arzneimittel, Adriamycin, Enzyme, Toxine und Hormone. Beispiele für immunogenische Agentien sind andere Vakzine gegen Tumore, wie Carcinome, oder für andere Zwecke. Beispiele für diagnostische Agentien sind unter anderem Radioisotope und Enzyme. Beispiele therapeutischer, immunogenischer und diagnostischer Agentien sind unter anderem Toxine, Vakzine und Radioisotope. Beispiele von Radioisotopen sind unter anderem ¹¹¹In, ³⁵S, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ²²⁵Ac, ¹²⁵I und ^99mTc. Beispiele von DNA- und RNA-Monomeren sind unter anderem A, T, U, G und C. Beispiele von chemischen Linkern sind unter anderem Dithiobis(succinimidyl)-propionat und Bis(sulfosuccinimidyl)suberat. Beispiele von Transmitter-Molekülen sind unter anderem cAMP und cGMP. Beispiele von Toxinen sind unter anderem Ricin A-Kette und Abrin A-Kette.
Wenn das Effektor-Agens ein Nicht-Polypeptid-Polymer ist, das mit dem erfindungsgemäßen Analog-Peptid verbunden ist, kann es Ester-, Ether-, Vinyl-, Amido-, Imido-, Alkylen-, Arylalkylen-, Cyanat-, Urethan- oder Isopren-Polymere, DNA-Polymere, RNA-Polymere, deren Copolymere und Copolymere daraus mit Peptid-Polymeren oder -Monomeren umfassen, oder es können markierte Atome daran gebunden sein. Beispiele von diesen sind Polyester, Polyether, Polyethylenglykole, Polyvinyle, Polyamido- und Polyimido-Harze, Polyethylene, Polytetrafluorethylen, Poly(ethylen)terephthalat, Polypropylen, Silikon-Kautschuk, Isoprene und deren Copolymere, Copolymere aus Silikon und carboxylierten Polymilch- oder Polyglykol-Säuren oder Kollagen, und ähnliche. Besonders bevorzugt sind bioabbaubare und bioresorbierbare oder bioabsorbierbare Materialien, welche keine endogenen Gewebe beschädigen werden, wenn sie vom Polypeptid abgelöst und in der systemischen Kreislaufzirkulation zurückgelassen werden. Das Effektor-Agens, das ein Peptid ist, kann Antikörper, wie IgA, IgG, IgM, IgE oder IgD, die konstante Region von Antikörpern einer Spezies, die sich von der variablen Region oder dessen Fragmenten unterscheidet, oder Fragmente davon, und die CDRs, variable Regionen, Fab, Fab', (Fab')₂-Fragmente von Antikörpern der oben beschriebenen Klassen, Hormone, Enzyme, Peptid-Transmitter und ganze Antikörper, Kombinationen daraus und Kombinationen daraus mit Nicht-Peptid-Polymeren, Copolymeren, Monomeren und Atomen, wie Radioisotopen, umfassen. Beispiele anderer Antikörper, Fab, Fab', (Fab')₂, CDRs und deren variabler Regionen, sind jene, die spezifisch Tumor-Epitope, wie jene von Carcinomen, einschließlich der Maus-BrE-3- und Anti-KC-4-Antikörper und anderer, die Spezifitäten für verschiedene Tumor-Epitope, wie unter anderem die BrE-1 (ATCC No. HB 9738), BrE-2 (ATCC No. HB 9795) und Mc5-Antikörper, umfassen, und deren Fragmente. Alle diese oben beispielhaft genannten Antikörper binden selektiv an das humane Milchdrüsen-Mucin, und insbesondere an humanes Milchfettkügelchen (HMFG). Jedoch sind Antikörper mit un terschiedlichen Spezifitäten für Antigene der Ziel-Spezies ebenfalls umfasst. Beispiele von Peptid-Transmittern und Hormonen, die sich zur Verwendung eignen, sind unter anderem Insulin, Wachstumshormone, FSH, LH, Endorphine und TNF. Beispiele von Enzymen sind unter anderem Peroxidase, LDH, alkalische Phosphatase und Galactosidase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Hybrid-Analogs umfasst das erfindungsgemäße Analog-Peptid-Polymer nicht-humane CDRs und Sequenzen der variablen Region, und das Effektor-Peptid umfasst die konstante Region der leichten oder schweren Ketten eines humanen Antikörpers oder dessen Fragmente, die von Immunglobulinen einer anderen Spezies gebunden werden können, die selektiv an die konstanten Regionen von Antikörpern, Protein G oder Protein A binden, oder Fragmente, die diese Bindungsfähigkeit besitzen. Ebenfalls ist ein halb-humanisierterlhalb-chimärischer oder Maus-Antikörper bevorzugt (z. B. humanisierte leichte Kette und Maus- oder chimäre schwere Kette und umgekehrt). In einer der am meisten bevorzugten Ausführungsformen umfasst(en) das/die Analog-Peptid(e) alle CDRs, flankierende Sequenzen von 1 bis 10 Aminosäuren, die sie verbinden, und eine N-terminale Region von mindestens bis zu 10 Aminosäuren. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst die vollständig humanisierten BrE-3HZ oder HuBrE3V2, ATCC No. HB 11200, und die vollständig humanisierten HuKC-4HZ oder HuKC4V2, ATCC No. HB 11455, wobei beide unter dem Budapester Abkommen als Beispiel der besten Ausführungsform dieser Erfindung am 13. November 1992 beziehungsweise am 23. September 1993 hinterlegt wurden. Andere am meisten bevorzugte Ausführungsformen sind jene, die chimäre schwere Ketten und humanisierte leichte Ketten besitzen, wie HuBrE3V1 und HuKC4V1, ATCC No. HB 11454, hinterlegt am 23. September 1993, und jene, die chimäre leichte Ketten und humanisierte schwere Ketten besitzen, wie HuBrE3V3 und HuKC4V3, ATCC No. HB 11456, hinterlegt am 23. September 1993, wobei alle unter dem Budapester Abkommen als Bei spiel einer besten Ausführungsform dieser Erfindung hinterlegt wurden.
Das Hybrid-Analog-Polymer kann zwei schwere und zwei leichte Ketten umfassen, wobei jede leichte und jede schwere Kette mindestens eine CDR oder ein Analog-Polypeptid der variablen Region oder Fragmente davon von einer Spezies, und die konstante Region und die substituierten Aminosäuren eines Antikörpers einer anderen Spezies, wie dem Menschen, mindestens eine andere CDR, analoge variable Region, chimäre Fab-, Fab'- oder (Fab')₂, Fragmente davon, Kombinationen daraus und Gemische davon umfassen. Noch bevorzugter ist ein Hybrid-Analog-Peptid, das mindestens zwei "humanisierte" Maus-humane oder chimäre Antikörper-Fragmente davon, Fab, Fab' oder (Fab')₂,-Fragmente davon umfasst, die funktionell miteinander verknüpft sind. Die Peptid-Fragmente können kovalent miteinander verbunden sein, wie im Stand der Technik bekannt ist (Marchis-Mouren G., et al ., "HT 29, a Model Cell Line: Stimulation by the Vasoactive Intestinal Peptide (VIP); VIP Receptor Structure and Metabolism", Bioch. 70(5): 663–71 (1988)), oder sie können mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden (Allen, G., et al., "Production of Epidermal Growth Factor in Escherichia Coli from a Synthetic Gene", J. Cell Sci. suppl. 3: 29–38 (1985)).
Das erfindungsgemäße Hybrid-Analog-Polymer, das oben beschrieben ist, kann zwei schwere und zwei leichte Analog-Ketten besitzen, die funktionell miteinander verbunden sind, wobei jedes Paar aus schweren und leichten Ketten Spezifität für ein (jeweils) anderes Epitop besitzt. Ein Beispiel dieses Analog-Peptids ist ein Paar von "humanisierten" schweren und leichten Ketten der variablen Region eines BrE-3-Analog-Peptids und ein Paar von "humanisierten" leichten und schweren Ketten der variablen Region eines KC-4-Analog-Peptids, die miteinander kovalent über ein Peptid- oder Nicht-Peptid-Polymer oder eine Disulfit-Brücke verknüpft sind, oder nicht-kovalent mittels eines Leucin-Zippers oder zweier helikaler Strukturen, und ähnliches. Nicht-Peptid-Polymere können mit Peptiden kovalent verknüpft werden, und zwar mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind (Duronio, v., et al., "Two Polypeptides Identified by Interleukin 3 Cross-Linking Represent Distinct Components of the Interleukin 3 Receptor", Exp. Hematol. 20 (4): 505–11 (1992)). In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Hybrid-Analog-Peptid bereit, das mindestens eine CDR oder eine analoge variable Region der schweren Kette eines Antikörpers einer ersten Spezies, oder Fragmente davon, funktionell verbunden mit einem ersten Effektor-Agens, und mindestens einer CDR oder analogen variablen Region der leichten Kette eines Antikörpers einer zweiten Spezies oder Fragmente davon, funktionell mit einem zweiten Effektor-Agens verknüpft, und Kombinationen davon, umfasst, wobei jedes Paar aus leichten und schweren Ketten eine vorbestimmte Spezifität besitzt, Kombinationen daraus und Gemische davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Hybrid-Analog-Peptids sind mindestens eine CDR oder analoge variable Region der schweren Kette eines Maus-Antikörpers oder Fragmente davon und mindestens eine CDR oder eine variable Region der leichten Kette eines Maus-Antikörpers oder Fragmente davon miteinander durch ein Nicht-Peptid-Polymer, wie ein Isopren-Polymer oder -Monomer, verbunden. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Hybrid-Analog-Peptid ein solches, bei dem mindestens ein Paar von leichten und schweren Ketten, das mindestens eine Maus-CDR oder analoge variable Region oder ein Fragment davon umfasst, mit mindestens einem anderen Paar von leichten und schweren Ketten, das mindestens eine Maus-CDR oder analoge variable Region oder ein Fragment davon umfasst, verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform sind die zwei oder mehr F_v-Regionen miteinander durch ein Peptid- oder Nicht-Peptid-Polymer oder eine Di sulfit-Brücke kovalent verbunden, oder nicht-kovalent mittels eines Leucin-Zippers oder zweier helikaler Strukturen, und ähnliches. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzen die Analog-Polypeptide der Erfindung Affinität und Spezifität für ein Epitop, das in der am stärksten hydrophilen Region einer Sequenzwieder-holung aus 20 Aminosäuren liegt, die einen großen Teil des Polypeptid-Kerns von Milchdrüsen-Mucin ausmacht, gegen Hexamer-Fragmente der Sequenz "APDTRPAPG" oder Trimer-TRP-Fragmente, von denen gezeigt wurde, dass sie die starke Bindung von allen fünf unterschiedlichen monoclonalen Antikörpern ermöglichen, die gegen das humane Milchfettkügelchen gezogen wurden (Mc1, Mc5, BrE-1, BrE-2 und BrE-3). Von den monoclonalen Antikörpern wurde gezeigt, dass sie an unterschiedliche, aber überlappende Polypeptid-Epitope binden, aber unterschiedliche Gewebs- und Tumor-Spezifitäten besitzen, dass sie sich quantitativ in ihrer Bindung an Tumor-Zellen, wie Brust-Carcinom-Zelllinien, beobachtet mittels Durchfluss-Cytometrie, unterscheiden, und dass sie unterschiedliche Kompetitions-Muster in Bezug auf die Bindung an das native Antigen auf Brust-Carcinom-Zellen besitzen. Unter den Antikörpern, die für die Präparation der vorliegenden Analog-Peptide und Hybrid-Polypeptide verwendet werden, sind auch jene bevorzugt, die starke Bindung an die oben beschriebenen Hexamer-Peptide oder an Fragmente, die ein TRP-Trimer oder invertierte Sequenzwiederholungen davon umfassen, aufweisen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Analog-Peptid den humanisierten Mutein-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie, die die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 11200 besitzt (BrE-3HZ), exprimiert wird. Diese Zelle wurde mit der ATCC unter dem Budapester Abkommen am 13. November 1992 hinterlegt. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Analog-Peptid den humanisierten Mutein-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie, die die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 11455 hat (HuKC-4V2), die unter dem Budapester Abkommen am 23. Sep tember 1993 hinterlegt wurde, exprimiert wird. Diese wurden als beste Ausführungsformen der Erfindung, die den Erfindern bekannt sind, hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Anti-Tumor-Analog-Peptid und/oder Hybrid-Analog-Polymer werden auch als Anti-Tumor-Zusammensetzung zusammen mit einem Trägermaterial oder Verdünnungsmittel, bevorzugt einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial oder Verdünnungsmittel, bereitgestellt. Das hierin bereitgestellte Anti-Tumor-Analog-Peptid und das Hybrid-Polymer können in der Zusammensetzung in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 99,99 Gew.-%, bevorzugter ungefähr 0,01 bis 20 Gew.-%, und noch bevorzugter ungefähr 1 bis 5 Gew.-%, vorliegen. Es sind jedoch auch andere Mengen geeignet. Trägerstoffe im Allgemeinen, und pharmazeutisch-annehmbare Trägerstoffe insbesondere, sind im Stand der Technik bekannt und brauchen hierin nicht weiter beschrieben zu werden. Der Trägerstoff kann in einem separaten sterilen Behälter oder gemischt mit den Polypeptiden bereitgestellt werden. Typischerweise sind Kochsalzlösung, wässrige alkoholische Lösungen, Albumin-Kochsalzlösung-Lösungen und Propylenglykol-Lösungen geeignet. Es können jedoch auch andere verwendet werden. Wenn das Proteinmaterial für therapeutische Zwecke verwendet wird, muss es von einer Reinheit sein, die für die Verabreichung an Menschen geeignet ist, und die Zusammensetzung kann andere Inhaltsstoffe enthalten, wie im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele dafür sind andere antineoplastische Arzneimittel, wie unter anderem Adriamycin und Mitomycin, Cytoxan, PALA und/oder Methotrexat. Jedoch können auch andere therapeutische Arzneimittel, Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel, immunologische Adjuvantien, und ähnliches, hinzugefügt werden. Wenn die oben beschriebene Zusammensetzung zur in vivo-Bild-Diagnostik verwendet wird, kann sie ungefähr 0,001 bis 99,9 Gew.-% Analog-Peptid, und bevorzugter ungefähr 0,01 bis 25 Gew.-% Analog-Peptid, umfassen. Typischerweise kann die Zusammenset zung, wenn sie für therapeutische Zwecke verwendet wird, ungefähr 0,001 bis 99,9 Gew.-% Analog-Peptid, und bevorzugter ungefähr 0,01 bis 30 Gew.-% Analog-Peptid, enthalten. Wenn die Zusammensetzung zur Befreiung von neoplastischen Zellen ex vivo von Körperflüssigkeiten, wie Spinalflüssigkeit, verwendet wird, kann sie ungefähr 0,0001 bis 50 Gew.-%, und bevorzugt ungefähr 0,01 bis 20 Gew.-% Analog-Peptid umfassen. Wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei der in vitro-Diagnose von Tumoren, wie Carcinomen, verwendet wird, kann sie ungefähr 0,001 bis 35 Gew.-% Analog-Peptid, und bevorzugter ungefähr 0,01 bis 10 Gew.-% Analog-Peptid, umfassen. Andere Mengen sind jedoch auch geeignet.
Solche Produkte finden eine Anwendung in der Behandlung von Tumoren, wie Carcinomen, wie unter anderem Brust-, Lungen-, Ovarien-, Endometrium-, Pankreas-, Prostata- und Dickdarm-Krebsarten. Die "humanisierten", "halb-humanisierten" und "teil-humanisierten" Analog-Peptide können zur in vivo-Behandlung oder Diagnose von Menschen verwendet werden. Die "animalisierten", "halb-animalisierten" und "teil-animalisierten" Analog-Peptide der Erfindung können für die Behandlung von nicht-humanen Arten, wie sie oben beschrieben wurden, verwendet werden, sofern die Aminosäuren der Spezies für jene der xenogenischen Aminosäuren, die an einer spezifischen Stelle vorkommen, eingesetzt werden, und jede konstante Region, die im Analog vorkommt. Die vorliegenden Analog-Peptide sind besonders geeignet für die wiederholte Verabreichung an einen Patienten und für Langzeit-Therapie, wie im Falle von Metastasen und/oder dem Wiederauftreten von Tumoren. Von allen Analoga, die hierin beschrieben wurden und umfasst sind, sind die geeignetsten für in vivo-Anwendungen jene, die niedrige oder keine Bindung mit Serum-Antigenen und mit normalen Zellen eingehen. Geeignet für in vitro- oder ex vivo-Verwendungen sind jene, die gute Bindung zu Tumorzell-Antigenen, wie dem Carcinomzell-Antigen, aufweisen und schwache oder keine Bindung an normale Zellen. Obwohl ein Patient im Blutkreislauf eine störende Menge eines Moleküls aufweisen kann, das das Analog-Peptid binden kann, kann das Peptid immer noch nach Entfernen eines solchen Serum-Moleküls, entweder durch ex vivo-Verfahren, oder durch Verabreichung von Ausspülungsdosen ("flush doses") des Analog-Peptids oder Fragmenten davon, verabreicht werden.
Ein Kit für die Diagnose von Tumoren, wie Carcinomen, kann eine Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Anti-Tumor-Analog-Peptid umfasst, einen festen Trägerstoff, Anti-Tumor-Antikörper (Positivkontrolle), Immunglobuline einer anderen Art, die selektiv die konstanten Regionen des Antikörpers binden, Protein G oder Protein A, und Anweisungen zu seiner Verwendung umfassen. Dieser diagnostische Kit kann verwendet werden, indem das Antigen oder das erfindungsgemäße Analog-Peptid oder ein Fusionsprotein daraus kovalent an den festen Trägerstoff mittels eines Linkers angehängt wird, wie im Stand der Technik bekannt ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Trägerstoff mit einem Polypeptid, wie beispielsweise methyliertem Albumin, beschichtet, wie in dem US-Patent 4 572 901 beschrieben, wobei auf dessen relevanten Text hier expressis verbis Bezug genommen wird. Wenn eine biologische Probe in eine Vertiefung gegeben wird, wird das erfindungsgemäße Analog-Peptid an irgendein Tumor-Antigen, wie beispielsweise ein Carcinom-Antigen, binden, das in der biologischen Probe vorkommt. Wenn ein kompetitiver Assay verwendet wird, werden zum festgebundenen Antigen oder dessen Hybrid-Peptid bekannte Mengen des Analog-Peptids und die Probe gegeben. Danach können γ-Globulin, Protein G oder Protein A in markierter Form zur Detektion hinzugefügt werden. Anti-Tumor-Antikörper einer ersten Spezies kann man erhalten, indem man ein Individuum einer anderen Spezies mit Tumor-Zellen, wie Carcinomzellen, dem humanen Milchfettkügelchen-Mucin, und ähnlichen, konfrontiert, wie im Stand der Technik bekannt ist (Peterson, J. A., et al., Hybridoma 9: 221 (1990); US-Patent Nr. 4 708 930). Monoclonale Antikörper können hergestellt werden, wie von Kohler und Milstein (Kohler, G. und Milstein, C., "Continuous Culture of Fused Cell Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256: 495–497 (1975)) beschrieben. Geeignet zur Verwendung in dieser Erfindung sind Antikörper, wie IgG, IgM, IgE, IgA und IgD. Protein A, Protein G und γ-Globulin sind kommerziell erhältlich.
Ein diagnostischer Kit zur Detektion von Tumoren, wie Carcinomen, und insbesondere humanen Carcinomen, der eine Anti-Tumor-Zusammensetzung, die ein Hybrid-Analog-Peptid und ein Effektor-Agens, umfassend ein Enzym, ein Radioisotop, einen Flüoreszenzfarbstoff und/oder ein Peptid, das die konstante Region eines Antikörpers der Spezies, für die es zur Verwendung vorgesehen ist, oder Fragmente davon, die in der Lage sind, die anti-konstante Region von Immunglobulinen, Protein G oder A zu binden, umfasst, einen Anti-Tumor-Antikörper, Immunglobuline gegen konstante Regionen, Protein G oder Protein A, einen festen Trägerstoff, woran funktionell ein Antigen gebunden ist, das an das erfindungsgemäße Anti-Tumor-Hybrid-Analog-Peptid und den Antikörper spezifisch bindet, und Anweisungen zu dessen Verwendung, umfasst, wird hierin bereitgestellt. Wenn das Effektor-Agens ein Peptid umfasst, wie die konstante Region eines Antikörpers der Ziel-Spezies, kann an den festen Trägerstoff funktionell ein Antikörper gebunden sein, welcher spezifisch an einen Teil eines Fusionsproteins, das sich von dem Antigen der Erfindung unterscheidet, bindet. Dies erlaubt die Bindung des Anti-Tumor-Analog-Peptids an das Antigen-Molekül, das jetzt an den festen Trägerstoff angehängt ist. Jeder Komplex, der sich zwischen dem erfindungsgemäßen Hybrid-Analog-Peptid und dem an die feste Oberfläche gebundenen Tumor-Antigen ausbildet, wird daher an das feste Substrat gebunden bleiben. Durch Zugabe einer bekannten Menge des Hybrid-Antigen-Peptids und der Probe zu dem festgebundenen Antigen kann dann ein kompetitiver Assay durchgeführt werden. Die Menge an Antigen, die in der Probe vorliegt, kann man aus einer Verdünnungskurve durch Zugabe von Immunglobulinen gegen die konstante Region, Protein G, Protein A oder anderen Antikörper-bindenden Molekülen, z. B. so markiert, dass sie an das Hybrid-Analog-Peptid, das jetzt an die feste Oberfläche gebunden ist, binden, erhalten. Dieser Kit kann in einem kompetitiven Assay verwendet werden, wobei das festgebundene Antigen-Molekül mit Antigen in der Probe bei bekannter Menge des erfindungsgemäßen Analog-Peptids kompetitiert. Der Assay wurde von Ceriani, R. L., et al. (Ceriani, R. L., et al., Anal. Biochem. 201: 178–184 (1992)) beschrieben, auf dessen relevanten Text hierin expressis verbis Bezug genommen wird .
