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CN1294517A - 具有合成可变区和修饰特异性的免疫球蛋白分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与结合对的一个成员免疫特异结合的修饰免疫球蛋白分子,尤其是抗体,该免疫球蛋白拥有一个含一个或多个互补决定区的可变区,该互补决定区含有一个针对结合对成员的结合位点的氨基酸序列,该结合位点来源于结合对的其他成员并且在互补决定区中未在天然环境中找到。本发明进一步提供该修饰免疫球蛋白的治疗和诊断用途。

Description

具有合成可变区和修饰特异性的免疫球蛋白分子
相关申请的交叉参考
本申请要求临时专利申请系列号60／065，716提交日期1997年11月4日，和临时专利申请系列号60／081，403，提交日期1998年4月10日的权利，所述的2个专利作为整体在此引入仅供参考。
1．发明领域
本发明涉及修饰的免疫球蛋白分子，尤其是抗体，这些分子与结合对的一个成员结合并且至少拥有一个互补决定区(CDR)，该互补决定区含有针对该结合对成员的结合位点的氨基酸序列，所述的结合位点来源于结合对的其它成员。本发明也涉及应用本发明的修饰抗体，治疗、诊断或筛选与该结合对成员表达相关的疾病和失调，尤其是癌症或传染疾病的方法。本发明也涉及含有本发明修饰抗体的药用组合物和诊断试剂盒。
2．发明背景
2．1抗体和免疫系统
抗体是属于免疫球蛋白超家族的蛋白。免疫球蛋白超家族包括T细胞受体、B细胞受体、细胞表面粘附分子，如共受体CD4、CD8、CD19和MHC分子的不变区。以其可溶的形式，抗体是由也称为浆细胞的成熟B细胞所产生的糖蛋白。在所有动物和人类对外来抗原应答中，抗体被分泌到血液和其他细胞外液中，在整个机体内循环。
抗体具有二个主要的功能。第一个功能是识别或结合外来抗原。第二个功能是动员免疫系统的其它因素摧毁外来物。在免疫效应细胞表面的受体设计用于识别抗原和其他细胞上的细胞表面标志。该识别过程传递是否这些标志属于自身或非自身的信息，并且是一种涉及调节免疫系统对存在抗原应答时的重要因素。
与抗体结合的抗原部分被称为其抗原决定簇或表位，有些抗原能激发免疫应答，而其他抗原作为自体分子被免疫系统识别。能激发免疫应答的抗原称为免疫原，它们通常至少是分子量5000道尔顿的大分子，如蛋白、核酸、糖类和脂类。称为半抗原的较小非免疫原分子，当与一个大载体分子偶联时也能激发免疫应答。
2．2抗体的结构
抗体的基本完整单位是一个四链Y型结构(图1)。在1970年代早期，Wu和Kabat拼接了大量所收集的抗体的氨基酸序列并阐明了抗体的结构，实际上所有免疫球蛋白超家族的成员由1个恒定区和4个相对保守的半刚性β折叠的支架区组成，3个相对短的熟知的互补确定区(CDRs)的超变序列区相间其中(Wu和Kabat，1970，实验医学杂志，132(2)：211-250；Wu和Kabat，1971，美国国家科学院院报68(7)：1501-1506)。该预测被抗体结构的结晶谱学研究所证实(Poljak等，1973，美国国家科学院院报70(12)：3305-3310；Disenhofer等1976，Hopper Seylers Z Physiol Chem(西德)357(10)：435-445；Disenhofer等1976，Hopper Seylers ZPhysiol Chem(西德)357(10)：1421-1434)。
图1表示抗体分子的整体结构。抗体由2个较短的轻链通过二硫键与2个较长的重链连结在一起而成，重链之间由二硫键连结在一起。如在图2所示，抗体蛋白的重链和轻链包含多个区，每个区的长度大约110个氨基酸残基。抗体的每条轻链和重链在其氨基末端拥有一个可变区(分别称为VL和VH)；正是抗体的可变区赋予结合抗原的特异性。一个重链可变区和一个轻链可变区一起形成单个抗原结合位点，因此，基本的免疫球蛋白单位拥有2个抗原结合位点。
在轻链和重链的可变区中的多样性限制在3个“超变”区或CDRs。在每个抗体分子中总共为6个CDRs(图2)，每个CDR含有大约5～10个氨基酸，当CDR以内源机制结合时可达大约20个氨基酸，这种情况在一些抗体种类中常见。每条轻链和重链可变区的3个CDRs形成簇在一起的环，并且连结至可变区的第4个称为构架区(“FRS”)剩余部分，构架区在抗体分子中相对保守。一般来说，抗体的多样性由CDRs的序列改变产生。
可变区对每种抗体来说均不同、而恒定区有更高的保守性。轻链仅拥有一个恒定区结构域，重链恒定区包含有多个结构域，命名为CH1、CH2、CH3、…CHx。恒定区结合域承担各种抗体效应器功能，例如补体结合和与Fc受体的结合，Fc受体由淋巴细胞、粒细胞、单核谱系细胞、刺激B细胞增殖的杀伤细胞、肥大细胞和其他免疫效应器细胞表达。其他效应器功能是分化、补体细胞裂解系统的活化、调理作用、巨噬细胞引诱。不同同种型抗体拥有不同的恒定区，并因此拥有不同的效应器功能。研究最深的同种型是IgG和IgM。
所有的动物物种表达几种不同的抗体类型。根据结构差异性，如在单个抗体分子中免疫球蛋白单位的数目，各个单位二硫键的结构以及链长和序列的差异性，人抗体可分为5种类型(IgG、IgA、IgM、IgD和IgB)，在这些类型中以分为各种五类。迄今为止，IgG抗体是诊断和治疗药学使用中最常用的种类，尽管来自其它类型的抗体的使用在某些用途中可见。
2．3抗体工程
由Kohler和Milstein(1975，自然256：495-497)首次披露的单克隆抗体技术的开发，可允许产生无限量的特异性准确和可重复产生的抗体。Koh1er和Milstein的程序包括从免疫过的动物获得的脾细胞与不死的骨髓瘤细胞系融合，而生产杂交瘤。然后从这些杂交瘤中，挑选出产生具有所需要特异性的抗体的克隆。杂交瘤产生的单克隆抗体，它们的特性和特异性是均一的。
至今为止，用于诊断和治疗用途的合适抗体的鉴别和产生依赖于随机过程。产生抗体的杂交瘤的产生包括用抗原免疫小鼠，或者另一种方法，把抗原加到体外脾细胞制备物中。因此脾细胞群体，和具有具体特异性的潜在单克隆抗体的细胞群体依赖于动物对该抗原的免疫反应。
作为对上面描述的费力的免疫方法的替代方法，开发了用于论断和治疗用途而产生抗体的其他方法。一种方法必需把抗体基因克隆到噬菌体病毒上，如在Clackson等，1991，自然，352：624；Marks等，1992，分子生物学杂志222：581：Zebedee等，1992，美国国家科学院院报39：3175；Gram等，1992，美国国家科学院院报89：3576描述的方法，在病毒表面表达单链可变区。应用噬菌体文库技术，人们能产生表达大量内在的遗传多样性的大量文库。然而，上述文库仍然被它们来源的抗体库所限制。仍在另一方法中，按照Pack的描述(1997，高质量抗体文库，第八届抗体工程国际会议摘要)，随机诱变和表达可变区的基因也产生大量的文库。尽管两种方法在形成极大多样性方面是成功的，但大体来说，与传统的免疫方法相比较，它们在鉴别有用抗体方面并没有更成功，因为这些方法依赖于随机方式产生CDR序列。此外，通过免疫小鼠产生的抗体在人类治疗中的应用受到限制。因为对人来说，小鼠单克隆抗体是外源的，因而具有免疫原性，它们诱导人抗小鼠抗体(HAMA)应答(Shawler等，1985，免疫学杂志，135：1530；Chatenaucl等，1986，免疫学杂志137：830)。
2．4．根据分子间相互作用操作的药物
药物的效能常来源于该药物可增强、拮抗或模拟一种分子与另一种分子，例如配体与其受体、病原体与细胞受体的结合的能力，因而获得了某些生理和药理活性用于疾病预防或消除。直到最近，药物仍受限于偶然发现的合成或天然产物，并且是模拟天然产生的配体结合的小分子效应物。甚至当得到关于配体或它们结合位点的结构信息时，目前可用的方法并没有轻易地用于开发有效的药物。诸如根据配体受体结合对的结晶结构资料设计小分子类似物的分子模型方法的应用，以及用肽组合文库或天然产物提取物与受体结合的筛选方法，未证明是可靠的。此外，这些合成或天然产物并不总是拥有区别受体亚型结合的亲和性和特异性的能力，这可能导致由于对药理效应的不足控制而产生的不良副作用。
需要一种方法能更直接地重新产生或抑制天然相互作用的效应，并能够设计出专用药用制剂，这些药用剂能和具体的结合对成员相互作用并更准确地模拟天然产生的配体的行为。
在此之前引用的参考文献不应该解释为承认上述参考文献是相对于本发明的现有技术。
3．本发明概述
本发明根据本发明人的观察结果。结合对的一个成员中包含另一个成员的结合位点，该结合位点能被转移到免疫球蛋白分子的至少一个CDR上，以赋予免疫球蛋白分子对结合对第二成员的特异性。
本发明的目的是提供一种方法，以设计具有特定特异性的免疫球蛋白，尤其是抗体，该方法克服了目前用于分离特异抗体的不能预测的免疫和筛选过程。具体来说，即构建了与结合对的一个成员免疫特异性结合的合成改性抗体，这样该改性抗体的可变区拥有1个或多个CDRs，CDRs含有针对该结合对的该成员的结合序列，所述的结合序列来源于结合对的其他成员。因此，该方法大大地简化鉴别合适抗体的过程并有效制取由于免疫耐受或神秘表达不可得到的许多抗原的抗体。
因此，本发明提供修饰的免疫球蛋白分子尤其是抗体，这些分子免疫特异性地与结合对的第一成员结合，该结合对由第一成员和第二成员组成，所述的抗体包含一个可变区，其中至少一个CDR含有针对结合对第一个成员结合位点的氨基酸序列，而该结合位点来源于结合对的第二成员。在本发明的优选方面，在天然CDR中，结合位点的氨基酸序列未有发现。
结合对可能是任何能特异性相互作用的2种分子。在具体的实施方案中，该结合对的第一个成员是癌抗原(即、在癌细胞表面表达的分子)、传染病病原的抗原(即在传染病病原表面表达的分子)或针对传染病病原的细胞受体。上述癌抗原包括人乳脂肪小球抗原(HMFG)、多形上表粘蛋白抗原的表位(PEM)、或人结肠癌相关蛋白抗原。上述传染病病原的抗原包括Brambell受体(FCRB)和HSV-2、淋球菌、梅毒密螺旋体、沙眼衣原体或人乳头瘤病毒的抗原。在其他具体的实施方案中，该结合对是一种受体配体结合对时，例如其中结合对的第一个成员是缓激肽受体。
本发明进一步提供用本发明的修饰免疫球蛋白的治疗或预防方法。例如，下述的修饰抗体能用于治疗或预防与特定癌抗原或传染病病原的抗原或针对传染病病原的细胞受体的表达有关的癌症或传染病；所述的修饰抗体拥有一个或多个含有针对癌抗原或传染病病原的抗原或相应于传染病病原的细胞受体的结合位点的CDRs。
本发明进一步提供利用本发明的修饰免疫球蛋白进行筛选或检测或诊断的方法。例如，拥有一个或多个含有针对下列抗原的结合位点的CDRs的修饰抗体，能用于与特定癌抗原或传染病病原的抗原或相应于传染病原的细胞受体的表达有关的癌症或传染病的(筛选，检测和诊断)，CDRs上含有的结合位点针对癌抗原或传染病病原的抗原
本发明也提供含有本发明的修饰免疫球蛋白的治疗和诊断试剂盒以及药用组合物。
本发明进一步提供产生本发明的合成修饰免疫球蛋白的方法。
下文第6节描述合成修饰抗体的合成方法，在该方法中，CDRs之一含有来自缓激肽包括针对缓激肽受体的结合序列的氨基酸序列。该实施例说明该合成修饰抗体免疫特异地与缓激肽受体结合并与缓激肽竞争与缓激肽受体的结合。合成修饰抗体的活性由缓激肽活性的拮抗剂所拮抗。
4．附图简述
图1．显示免疫球蛋白轻链或重链结构的概要性图，每条链由位于免疫球蛋白氨基末端区(H2N-)的可变区和位于免疫球蛋白羧基末端区(-COOH)的恒定区组成。
图2．IgG的概要性图显示在轻链和重链可变区中(分别标记为VL和VH)的4个构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和3个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。恒定区结构域相应于轻链恒定区标示为CL，而相应于重链恒定区的3个结构域标示为CH1、CH2和CH3。Fab显示抗体片段的部分，该抗体片段包括轻链和重链的可变区结构域和CL及CH1结构域。Fc表示含有CH2和CH3结构域的恒定区片段。
图3A-C．(A)表达载体pMRRO10．1的结构，该载体含有一条人K轻链恒定区序列。(B)表达载体pGammal的结构，该载体含有编码人IgG1恒定区(CH1、CH2、CH3)重链和绞链区序列的序列。(C)表达载体pNEPuDGV的结构，该载体含有编码K轻链恒定区和重链的恒定区和绞链区的序列。所有3种载体见Bebbington等，1991，酶学方法2：136-145。
