CN105263953B - 猪细小病毒5a、使用方法及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供新颖核苷酸序列、蛋白质序列、免疫原性组合物、疫苗以及关于制造及使用新型猪细小病毒5A(PPV5A)之方法，该猪细小病毒5A尤其感染驯养猪。该等组合物及方法提供由该新型病毒所致之感染之检测、监测野生及驯养动物以及畜群中病毒序列之遗传性变化，以及制造及使用新颖疫苗来保护动物免受病毒感染。

Description

猪细小病毒5A、使用方法及疫苗

序列表

本申请案含有根据37C.F.R.1.821-1.825之序列表。本申请案之随附序列表以全文引用的方式并入本文中。2013年3月21日建立之该ASCII复本系命名为10-0150-PCT-SEQ.txt且大小为34,542字节。

技术领域

本发明属于动物健康领域且涉及新猪细小病毒株(包括用于接种之减毒病毒株)、制造方法及使用自该新颖细小病毒株获得之疫苗之治疗方法。

背景技术

细小病毒感染多种动物物种，且其中一些可引起严重临床疾病，但大部分该等病毒仅引起轻度或亚临床感染。其属于细小病毒科(Parvoviridae)且形成两个亚科：浓核病毒亚科(Densovirinae)，其成员感染昆虫；及细小病毒亚科(Parvovirinae)，其成员感染脊椎动物。后一亚科当前包括五个属：依赖病毒属(Dependovirus)、红病毒属(Erythrovirus)、阿留申水貂病毒属(Amdovirus)、博卡病毒属(Bocavirus)及细小病毒(1)(Parvovirus(1))。

细小病毒病毒粒子为非包膜型且含有约5-6千碱基(kilobases；kb)之单股、线性DNA基因组。基因组由两个主要开放阅读框架(ORF)组成，该两个主要开放阅读框架编码非结构及衣壳蛋白。最近描述之博卡病毒在两个主要ORF之间携带第三个ORF(1)。

细小病毒属中之经典猪细小病毒(PPV1)株在全世界广泛分布且可引起猪之生殖性障碍，尤其在接种方案未正确进行或疫苗功效由于免疫抑制因子而降低之畜群中。在最近十年期间，已在猪中检测到多种新型细小病毒。该等细小病毒包括猪细小病毒2(PPV2)(2)及相关病毒(3)。在香港鉴定一组新型猪及牛细小病毒，亦即胡可病毒(hokoviruses)(PHoV，BHoV)(4)，且发现该等病毒在遗传学上与人类PARV4及PARV5类似。尽管其最初以香港命名为胡可病毒，但提出将PHoV新型分类为PPV3(5)。PPV4展示与牛细小病毒2之最高相似性，但编码能力及基因组组构与博卡病毒类似，因为PPV4与博卡病毒类似地编码位于ORF1与ORF2之间的额外ORF3。然而，PPV4编码之推定ORF3蛋白与博卡病毒编码之蛋白质显著不同(5)。

仍需要监测猪中新型病毒之出现及研发关于新型病毒之疫苗、治疗及检测方法。

发明内容

本发明提供新颖核苷酸序列、蛋白质序列、免疫原性组合物、疫苗以及关于制造及使用新型细小病毒株之方法，该等新颖细小病毒株尤其感染驯养猪。该等病毒株涉及在来自临床患病之驯养猪之组织样品中鉴定的新颖猪细小病毒；基于与已知猪细小病毒物种及病毒株之序列同源性，该新颖病毒命名为猪细小病毒5A或PPV5A。

本发明之组合物及方法使得检测由该新型病毒所致之感染、监测野生及驯养动物以及畜群中病毒序列之遗传性变化，以及制造及使用新颖疫苗来保护动物免于病毒感染。

本发明之免疫原性组合物及疫苗包含由SEQ ID NO:1之核酸序列编码之多肽序列，或其免疫原性片段，可选地包括用于诱导更强免疫原性反应的佐剂。

本发明之例示性组合物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4之多肽序列或其对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之片段中之任一者。本发明之较佳多肽包括SEQID NO:2或SEQ ID NO:4之序列，尤其SEQ ID NO:4。较佳地，该等多肽或其片段对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性。

在另一方面中，本发明提供编码一或多种多肽、抗体构建体或抗体缀合物之核酸序列。编码多肽之基因序列包含与SEQ ID NO:1之序列至少95％、90％、85％或甚至80％同源及/或相同的核酸序列，详言之，SEQ ID NO:1(衣壳蛋白)之核苷酸序列2845-5547，或SEQID NO:1中编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肽的片段。本发明之例示性核酸序列包括SEQ ID NO:1之核苷酸1975-2844及SEQ ID NO:1之核苷酸2845-5547之序列，及其编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肽的片段之序列中之任一者。较佳地，核酸序列或基因为编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肽或肽的核酸序列或基因。

此外，如本文中所用之本发明之多肽包括(但不限于)包含以下之多肽：

i)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的多肽；

ii)与i)之多肽至少80％同源及/或相同之多肽；

iii)i)及/或ii)之多肽之片段；

iv)iii)或iv)之片段，其包含至少5个、较佳8个、更佳10个、甚至更佳15个包括于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之序列中之连续氨基酸；

v)由多核苷酸编码之多肽，该多核苷酸包含SEQ ID NO:1之核苷酸1975-2844或SEQ ID NO:1之核苷酸2845-5547的序列；

vi)由与vi)之多核苷酸至少80％同源或相同之多核苷酸编码之多肽；

vii)由多核苷酸编码之蛋白质片段，该多核苷酸包含至少15个、较佳24个、更佳30个、甚至更佳45个包括于SEQ ID NO:1之核苷酸1975-2844或SEQ ID NO:1之核苷酸2845-5547之序列中之连续核苷酸。

本发明之免疫原性组合物包含至少一或多种如本文中定义之PPV5A多肽，可进一步包含生理学上可接受之媒介物，诸如医药学上或兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。

由此提供之任何PPV5A多肽或包含由此提供之该等PPV5A多肽中一或多者之任何免疫原性组合物均可用作药物，较佳用作疫苗或免疫原性组合物，最佳用于对象针对PPV5A感染之预防或治疗。

尤其较佳PPV5A多肽包括具有免疫原性表位之多肽，该等免疫原性表位诱导对PPV5A具有特异性之免疫学反应。较佳PPVA多肽包括具有在相关PPV1中被预测为表面抗原之氨基酸序列的多肽(Simpson等人,JMB 315,2002)且包括(但不限于)SEQ ID NO:4之残基141-156、272-278及329-339。

本领域技术人员将理解，本文中使用之组合物可合并有已知可注射、生理学上可接受之无菌溶液。对于制备供非经肠注射或输注之即用型溶液，可轻易地使用等张水溶液，例如生理食盐水或血浆蛋白溶液。此外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括兽医学可接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。

本发明之方法包括(但不限于)在对象中引起针对PPV5A感染之免疫反应的方法，其包含向对象施用包含一或多种如本文中定义之PPV5A多肽之免疫原性组合物的步骤。较佳地，针对PPV5A之大于一种血清型或病毒株引起免疫反应。本发明之组合物可用于治疗或者预防PPV5A感染。较佳地，该免疫反应降低与一或多种PPV5A血清型之感染相关或由一或多种PPV5A血清型之感染引起之一或多种临床病征之发病率或严重性。

本文中，需要接受本发明之组合物之施用的合适对象包括需要预防或治疗与病毒、微生物、寄生物、原虫、细菌或真菌有关之感染、疾病或病状的动物。藉由使用本发明之组合物或方法来刺激免疫反应之动物包括家畜，诸如猪、牛、家禽(例如鸡、鸭、鹅或火鸡)、山羊及绵羊；及驯养动物，诸如小鼠、兔、犬、猫及马。较佳动物包括猪、鼠科动物、马科动物、兔类动物及牛科动物。最佳在猪中刺激免疫反应。

本发明亦提供降低与PPV5A感染相关或由PPV5A感染引起之一或多种临床病征之发病率或严重性的方法，其包含施用本发明之免疫原性组合物之步骤，该免疫原性组合物包含一或多种由此提供之PPV5A肽且较佳包含载体分子，使得与未接受由此提供之免疫原性组合物的对象相比，PPV5A感染之临床病征之发病率或严重性降低至少10％，较佳至少20％，更佳至少30％，更佳至少50％，更佳至少70％，最佳至少100％。该等临床病征包括由单独PPV5A感染引起之病毒血症及免疫抑制。该等临床病征可包括神经病学病征(抑郁症、共济失调、嗜睡)、腹泻、呼吸困难、体况损失、关节肿胀(引起跛行及仰卧)、平均每日体重增加降低、死亡及由与另一生物体(例如猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis))之合并感染引起之多发性浆膜炎。

根据另一方面，本发明亦涉及预防PPV5A感染之方法，其中该PPV5A感染可由与SEQID NO 1、2、3及/或4之核苷酸序列具有100％序列相同性、与SEQ ID NO 1、2、3及/或4之核苷酸序列具有至少95％序列相同性、与SEQ ID NO 1、2、3及/或4之核苷酸序列具有至少90％序列相同性或与SEQ ID NO 1、2、3及/或4之核苷酸序列具有至少85％序列相同性的PPV5A引起，该方法包含施用本发明之免疫原性组合物之步骤，该免疫原性组合物包含一或多种由此提供之PPV5A肽。