Ein Tumor, wie ein Carcinom, kann in vivo bildlich dargestellt und/oder diagnostiziert werden, indem einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er ein Carcinom hat, das Anti-Tumor-Analog-Peptid der Erfindung in radioaktiv markierter Form verabreicht wird, und zwar in einer Menge, die wirksam ist, die Tumorzellen zu erreichen und daran zu binden, und indem jede lokale Bindung des markierten Analog-Peptids an den Tumor detektiert wird. Typischerweise kann das erfindungsgemäße Analog-Peptid in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 5.000 mg/kg Gewicht pro Behandlung, bevorzugter ungefähr 0,01 bis 5.000 μg/kg Gewicht pro Behandlung, und insbesondere ungefähr 0,1 bis 500 μg/kg Gewicht pro Behandlung verabreicht werden. Jedoch können auch andere Mengen verwendet werden. Radioaktive Markierungen, die verwendet werden können, sind unter anderem ¹¹¹IN, ¹²⁵I, ^99mTc, ¹³¹I. Diese Radioisotope können mit einem PET-Scanner, mittels NMR-Bild-Diagnostik und Radioaktivitäts-messenden Apparaten detektiert werden, welche von der medizinischen Gemeinschaft in breitem Maße verwendet werden.
Die Anwesenheit eines Tumors, wie eines Carcinoms, kann auch in vitro diagnostiziert werden, indem eine biologische Probe mit dem Anti-Tumor-Analog-Peptid oder Hybrid-Polypeptid der Erfindung unter Bildung eines Anti-Tumor-Analog-Peptids-Antigen-Komplexes mit jedem Tumor-Antigen, das in der Probe vorhanden ist, in Kontakt gebracht wird, und indem jeder gebildete Komplex detektiert wird. Die biologische Probe erhält man typischerweise von einem Patienten, wie beispielsweise einem Menschen, von dem vermutet wird, dass er den Tumor hat. Geeignete biologische Proben sind unter anderem Serum, Blut, Sputum, Fäces, Lymphflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Lungensekretionen und Urin. Natürlich kann jede Flüssigkeits-, Gewebe- und ähnliche Quelle zur Verwendung in diesem Verfahren präpariert werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Weder das halb-chimäre/halb-humanisierte Hybrid-BrE-3-Analog-Peptid, noch das chimäre BrE-3-Polypeptid dieser Erfindung oder der Maus-BrE-3-Antikörper zeigen im Wesentlichen starke Bindung an normales Gewebe. Das Hybrid-BrE-3-Analog-Peptid zeigt ein Bindungsmuster, das dem des chimären BrE-3-Polypeptids und des Maus-BrE-3-Antikörpers ähnlich ist. Vom Maus-BrE-3-Antikörper wurde gezeigt, dass er mit Spezifität an verschiedene Tumoren, wie beispielsweise Carcinome der Brust, Lunge, Ovarien, Blase und des Endometriums, des Mesothelioms, des Dickdarms, der Niere, der Leber, des Pankreas, der Speicheldrüsen, an Sarkome und die der Schilddrüse bindet. Schwache Bindung wurde nur bei normalem Brustgewebe, Lungengewebe, den distalen verknäulten Tubuli der Niere, den Acini des Pankreas und der Magenschleimhaut beobachtet (Peterson, J. A., et al. (1990), s. oben). Das Maus-KC-4-Hybrid-Peptid besaß eine Gewebsspezifität, die der von dem Maus-KC-4-Antikörper ähnlich war. Von dem monoclonalen KC-4-Antikörper wurde gezeigt, dass er spezifisch und stark an festes Tumorgewebe in der Lunge, dem Dickdarm, der Niere, der Brust, dem Magen, der Prostata, dem Pankreas, Lymphknotengängen und Lymphomen bindet, und nicht-spezifisch und schwach an normales Brust-, Nieren- und Magen-Gewebe. KC-4 zeigte auch einige schwache Bindung an normales Gewebe, einschließlich der Nabelschnur, Uterus, Schilddrüsen, Zunge, Prostata, Niere. Nebenniere, Lunge, Gallenblase, Herz, Lymphknoten, Dickdarm, Leber, Gehirn, Hoden, Thymus und Placenta (US-Patent 4 708 930). In einer bevorzugten Ausführungsform des in vitro-diagnostischen Verfahrens umfasst das Anti-Carcionom-Analog-Peptid, das zu der biologischen Probe gegeben wird, ein markiertes Hybrid-Analog-Peptid. Geeignete Markierungsmaterialien wurden oben beschrieben. Dieses Verfahren kann mit dem oben beschriebenen Kit, der einen festen Trägerstoff enthält, als kompetitiver Assay durchgeführt werden, wie von Ceriani, R. L., et al. offenbart (Ceriani, R. L., et al. (1992), s. oben).
Die vorliegenden Analog-Peptide sind auch für die Befreiung biologischer Proben von neoplastischen Zellen, wie beispielsweise Carcinomzellen, anwendbar, seien es Flüssigkeits- oder Gewebe-Proben. Die Befreiung einer Flüssigkeits-Probe von neoplastischen Zellen ist Teil der Erfindung und kann durchgeführt werden, indem eine biologische Flüssigkeit, von der vermutet wird, dass sie neoplastische Zellen umfasst, mit dem erfindungsgemäßen Analog-Peptid in Kontakt gebracht wird, welches in der Lage ist, selektiv an ein Antigen der neoplastischen Zellen zu binden, und indem man dem Peptid erlaubt, das Antigen zu binden, und indem man den Analog-Peptid-Zell-Komplex vom Rest der Flüssigkeit trennt.
Dieses Verfahren kann angewendet werden um ungewollte Zellen ex vivo zu reinigen, indem eine biologische Probe von einem Patienten extrahiert wird, die neoplastischen Zellen daraus durch Abtrennung der Analog-Peptid-Zell-Komplexe oder durch weitere Zugabe eines Effektors, wie Komplement, oder eines Toxins oder einer radioaktiven Markierung, die auf die Zelle wirken kann, eliminiert werden, und die ge reinigte Probe dann dem Patienten zurückgegeben wird. Dies ist typischerweise für die Verwendung zusammen mit Spinalpunktionen geeignet, wobei die Spinalflüssigkeit von neoplastischen Zellen, wie Carcinomzellen, vor der Re-Injektion befreit ist. Andere Flüssigkeiten können ebenfalls auf diese Weise behandelt werden.
Die vorliegenden Analog-Peptide können auch für die histochemische Untersuchung auf Anwesenheit von neoplastischen Zellen, wie Carcinomzellen, in einem Gewebe, das man von einem Patienten entnommen hat, von dem vermutet wird, dass er an einem Carcinom leidet, verwendet werden, und zwar mittels Verfahren, die im Stand der Technik Standards sind, wie der Präparation von Gewebeschnitten und Fixierung auf einem festen Substrat um das Aufbringen des Peptids und dann die Untersuchung irgendwelcher Bindung an neoplastische Zellen in der Probe, wie sie durch die Bildung von Komplexen zwischen dem Analog-Peptid und Antigenen auf oder in den Zellen angezeigt werden, ermöglichen.
Das Wachstum oder die Größe eines primären oder metastasierenden Tumors oder einer Neoplasie, wie beispielsweise einem Carcinom, kann inhibiert oder reduziert werden, indem einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, eine effektive Menge des erfindungsgemäßen Anti-Tumor-Hybrid-Analog-Peptids verabreicht wird. Typischerweise kann das Hybrid-Analog-Peptid in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 2000 μg/kg Körpergewicht pro Dosis, und bevorzugter ungefähr 0,01 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Dosis, verabreicht werden. Wiederholte Dosen können verabreicht werden, wie vom behandelnden Arzt vorgeschrieben. Jedoch sind auch andere Mengen geeignet. Im Allgemeinen wird die Verabreichung des Hybrid-Analog-Peptids durch Infusion durchgeführt, so dass die Menge an radioaktiver Markierung, Toxin oder anderem Effektor-Agens, das vorhanden ist, welches eine zerstörerische Wirkung hervorrufen kann, unter Kontrolle gehalten werden kann, indem die Verabreichungs-Rate variiert wird. Typischerweise kann die Infusion einer Dosis einige Stunden dauern. Jedoch wird hierin auch die konstante Infusion einer Dosis für therapeutische Zwecke vorgeschlagen, die die Aufrechterhaltung eines konstanten Spiegels des Hybrid-Polypeptids im Serum ermöglicht. Die Infusion des erfindungsgemäßen Hybrid-Analog-Peptids kann wie folgt durchgeführt werden. Ein intravenöser (I. V.) Katheter kann vorbehandelt werden, z. B. mit 0,9% NaCl und 5% humanem Serumalbumin, und zur intravenösen Verabreichung gesetzt werden. Die vorgeschriebene Dosis des Analog-Peptids kann wie folgt infundiert werden. Anfänglich kann unmarkiertes Analog-Peptid infundiert werden. 30 Minuten nach der Fertigstellung der Infusion des urmarkierten Antikörpers können ¹¹¹In-markierter und ⁹⁰Y-markierter Antikörper co-infundiert werden. Die I. V.-Infusion kann ein Gesamtvolumen von 250 ml 0,9% NaCl und 5% humanes Serumalbumin umfassen und über eine Dauer von ungefähr 2 Stunden infundiert werden, abhängig von irgendwelchen Raten-abhängigen Nebenwirkungen, die beobachtet wurden. Lebenszeichen sollten alle beispielsweise 15 Minuten während der Infusion und jede Stunde nach der Infusion gemessen werden, bis sie stabil sind. Eine gründliche kardio-pulmonale ärztliche Untersuchung kann vor und nach Abschluss der Infusion durchgeführt werden. Medikamente, einschließlich Acetaminophen, Diphenhydramin, Epinephrin und Corticosteroide können zur Behandlung von allergischen Reaktionen bereitgehalten werden, sollten sie auftreten. Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Hybrid-Analog-Peptids kann wiederholt werden, wenn es einem praktizierenden Arzt wünschenswert erscheint. Wenn einmal eine erste Dosis verabreicht wurde und die Bild-Diagnostik andeutet, dass eine Reduktion in der Größe des Tumors vorliegen könnte, ob es nun ein primärer oder metastasierender Tumor ist, dann können typischerweise wiederholte Behandlungen alle ungefähr 1 bis 100, und bevorzugter ungefähr 2 bis 60 Tage, verabreicht werden. Diese wiederholten Behandlungen können über eine Dauer von bis zu 2 Jahren fortgeführt werden, und unter gewissen Umständen sogar für längere Zeitspannen oder bis zum vollständigen Verschwinden des/der Tumors(e).
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Hybrid-Analog-Peptides ist typischerweise nützlicher, wenn ein primärer Tumor beispielsweise ausgeschnitten wurde. Daher ist es vornehmlich so, dass das vorliegende Verfahren zum „Säubern" ("mopping up") nach chirurgischem Eingriff oder in Fällen von Krebsmetastasen von höchstem Nutzen ist.
Ein reines, isoliertes Analog-Polydesoxyribonucleotid, das ein analoges Oligodesoxyribonucleotid umfasst, das das Analog-Peptid oder Hybrid-Peptid dieser Erfindung codiert, einschließlich aller redundanten Sequenzen, kann für die Herstellung des Peptids verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Analog-Polydesoxyribonucleotid der Erfindung eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Sequenz ID No. 64 aus Tabelle 45, oder DNA-Sequenz ID No. 65 aus Tabelle 46, oder DNA-Segmenten, die die CDR-Fragmente Sequenz ID No. 68, 70 und/oder 72 oder 76, 78 und/oder 80, flankiert von 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, und das N-terminale Fragment von 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren humanen Ursprungs codieren. Die obigen DNA-Sequenzen können zur Expression unter demselben Promotor cloniert werden. Ähnlich bevorzugt sind auch die DNAs, die Sequenz ID No.: 93 und/oder 94 aus Tabellen 52 und 53 haben, und die Segmente, die deren CDR-Fragmente codieren, alleine oder von DNA-Segmenten, die für 1 bis 10 oder mehr flankierende Aminosäuren codieren, getrennt, und/oder terminiert von DNA-Segmenten, die für 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren des N-Terminus codieren.
Ebenfalls wird hierin ein Hybrid-Vektor bereitgestellt, der einen Vektor umfasst, bei dem die erfindungsgemäßen Analog-Polydesoxyribonucleotide funktionell damit ver knüpft sind. Typischerweise sind Vektoren geeignet, die sowohl in eukaryotischen, als auch in prokaryotischen Zellen zur Replikation befähigt sind. Wenn die Präparation eines glykosylierten Analog-Polypeptids erwünscht ist, sollte sich der Vektor zur Transfektion von eukaryotischen Wirtszellen eignen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Hybrid-Vektor das Analog-Polydesoxyribonucleotid und ein Polydesoxyribonucleotid, das ein Oligodesoxyribonucleotid umfasst, das für ein Effektor-Peptid codiert, wobei das das Effektor-Peptid codierende Polydesoxyribonucleotid funktionell mit dem Vektor verbunden ist. Wie schon angedeutet, können die verschiedenen DNA-Sequenzen zur Expression unter demselben Promotor cloniert werden. Zusätzlich kann auch das Polydesoxyribonucleotid, das für das Effektor-Polypeptid codiert, zur Expression unter demselben Promotor cloniert werden.
Diese Erfindung umfasst auch eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Hybrid-Vektor transfiziert wurde. Geeignete Wirte sind prokaryotische und eukaryotische Wirte, wie unter anderem Bakterien, Hefe, und Säugerzellen, wie Insektenzellen und nicht-produzierende Hybridom-Zellen. Geeignete Vektoren und/oder Plasmide zur Transfektion von jedem dieser Wirtstypen sind im Stand der Technik bekannt und brauchen nicht weiter hierin beschrieben werden. Ebenfalls sind im Stand der Technik Verfahren zur Clonierung von DNA-Sequenzen zu jedem dieser Vektorentypen und für die Transfektion der verschiedenen Wirtszelltypen bekannt. Besonders bevorzugt ist die Zelllinie, die die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 11200 hat (BrE-3 HZ).
Polyribonucleotide kann man durch Transkription der Polydesoxyribonucleotide, die oben beschrieben sind, erhalten, wie im Stand der Technik bekannt ist. Es werden hierin Analog-Polyribonucleotide bereitgestellt, die Analog-Oligoribonucleotide umfassen, die für mindestens eine CDR oder eine analoge variable Region oder Fragmente davon co dieren, Kombinationen daraus und Kombinationen daraus mit einem Effektor-Peptid können präpariert werden, indem die gewünschten DNA-Segmente cloniert werden und das somit erhaltene Hybrid-Polydesoxyribonucleotid in die entsprechenden RNA-Sequenzen transkribiert werden.
Das Analog-Peptid, welches spezifisch an ein Antigen auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer neoplastischen Zelle bindet, oder das von der Zelle freigesetzt wird, kann mittels eines Verfahrens hergestellt werden, das die Clonierung des erfindungsgemäßen Analog-Polydesoxyribonucleotids in einen Vektor unter Bildung eines Hybrid-Vektors, die Transfektion einer Wirtszelle mit dem Hybrid-Vektor und das Ermöglichen der Expression des Anti-Tumor-Analog-Peptids, und die Isolierung des Anti-Tumor-Polypeptids oder Gemischen davon, umfasst. Das DNA-Segment, das für das Analog-Polypeptid codiert, kann man durch chemische Synthese oder durch Orts-spezifische Modifikation der Sequenz, die für die variable Region der xenogenischen Spezies codiert, und zwar durch PCR-Amplifikation mit spezifisch entworfenen Primern, erhalten, wie im Stand der Technik bekannt ist. Die DNA-Fragmente können auch mit Primern, die ein Stop-Codon an gewünschten Positionen einführen, durch PCR präpariert werden, wie im Stand der Technik bekannt ist. Bevorzugt werden die Clonierungs- und Transfektions-Schritte durchgeführt, indem Polydesoxyribonucleotide, die für die Analog-Peptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend mindestens eine CDR oder analoge variable Region der schweren oder leichten Ketten der xenogenischen Spezies, Antikörper davon, oder Fragmente davon, cloniert werden. Das Verfahren kann weiterhin umfassen, dass den exprimierten Analog-Peptiden erlaubt wird, miteinander in Wechselwirkung zu treten um doppelkettige Analog-Peptide zu bilden, wobei eine oder beide Analog-Peptid-Ketten mindestens eine xenogenische CDR oder eine variable Region der leichten oder schweren Kette des Antikörpers oder ein Fragment davon umfassen, und zwar so modifiziert, wie oben beschrieben. Immer noch ein Teil dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Hybrid-Analog-Peptids, das ein Effektor-Peptid und ein Analog-Peptid, welches spezifisch an ein Antigen auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer Tumorzelle, wie eine Carcinomzelle, oder das von der Zelle freigesetzt wird, bindet, umfasst, wobei das Verfahren die Transfektion einer Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Hybrid-Vektor, der eine DNA-Sequenz trägt, die für das Analog-Hybrid-Peptid codiert, das Ermöglichen der Expression des Hybrid-Analog-Peptids, und die Isolierung des Hybrid-Analog-Peptids oder Gemischen davon, umfasst. Die Techniken zum Erlangen von mRNA zur Ausführung reverser Transkription und PCR-Amplifikation von DNA, chemischer Synthese von Primern, Clonierung von DNA-Sequenzen in einen Vektor, der Transfektion einer Wirtszelle und der Aufreinigung von Polypeptiden aus Kulturmedium, sind im Stand der Technik bekannt und brauchen hierin nicht weiter beschrieben werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf ein Anti-Idiotyp-Peptid, das polyclonale Antikörper umfasst, gezogen gegen Anti-Tumor-Antikörper, das Analog-Peptid der Erfindung, dessen monoclonale Antikörper, Fragmente davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CDRs, Fab, Fab', (Fab')₂, und Fragmente der variablen Region und Fragmente davon, Analoga davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fab', (Fab')₂, und variable Regionen davon, wobei ungefähr 1 bis mindestens 46 Aminosäuren in den FRs pro Kette mit Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren, die in äquivalenten Positionen in menschlichen Antikörpern vorkommen, substituiert sind, oder Fragmente davon, die 1 bis 3 CDRs pro Kette und deren flankierende Regionen umfassen, jedes mit ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren, alleine oder mit einem N-terminalen Fragment aus ungefähr 1 bis 10 oder mehr Aminosäuren. Die Technik zum Erhalt von Anti-Idiotyp- Polypeptiden ist ebenfalls im Stand der Technik bekannt und braucht nicht weiter hierin beschrieben zu werden (Nisonoff, A. und Lamoyi, "Implication of the Presence of an Internal Image of an Antigen in Anti-Idiotype Antibo-dies: Possible Applications to Vaccine Production", Clin. Immunol. Immunopathol. 21: 397–406 (1981)). Außerdem ist die Technik zur Herstellung von Hybridomen, die monoclonale Antikörper einer bestimmten Spezifität sezernieren, ebenfalls im Stand der Technik bekannt (Kohler, G. und Milstein, C. (1975), s. oben). Techniken zum Erhalt unterschiedlicher Antikörperfragmente wurden oben beschrieben oder sind im Stand der Technik bekannt und brauchen nicht weiter hierin beschrieben werden (Wilbanks, T., et al., "Localization of Mammary Tumors in Vivo with ¹³¹I-Labeled Fab Fragments of Antibodies Against Murine Mammary Epithelial (MME) Antigens", Cancer 48: 1768–1775 (1981)). Die Techniken zur Modifizierung von Peptiden, um die erfindungsgemäßen Analog-Peptide zu erhalten, wurden oben beschrieben oder sind im Stand der Technik bekannt.
Das Hybrid-Anti-Idiotyp-Polymer kann außerdem ein Effektor-Agens umfassen, das mit dem Anti-Idiotyp-Polypeptid funktionell verknüpft ist. Effektor-Agentien, die zur Verwendung hierin geeignet sind, wurden oben für das Anti-Tumor-Analog-Polypeptid der Erfindung beschrieben und sind auch zur Verwendung mit dem Anti-Idiotyp-Polypeptid geeignet. Bevorzugte Hybrid-Polymere sind polyclonale Antikörper, die gegen die monoclonalen Anti-Tumor-Antikörper oder das erfindungsgemäße Analog-Peptid gezogen wurden, und ein monoclonaler Antikörper, der durch Fusion einer B-Zelle, die einen Antikörper produziert, der Spezifität für das erfindungsgemäße Analog-Peptid besitzt, und einer immortalisierten Zelllinie erhalten wird. Ebenfalls sind Fragmente des monoclonalen Antikörpers, wie Fab, Fab', (Fab')₂, und Fragmente der variablen Region, Analoga und Fragmente davon, wie oben beschrieben, und CDRs bevorzugt. Wie oben für das Anti-Tumor-Polypeptid-Analog beschrieben, sind auch Kombinationen der obigen Fragmente und Analoga und Kombinationen der Fragmente mit ganzen Antikörpern und deren Analoga bevorzugt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anti-Idiotyp-Polymer eine analoge variable Region eines monoclonalen Antikörpers, die mit einem Peptid verbunden ist, das die oben beschriebenen Hexamere oder Trimere oder invertierte Sequenzwiederholungen davon umfasst.
Es werden ebenfalls DNA- und RNA-Segmente vorgeschlagen, die das Anti-Idiotyp-Polymer und Hybrid-Polymer codieren, ein Hybrid-Vektor, bei dem die DNA funktionell damit verbunden ist, und eine Wirtszelle, die mit dem Hybrid-Vektor transfiziert ist.
Es wird hierin auch ein Anti-Tumor-Vakzin bereitgestellt, das das erfindungsgemäße Anti-Idiotyp-Polypeptid und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfasst. Typischerweise liegt das Anti-Idiotyp-Polypeptid in der Zusammensetzung in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 99,99 Gew.-%, und bevorzugter ungefähr 0,01 bis 50 Gew.-%, der Zusammensetzung vor. Jedoch sind auch andere Mengen geeignet. Pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe sind im Stand der Technik bekannt und brauchen hierin nicht weiter beschrieben werden. Das hierin bereitgestellte Vakzin kann außerdem andere Inhaltsstoffe, wie Adjuvantien, und ähnliches, umfassen. Beispiele von Adjuvantien sind unter anderem SAF-1 und Freund'sches Adjuvans. Geeigneterweise können auch andere Inhaltsstoffe, die typischerweise für die Herstellung von Vakzinen verwendet werden, hierin verwendet werden. In einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Vakzin in Einheitsform als Puder oder in einem Lösungsmittel bereitgestellt werden. In einer anderen Ausführungsform kann es in Puderform in einem sterilen Behälter bereitgestellt werden, der eine Vielzahl von Dosen zur Herstellung vor der Anwendung umfasst. Verdünnungsmittel, die zur Herstellung einer Formulierung geeignet sind, die ei nem Patienten durch Injektion verabreicht werden kann, sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele wurden oben gegeben.