图4A-H，编码轻链和重链可变区结构域的氨基酸和核苷酸序列，这些结构域拥有一个含有缓激肽序列的CDR和相应于合成抗体的重链和轻链可变区共有序列。所有这些序列也含有前导序列。(A)编码共有轻链可变区ConVL1的氨基酸序列和相应的核苷酸序列。(B)编码轻链可变区BKCDR1的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR1含有缓激肽序列，(C)编码轻链可变区BKCDR2的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR2含有缓激肽序列。(D)编码轻链可变区BKCDR3的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR3含有缓激肽序列。(E)编码共有重链可变区ConVH1的氨基酸和相应的核苷酸序列。(F)编码重链可变区BKCDR4的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR4含有缓激肽的序列。(G)重链可变区BKCDR5的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR5含有一缓激肽序列。(H)重链可变区BKCDR6的氨基酸和相应的核苷酸序列，其中CDR6含有缓激肽序列。
图5编码含有缓激肽序列的合成修饰抗体的工程基因组装的一般步骤的概要性图解。用于组装该基因的寡核苷酸表示为“oligol”～“oligo10”。
图6A和B．(A)由图5中显示的方案用于组装共有轻链(ConVl1)和含有轻链可变区的缓激肽的寡核苷酸的核苷酸序列。(B)如在图5所示的，用于组装共有重链可变区(ConVH1)和含有重链可变区缓激肽的寡核苷酸的核苷酸序列。
图7A-C．(A)在SV-T2细胞中由缓激肽刺激PGE2的合成，每次处理以PGE2 ng／孔表示。在下面的图中，符号“-”表示细胞在不存在因子时温育，而“+”表示细胞在存在因子时温育，即1nM缓激肽(上排)或，1nM HOE 140，一种缓激肽的拮抗剂(下排)。(B)由某些拥有含缓激肽序列的CDRs的合成修饰抗体刺激PGE2合成，刺激结果以pg／孔PGE2表示，合成抗体BKCDR3(具有实方形的线)、BKCDR4(具有实三角形的线)、及BKCDR5(具有实菱形的线)、共有重链可变区(具有实心圆的线)以及培养基对照(具有空心圆的线)的稀释度作为函数。(C)存在或缺乏缓激肽(在图下部，分别表示为“+”或“-”)情形下，SV-T2细胞和具有BKCDR3、BKCDR4、或BKCDR5可变区的抗体或具有重链共有可变区(ConVH)的抗体温育的PGE2刺激结果(用Pg／孔表示PGE2的量)，结果分别用条形图表示。
5．本发明详述
本发明涉及修饰的免疫球蛋白分子，尤其是免疫特异性地与结合对的第一个成员结合的抗体(例如用本领域熟知的测定针对其抗原的抗体结合特异性的任何方法确定免疫特异性，例如，下面5．7节描述的方法，并且该免疫特异结合排除非特异结合，但对天然出现的抗体常观察到的交叉反应性不是必需的)，并且这些抗体至少拥有一个含有来自结合对的第二个成员的氨基酸序列的互补决定区(CDR)，这些分子的氨基酸序列是一种针对结合对第一个成员的结合序列。结合对可以是任意2个分子，包括互相之间能相互作用的蛋白、核酸、糖类或脂类，尽管优选的结合配对分子(结合位点来源于该分子)是一种蛋白分子。在优选的实施方案中，该抗体含有一种针对癌抗原(即癌或肿瘤细胞表面的分子)、传染病抗原(即在传染病病原表面的分子)、相对于病原或受体或配体的细胞受体(优选受体-配体结合对的受体或配体，其中该配体与受体结合并由此引起生理应答)的结合序列。
本发明也提应用本发明的修饰免疫球蛋白的治疗方法，例如，不限制使用方式，拥有至少一个CDR的修饰抗体可用于治疗或预防癌症或传染病，这些疾病的特征是存在特异的抗原通过该抗原把传染病病原与特异受体结合，修饰抗体拥有的CDR含有一种针对特异癌抗原或传染病病原的抗原或相应于传染病病原的细胞受体的结合序列。
本发明也提供用本发明的修饰免疫球蛋白诊断和筛选的方法，例如，不限制使用方式，拥有至少一个CDR的修饰抗体能用于检测以特异抗原或传染病病原与特异受体为特征的癌症或传染病，该修饰抗体拥有的CDR含有一种针对特异癌抗原或传染病病原的抗原的结合序列。
为了清楚地披露本发明的内容但不是限制本发明，将下列分为各小节内容中详细描述本发明。
5．1修饰的免疫球蛋白分子
本发明提供修饰免疫球蛋白分子，尤其是抗体，这些分子与结合对的第一个成员免疫特异地结合(即通过本领域熟知的测定针对其抗原的抗体结合特异性的任何方法确定，例如，如下面5．7节中描述的方法)，其中抗体的CDRs中至少一个含有针对结合对第一个成员的结合位点，该结合位点来源于结合对其它成员的氨基酸序列。在本发明优选的一个方面，结合位点的氨基酸序列在未在天然CDR中发现。
结合位点的氨基酸序列可通过本领域熟知的任何方法鉴别。例如，在某些情形中，已经确定结合对某一成员的序列直接与结合对的其他成员的结合有关。在该情况下，上述的序列能用于构建合成抗体的CDR，该合成抗体特异地识别结合对的其他成员。如果在结合对一个成员对结合对其他成员的结合位点的氨基酸序列未知情况下，可通过本领域任何熟知的方法确定，例如但不局限于分子建模方法或实验方法，如测定针对结合到其它成员的该成员的部分(如肽类)，或在该成员中突变并测定哪种突变阻断结合的方法。
结合对可以是任何2种分子，包括能互相作用的蛋白类、核酸类、糖类或脂类，尽管优选的结合配对分子(结合位点来源于此)是一种蛋白分子。在优选的实施方案中，修饰免疫球蛋白含有针对癌抗原、传染病抗原、病原的细胞受体或参与受体-配体结合对的受体或配体。
在具体的实施方案中，结合对是蛋白-蛋白相互作用对，它们是同型相互作用(即，2种相同蛋白之间的相互作用)或异型相互作用(即，2种不同蛋白之间的相互作用)。
在一具体的实施方案中，第一个成员是配体-受体结合对的一个成员，优选配体结合到受体然后激发诸如细胞内信号传递的生理应答的受体-配体结合对的一个成员。作为举例的方式而不是限制本发明，配体或受体可以是激素、自体有效物质生长因子、细胞因子或神经递质、或相应于激素、自体有效物质、生长因子、细胞因子或神经递质的受体、或涉及信号转导的任何受体或配体。(关于信号转导通路的综述，如见Campbell，1977，儿科杂志131：S42-S44；Hamilton，1977，J．Leukoc．Biol．62：145-155；Soede-Bobok & Touw，1977，分子医学杂志75：470-477；Heldin，1995，细胞80：213-223；Kishimoto等，1994，细胞76：253-262；Miyajima等，1992，免疫学年评10：295-331；和Cantley等，1991，细胞64：281-302)。)在具体的实施方案中，结合对的一个成员是配体，例如但不局限于缩胆囊肽、galanin、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、趋化因子、瘦素、蛋白酶、神经肽Y、神经激肽-1、神经激肽-2、神经激肽-3、铃蟾肽、胃泌素、促肾上腺皮质素释放激素、内皮素、褪黑激素、促生长素抑制素血管活性肠肽、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、多巴胺、内皮素、或对应于这些配体任一种的受体。在其他实施方案中，结合对的一个成员是受体、例如，但不局限于阿片样受体、葡萄糖转运蛋白、谷氨酸受体、狐独素受体、红细胞生成素受体、胰岛素受体、酪氨酸激酶(TK)受体、KIT干细胞因子受体、神经生长因子受体、胰岛素样生长因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、促生长素受体、来源于胶质细胞的神经营养因子受体或gp39受体、G-蛋白受体类或β-肾上腺能受体，或结合任一种这些受体的配体。在另一实施方案中，结合对成员之一是配体门控的离子通道、例如但不局限于钙通道、钠通道或钾通道。在一些实施方案中，本发明提供免疫特异地与受体结合的修饰免疫球蛋白，并且这些蛋白是结合所述受体的配体拮抗剂，例如但不局限于内啡肽、脑啡肽或伤害肽的拮抗剂。在其他实施方案中，本发明提供免疫特异地结合受体的合成修饰抗体，这些抗体并且是所述受体的激动剂，例如但不局限于内啡肽、脑啡肽或伤害肽受体。在一优选的实施方案中，修饰免疫球蛋白不结合到纤连蛋白受体上。在另一优选的实施方案中，该结合序列不是Arg-Gly-Asp，也不是结合序列的多体，并且优选地不是序列Arg-G1y-Asp的多体。
在其它具体的实施方案中，修饰免疫球蛋白拥有一个CDR，该CDR含有对应于一转录因子的结合位点。在优选方面，修饰免疫球蛋白不与特异DNA序列结合，尤其是不与转录因子结合位点结合。
在优选的实施方案中，修饰免疫球蛋白至少拥有一个CDR，该CDR含有针对癌抗原或肿瘤抗原的结合位点的氨基酸序列(如：下面5．3．1节中详细描述)，更优选的抗原是人结肠癌相关抗原或表皮粘蛋白抗原。在其他实施方案中，至少修饰免疫球蛋白的一个CDR含有针对人乳脂肪小球受体的结合位点的氨基酸序列。在其它实施方案中，修饰免疫球蛋白拥有至少一个CDR，所述的CDR含有针对如下肿瘤的抗原的结合位点的氨基酸序列，这些肿瘤为乳腺、卵巢、子宫、前列腺、膀胱、肺、皮肤、胰腺、结肠、胃肠道、B淋巴细胞或T淋巴细胞的肿瘤。
在本发明的其他优选实施方案中，修饰抗体的至少一个CDR含有针对传染病病原的抗原的结合位点或传染病病原细胞受体的结合位点的氨基酸序列(例如，下面5．3．2节中详细描述)，优选结合位点不是疟原虫的抗原的氨基酸序列，或不是结合位点Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro。在另外实施方案中，修饰抗体拥有含针对细菌或病毒酶结合位点的CDR。
本发明修饰免疫球蛋白分子可来源于任何类型的免疫球蛋白分子，例如但不局限于抗体、T细胞受体、B细胞受体、诸如辅因子CD4、CD8、CD19的细胞表面粘附分子和MHC分子的不可变区。在本发明一个优选的实施方案中，该修饰免疫球蛋白分子是一种抗体，它可以是任何种类的抗体，如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA，优选抗体是IgG。此外，抗体可以是任一种特异类型抗体的亚类。在另一个具体的实施方案中，修饰免疫球蛋白分子是一种T细胞受体。
为产生修饰过的免疫球蛋白，被修饰的免疫球蛋白可以是任何可得到的免疫球蛋白分子，优选单克隆抗体或合成抗体。被修饰的抗体可以是天然产生或先前存在的抗体或根据熟知的共有序列合成的，例如在图4A和B所示的轻和重链可变区的共有序列，或任何其他抗体共有序列或胚系(即没有重组的基因组序列)序列(例如，在Kabat等，1991，免疫学目的蛋白的序列，第5版，NIH出版号91-3242，2147-2172页所描述的那些抗体共有序列和胚系序列)。
如上面所解释的那样，每种抗体分子有6个CDR序列，轻链上有3个和重链上3个，并且这些CDRs的5个是胚系CDRs(即，没有经过任何重组，直接来源于该动物的胚系基因组序列)和这些CDRs的一条是非胚系CDR(即，通过胚系序列重组产生的与该动物胚系基因组序列不同的序列)。一个CDR是否是胚系或非胚系序列，可通过测定CDR序列，然后与如Kabat等(1991，免疫目的蛋白的序列，第5版，NIH出版号91-3242，2147-2172)所列出的已知胚系序列比较后确定。与已知胚系序列的明显变化表明该CDR是一种非胚系CDR。
相应地，在本发明的其他实施方案中，含有结合位点氨基酸序列的CDR是胚系CDR或另外是非胚系CDR。
结合位点可被插入到所述抗体的任一个CDRs中，并且把结合位点插入到抗体不同的CDRs中然后筛选产生的能与结合对的特殊成员结合的修饰抗体，这一技术在本领域的技术人员掌握之中，如下面5．7节所讨论的技术。由此，人们能确定哪种CDR最适合含有结合位点。在具体的实施方案中，修饰重或轻链可变区的CDR，使其含有结合位点的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，修饰抗体含有一个可变区，其中，重链可变区的第一、第二或第三个CDR或轻链可变区的第一、第二或第三个CDR含有结合位点的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，多于1个CDR含有结合位点的氨基酸序列，或者多个1个CDR每个含有针对相同分子的不同结合位点或含有针对不同分子的不同结合位点。尤其是一实施方案中，工程改造2个、3个、4个、5个或6个CDRs，使其含有针对结合对第一个成员的结合位点。在一优选的实施方案中，1个或多个CDRs含有针对对合对第一个成员的结合位点，和1个或多个CDRs含有针对诸如但不局限于T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞、TIL细胞或嗜中性细胞的免疫细胞表面分子的结合位点。例如，具有一个针对癌抗原或传染病病原的结合位点和一个针对免疫细胞表面分子的结合位点的修饰抗体，能用于把免疫细胞导向到负载有癌抗原的癌细胞或导向到传染病病原上。