本发明亦提供制备由此提供之任何免疫原性组合物之方法，该方法包含将一或多种由此提供之PPV5A肽与载体分子混合，较佳使得该一或多种PPV5A肽及载体分子彼此共价偶合或缀合。该等缀合物可为多价或单价的。多价组合物或疫苗包括多种PPV5A肽与载体分子之免疫结合。在另一方面中，本发明提供制造一或多种PPV5A肽之方法，该方法包含用编码由此提供之任何PPV5A肽的核酸分子转化宿主细胞(较佳为原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli))。或者，宿主细胞可为真核细胞，诸如动物细胞、昆虫细胞、原生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。较佳地，真核细胞为哺乳动物细胞，诸如CHO、BHK或COS；或真菌细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆虫细胞，诸如Sf9。本发明核酸之杆状病毒(Baculovirus)表达亦为较佳。

本发明之另一方面提供制造一或多种PPV5A肽之方法，该一或多种PPV5A肽诱导针对至少一种PPV5A遗传变体且更佳两种或两种以上PPV5A遗传变体之免疫反应。此方法包含培养经转化之表达载体，该经转化之表达载体编码及表达一或多种本文中揭示之PPV5A肽。经表达之蛋白质由表达生物体保留或分泌至培养基中。表达系在足以产生能够诱导针对PPV5A之免疫反应的PPV5A肽之条件下进行。PPV5A血清型(PPV5A肽诱导针对其之免疫反应)包括(但不限于)具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同性之序列。

制造本发明之组合物之方法可进一步包含将一或多种PPV5A肽与载体分子之缀合物与生理学上可接受之媒介物(诸如医药学上或兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合)混合。本领域技术人员将认识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人偏好及动物物种决定。

在另一方面中，本发明提供诊断对象中之PPV5A感染之方法。该方法包含提供一或多种PPV5A肽；使该一或多种PPV5A肽与自对象获得之样品接触；及若在样品中检测到能够结合一或多种PPV5A肽之抗体，则鉴定对象患有PPV5A感染。

在另一方面中，本发明提供确定对象先前已暴露于PPV5A感染且能够表达针对PPV5A之免疫反应的方法。该方法包含提供一或多种PPV5A肽；使该一或多种PPV5A肽与自对象获得之样品接触；及若在样品中检测到能够结合一或多种PPV5A肽之抗体，则鉴定对象患有PPV5A感染。

本发明亦提供包含免疫原性组合物之试剂盒，该免疫原性组合物包含一或多种PPV5A肽，较佳连同载体分子一起；用于封装免疫原性组合物之容器；一组印刷说明书；及能够将免疫原性组合物施用动物之施配器。可选地，一或多种PPV5A肽及载体分子可以缀合物形式或以各别化合物形式被封装。当分开供应时，亦供应使一或多种PPV5A肽与载体分子缀合之构件以及适当印刷说明书。

本发明亦提供用于对动物进行接种之试剂盒，其包含一组印刷说明书；能够将由此提供之包含一或多种PPV5A肽之免疫原性组合物施用至动物之施配器；且其中至少一种PPV5A肽有效地使动物对至少一种与PPV5A感染相关之疾病免疫。较佳地，该一或多种PPV5A肽系选自由此提供之PPV5A肽。本发明之试剂盒可进一步包含兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。

本发明之试剂盒中之施配器能够将其内含物以液滴形式施配；且当经鼻内、经口、皮内或肌肉内施用动物时，试剂盒中所包括之包含由此提供之PPV5A肽的免疫原性组合物能够降低PPV5A感染之至少一种临床病征之严重性。较佳地，与未经治疗之受感染动物相比，临床病征之严重性较佳降低至少10％，较佳至少20％，更佳至少30％，更佳至少50％，更佳至少70％，最佳至少100％。

亦揭示用于治疗或预防由PPV5A引起之感染的方法。该方法包含向对象施用有效量之本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防系选自由以下组成之群：减少PPV5A感染之病征、降低PPV5A感染之临床病征之严重性或发病率、降低由PPV5A感染引起之对象死亡率及其组合。

本发明之组合物进一步包含兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。该等组合物可用作疫苗且包含一或多种额外减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。该等疫苗引起针对至少一种与选自由以下组成之群之病毒相关的疾病之保护性免疫学反应：猪细小病毒1、2、3、4、5A、5B、其它猪细小病毒种、其它猪病原性病毒及细菌及其组合。可与针对PPV5A之疫苗组合共施用之其它类型之疫苗包括(但不限于)2型猪环状病毒(例如

CircoFLEX、

CircoFLEX-MycoFLEX)、猪生殖性及呼吸症候群病毒(例如

PRRS ATP、

PRRSV MLV)、猪细小病毒(例如

PRRSV-PLE)、支原体(例如

MycoFLEX)等。

本领域技术人员将理解，本文中使用之组合物可合并有已知可注射、生理学上可接受之无菌溶液。对于制备供非经肠注射或输注之即用型溶液，可轻易地使用等张水溶液，例如生理食盐水或血浆蛋白溶液。此外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括医药学上或兽医学可接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。

本发明之方法亦可包含将本发明之组合物与兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合混合。本领域技术人员将认识到载剂、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人偏好及动物物种决定。

本发明亦提供藉由向动物施用组合物来降低动物中进行性PPV5A感染之严重性的方法。组合物可包括减毒病毒培养物或一或多种PPV5A肽与可接受之兽医学载剂之组合。

较佳施用途径包括经鼻内、经口(例如于饮用水中)、皮内及肌肉内。较佳为肌肉内施用，最佳以单次剂量形式。本领域技术人员将认识到，本发明之组合物亦可以两次或两次以上剂量施用以及藉由其它施用途径施用。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、小叶内、髓内、肺内或阴道内。视治疗之所需持续时间及有效性而定，本发明之组合物可施用一次或数次，亦可间歇地施用，例如在数天、数周或数月内每天及以不同剂量施用。

本发明亦提供用于对动物进行接种之试剂盒，其包含一组印刷说明书；能够将疫苗施用动物之施配器；及至少一种来自细胞培养物(包括但不限于细菌、真菌、昆虫或哺乳动物细胞培养物)之分离株，其有效地使动物对至少一种与PPV5A、其它细小病毒株、其它病原体及/或其组合相关之疾病免疫。本发明之试剂盒可进一步包含兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。

本发明之试剂盒中之施配器能够将其内含物以液滴形式施配；且当经鼻内、经口、皮内或肌肉内施用动物时，试剂盒中所包括之分离株能够降低PPV5A感染之至少一种临床病征之严重性。在一些试剂盒中，分离株亦能够降低PPV5A感染之至少一种临床病征之严重性。较佳地，与未经治疗之受感染动物相比，临床病征之严重性降低至少10％。

本发明之其它目标、特征及优点将由以下详细描述变得显而易见。然而，应理解，尽管指示本发明之较佳实施例，但详细描述及特定实施例系仅作为说明提供，因为本领域技术人员将自该详细描述明白本发明之精神及范畴内的各种变化及修改。

附图说明

以下附图形成本说明书之一部分，且包括该等附图以进一步说明本发明之某些方面。可藉由参考此等附图中之一或多者，组合本文中提供之特定实施例之详细描述更好地理解本发明。本申请案含有至少一张以彩色制成之图。本专利申请公开案之具有彩色附图之复本将由事务所在有需要及支付必需费用后提供。

图1为PPV5A(SEQ ID NO:1)之核酸序列。

图2为PPV5A复制酶(SEQ ID NO:2)之蛋白质序列。

图3为PPV5A开放阅读框(ORF)蛋白质(SEQ ID NO:3)之蛋白质序列。

图4为PPV5A衣壳蛋白(SEQ ID NO:4)之蛋白质序列。

图5为PPV5A衣壳蛋白之蛋白质序列及许多其它病毒序列之成对氨基酸相同性比较。

关于病毒序列之参考文献列举于表1中：

表1

图6展示与表1中列举之其它病毒VP1及衣壳蛋白相比，PPV5A之VP1/CAP区域之系统发生分析(phylogenetic analysis)。

图7展示PPV5A衣壳蛋白(SEQ ID NO:4之残基55-792)与最密切相关的PPV4蛋白(GenBank编号AFM73871(SEQ ID NO:5))之相同性，其展示40％(310/774)序列相同性。

图8展示PPV5A复制酶蛋白(SEQ ID NO:2之残基15-516)与最密切相关的PPV4蛋白(GenBank编号ADB20210(SEQ ID NO:11))之相同性，其展示58％(292/504)序列相同性。

具体实施方式

本发明提供与本文中所揭示之新颖猪细小病毒5A及其变体有关之核酸及其片段、多肽及其免疫学有效片段、疫苗、免疫学有效制剂、抗体、诊断分析法及试剂盒，以及制造及使用该等组合物及制剂之方法。