Ein Anti-Tumor-Vakzinierungs-Kit wird ebenfalls durch diese Erfindung bereitgestellt, der das oben beschriebene Vakzin und ein Verdünnungsmittel in getrennten sterilen Behältern und Anweisungen zu seiner Verwendung umfasst.
Eine effektive Menge des oben beschriebenen Anti-Idiotyp-Polypeptids oder Hybrid-Polypeptids kann verabreicht werden um einen Menschen zu impfen. Typische Mengen, die verabreicht werden um einen Menschen zu impfen, sind ungefähr 0,001 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/Dosis, bevorzugter ungefähr 0,1 bis 5000 μg/kg Körpergewicht/Dosis. Das erfindungsgemäße Anti-Idiotyp-Vakzin kann wiederholt verabreicht werden um die aktive Immunisierung, die von der ersten Dosis hervorgerufen wurde, zu verstärken. Ein Anti-Idiotyp-Antikörper spiegelt sehr wahrscheinlich das Epitop auf den neoplastischen Zellen wieder, gegen welche der Anti-Tumor-Antikörper bindet. Daher kann er zum Hervorrufen einer immunologischen Antwort eines Patienten, wie eines Menschen oder eines anderen Säugers, gegen seine eigenen neoplastischen Zellen verwendet werden.
Wenn ein Anti-Idiotyp-Polypeptid von z. B. nicht-humaner Herkunft z. B. einem Menschen verabreicht wird, kann es eine irgendwie zerstörerische Antwort hervorrufen. Dementsprechend ist in der Theorie die immunogenische Reaktion gegen die xenogenischen Sequenzen, die in einem Menschen ausgelöst wird, umso geringer, je kleiner die nicht-humane Aminosäure-Sequenz ist, die das Anti-Idiotyp-Polypeptid enthält. Dementsprechend sind bevorzugte Anti-Idiotyp-Polypeptide jene, die mindestens eine CDR oder eine variable Region eines nicht-humanen Antikörpers enthalten, der spezifisch an das hierin beschriebene Anti-Tumor-Polypeptid bindet, und zwar wahlweise als Hybrid- Polypeptid. Ebenfalls sind humane Anti-Idiotyp-Antikörper, CDR und variable Fragmente davon bevorzugt, und Fragmente davon, die mit einem Effektor-Agens funktionell verbunden sind, das ein humanes Polypeptid umfasst, das die konstante Region eines humanen Antikörpers und Fragmente davon, Nicht-Peptid-Polymere, Monomere und Atome, die, wie oben beschrieben, radioaktiv markiert sein können, umfassen kann. Andere Typen von Konstrukten sind ebenfalls möglich, von denen mehrere oben beschrieben wurden.
Peptide, die die Sequenz APDTRPAPG oder Fragmente davon, die Hexamere mit dem Trimer TRP oder TRP selbst oder invertierte Sequenzwiederholungen davon umfassen, umfassen, können ebenfalls zur Herstellung des Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere als Teil des antigenischen Peptids. Das Peptid, das die Hexapeptid- oder Tripeptid-Sequenzen umfasst, kann als invertierte Sequenzwiederholung, die bis zu 10.000 Wiederholungen der Grundeinheit, und in einigen Beispielen bis zu 500.000 Wiederholungen umfasst, verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform können Peptide, die ein oder mehrere Hexapeptide oder Tripeptide umfassen, funktionell mit anderen Polypeptid-Sequenzen mit verwandter oder nicht-verwandter Funktion verbunden werden, wobei die Sequenzen eine Masse zur Verfügung stellen, die die Ausscheidung des immunologischen Komplexes, der zwischen den zirkulierenden ungebundenen oder übrigen Antikörpern oder Polypeptiden, die zur Therapie der Neoplasie, wie beispielsweise Carcinomen, und dem Hexapeptid gebildet werden, durch die Leber und/oder Nieren zu unterstützen. Die Peptide, die das Hexapeptid oder Tripeptid umfassen, können auch als Hybrid-Analog-Peptid mit anderen Analog-Peptiden, die oben beschrieben sind, bereitgestellt werden. In Abwesenheit einer solchen Behandlung kann der therapeutische Antikörper, der ein Radioisotop, ein Toxin oder andere therapeutische Moleküle tragen kann, für mehrere Tage und in einigen Beispielen für mehrere Wochen im Kreislauf verbleiben. Dies kann im Falle eines erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Antikörpers oder Analogs ausgedehnten Schaden hervorrufen, was für die Gesundheit des Patienten hochschädlich, und in einigen Beispielen tödlich ist.
Daher kann die Serum-Konzentration an zirkulierendem Antikörper oder Polypeptid, das an ein Antigen auf der Oberfläche oder im Cytoplasma von Tumorzellen, wie Carcinomen, oder von den Zellen freigesetzt, bindet, durch Verabreichung des oben beschriebenen Anti-Idiotyp-Polypeptids an einen Patienten herabgesetzt werden, und zwar Verabreichung in einer Menge, die wirksam ist, das zirkulierende Polypeptid zu binden und dabei seine Ausscheidung zu beschleunigen. Typischerweise wird das Anti-Idiotyp-Polypeptid oder Hybrid-Polymer in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 5000,00 mg/kg Körpergewicht/Dosis, bevorzugter ungefähr 0,01 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/Dosis, verabreicht. Jedoch können auch andere Mengen verwendet werden. Die Verabreichung des Anti-Idiotyp-Polypeptids kann, wie oben beschrieben, eine Infusion sein.
Das Wachstum oder die Größe eines primären oder metastasierenden Tumors kann inhibiert oder reduziert werden, indem einem Patienten, der die Behandlung benötigt, eine effektive Menge eines Antikörpers oder eines Anti-Tumor-Hybrid-Analog-Peptids, der/das ein Effektor-Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioisotopen, therapeutischen Medikamenten und Vakzinen, und ein Anti-Tumor-Polypeptid, welches spezifisch an ein Antigen auf der Oberfläche oder im Cytoplasma einer Tumorzelle, oder freigesetzt von der Zelle, bindet, verabreicht wird, indem es dem Hybrid-Polypeptid erlaubt wird, den Tumor zu erreichen und daran zu binden, und indem dem Patienten eine Menge des erfindungsgemäßen Anti-Idiotyp-Polypeptids verabreicht wird, die wirksam ist, übriges oder ungebundenes zirkulierendes Hybrid-Analog-Peptid zu binden um dabei die Ausscheidung des Hybrid-Polypeptids zu beschleunigen.
Nachdem nun diese Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird diese durch Verweis auf bestimmte spezifische Beispiele besser verständlich, welche hierin lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung enthalten sind und nicht um die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform davon zu beschränken, solange es nicht so angegeben ist.
BEISPIELE
Beispiel 1: Verwendete Methoden
Die hierin verwendeten Verfahren für die reverse Transkription (RT) von RNAs, die für die variablen Regionen codieren, und die nachfolgende Amplifikation der cDNAs durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden bereits beschrieben (Orlandi, R., et al., "Cloning Immunoglobulin Variable Domains for Expression by the Polymerase Chain Reaction", PNAS (USA) 86: 3833–3837 (1989); Coloma, M. J., et al., "Primer Design for the Cloning of Immunoglobulin Heavy-Chain Leader-Fvs from Murine Hybridoma Cells Using the PCR", Bio.Techniques 11: 152–156 (1991); Gavilondo-Cowley, J. V., et al., "Specific Amplification of Rearranged Immunoglobulin Fv Genes from Murine Hybridoma Cells", Hybridoma 9: 407–417 (1990)).
Gesamt-RNA ist ein geeignetes Substrat für RT-PCR. Hierin wurde jedoch polyadenylierte RNA verwendet, weil sie nur geringe Spiegel an kontaminierender ribosomaler RNA und praktisch keine DNA enthält. Die polyadenylierte RNA wurde mit einem "Fast Track"-mRNA-Isolations-Kit isoliert (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Die Oligonucleotide wurden in einem "PCR-Mate EP DNA synthesizer", Modell 391 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Ein Maus-PCR-Ig-Primer-Set wurde von Novagen (Madison, WI) bezogen, und komplementäre DNA (cDNA) wurde mit einem RNA-PCR-Kit (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT) präpariert.
PCR-DNA-Fragmente wurden direkt in pCR1000 cloniert, und zwar unter Verwendung eines TA-Clonierungs-Kits (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Plasmid-DNA wurde mit einem Kit isoliert, der von Qiagen (Tchapsworth, CA) bezogen wurde, und DNA-Sequenzierung, wurde mit einem Sequenaee 2.0 DNA-Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) unter Verwendung von wässrigem 5'α-³⁵SdATP mit 600 mCi/mmol (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) durchgeführt.
Sequenzanalysen wurden auf einem Macintosh-Computer unter Verwendung des Programms GeneWorks (IntelliGenetics, Inc., Mountain View, CA) durchgeführt.
Beispiel 2: Gewebekulturmedien
SP2/0-Ag14-Zellen (Shulman, M., et al. (1978), s. unten) wurden entweder in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (ME): fötales Kälberserum (FBS), 90 : 10 (Vol/Vol), oder in einem Gemisch von DME : RPMI : FBS, 45 : 45 : 10 (Vol/Vol/Vol) oder RPMI : FBS, 90 : 10 (Vol/Vol) kultiviert. Es wurden Penicillin und Streptomycin hinzugefügt um Bakterien-wachstum zu verhindern. Wenn Serum-freies Medium verwendet wurde, enthielt es ein HL-1-Supplement, wie vom Hersteller vorgegeben (Ventrex Labs., Portland, ME). Das Gefrier-Medium war 10% DMSO in Rinderserum.
Beispiel 3: PCR-Primar
Primer und Primarmischungen MulgKV_L5'-C, MulgλV_L3'-1, MulgV_H5'-C, MulgV_H5'-F und MulgλV_H3'-2 waren Teil eines Primer-Sets, das von Novagen bezogen wurde. Deren Sequenzen kann man von Novagen erhalten. Andere Primar wurden von den Erfindern synthetisiert. Diese Sequenzen sind in Tabelle 12 unten gezeigt.
Tabelle 12: Synthetische Primer
Beispiel 4: Clonierung chimärer BrE-3-Antikörper-Polydesoxyribonucleotide
Es wurden hierin zwei Expressionsvektoren pAG4622 und pAH4604 verwendet (Coloma, M. J., et al., "Novel Vectors for the Expression of Antibody Molecules Using Variable Regions Generated by PCR", J. Immunol. Methods 152: 89–104 (1992)). Diese wurden freundlicherweise von S. L. Morrison zur Verfügung gestellt (Abteilung für Mikrobiologie und molekulare Genetik, UCLA). Die Konstruktion und Expression chimärer Gene wurde wie von Coloma et al. beschrieben durchgeführt (Coloma, M. J., et al. (1992), s. oben).
E s wurden Oligonucleotide synthetisiert und in einem PCR-Gemisch verwendet um variable schwere (V_H) und variable leichte (V_L) Fragmente mit den korrekten Enden für die Insertion in die pAG4622- und pAH4604-Expressionsvektoren herzustellen. Diese Sequenzen sind in Tabelle 13 unten gezeigt.
Tabelle 13: Synthetisierte Oligonucleotide
Die originalen pCR1000-Clone wurden als Start-Matrizen für die PCR verwendet. Die neuen PCR-Produkte wurden in pCR1000 zurückcloniert und deren Sequenz bestätigt. Korrekt modifizierte und amplifizierte Fragmente wurden entweder mit EcoR V und Sal I (für V_L) , oder mit EcoR V und Nhe I (für V_H) ausgeschnitten. Diese Fragmente wurden dann in die jeweiligen Vektoren ligiert, welche mit den geeigneten Restriktiönsenzymen offen geschnitten wurden. Sowohl Vektoren, als auch die Inserts wurden vor der Ligation aus Agarosegel gereinigt, und zwar unter Verwendung des Bio101-GeneClean-Kits (Glaskügelchen) (La Jolla, CA).
Beispiel 5: Expression von chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörpern
Die V_H- und V_L-Regionen im fertigen chimären Maus-Mensch-Antikörper wurden noch einmal sequenziert um zu verifizieren, dass deren Sequenzen korrekt waren.
Die nicht-produzierende Myelom-Zelllinie SP2/0-Agl4, (ATCC: CRL 1581, Shulman, M., et al., "A Better Cell Line for Making Hybridomas Secreting Specific Antibodies", Nature 276: 269–270, (1978)) wurde transfiziert, und wie von Coloma, M. J., et al. (1992) beschrieben, wurden chimäre Antikörper isoliert, und zwar mit den folgenden Modifikationen. Die Selektion wurde lediglich im Hinblick auf die Aufnahme von hisD vorgenommen, und zwar durch Zugabe von 5 mM Histidinol zum Medium und Wiederherstellen des pH auf 7,4 mit NaOH.
Beispiel 6: Herstellung transfizierter Wirte
Nach zehn Tagen wurden eindeutig stabile, transfizierte Kolonien mit einer Häufigkeit von ungefähr 10^–5 etabliert. Die Kolonien wurden in Normal-Medium (ohne Histidinol) transferriert, und die Überstände von stabilen Transfektanden wurden auf Anwesenheit des chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörpers untersucht. Dies erfolgte durch Einfangen der sezernierten chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper mit einem Ziege-anti-Mensch-κ-Antikörper, der an eine Platte gebunden war, und durch Entwickeln mit Ziege-anti-Mensch-γ-Antikörper, wie von Coloma et al. beschrieben, und zwar mit den folgenden Modifikationen. Der sekundäre Antikörper, der hierin verwendet wurde, war mit ¹²⁵I radioaktiv markiert.
Beispiel 7: Bestätigung der Expression von chimärem Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper
Die Überstände wurden im Hinblick auf die Bindung von humanem Milchfettkügelchen (HMFG) hin untersucht, wie von Ceriani et al. beschrieben (Ceriani R. L., et al., "Diagnostic Ability of Different Human Milk Fat Globule Antigens in Breast Cancer", Breast Cancer Res. Treat. 15: 161-174 (1990)). HMFG wurde, wie zuvor beschrieben, an die Mikrotiterplatten gebunden (Ceriani R. L., "Solid Phase Identification and Molecular Weight Determination of Cell Membrane Antigens with Monoclonal Antibodies", in: Monoclonal antibodies and functional cell lines. Progress and application, Bechtol, K..B., McKern, T. J., und Kennett, R., Hrsg., Plenum Press, New York, S. 398–402 (1984)).
Die meisten Kolonieüberstände waren in beiden Assays positiv. Die Kolonien, die die höchsten Spiegel an chimären Antikörpern in die Überstände sezernierten, wie durch diese Assays bestimmt, wurden subcloniert und anschließend zur Aufreinigung von Antikörper an Serum-freies Medium angepasst.
Beispiel 8: Bestimmung von Affinitätskonstanten
Die Antikörper-Antigen-Affinitätskonstanten für den chimären Maus-Mensch-Antikörper gegen humanes Milch-Mucin und den gesamten Maus-Antikörper wurden bestimmt, indem der Kehrwert der Konzentration, die mit unmarkiertem monoclonalen Antikörper kompetitierte, was zu 50% Bindung führte, genommen wurde, wie beschrieben von Sheldon et al. (Sheldon, K., et al., "Characterization of Binding of Four Monoclonal Antibodies to the Human Ovarian Adenocarcinoma Cell Line HEY", Biochem. Cell Biol., 65: 423–428, (1987)). Das Protokoll für den Assay war das folgende.
Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Lagen von methyliertem BSA, Glutaraldehyd, Anti-β-galactosidase und dem bakteriellen Fusionsprotein 11–2 (einem Hybrid aus β-Galactosidase und humanem Milchdrüsen-Mucin) präpariert, wie beschrieben in Ceriani et al. (Ceriani, R. L., et al., "A Novel Serum Assay for Breast Cancer Epithelial Antigen Using a Fusion Protein", Anal. Biochem. 201: 178–184 (1992)). Jede Vertiefung enthielt 388 ng des 11–2-Fusionsproteins. Zu jeder Vertiefung wurden 25 μl ¹²⁵I-BrE-3 (ATCC No. HB 10028) in RIA-Puffer (10% Kälberserum, 0,3% Triton X-100, 0,05% Natriumazid pH 7,4, in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung) gegeben, und entweder mit 25 μl unmarkiertem Maus-Antikörper oder chimärem Maus-Mensch-Antikörper in RIA-Puffer mit Endkonzentrationen im nanomolaren Bereich kompetitiert.
Iodierungen wurden mit ¹²⁵I (17 Ci/mg, Nordion International Inc., Kanata, Ontario, Canada) durchgeführt. 50 Mikrogramm monoclonaler Antikörper BrE-3 (Coulter, Hialeah, FL) wurden mit einer spezifischen Aktivität von 9,56 mCi/mg unter Verwendung der Chloramin-T-Methode, wie beschrieben von Ceriani, R. L., und Blank, E. W., (Ceriani, R. L., und Blank, E. W., "Experimental Therapy of Human Breast Tumors with 131 I-Labeled Monoclonal Antibodies Prepared Against the Human Milk Fat Globule", Cancer Res. 48: 4664–4672 (1988)) markiert. Wenn die Counts von gebundenem, radioaktiv markierten Maus-anti-BrE-3-Antikörper auf die Y-Achse aufgetragen wurden und der Logarithmus der nanomolaren (nM) Konzentration des kompetitierenden, unmarkierten Mausanti-BrE-3-Antikörpers oder chimären Maus-Mensch-Antikörpers auf die X-Achse aufgetragen wurden, überlappten beide Kurven innerhalb eines Fehlers von 5% (Figur nicht gezeigt). Dies beweist, dass die Affinitäts-Eigenschaften der variablen Region bewahrt wurden.
Beispiel 9: Affinitäts-Bindungskonstanten für Maus-BrE-3- und chimäre Maus-Mensch-Antikörper
Der gereinigte chimäre Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper und der gereinigte Maus-BrE-3-Antikörper ergaben ähnliche Kompetitions-Kurven, wenn gegen die Bindung von ¹²²I-markiertem Maus-BrE-3 an sein Antigen getestet wurde. Die Affinitäts-Bindungskonstanten des Maus-Antikörpers und des chimären Maus-Mensch-Antikörpers wurden in unabhängigen Kompetitions-Assays bestimmt, wie in Beispiel 8 oben beschrieben. Die Werte der Konstanten sind 2, 68 × 10⁸ M^–1 und 3, 75 × 10⁸ M^–1 für die chimären Hybrid-BrE-3-Polypeptide beziehungsweise für den Maus-BrE-3-Antikörper. Diese Werte sind mit einem 95% Konfidenzintervall nicht zu unterscheiden.
Beispiel 10: Amplifikation von cDNAs, die für variable Regionen des BrE-3-Antikörpers codieren
Die cDNAs, die für die variablen Domänen (V_H und V_L) des Maus-anti-BrE-3-Immunglobulins codieren, wurden durch reverse Transkription und PCR-Amplifikation (RT-PCR) aus polyadenylierter RNA, die aus 10⁸ BrE-3-Hybridomzellen mit tels des folgenden Verfahrens isoliert wurden, präpariert. Die JO2, JO3, JO4, JO14 und V_H1BACK-Primer wurden synthetisiert, und ihre Sequenzen sind in Beispiel 3 oben gezeigt. Andere Primer wurden von Novagen bezogen. Mit der Ausnahme von V_H1BACK, welcher ein Gerüst-spezifischer Primer ist, sind alle Primer für den codierenden Strang spezifisch für die Leitpeptid-Region. Alle Primer für den nichtcodierenden Strang sind spezifisch für die konstanten Regionen. Die degenerierte λ-Kette des spezifischen Primers Mu1gλV_L3'-1 (von Novagen) wurde aufgrund der Ähnlichkeit von λ und K verwendet um die κ-Ketten-cDNA-Clone zu isolieren. Ein identischer κ-Ketten-Clou wurde mit dem Primer JO2, welcher spezifisch für die konstante Domäne der κ-Kette ist, isoliert. Die cDNA der V_H-Region konnte nicht mit den verfügbaren Leitpeptid-Primern isoliert werden. Daher wurde der V_HIBACK-Primer verwendet, welcher zu der V_H-cDNA γ72 führte. Der Leitpeptid-Primen JO14 wurde daraufhin entworfen, indem von der Gerüst-Sequenz von γ72 unter Verwendung von katalogisierten Nucleotid-Sequenzen extrapoliert wurde (Kabat, E. A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U. S. Dept. Health and Human Services, NIH-Publikation No. 91–3242, 5. Auflage (1991)). Nach aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen führte dieser neue Primen zur vollständigen V_H-Gerüst-cDNA. Diese Informationen sind unten in Tabelle 14 zusammengefasst.
Tabelle 14: Primen-Kombinationen für die PCR-Amplifikation
Beispiel 11: Isolierung amplifizierter BrE-3-V_L- und V_s-cDNA und -Sequenzen
Die PCR-Produkte wurden ohne vorherige Reinigung in pCR1000 (Invitrogen) cloniert und in beide Richtungen sequenziert. Die Clone 152, 164, 1012 und 1043 wurden unabhängig voneinander während unterschiedlicher RT-PCR-Durchgänge isoliert. Es stellte sich heraus, dass die Sequenzen von den V_L-Clonen 152 und 164 identisch waren, wie auch die Sequenzen der V_H-Clone 1012 und 1043. Die V_H- und V_L-DNA-Sequenzen und deren abgeleitete Protein-Sequenzen sind in den Tabellen 15 und 16 unten gezeigt.
Tabelle 15: BrE-3-V_L-Nucleotid- und abgeleitete Protein-Sequenzen
Tabelle 16: BrE-3-V_s-Nucleotid- und abgeleitete Protein-Sequenzen
Die Sequenzen wurden wie von Kabat et al. (1991) beschrieben interpretiert. Die Reste, die in Kleinbuchstaben gezeigt sind, entsprechen PCR-Primern. Die reifen Ketten beginnen bei D1 (V_L) beziehungsweise E1 (V_H). Die Aminosäuren, die unterstrichen sind, sind jene, die den CDRs entsprechen. Die unterstrichenen Nucleotide zeigen Verknüpfungs-Segmente an.
Die Gerüst- und CDR-Polypeptid-Segmente wurden entsprechend Kabat et al. (1991, s. oben) identifiziert. V_L ist eine Gruppe IIκ-Kette. Ein Teil der CDR3 und die gesamte Gerüst-Region 4 (FR4) werden von J_kl, codiert. V_H gehört zur Gruppe IIIc . CDR3 und FR4 werden von J_H3 codiert . Wenig oder gar nichts bleibt von einem nicht-identifizierten D-Minigen übrig. Daher ist der CDR3 lediglich 4 Aminosäuren lang.