在本发明具体的实施方案中，结合位点的氨基酸序列是没有取代CDR本身任何氨基酸序列而插入到CDR中，或者是，结合位点的氨基酸序列取代全部或部分CDR的氨基酸序列。在具体的实施方案中，结合位点的氨基酸序列取代CDR序列的1、2、5、8、10、15或20个氨基酸。
CDR中的结合位点的氨基酸序列是与结合对的成员结合必需的最小结合位点(它可通过本领域熟知的任何方法实验测定)；另外，结合位点可以比与结合对的成员结合必需的最小结合位点更大。在具体的实施方案中，结合位点的氨基酸序列至少是长度为4个氨基酸、或至少长度为6、8、10、15或20个氨基酸。在其他实施方案中，结合位点的氨基酸序列长度不超过10、15、20或25个氨基酸，或长度为5-10、5-15、5-20、10-15、10-20或10-25个氨基酸。
此外，CDR的总长度(即，结合位点序列和CDR序列的其余部分的合并长度)应该有合适的氨基酸数目，以允许该抗体结合到抗原上。表1提供观察到的CDRs含有氨基酸残基数目的范围和观察到的CDRs大小范围(由表2说明的缩写注明)。
表1CDR       残基数目L1         10-17L2           7L3         7-11H1         5-7H2         9-12H3         2-25
(由Kabat和Wu，1971，纽约科学院年报190：382-93页的资料编写)
虽然许多CDR H3区长为5-9残基，已观察到某些CDR H3区比此更长。尤其是，许多抗病毒的抗体有长为17-24个残基的重链CDR H3区。
相应地，在本发明具体的实施方案中，含有结合位点的CDR范围在表1所提供的有关特异CDR的大小范围之中，即，如果它是轻链的第一个CDR，L1，该CDR为10～17个氨基酸残基；如果它是轻链的第二个CDR，L2，该CDR为7个氨基酸残基；如果它是轻链的第三个CDR，L3，该CDR为7～11个氨基酸残基；如果它是重链的第一个CDR，H1，该CDR为5～7个氨基酸残基；如果它是重链的第二个CDR，H2，该CDR为9～12个氨基酸残基；以及如果它是重链的第三个CDR，H3，该CDR为2～25个氨基酸残基。在其他具体的实施方案中，含有该结合位点的CDR长度为5-10、5-15、5-20、11-15、11-20、11-25或16-25个氨基酸。在其他实施方案中、含有结合位点的CDR长度至少为5、10、15或20个氨基酸或不多于10、15、20、25或30个氨基酸。
在具体的实施方案中，本发明的修饰免疫球蛋白含有可变区一部分，即，其中轻或重链含有比构架区和3个CDRs更少，例如但不局限于其中可变区含有1或2个CDRs，而优选地含有介入构架区。
在具体的实施方案中，该修饰抗体免疫特异地与缓激肽受体结合(例如，但不局限于下面第6节描述的修饰抗体)。尤其是，该实施方案提供一种修饰抗体，其中至少1个CDR含有Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg的氨基酸序列。
在其他具体的实施方案中，修饰抗体免疫特异地与人乳脂肪小球抗原结合，并且修饰抗体的CDRs至少一个中含有选自下列的氨基酸序列：(i)Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu(SEQID NO：4)；(ii)Glu-Ile-Leu-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(SEQ ID NO：5)；(iii)Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr(SEQ ID NO：6)；(iv)Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO：7)；(v)Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser(SEQ ID NO：8)；and(vi)Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr(SEQ ID NO：9)．
在一更具体的实施方案中，重链可变区的CDRs含有上述(ⅰ)-(ⅲ)的氨基酸序列，而轻链可变区的CDRs含有上述(ⅳ)-(ⅵ)的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，本发明提供一种与人结肠癌相关抗原免疫特异结合并且包含一个可变区的修饰抗体，该可变区至少拥有一个含下列氨基酸序列之一的CDR：Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala(SEQ ID NO：10)；Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr(SEQ ID NO：11)；Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO：12)；Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn(SEQ ID NO：13)；Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(SEQ ID NO：14)；or Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr(SEQID NO：15)．
构建含有修饰CDRs的抗体后，能进一步改变成筛选修饰抗体，以选择出具有更高亲和性或特异性的抗体。通过本领域熟知的任何方法可产生和选出对靶抗原具有更高亲和性或特异性的抗体。例如但不局限于以下方法，编码合成修饰抗体的核酸能随机地即化学或定点诱变或在编码修饰抗体的核酸特定位置制造特异突变方法产生，然后筛选对靶抗原结合亲和性来源于突变核酸分子的抗体来获得。由逐个检测表达的抗体分子或筛选突变序列的文库，如通过噬菌体展示技术(如见，美国专利号5，223，409；5，403，484和5，571，698，所有专利由Ladner等人完成；PCT由McCafferty等人完成的PCT出版物WO 92／01047专利或本领域熟知的任何其他噬菌体展示技术)，完成筛选过程。
相应地，在一具体的实施方案中，所述的修饰抗体对抗原比天然产生的免疫特异地结合相同抗原的抗体拥有更高的特异性或亲和性。在另一个实施方案中，修饰抗体表现为对至少2×107M抗原的稳定结合。
本发明修饰抗体也可以用本领域熟知的修饰抗体的任何方法进一步修饰，只要进一步的修饰不阻止或抑制修饰抗体与特异抗原的结合。尤其是，除了用结合序列的氨基酸序列插入或取代CDR序列外，本发明的修饰抗体可以有1个或多个氨基酸替换、缺失或插入。上述氨基酸替换、缺失或插入可以是任何形式的替换、缺失或插入，但不能阻止或抑制修饰抗体与靶抗原的免疫特异结合。例如，上述氨基酸替换包括功能拉近的氨基酸残基的替换。例如，1个或多个氨基酸残基能被极性相似，功能相近的另外氨基酸替换，结果产生沉默改变。对氨基酸的替换可以从该氨基酸所属类别的其他成员中选出。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸。
另外，序列中1个或多个氨基酸残基能被非经典氨基酸替换，或化学氨基酸类似物以替换或添加方式导入到免疫球蛋白序列中。非经典氨基酸包括但不局限于普通氨基酸的D-异构型体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟基氨基酸、设计的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
在本发明的一个具体实施方案中，该修饰免疫球蛋白进一步被修饰，以增强其诱导抗独特型应答的能力，例如按由Burch申请的美国专利申请系列号＿＿，题目“增强激发抗独特型应答能力的修饰抗体”，提交日期1998年11月13日(代理人存档号6750-015)所描述的方法进行，该专利作为整体在此引入仅供参考。使用上述修饰方法，例如移去或还原链内或链间二硫键，以降低对免疫球蛋白可变区的构象限制。具体而言，修饰免疫球蛋白被进一步修饰，这样形成二硫键的1个或多个可变区半胱氨酸残基被不具有巯基的氨基酸残基所取代。
在特异抗体的可变区中鉴别形成二硫键的半胱氨酸残基可通过本领域熟知的任何方法完成。例如，但此处并非限制描述，形成链内二硫键的半胱氨酸残基在各种抗体和相互物种中高度保守，这一事实在本领域众所周知。因此，通过与已知哪一个残基形成二硫键的其他抗体分子的序列比较，能鉴别参与二硫键形成的半胱氨酸残基(例如图4A和E提供的共有序列，或在Kabat等，1991，免疫目的蛋白的序列，第5版，美国健康和人类服务，贝苏达，马里兰)。
表1提供针对许多抗体分子形成二硫键的半胱氨酸残基的位置列表。
表1
(资料来源于Kabat等，1991，免疫目的蛋白的序列，第5版，美国健康和人类服务部，贝苏达，马里兰)
Figure 9881311700361
由()包括的位置数表示该蛋白对应于该位置不是序列数，但该残基序列数量通过与已知序列比较推论出来。
值得注意的是，对表1列出的全部抗体分子，形成链内二硫键的半胱氨酸残基为轻链可变区23和88位的残基和重链可变区22和92位的残基。该位置数指的是与共有序列中该残基相应的残基，由Kabat(1991，免疫目的蛋白的序列，第5版，美国健康和人类报务部，贝苏达，马里兰)确定或分别在图4A和E描述的重链和轻链可变区序列表示(把特异抗体序列和共有序列或图4A和E描述的重或轻链可变区的序列排列在一起确定)。
相应地，在本发明的一实施方案中，修饰免疫球蛋白分子被进一步修饰，这样轻链23和／或88位的残基用不含有巯基的氨基酸残基替换，和／或22和／或92位的残基用不含有巯基的氨基酸残基替换。
替换形成二硫键的半胱氨酸的氨基酸残基是任一种不含有巯基的氨基酸残基，如丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸盐(或天门冬氨酸)、谷氨酰胺、谷氨酸盐(或谷氨酸)、甘氨酸、异亮氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨盐、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。在一优选的实施方案中，半胱氨酸残基被甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺残基取代，最优选地被丙氨酸残基取代。
另外，形成二硫键的半胱氨酸残基可以被如上面所列的不含有巯基的非经典氨基酸或化学氨基酸类似物。
在具体的实施方案中，替换形成二硫键的残基是在重链可变区或在轻链可变区或者重链和轻链可变区。在其他具体的实施方案中，形成特异二硫键残基的一个被取代(或缺失)、或者是二个形成特异二硫键的残基被取代(或缺失)。
在其他具体的实施方案中，本发明提供修饰免疫球蛋白的功能性活性片段。功能性活性片段是指所述多肽能与靶抗原免疫特异结合，这种结合可用本领域测定免疫特异结合的任何已知方法(如按下面5．7节所述的方法)确定。例如，上述片段包括但不局限于F(ab′)2片段(含有重链和轻链可变区)、轻链恒定区和重链CH1结构域(该片段通过胃蛋白酶消化抗体产生的)、和Fab片段(由还原F(ab′)2片段的二硫键产生)(图1；King等，1992，生物化学杂志，281：317)、及Fv片段，Fv片段即含有重链和轻链可变区结构域的片段(Reichmann和Winter，1988，分子生物学杂志203：825；King等，1993，生物化学杂志290：273)。
本发明也包括单链抗体(SCA)(美国专利4，946，778；Bird，1988，科学242：423-426；Huston等，1988，美国国家科学院院报85：5879-5883；和Warol等，1989，自然334：544-546)。经氨基酸桥连接Fv区的重和轻链片段形成单链抗体，结果产生单链多肽。此外，本发明也提供重链和轻链二聚体和diabodies。