除非另外指示，否则本发明之实践将使用本领域内已知的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学之常规技术。该等技术已在文献中充分说明。参见例如Sambrook,Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第I、II及III卷,第二版(1989)；DNA Cloning,第I及II卷(D.N.Glover编1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins编1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL出版社,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology系列(S.Colowick及N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Proteinpurification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal编,IRL Press,Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编,1986,Blackwell Scientific Publications)。

在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于特定DNA、多肽序列或制程参数，因而该等序列或参数当然可变化。亦应理解，本文中所用之术语系仅出于描述本发明之特定实施例之目的且不意欲具限制性。必须注意，除非本文明确地另外指示，否则如本说明书及随附申请专利范围中所使用，单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个指示物。因此，举例而言，对“一抗原”之提及包括两种或两种以上抗原之混合物，对“一赋形剂”之提及包括两种或两种以上赋形剂之混合物，及其类似情况。

A.定义

除非另有定义，否则在提交申请时，本文中使用之所有技术及科学术语具有与本领域技术人员通常所理解相同之含义。术语之含义及范畴应清楚；然而，若存在任何潜在歧义，则本文中提供之定义优先于任何词典或非固有定义。此外，除非本文另有要求，否则单数术语应包括复数形式且复数术语应包括单数形式。本文中，除非另有说明，否则“或”之使用意谓“及/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式(诸如“包括(includes)”及“包括(included)”)之使用不具有限制性。本文中提及之所有专利及公开案均以引用的方式并入本文中。

“针对疾病之保护”、“保护性免疫性”、“功能性免疫性”及类似短语意谓藉由施用一或多种本发明之治疗性组合物或其组合而产生之针对疾病或病状之反应，其引起的有害作用与已暴露于疾病或感染之未经免疫之对象中所预期相比较少。亦即，经接种之对象中感染之有害作用之严重性降低。在经接种之对象中，可降低、减缓或可能完全预防感染。本文中，当意谓完全预防感染时，其将特定说明。若未说明完全预防，则该术语包括部分预防。

本文中，“降低临床病征之发病率及/或严重性”或“减少临床症状”意谓(但不限于)与野生型感染相比，降低群体中受感染对象之数目、降低或消除呈现感染之临床病征之对象的数目或降低一或多个对象中存在之任何临床病征之严重性。举例而言，其应指任何病原体负荷降低、病原体脱落、病原体传播减少或PPV5A感染之任何临床症状性病征减少。较佳地，与未接受组合物且受到感染之对象相比，一或多个接受本发明之治疗性组合物之对象中该等临床病征减少至少10％。更佳地，接受本发明之组合物之对象中临床病征减少至少20％，较佳至少30％，更佳至少40％且更佳至少50％。

术语“增加之保护”在本文中意谓(但不限于)与未经接种之对象对照组相比，经接种之对象组中与感染物(较佳为PPV5A)感染有关之一或多种临床症状显著减少。术语“临床症状显著减少”意谓(但不限于)在攻击感染物后，与未经接种之对照组相比，经接种之对象组中至少一种临床症状之发病频率降低至少10％，较佳20％，更佳30％，更佳50％且更佳70％。

“长效保护”应指“改良之功效”，其持续至少3周，但更佳至少3个月，更佳至少6个月。在家畜情况下，最佳为长效保护应持续至动物达到出售其肉品之平均年龄。

“免疫原性或免疫组合物”系指包含至少一种PPV5A蛋白质或多肽或其免疫原性部分之目标组合物，其引起细胞或抗体介导之针对该组合物之免疫反应之宿主中之免疫学反应。在本发明之较佳实施例中，免疫原性组合物诱导针对PPV5A感染之一或多种临床病征之免疫反应且更佳赋予保护性免疫。

如本文中所用之“免疫原性”PPV5A多肽或“抗原”系指引起本文中所描述之免疫学反应之多肽或蛋白质。“免疫原性”PPV5A蛋白质或多肽包括本文中鉴定之任何编码序列之全长序列或其类似物或免疫原性片段。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”系指PPV5A蛋白质之氨基酸序列之片段或经截短及/或经取代形式，其包括一或多个表位且因此引起本文中所描述之免疫学反应。通常，该等经截短及/或经取代形式或片段将包含或编码至少六个来自全长蛋白(例如衣壳蛋白)之连续氨基酸。更佳地，经截短或经取代形式或片段将具有至少10个，更佳至少15个，且更佳至少19个，且更佳30个来自全长蛋白(例如衣壳蛋白)之连续氨基酸。

术语“表位”意谓目标组合物例如蛋白质或多肽之区段或片段，其由免疫系统识别，特定地由抗体、B细胞或T细胞识别。在本发明中，表位通常为病毒蛋白之多肽序列之一或多个片段。

该等片段可使用现有技术中熟知的多种表位作图技术鉴定。参见例如EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可藉由在固体支撑物上同时合成大量的肽(该等肽对应于蛋白质分子之某些部分)且在该等肽仍附着至支撑物时使肽与抗体反应来确定。此项技术已知且描述在现有技术中，参见例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，可藉由确定氨基酸之空间构象(诸如藉由例如x射线结晶学及二维核磁共振)而容易地鉴定构象表位。参见Epitope Mapping Protocols,见上文。该定义内亦包括合成抗原，例如多表位、侧接表位及其它重组或以合成方式衍生之抗原。参见例如Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人,(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,6月28日-7月3日,1998(其教示及内容均以引用的方式并入本文中)。

“免疫反应”或“免疫学反应”意谓(但不限于)发展细胞及/或抗体介导之针对相关组合物或疫苗之免疫反应。通常，免疫或免疫学反应包括(但不限于)以下作用中之一或多者：抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞及/或细胞毒性T细胞之产生或活化，其特定地针对相关组合物或感兴趣疫苗中所包括之抗原。较佳地，宿主将显示治疗性或保护性免疫学(记忆)反应，使得对新型感染之抗性将增强及/或疾病之临床严重性降低。该保护将由症状数目、症状严重性降低；或不存在与病原体感染有关之一或多种症状；病毒血症发作延迟；病毒续存性降低；总体病毒负荷降低及/或病毒排出降低证明。

本文中，“特定免疫反应性”系指免疫反应性蛋白质或多肽，其识别PPV5A感染之抗原特征，但不与严格攻击对照物之抗原特征反应。为确定潜在PPV5A免疫反应性蛋白质或其它多肽之特异性，将针对含有遗传上类似病毒之动物血清使用多种免疫分析法(ELISA、IFA、西方墨点法(WesternBlot))测试蛋白质。亦将针对含有与表达方法相关之蛋白质的物质(杆状病毒、Sf9细胞等)在多种免疫分析法中测试蛋白质。

如本文中所用，“医药学上或兽医学上可接受之载剂”或“赋形剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂及其类似物。在一些较佳实施例中且尤其在包括冻干免疫原性组合物之实施例中，用于本发明之稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥之稳定剂。

在一些实施例中，本发明之免疫原性组合物含有佐剂。如本文中所使用之“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂苷(例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基于以下物质：轻液态石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)类型)；诸如角鲨烷或角鲨烯之类异戊二烯油；由烯烃、尤其异丁烯或癸烯之寡聚合产生之油；含有直链烷基之酸或醇之酯，更尤其为植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支链脂肪酸或醇之酯，尤其为异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂较佳为非离子性界面活性剂，尤其为可选地经乙氧基化之脱水山梨糖醇酯、二缩甘露糖醇酯(例如去水甘露糖醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，尤其为Pluronic产品，特别为L121。参见Hunter等人,The Theory andPractical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley andSons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人,Vaccine15:564-570(1997)。例示性佐剂为“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”,M.Powell及M.Newman编,Plenum Press,1995之第147页中描述之SPT乳液及同一本书之第183页中描述之乳液MF59。

佐剂之另一实施例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及顺丁烯二酸酐与烯基衍生物之共聚物之化合物。有利之佐剂化合物为尤其与糖或多元醇之聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物藉由术语卡波姆(carbomer)而为人所知(Phameuropa第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基、较佳不超过8个羟基之多羟基化化合物交联之该等丙烯酸聚合物，至少三个羟基之氢原子经具有至少2个碳原子之不饱和脂族基团置换。较佳基团为含有2至4个碳原子之基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和基团。该等不饱和基团本身可含有诸如甲基之其它取代基。以名称卡波莫(Carbopol)出售之产品(BF Goodrich,Ohio,USA)为尤其适合的。其与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中，可提及卡波莫974P、934P及971P。最佳为使用卡波莫971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物之共聚物中，有共聚物EMA(Monsanto)，其为顺丁烯二酸酐与乙烯之共聚物。此等聚合物在水中之溶解产生酸性溶液，其将经中和，较佳至生理学pH值以产生佐剂溶液，该佐剂溶液中将并入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身。

其它适合之佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)之热不稳定肠毒素(重组或其它方式)、霍乱毒素(cholera toxin)、IMS 1314或胞壁酰二肽，或天然存在或重组细胞激素或其类似物或内源性细胞激素释放刺激剂。