Beispiel 12: Vergleich von der von cDNA abgeleiteten Aminosäure-Sequenz mit direkt bestimmter N-terminaler Fragment-Sequenz
Tabelle 17 unten zeigt einen Vergleich zwischen der cDNA-0 abgeleiteten Polypeptid-Sequenz und der Polypeptid-Sequenz, die direkt von monoclonalem, gereinigten Maus-BrE-3-Antikörper bestimmt wurde.
Tabelle 17: Vergleich von einer von cDNA-abgeleiteten Protein-Sequenz mit direkt bestimmter N-terminaler Prote in-Sequenz
Der Maus-BrE-3-Antikörper wurde mit 5%igem Mercaptoethanol reduziert, auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und elektrisch auf eine ProBlott-Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) geblottet. Die Aminosäure-Sequenzierung wurde direkt auf den immobilisierten Banden durch die Biotechnologie-Instrumentierungs-Einrichtung, University of California, Riverside, durchgeführt. Die hier angegebene Protein-Sequenz ist der beste Vorschlag des Sequenzierers.
Nachdem die cDNAs der variablen Region erst einmal cloniert waren, wurde bestätigt, dass sie tatsächlich die variablen Regionen des Maus-BrE-3-Antikörpers und nicht jene eines anderen Antikörpers codieren, indem die cDNA-abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen der variablen Region des clonierten Maus-BrE-3-Antikörpers mit der N-terminalen Sequenz des gereinigten Maus-anti-BrE-3-Antikörpers, die direkt durch einen einzelnen Lauf der Protein-Sequenzierung bestimmt wurde, verglichen wurden. Durch Vergleich mit zwei unabhängig voneinander revers transkribierten Clonen wurde gezeigt, dass die cDNA-Sequenzen stimmen.
Die grundsätzliche Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten und den bestimmten Aminosäure-Sequenzen zeigt, dass die clonierten cDNAs Polypeptide derselben Klasse und Subklasse codieren wie die variablen Regionen des Maus-BrE-3-Antikörpers. Dies deutet darauf hin, dass die cDNAs autentisch variable Regionen codieren. Die Autentizität des Polypeptids der variablen Region, und daher die des chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörpers, ist mit der Vorgabe, dass die variablen Regionen und die Affinitätskonstanten des chimären Antikörpers nicht von jenen des Maus-BrE-3-Antikörpers zu unterscheiden sind, unzweifelhaft.
Beispiel 13: Konstruktion von chimären Maus-Mensch-Antikörper-Genen
Die verwendeten Vektoren wurden von Coloma et al. (Coloma, M. J., et al. (1992), s. oben) entwickelt und wurden freundlicherweise von S. L. Morrison (Abteilung für Mikrobiologie und molekulare Genetik, UCLA) zur Verfügung gestellt. Beide Vektoren wurden von pSV2 (Mulligan, R. C., und Berg, P., "Expression of a Bacterial Gene in Mammalian Cells", Science 209: 1422–1427 (1980)) abgeleitet und enthalten genomische Fragmente, die entweder die konstanten Domänen der schweren Kette oder die der leichten Kette codieren. Die Vektoren nehmen cDNAs auf, die die F_v-Regionen codieren. Um die F_v-cDNAs in die Vektoren zu ligieren, wurden Restriktions-Enden in einem Satz von PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primer JO16, JO17, JO18 und JO19 an die cDNAs angefügt.
Der Vektor mit der leichten Kette pAG4622 enthält das Gen für die humane konstante Region der κ-Kette, einschließlich des J-C-Introns. Er codiert Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase oder gpt (Mulligan, R. C., und Berg, P., "Selection for Animal Cells that Express the Escherichia Coli Gene Coding for Santhin-Guanine Phosphoribosyltransferase", PNAS (USA) 78: 2072–2076 (1981)) als dominant-selektierbare Marker. Er nimmt die Maus-VL-cDNA zwischen der Ribosomen-Bindestelle (Kozak, M., "Compilation and Analysis of Sequences Upstream from the Translational Start Site in Eukaryotic mRNAs", Nucleic Acids Res. 12: 857–872 (1984)), welcher dem VH-Promotor vom monoclonalen Anti-Dansyl-Maus-Antikörper 27.44 vorangeht (Coloma, M. J., (1992), s. oben), und dem J-C-Intron. Das J-C-Intron enthält den κ-Ketten-Enhancer (Potter, H., et al., "Enhancer-Dependent Expression of Human κ Immunoglobulin Genes Introduced into Murine Prep-B Lymphocytes by Elektroporation", PNAS (USA) 81: 7161–7165 (1984); Emorine, L., et al., "A Conserved Sequence in the Immunoglobulin J Kappa-C Kappa Intron: Possible Enhancer Element", Nature 304 : 447-449 (1983)).
Der Vektor mit der schweren Kette pAH4604 enthält das Gen für die konstante Region der schweren Kette γl, aber kein J-C-Intron. Er codiert für Histidinol-Dehydrogenase oder hisD (Hartmann, S. C. und Mulligan, R. C. Two Dominant-Acting Selectable Markers for Gene Transfer Studies in Mammalian Cells", PNAS (USA) 85: 8047–8051 (1988)) als dominant-selektierbare Marker. Er nimmt die Maus-V_H-cDNA zwischen der Dansyl-Promotor-Ribosomen-Bindestelle und dem konstanten γl-Gen auf. Der Vektor enthält auch ein Insert, das den Enhancer für die schwere Kette codiert (Rabbitts, T. H., et al., "Transcription Enhancer Identified Near the Human C mu Immunoglobulin Heavy Chain Gene is Unavailable to the Translocated c-myc Gene in a Burkitt Lymphoma", Nature 306: 806–809 (1983)).
Die neuen V_H- und V_L-DNA-Fragmente mit geeigneten Restriktionsenden wurden in pAH4604 und pAG4622, wie oben in Beispiel 4 beschrieben, integriert. Die Vektoren wurden dann durch Elektroporation (zusammen) in 5P2/0-Ag14-Myelomzellen eingeführt, wie von Coloma et al. (1992, s. oben) beschrieben.
Beispiel 14: Charakterisierung von chimärem Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper
Die Überstände von stabilen Transfektanden wurden auf Anwesenheit des chimären Maus-Mensch-Antikörpers hin untersucht, wie in Beispielen 6 und 7 oben beschrieben. Stark produzierende Transfektanden wurden subcloniert und anschließend an das Wachstum auf Serum-freiem Medium angepasst. Die chimären Maus-Mensch-Antikörper, die von der Myelom-Zelllinie produziert wurden, wurden dann aus dem Kulturüberstand unter Verwendung einer Sepharose 4B-Protein A-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt, wie beschrieben in Ey, P. L., et al. (Ey, P. L., et al., "Isolation of Pure Igel, IgG2a und IgG2b Immunoglobulins from Murine Serum Using Protein A-Sepharose", Immunochemistry 15: 429–436 (1978)). Disulfit-Bindungen von Antikörpern wurden reduziert um die leichten und schweren Ketten zu trennen, und zwar durch Erhitzen für 10 Minuten bei 65° in Laemmli-Auftragspuffer, der 5% beta-Mercaptoethanol enthielt. Die getrennten Ketten wurden dann auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (10%) einer Chromatographie unterzogen. Die reduzierten chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper und Maus-Antikörper wurden in getrennten Spuren neben 97,4, 66,2, 45,0, 31,0 und 2,5 kD Protein-Markern der Elektrophorese unterzogen. Tabelle 18 unten zeigt die apparenten Molekulargewichte der zwei Banden, die für beide erhalten wurden.
Tabelle 18: Apparente Molekulargewichte von leichten und schweren Ketten von Maus- und chimären BrE-3-Antikörpern
Die schweren und leichten Ketten des chimären Anti-BrE-3-Antikörpers trennen sich wie erwartet, wenn sie auf einem Polyacrylamid-Gel der Elektrophorese unterzogen werden.
Beispiel 15: Gewebe-Bindungsstudien mit chimärem BrE-3-Antikörper
Mit dem chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper wurden unter Verwendung der Immunperoxidase-Technik immunhistochemische Färbungen von aufeinanderfolgenden Gewebsschnitten von humanem Brust-Carcinom durchgeführt. Eine Kontrolle wurde nur mit dem sekundären Anti-Mensch-Antikörper durchgeführt. Positive Färbung resultierte aus der Verwendung des chimären Maus-Mensch-BrE-3-Antikörpers, gefolgt von der spezifischen Bindung durch Anti-Mensch-Antikörper. (Bilder nicht gezeigt).
Die Brust-Carcinom-Gewebeschnitte wurden mit dem Überstand der transfizierten Zellen unter Verwendung der Vectastain-ABC-Methode gefärbt (Vector Labs, Burlingame, CA). Das Gewebe, das nur mit dem sekundären Ziege-anti-Mensch-Ig-Antikörper gefärbt wurde, zeigt Hintergrund- oder nichtspezifische Färbung nekrotischer Bereiche der Gewebsschnitte.
Das Gewebe, das mit chimärem Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper, gefolgt von dem sekundären Antikörper, gefärbt wurde, zeigt spezifische Färbung der Brust-Carcinom-Zellen in den Brustgewebe-Schnitten.
Beispiel 16: In vivo-Bild-Diagnostik-Studien mit chimärem HrE-3-Antikörper
Es wurde gezeigt, dass der monoclonale Maus-anti-BrE-3-Antikörper für in vivo-Bild-Diagnostik und für die Radioimmuntherapie von Brustkrebs hocheffektiv war. Z. B. waren in einer pharmakokinetischen Studie mit 15 Brustkrebs-Patienten, die mit einem "'In-MXDTPA-BrE-3-Radioimmunkonjugat (Anti-BrE-3-Antikörper) durchgeführt wurden, die Serum-Spiegel in den meisten Patienten niedrig, die Blut-Ausscheidung korrelierte mit dem zirkulierenden Antigen und die in vivo-Bild-Diagnostik-Ergebnisse zeigten, dass ungefähr 86% aller Stellen dargestellt werden konnten (Liebes, L., et al., "Pharmacokinetics of ¹¹¹In-BrE-3 Monoc-lonal Antibody in Patients with Breast Carcinoma", Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 33: 216 (Abs No. 1292) (1992)). Ein ⁵⁰Y-BrE-3-Radioimmunkonjugat mit ähnlichen pharmakokinetischen Eigenschaften und mit Extrapolieren der "'In-BrE-3-Dosimetrie-Ergebnisse bietet ebenfalls ein hervorragendes therapeutisches Agens.
Wie mit vielen anderen monoclonalen Antikörpern, sind jedoch die klinischen Anwendungen des Maus-anti-BrE-3-Antikörpers, eines vollständigen Maus-Antikörpers, durch die RAMA-Reaktion begrenzt. Ein chimärer monoclonaler Antikörper sollte eine begrenztere HAMA-Reaktion ergeben.
Beispiel 17: Immunogenität des chimären BrE-3-Antikörpers
Die Maus-Polypeptide der BrE-3-variablen Region wurden ohne die konstanten Regionen cloniert um weniger immunogene Polypeptide als die ursprünglichen Maus-Antikörper zu produzieren. Es wurde außerdem hierin gezeigt, dass der chi märe Maus-Mensch-BrE-3-Antikörper, dem die ursprüngliche konstante Region der Maus fehlt, seine Antigen-Bindungseigenschaften bewahrt.
Eine variable Region eines BrE-3-Antikörpers alleine oder als ein chimärer Maus-Mensch-Antikörper, der ebenfalls eine konstante humane Region oder dessen Fragment enthält, wäre für Menschen signifikant weniger immunogen als der ursprüngliche Maus-Antikörper. Von dem Hybrid-Polypeptid, das die variable Region des BrE-3-Antikörpers und die konstante Region eines humanen Antikörpers umfasst, wurde gezeigt, dass es die ursprüngliche Bindungsaffinität des Maus-Antikörpers bewahrt. Bei diesem Hybrid-Polypeptid wurden ungefähr 2/3 der zusammenhängenden nicht-humanen immunogenen Ziel-Stellen (C_L- und C_H-Regionen) vollständig durch humane konstante Domänen ersetzt.
Beispiel 18: PCR-Primer, die bei der ersten Isolierung von Anti-KC-4-cDNAs verwendet wurden
Die PCR-Primer wurden von Novagen (Madison, WI) bezogen. Ihre Sequenzen, die aus der von Novagen bereitgestellten Broschüre wiedergegeben werden, sind in Tabelle 19 unten gezeigt.
Tabelle 19: PCR-Primer-Sequenzen
Beispiel 19: Clonierung von chimären Maus-Mensch-anti-KC-4-Antikörper-Ribonucleotid
Die zwei Expressionsvektoren pAG4622 und pAH4604, die in Beispiel 4 beschrieben wurden, wurden verwendet. Oligonucleotide, die synthetisiert und in einer PCR zur Herstellung von V_H- und V_L-Fragmenten mit den korrekten Enden für die Insertion in die pAG4622- und pAH4604-Expressionsvektoren verwendet wurden, sind in Tabelle 20 unten gezeigt.
Tabelle 20: PCR-Primer-Sequenzen
Die Original-PCR1000-Clone waren die Ausgangs-Matrizen für die PCR, und der Rest der Verfahren war wie in Beispiel 4 oben beschrieben.
Beispiel 20: Expression des chimären Anti-RC-4-Antikörper-Gens
Die V_H- und V_L-Regionen im chimären Maus-Mensch-anti-KC-4-Antikörper wurden noch einmal sequenziert um zu verifizieren, dass ihre Sequenzen korrekt waren. Die Transfektion der nicht-produzierenden Myelom-Zelllinie SP2/0-Ag14 (ATCC: CRL 1581), und die Isolierung von Polypeptid wurde wie oben in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 21: Produktion transfizierter Wirte
Nach 10 Tagen wurden eindeutig stabile transfizierte Kolonien mit einer Häufigkeit von ungefähr 1/10.000 etabliert. Die Kolonien wurden in Normal-Medium transferriert, und die Assays wurden wie in Beispiel 6 oben beschrieben durchgeführt.
Beispiel 22: Bestätigung der Expression von chimärem Maus-Mensch-anti-KC-4-Antikörper
Die Überstände wurden, wie zuvor in Beispiel 7 oben beschrieben, auf die Bindung an humanes Milchfettkügelchen (HMFG) und an das Brustepithel-Mucin (BEM) hin untersucht. HMFG und BEM wurden an die Mikrotiterplatten gebunden, wie zuvor von Ceriani, R. L., (1990, s. oben) beschrieben. In diesem Radio-Assay wurde der gebundene chimäre Anti-KC-4-Antikörper durch Anti-Human-gamma-Kette, die mit ¹²⁵I konjugiert war, detektiert. Die meisten Kolonieüberstände waren bei beiden Assays positiv. Die Kolonien, die die höchsten Spiegel an chimärem Antikörper in die Überstände sezernierten, wie dies mittels dieser Assays bestimmt wurde, wurden subcloniert.
Beispiel 23: Western Blot
75 μl des Kulturüberstandes wurden zu 20 μl 4 × Laemmli-Puffer und 5 μl β-Mercaptoethanol gegeben, und die Mischung wurde bei 65°C für 15 Minuten erhitzt um die Disulfit-Bindungen der Antikörper zu reduzieren und somit schwere von leichten Ketten zu trennen. 20 μl der behandelten Probe wurden in doppelter Ausfertigung in Spuren auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel zusammen mit anderen Antikörpern, die ähnlich behandelt wurden und die zu Vergleichszwecken aufgetragen wurden, der Chromatographie unterzogen. Vorgefärbte Größenmarker (BioRad, Richmond, CA) wurden ebenfalls aufgetragen.
Nach der Chromatographie wurden die Proteine elektrisch auf eine ProBlott-Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 90% 30 mM CAPS pH11, 10% Methanol, für 1 Stunde bei 25 V und bei 4°C geblottet. Die Membran wurde in 2 Teile geschnitten, die identische Antikörper-Proben enthielten. Die zwei Membranen wurden in 20% Kälberserum in PBS getaucht und langsam bei Raumtemperatur für 1 Stunde und 35 min geschüttelt. Zu einer Membran wurde ¹²⁵I-markierter Ziegen-Antikörper gegen die humane κ-Kette hinzugefügt, und ¹²⁵I-markierter Ziegen-Antikörper gegen die humane γ-Kette zu der anderen Membran hinzugefügt. Antikörper wurden mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 10 mCi/mg markiert, und zwar unter Verwendung der Chloramin T-Methode, wie von Ceriani, R. L., und Blank, E. W. (1988) beschrieben. Die markierten Antikörper wurden in RIA-Puffer auf 4.000 cpm/μl verdünnt.
Nach 3-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Blots zweimal für jeweils 10 min in TBS gewaschen, einmal in TBST (50 mM Tris pH7,5, 3 mM ETA 25 mM NaCl) für 10 min, und noch einmal in TBS für 10 min (TBS mit 0,05% Tween 20). Die Membranen wurden getrocknet und einem Kodak XAR-Film ausgesetzt.
Die Western Blot-Analyse von Kulturüberständen zeigte, dass drei Antikörperketten exprimiert wurden, die mit den drei Antikörperketten, die in dem Original-Maus-anti-KC-4-Antikörper gesehen wurden, übereinstimmten. Diese waren eine schwere Kette, die mit ¹²⁵I-markiertem Ziegen-Antikörper gegen die humane γ-Kette gefärbt wurde, und zwei leichte Ketten, die mit ¹²⁵I-markiertem Ziegen-Antikörper gegen die humane κ-Kette gefärbt wurden (Figur nicht gezeigt).
Die Behandlung des ursprünglichen Maus-anti-KC-4-Antikörpers mit N-Glykosidase-F (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) nach den Empfehlungen des Herstellers führte zu einer merklichen Abnahme in der Intensität der "oberen" leichten Kette und eine gleichlaufende Abnahme in der Intensität der unteren leichten Kette (Figur nicht gezeigt).
Die Erklärung für die Existenz einer leichten Extrakette ist, dass diese Kette glykosyliert ist. Drei Beweislinien belegen dies. Erstens, die Detektion einer Asparagingebundenen Glykosylierungsstelle in der Aminosäure-Sequenz der leichten Kette. Dies ist die Triade NIS (Asn-Ile-Ser) in Gerüst 3. Zweitens, die Abnahme der Intensität in der vermuteten glykosylierten Bande nach Behandlung mit N-Glykosidase F, während gleichzeitig die Intensität der nicht-glykosylierten Bande erhöht wurde. Letztlich werden zwei sich entsprechende Banden für leichte Ketten in der chimären Antikörper-Version beobachtet. Die leichte Extrakette in der chimären Version kann keine Kontaminante sein, da sie spezifisch durch den Ziegen-Antikörper gegen die humane κ-Kette gefärbt wurde. Es kann nur ein Produkt sein, das von pAG4622 exprimiert wird. Daher müssen beide leichten Ketten dieselbe V_L-Aminosäure-Sequenz besitzen und dieselbe humane konstante Region. Diese Beobachtungen zeigen, dass ungefähr die Hälfte der leichten Ketten von beiden Antikörpern, dem Maus-anti-KC-4- und dem chimären An tikörper, an der Asparagin-gebundenen Glykosylierungsstelle glykosyliert sind.
Beispiel 24: Amplifikation von cDNAs, die Anti-RC-4-Antikörper-F_v-Regionen codieren
Die cDNAs, die für Anti-KC-4-Maus-Immunglobulin V_H und V_L codieren, wurden wie in Beispiel 9 oben beschrieben aus polyadenylierter RNA, die aus 100 Millionen KC-4-Hybridomzellen isoliert wurden, präpariert. Alle Clone erhielt man aus unabhängigen PCRs. Die Sequenzen der Primer sind in Beispiel 19 und 20 oben angegeben. Alle Primer sind spezifisch entweder für die Leitpeptid-Region oder für die konstanten Regionen. Die hierin verwendeten Primer-Kombinationen sind unten in Tabelle 21 angezeigt.
Tabelle 21: Primer-Kombination für PCR-Amplifikationen
Beispiel 25: Isolierung von amplifizierter Anti-RC-4 F_VL (V_L) – und F_VM (V_M)-cDNA und Sequenzen
Die PCR-Produkte wurden ohne vorherige Aufreinigung in pCR1000 (Invitrogen) cloniert und in beide Richtungen sequenziert. Die V_H- und V_L-DNA-Sequenzen und die davon abgeleiteten Protein-Sequenzen sind in Tabellen 22 und 23 unten gezeigt.
Tabelle 22: V_L-Nucleotid-Sequenzen Anti-RC-4 V_L (kII-Jk2)
Tabelle 23: V_M-Nucleotid-Sequenzen Anti-RC-4 V_M (IIID-D9-JH)
Beispiel 26: Aminosäure-Sequenzen von F_v-Regionen von chimärem Anti-RC-4-Antikörper
Nachdem die cDNAs der F_v-Region von Anti-KC-4 cloniert und sequenziert waren, wurde ihre cDNA-abgeleitete Aminosäure-Sequenz mit der N-terminalen Sequenz, die direkt durch einen einzigen Durchlauf der Aminosäure-Sequenzierung von gereinigtem Anti-KC-4-Antikörper bestimmt wurde, verglichen. Es wurde gezeigt, dass die cDNA-Sequenzen stimmten, da sie in beiden Fällen für Clone, die von unabhängigen Reaktionen der reversen Transkription präpariert wurden, identisch waren. Dieses bestätigt, dass die clonierten cDNAs authentische Anti-KC-4-F_v-Regionen sind. Die Sequenzen sind in Tabelle 24 und 25 unten gezeigt.
Tabelle 24: V_L-Aminosäure-Sequenzen Anti-xC-4V_L(kII-Jk2)
Tabelle 25: V_M-Aminosäure-Sequenzen Anti-KC-4V_M(IIID-D9-JH3)
Die Sequenzen wurden wie von Kabat et al. (1991, s. oben) beschrieben interpretiert. Die Reste, die unterstrichen sind, entsprechen PCR-Primern. Die reifen V_L- und V_H-Ketten beginnen an Aminosäuren D beziehungsweise E von Gerüst-Region 1 (FR1).