本发明进一步提供修饰抗体，该抗体可以是嵌合或人源化抗体的修饰抗体。嵌合抗体是一种抗体分子，该抗体分子的不同部分来源于不同动物物种的分子，如具有一个来源于鼠mAb的可变区和一个来源于人免疫球蛋白恒定区的恒定区的那些分子，如人源化抗体。已开发了生产嵌合抗体的技术(Morrison等，1984，美国国家科学院院报81：6851-6855；Neuberger等，1984，自然312：604-608；Takeda等，1985，自然314：452-454；国际专利申请号PCT／GB85／00392(Neuberger等和Celltech有限公司))，该技术是把来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自合适生物活性的人抗体分子基因拼接在一起。在一具体的实施方案中，合成修饰抗体是一种含有非人抗体可变区和人抗体恒定区的嵌合抗体。
在一更优选的实施方案中，修饰抗体是一种人源化抗体，尤其是该抗体中，抗体的CDRs(除了含有结合序列的1个或多个CDRs)来源于非人动物的抗体，而构架区和恒定区来源于人抗体(由Winter所有的美国专利号5，225，539)。已成功地构建了抗各种抗原的上述移植CDR抗体，例如Queen等(1989，美国国家科学院院报86：10029)描述的抗IL-2受体的抗体；Riechmann等(1988，自然332：323)描述的抗CAMPATH-细胞表面受体的抗体；Co等(1991，美国国家科学院院报)描述的抗乙型肝炎病毒的抗体；以及Tempest等(1991，生物技术9：267)描述的抗呼吸细胞体病毒的抗原的抗体。
使用各种方法，如(Jones等，1986，自然321：522；Riechmann等，1988，自然332：323)描述的定点诱变技术，完整移植CDR可变区的体外组装技术(Queen等，1989，美国国家科学院院报86：10029)；以及应用PCR合成移植CDR基因(Daugherty等，1991，核酸研究19：2471)等方法，构建移植CDR可变区基因。把鼠单克隆抗体的CDRs移植到人抗体的构架区产生移植CDR的抗体。移植后，大多数抗体从构架区中额外氨基酸变化受益，可维持亲和性，有可能这是因为构架区残基对维持CDR构象是必需的，并且已阐明构架区某些残基是抗原结合位点的部分。因此，在本发明的具体实施方案中，所述的修饰抗体包括一个可变区，其中至少1个构架区拥有一个或多个与天然出现的构架区中该部位的残基不同的氨基酸残基。
在本发明的一优选实施方案中，该修饰抗体来源于人单克隆抗体。通过应用转基因小鼠有可能制取完全的人单克隆抗体。用人免疫球蛋白基因座取代小鼠免疫球蛋白基因座的转基因小鼠提供体内亲和性成熟机制，以产生人免疫球蛋白。
在一些实施方案中，该修饰免疫球蛋白(或其片段)经共价键(例如，但不局限于肽键)在N-末端或C-末端与另一个不是修饰免疫球蛋白的蛋白(或其部分，优选地至少10、20、或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。优选地，该修饰免疫球蛋白在该免疫球蛋白恒定区的N-末端与其他蛋白共价连接。在优选的实施方案中，本发明提供所述的修饰免疫球蛋白质与生长增强因子部分或免疫刺激因子部分共价连接的融合蛋白，所连接的因子包括白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-10、白介素-12、白介素-15、G-集落刺激因子、肿瘤坏死因子、穿孔素、γ-干扰素和NK细胞抗原或MHC衍生肽。
例如，通过共价连接任何类型的分子可进一步修饰该修饰免疫球蛋白，只要上述共价连接不阻止或抑制该免疫球蛋白对其靶抗原免疫特异结合就行。例如，但不是仅限制于以下方法，所述的修饰免疫球蛋白例如经下列方法进一步修饰，这些方法包括糖苷化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护／阻断基团衍生化、蛋白水解性切割、与细胞配体或其他蛋白连接等。通过已知的技术可执行大量化学修饰方法的任一种，这些方法包括但不局限于特异化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该修饰抗体可含有1或多个如本节上述所列的非经典氨基酸。
在本发明具体的实施方案中，该修饰免疫球蛋白(或其片段)被共价地与一个治疗分子连接，例如，把治疗分子导向到特异的细胞类型或组织中，例如癌或肿瘤细胞。所述的治疗分子可以是本领域已知的任何类型的治疗分子，例如但不局限于化疗药、如蓖麻毒蛋白的毒素、反义寡核苷酸、放射性核素、抗生素、抗病毒药、或抗寄生虫药等。
5．2产生所述的修饰免疫球蛋白的方法
通过本领域已知的合成免疫球蛋白的任何方法，尤其是化学合成法或重组表达法能产生本发明的修饰免疫球蛋白，优选重组表达技术生产。
本发明的修饰免疫球蛋白或其片段的重组表达需要构建编码修饰免疫球蛋白的核酸。应用本领域已知的任何方法，例如重组技术或化学合成法(如见Creighton，1983，“蛋白质：结构和分子原理”W．H．Freeman & Co．N．Y．34-49页和Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，纽约)，或用对已知的免疫球蛋白基因PCR法以工程化制取编码含有结合位点的CDR序列的核苷酸序列，能产生上述含有编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列。
相应地，本发明提供含有编码本发明的修饰免疫球蛋白或其功能性活性片段的核苷酸序列的核酸。
优选地，编码修饰免疫球蛋白的核酸可以化学合成的寡核苷酸组装而成(如，按照Kutmeier等，1994，生物技术17：242描述的方法)，简言之，该方法包括合成一套含有编码该免疫球蛋白序列部分的且部分重叠寡核苷酸，退火和连接这些寡核苷酸，然后如下面第6节所示范的PCR法扩增所连接的寡核苷酸。
相应地，本发明提供一种产生编码修饰免疫球蛋白的核酸的方法，所述的方法包括：(a)合成一套寡核苷酸，该套寡核苷酸包括含有编码合成修饰免疫球蛋白的核苷酸部分序列和含有与编码合成修饰免疫球蛋白的核苷酸序列互补的部分核苷酸序列的寡核苷酸，并且除了那些含有编码合成修饰免疫球蛋白的N-末端和C-末端部分的核苷酸序列的寡核苷酸外，所述的每种寡核苷酸拥有和该套另一个寡核苷酸重叠的末端序列；(b)使这些寡核苷酸互相杂交或退火；以及(c)连接所杂交的寡核苷酸，这样产生了含有编码合成修饰免疫球蛋白的核苷酸序列的核酸。
或者，从含有编码例如抗体分子或至少抗体分子的可变区的核苷酸序列的核酸中，构建含有编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列的核酸。例如，用对特异的抗体分子特异的探针杂交方法或用合成能与该序列的3＇和5＇末端杂交的引物，而后PCR扩增出该序列的方法，能从已有的抗体分子或可变区的克隆中，或从合适来源中分离编码抗体分子或可变区的核酸获得含有编码抗体分子的核苷酸序列的核酸，这些来源优选cDNA文库，例如从表达抗体分子库或合成抗体文库的细胞或组织制备的抗体DNA文库或cDNA文库(如见，Clackson等，1991，自然352：624；Hane等，1997，美国国家科学院院报94：4937)。
一旦克隆到含有至少编码抗体分子一个可变区的核苷酸序列的核酸，那么该结合位点序列就能被插入到编码1个或多个CDRs的核苷酸序列中。上述特异CDR编码序列的工程操作，能通过本领域已知的常规重组DNA技术完成。例如，应用基于PCR的方法、体外定点诱变法等，由编码含有特异结合位点序列的CDR的核苷酸序列可取代所述的编码CDR的核苷酸序列。如果在CDR的核苷酸序列中存在常规的限制性内切酶位点，那么该序列能被限制性内切酶消化，然后含有编码结合位点的核苷酸序列的核酸片段能连接到限制性位点上。含有结合位点的核酸片段能从编码含有结合位点的蛋白的全部或部分核酸中得到，或者从含有编码结合位点和其反向补体的序列的合成寡核苷酸中产生。
编码修饰抗体的核酸可选择性地含有编码一条前导肽序列的核苷酸序列，该前导肽序列指导合成修饰抗体分子的分泌。
一旦获得了编码至少修饰抗体可变区的核酸，它就可导入到含有编码抗体恒定区的核苷酸序列的载体中(如见，PCT出版物WO 86／05807；PCT出版物WO 89／01036；和美国专利号5，122，464)。含有完全轻链或重链的载体可与所述的核酸共表达，以表达完整的抗体分子，而这些载体在本领域众所周知，如，pMRRO10．1和pGammaI(也见Bebbington，1991，酶学方法2：136-145)。
然后通过常规技术把表面载体转移到宿主细胞，然后用常规技术培养该转染细胞，以产生本发明的抗体。具体而言，一旦产生修饰抗体可变区的核酸，该修饰抗体能例如经第6节所举例的方法表达(也见Bebbington，1991，酶学方法2：136-145)。例如，所述的方法包括把编码修饰免疫球蛋白的表达载体瞬时转染到COS细胞中，培养该细胞合适的时间以使免疫球蛋白表达，然后收集从COS细胞培养上清液，该上清液含有分泌表达的修饰免疫球蛋白。
用于表达本发明重组抗体的宿主细胞可以是诸如大肠杆菌的细菌细胞，这些细胞尤其适于表达重组抗体片段，或者优选地真核细胞，这些细胞尤其适于表达重组抗体分子。尤其是，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞等哺乳动物细胞在来自人巨细胞病毒的主要立刻早期基因启动子元件控制下的抗体表达载体相结合是用于免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等，1986，基因45：101；Cockett等，1990，生物技术8：662)。
多种宿主表达载体系统可用于表达本发明的序列编码的抗体。上述宿主表达系统代表由载体可产生目的编码序列并接着纯化的载体，也可用合适的核苷酸编码序列转化或转染产生细胞，该细胞原位表达本发明的抗体产物。这些系统包括但不局限于诸如细菌的微生物(如，大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)、酵母(如酿酒酵母属、毕赤酵母属)、昆虫细胞系统、植物细胞系统或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293和3T3细胞)，其中用含有抗体编码序列的重组细胞噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化微生物；用含有抗体编码序列的理组酵母表达载体转化酵母；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；容有含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(如，腺病毒晚期启动子，痘菌病毒7．5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统。
在细菌系统中，依据待表达抗体的应用目的，可优选各种表达载体。例如，当为产生抗体药用组合物要生产大量的上述蛋白时，指导高水平表达且易于纯化的融合蛋白产物的载体是合乎要求的。上述载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBOJ．2：1791)(在pUR278中，抗体编码序列可单个地连接到具有lacZ编码区的载体内，以使融合蛋白产生)；pIN载体(Inouye &Inouye，1985，核酸研究13：3101-3109；Van Heeke &Schuster，1989，生物化学杂志264：5503-5509)等。也可用pGEX载体以表达带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。总的来说，上述融合蛋白是可溶的，并且利用其吸附和结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠上，然后用含游离谷胱甘肽的洗脱方法，从裂解细胞中容易地纯化该蛋白。pGEX载体设计有包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，这样所克隆的靶基因产物从GST组分中释放。
在昆虫系统中，苜宿纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)用作载体以表达外源基因。该病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以单个克隆到病毒的非必需区(例如多角体基因)并且置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，目的抗体编码序列可以连接到腺病毒转录／翻译控制复合体上，如晚期启动子和三联前导序列。然后该嵌合基因可以通过体外或体内重组技术插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区中(如E1或E3区)的插入可在感染突主中产生活的，并能表达抗体的重组病毒(如见Logan & Shenk，1984，美国国家科学院院报)。为使插入的抗体编码序列有效翻译，也需要特异的启动信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。而且，该起始密码子必须同时具有所需编码序列的阅读框，以保整完整插入片段的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的各种起源。表达的效率增强可通过包含合适的转录增强元件、转录终止子等进行(见Bittner等，1987，酶学方法153：516-544)。