预期佐剂可以每剂约100μg至约10mg之量，较佳每剂约500μg至约5mg之量，更佳每剂约750μg至约2.5mg之量且最佳每剂约1mg之量添加。或者，以最终产物之体积计，佐剂可处于约0.01％至50％之浓度，较佳处于约2％至30％之浓度，更佳处于约5％至25％之浓度，更佳处于约7％至22％之浓度且最佳处于10％至20％之浓度。

“稀释剂”可包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等张剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之碱金属盐。

“经分离”意谓“藉由人工”自天然状态改变，亦即若其存在于自然界中，则其已自其初始环境发生变化或移出，或两者。举例而言，当该术语用于本文中时，天然存在于活生物体中之多核苷酸或多肽不“经分离”，但与其天然状态之共存物质分离的相同多核苷酸或多肽“经分离”。

“安全性”系指经接种之动物在接种后不出现不良后果，该等不良后果包括(但不限于)：活的基于病毒之疫苗可能逆转成毒性；显著临床副作用，诸如持续性、全身性疾病或疫苗施用位点处之不可接受之炎症。

如本文中所用之术语“接种(vaccination/vaccinating)”或其变体意谓(但不限于)一个过程，其包括施用本发明之免疫原性组合物，该免疫原性组合物在施用动物时引起或能够引起(直接或间接)动物中针对PPV5A之免疫反应。

在本发明之背景下，“死亡”系指由PPV5A感染及/或由PPV5A感染增强之与其它生物体之合并感染引起之死亡，且包括因感染过于严重而处死动物以免受苦及对其生命提供人道终结之情形。

“减毒”意谓降低病原体之毒性。在本发明中，“减毒”与“无毒性”同义。在本发明中，减毒病毒为其中毒性已降低使得其不引起PPV5A感染之临床病征，但能够诱导目标哺乳动物中之免疫反应的病毒，但亦可意谓与受到非减毒PPV5A感染且未接受减毒病毒之“对照组”动物相比，受到减毒PPV5A感染之动物中之临床病征之发病率或严重性降低。在此背景下，术语“降低(reduce/reduced)”意谓与如上文所定义之对照组相比降低至少10％，较佳25％，更佳50％，更佳60％，更佳70％，更佳80％，更佳90％且最佳100％。因此，减毒、非毒性PPV5A病毒株为适合并入包含经修饰之活PPV5A病毒之免疫原性组合物中的病毒株。

“杀死”或“灭活”意谓用物理或化学试剂处理，该物理或化学试剂使PPV5A病毒死亡及/或以其它方式使其不能再现。可藉由习知方法杀死PPV5A，例如加热、辐射或在紫外光存在下使用补骨脂素。可藉由习知方法使PPV5A灭活，例如使用一或多种化学灭活剂，包括但不限于二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯、福尔马林(formalin)、戊二醛及/或十二烷基硫酸钠中之一或多者进行化学灭活。使该等病毒之毒性病毒株减毒之方法及制造灭活病毒制剂之方法在此项技术中已知，且描述于例如U.S.4,567,042及4,567,043中。用于本发明之疫苗组合物中之来自PPV5A之抗原因此可尤其呈全病毒形式，全病毒为经修饰及/或减毒之活病毒制剂或经杀死或灭活之病毒制剂。

如本文中所用之“抗体”包括抗PPV5A抗体，例如单克隆及多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、猪抗体及CDR嫁接抗体，包括其中包括特定地识别本发明之PPV5A多肽之CDR序列的化合物。术语“对…具有特异性”指示本发明之抗体之可变区仅识别及结合PPV5A多肽(亦即能够区分单一PPV5A多肽与相关多肽，而无视在多肽家族中发现之序列相同性、同源性或相似性)，且允许(可选地)其经由与抗体之可变区外部(且详言之，在抗体分子之恒定区中)之序列相互作用而与其它蛋白质(例如金黄色葡萄球菌蛋白A(S.aureus protein A)或ELISA技术中之其它抗体)相互作用。用于测定本发明之抗体之结合特异性之筛选分析法已为本领域所熟知且在此项技术中按常规实践。关于该等分析法之综合论述，参见Harlow等人(编),Antibodies A Laboratory Manual:Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor,NY(1988),第6章。亦涵盖识别及结合本发明之PPV5A多肽之片段的抗体，前提为该等抗体首先且最先对衍生出该片段之本发明之PPV5A多肽具有如上文所定义之特异性。出于清楚目的，“抗体”系指免疫球蛋白分子，其由于针对特异性抗原之免疫反应而可结合于该抗原。免疫球蛋白为由“轻”多肽链及“重”多肽链构成之血清蛋白质，其具有“恒定”区及“可变”区且基于恒定区之组成而分类(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。抗体可以多种形式(包括例如Fv、Fab'、F(ab')2以及单链)存在，且包括合成多肽，其含有一或多个抗体单链多肽序列中之所有或一部分。

本文中，“有效剂量”意谓(但不限于)引起或能够引起免疫反应之抗原量，该免疫反应引起接受抗原施用之动物中之临床症状减少。

如本文中所用，在组合物之背景下，术语“有效量”意谓能够诱导免疫反应之免疫原性组合物的量，该免疫反应降低动物中疾病之感染或事件之发病率或减轻其严重性。特定言之，减毒活病毒制剂之有效量(如由每剂空斑形成单位(plaque forming unit；PFU)之数目或等效量度所测量)系利用半数组织培养感染剂量(TCID50)(亦即将引起50％经接种及敏感细胞培养物之病理变化的病原体的量)来监测。对于灭活之疫苗或抗原亚单位，有效量系指相对抗原含量(RAC)，亦即每个有效剂量中之抗原之包含量。或者，在疗法之背景下，术语“有效量”系指疗法之量足以降低或改善疾病或病症或其一或多种症状之严重性或持续时间、阻止疾病或病症发展、引起疾病或病症消退、预防与疾病或病症有关之一或多种症状之复发、发展、发作或进程，或增强或改良另一疗法或治疗剂之预防或治疗。

如此项技术中已知之“序列相同性”系指两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列(亦即参考序列与待与参考序列比较之既测序列)之间的关系。序列相同性系藉由在将既测序列与参考序列以最佳方式比对以产生最高程度之序列相似性之后比较该等序列来测定，其中序列相似性如藉由该等序列之串之间的匹配(必要时引入间隙)来测定。在该比对后，在位置对位置之基础上确定序列相同性，例如若在一特定位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则该等序列在该位置处“相同”。随后，将该等位置相同性之总数除以参考序列中核苷酸或残基之总数以产生序列相同性％。序列相同性可由已知方法容易地计算，包括(但不限于)以下文献中描述之方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编,Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysisof Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编,M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)；其教示以引用的方式并入本文中。测定序列相同性之较佳方法经设计以产生测试序列之间的最大匹配。在测定既测序列之间的序列相同性之公开可用之计算机程序中对用于测定序列相同性之方法编程。该等程序之实施例包括(但不限于)GCG程序套件(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可自NCBI及其它来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示以引用的方式并入本文中)。此等程序最佳使用预设间隙权数(default gap weight)比对序列以产生既测序列与参考序列之间的最高程度之序列相同性。作为说明，具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％、较佳90％、更佳95％“序列相同性”之核苷酸序列的多核苷酸意指，除既定多核苷酸序列与参考核苷酸序列之每100个核苷酸相比可能包括至多15个、较佳至多10个、更佳至多5个点突变外，既定多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、较佳90％、更佳95％相同性之核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中之至多15％、较佳10％、更佳5％之核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可将占参考序列中之总核苷酸之至多15％、较佳10％、更佳5％之多个核苷酸插入参考序列中。参考序列之此等突变可能发生在参考核苷酸序列之5'端位置或3'端位置处，或该等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列中之核苷酸间或参考序列内之一或多个连续基团中。类似地，具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％、较佳90％、更佳95％序列相同性之既定氨基酸序列的多肽意指，除既定多肽序列与参考氨基酸序列中之每100个氨基酸相比可能包括至多15个、较佳至多10个、更佳至多5个氨基酸改变外，多肽之既定氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、较佳90％、更佳95％之序列相同性之既定多肽序列，参考序列中之至多15％、较佳至多10％、更佳至多5％之氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可将占参考序列中之氨基酸残基总数之至多15％、较佳至多10％、更佳至多5％之多个氨基酸插入参考序列中。参考序列之此等改变可发生于参考氨基酸序列之氨基末端或羧基末端位置处或该等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列之残基间或参考序列内之一或多个连续基团中。较佳地，不相同之残基位置之不同在于保守氨基酸取代。然而，当测定序列相同性时，不包括保守取代作为匹配。

如本文中所用之“序列同源性”系指一种测定两个序列之相关性的方法。为测定序列同源性，将两个或两个以上序列以最佳方式比对且必要时引入间隙。然而，与“序列相同性”相反，保守氨基酸取代在测定序列同源性时亦视为匹配。换言之，为获得与参考序列具有95％序列同源性之多肽，参考序列中85％、较佳90％、更佳95％之氨基酸残基必须匹配或包含具有另一氨基酸之保守取代，或可将占参考序列中总氨基酸残基之至多15％、较佳至多10％、更佳至多5％之多个氨基酸(不包括保守取代)插入参考序列中。同源序列较佳包含至少一个具有50个、更佳100个、更佳250个、更佳500个编码同源氨基酸之核苷酸之延伸子。