Gerüst- und CDR-Protein-Segmente wurden entsprechend Kabat et al. (1991, s. oben) identifiziert. V_L ist eine Gruppe IIκ-Kette. Ein Teil der CDR 3 und die gesamte Gerüst-Region 4 (FR4) werden von Jk2 codiert. V_H gehört zur Gruppe IIId. CDR 3 und FR4 gehen aus einer genomischen Rekombination hervor, die die Minigene D9 und JH3 umfasst. Es gibt eine Asparagin-Glykosylierungsstelle in der leichten Kette in FR3. Die Stelle hat die Sequenz NIS (Asn Ile Ser)
Beispiel 27: Vergleich von cDNA-abgeleiteter Aminosäure-Sequenz mit direkt bestimmter N-terminaler Fragment-Sequenz
Es wurde ein Vergleich zwischen der cDNA-abgeleiteten Polypeptid-Sequenz und der Aminosäure-Sequenz, die direkt am monoclonalen, gereinigten Anti-KC-4-Antikörper bestimmt wurde, unternommen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 26 gezeigt.
Tabelle 26: Vergleich von cDNA-abgeleiteter mit direkt bestimmter N-terminaler Aminosäure-Sequenz
Eine Probe von chimärem Anti-KC-4-Antikörper (ungefähr 190 μg) wurden mit 5% beta-Mercaptoethanol reduziert (65°C für 15 min.) in drei Spuren auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und elektrisch auf eine ProBlott-Membran (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 90% 30 mM CAPS pH11, 10% Methanol, für 1 Stunde bei 25 V und bei 4°C geblottet. Die übertragenen Protein-Spezies wurden mit Commassie Brilliant Blue gefärbt. In jeder Spur waren 3 Banden zu sehen, von denen 2, wie für eine schwere und eine leichte Kette erwartet, wanderten. Die dritte Bande wanderte oberhalb der leichten Kette. Es wurde direkt auf den immobilisierten Banden von der Biotechnologie-Instrumentierungs-Einrichtung, University of California, Riverside, eine Aminosäure-Sequenzierung durchgeführt. Die hier angegebene Aminosäure-Sequenz ist der beste Vorschlag des Sequenzierers.
Beispiel 28: Konstruktion von chimären Maus-Mensch-anti-KC-4-Antikörper-Genen
Der verwendete Vektor wurde in Beispiel 1 oben beschrieben. Unter Verwendung von Primern JO20, 21, 22 und 24 wurden in einem Satz von PCR-Reaktionen den cDNAs Restriktionsenden angefügt.
Der Vektor mit der leichten Kette pAG4622 und der Vektor mit der schweren Kette pAH4604 wurden in Beispiel 12 oben beschrieben.
Die neuen V_H- und V_L-DNA-Fragmente mit geeigneten Restriktionsenden wurden in pAH4604 und pAG4622, wie in Beispiel 12 oben beschrieben, eingefügt. Die Vektoren wurden dann (zusammen) elektroporiert, wie in Beispiel 12 oben beschrieben.
Beispiel 29: Gewebe-Bindungsstudien
Die Überstände von stabilen Transfektanden wurden auf Anwesenheit des chimären Maus-Mensch-anti-KC-4-Antikörpers hin untersucht, wie in Beispiel 13 oben beschrieben. Der in den Überstand sezernierte Chimäre Antikörper band sehr stark an sowohl HMFG, als auch an BEM. Zusätzlich wurden die Überstände, die chimären Mensch-Maus-anti-KC-4-Antikörper enthielten, verwendet um Gewebsschnitte von humanem Brust-Carcinom zu färben, und zwar unter Verwendung der immunhistochemischen Immunperoxidase-Färbetechnik. Die Intensität der Färbung war mit der vergleichbar, die mit dem originalen monoclonalen Maus-Antikörper erhalten wurde. Man weiß von dem monoclonalen Anti-KC-4-Antikörper, dass er humanes Milchfettkügelchen und das Brustepithel-Mucin bindet. Diese Bindungsspezifität des monoclonalen Maus-anti-KC-4-Antikörpers wurde sogar nach dem rekombinanten Verfahren aufrechterhalten. Der chimäre Anti-KC-4-Antikörper konnte sehr stark an HMFG und BEM binden, wie mittels eines Radio-Assays bestimmt wurde (Ceriani, et al., Breast Cancer Res. Trent. 15 : 161 (1990)). Zusätzlich band der chimäre Anti-KC-4-Antikörper mehrere humane Brust-Tumore in histopathologischen Schnitten in einer Weise, die mit dem monoclonalen Maus-anti-KC-4-Antikörper vergleichbar ist; dies wurde durch Immunfärbung bestimmt, wie in Beispiel 15 oben beschrieben. Die Spezifität der Bindung zeigt die aufrechterhaltene Bindungsreaktivität der variablen Regionen von Maus-anti-KC-4-Antikörper durch das erfindungsgemäße Polypeptid, wenn es an humane F_c-Fragmente angehängt wird.
Beispiel 30: Materialien und Assays für die Epitop-Kartierung
Die spezifischen Details der Herstellung von Materialien, Zelllinien und der verwendeten Techniken wurden von Peterson et al. (Peterson, J. A., et al., "Molecular Analysis of Epitope Heterogeneity of the Breast Mucin", Breast Epithelial Antigens, Hrsg. Ceriani, R. L., Plenum Press, NY (1991)) offenbart, wobei hier auf den relevanten Text expressis verbis Bezug genommen wird.
Überlappende Peptid-Hexamere wurden auf den Enden von Polyethylen-Nadeln unter Verwendung eines Epitop-Scanning-Kits (Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, UK) synthetisiert, was auf einer Methode basiert, die ursprünglich von Geysen et al. (Geysen, H. L., et al., "Use of Peptide Synthesis to Probe Vital Antigens for Epitopes to a Resolution of a Single Amino Acid", PNAS (USA) 81: 3998- 4002 (1984)) beschrieben wurde. Die Polyethylen-Nadeln waren in einer 8 × 12-Konfiguration angeordnet, die in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen passt. Die Nadeln sind mit einem Alanin ausgerüstet, das an die Enden angehängt ist, an welches die Aminosäuren nacheinander unter Verwendung von aktivierten Pentafluorphenylestern von Fluorphenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-L-Aminosäuren angefügt werden. Jedes nachfolgende überlappende Hexamer unterscheidet sich von dem vorigen nur durch eine einzelne Aminosäure, und es wurden genügend synthetisiert um die gesamte Sequenz des zu testenden Peptids zu überspannen, so dass jede Hexamer-Kombination vorhanden war. Jeder monoclonale Antikörper wurde auf die Bindung an die synthetischen Peptide getestet, und zwar unter Verwendung einer ELISA-Methode mit Merrettich-Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG (Promega, Madison, WI) und Farbentwicklung mit 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (Sigma, St. Louis, MO).
Die Hexapeptide, die mit A, P, D und T beginnen, binden gut an die Antikörper (Hexamere 1 bis 3 und 20), während die Hexamere, die zwischen diesen Positionen beginnen, dies nicht taten. Die Hexamere, die präpariert wurden, sind in Tabelle 27 unten gezeigt. Die lineare Aminosäure-Sequenz, die für die Bindung an das Antigen essentiell ist, kann von dem Hexamer abgeleitet werden, das jeder monoclonale Antikörper bindet. Zum Beispiel erforderte der Anti-BrE-3-Antikörper die Sequenz CRP innerhalb des Hexamers. Andere monoclonale Antikörper erforderten andere Aminosäure-Sequenzen (z. B. Anti-McS, TRPAP; Anti-Mc1, DTR; Anti-BrE-1, DTRP). BrE-2 erforderte ebenfalls TRP, aber seine abweichende Spezifität für normales und Tumor-Gewebe deutet darauf hin, dass ein Epitop auf dem nativen Antigen sich von dem von BrE-3 unterscheidet.
Tabelle 27: Epitop-Kartierung der Peptid-Wiederholungssequenz von Brust-Mucin
Beispiel 31: Epitop-Kartierung
Fünf unterschiedliche monoclonale Antikörper (Mc1, Mc5, BrE1, BrE2 und BrE3) wurden unter Verwendung von HMFG zur Immunisierung präpariert. Alle identifizierten Epitope auf dem stark glykosylierten Brust-Mucin mit dem hohen Molekulargewicht. In der Immunhistochemie schienen sie unterschiedliche Epitope zu erkennen, da sie unterschiedliche Gewebs- und Tumor-Spezifitäten besaßen (Peterson, J. A., et al., "Biochemical and Histological Characterization of Antigens Preferentially Expressed on the Surface and Cytoplasm of Breast Carcinomas Cells Identified by Monoclonal Antibodies Against the Human Milk Fat Globule", Hybridoma 9: 221–235 (1990)). Jeder monoclonale Antikörper band an ein unterschiedliches Spektrum normaler Gewebe, und ihre Spezifitäten für unterschiedliche Carcinome unterschieden sich. Jedoch waren Anti-BrE-2 und Anti-BrE-3 recht ähnlich. Zusätzlich wurden durch Durchmusterung von λgtII Brust-cDNA-Expressionsbibliotheken mit einigen dieser monoclonalen Antikörper cDNA-Clone isoliert, die Fusi onsproteine produzierten, die alle von ihnen banden, während andere cDNA-Clone lediglich einige banden (Larroca, D., et al., "High Level Expression in E. Coli of an Alternate Reading Frame of pS2 mRNA that Encodes a Mimotope of Human Breast Epithelial Mucin Tandem Repeat", Hybridoma 11(2): 191–201 (1992)). Diese Bindung an die Fusionsproteine deutete darauf hin, dass die Epitope für diese fünf monoclonalen Antikörper den Polypeptid-Teil dieses Glykoproteins umfassten. Um dies zu bestätigen, wurde die Bindung dieser monoclonalen Antikörper an zwei synthetische Polypeptid-20-mere (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA und APPAHGVTSAPDTRPAPGST) getestet, welche die Konsensus-Sequenz der invertierten Sequenzwiederholung überspannten (Gendler, S. J., et al., "Cloning of Partial cDNA Encoding-Differentiation and tumor-Associated Mucin Glycoproteins Expressed by Human Mammary Epithelium", PNAS (USA) 84: 6060–6064 (1987); Siddiqui, J., et al. "Isolation and Sequencing of a cDNA Coding for the Human DF3 Breast Carcinoma-Associated Antigen", PNAS (USA) 85: 2320–2323 (1988)).
Eines startete am Beginn der publizierten 20 Aminosäure langen Sequenzwiederholung (Gendler, S. J., et al. (1987, s. oben)), und das andere startete in der Mitte. Alle fünf monoclonalen Antikörper haben beide synthetischen Peptide gebunden, genauso wie DF3, ein monoclonaler Antikörper gegen Brust-Carcinomzellen, der von anderen hergestellt wurde (Hull, S. R., et al., "Oligosaccharide Differences in the DF3 Sialomucin Antigen from Normal Human Milk and the BT-20 Human Breast Carcinoma Cell Line", Cancer Comm. 1: 261–267 (1989)). Drei andere monoclonale Antikörper gegen andere Komponenten von HMFG, die nicht mit dem Brust-Mucin kreuz-reagieren, Mc13, gegen ein 70 kDa-Glykoprotein, und Mc3 und Mc8, gegen ein 46 kDa-Glykoprotein, banden nicht an diese synthetischen Peptide (Daten nicht gezeigt) (Ceriani, R. L., et al., "Characterization of Cell Surface Antigens of Human Mammary Epitheli al Cells with Monoclonal Antibodies Prepared Against Human Milk Fat Globule", Somat. Cell Genet., 9: 415–427 (1982); Peterson, J. A., et al., "Biochemical and Histological Characterization of Antigens Preferentially Expressed on the Surface and Cytoplasm of Breast Carcinoma Cells Identified by Monoclonal Antibodies Against the Human Milk Fat Globule", Hybridoma 9: 221–235 (1990)).
Beispiel 32: Ansatz zur Humanisierung von Antikörpern
Der vorliegende Humanisierungsansatz basiert auf Padlan, E. A., "Choosing the Best Framework to Use in the Humanization of an Antibody by CDR Grafting: Suggestions from 3-D Structural Data", Antibody Engineering 2. jährliche Konferenz, San Diego, CA (16.-17. Dezember 1991).
Die genaue Spezifität kann in einem humanisierten Antikörper nur bewahrt werden, wenn die CDR-Strukturen, ihre Wechselwirkung miteinander und ihre Wechselwirkung mit dem Rest der variablen Domänen aufrecht erhalten werden kann (Padlan, E. A. (1991, s. oben)). Dies erfordert die Bewahrung von Resten der FR-Aminosäuren, welche mit den CDRs in Kontakt stehen, jener, die in den V_L-V_H-Kontakt involviert sind, und jener, welche verborgen sind und die Domänen-Gesamtstruktur und die Struktur der Kombinationsstelle beeinflussen könnten.
Durch Untersuchung von Maus-Fab-Strukturen, für welche Atomkoordinaten verfügbar sind, werden die Fr-Aminosäuren, die wahrscheinlich "wichtig" für die Aufrechterhaltung der Struktur der Kombinatinosstelle sind, bestimmt (Padlan, E. A., 8. Internationaler Kongress für Immunologie, Budapest, Ungarn, Abstracts S. 19 (2.-28. August 1992)).
Die Spezifität eines Antikörpers hängt von den CDR-Strukturen und manchmal auch von einigen der benachbarten Resten ab. Diese CDR-Strukturen hängen umgekehrt von Kon takten mit Gerüst-Aminosäuren und von der Wechselwirkung der V_L- und V_H-Domänen ab. Daher müssen, um die bewahrung der Bindungsaffinität sicherzustellen, nicht nur die CDR-Reste, sondern auch jene FR-Reste, die entweder mit den CDRs oder deren gegenüberliegenden Domänen in Kontakt stehen, sowie auch alle verborgenen Reste, welche den variablen Domänen ihre Form geben, bewahrt werden. Die verborgenen Aminosäuren liegen im humanen und in Maus-Gerüsten an exakt denselben Positionen (Padlan, E. A., "A Possible Procedure for Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology 28: 489–498 (1991)).
Dieser Ansatz wurde angewendet um erfindungsgemäße humanisierte Analoga der variablen Regionen der Maus-Antikörper zu konstruieren. Die Humanisierung oder Konstruktion der beispielhaften Analog-Peptide, die hierin dargeboten wird, wurde wie folgt vorgenommen. Die Identifizierung der Reste, welche höchstwahrscheinlich "wichtig" bei der Bewahrung der Struktur der Kombinationsstelle sind, erlaubt die Selektion der besten humanen FR-Sequenzen für die Verwendung in der "Humanisierung" von jedem chimären Antikörper bekannter Struktur oder von Analog-Peptiden dieser Erfindung. Das Ergebnis der Analyse kann auch verwendet werden um vorauszusagen, welche FR-Aminosäuren wahrscheinlich in jenen Fällen bewahrt werden sollten, bei denen keine dreidimensionalen Strukturdaten verfügbar sind.
Das vorliegende Verfahren wurde entworfen um die Immunogenität der xenogenischen Antikörper durch Präparation von deren chimären Derivaten oder deren Fragmenten zu reduzieren, während ihre Antigen-Bindungseigenschaften bewahrt werden. Im Allgemeinen werden die Antigen-Bindungseigenschaften eines Antikörpers in erster Linie von seinen CDRs bestimmt. Die CDRs des Maus-Antikörpers wurden hierin auf ein humanes Gerüst "aufgepflanzt". Zusätzlich können die FR-Aminosäuren in dem Antikörper, die als wahrschein lich wichtig bei der Aufrechterhaltung der Struktur der Kombinationsstelle beurteilt wurden, ebenfalls im humanisierten Molekül beibehalten werden.
Beispiel 33: Auswahl eines Maus-Modells bekannter Struktur für die Humanisierung des BrE-3-Antikörpers
Die Klassifikation der V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, wie des Anti-BrE-3-Antikörpers, wurde entsprechend Kabat, E. A., et al. (Kabat, E. A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (NIH (1991)) vorgenommen. Die kappa-Ketten-V_L-Domäne von Anti-BrE-3 gehört zur Gruppe II, und die V_H-Domäne gehört zur Gruppe IIIc. Dann wurde ein Maus-Antikörper gefunden, dessen Struktur bestimmt wurde, und dessen variable Regionen zu denselben Klassen gehören. Der oben in Tabelle 1 gezeigte Maus-anti-Fluorescyl-Antikörper 4-4-20 (Herron, J. N., et al., "Three Dimensiona 1 Structure of a Fluorescein-Fab Complex Crystallized in 2-Methyl-2,4-Pentanediol", Proteins, 5: 271–280 (1989)) erfüllt diese Erfordernisse, da er wie BrE-3 V_L- und V_H-Domänen besitzt, die zu den Gruppen II und IIIC gehören. Daher sollte die dreidimensionale Struktur von den Antikörpern BrE-3 und 4-4-20 ähnlich sein, und BrE-3 kann nach 4-4-20 modelliert werden.
Beispiel 34: Auswahl von humaner Ziel-Gerüst-Region für die Humanisierung des BrE-3-Antikörpers
Die Auswahl der humanen Ziel-Gerüst-Region basierte nicht auf der Ähnlichkeit der Aminosäure-Sequenz des gesamten Gerüsts, sondern strikt auf der Ähnlichkeit der Reste, die entsprechend dem 4-4-20-Modell für strukturell wichtig gehalten wurden. D. h., nur Aminosäuren, die in Kontakte mit CDR der gegenüberliegenden Kette involviert sein könnten, oder Aminosäuren, von deren Seitenketten vorhergesagt wurde, dass sie nach innen zeigen. Die Positionen dieser Aminosäuren sind in Tabellen 8 und 9 und auch in Tabellen 2, 3, 4, 5 und 6 oben gezeigt. Es sind dies die folgenden Positionen.
Für das Gerüst der variablen Region der leichten Kette: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 13, 19, 21, 23, 35, 36, 37, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 58, 60, 61, 62, 69, 71, 73, 75, 78, 82, 86, 88, 98, 102 und 104.
Für das Gerüst der variablen Region der schweren Kette: 4, 6, 12, 18, 20, 22, 24, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 68, 69, 71, 73, 76, 78, 80, 82c, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 103, 107, 109 und 111.
Das Zählsystem ist übereinstimmend akzeptiert (Kabat, et al. (1991), s. oben)) und ist in Tabellen 10 und 11 oben gezeigt. In diesem Fall wurden die Konsensus-Sequenzen von allen humanen F_v-Regionen als humanes Ziel-Gerüst ausgewählt um die Immunogenität des Produktes zu minimieren.
Als Erstes wurden die Sequenzen der variablen Maus-Ketten mit Konsensus-Sequenzen von allen bekannten humanen Klassen von variablen Regionen vergleichend angeordnet (Herron, J. N. (1989, s. oben)), und die Anzahl der Unterschiede in den Aminosäuren, die von der Maus-Sequenz bewahrt werden müssen, wurde gewichtet. Die Positionen dieser Aminosäuren wurden von jenen des monoclonalen Maus-Antikörpers 4-4-20 genommen, welcher ausgewählt wurde um den Anti-BrE-3-Antikörper zu modellieren, wie in Tabellen 28 und 29 unten gezeigt.
Tabelle 28: Auswahl von humanem BrE-3-V_L-Ziel-Gerüst
Tabelle 29: Auswahl von humanem BrE-3-V_a-Ziel-Gerüst
Basierend auf diesen Gewichtungen wurden die humanen Gerüst-Regionen, die zu Gruppen V_kII und V_HIII gehören, ausgewählt, damit sie die Anti-BrE-3-CDRs plus andere wichtige Aminosäuren erhalten.
Beispiel 35: Identifizierung von Maus-Human-Unterschieden von BrE-3
Die Original-Maus-Sequenzen (BrE-3 V_κ oder V_H) wurden mit ihren nächsten humanen Verwandten (humanes KII oder HIII), die nach dem Vergleich ihrer Sequenzen in Tabelle 28 oben ausgewählt wurden, vergleichend angeordnet. Die vergleichende Anordnung dieser zwei Sequenzen ist in Tabelle 30 unten gezeigt. Die Informationen in dieser Tabelle sind auch in Tabelle 28 oben enthalten, aber sie sind hier aus Gründen der Klarheit wiedergegeben. Die CDRs sind nicht gezeigt, da ihre Sequenzen während des Humanisierungs-Prozesses nicht verändert wurden. Daher zeigt Tabelle 30 die maximale Anzahl von Aminosäuren, die zur Humanisierung des Anti-BrE-3-Antikörpers verändert werden kann, basierend auf den humanen Konsensus-Sequenzen, die aus den derzeitigen Datenbanken ermittelt wurden (Kabat, E. A., et al. (1991, s. oben)). Wenn alle diese Positionen mit den entsprechenden humanen Aminosäuren ersetzt würden, erhielte man die entsprechenden CDR-verpflanzten variablen Antikörper-Regionen.
Tabelle 30: Entsprechende Aminosäure-Sequenzen von VK BrE-3 und humanem KII
Tabelle 31 und 32 unten enthalten dieselbe Information wie Tabelle 30 oben in einem anderen Format. Sie zeigen die Anzahl der Reste, die verändert werden müssten um das Original-Maus-Gerüst vollständig in ein humanes Konsensus-Gerüst zu verwandeln.
Tabelle 31: BrE-3 V_L Aminosäure-Kandidaten für die Veränderung in humane Konsensus-Sequenzen
Tabelle 32: BrE-3 V_H Aminosäure-Kandidaten für den Austausch in humane Konsensus-Sequenzen
Beispiel 36: Identifizierung von wichtigen Maus-BrE-3-Aminosäuren
Die "wichtigen" Maus-Aminosäuren, die bewahrt werden sollten, wurden, basierend auf den Kontakten der jeweiligen Aminosäure mit den CDRs, und mit den gegenüberliegenden Ketten und/oder danach, ob ihre Seitenketten nach innen oder nach außen zeigen, ausgewählt. Die Positionen dieser "wichtigen" Aminosäuren wurden, basierend auf der Untersuchung der bekannten Strukturen anderer Antikörper, be_stimmt. Diese Information ist in Tabelle 33 und 34 unten wiedergegeben.