此外，可选择宿主细胞株、以调节插入序列，或以特定需要的方式修饰和加工基因产物。上述蛋白产物的修饰方法(如糖苷化)和加工方法(如切割)可能对蛋白的功能是重要的。对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰，不同宿主细胞具有其特征性的和特异的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为达到本目的，可用真核生物宿主细胞，这些细胞拥有对初始转录体的合适加工，基因产物的糖苷化和磷酸化的细胞机制。上述哺乳动物宿主细胞包括但不局限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38。
为了长期高产量地生产重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可工程处理稳定表达抗体的细胞系。不用含有病毒复制原始序列的表达载体，用由合适表达控制元件(如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷化位点等)和可选择的标记控制的DNA转化宿主细胞。导入外源DNA后，工程细胞可在营养丰富的培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基中。在重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体上，然后生长形成转化灶，结果该转化灶被克隆并且扩大成细胞系。该方法有益于构建表达该抗体的工程细胞系。上述工程化细胞系在筛选和评价直接或间接与抗体相互作用的化合物中特别有用。
可用许多选择系统，这些系统包括但不局限于分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等，1977，细胞11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska &Szybalski，1962，美国国家科学院院报48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，细胞22：817)基因。另外，可用抗代谢物抗性作为下列基因的选择基础：dhfr赋予对氨甲蝶蛉的抗性(Wigler等，1980，美国国家科学院院报77：3567；O＇Hare等，1981，美国国家科学院院报78：1527)；gpf赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，1981，美国国家科学院院报78：2072)；neo赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物学杂志150：1)以及hygo赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30：147)。
通过载体扩增法能增加合成修饰抗体的表达水平(综述见Bebbington和Hentschel，在DNA克隆中基于基因扩增法在哺乳动物细胞中表达克隆基因的载体的用途，第3卷(学术出版社，纽约，1987))。当在表达免疫球蛋白的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中的抑制剂水平将增加标记基因的拷贝数目。由于所扩增的基因和免疫球蛋白基因相连接，免疫球蛋白的产生也将增加(Crouse等，1983，分子细胞生物学3：257)。
所述的宿主细胞可以用本发明的2种表达载体的共转染，第一个载体编码来源于重链的多肽而第二个载体编码来源于轻链的多肽。这2种载体可以含有一致的可选择标记，该标记使重链和轻链多肽等量表达，或者是，使用单一载体，该载体编码重链与轻链多肽在上述情况下，轻链应该置于重链之前，以避免有毒的自由重链过度(Proudfoot，1986，自然322：562；Kohler，1980，美国国家科学院院报77：2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
本发明提供一种含有编码合成抗体的载体的重组细胞，该抗体拥有一个CDR区，该区含有来自结合对一个成员的活性结合位点的氨基酸序列。
5．3．合成修饰抗体的治疗用途
本发明也提供通过施用本发明的治疗药物(在此术语为“治疗药物”)，用于治疗或预防和特异分子表达有关的疾病和失调的方法。上述治疗药物包括本发明的修饰免疫球蛋白，和其功能性活性片段(例如上面5．1节所述的)，以及编码本发明修饰免疫球蛋白和其功能性活性片段的核酸(例如上面5．2节所述的)。
一般来说，施用与受试者具有相同的物种起源或物种反应性产物方法是优选的。因此，在优选的实施方案中，本发明的治疗方法用一种来源于人抗体的修饰抗体；在其他实施方案中，本发明的方法用一种来源于嵌合或人源化抗体的修饰抗体。
具体而言，含有免疫特异性地结合特异分子的本发明修饰抗体(或其功能性活性片段)的药用组合物，能用于治疗或预防和特异分子如抗原表达有关的疾病或失调。在具体方面，下列分题中更详细地讨论的实施方案中，免疫特异地结合肿瘤或癌抗原或传染病病原的抗原或针对传染病病原的细胞受体的修饰抗体，能用于治疗或预防与特异抗原的表达有关的肿瘤、癌症或传染病。免疫特异地结合配体或受体的修饰免疫球蛋白能用于治疗或预防增加或降低特异配体受体的数量的缺陷有关的疾病。在一些实施方案中，所述的修饰免疫球蛋白用于治疗或预防自身疾病，这些疾病包括但不局限于风湿性关节炎、狼疮、溃疡性结肠炎或牛皮癣。该修饰免疫球蛋白也可以用于治疗变态反应。
可用于本发明的受试者可以是任一种哺乳动物或脊椎动物物种，这些物种包括但不局限于牛、马、绵羊、猪、禽(如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠、大鼠、猴、兔子、黑猩猩和人类。在一优选的实施方案中，受试者是人类。
5．3．1癌症的治疗和预防
本发明提供治疗或预防其特征为存在结合对成员的特异癌抗原的癌症的方法。该方法包括给需要上述治疗或预防的受试者施用本发明的治疗药物、例如免疫特异地与特异癌抗原结合的合成修饰抗体(或其功能性活性片段)，该抗体包含一个具有CDR的可变区，所述的CDR含有针对癌抗原的结合位点的氨基酸序列。
通过施用本发明的合成修饰抗体，能治疗或预防癌症，这些癌症包括但不局限于恶性肿瘤、肿瘤、转移性肿瘤或任何以不受控制的细胞增殖为特征的疾病或失调，该修饰抗体免疫特异地与一种或多种待治疗或预防的癌症的癌细胞有关的抗原结合。特异的治疗药物是否对治疗或预防某些癌症有效，能通过本领域任何已知的方法确定，例如但不局限于下面5．6节中所述的那些方法。
例如，但不是限制本发明的方式，通过施用含有能CDR序列能识别下列癌抗原的本发明的合成抗体，能治疗或预防与所述抗原有关的癌症和肿瘤：KS 1／4全癌抗原(Perez和Walker 1990，免疫学杂志142：3662-3667：Bumal，1998，杂交瘤Z(4)：407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，199l癌症研究51(2)：468-475)、前列腺酸磷酸(Tailor等，1990，核酸研究18(16)：4928)、前列腺特异抗原(Henttu和Vihko，1989，生物化学生物物理研究通讯160(2)：903-910；Israeli等，1993，癌症研究53：227-230)、黑色素瘤相关抗原p97(Estin等，国家癌症研究院杂志81(6)：445-446)、黑色素瘤抗原gp75(Viiayasardahl等，1990，实验医学杂志171(4)：1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，癌症59：55-63；Mittelman等，1990，临床研究杂志86：2136-2144)、前列腺特异膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，美国临床肿瘤学会学报13：294)、多形表皮粘蛋白抗原、人乳脂肪白细胞抗原、结直肠肿瘤相关抗原如：CEA、TAG、72(Yokata等，1992，癌症研究52：3402-3408)、GICA 19-9(Herlyn等，1982，临床免疫学杂志2：135)、CTA-1和LEA、Burkitt＇s淋巴瘤抗原38．13．CD19(Ghetie等，1994，血液83：1329-1336)、人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，血液83：435-445)、CD33(Sgouros等，1993，核酸医学杂志34：422-430)、黑色素瘤特异抗原如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，免疫学杂志，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，癌症免疫学和免疫治疗36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等，1994，临床肿瘤学杂志12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon等，1993，癌症研究53：5244-5250)、诸如包括下抗原DNA肿瘤病毒的病毒诱导的肿瘤抗原和RNA肿瘤病毒的被膜抗原等肿瘤特异转移型细胞表面抗原(TSTA)、癌胎抗原-α-胎儿蛋白如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌肥抗原(Hellstrom等，1985，癌症研究45：2210-2188)、分化抗原如人肺癌抗原L6、L20、(Hellstrom等，1986，癌症研究，46：3917-3923)、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988，免疫特异性杂志141：1398-1403)、新糖蛋白、鞘脂类、乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、多型表皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，生物化学科学趋势17：359)、恶性肿瘤人淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，科学245：301-304)、分化抗原(Feizi，1985，自然314：53-57)如在胎儿红细胞中、初级内胚层中找到的I型抗原、在成人红细胞、前移植性胚胎中找到的I型抗原、在胃腺癌中找到的I(Ma)、在乳腺表皮找到的M18、M39、在类髓细胞中找到的SSEA-1、在直结肠癌中找到的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、在结肠腺癌中找到的TRA-1-85(血型H)、C14、在肺腺癌中找到的F3、在胃癌中找到的AH6、在胚胎性癌细胞中找到的Y半抗原、Ley、在A431细胞中找到的TL5(血型A)、EGF受体、在胰腺癌中找到的E1系列(血型B)、在胚胎性癌细胞中找到的FC10．2、胃腺癌抗原、在腺癌中找到的CO-154(血型Lea)、在腺癌中找到的NS-10、在AC31细胞EGF受体中找到的CO-43(血型Leb)、G49、在结肠癌中找到的19．9、胃癌粘蛋白、在髓样细胞中找到的T5A7、在黑色素瘤中找到的R24、在胚胎性癌细胞中找到的GD．3、D1．1、DFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1：22：25：8、以及在4～8细胞期胚胎中找到的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方案中，抗原是一种来源于皮肤T淋巴细胞瘤(见Edelson，1998，癌症杂志4：62)的T细胞受体衍生肽。