“保守取代”系指氨基酸残基经具有类似特征或性质(包括尺寸、疏水性等)之另一氨基酸残基取代，使得整体功能性不显著改变。其亦可意谓引起保守氨基酸取代之核苷酸取代。

B.载体分子

本发明之PPV5A蛋白质或肽可结合或共价连接之载体分子较佳为上述载体分子。供动物使用之较佳载体为牛血清白蛋白及匙孔螺血蓝蛋白。载体蛋白质本身较佳为免疫原。

本发明之PPV5A蛋白质或肽可藉由此项技术中已知的任何便利方法与载体共价偶合。尽管使用对称连接子(诸如己二酸二酰肼，如由Schneerson等人,J.ExperimentalMedicine,152,361-376(1980)描述)或杂双官能连接子(诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯，如由Fattom等人,Infection and Immunity,56,2292-2298(1988)描述)属于本发明之范畴内，但较佳避免使用任何连接子而改为使本发明之PPV5A肽直接与载体分子偶合。该偶合可藉助于还原性胺化实现，如由Landi等人J.Immunology,127,1011-1019(1981)描述。

免疫原性组合物之尺寸(如由平均分子量定义)可变化且视所选PPV5A蛋白质或肽及使PPV5A蛋白质或肽与载体偶合之方法而定。因此，其可小至1,000道尔顿(10³)或大于10⁶道尔顿。藉由还原性胺化偶合方法，PPV5A蛋白质或肽之分子量通常在5,000至500,000或500,000以上之范围内；例如对于SEQ ID NO:4之衣壳蛋白，预测分子量为约80,000道尔顿，预测其形成包含60个单体蛋白之类病毒粒子(VLP)。

载体分子(亦即特异性结合本发明之PPV5A蛋白质或肽之肽、其衍生物及类似物及肽模拟剂)可由此项技术中已知的各种方法产生，包括(但不限于)固相合成或利用溶液(Nakanishi等人,1993,Gene 137:51-56；Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154；Neurath,H.等人编,The Proteins,第II卷,第3版,第105-237页,Academic Press,New York,N.Y.(1976)，其以全文引用的方式并入本文中)。

本发明之PPV5A蛋白质或肽或本发明之抗体或其结合部分可藉由于稀释剂中之溶液或悬浮液形式与医药学或兽医学载体一起以可注射剂量施用。

该等分子之安全性及功效在所描述之细胞培养物或实验动物中藉由标准程序测定且由兽医生物制剂中心(Center for Veterinary Biologics；CVB)进行调节。该等分子之毒性及治疗功效可在细胞培养物或实验动物中藉由标准医药程序测定，例如测定LD₅₀(50％群体致死之剂量)。

本发明之疫苗可为多价或单价的。多价疫苗系由多种PPV5A蛋白质或肽与载体分子之免疫结合制成。

在一个方面中，PPV5A蛋白质或肽组合物包含有效免疫量之免疫原性缀合物，较佳与免疫刺激剂组合；及生理学上可接受之媒介物。如本发明中所使用，“免疫刺激剂”意欲涵盖任何能够增强免疫系统活性之化合物或组合物，无论其为与特异性抗原组合之特异性增强作用，或仅为对免疫反应中之一或多个要素之活性的独立作用。免疫刺激剂化合物包括(但不限于)矿物质凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇；聚阴离子；肽；油乳液；明矾及MDP。使用该等物质之方法在此项技术中已知，且确定用于既定疫苗之刺激物之最佳量完全属于本领域技术人员之能力范围内。既定调配物中可使用一种以上免疫刺激剂。亦可将免疫原并入脂质体中，或与疫苗调配物中使用之多糖及/或其它聚合物缀合。

组合物必要时可于包装或施配器装置中，该包装或施配器装置可含有一或多个含有活性成分之单位剂型。包装可例如包含金属或塑料箔，诸如泡壳封装。包装或施配器装置可附有施用说明书，较佳用于施用哺乳动物，尤其为猪。

C.佐剂

为进一步提高由此提供之免疫原性组合物之免疫原性，该等组合物除含有一或多种PPV5A蛋白质或肽以外亦可包含一或多种佐剂。

佐剂可由先前描述或现有技术中已知的任何技术纯化。较佳纯化技术为硅胶层析，尤其“急骤”(快速)层析技术，如由W.Clark Still等人,J.Organic Chemistry,43,2923-2925(1978)描述。然而，可使用其它层析方法(包括HPLC)进行佐剂之纯化。亦可使用结晶法纯化佐剂。在一些情况下，若自合成直接获得具有分析级纯度之产物，则无需进行纯化。

根据用于产生佐剂组合物之已知技术，藉由将佐剂与PPV5A蛋白质或肽在适当无菌条件下物理混合来制备本发明之疫苗组合物。藉由使缀合物上存在净负电荷(其由静电吸引至长链烷基化合物佐剂上之正电荷)来促进PPV5A蛋白质或肽与佐剂之复合。

D.生理学上可接受之媒介物

本发明之疫苗组合物可使用与用于其它医药多肽组合物之技术类似之技术调配。因此，佐剂及较佳与载体分子结合及/或与佐剂混合之PPV5A蛋白质或肽可以冻干形式储存且在施用之前于生理学上可接受之媒介物中复原以形成悬浮液。或者，佐剂及缀合物可储存于媒介物中。较佳媒介物为无菌溶液，尤其无菌缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲生理食盐水。任何使佐剂及缀合物于媒介物中组合使得免疫原性组合物之免疫有效性得到改良之方法均为合适的。

单一剂量之本发明之疫苗之体积可变化，但通常将属于常规疫苗之常用范围内。在上述缀合物及佐剂之浓度下，单一剂量之体积较佳介于约0.1ml与约3ml之间，较佳介于约0.2ml与约1.5ml之间，更佳为约1.0ml。

本发明之疫苗组合物可藉由任何便利方法施用。

E.调配物

包含与载体分子偶合之PPV5A蛋白质或肽之免疫原性缀合物可用作疫苗以用于针对PPV5A之一或多种血清型免疫。包含于生理学上可接受之媒介物中之免疫原性缀合物的疫苗适用于使动物(较佳为猪)免疫以治疗或预防PPV5A感染之方法中。

藉由用免疫原性缀合物免疫产生之针对本发明之免疫原性缀合物之抗体可用于被动免疫疗法及产生抗独特型抗体以治疗或预防PPV5A感染。

组合物施用之对象较佳为动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、犬、仓鼠、小鼠及大鼠；最佳为猪。

本发明之调配物包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物或针对其之抗体及生理学上可接受之媒介物。疫苗包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物及生理学上可接受之媒介物。调配物应适应施用模式。

免疫原性组合物必要时亦可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂。经口调配物可包括标准载剂，诸如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、钠糖精、纤维素、碳酸镁等。

F.有效剂量

本文中所描述之化合物可以治疗有效剂量施用至对象以治疗PPV5A相关疾病。剂量将视接受疫苗之宿主以及多种因素(诸如宿主体型、体重及年龄)而定。

欲用于调配物中之本发明之免疫原性缀合物或抗体之精确量将视施用途径及对象性质(例如物种、年龄、体型、疾病之阶段/程度)而定，且应根据标准临床技术根据医师之判断及每一对象之情形来判定。有效免疫量为足以治疗或预防对象中之PPV5A感染性疾病之量。有效剂量亦可由得自动物模型测试系统之剂量反应曲线推算且可自0.1mg/kg至20mg/kg，较佳1mg/kg至10mg/kg变化。

组合物之免疫原性可藉由使用此项技术中已知的任何免疫分析法在用组合物免疫后监测测试对象之免疫反应来确定。可将产生体液(抗体)反应及/或细胞介导之免疫性视为免疫反应之指示。测试对象可包括动物，诸如猪、小鼠、仓鼠、犬、猫、兔、牛、马、绵羊及家禽(例如鸡、鸭、鹅及火鸡)。

测试对象之免疫反应可藉由各种方法分析，诸如：所得免疫血清与免疫原性缀合物之反应性，如由已知技术分析，例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)、免疫墨点法、免疫沉淀法等；或保护经免疫之宿主免于病原体感染及/或经免疫之宿主中由病原体感染引起之症状的减弱，如由此项技术中已知的任何用于分析感染性疾病因子(infectious diseaseagent)含量之方法确定，例如定量PCR、病毒分离或此项技术中已知的其它技术。亦可藉由测量免疫球蛋白所针对之抗原之含量来确定感染性疾病因子之含量。感染性疾病因子之含量降低或感染性疾病之症状改善指示组合物有效。

在动物中活体内使用之前，可活体外测试本发明之治疗剂之所需治疗性或预防性活性。举例而言，可用于确定是否指示施用特异性治疗剂之活体外分析法包括活体外细胞培养分析法，其中来自细胞株之合适细胞或自患有特定疾病或病症之对象培养之细胞暴露于治疗剂或以其它方式接受治疗剂施用，且观测治疗剂对细胞之作用。