Tabelle 33: Wichtige V_L-Aminosäure-Positionen, die zu bewahren sind
Tabelle 34: Wichtige V_M-Aminosäure-Positionen, die zu bewahren sind
Die meisten der "wichtigen" Aminosäuren wurden auf der Basis der Struktur von Antikörper 4-4-20 und entsprechend der Tabellen 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 oben ausgewählt. Zwei wichtige Aminosäuren von jeder Kette wurden jedoch, basie rend auf einer allgemeineren Struktur-Analyse, unter Verwendung von anderen Antikörper-Strukturen, ausgewählt. Dies wurde so gemacht um die Chancen der Konservierung der Liganden-Bindungseigenschaften zu maximieren. Insbesondere wurde die Beibehaltung des Leu an 89-H vorgeschlagen um die Aufrechterhaltung des V_L : V_H-Kontaktes sicherzustellen. Obwohl der Rest an 89-H üblicherweise nicht mit V_L in Kontakt steht und nur zum Teil verborgen ist, trägt er nichtsdestotrotz zur Grenzfläche bei. Ein Ersetzen des Leu durch Val an dieser Position könnte sehr wohl einen "Hohlraum" erzeugen, welcher den Kontakt beeinflussen könnte. i Ein Ersetzen des Leu durch Ile würde vermutlich in Ordnung sein, da diese Aminosäuren im Wesentlichen dasselbe Seitenkettenvolumen besitzen.
Schließlich wurde durch Vergleich der Position aller Aminosäuren, die Kandidaten für die Mutation sind, die in Tabellen 31 und 32 oben gezeigt sind, mit jenen, die "wichtig" sind und bewahrt werden sollten, die in Tabellen 33 und 34 gezeigt sind, die Endauswahl für die Aminosäure-Positionen für die tatsächlichen Mutationen getroffen. Keine "wichtige" Aminosäure-Position wurde von der Liste der Kandidaten gestrichen. Tabelle 35 unten zeigt die Aminosäuren, die für den Austausch von den Maus- zu den humanen Identitäten ausgewählt wurden um das vorliegende humanisierte Analogon zu erhalten.
Tabelle 35: Ausgewählte Aminosäuren für die Mutation
Beispiel 37: Einführung von Austauschen in der BrE-Aminosäure-Sequenz
Die Austausche wurden auf DNA-Ebene sequentiell vorgenommen. Alle bis auf eine der Codon-Mutationen wurden unter Verwendung von enzymatischer inverser PCR (EIPCR) vorgenommen, einer Mutagenese-Technik, die von Stemmer und Morris entwickelt wurde (Stemmer, W. P. C., und Morris, S. K., "Enzymatic Inverse Polymerase Chain Reaction: a Restriction Site Independent, Single Fragment Method for High Efficiency Site-Directed Mutagenesis", BioTechniques 13: 146-220 (1992)).
Zunächst wurde das gesamte Plasmid, das die Ziel-cDNA enthielt, durch inverse PCR unter Verwendung von endständigen mutagenen Oligonucleotiden amplifiziert. Als zweites wurde BsaI verwendet um die Enden der eingebauten Primer zu schneiden. Dieses Enzym schneidet an einer Stelle, die von seiner Erkennungsstelle getrennt liegt. Daher ist nach dem Verdau des offenen amplifizierten Plasmids mit BsaI die BsaI-Erkennungsstelle von den Enden der DNA entfernt. Die DNA bleibt mit komplementären, klebrigen Enden zurück und kann zu einem funktionellen Plasmid geschlossen werden, das die mutagenisierte Region enthält. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen der nicht-mutierten (Wildtyp-) variablen leichten und schweren Ketten des Anti-BrE-3-Antikörpers sind in Tabellen 15 und 16 oben gezeigt. Die Aminosäure-Sequenzen des Anti-BrE-3-Antikörper-Gerüstes und die Mutationen, die für die Humanisierung durchgeführt wurden, das Oligonucleotid, das für die Mutagenese verwendet wurde, und das Verfahren der Mutagenese sind in Tabellen 36 bis 44 unten gezeigt.
Tabelle 36: F_VL-FR1-Mutationsstellen
Tabelle 37: F_VL-FR2-Mutationsstellen
Tabelle 38: F_VL-FR3-Mutationsstellen
Tabelle 39: F_VL-FR4-Mutationsstellen
Tabelle 40: F_VM-FR1-Mutationsstellen
Tabelle 41: F_VM-FR2-Mutationsstellen
Tabelle 42: F_VM-FR3-Mutationsstellen
Tabelle 43: F_VM-FR4-Mutationsstellen
Tabelle 44: Sequenzen mutagener Oligonucleotide
Beispiel 38: Synthese von Primern
Alle Primer, mit Ausnahme von JO51 und JO52, wurden in einem PCR-Mate EP DNA-Synthesizer, Modell 391 (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Primer JO51 und JO52 wurden von Keystone Laboratories, Inc., Menlo Park, CA, bezogen. Sowohl die PCR-Methode, die mit JO51 und JO52 verwendet wurde, als auch die EIPCR-Methode, die mit allen anderen Primer-Sets verwendet wurde, ist unten beschrieben.
Plasmid-DNA-Matrize wurde mit einem Kit extrahiert, der von QIAGEN (Tchapsworth, CA) bezogen wurde, und auf 1 ng/μl in 10 mM TRIS 1 mM ETA pH7,5-8, verdünnt. Dieses Plasmid setzt sich aus dem Vektor pCR1000 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) zusammen, in welches die cDNA, die für die zu humanisierende variable Region codiert, insertiert wurde.
Ein Gemisch von PCR-Primern wurde hergestellt, wobei jeder Primer mit einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser vorlag.
Die PCR-Amplifikations-Bedingungen waren wie folgt. Alle Reagentien sowie das GeneAmp-PCR-System 9600, wurden von Perkin Elmer Cetus bezogen. Optimale PCR-Bedingungen wurden empirisch für jedes Paar mutagener Primer bestimmt. Eine Matrix von Bedingungen, die die Konzentration von MgCl₂, mutagenen Primern und Matrizen-Plasmid-DNA variiert, wurde erstellt. Die Anlagerungs- und Verlängerungs-Temperaturen während der PCR können variiert werden.
Plasmid-Matrize (500 pg/μl), 0,5 μM von jedem mutagenen Oligonucleotid, 1 mM MgCl₂, 10 mM TRIS pH 8,3, 50 mM KCl, 0,2 mM von jedem Nucleotid-Triphosphat (dGTP, dATP, TTP, DCTP) und Taq-Polymerase 1 Einheit/20 μl Reaktionsgemisch.
Beispiel 39: Heißstart-PCR
Alle Komponenten des PCR-Gemisches, mit Ausnahme der Taq-Polymerase, wurden in einem Volumen von 95 μl gemischt. Die Mischung wurde dann in 19 μl-Aliquots auf 5 PCR-Reaktionsgefässe verteilt. Der Grund zur Durchführung von fünf unabhängigen Reaktionen war der, die Wahrscheinlichkeit, dass ungewollte Mutationen als Ergebnis von Nucleotid-Fehleinbau während der PCR isoliert werden, zu vermindern. Die Reaktionsgefäße wurden für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf 72°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde 1 μl einer geeigneten Taq-Polymerase-Verdünnung in 10 mM TRIS, pH 8,3, 50 mM KCl, zu den Reaktionsgefässen hinzugegeben. Die Temperaturzyklen wurden dann wie folgt durchgeführt.
94°C, 3 min
[(94°C, 1 min) (50°C, 1 min) (72°C, 3,5 min)] 3 Zyklen
[(94°C, 1 min) (55°C, 1 min) (72°C, 3,5 min)] 25 Zyklen
72°C, 10 min
Beispiel 40: Extraverlängerung am Ende
Nach den Zyklen wurde der Inhalt der fünf Reaktionsgefäße vermischt und eine zusätzliche finale Verlängerungsreaktion durchgeführt. Es wurden zusätzliche Nucleotid-Triphosphate hinzugefügt (auf 125 μM), 5 Einheiten Taq-Polymerase wurden ebenfalls zugesetzt, und die Mischung wurde für 10 min auf 72°C erhitzt.
Beispiel 41: Reinigung von PCR-Produkten
Die PCR-Produkte wurden dann auf einem 0,8%igen Agarosegel in 1 × TAE-Puffer und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Die korrekte DNA-Bande wurde mit UV-Licht (366 nm) sichtbar gemacht, aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem GeneClean-Kit, der von Bio 101, La Jolla, CA, bezogen wurde, extrahiert.
Beispiel 42: Restriktionsverdau
Dann wurde die DNA mit BsaI für zwei Stunden bei 60 Grad Celsius in 25 μl (20,5 μl DNA, 2,5 μl 10 × Puffer 4 (NEB) und 2 μl BsaI (NEB)) verdaut. BsaI-Schnittstellen waren nahe dem 5'-Ende der PCR-Primer angelegt. Die Primer enthielten 6 zusätzliche Nucleotide 5' von den BsaI-Schnittstellen gelegen um den Verdau durch BsaI zu erleichtern. Es gab anderswo im Plasmid keine BsaI-Schnittstellen. Andere Restriktionsenzyme können, wie von Stemmer und Morris (Stemmer und Morris (1992, s. oben)) empfohlen, verwendet werden. Diese spezielle Klasse von Restriktionsenzymen schneidet an einer Stelle, die sich von der Erkennungsstelle unterscheidet, aber nichtsdestotrotz in genauer Entfernung davon liegt. Unter Verwendung dieses Verfahrens bestand keine Notwendigkeit dafür, Restriktionsschnittstellen in der Sequenz zu haben um die Mutagenese durchzuführen.
Beispiel 43: Zweite Reinigung
Die Restriktions-verdauten Produkte wurden dann auf einem 0,8%igen Agarosegel in 1 × TAE-Puffer und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Die korrekte DNA-Bande wurde mit W-Licht (366 nm) sichtbar gemacht, aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem GeneClean-Kit, der von Bio 101, La Jolla, CA, bezogen wurde, extrahiert.
Beispiel 44: Ligation (Schließen des Plasmids)
Die Ligationsgemische bestanden aus 5 μl extrahierter DNA, 2 μl 10 × Ligationspuffer (NEB), 1 μl T4-DNA-Polymerase (NEB), 12 μl Wasser. Die Plasmid-DNA-Menge kann abhängig von der aus dem Gel extrahierten Bande variiert werden.
Die Ligation wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden, oder alternativ bei 14°C über Nacht, durchgeführt.
Beispiel 45: Transformation und Seguenzierung
Die wieder verschlossenen Plasmide wurden dann in E. coli transformiert. Wir verwendeten Inv alpha F' kompetente Zellen, die von der Invitrogen Corporation, San Diego, CA, bezogen wurden.
Plasmid-DNA wurde dann von einigen wenigen Transformanden präpariert und sequenziert um zu bestätigen, dass die Mutagenese erfolgreich war.
Beispiel 46: Mutagenese von BrE-3-Antikörper unter Ver
wendung von JO51 und JO52 Diese 0ligonucleotide wurden konstruiert um K19 zu R (mittels JO51) und A113 zu S (mittels JO52) zu mutieren, und zwar nicht unter Verwendung von EIPCR, sondern unter Verwendung der normalen PCR (mit Primern, die zueinander zeigen). Der Primer JO51 enthielt eine BamHI-Schnittstelle, und der Primer JO52 enthielt eine NheI-Schnittstelle. Nach der mutagenen PCR-Amplifikation wurde die daraus hervorgehende amplifizierte DNA-Kassette anstelle des entsprechenden Wildtyp-DNA-Fragmentes in das Plasmid eingefügt. Es gab keinen zwingenden Grund, dieses Verfahren eher als die EIPCR-Methode zu verwenden, außer dass geeignet gelegene Restriktionsschnittstellen (BamHI und NheI) verfügbar waren. Diese Methode führte jedoch lediglich zu der A113 zu S-Mutation. Eine nachfolgende Analyse zeigte, dass der JO51-Primer, welcher die K19 zu R-Mutation enthält, auf einem Polyacrylamid-Gel falsch lief.
Das Protokoll für den mutagenen Amplifikations-Schritt war wie folgt. Plasmid-Matrize (500 pg/μl), 0,75 μM von jedem mutagenen Oligonucleotid, 2 mM MgCl₂, 10 mM TRIS pH 8,3, 50 mM KCl, 0,2 mM von jedem Nucleotidtriphosphat (dGTP, dATP, TTP, dCTP), und Taq-Polymerase 1 Einheit/20 μl Reaktionsgemisch.
Die PCR wurde, wie oben für EIPCR beschrieben, heiß gestartet. Die Bedingungen für die verwendeten Temperaturzyklen waren wie folgt.
94°C, 3 min
[(94°C, 1 min) (44°C, 1 min) (72°C, 1 min)] 3 Zyklen
[(94°C, 5 s) (65°C, 1 min) (72°C, 1 min)] 32 Zyklen
72°C, 10 min
Die zusätzliche End-Verlängerung und die Reinigung der PCR-Produkte wurden wie oben für EIPCR beschrieben durchgeführt.
Der Restriktionsverdau des Vektors und des Inserts wurden wie folgt durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde für 1 h 50 min. bei 37°C mit BamHI und NheI verdaut (19 μl DNA, 2,5 μl 10 × Puffer 3 (NEB), 1,5 μl BamHI (NEB), 1,5 μl NheI (NEB)). Der Vektor, welcher das oben beschriebene Start-Plasmid ist, wurde unter ähnlichen Bedingungen verdaut [1 μl Plasmid (1 μg), 2 μl 10 × Puffer 3 (NEB), 1,5 μl BamHI (NEB), 1,5 μl NheI (NEB), 14 μl Wasser, 2 ½ Stunden bei 37°C].
Die Restriktions-verdauten Produkte, Vektor und Insert, wurden dann noch einmal gereinigt, wie oben für EIPCR beschrieben.
Die Ligation des Fragments wurde wie folgt durchgeführt. Das Ligationsgemisch bestand aus 5 μl Vektor, 5 μl Insert, 2 μl 10 × Ligationspuffer (NEB), 1 μl T4-DNA-Polymerase (NEB), 7 μl Wasser. Die Plasmid-DNA-Menge kann, abhängig von der Intensität der aus dem Gel extrahierten Bande, variieren. Die Ligation wird bei 14°C über Nacht durchgeführt. Eine Kontroll-Ligation nur mit Vektor wurde paral lel durchgeführt. Die Transformation der Wirtszellen wurde wie für EIPCR beschrieben durchgeführt.
Beispiel 47: Plasmid-Präparation und Sequenzierung von humanisiertem BrE-3 V_H
Plasmid-DNA wurde dann von mehreren unbhängigen Transformanden präpariert. Einige der Plasmide, bei denen durch Restriktions-Analyse gezeigt wurde, dass sie das Insert enthalten, wurden dann sequenziert um zu bestätigen, dass die Mutagenese erfolgreich war. Wenn eine der sequenzierten DNAs die erwünschte Mutation enthielt, wurde sie für den nächsten Mutationszyklus verwendet. Die vollständig mutierten humanisierten BrE-3-Analog-DNA-Sequenzen für die V_H- und V_L-Segmente sind in Tabellen 45 und 46 unten gezeigt.
Tabelle 45: Humanisierte V_L-Analog-DNA-Sequenzen vom BrE-3-Antikörper BrE-3 V_L FR-HZ
Tabelle 46: Humanisierte V_H-Analog-DNA-Sequenzen vom BrE-3-Antikörper
Beispiel 48: Expression von humanisiertem BrE-3-Antikörper
Zwei Expressions-Vektoren pAG4622 und pAH4604 (Coloma, M. J., et al. (1992), s. oben) wurden verwendet, die von S. L. Morrison (Abtl. für Mikrobiologie und molekulare Genetik, ULLA) entwickelt und zur Verfügung gestellt wurden. Jede cDNA, die für ein Signal-Peptid und entweder die variable schwere Kette oder die variable leichte Kette codiert, kann im Prinzip in diese Vektoren eingefügt werden, was zu einer Konstruktion führt, die einen IgG1, K, Antikörper mit humanen konstanten Regionen codiert. Korrekt modifizierte cDNAs wurden aus pCR1000 mit EcoRV und Sal 2 ausgeschnitten und in pAG4622 eingefügt. Diese codieren die modifizierte leichte Kette. Die schwere Wildtyp-Kette wurde ganz ähnlich aus pCR1000 durch Verdau mit EcoRV und NheI ausgeschnitten und in pAH4604 eingefügt. Die Restriktions- und Ligations-Reaktionen, die notwendig waren um diese Arbeitsgänge durchzuführen, wurden unter den Bedingungen, die von den Enzym-Herstellern (New England Biolabs, Beverly, MA) gefordert wurden, durchgeführt. Sowohl die Vektoren, als auch die Inserts wurden vor der Ligation aus einem Agarosegel gereinigt, und zwar unter Verwendung des Bio 101 (La Jolla, CA) GeneClean-Kits (Glaskügelchen). Die V_H- und V_L-Regionen in den Endkonstruktionen wurden noch einmal sequenziert um zu bestätigen, dass sie korrekt waren. Die nicht-produzierende Myelom-Zelllinie SP2/0-Agl4, ATCC: CRL 1581 (Shulman, M., et al. (1978), s. oben) wurden mit beiden Plasmid-Konstruktionen transfiziert, und Antikörper-herstellende Zellen wurden isoliert, indem man den Empfehlungen folgte, die in (Coloma, M. J., et al. (1992, s. oben)) dargestellt sind, befolgt wurden, mit der Ausnahme, dass die Selektion lediglich auf Aufnahme von hisD vorgenommen wurde (indem 5 mM Histidinol zum Medium gegeben wurden und der pH mit NaOH wieder auf 7,4 eingestellt wurde). Üblicherweise wurden nach 10 Tagen stabile Transfektanden-Kolonien mit einer Häufigkeit von ungefähr 10^–5 bis 10^–4 etabliert. Die Kolonien wurden dann in Normal-Medium transferriert (ohne Histidinol). Die Kulturmedien waren entweder Dulbeco's modifiziertes Eagle's Medium (DME): fötales Rinderserum (FBS), 90 : 10 (Vol/Vol), oder ein Gemisch aus DME: RPMI : FBS, 45 : 45 : 10 (Vol/Vol/Vol). Penicillin und Streptomycin wurden zugegeben um Bakterienwachstum zu vermeiden.
Die Überstände von stabilen Transfektanden wurden auf Anwesenheit von Antikörpern hin untersucht. Dies wurde durch Einfangen der sezernierten chimären Antikörper mit einem Platten-gebundenen Ziege-anti-Human-kappa-Kette-Antikörper und die Entwicklung mit Ziege-anti-Human-gamma-Kette-Antikörper durchgeführt, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Coloma, M. J. (1992, s. oben)), mit der Ausnahme, dass der sekundäre Antikörper mit ¹²⁵I radioaktiv markiert war. Die Überstände wurden ebenfalls im Hinblick auf die Bindung an humanes Milchfettkügelchen (HMFG) untersucht, wie zuvor beschrieben (Ceriani, R. L., et al., "Diagnostic Ability of Different Human Milk Fat Globule Antigens in Breast Cancer", Breast Cancer Res. Treat. 15: 161-174 (1990)). HMFG ist an die Mikrotiterplatten gebunden, wie zuvor beschrieben (Ceriani, R. I. (1984, s. oben)). Üblicherweise waren die meisten Kolonie-Überstände in beiden Assays positiv. Kolonien, die die höchsten Antikörper- Spiegel in die Überstände sezernierten, wie dies durch diese Assays bestimmt wurde, wurden subcloniert und anschließend für die Reinigung von Antikörper an Serumfreies Medium angepasst. Serum-freies Medium enthält HL-1-Supplement, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Ventrex Labs., Portland, ME).
Beispiel 49: Halb-humanisierter-halb-chimärer BrE-3-Antikörper
Durch Co-Transfektion von SP2/0-Myelomzellen mit Hybrid-Plasmiden, die die entsprechenden DNA-Sequenzen und jene von einem humanen F_c enthielten, wurde eine humanisierte leichte BrE-3-Kette mit einer nicht-humanisierten chimären schweren Anti-BrE-3-Kette verpaart.
Beispiel 50: Bestimmung von Affinitätskonstanten für halb-humanisierte und voll-humanisierte BrE-3-Antikörper
Die sezernierten halb-humanisierten-halb-chimären und vollständig humanisierten Antikörper wurden aus den Kulturüberständen unter Verwendung einer Sepharose 4B-Protein A-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt, wie von Ey et al. (Ey, P. L., et al. (1978, s. oben)) beschrieben. Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden wie von Ceriani et al. (Ceriani, R. L. et al. (1992, s. oben)) beschrieben, unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Lagen von methyliertem BSA, Glutaraldehyd, Anti-β-galactosidase und dem bakteriellen Fusionsprotein 11-2 (einem Hybrid aus β-Galactosidase und humanem Brustdrüsen-Mucin) präpariert. Jede Vertiefung enthielt 388 ng des 11-2-Fusionsproteins. Zu jeder Vertiefung wurden 25 μl ¹²⁵I-BrE-3 in RIA-Puffer (10% Kälberserum, 0,3% Triton X-100, 0,05% Natriumazid pH 7,4, in Phsophat-gepufferter Kochsalzlösung) gegeben, und es wurde mit 25 μl entweder unmarkiertem Maus- oder chimärem Antikörper in RIA-Puffer mit den Endkonzentrationen 130 pM, 850 pM, 1,3 nM, 4 nM und 13 nM kompetitiert. Io dierungen wurden mit ¹²⁵I (17 Ci/mg, Nordion International) durchgeführt. Fünfzig Mikrogramm monoclonaler Antikörper BrE-3 (Coulter, Hialeah, FL) wurden mit einer spezifischen Aktivität von 9,56 mCi/mg unter Verwendung der Chloramin T-Methode, wie zuvor von Ceriani et al. (Ceriani, R. L., et al. (1988, s. oben)) beschrieben, markiert.
Antikörper-Antigen-Affinitätskonstanten wurden bestimmt, indem der reziproke Wert der Konzentration von kompetitiertem, urmarkierten monoclonalen Antikörper genommen wurde, die zu 50% Bindung führte, wie von Sheldon et al. (Sheldon, K., et al. (1987, s. oben)) beschrieben. Das verwendete Protokoll zur Bestimmung der Affinitätskonstanten war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall ein unmarkierter Antikörper gegen denselben radioaktiv-markierten Antikörper um die Bindung an Antigen kompetitierte. Sowohl die halb-humanisierten-halb-Chimären Antikörper, als auch die vollständig humanisierten Antikörper kompetitierten ungefähr genauso gut oder besser mit dem Maus-anti-BrE-3-Antikörper um das Antigen.
Es wurde Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt um sicherzustellen, dass die Antikörperketten, wie erwartet, wanderten. Die Affinitäts-Bindungskonstanten der Maus-, chimären, halb-humanisierten und humanisierten Antikörper wurden in unabhängigen Kompetetions-Assays bestimmt.