在本发明的其他实施方案中，接受所述的修饰抗体治疗的受试者，可选择性地接受诸如手术、放射治疗和化学治疗等其它癌症治疗。具体而言，用于治疗或预防癌症的本发明治疗药物，可以和一种或联合形式的化疗药物一起施用，这些化疗药物包括但不局限于氨甲喋呤、紫杉醇、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、碳铂、丝裂霉素、氮烯咪胺、甲基苄肼、鬼乙叉苷、喜树碱、博菜霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、柔红霉素、放线菌素、褶皱霉素、半托蒽醌、天冬酰胺酶、长春花碱、长春新碱、维诺利宾、paclitaxel、docetotaxel等。在一个优选的实施方案中，合成修饰抗体与化疗药或其它类型的毒素相结合，如蓖麻毒素或放射性核素或其它任何有效地杀死癌或肿瘤细胞或抑制癌细胞生长的其他药剂。在另一个优选的实施方案中，该修饰免疫球蛋白拥有一个含有针对癌抗原的结合位点的CDR1和另一个含有针对免疫细胞表面分子的结合位点的CDR，所述的免疫细胞例如但不局限于T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞、TIL细胞或嗜中性细胞。
在本发明的一些实施方案中，其中合成修饰抗体的CDR包括一种免疫特异地与人结肠癌相关蛋白抗原结合的氨基酸序列，所述的抗体拥有下列特性是优选的：(ⅰ)识别抗原的蛋白组分表位但不识别抗原糖类组分表位的抗体；(ⅱ)在正常人组织中检测不到的抗原；(ⅲ)除了结肠癌细胞外的人癌细胞中检测不到的抗原。在其他实施方案中，合成修饰抗体的CDR包括免疫特异地与一种抗原结合的氨基酸序列，该抗原除了乳腺癌细胞外的人癌细胞中检测不到。仍在其他实施方案中，合成修饰抗体的CDR包括免疫特异地与一种抗原结合的氨基酸序列，该抗原除了卵巢癌细胞外的人癌细胞中检测不到。
5．3．1．1恶性肿瘤
由施用本发明的治疗药物能治疗或预防的恶性肿瘤和相关失调包括但不局限于在表2中所列出的那些种类(关于这些失调的综述，见Fishman等，1985，医学，第二版，J．B．Lippincott Co．，Philadelphia)：
表3
恶性肿瘤和相关失调
白血病
急性白血病
急性淋巴细胞白血病
急性髓细胞白血病
成髓细胞性
早幼粒髓细胞
单核髓细胞
单核细胞
红白血病
慢性白血病
慢性髓细胞(单核细胞)白血病
慢性淋巴细胞白血病
真性细胞增多症
淋巴瘤
何杰金病
非何杰金病
多发性骨髓瘤
Waldenstrom′s巨球蛋白血症
重链病
实体瘤
肉瘤和癌
纤维肉瘤
粘液肉瘤
脂肉瘤
软骨肉瘤
成骨肉瘤
脊索瘤
血管肉瘤
内皮肉瘤
淋巴管肉瘤
淋巴管内皮瘤
滑膜瘤
间皮瘤
尤因瘤
平滑肌瘤
成横纹肌肉瘤
结肠癌
胰腺癌
乳腺癌
卵巢癌
前列腺癌
鳞状细胞癌
基底细胞癌
腺癌
汗腺癌
皮脂腺癌
乳头癌
乳头腺癌
囊腺癌
髓质癌
支气管癌
肾细胞癌
肝癌
胆管癌
绒毛膜癌
精原细胞瘤
胚胎性癌
维尔姆斯瘤
宫颈癌
子宫癌
睾丸瘤
肺癌
小细胞肺癌
膀胱癌
上皮肉瘤
神经胶质瘤
星形细胞瘤
成神经管细胞瘤
颅咽管瘤
室管膜瘤
松果体瘤
成血管细胞瘤
神经瘤
少突神经胶质瘤
脑膜瘤
黑色素瘤
成神经细胞瘤
成视网膜瘤
在具体的实施方案中，治疗或预防在卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰腺、前列腺、子宫、胃肠道、B淋巴细胞或T淋巴细胞中的恶性或增殖失调变化(如组织变形和发育异常)或过度增殖失调。在其他具体实施方案中，可治疗或预防肉瘤、黑色素瘤或白血病。
5．3．1．2．癌前期病情
也能施用本发明的治疗药物以治疗癌前期病情和预防包括但不局限于表3所列的那些失调的瘤形成或恶性状态。在已知或疑有向瘤形成或癌方向发展的病情使用上述预防或治疗，尤其是由增生、组织变形组成的非瘤形成的细胞增殖，或特别是发育异常(关于上述异常增殖病情的综述见，Robbins和Angell 1976，基础病理学，第2版，W．B．Saunders Co．，Philadelphia，68-79页)。增生是一种不明显改变结构或功能但涉及组织或器官中细胞数量增加的受控的细胞增殖形式。如仅在一个实施例中那样，子宫内膜增生经常先于子宫内膜癌。组织变形是一种受控的细胞生长的形式，在该形式中，1种类型的成年或完全分化细胞替换另1种类型的成年细胞。组织变形能在表皮或结缔组织细胞中出现。非典型的组织变形包括有点紊乱的组织变形性表皮。发育异常通常是癌症的前兆，主要在表皮中发现；这是非瘤形成性细胞生长最紊乱的形式，包括细胞个体均一性的丢失和细胞空间结构定向的丢失。发育异常的细胞经常具有异常大的染色深细胞核，并且表现为多形性。发育异常的特征是存在慢性刺激或炎症的部位出现，并且常在子宫颈、呼吸道、口腔和胆囊中找到。
另外或除了存在以增生、组织变形或发育异常为特征的异常细胞生长外，来自病人细胞样品，在体内或体外显示存在1种或多种转化表型或恶性表型的特征时，就表明需要预防性／治疗性施用治疗药物。如上面提到的那样，上述转化表型的特征包括形态变化、较松驰的基质附着性、丧失接触抑制、丧失锚定依赖性、释放蛋白酶、增加糖运输、降低血清需求、表达胎儿抗原、250，000道尔顿细胞表面蛋白消失等等(有关与转化或恶性表型相关的特征，也见同上，84-90页)。
在一具体的实施方案中，粘膜白斑病、表皮良性出现的增生或发育异常性损伤、或鲍界病、原位癌症为前瘤形成性损伤，表明需要预防性介入治疗。
在另一实施方案中，纤维囊性病(囊性增生、乳房发育异常，尤其是腺病(良性表皮增生))表明需要预防性介入治疗。
在其他实施方案中，通过施用本发明有效量的治疗药物治疗表现为下列1种或更多种倾向于恶性的因素的病人：与恶性有关的染色体易位(如慢性骨髓性白血病的费城染色体、滤泡淋巴瘤的t(14：18)等等)、家族性息肉病或加德纳综合症(可能结肠癌的前兆)、良性单克隆丙种球蛋白症(可能为多发性骨髓瘤的前兆)、和患有癌或前癌性病表现为孟德尔式(遗传性)遗传类型的人员有关的直系亲属关系，这些孟德尔式遗传类型为(如结肠的家族性息肉病、加德纳综合症、遗传性外生骨疣、多内分泌腺腺瘤病、具有淀粉样和成嗜铬细胞瘤的髓质甲状腺癌、Peutz-Jeghers综合症、Von Recklinghausen神经纤维瘤病、成视网膜瘤、颈动腺体瘤、皮肤黑色素癌、眼内黑色素癌、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、切迪阿克-东综合症、白化病、范可尼再生障碍性贫血和Bloom＇s综合症，见Robbins和Angell，1976，基础病理学，第2版，W．B．Saunders Co．，Philaolephca 112-113页)等)。
在另一具体的实施方案中，给病人施用本发明的治疗药物以预防卵巢、乳腺、结肠、胰腺、膀胱、皮肤、前列腺、结肠、胃肠道、B淋巴细胞、T淋巴细胞或子宫癌、或黑色素瘤或肉瘤的发展。
5．3．2传染病的治疗
通过施用本发明的治疗药物，尤其是施用与引起传染病病原的抗原或针对传染病病原的细胞受体或由传染病病原表达的酶免疫特异结合的合成修饰免疫球蛋白(或其功能性活性片段)，本发明也提供治疗或预防传染病的方法。如在下面详细讨论的那样，传染性病原包括但不局限于病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫。
在具体的实施方案中，通过施用免疫球蛋白的修饰抗体(或其功能性活性片段)预防或治疗传染病，所述的修饰抗体免疫特异地识别下列传染病病原的抗原之一：流感病毒血凝素(基因库登记号JO 2132，Air，1981，美国国家科学院院报78：7639-7643；Newton等，1983，病毒学128：495-501)、人呼吸性合胞体病毒G糖蛋白(基因库登记号Z 33429；Gareia等，1994，病毒学杂志；Collins等，1984，美国国家科学院院报81：7683)、登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白(基因库登记号M 19197；Hahn等，1988，病毒学162：167-180)、麻疹病毒血凝素(基因库登记号M 81899；Rota等，1992，病毒学188：135-142)、II型单纯疱疹病毒糖蛋白gB(基因库登记号M 14923；Bzik等，1986，病毒学155：322-333)、脊髓灰质类病毒I VP1(Emini等，1983，自然304：699)、HIV I的被膜糖蛋白(Putney等，1986，科学234：1392-1395)、乙型肝炎病毒表面抗原(Itoh等，1986，自然308：19；Neurath等，1986，疫苗4：34)、白喉毒素(Audibert等，1981，自然289：543)、链球菌24M表位(Beachey，1985，实验医学生物学进展185：193)、淋球菌菌毛蛋白(Rothbard和Schoolnik，1985，实验医学生物学进展185：247)、假性狂犬病毒g50(gpD)、假性狂犬病毒Ⅱ(gpB)、假性狂犬病毒Ⅲ(gpC)、假性狂犬病毒糖蛋白H、假性狂犬病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒糖蛋白28、猪乳多空衣壳蛋白、猪痢疾小蛇菌保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新域病病毒血凝素神经氨酸酶、猪流感血凝素、猪流感神经氨酸酶、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、非洲猪热病毒、猪肺炎支原体、传染性牛鼻气管炎病毒(如，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)、或传染性喉气管炎病毒(如传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白Ⅰ)、LaGrosse病毒的糖蛋白(Gonzales-Scarano等，1982，病毒学120：42)、新生小牛腹泻病毒(Matsuno和Inouye，1983，传染和免疫39：155)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Mathews和Roehrig，1982，免疫学杂志129：2763)、punta foro病毒(Dalryaple等，1981，负链病毒的复制，Bishop和Compans(编著)、Elsevier，纽约，167页)、鼠白血病病毒(Steeves等，1974，病毒学杂志14：187)、小鼠乳房肿瘤病毒(Massey和Schochetman，1981，病毒学115：20)、乙型肝炎病毒核心蛋白和／或乙型肝炎病毒表面抗原或片段或其衍生物(如见1980年6月4日出版的英国专利申请书，号码为GB 203423A；Ganem和Varmus，1987，生物化学年评56：651-693；Tiollais等，1985，自然317：489-495)、马流感病毒或马疱疹病毒的抗原(如，马流感病毒A型／阿拉斯加91神经氨酸酶、马流感病毒A型／迈阿密63神经氨酸酶、马流感病毒A型／肯塔基81神经氨酸酶、马疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B和马疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D)、牛呼吸性合胞体病毒或牛类流感病毒的抗原(如，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSVG)、牛呼吸性合胞体病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸性合胞体病毒核衣壳蛋白(BRSV N)、3型牛类流感病毒融合蛋白和牛类流感病毒3型血凝素神经氨酸酶)、牛病毒性腹泻病毒糖蛋白48或糖蛋白53)。
导向用于治疗传染病的细胞受体在表3列出，同时也列出与细胞受体结合的病原。
病原 细胞受体
B-亲淋巴细胞乳多空病毒(LPV) 在B细胞上的LPV受体
百日咳杆菌 腺苷酸环化酶
博尔纳病病毒(BDV) BDV表面糖蛋白
牛冠状病毒 N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸受体
脉络丛脑膜炎病毒 CD4+
登革病毒 高硫酸化型硫酸肝素p65
大肠杆菌 含Galal-4Gal异受体
埃博拉病毒 CD16b
埃可病毒1 整联蛋白VLA-2受体
埃可病毒-11(EV) EV受体
内毒素(LPS) CD14
肠道细菌 糖偶联物受体