或者，可藉由以下方法来分析治疗剂：使治疗剂与细胞(自对象培养或来自经培养之细胞株)接触，该等细胞对感染性疾病因子之感染敏感但未受感染性疾病因子感染；使细胞暴露于感染性疾病因子；且接着确定与治疗剂接触之细胞之感染率是否低于未与治疗剂接触之细胞之感染率。可藉由此项技术中已知的任何方法分析细胞之感染性疾病因子感染。

此外，可藉由在疗法之前、在疗法期间或在疗法之后以合适时间间隔测量动物模型对象中抗体所针对之分子之含量来评估治疗剂。可鉴定分子之量之任何改变或未发生改变且将其与治疗对对象之作用相关联。分子之含量可藉由此项技术中已知的任何方法确定。

在使用本发明之方法及组合物将动物针对PPV5A接种后，可使用现有技术中已知的任何结合分析法评估所得抗体与特定分子之间的结合。亦可进行该等分析法以选择对特定抗原呈现较高亲和力或特异性之抗体。

G.检测及诊断方法

由使用本发明之原生PPV5A、减毒病毒、蛋白质或肽而产生之抗体或其结合部分适用于检测样品中PPV5A之存在。此检测方法包含以下步骤：提供针对本发明之原生PPV5A、减毒病毒、蛋白质或肽所产生之经分离抗体或其结合部分，将经分离抗体或其结合部分添加至怀疑含有一定量的PPV5A病毒之样品中，及检测包含结合于PPV5A病毒之经分离抗体或其结合部分之复合物的存在。

本发明之抗体或其结合部分亦适用于检测样品中PPV5A蛋白质或肽之存在。此检测方法包含以下步骤：提供针对原生PPV5A、减毒病毒、蛋白质或肽所产生之经分离抗体或其结合部分，将经分离抗体或其结合部分添加至怀疑含有一定量的PPV5A蛋白质或肽之样品中，及检测包含结合于PPV5A蛋白质或肽之经分离抗体或其结合部分之复合物的存在。

如本文中所描述，结合作为结合对之成员的特异性分子之免疫球蛋白，特定言之抗体(及其功能活性片段)可用作诊断剂及预后剂。在多个实施例中，本发明提供结合对之成员之测量及该等测量在临床应用中之用途。本发明之免疫球蛋白可用于例如检测生物样品中之抗原，藉此可测试对象中免疫球蛋白所结合之分子之异常含量及/或该等分子之异常形式之存在。“异常含量”意谓相对于来自未患有疾病之身体部分或对象之类似样品中之存在量或表示存在量之标准含量有所增加或降低。试剂盒中亦可包括本发明之抗体作为试剂以用于诊断或预后技术。

在一个方面中，免疫特异性结合于PPV5A原生或减毒病毒、蛋白质或肽之本发明之抗体可用于PPV5A感染之诊断、预后或筛选。

在另一方面中，本发明提供诊断或筛选PPV5A感染或针对其之免疫性之存在的方法，其包含测量对象中抗体与来源于对象之样品之免疫特异性结合的程度，其中抗体免疫特异性结合PPV5A蛋白质或肽，其中该免疫特异性结合之程度相对于来自不具有感染性疾病因子之对象之类似样品中该免疫特异性结合之程度有所增加指示PPV5A存在。

用于检测PPV5A肽或其拮抗剂之存在的合适分析法之实施例包括(但不限于)ELISA、放射免疫分析法、凝胶扩散沉淀反应分析法、免疫扩散分析法、凝集分析法、荧光免疫分析法、蛋白质A免疫分析法或免疫电泳分析法。

用于特定分子之免疫分析法将典型地包含在以可检测方式经标记之抗体存在下孵育样品(诸如生物流体、组织提取物、新鲜收集之细胞或所培养细胞之溶解产物)及藉由此项技术中熟知的多种技术中之任一种检测结合之抗体。

可根据熟知方法测定既定抗体之结合活性。本领域技术人员将能够使用常规实验确定各测定之操作性及最佳分析条件。

本发明之另一方面涉及用于检测或测量PPV5A之诊断试剂盒。提供用于诊断用途之试剂盒，其在一或多个容器中包含抗PPV5A抗体，及可选地针对抗体之经标记之结合搭配物。或者，抗PPV5A抗体可经标记(使用可检测标记，例如化学发光、酶、荧光或放射性部分)。因此，本发明提供诊断试剂盒，其包含抗PPV5A抗体及对照免疫球蛋白。在一特定实施例中，容器中之一种上述化合物可以可检测方式经标记。试剂盒可以可选地进一步在容器中包含预定量之由试剂盒之抗体识别之PPV5A病毒、蛋白质或肽，以用作标准物或对照物。

H.施用对象

施用途径包括(但不限于)鼻内、经口(例如于饮用水中)、皮内及肌肉内。肌肉内施用尤其较佳。本领域技术人员将认识到，本发明之组合物亦可以一次、两次或两次以上剂量施用以及藉由其它施用途径施用。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、心内、小叶内、髓内、肺内及阴道内。视治疗之所需持续时间及有效性而定，本发明之组合物可施用一次或数次，亦可间歇地施用，例如在数天、数周或数月内每天及以不同剂量施用。

包括以下实施例以说明本发明之较佳实施例。本领域技术人员应了解，以下实施例中揭示之技术表示由发明者发现之在本发明实践中起良好作用之技术，且因此可视为构成本发明实践之较佳模式。然而，根据本发明，本领域技术人员应了解，在不偏离本发明之精神及范畴下，所揭示之特定实施例中可产生多种变化且仍然获得相似或类似结果。

本申请案涉及同一日期申请之标题为“Porcine Parvovirus 5B,Methods of Useand Vaccine”之申请案(代理人案号BIC-1153)，其内容以全文引用的方式并入本文中。

实施例

材料及方法

材料来源：自罕见爆发调查接收来自三只猪之组织匀浆。饲养场之临床病史为200lb猪患有全身肌肉颤动，其在静止时存在，但在运动期间增强。在兽医诊断实验室中进行广泛测试，该实验室提示病毒因子(基于微观病变)，但仅鉴定出因子X(与瘟病毒相关之非经典猪瘟病毒)，之后将样品提供至发明者以帮助确定该等动物中CNS病征之潜在起因。

DNA及蛋白质分析：使用来自454Life Sciences(Branford CT)(“454技术”)之高通量测序进行来自受感染猪之样品的DNA分析，由Operon(Huntsville AL)进行。经由病毒粒子保护核酸之核酸酶处理使样品富含病毒序列，接着进行提取、随机扩增及高通量测序；通常如Victoria等人PLoS pathogen 2008年9月26日；4(9):e1000163中所描述进行。

最初由BLASTx分析将所得序列表征为细小病毒科(Parvoviridae family)之分歧成员(divergent member)。使用Sequencher软件装配序列且该等DNA分析之结果联合目标测序会得到SEQ ID NO:1之DNA序列，其为命名为PPV5A的病毒之推定完全编码序列。使用Sequencher软件进一步分析DNA序列，鉴定出三个推定编码区，其对应于在其它细小病毒种中发现之编码区，包含病毒复制酶(SEQ ID NO:2)、开放阅读框架“ORF3”(SEQ ID NO:3)及病毒衣壳蛋白(SEQ ID NO:4)。

实施例1：鉴定新颖病毒

藉由454技术(病毒多源基因组学)鉴定来自不同状态之两只无关猪之肺匀浆之样品中的DNA序列。BLASTn及BLASTx分析表明与猪细小病毒4最密切相同，其中复制酶基因(REP)之保守区域中存在67％核苷酸相同性最大值，而衣壳蛋白(CAP)编码区在核苷酸层面上未呈现可辨别之匹配。在蛋白质层面上，推定之复制酶蛋白呈现约60％氨基酸相同性且在衣壳蛋白中呈现约50％相同性。病毒表示为新型种，即猪细小病毒5A(PPV5A)。基于衣壳蛋白编码序列研发特异性引物，且组织中类似之匀浆基于PCR之筛选及病理学/临床特征表明约16％样品中存在因子。基于所报导之临床病征及与所筛选组织相关之病毒学数据，观测到与若干其它病毒剂及临床病理学/组织病理学之统计学显著相关性。

实施例2：鉴定PPV5A为新颖细小病毒及系统发生分析

多种已知病毒种之推定之复制酶(REP)及衣壳(VP1/CAP)蛋白之成对氨基酸相同性展示于图5中。PPV5A序列与最密切相关之具有REP及CAP之PPV4之相同性(分别为约60％/50％)支持将PPV5A指定为新型种。

基于CAP蛋白质之保守区域，系统发生分析(图6)显示该病毒为细小病毒科及细小病毒属中之新颖种。使用更保守的REP蛋白序列(未图示)得到类似结果。

实施例3：确认PPV5A为疾病因子

使用来自ISU之三种PPV5a PCR阳性组织匀浆对剖腹分娩之未喂食初乳(CDCD)之动物进行接种，以尝试扩增病毒及确定新颖细小病毒与PRRSV之合并感染是否引起临床呼吸病征增加。在此项研究中，用含有新颖细小病毒之组织匀浆接种之组中出现意外的高死亡数(20％-22％)，且使用靶向衣壳蛋白编码区之PPV5A特异性PCR鉴定血清中高效价之PPV5A。接着使用来自此项研究中之一只动物的组织攻击CDCD猪以再现临床病征。在此项研究中，在大部分受感染动物中发现高效价病毒血症之全身感染。在接受含有PPV5A之接种物的组中，死亡(20％)、跛行、平均每日增重降低、发热以及巨观及微观病变之发生率较高。