Beispiel 51: Histochemische Spezifität von halb- und vollständig humanisierten BrE-3-Antikörpern
Immunhistochemische Färbung von aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten von humanem Brust-Carcinom unter Verwendung der Immunperoxidase-Technik wurde als Test verwendet um zu bestätigen, dass die Analog-Antikörper eine nützliche Affinität für die Carcinom-Antigene behalten. Brust-Carcinom-Gewebeschnitte wurden mit dem Überstand der halbhumanisierten/halb-Chimären und der vollständig humani sierten transfizierten Zellen unter Verwendung der Vectastain ABC-Methode gefärbt (Vector Labs, Burlingame, CA). Beide Antikörper zeigten starke Färbungsmuster.
Beispiel 52: Gelchromatographie von halb-humanisierten/ halb-chimären und vollständig humanisierten BrE-3-Antikörpern
Antikörper-Disulfid-Brücken wurden durch Erhitzen für 10 min bei 65°C in Laemmli-Auftragspuffer, der 5% beta-Mercaptoethanol enthielt, reduziert. Die getrennten Ketten wurden dann auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel (10%) der Chromatographie unterzogen. Es wurden zwei Banden für beide Antikörper beobachtet, und zwar mit einem ähnlichen Wanderungsmuster, wie bei dem Maus-Antikörper. Diese Daten wurden auch durch Western-Blot bestätigt.
Beispiel 53: Abgeleitete Aminosäure-Sequenzen von humanisierten variablen leichten und schweren Ketten von BrE-3
Die Aminosäure-Sequenzen der leichten und schweren Ketten der humanisierten Analog-Antikörper sind in Tabellen 47 und 48 unten gezeigt. Diese Aminosäure-Sequenzen können entweder verbessert werden um die Affinität für das Antigen zu erhöhen oder um die Immunogenität in Menschen zu vermindern. Zahlreiche Varianten dieser Sequenz können im Einklang mit der Erfindung hergestellt werden.
Tabelle 47: Aminosäure-Sequenz von humanisiertem BrE-3 V_L-Analog BrE-3 V_L FR-HZ
Tabelle 48: Aminosäure-Sequenz vom BrE-3 V_M-Analog BrE-3 V_M FR-HZ
Beispiel 54: Auswahl eines Maus-Modells bekannter Struktur für die Humanisierung vom Anti-KC-4-Antikörper
Die Klassifizierung der V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, wie des Anti-KC-4-Antikörpers, wurde entsprechend Kabat et al. (Kabat, E. A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" NIH (1991)) durchgeführt. Die KC-4G3-kappa-Kette V_L-Domäne gehört zur Gruppe II, und die V_H-Domäne gehört zur Gruppe IIId. Es wurde dann ein Maus-Antikörper gefunden, dessen Struktur bestimmt worden war und dessen variable Regionen zu denselben Klassen gehören. Der Anti-Myohämerythrin-Peptid-Antikörper B13I2 erfüllt diese Anforderungen, da er, wie der Maus-anti-KC-4-Antikörper V_L- und V_H-Domänen besitzt, die zu den Gruppen II und IIId gehören (Standfield, R. L., et al., "Crystal Structures of an Antibody to a Peptide and its complex with Peptide Antigen at 2,8 Å, Science 248: 712–719 (1990)). Daher sollten die dreidimensionalen Strukturen der Antikörper Anti-KC-4 und B13I2 ähnlich sein, und die Humanisierung des Anti-KC-4-Antikörpers kann nach B13I2 modelliert werden.
Beispiel 55: Auswahl des humanen Ziel-Gerüsts für die Humanisierung von chimärem Anti-KC-4-Antikörper
Die Auswahl des humanen Ziel-Gerüsts basierte strikt auf der Ähnlichkeit der Reste, die entsprechend dem B13I2-Modell als strukturell wichtig beurteilt wurden. D. h., nur Aminosäuren, die in Kontakte mit CDRs der gegenüberliegenden Kette involviert sein könnten, oder Aminosäuren, von deren Seitenketten vorhergesagt wurde, dass sie nach innen zeigen. Die Positionen dieser Aminosäuren sind in Tabelle 49 unten gezeigt.
Tabelle 49: Wichtige Aminosäure-Positionen für den Anti-KC-4-Antikörper
Das Nummerierungssystem ist allgemein akzeptiert (Kabat, et al. (1991, s. oben)), und ist in Tabellen 10 und 11 oben gezeigt. In diesem Fall wurden die Konsensus-Sequenzen von allen humanen F_v-Regionen als humanes Ziel-Gerüst ausgewählt um die Immunogenität des Produktes zu minimieren.
Als erstes wurden die Sequenzen der variablen Maus-Ketten mit Konsensus-Sequenzen von allen bekannten humanen Klassen der variablen Region vergleichend angeordnet (Herron, J. N., (1989, s. oben)), und die Anzahl der Unterschiede in den Aminosäuren, die von der Maus-Sequenz bewahrt werden mussten, wurde gewichtet. Die Positionen dieser Aminosäuren erhielt man von jenen des monoclonalen Maus-B13I2-Antikörpers, welcher als Modell für die Humanisierung des Anti-KC-4-Antikörpers ausgewählt wurde.
Basierend auf diesen Gewichtungen wurden die Konsensus-Sequenzen der humanen Gerüste, die zu Gruppen V_κII und V_HIII gehörten, ausgewählt, damit sie die CDRs des Mausanti-KC-4-Antikörpers plus andere wichtige Aminosäuren erhalten.
Beispiel 56: Identifizierung von Maus-Human-Unter- schieden beim Anti-RC-4-Antikörper
Die Original-Maus-Sequenzen (Anti-KC-4 V_K oder V_M) wurden vergleichend mit ihren nächsten humanen Verwandten (Human KII oder HIII), die nach dem Vergleichen ihrer Sequenzen wie in Beispiel 34 oben beschrieben ausgewählt wurden, angeordnet. Im vorliegenden Beispiel war es beabsichtigt, dass so viele Aminosäuren wie möglich beim Übergang von der Maus- zur humanisierten variablen Konsensus-Sequenz substituiert wurden, wobei die wichtigen Aminosäuren intakt gelassen wurden, wie in Beispielen 55 und 57 beschrieben. Die Aminosäuren, die dazu ausgewählt wurden, dass sie bewahrt blieben, waren eine Untergruppe der oben aufgelisteten. Diese wurden mittels Analogie zur B13I2-Sequenz ausgewählt. Die einzige Ausnahme war der Glycin-Rest (100) des Original-Gerüstes der variablen Region der Maus-kappa-Kette, welcher beibehalten wurde, obwohl er nicht in Tabelle 49 oben enthalten war, da man glaubte, dass er Kontakt mit der variablen Domäne der schweren Kette haben könnte. Solche Kontakte wurden in mindestens drei Fab beobachtet, denen ein Gly an dieser Position fehlt.
Beispiel 57: Identifizierung wichtiger Maus-Aminosäuren im Anti-R-4-Antikörper
Die "wichtigen" Maus-Aminosäuren wurden, basierend auf den Kontakten der jeweiligen Aminosäure mit den CDRs und mit den gegenüberliegenden Ketten und/oder danach, ob ihre Seitenketten nach innen oder nach außen zeigen, zur Beibehaltung ausgewählt. Die Positionen dieser "wichtigen" Aminosäuren wurden, basierend auf der Untersuchung der bekannten Strukturen anderer Antikörper, bestimmt.
Die meisten der "wichtigen" Aminosäuren wurden auf Basis der Struktur des Antikörpers B13I2 und entsprechend der Tabellen 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 oben ausgewählt. Die Endauswahl von Aminosäure-Positionen für die tatsächliche Mutation wurde durch Vergleich der Position aller Aminosäuren, die Kandidaten für die Mutation waren, mit jenen, die wichtig sind und bewahrt werden sollten, getroffen. Jede "wichtige" Aminosäure-Position wurde von der Kandidatenliste gestrichen. Tabelle 50 unten zeigt die Aminosäuren, die in der Maus-Sequenz für den Austausch ausgewählt wurden um die humanisierte Sequenz im vorliegenden beispielhaften Analog zu erreichen.
Tabelle 50: Aminosäuren der variablen Region des Maus anti-RC-4-Antikörpers, die für die Mutation ausgewählt wurden
Der Austausch N K an Position 74 in der leichten variablen Kette entfernte Bekannterweise eine N-gekoppelte Glykosylierungsstelle, welche in dem original monoklonalen Maus-Antikörper vorhanden war.
Beispiel 58: Einführung von Austauschen in der Aminosäure-Sequenz zur Humanisierung des Anti-RC-4-Antikörpers
Die Einführung der Austausche in der Aminosäure-Sequenz wurde nicht wie in Beispiel 37 oben beschrieben vorgenommen. Statt dessen wurde die DNA, die jede humanisierte variable Region codiert, in einer einzelnen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von überlappenden Oligonucleotiden entsprechend dem von Ye et al. (Ye, Q.-Z., Johnson, L. L., und Baragi, V., "Gene Synthesis and Expression in E. coli for PUMP, a Human Matrix Metalloproteinase", BBRC 186(1): 143–149 (1992)) beschrieben, synthetisiert. Die mutagenen Sequenzen sind in Tabelle 51 unten gezeigt.
Tabelle 51: Primer für die Humanisierung von variablen Regionen des Anti-KC-4-Maus-Antikörpers
Beispiel 59: Synthese von Primern zur Humanisierung von Anti-KC-4-Antikörper
Alle Primer wurden auf einem PCR-Mate EP DNA-Synthesizer, Modell 391 (Applied Biosystems, Foster City, CA), unter Verwendung von 40 nmol-Säulen, Zyklus 1 : 63, ohne Trityl, synthetisiert. Keiner wurde vor der Verwendung gereinigt. Die EIPCR-Methode wurde zur Präparation aller Primer-Sets verwendet. Ihre Sequenzen sind in Tabelle 51 oben gezeigt. Die Plasmid-DNA-Matrize wurde mit einem Kit, der von QIAGEN (Tchapsworth, CA) bezogen wurde, extrahiert, und in 10 mM TRIS 1 mM ETA pH 7,5–8 auf 1 ng/μl verdünnt. Dieses Plasmid setzt sich aus dem Vektor pCR1000 (Invitrogen Cor poration, San Diego, CA) zusammen, in den die cDNA, die für die zu humanisierende variable Region codiert, eingefügt wurde.
Beispiel 60: Synthese von humanisierten variablen Regionen der schweren Rette von Anti-KC-4
Es wurde ein Gemisch von PCR-Primern erstellt, wobei jeder Primer mit einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser vorlag.
Vier 101-mere Oligonucleotide (JO61, JO62, JO63 und JO64), ein 50-mer (JO59) und ein 49-mer (JO60) wurden für die Synthese der humanisierten schweren variablen Kette verwendet. Die Oligonucleotid-Konzentrationen wurden unter Verwendung der Formel c = [(A,260)/30] μg/μlabgeschätzt.
Die PCR-Amplifikations-Bedingungen waren wie folgt. Alle Reagentien sowie das GeneAmp PCR-System 9600 wurden von Perkin Elmer Cetus bezogen.

Optimale PCR-Bedingungen wurden für jedes Paar mutagener Primer empirisch bestimmt. Es wurde eine Matrix von Bedingungen erstellt, die die Konzentration von MgCl₂, mutagenen Primern und Matrizen-Plasmid-DNA variiert, und zwar wie folgt. Die Doppelstrangbildungs- und Verlängerungs-Temperaturen während der PCR können jedoch verändert werden.

2 μM Primer JO59	150 nM von jedem der Primer JO61, 61, 63 und 64
2 μM Primer JO60	200 μM von jedem dGTP, dATP, TTP und dCTP
10 mM KCl	20 mM Tris-HCL pH 8,8
10 mM (NH₄)₂SO₄ 0,1% Triton X-100	2 Einheiten pro 100 μl-Reaktion Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) 6 mM MgSO₄

Beispiel 61: Heißstart-PCR zur Humanisierung von Anti-KC-4-Antikörper
Alle Komponenten des PCR-Gemisches, mit Ausnahme der Vent-DNA-Polymerase, wurden gemischt. Das Gemisch wurde dann in 19 μl-Aliquots auf 5 PCR-Reaktionsgefäße verteilt. Der Grund für die Durchführung von fünf unabhängigen Reaktionen war der, die Wahrscheinlichkeit, dass ungewollte Mutationen als Ergebnis von Nucleotid-Fehleinbau während der PCR isoliert werden, zu vermindern. Die Reaktionsgefäße wurden für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf 72°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde 1 μl einer geeigneten Vent-DNA-Polymerase-Verdünnung in 1 × Puffer zum Reaktionsgemisch gegeben (Heißstart). Die Temperaturzyklen werden dann wie folgt durchgeführt.
[(96°C, 6 s) (55°C, 10 s) (72°C, 30 s)] 3 Zyklen
[(96°C, 5 s) (60°C, 10 s) (72°C, 30 s)] 29 Zyklen
72°C, 10 min
Beispiel 62: Zusätzliche End-Verlängerung für humanisierte Anti-KC-4-Antikörper-DNA
Nach den Zyklen wurde eine zusätzliche End-Verlängerungs-Reaktion durchgeführt. Zusätzliche Desoxyribonucleotid-Triphosphate (auf 125 μM) und 1 Einheit Vent-DNA-Polymerase wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 10 Minuten auf 72°C erhitzt.
Das daraus hervorgehende synthetische DNA-Fragment wurde mit DraI und NheI verdaut und in dieselben Restriktions-Schnittstellen in ein Plasmidkonstrukt insertiert, das die entsprechende variable Region der schweren Kette der Maus codiert.
Beispiel 63: Synthese von humanisierten variablen Regionen der leichten Kette von Anti-KC-4
Die Gene der variablen Region der leichten Kette (V_L) wurden auf ähnliche Weise synthetisiert, wie in Beispielen 60 bis 62 oben für die variablen Regionen der schweren Kette beschrieben.
Beispiel 64: Reinigung von humanisierten Anti-KC-4-PCR-Produkten
Die PCR-Produkte wurden dann auf einem 0,8%igen Agarosegel in 1 ×TAE-Puffer und 0,5 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Die korrekte DNA-Bande wurde mit W-Licht (366 nm) sichtbar gemacht, aus den Gelen ausgeschnitten und mit dem GeneClean-Kit extrahiert (Bio 101, La Jolla, CA).
Beispiel 65: Ligation von humanisierter Anti-KC-4-DNA zu einem Plasmid (Schließen eines Plasmids)
Die Ligations-Gemische bestanden aus 5 μl extrahierter DNA, 2 μl 10 × Ligationspuffer (NEB), 1 μl T4-DNA-Polymerase (NEB), 12 μl Wasser. Die Menge an Plasmid-DNA kann abhängig von der Intensität der aus dem Gel extrahierten Bande variieren. Die Ligation in ein pBluescript KS-Plasmid (Stratagene) wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden, oder alternativ über Nacht bei 14°C, durchgeführt.
Beispiel 66: Transformation und Sequenzierung von humanisierter Anti-KC-4-DNA
Die wieder geschlossenen Plasmide wurden dann in E. coli transformiert, und zwar unter Verwendung Inv alpha F' kompetenter Zellen, die von Invitrogen Corporation, San Die go, CA, bezogen wurden. Dann wurde Plasmid-DNA aus einigen wenigen Transformanden präpariert und sequenziert um zu bestätigen, dass die Mutagenese erfolgreich war.
Beispiel 67: Hybrid-Plasmid-Präparation und Sequenzierung
Plasmid-DNA wurde dann präpariert und sequenziert um zu bestätigen, dass die Mutagenese erfolgreich war. Die mutierten humanisierten Analog-DNA-Sequenzen von Anti-KC-4 für die V_H- und V_L-Segmente sind in Tabellen 52 und 53 unten gezeigt.
Tabelle 52: Humanisierte V_L-Analog-DNA-Sequenzen von Anti-KC-4-Antikörper
Tabelle 53: Humanisierte V_M-Analog-DNA-Sequenzen von Anti-KC-4-Antikörper
Beispiel 68: Expression von humanisiertem Anti-KC-4-Antikörper
Es wurden zwei Expressionsvektoren pAG4622 und pAH4604 (Coloma, M. H., et al. (1992, s. oben)) verwendet, die von S. L. Morrison (Abtl. für Mikrobiologie und molekulare Genetik, UCLA) entwickelt und zur Verfügung gestellt wurden. Im Prinzip kann jede cDNA, die ein Signal-Peptid codiert, und entweder die variable schwere Kette oder die variable leichte Kette in diese Vektoren eingefügt werden, was zu einer Konstruktion führt, die einen IgG1, K, Antikörper mit humanen konstanten Regionen codiert. Korrektmodifizierte cDNAs wurden aus pCR1000 mit EcoRV und SalI ausgeschnitten und in pAG4622 eingefügt. Diese codieren die modifizierte leichte Kette. Die schwere Wildtyp-Kette wurde ganz ähnlich durch Verdau mit EcoRV und NheI aus pCR1000 ausgeschnitten und in pAH4604 eingefügt. Die Restriktions- und Ligations-Reaktionen, die notwendig sind um diese Arbeitsgänge durchzuführen, wurden unter den Bedingungen, die vom Enzym-Hersteller gefordert werden (New England Biolabs, Beverly, MA), durchgeführt. Sowohl die Vektoren, als auch die Inserts wurden vor der Ligation aus einem Agarosegel gereinigt, und zwar unter Verwendung des Bio 101 (La Jolla, CA) GeneClean-Kits (Glaskügelchen). Die V_H- und V_L-Regionen in den endgültigen Konstruktionen wurden noch einmal sequenziert um zu bestätigen, dass sie korrekt waren. Die nicht-produzierende Myelom-Zelllinie SP2/0-Ag14, ATCC: CRL 1581 (Shulman, M., et al. (1978), s. oben) wurde mit beiden Plasmid-Konstruktionen transfiziert, und Antikörper-Produzenten wurden isoliert, indem man den Empfehlungen folgte, die in Coloma et al. (Coloma, M. J., et al. (1992, s. oben)) dargestellt sind, mit der Ausnahme, dass die Selektion lediglich auf Aufnahme von hisD vorgenommen wurde (indem 5 mM Histidinol zum Medium gegeben wurden und der pH mit NaOH wieder auf 7,4 eingestellt wurde). Üblicherweise werden nach 10 Tagen stabile Transfektanden-Kolonien mit einer Häufigkeit von ungefähr 10^–5 bis 10^–4 etabliert. Die Kolonien wurden dann in Normal-Medium transferriert (ohne Histidinol). Das Kulturmedium war entweder Dulbeco's modifiziertes Eagle's Medium (DME): fötales Rinderserum (FBS), 90 : 10 (Vol/Vol), oder ein Gemisch aus DME: RPMI : FBS, 45 : 45 : 10 (Vol/Vol/Vol). Penicillin und Streptomycin wurden zugegeben um Bakterienwachstum zu vermeiden.
Die Überstände von stabilen Transfektanden wurden auf Anwesenheit von Antikörpern hin untersucht. Dies wurde durch Einfangen der sezernierten chimären Antikörper mit einem Platten-gebundenen Ziege-anti-Human-kappa-Kette-Antikörper und die Entwicklung mit Ziege-anti-Human-gamma-Kette-Antikörper durchgeführt, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Coloma, M. J. (1992, s. oben)), mit der Ausnahme, dass der sekundäre Antikörper mit ¹²⁵I radioaktiv markiert war. Die Überstände wurden ebenfalls im Hinblick auf die Bindung an humanes Milchfettkügelchen (HMFG) untersucht, wie zuvor beschrieben (Ceriani, R. L., et al., "Diagnostic Ability of Different Human Milk Fat Globule Antigens in Breast Cancer", Breast Cancer Res. Treat. 15: 161–174 (1990)). HMFG ist an die Mikrotiterplatten gebunden, wie zuvor beschrieben (Ceriani, R. L. (1984, s. oben)). Üblicherweise waren die meisten Kolonie-Überstände in beiden Assays positiv. Kolonien, die die höchsten Antikörper-Spiegel in die Überstände sezernierten, wie dies durch diese Assays bestimmt wurde, wurden subcloniert und anschließend für die Reinigung von Antikörper an Serumfreies Medium angepasst. Serum-freies Medium enthält HL-1-Supplement, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Ventrex Labs., Portland, ME).
Beispiel 69: Halb-humanisierterthalb-chimärer Anti-RC-4-Antikörper
Durch eine humanisierte leichte Kette von Anti-KC-4 wurde durch Co-Transfektion von SP2/0-Ag14-Myelomzellen mit Hy brid-Plasmiden, die die entsprechenden DNA-Sequenzen und jene von einem humanen F_c enthielten, mit einer nichthumanisierten chimären schweren Kette verpaart. Die erhaltene Zelllinie, HuKC-4V1, wurde bei der ATCC am 23. September 1993 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 11454.
Zusätzlich wurde eine humanisierte Anti-KC-4-schwere Kette mit einer nicht-humanisierten chimären leichten Kette von Anti-KC-4, wie oben in Beispiel 69 beschrieben, verpaart. Die so erhaltene Zelle, HuKC-4V3, wurde bei der ATCC am 23. September 1993 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 11456.
Beispiel 70: Vollständig humanisierter Anti-RC-4-Antikörper
Ein vollständig humanisierter Anti-KC-4-Antikörper wurde hergestellt, indem vollständig humanisierte leichte und schwere Ketten von Anti-KC-4 miteinander verpaart wurden, und zwar durch Co-Transfektion, wie in Beispiel 69 oben beschrieben. Die Zelllinie HuKC-4V2 wurde bei der ATCC am 23. September 1993 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 11455.
Beispiel 71: Bestimmung von Affinitätskonstanten für halb- und voll-humanisierte Anti-KC-4-Antikörper
Die sezernierten halb-humanisierten Antikörper und die vollständig humanisierten Antikörper wurden unter Verwendung einer Sepharose-4B-Protein-A-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt, wie von Ey et al. (Ey, P. L., et al. (1978, s. oben)) beschrieben, aus Kulturüberständen gereinigt. Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden wie von Ceriani et al. (Ceriani, R. L. et al. (1992, s. oben)) beschrieben, unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Lagen von methyliertem BSA, Glutaraldehyd, Anti β-galactosidase und dem bakteriellen Fusionsprotein 11-2 (einem Hybrid aus β-Galactosidase und humanem Brustdrüsen-Mucin) präpariert. Jede Vertiefung enthielt 388 ng des 11-2-Fusionsproteins. Zu jeder Vertiefung wurden 25 μl ¹²⁵I-KC-4 in RIA-Puffer (10% Kälberserum, 0,3% Triton X-100, 0,05 Natriumazid pH 7,4, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) gegeben, und es wurde mit 25 μl entweder unmarkiertem Maus- oder chimärem Antikörper in RIA-Puffer mit den Endkonzentrationen 130 pM, 850 pM, 1,3 nM, 4 nM und 13 nM kompetitiert. Iodierungen wurden mit ¹²⁵I (17 Ci/mg, Nordion International) durchgeführt. 50 μg monoclonaler Anti-KC-4-Antikörper (Coulter, Hialeah, FL) wurden mit einer spezifischen Aktivität von 9,56 mCi/mg unter Verwendung der Chloramin T-Methode, wie zuvor von Ceriani et al. (Ceriani, R. L., et al. (1988, s. oben)) beschrieben, markiert.