肠道孤儿病毒 α／βT细胞受体
肠道病毒 速衰因子受体
猫白血病病毒 细胞外被膜糖蛋白(Env-SU)受体
口蹄疫病毒 免疫球蛋白Fc受体痘病毒M-T7
长臂猿白血病病毒(GALV) GALV受体
革兰氏阴性菌 CD14受体
幽门螺旋菌 Lewis(b)血型抗原受体
乙型肝炎病毒(HBV) T细胞受体
单纯疱疹病毒 硫酸肝素糖氨聚糖受体成纤维细胞生长因子受体
病原 细胞受体
HIV-1 CC-趋化因子受体CCR5CD11aCD2G-蛋白偶联受体CD4
人巨细胞病毒 硫酸肝素蛋白聚糖膜联蛋白ICD13(氨肽酶N)
人冠状病毒 人氨肽酶N受体
流感病毒A、B和C 血凝素受体
军团菌属 CR3受体蛋白激酶受体半乳糖N-乙酰半乳糖胺(Gal／Gal／NAC可抑制的凝集素受体趋化因子受体
墨西哥利什曼原虫 膜联蛋白Ⅰ
单核细胞增多性利斯特菌 Act A蛋白
麻疹病毒 CD46受体
脑膜炎双球菌 脑膜炎双球菌毒力相关Opa受体
麻疹病毒 CD46受体
小鼠肝炎病毒 癌胚性抗原家族受体癌胚性抗原家族Bgla受体
鼠白血病病毒 被膜糖蛋白
γ-鼠疱疹病毒 γ干扰素受体
鼠逆转录病毒 糖蛋白gp70Rmc-1受体
鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒 癌胚性抗原家族受体
鸟型结核分支杆菌-M 人整联蛋白受体αVβ3
病原 细胞受体
淋病奈瑟菌 硫酸肝素蛋白聚糖受体CD66受体整联蛋白受体膜共因子受体CD46GM1GM2GM3CD3神经酰胺
新城病病毒 血凝素神经氨酸酶蛋白融合蛋白
细小病毒B19 红细胞P抗原受体
恶性疟原虫 CD36受体血型糖蛋白A受体
痘病毒 γ-干扰素受体
假单胞菌属 KDEL受体
轮状病毒 导向粘膜α4β7受体
鼠伤寒沙门氏菌 表皮生长因子受体
志贺菌 α5β1整联蛋白
链球菌 非糖苷化J774受体
1型辅助T细胞 包括如下的趋化因子受体：6．CXCR1-47．CCR1-58．CXCR39．CCR5
1型亲T淋巴细胞病毒 gp46表面糖蛋白
痘苗病毒 TNFRp55受体TNFRp75受体可溶性白介素-1β受体
能被本发明的方法治疗或预防的病毒病包括但不局限于由如下病毒引起的疾病，这些病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)、Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)、牛疫病毒、鼻病毒、echo病毒、轮状病毒、呼吸性合胞体病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、束形病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ)和Ⅱ型人免疫缺陷病毒(HIV-Ⅱ)、任何细小核糖核酸病毒、肠道病毒、嵌杯状病毒、任一种诺沃克组病毒、外衣病毒、如登革病毒、甲病毒、黄热病病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、沙粒病毒、呼吸道肠道病毒、轮形病毒、眶病毒、Ⅰ型人T细胞白血病病毒、Ⅱ型人T细胞白血病病毒、类人猿免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、细小病毒、Epstein-Barr病毒、人疱疹病毒-6、Ⅰ型猕猴疱疹病毒(B病毒)和痘病毒。
能通过本发明的方法治疗或预防的细菌性疾病由包括但不局限于如下细菌所引起的疾病，这些细菌是分支杆菌、立克次氏体、支原体、奈瑟菌类(如脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌)、军团菌属、霍乱弧菌、链球菌属如肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭状芽胞杆菌、百日咳杆菌、嗜血杆菌类(如流感菌)、衣原体类、肠毒性的大肠杆菌等。
能通过本发明的方法治疗或预防的原生动物疾病包括但不局限于由疟原虫属、艾美球虫属、利什曼原虫属、可可齐地虫属(kokzidioa)和锥虫属引起的疾病。
在本发明具体的实施方案中，所述的治疗药物可以与用于治疗或预防传染病的合适的抗生素、抗真菌剂、抗病毒药或任何其他药物结合施用。在一优选的实施方案中，合成的修饰抗体与有效地抗传染病病原的化合物连接，该合成修饰抗体例如把抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂导向到病原上。在另一个优选的实施方案中，修饰免疫球蛋白拥有一个含针对传染病病原的抗原的结合位点的CDR和另一个含针对在下列免疫细胞表面分子的结合位点的CDR，这些免疫细胞例如但不局限于T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞、TIL细胞或嗜中性细胞。
5．3．3基因治疗
在一具体的实施方案中，施用包含编码本发明合成修饰抗体的序列的核酸，治疗或预防与合成修饰抗体免疫特异地结合的分子表达有关的疾病或失调。
在本发明的该实施方案中，治疗用的核酸编码一种序列，该序列在细胞内(没有引导序列)或细胞间(具有引导序列)的可生产本发明修饰免疫球蛋白。
根据本发明任一种本领域有效的基因治疗方法都能用。典型方法描述如下。
关于基因治疗方法的一般综述。见Goldspiel等，1993，临床药学12：488-505；Wu和Wu，1991，生物治疗法3：87-95；Tolstoshev，1993，药理学毒理学年评32：573-596；Mulligan，1993，科学260：926-932，以及Morgan和Anderson，1993，生物化学年评62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215)。本领域众所周知能用的重组DNA技术方面的方法见如下描述，Ausubel等(编著)，1993，分子生物学现代方法，John Wiley& Sons，纽约；Kricgler，1990，基因转移和表达，室验室手册，Stockton出版社，纽约；以及第12和13章，Dracocoli等(编著)1994，人类遗传学现代方法，John Wiley和Sons，纽约。
一个方面，治疗核酸包括一种表达载体，该表达载体在合适的宿主中表达修饰免疫球蛋白(或其片段)。具体而言，上述核酸有一个可操作性连接到修饰合成抗体的编码序列上的启动子，所述的启动子可被诱导或组成性的，和可选择的组织特异的。在另一个实施方案中，所用核酸分子，其中由在基因组中所需的位点促进同源重组的区域位于抗体编码序列和任何其他所需的序列侧翼，由此提供修饰抗体的染色体内表达(Koller和Smithes，1989，美国国家科学院院报86：8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342：435-438)。
把该核酸给病人输送可以是直接或间接的方法，在直接的情形中，病人直接接触核酸或携带核酸的载体或输送复合体；在非直接的情形中，首先用核酸体外转化细胞，然后移植到病人体内。这2种方法分别是熟知的体内或离体基因治疗法。
在一具体实施方案中，直接体内施用核酸在施用部位核酸表达以产生抗体。该方案可通过本领域熟知的大量方法的任一种完成，例如构建其作为合适的核酸表达载体的部分，然后施用结果成为细胞内表达的方法；例如用缺陷或减毒的逆转录病毒或其他病毒的载体感染的方法(见美国专利号4，980，286)，或直接注射裸露的DNA方法，或应用微颗粒冲击法(如基因枪，Biolistic，Dupont)、或应用脂类或细胞表面受体或转染剂，用生物聚合物包被法(如，聚-β-1-＞4-N-乙酰葡糖胺多糖，见美国专利号5，635，493)脂质体被囊化、微颗粒或微囊化法，或与已知能进入细胞核的肽连接后施用，或与已知能进入细胞核的配体连接后施用，或与进行受体介导的细胞内吞的配体连接后施用(例如见，Wu和Wu，1987，生物化学杂志，262：4429-4432)等方法。在另一个实施方案中，能形成核酸配体复合物，在该复合物中配体包含一种融合病毒肽以破坏核内体，使核酸避免溶酶体降解。而在另一个实施方案中，通过导向特异的受体，该核酸能在体内导向以进行细胞特异的吸收和表达(如见，PCT出版物WO 92／06180，公布日期1992年4月6日(Wu等)；WO 92／22635公布日期1992年12月23日(Wilson等)；WO 92／20316公布日期1992年11月26日(Findeis等)；WO 93／14188公布日期1993年7月22日(Young))。另外，通过同源重组方法将核酸导入细胞内并且结合到表达的突主细胞DNA中(Kollen和Smithies，1989，美国国家科学院院报86：8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342：435-438)。
另外，在能施用单链抗体，例如该方法利用如Marasco等(Marasco等，1993，美国国家科学院院报90：7889-7893)描述的那些技术使编码单链抗体的核苷酸序列在靶细胞群体中表达。腺病毒是能用于基因治疗的另一种病毒载体。特别是将基因输送到它们引起温和疾病的呼吸系统表皮内，腺病毒是有吸引力的载体。腺病毒输送系统的其他靶点是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson(1993，遗传学和发育的现代观点3：499-503)发表了基于腺病毒基因治疗的综述。Bout等(1994，人类基因治疗5：3-10)阐明了腺病毒载体传递基因到恒河猴呼吸系统表皮的用途。在基因治疗中应用腺病毒的其他实例可在Rosenfeld等，1991，科学252：431-434；Rosenfeld等，1992，细胞68：143-155和Mastrangeli等，1993，临床研究杂志91：225-234中找到。也有人建议用腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等，1993，实验生物医学学会学报204：289-300)。
预想所用的治疗核酸的形式和剂量依赖于疾病的类型和所需效应的严重性、病人状态等，并能由本领域的技术人员确定。
5．3．4疫苗免疫接种法
本发明的修饰抗体可用作疫苗给受试者使用在该受试者中，需要针对特异分子或抗原结合位点的免疫性。本发明的疫苗和方法可用于预防疾病或失调，或者治疗疾病或失调，其中对特异合成抗体的抗独特型应答在治疗和预防上是有用的。
本发明的方法和组合物可用于激发在受试者中抗疫苗的合成抗体的体液和／或细胞介导的应答。在一具体的实施方案中，该方法和组合物激发受试者中抗所施用的合成抗体的体液应答。在另一个具体的实施方案中，该方法和组合物激发在受试者中抗所施用的合成抗体的细胞介导应答。在一优选的实施方案中，该方法和组合物激发体液和细胞介导的应答。
5．4药用制备物和施用方法
5．4．1制剂和施用方法
根据本发明应用含有修饰免疫球蛋白的治疗组合物，可用1种或多种生理学可接受的载体或赋形剂以任何常规的方法制成。
因此，修饰免疫球蛋白(或其功能性活性片段或编码抗体或片段的核酸)和它们生理学可接受的盐类和溶剂能制成制剂，通过吸入法或吹入法(通过嘴或鼻)或口腔、颊部、肠道外或直肠施用。
关于口腔施用，用药学上可接受的赋形剂通过常规方法将治疗药物制备成例如能制成片剂或胶囊的形式，这些赋形剂如结合剂(如预先明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或硅石)、崩解剂(如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(如月桂硫酸钠)。片剂可通过本领域众所周知的方法加上包被。用于口腔施用的液体制备物可制成如溶液、糖浆或悬浮剂的形式，或者把它们制成干燥产物，使用前用水或其他合适的载体溶解。上述液体制备物可通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，这些添加剂如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食的脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶；非水载体(如杏仁油、油酯、乙基乙醇或分级的植物油)；和防腐剂(如甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸)。制备物也可含有合适的缓冲盐、香味剂、增色剂和甜味剂。
可适当制取用于口服药剂，以使活性化合物的受控释放。
用于口腔施用，该治疗药物可采用片剂或锭剂的形式，用常规的方法制成。