实施例4：PPV5A之培养、分离及纯化

使用无菌研钵及杵棒研磨PCR阳性组织(例如脾、脑、肺、肠等)之小切片。将经研磨之组织再悬浮于5-10ml含有HEPES缓冲液及抗生素之经改质EMEM中且使其澄清以消除较大的组织块。收集上清液且连续通过各种过滤器以消除大部分较大粒子(包括细菌)。此外，亦藉由连续过滤来处理来自PCR阳性动物之粪便样品悬浮液及血清以进行病毒分离。

滤液之稀释物经胰蛋白酶处理或保持未经处理且在6孔板中在特定温度下吸附于建立的及原生细胞培养物(列举于下文中)上。抽出接种物且替换为2ml新鲜维持培养基。板接着在5％CO₂氛围中在33℃-37℃下孵育且每天观测与模拟(普通培养基)接种之对照物相比之细胞病变效应，诸如细胞变圆、细胞-细胞融合、脱落、细胞丛集等。藉由PCR筛选潜在阳性孔之病毒生长/分离。

适用于病毒分离之建立的细胞系尤其包括：ST(猪睾丸)、SK6(猪肾脏)、BHK-21(仓鼠仔肾脏)、VIDO R1(猪胎儿视网膜)、PK-15NADC(猪肾脏)、PK/WRL(猪肾脏)、HRT-180(人类结肠直肠腺癌)、Hep2(人类上皮)、Vero(非洲绿猴肾脏)及RK-13(兔肾脏)。

适用于该过程之原生细胞培养物尤其包括：猪胚胎之肺、肾脏、睾丸、气管及肠培养物。

在分离病毒后，藉由多轮斑块纯化或限制稀释来纯化病毒且以较大量扩增病毒，并且产生用于动物实验之储备培养物。

实施例5：制备灭活病毒及疫苗

在约35℃至39℃之间且在2至15mM BEI存在下，更佳在约10mM BEI存在下进行灭活。灭活系进行至少24小时，多达24至72小时。接着添加等效量之中和溶液内之灭活试剂的试剂；例如等效量之硫代硫酸钠。根据此项技术中已知之方法制备灭活病毒制剂，举例而言，如Preuss,T.等人,Comparison of Two Different Methods for Inactivation ofViruses in Serum,CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY,(1997),504-508或Bahnemann,H.G.,Inactivation of viral antigens for vaccine preparation withparticular reference to the application of binary ethylenimine,VACCINE,(1990),299-303中所揭示。一旦制备灭活病毒，则将材料与载体制剂组合以用于最终疫苗调配。

实施例6：制备减毒病毒及疫苗

减毒病毒制剂系根据此项技术中已知之方法制备，举例而言，如VaccineProtocols,第2版；Robinson,Husdon,Cranage编,Humana Press 2003中所揭示。举例而言，“…野生型病毒在组织培养物/动物宿主中广泛继代直至毒性损失与免疫原性保持之间达到可接受之平衡…”。

藉由多轮斑块纯化或限制稀释来纯化减毒病毒。使用PCR分析法、深度测序或免疫荧光分析法确定培养物质之特异性。

藉由组合经纯化之减毒病毒制剂与载体制剂来制备减毒病毒疫苗。

实施例7：制备包含衣壳蛋白之亚单位疫苗

藉由经克隆之SEQ ID NO:4或其片段于多种蛋白质表达系统中之表达来制备SEQID NO:4之衣壳蛋白。

杆状病毒表达：SEQ ID NO:4之PPV5A衣壳蛋白于杆状病毒表达系统中表达，通常根据Kost等人(6),2012中揭示之方法。在初始纯化时，在不可溶部分内发现少量蛋白质。提高产率及溶解度之方法包括(但不限于)使用替代性缓冲条件(例如脲或盐酸胍)、替代性结合及纯化条件(例如钴或镍亲和管柱、阴离子或阳离子交换管柱)或替代性表达条件(例如温度、时间、替代性细胞株)。

细菌表达：SEQ ID NO:4之PPV5A衣壳蛋白于细菌表达系统中表达，通常根据EMDChemicals Inc.Novagen User Protocol TB184中揭示之方法。此方法包括添加细菌载体中所含之固有HIS标签(EMD Chemicals Inc.,2011(7))以促进所产生之蛋白质之纯化。通常根据GE Healthcare,2012(8)中揭示之方法纯化经细菌表达之HIS标记衣壳蛋白，且使用所得产物如实施例8中所描述产生PPV5A特异性抗体。

藉由组合经纯化之衣壳蛋白制剂与载体制剂来制备减毒亚单位疫苗。

实施例8：制备特异性结合于PPV5A之抗体

藉由使用PPV5A病毒之抗原性制剂或衣壳(SEQ ID NO:4)蛋白或其片段之亚单位蛋白制剂使兔免疫来制备特异性结合于PPV5A之抗体。针对结合于PPV5A抗原之多克隆抗体筛选来自经接种之兔之血清样品。使来自经接种之小鼠且确定产生针对抗原之抗体之脾与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。接着针对与PPV5A抗原之结合来筛选杂交瘤。

多克隆抗体：在定制抗体制备服务公司(custom antibody productionservice)，使用根据实施例7制备之HIS标记之经细菌表达之衣壳蛋白使两只新西兰白兔(New Zealand White rabbit)免疫(Rockland抗体及分析法(Rockland Antibodies andAssays)；Gilbertsville,PA)。在D0、D7、D14及D28，使用每只兔约100μg抗原使兔免疫。对于D0及D7接种，动物系皮内接种；在D14及D28进行之接种系皮下施用。在第一次接种中使用完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant)；在后续接种中使用不完全弗氏佐剂(incomplete Freud's adjuvant)。在免疫之前以及在免疫后第38天及第45天收集来自两只兔子之血清样品。

藉由Rockland抗体及分析法筛选抗PPV5A特异性之多克隆抗体制剂。藉由免疫荧光分析法(IFA)、西方墨点法及酶联结免疫吸附剂分析法(ELISA)，产生对经纯化或部分纯化之PPV5A蛋白质具有结合特异性之抗体。各分析法之特异性之参数如下：藉由检测预测的88.8kDa尺寸蛋白质来测量西方墨点法特异性，藉由与未感染之细胞相比来测量IFA特异性且藉由用非相关蛋白涂布板来测量ELISA特异性。

单克隆抗体：在定制抗体制备服务公司(Rockland抗体及分析法；Gilbertsville,PA)，使用根据实施例7制备之HIS标记之经杆状病毒表达之衣壳蛋白在Balb/c小鼠中产生单克隆抗体。根据由定制抗体制备设备设计之标准方案使用多种PPV5A抗原性制剂使小鼠免疫。藉由定制抗体制备设备监测接种后之免疫反应，且选择用于产生杂交瘤之抗体候选物。用于产生单克隆抗体之标准方案已为本领域技术人员所熟知，举例而言，如Gabriele等人(9),第117-135页中所揭示。

藉由根据标准方案组合在杂交瘤培养基中培养至增殖期之B细胞肿瘤细胞与自确定产生针对PPV5A抗原之抗体之经接种小鼠收集的脾细胞来产生杂交瘤，如Gabriele等人(9),第117-135页中所揭示。在融合及培养杂交瘤后，针对与PPV5A抗原之结合筛选杂交瘤，且选择产生抗PPV5A之杂交瘤。根据标准方案使用亲和层析纯化由杂交瘤产生之单克隆抗体，如Gabriele等人(9),第209-232页中所揭示。

使用此项技术中熟知的免疫学技术，例如ELISA、西方墨点分析及表位定位(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(GlennE.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey)来鉴定对PPV5A具有特异性之高亲和力抗体且进一步表征，包括确定其结合之表位、抗体关于其它相关病毒种之特异性，且选择对PPV5A病毒抗原具有高特异性之适合的高亲和力抗体。

实施例9：PPV5A之诊断分析法

ELISA分析法：使用ELISA程序，使用根据实施例8制备之抗体测量生物样品中之PPV5A。分析法系如下进行：

将选自SEQ ID NO:4之衣壳蛋白之包被抗原于包被缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲剂；pH 9.6)中稀释至实现8ng/μl之最终浓度。每孔用50μl包被抗原涂布板(高蛋白结合96孔ELISA板，Phenix目录号MPG-655061)。密封板且在37℃下孵育1小时或在4℃下孵育隔夜。移除涂布溶液且板用每孔200μl PBST(1X PBS+0.05％Tween-20)洗涤三次。板用每孔300μl封闭溶液(含0.5％w/v脱脂乳粉之PBS)包被，密封且在37℃下孵育1小时。移除封闭溶液且板用每孔200μl PBST洗涤三次。样品在封闭溶液中以1:100稀释；向板中每孔添加100μl血清样品。密封板且在37℃下孵育1小时。移除血清样品且板用每孔200μl PBST洗涤三次。第二抗体(HRP结合之山羊抗猪IgG(H+L)；Jackson Immuno-Research 114-035-003)于封闭溶液中以1:10,000稀释且用于以每孔100μl包被板。密封板且在37℃下孵育1小时。移除第二抗体且板用每孔200μl PBST洗涤三次。板用每孔50μl TMB(3,5,3',5'-四甲基联苯胺；KPL目录号53-00-01)包被。板于黑暗中在室温下孵育约十分钟。板用每孔50μl终止溶液(2M H₂SO₄；KPL目录号50-85-04)包被。在450nm下读取光学密度。