Die Antikörper-Antigen-Affinitätskonstanten wurden bestimmt, indem der reziproke Wert der Konzentration von kompetitiertem, unmarkierten monoclonalen Antikörper genommen wurde, die zu 50% Bindung führte, wie von Sheldon et al. (Sheldon, K., et al. (1987, s. oben)) beschrieben. Das verwendete Protokoll zur Bestimmung der Affinitätskonstanten war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall ein unmarkierter Antikörper gegen denselben radioaktiv-markierten Antikörper um die Bindung an Antigen kompetitierte. Es wurde von dem vollständig humanisierten Antikörper gezeigt, dass er ungefähr so gut oder besser mit dem Maus-anti-KC-4-Antikörper um das KC-4-G3-Antigen kompetitierte.
Es wurde Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt um sicherzustellen, dass die Antikörperketten, wie erwartet, wanderten. Die Affinitäts-Bindungskonstanten der Maus-, chimären, halb-humanisierten und humanisierten Antikörper wurden in unabhängigen Kompetitions-Assays bestimmt.
Beispiel 72: Histochemische Spezifität von halb- und vollständig humanisierten Anti-KC-4-Antikörpern
Immunhistochemische Färbung von aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten von humanem Brust-Carcinom unter Verwendung der Immunperoxidase-Technik wurde als Test verwendet um zu bestätigen, dass die Analog-Antikörper eine nützliche Affinität für das KC-4G3-Carcinom-Antigen des Maus-Antikörpers beibehalten. Brust-Carcinom-Gewebeschnitte wurden mit dem Überstand der mit Maus-KC-4 und mit vollständig humanisiertem KC-4-transfizierten Zellen unter Verwendung der Vectastain ABC-Methode gefärbt (Vector Labs, Burlingame, CA). Beide Antikörper zeigten starke Färbungsmuster.
Die folgende Tabelle 54 zeigt das Ergebnis der Immünperoxidase-Färbung von fünf humanen Brust-Carcinomen, entweder mit dem Standard-anti-KC-4G3-Maus-Antikörper oder den vollständig humanisierten Antikörpern. Beide färbten dieselben Gewebe zu einem vergleichbaren Grad.
Tabelle 54: Immunperoxidase-Färbung von humanen Brust-Carcinom-Gewebsschnitten mit Maus- und vollständig humanisierten Anti-KC-4-Antikörpern
Beispiel 73: Bindung an HMFG von halb-humanisierten und vollständig humanisierten Anti-KC-4-Antikörpern
Gewebekultur-Überstände von Transfektanden aller drei Anti-KC-4-Varianten des humanisierten Antikörpers banden an humanes Milchfettkügelchen (HMFG), wie durch Radio-Immuntests gezeigt und bestätigt wurde.
Beispiel 74: Halb-humanisierte und vollständig humanisierte Anti-RC-4-Antikörper binden an Ziege-anti-Human-K- oder -γ-Antikörper
Es wurde gezeigt, dass Gewebekultur-Überstände von Transfektanden aller drei Varianten der humanisierten Anti-KC-4-Antikörper in Sandwich-Radio-Immuntests sowohl an Ziegeanti-Human-kappa-Kette-Antikörper, der an Mikrotiterplatten-Vertiefungen gebunden war (750 ng/Vertiefung), als
auch an Radio-iodierte, ¹²⁵I-markierte Ziege-anti-Humangamma-Kette-Antikörper banden.
Die Ergebnisse dieser Sandwich-Tests zeigen, dass beide Ketten der humanisierten Antikörper tatsächlich humane konstante kappa- und gamma-Regionen besitzen.
Beispiel 75: Abgeleitete Aminosäure-Sequenzen von humanisierten Anti-RC-4-variablen leichten und schweren Retten
Die Aminosäure-Sequenzen der leichten und schweren Ketten des humanisierten Analog-Antikörpers sind in Tabelle 55 und 56 unten gezeigt. Die tatsächlichen Aminosäure-Sequenzen können variiert werden, entweder um die Affinität an das Antigen zu erhöhen, oder um die Immunogenität in Menschen zu vermindern. Zahlreiche Varianten dieser Sequenz können im Einklang mit der Erfindung hergestellt werden.
Tabelle 55: Humanisierte V_L-Analog-Sequenz von Anti-RC-4-Antikörper
Tabelle 56: Humanisierte V_M-Analog-Sequenz von Anti-KC-4-Antikörper
Beispiel 76: Halb-humanisierte/halb-chimäre Anti-BrE-3-Antikörper
Eine humanisierte leichte BrE-3-Kette wurde mit einer nicht-humanisierten chimären schweren BrE-3-Kette verpaart, und zwar durch Co-Transfektion von SP2/0-Ag14-Myelomzellen mit Hybrid-Plasmiden, die die entsprechenden DNA-Sequenzen und jene einer humanen F_c enthielten. Die erhaltene Zelllinie, HuBrE3V1, wurde bei der ATCC am 10. November 1993 hinterlegt.
Zusätzlich wurde eine humanisierte schwere BrE-3-Kette mit einer nicht-humanisierten chimären leichten BrE-3-Kette, wie in Beispiel 69 oben, verpaart. Die somit erhaltene Zelle, HuBrE3V3, wurde bei der ATCC am 10. November 1993 hinterlegt.
Beispiel 77: Vollständig humanisierter BrE-3-Antikörper
Der vollständig humanisierte BrE-3-Antikörper wurde durch Verpaaren von vollständig humanisierten leichten und schweren BrE-3-Ketten hergestellt, und zwar durch Co-Transfektion, wie in Beispiel 69 oben beschrieben. Die somit erhaltene Zelllinie, HuBrE3V2, wurde bei der ATCC am 13. November 1992 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer HB 1111200.
Beispiel 78: Halb-humanisierte und vollständig-humanisierte BrE-3-Antikörper binden an Ziege-anti-Human-K- oder γ-Antikörper
Es wurde gezeigt, dass Gewebekultur-Überstände von Transfektanden aller drei Varianten des humanisierten BrE-3-Antikörpers in Sandwich-Radio-Immuntests sowohl an Ziege-, anti-Human-kappa-Kette-Antikörper, der an Mikrotiterplatten gebunden war (750 ng/Vertiefung), als auch an Radioiodierte, ¹²⁵I-markierte Ziege-anti-Human-gamma-Kette-Antikörper banden.
Die Ergebnisse dieser Sandwich-Tests zeigen, dass beide Ketten der humanisierten Antikörper tatsächlich humane konstante kappa- und gamma-Regionen besitzen.
Beispiel 79: Bindung an HMFG von halb-humanisierten und vollständig humanisierten BrE-3-Antikörpern
Es wurde gezeigt, dass Gewebekultur-Überstände von Transfektanden aller drei BrE-3-Varianten des humanisierten Antikörpers an humanes Milchfettkügelchen (HMFG) binden, wie durch Radio-Immuntests bestimmt wurde.
Beispiel 80: Kompetitions-Assays und Bestimmung von Affinitätskonstanten für halb-humanisierte BrE-3-Antikörper
Die sezernierten halb-humanisierten Antikörper wurden aus Kulturüberständen unter Verwendung einer Sepharose-4B-Protein-A-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt, wie von Ey et al. (Ey, P. L., et al. (1978, s. oben)) beschrieben. Der vollständig humanisierte Antikörper (HuBrE3 V2) wurde nicht gereinigt. Seine Konzentration in dem Kultur-Überstand wurde durch Radio-Immuntest unter Verwendung eines Platten-gebundenen Ziege-anti-Human-kappa-Kette-Antikörpers als Einfang-Antikörper und unter Verwendung eines radioaktiv markierten Ziege-anti-Human-gamma-Kette-Anti körpers als Detektions-Antikörper bestimmt. Eine parallele Standardkurve von humanem IgG_1κ wurde verwendet um die unbekannte Konzentration von HuBrE3 V2 zu bestimmen. Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden, wie von Ceriani et al. beschrieben (Ceriani, R. L., et al. (1992, s. oben)) unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Lagen von methyliertem BSA, Glutaraldehyd, Anti-β-galactosidase und dem bakteriellen Fusionsprotein 11-2 (einem Hybrid aus (β-Galactosidase und humanem Maus-Mucin) präpariert. Jede Vertiefung enthielt 388 ng des 11-2-Fusionsproteins. Zu jeder Vertiefung wurden 25 μl ¹²⁵I-BrE-3 in RIA-Puffer (10% Kälberserum, 0,3% Triton X-100, 0,05% Natriumazid pH 7,4, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) gegeben und mit 25 μl von entweder unmarkiertem Maus- oder humanisiertem Antikörper in RIA-Puffer mit den Endkonzeritrationen 130 pM, 850 pM, 1,3 nM, 4 nM und 13 nM kompetitiert. Iodierungen wurden mit ¹²⁵I (17 Ci/mg, Nordion International) durchgeführt. 50 μg monoclonaler BrE-3-Antikörper (Coulter, Hialeah, FL) wurden mit einer spezifischen Aktivität von 9,56 mCi/mg unter Verwendung des Chloramin T-Verfahrens markiert, wie zuvor von Ceriani et al. beschrieben (Ceriani, R. L., et al. (1988, s. oben)).
Von allen humanisierten Versionen des BrE-3-Antikörpers wurde gezeigt, dass sie ungefähr so gut oder besser mit dem markierten Maus-BrE-3-Antikörper um das Antigen kompetitieren, wie es der Maus-BrE-3-Antikörper tat. Das Protokoll, das verwendet wurde um die Affinitätskonstanten zu bestimmen, war wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall ein unmarkierter Antikörper um die Bindung an das Antigen gegen denselben radioaktiven Antikörper kompetitierte. Die Antikörper-Antigen-Affinitätskonstanten wurden bestimmt, indem der Kehrwert der Konzentration von kompetitierendem urmarkierten monoclonalen Antikörper genommen wurde, die 50% Bindung hervorbrachte, wie von Sheldon et al. beschrieben (Sheldon, K., et al. (1987, s. oben)).
Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde durchgeführt um sicherzustellen, dass die Antikörper-Ketten, wie erwartet, wanderten. Die Affinitäts-Bindungskonstanten der Maus-, chimären, halb-humanisierten und humanisierten Antikörpers wurden in unabhängigen Kompetitions-Assays bestimmt.
Beispiel 81: Histochemische Spezifität von halbhumanisierten BrE-3-Antikörpern
Immunhistochemische Färbung von aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten von humanem Brust-Carcinom unter Verwendung der Immunperoxidase-Technik wurde als Test verwendet um zu bestätigen, dass die Analog-Antikörper die Affinität für das Carcinom-Antigen des Maus-BrE-3-Antikörpers beibehalten. Brust-Carcinom-Gewebeschnitte wurden mit dem Überstand von Zellen, die mit dem humanisierten HuBrE3 V1-Antikörper transfiziert waren, unter Verwendung der Vectastain ABC-Methode gefärbt (Vector Labs, Burlingame, CA). Beide Antikörper zeigten starke Färbungsmuster.
Die folgende Tabelle 57 zeigt die Ergebnisse der Immunperoxidase-Färbung von fünf humanen Brust-Carcinomen, entweder mit dem Standard-Maus-BrE-3, oder mit dem halbhumanisierten HuBrE3 V1-Antikörper. Beide färbten dieselben Gewebe zu einem vergleichbaren Grad.
Tabelle 57: Immunperoxidase-Färbung von humanen Brust- Carcinom-Gewebsschnitten mit Maus- und halb-humanisierten BrE-3-Antikörpern
Beispiel 82: Hybridomzellen-Hinterlegungen Die folgenden Zelllinien wurden als vorliegende Beispiele der besten Ausführungsform der Erfindung hinterlegt. Die Hybridom-Zelllinien, die die vollständigen chimären Maushumanen BrE-3- und Anti-KC-4-Antikörper und den vollständig humanisierten BrE-3-Antikörper exprimieren, wurden bei der ATCC am 13. November 1992 unter dem Budapester Abkommen hinterlegt und erhielten die Zugangsnummern HB 11199 (chimärer BrE-3 A1C10), HB 11201 (chimärer Anti-KC-4 1E8) und HB 11200 (humanisierter BrE-3 A1C10). Die Hybridom-Zelllinie, die den humanisierten Anti-KC-4-Antikörper exprimiert, wurde bei der ATCC am 23. September 1993 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer HB 11455 (humanisierter HuKC-4 V2). Die halb-chimären/halb-humanisierten Antikörper-Zelllinien, die bei der ATCC hinterlegt wurden, sind die folgenden: ATCC Nr. HB 11454 (leichte humanisierte/schwere chimäre Ketten, HuKC-4V1) und ATCC Nr. HB 11456 (schwere humanisierte/leichte chimäre Ketten, HuKC-4V3) wurden am 23. September 1993 unter dem Budapester Abkommen als Beispiele der besten Ausführungsform der Erfindung, die den Erfindern bekannt ist, hinterlegt.

Claims

Modifizierter Antikörper oder Fragment davon, der/das selektiv an humanes Milchfettkügelchen (HFMG)-Antigen bindet, dadurch gekennzeichnet, dass er/es – nicht-Antigen-bindendes Peptid des Menschen und – HMFG-Antigen-bindendes Peptid, das die leichte und die schwere Kette der variablen Region eines Antikörpers einer anderen Art umfasst, wobei mindestens eine Kette des nicht-HMFG-Antigen-bindenden Peptids mit dem HMFG-Antigen-bindenden Peptid verbunden ist, und wobei die leichte Kette der variablen Region des Antikörpers die Aminosäuresubstitutionen S, T, P, E, P, P, G und V an den Positionen 7, 14, 15, 17, 18, 40, 68 bzw. 83 umfasst; und/oder wobei die schwere Kette der variablen Region des Antikörpers die Aminosäuresubstitutionen Q, V, R, G, T, N, A und S an den Positionen 3, 5, 19, 42, 77, 82, 88 bzw. 113 umfasst, umfasst, oder dessen Einzelkette.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass das HMFG-Antigen-bindende Peptid die leichte Kette und/oder die schweren Ketten der variablen Region eines Antikörpers umfasst, der von einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID No.: 64 und SEQ. ID No.: 65 codiert wird, und dass das nicht-HMFG-Antigen-bindende Peptid die leichten und schweren Ketten einer konstanten Region eines humanen Antikörpers umfasst, wobei die Ketten an einer anderen Stelle als der HMFG-Antigen-Bindestelle miteinander verbunden sind.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette der variablen Region eines Antikörpers den SEQ: ID Nos: 67 bis 73, miteinander wie in Tabelle 47 aufgezeigt verbunden, entspricht, wobei die Kette mit der leichten Kette einer konstanten Region eines humanen Antikörpers an einer anderen Stelle als der HMFG-Antigen-Bindestelle verbunden ist.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach Anspruch 3 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette der variablen Region eines Antikörpers SEQ. ID No: 13 entspricht, wobei die Kette mit der schweren Kette einer konstanten Region eines humanen Antikörpers an einer anderen Stelle als der HMFG-Antigen-Bindestelle verbunden ist.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette der variablen Region eines Antikörpers den SEQ. ID Nos: 75 bis 81, miteinander wie in Tabelle 47 aufgezeigt verbunden, entspricht, wobei die Kette mit der schweren Kette einer konstanten Region eines humanen Antikörpers an einer anderen Stelle als der HMFG-Antigen-Bindestelle verbunden ist.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach Anspruch 5 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette der variablen Region eines Antikörpers SEQ. ID No: 11 entspricht, wobei die Kette mit der leichten Kette einer konstanten Region eines humanen Antikörpers an einer anderen Stelle als der HMFG-Antigen-Bindestelle verbunden ist.
Modifizierter Antikörper, Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder dessen Einzelkette, dadurch gekennzeichnet, dass er/es aus der Gruppe bestehend aus dem Antikörper, der von der Hybridomzelle ATCC No. HB 11200 exprimiert wird; dem Antikörper, der die variable Region der leichten Kette umfasst, die von der Hybridomzelllinie ATCC No. HB 10028 exprimiert wird, dem Antikörper, der die variable Region der schweren Kette umfasst, die von der Hybridomzelllinie ATCC No. HB 10028 exprimiert wird, dem Antikörper, der die variable Region der schweren Kette oder die variable Region der leichten Kette umfasst, die von der Hybridomzelle ATCC HB 11200 exprimiert werden, ausgewählt wird, und deren Fab-, Fab'- oder (Fab')₂- Fragmente.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie den modifizierten Antikörper, das Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder dessen Einzelkette und einen nicht proteolytischen Träger umfasst.
Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nucleinsäure umfasst, die den modifizierten Antikörper, das Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder dessen Einzelkette codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nucleinsäure in Form von DNA oder RNA umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – der Nucleinsäure, die den modifizierten Antikörper Fab-Fab'- oder (Fab')₂- Fragmente, die von der Hybridomzelle ATCC No. HB 11200 exprimiert werden, codiert, – der Nucleinsäure, die einen Antikörper codiert, der die variable Region der leichten Kette umfasst, die von der Hybridomzelllinie ATCC No. HB 10028 exprimiert wird, und – der Nucleinsäure, die einen Antikörper codiert, der die variable Region der schweren Kette umfasst, die von der Hybridomzelllinie ATCC No. HB 10028 exprimiert wird.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Polynucleotid nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 und einen nicht-lytischen Träger umfasst.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er das Polynucleotid nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, funktionell mit ihm verbunden, umfasst.
Wirtszelle, transfiziert mit einem Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Polynucleotid nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 und dem Vektor nach Anspruch 12.
Hybridpolymer, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen modifizierten Antikörper, eine Einzelkette davon oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und mindestens einen Effektor, der aus der Gruppe bestehend aus Markern, nicht-peptidischen und peptidischen Monomeren und Polymeren mit Ausnahme der konstanten Region eines Antikörpers derselben Art ausgewählt wird, wobei der Effektor funktionell mit dem Peptid verbunden ist, oder Mischungen davon, umfasst.
Anti-Carcinom-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Hybridpolymer nach Anspruch 14 und einen Träger umfasst.
Anti-Carcinom-Therapie-Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er die Anti-Carcinom-Zusammensetzung nach Anspruch 15 in pharmazeutisch annehmbarer Form und Anleitungen zu deren Verwendung umfasst.
Verwendung eines modifizierten Antikörpers oder einer Einzelkette oder eines Fragmentes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels, das verwendbar ist: – beim Feststellen der Anwesenheit von Carcinomzellen in einem Gewebe, indem es mit einem Gewebe, von dem angenommen wird, dass es Carcinomzellen enthält, in Kontakt gebracht wird, und dem analogen Peptid erlaubt wird, jedes Antigen zu binden, das mit Carcinomzellen assoziiert ist, die in dem Gewebe anwesend sind, um einen Komplex aus analogem Peptid und Zellantigen zu bilden; und durch Nachweisen der Anwesenheit von gebildeten Komplexen; oder – bei der Diagnose eines Neoplasmas durch Vergleichen der ermittelten Ergebnisse mit einem Standard-Grenzwert, der durch Vergleichen der Ergebnisse, die für normale und Carcinom-Proben ermittelt wurden, bestimmt wurde, wobei ein Ergebnis oberhalb des Grenzwertes diagnostisch für ein Neoplasma ist; oder – bei der Diagnose eines Neoplasmas, indem man es in Anwesenheit eines an einen Feststoff gebundenen Antigenmoleküls, das durch den modifizierten Antikörper selektiv gebunden wird, mit einer von einem Versuchsobjekt erhaltenen biologischen Probe in Kontakt bringt, und die Bildung eines Komplexes aus einem fest gebundenen modifizierten Antikörper und einem Antigenmolekül und von Komplexen aus modifiziertem Antikörper und Probenantigen mit jedem Carcinomzell-Antigen, das in der Probe anwesend ist, zulässt; indem man jeden Komplex, der zwischen dem modifizierten Antikörper und dem an einen Feststoff gebundenen Carcinom-Antigen gebildet wurde nachweist; und die ermittelten Ergebnisse mit einem Standard-Grenzwert vergleicht; oder – bei der in vivo-Abbildung eines Neoplasmas, gegebenenfalls in radioaktiv-markierter Form, indem es einem Versuchsobjekt, von dem vermutet wird, dass es primäres oder metastasierendes Neoplasma hat, verabreicht wird; indem dem Antikörper erlaubt wird, das Neoplasma zu erreichen und daran zu binden; und durch Nachweisen jeder Bindung des markierten modifizierten Antikörpers an das Antigen, das auf der Oberfläche oder im Zytoplasma der neoplastischen Zellen anwesend ist; besonders nützlich – bei der in vivo-Diagnose eines Neoplasmas bei einem Versuchsobjekt durch Vergleichen der ermittelten Ergebnisse mit einem Standardgrenzwert, der durch Vergleichen der Ergebnisse, die für normale und neoplastische Proben ermittelt wurden, bestimmt wurde, und Auswählen eines Ergebnisses oberhalb des Grenzwertes als diagnostisch für ein Neoplasma.
Ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Antikörpers, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Stufen a) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Vektor nach Anspruch 12 und Zulassen der Expression des modifizierten Antikörpers und b) Isolieren des modifizierten Antikörpers, oder der Einzelkette, des Fragmentes, oder Mischungen davon, umfasst.
Ein Anti-Idiotyp-Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Antikörper, ein Antikörperfragment, oder Kombinationen davon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: polyklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, CDRs, Fab, Fab', (Fab')₂, oder variable Regionen davon, erzeugt gegen den modifizierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, Kombinationen davon mit einem Oligopeptid, das die Aminosäuresequenz ARDTRPAPG oder Fragmente davon, die das TRP-Trimer, Hexamere davon, die das TRP-Trimer umfassen, oder Tandem-Repeats davon, umfassen, wobei jedes analoge Peptid funktionell mit mindestens einem anderen analogen Peptid verbunden ist, und Mischungen davon.