PCR分析法：用于PPV5A之基于凝胶之PCR及qPCR分析法已经最佳化。该等分析法系如下进行：对于qPCR分析法，各反应物系藉由添加以下试剂来制备：每种反应物10μl 2XSsoFast探针supermix(BioRad,目录号172-5233)、每种反应物5μl经DEPC处理之水、每种反应物1μl正向引物(6μM浓度)(AAT GCG TGT GCT TAC GCT TA：SEQ ID NO:6)、每种反应物1μl逆向引物(6μM浓度)(TGG GTT CGA ATA TGA AGA GG：SEQ ID NO:7)、每种反应物1μl探针(4μM浓度)(6-FAM/TC ATC AGG AAC CCT GGA GTG ATC TCA/BHQ_1：SEQ ID NO:8)及每种反应物2μl经提取之DNA。反应在T100热循环器(Bio-Rad)上在95℃下持续2分钟进行一次循环，接着在以下两种温度下进行四十次循环：95℃下持续5秒，接着60℃下持续5秒。使用CFX96光学成像系统(Bio-Rad)读取数据。对于基于凝胶之分析法，各反应物系藉由添加以下试剂来制备：每种反应物12.5μl 2X AmpliTaq Gold Mastermix(Applied Biosystems,目录号4302758)、每种反应物8.0μl经DEPC处理之水、每种反应物1.25μl正向引物(GTA CTATGA ATT TCC AAA CGA TCT TCC TTT CG：SEQ ID NO:9)(10μM浓度)、每种反应物1.25μl逆向引物(TTA CAC CAA ATC TGG GAC TCT AAA CAG GC：SEQ ID NO:10)(10μM浓度)及每种反应物2μl经提取之DNA。反应在T100热循环器(Bio-Rad)上在95℃下持续5分钟进行一次循环，接着在以下温度下进行四十次循环：95℃下持续30秒，60℃下持续30秒且72℃下持续45秒，接着在72℃下最终延长持续10分钟。

实施例10：评估猪中PPV5A疫苗之功效

为评估包含至少一种PPV5A蛋白质或多肽(原型PPV5A疫苗)之目标组合物在猪中之功效，使用随机分为三组之五周龄剖腹分娩之未喂食初乳(CDCD)动物(参见表2)进行随机化研究。在研究第0天(D0)及D14用组合物或安慰剂(磷酸盐缓冲生理食盐水；PBS)对动物进行接种。在D28用已知含有PPV5A之物质攻击动物。监测临床观测、直肠温度、体重测量及血液收集。在D56，对动物进行尸检以评估巨观病变。藉由以统计学方式比较经接种与未经接种之动物之间的死亡百分比、病毒血症(效价及持续时间)、血清转化(效价及持续时间)及临床病征来确定PPV5A疫苗之功效。

表2.

组编号	组	N	室	接种	攻击
						1	PPV5A-Vx	10	1和2	PPV5A原型	是
2	PBS-Vx	10	1和2	PBS	是
						3	严格对照	5	3	无	否

可根据本发明在无不当实验下制备及执行本文中揭示及主张之所有组合物及方法。虽然已依照较佳实施例描述本发明之组合物及方法，但本领域技术人员将显而易见，在不偏离本发明之概念、精神及范畴下，可对本文所描述之组合物及方法以及在该方法之步骤或步骤次序中作出变化。更特定言之，将显而易知可用某些化学且生理学相关试剂取代本文中所描述之试剂而获得相同或类似结果。本领域技术人员显而易见的所有该等类似取代及修饰均视为属于由以下申请专利范围所界定之本发明之精神、范畴及概念内。

参考文献

以下参考文献以引用的方式明确并入本文中，其并入程度使得其提供对本文所述内容之例示性程序性或其它细节补充。

(1)Cságola A,et al.,Detection,prevalence and analysis of emergingporcine parvovirus infections.Arch Virol.Jun；157(6):1003-10(2012).

(2)Hijikata M,et al.,Identification of new parvovirus DNA sequence inswine sera from Myanmar.Jpn J Infect Dis 54:244-245(2001).

(3)Wang F,et al.,Novel parvovirus sublineage in the family ofParvoviridae.Virus Genes 41:305-308(2010).

(4)Lau SK,et al.,Identification of novel porcine and bovineparvoviruses closely related to human parvovirus 4.J Gen Virol 89:1840-1848(2008).

(5)Cheung AK,et al.,Identification and molecular cloning of a novelporcine parvovirus.Arch Virol 155(5):801-806(2010).

(6)Kost et al.,Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors,Trends in Biotechnology,20,173-180,Apr.2002.cited by other.

(7)EMD Chemicals Inc.2011.Xa/LIC Kits,User Protocol TB184.

(8)GE Healthcare.Recombinant Protein Purification Handbook.18-1142-75.

(9)Gabriele et al.(eds.),Antibody Methods and Protocols,Methods inMolecular Biology,2012,vol.901,chapter 7.

Claims (22)

1.一种经分离的多核苷酸，

a)由SEQ ID NO:1的核酸序列组成；或

b)由编码以下多肽的核酸序列组成：

-由包含SEQ ID NO:1的核苷酸2845-5547的序列的多核苷酸所编码的多肽。

2.一种经分离的多肽，由以下氨基酸序列组成：

-由包含SEQ ID NO:1的核苷酸2845-5547的序列的多核苷酸所编码的氨基酸序列。

3.一种经分离的猪细小病毒5A，包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

4.如权利要求3的猪细小病毒5A，其包含猪细小病毒5A的减毒、非毒性形式。

5.一种用于治疗或预防毒性猪细小病毒5A感染的疫苗，其包含如权利要求3的猪细小病毒5A的被杀死的或减毒的形式。

6.一种用于治疗或预防毒性猪细小病毒5A感染的疫苗，其包含如权利要求3的猪细小病毒5A的被杀死的或减毒的形式的亚单位。

7.如权利要求6的疫苗，其中所述亚单位为衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白为由包含SEQID NO:1的核苷酸2845-5547的序列的多核苷酸所编码的多肽。

8.一种免疫原性制剂，其包含免疫学有效量的如权利要求2的多肽，以及医药学或兽医学可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

9.免疫学有效量的如权利要求3的猪细小病毒5A在制备用于在哺乳动物中产生免疫反应的疫苗中的用途。

10.免疫学有效量的如权利要求2的多肽在制备用于在哺乳动物中产生免疫反应的疫苗中的用途。

11.免疫学有效量的如权利要求5的疫苗在制备用于在哺乳动物中产生免疫反应的疫苗中的用途。

12.免疫学有效量的如权利要求6的疫苗在制备用于在哺乳动物中产生免疫反应的疫苗中的用途。

13.免疫学有效量的如权利要求7的疫苗在制备用于在哺乳动物中产生免疫反应的疫苗中的用途。

14.如权利要求9的用途，其中所述哺乳动物为猪，且所述免疫反应提供针对由猪细小病毒5A感染引起的疾病的保护性免疫。

15.如权利要求10的用途，其中所述哺乳动物为猪，且所述免疫反应提供针对由猪细小病毒5A感染引起的疾病的保护性免疫。

16.如权利要求11的用途，其中所述哺乳动物为猪，且所述免疫反应提供针对由猪细小病毒5A感染引起的疾病的保护性免疫。

17.如权利要求12的用途，其中所述哺乳动物为猪，且所述免疫反应提供针对由猪细小病毒5A感染引起的疾病的保护性免疫。

18.如权利要求13的用途，其中所述哺乳动物为猪，且所述免疫反应提供针对由猪细小病毒5A感染引起的疾病的保护性免疫。

19.一种载体或质粒，其包含如权利要求1的多核苷酸。

20.一种宿主细胞，其包含如权利要求19的载体。

21.一种免疫原性试剂盒，其包含

a)至少一种权利要求2的免疫原性猪细小病毒5A的多肽，其有效地使动物对至少一种与猪细小病毒5A感染相关的疾病免疫；

b)至少一种载剂或佐剂分子；

c)用于封装所述免疫原性组合物的容器，所述免疫原性组合物包含a)的肽和b)的载剂或佐剂分子；

d)一组印刷说明书；及

e)施配器，其能够将所述免疫原性组合物施用至动物。

22.如权利要求21的免疫原性试剂盒，其进一步包含至少一种免疫原性蛋白质，所述至少一种免疫原性蛋白质有效地使所述动物对至少一种其它猪病原性病毒或细菌免疫，所述至少一种其它猪病原性病毒或细菌会引起与所述病毒或细菌的感染相关的疾病。

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