至于吸入法施用，根据本发明应用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，将本发明的治疗药物以气溶胶喷雾呈现的形式从压力容器或喷雾器中方便地输送。在压力气溶胶的情况下，剂量单位由提供测定数量的阀确定。用于吸入剂或吹入剂胶囊和Catridgel如明胶制成的化合物的粉末混合物和诸如乳糖或淀粉的合适粉末基质的制剂。
经注射法如块状注射或连续输注，本发明的治疗药物能制成肠道外施用(即静脉内或肌肉内)的制剂。注射用的制剂以单位剂量的形式，与添加的防腐剂一起放在如安瓿或多剂量的容器中。该组合物能采用如在油和水载体中的悬浮剂、溶液或乳剂的形式，并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和／或分散剂的处方用试剂。另外，活性组分可以粉末的形式，使用前合适的载体如无菌的无热原的水溶解。
该治疗药物也能制成诸如栓剂或滞留灌肠剂的直肠组合物，如含有常规的栓剂基质如可可油或其他甘油酯。
除了前面描述的制剂外，该治疗药物也能制成储存制备物。上述长时间作用的制剂可通过植入法(如皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，例如，该化合物用合适的聚合物或疏水材料(如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂、或少量的可溶性衍生物如少量可溶的盐类制成制剂。
本发明的修饰免疫球蛋白可作为独立的组合物或单一组合物，与由常规化学方法或分子生物学方法连接的1种以上的抗体一起施用。此外，本发明抗体的诊断和治疗价值可和放射性核素或诸如蓖麻毒蛋白的毒素或如氨甲喋呤的化疗药联合使用而增大。
如果有必要，该组合物也能含有微量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。该组合物可以是液状溶液、悬浮剂、乳化剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂或粉剂。口服制剂可包括标准的载体如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
一般来说，以单位剂量的形式独立或混合在一起提供各组分，例如作为冷冻干燥粉末或无水浓缩在密封容器中，如标明活性剂数量的安瓿或小囊(sachetle)中。如果该组合物通过注射施用，应提供一安瓿量的无菌稀释液，这样施用前各组分可进行混合。
本发明也提供一种包括1或多种容器的药用包或药用试剂盒，容器中装有1或多种本发明疫苗制剂的组分。上述这些容器上所附的是注意事项，其形式是由政府机构所制订的药物或生物产品的制造、使用或销售规则，该注意事项表明施用于人的制造、使用或销售的机构是经过批准许可的。
如果有必要，该组合物可放在一个药包或配药装置中，可含有活性组分的1或多个单位剂量形式。该药包例如可以包括金属或塑料膜，如发泡包。该药包或配药装置可以附施用的说明书。包含本发明的化合物的组合物也可以用可兼容的药学载体制成组合物，放置在合适的容器内，并且标明治疗的指征条件。
可用许多方法导入本发明的疫苗制剂；这些方法包括但不局限于口服、大脑内、真皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、鼻内通道和经划痕法(如用叉状针划破皮肤的表层)或任何其他标准的免疫途径。
被用于制剂中的该修饰免疫球蛋白分子的精确剂量也将依赖于施用的途径和病人的特点，然后按照标准的临床技术并依据医生的诊断和每个病人的情况确定。有效免疫量指的是在宿主中施用该疫苗制备物的量，足以产生对合成抗体免疫应答的数量。有效剂量也可以从动物模型测定系统中得到的剂量应答曲线中推导出来。
5．4．2有效剂量
在本发明中描述的化合物和核酸序列给病人施用，其治疗有效剂量将治疗诸如癌症或传染病的某些疾病或失调。一种治疗性有效剂量指的是化合物的量足以使治疗过的受试者中得到健康益处。
化合物的毒性和治疗效能可通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中确定，例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效应的比值为治疗指数，并且它可表示为LD50／ED50的比值。表现为大治疗指数的化合物是优选的。虽然能用有毒副作用的化合物，但应该小心设计一种将上述化合物导向受影响组织的作用位点的输送系统，以使对未感染细胞的潜在损害降低到最低程度，并因此降低副作用。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据能用于确定用于人类的剂量范围。优选地，上述化合物的剂量位于包括极少或没有毒性的ED50的循环浓度范围之中。该剂量可在依赖于所采用的剂量形式和所用的施用途径的该范围之内变动。对本发明的方法中所用的任一种化合物来说，开始可从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。在动物模型中系统地确定一种剂量以获得循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养中测定的IC50值(即获得最大抑制症状一半时所测定化合物的浓度)。上述资料用于更准确地确定人类中的可用剂量。例如通过高效液相层析技术可测定血浆中的水平。
5．4．3疫苗制剂和施用
本发明也提供含有本发明治疗药物的疫苗制剂，该疫苗制剂适用于施用以激发抗某些抗原的保护性免疫(体液和／或细胞介导的)应答，例如用于治疗和预防疾病。
上述疫苗的合适制备物包括作为液体溶液或悬浮液的可注射剂；也可以制备成注射前适用于溶液、悬浮液、液体的固体形式。也可是乳化制备物，或该多肽用脂质化囊化。活性免疫原成分经常和药学上可接受的并与活性成分兼容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如水、盐、乳脂盐、葡萄糖、甘油、乙醇、灭菌的等渗水缓冲液等以及结合物。此外，如果有必要，疫苗制备物也可包括微量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、和／或增强疫苗有效性的佐剂。
有效佐剂的实例包括但不局限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thrMDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1＇-2＇-二棕榈酰-Sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺。
可通过测定诱导抗独特型抗体直接抗用特殊佐剂佐剂制成的注射免疫球蛋白的作用确定佐剂的有效性。
该组合物可以是液体溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂或粉剂。口服制剂可包括标准载体如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
一般来说，以单位剂量的形式独立或混合在一起提供各组分，例如作为冷冻干燥粉末或无水浓缩在密封的容器中，如显示活性剂数量的安瓿或小囊(sachette)中。如果该组合物通过注射法施用，应提供一安瓿的无菌稀释剂，这样施用前可混合各组分。
在具体的实施方案中，在第一容器中提供本发明的冷冻干燥修饰免疫球蛋白，第二容器包含稀释剂，由50％甘油、0．25％酚和抗菌剂(如0．005％的亮绿)组成。
本发明也提供包含1种或多种容器的药用包或药用试剂盒，这些容器内装有1种或多种本发明疫苗制剂的成分。上述容器上附有注意事项，其形式是政府机构制订的药物或生物产物的制造、使用或销售规则，该规则表示施用于人类的制造、使用或销售的机构得到许可批准。
如果有必要，该组合物可以放在药包或配药装置中，其中含有活性组分的1个或多个单位剂量形式。药包可以包含例如金属或塑料膜，如发泡包。该药包或配药装置可附施用说明书。也可制备包含本发明的化合物并用兼容的药用载体制成的组合物，放置在合适的容器内，并且标明治疗的指证条件。
施用该疫苗的受试者优选的是哺乳动物，最优选的是人类，但也可以是非人类的动物，这些动物包括但不局限于母牛、马、绵羊、猪、禽类(如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠。
可用许多方法导入本发明的疫苗制剂；这些方法包括但不局限于口服、大脑内、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内途径和经吹入法(如用叉形针划破皮肤的表层)或任何其他的标准免疫途径。在一具体的实施方案中，使用划痕法。
被用在制剂中的该修饰免疫球蛋白分子的精确剂量也将依赖于施用途径和病人的特点，并且按照标准的临床技术依据医生的诊断和每个病人的情况确定。有效免疫量是指在施用了疫苗制备物的宿主中，足以产生对修饰免疫球蛋白分子免疫应答(即抗独特型反应)的数量。有效剂量也可以从动物模型测定系统得到的剂量应答曲线中推导出来。
5．5诊断方法
与结合对成员的特异分子结合的修饰免疫球蛋白，尤其是抗体(和其功能性活性片段)，按照本发明所述的方法可用作诊断剂和预后诊断剂。在各种实施方案中，本发明提供结合对成员的测定方法和上述测定方法在临床使用中的用途。本发明的修饰免疫球蛋白例如可用于检测生物样品中的抗原，因此可对修饰免疫球蛋白与之结合的分子的异常水平和／或存在上述分子的异常形式的病人进行检测，至少“异常水平”意味着相对于来自身体的部分或来自不患有该失调的受试者的相似样品存在的水平或代表性标准水平增加或降低。本发明的修饰抗体也可以包括用于诊断或预后技术试剂盒中的试剂。
在本发明的具体实施方案中，与癌或肿瘤的抗原或传染病病原的抗原免疫特异结合的本发明修饰抗体，可用于诊断、预后检测或筛选与癌或肿瘤的抗原或传染病病原的抗原表达有关的癌症或肿瘤或传染病。在优选的方面，本发明提供一种诊断或筛选癌症或癌症发展趋向的方法，其特征是存在的癌抗原增加，该抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包括测定受试者中修饰抗体与来源于受试者的样品的免疫特异结合水平，其中所述的修饰抗体免疫特异地与所述的癌抗原结合并且该修饰抗体包含一个可变区，该可变区至少拥有1个含有所述第二成员部分的CDR，所述的部分含有一个针对该癌抗原的结合位点且未在天然CDR环境下发现。其中，相对于来自未患癌症或未出现发展成癌症趋向的受试者的类似样品中该免疫特异结合的水平，所述的免疫特异结合的水平增加表明存在癌症或有发展成癌症的趋向。
在另一优选的方面，本发明提供一种诊断或筛选存在传染病病原的方法，其特征是存在所述传染病病原的抗原，该抗原是由第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包括测定在受试者中修饰抗体与来源于该受试者的样品免疫特异结合的水平、其中所述的修饰抗体免疫特异地结合所述的抗原并且该修饰抗体包含一个可变区，该可变区至少拥有1个含有所述的第二成员的至少4个氨基酸部分的CDR，所述的部分含有针对所述抗原的结合位点并且未在天然CDR环境下发现，其中，相对于来自未有传染病病原的受试者的类似样品中所述的免疫特异结合水平，该免疫特异结合的增加表明存在所述的传染病病原。
在另一优选的实施方案中，本发明提供一种检测来源于受试者的样品中特异配体或受体异常水平的方法，该方法将针对样品结合特异配体或受体的修饰抗体的免疫特异结合与该修饰抗体寺具有正常水平的配体或受体的样品的免疫特异结合相比较。
测定被修饰抗体结合的分子的方法，可对检测受试者中与该分子相关的疾病和／或对疾病进行分期，在群体中筛选上述疾病，在受试者生理条件的差异诊断和监测药物治疗对受试者的影响中，都具有价值。
设计下列测定法以检测与该修饰抗体免疫特异结合的分子。
在具体的实施方案中，可用这些诊断方法检测基因表达水平的异常，或结构和／或暂存结构、组织、细胞或待测定的特异分子的亚细胞定位中的异常。
一般来说待分析的组织或细胞类型包括那些已知的或可疑的表达特异分子的种类。在此所用的分离蛋白的方法可以是例如Harlow和Lane(Harlow，E和Lane，D．1988，“抗体：实验室手册”冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)等描述的那些方法。所分离的细胞可来源于细胞培养或来自病人。此外，用于本发明的修饰抗体(或其功能性活性片段)，可用组织学方法用在免疫荧光或免疫电子显微镜中，以原位检测该分子。通过从病人中移取组织学样本，如受影响组织的石蜡包埋切片，然后加上标记过的本发明修饰抗体的方法，可完成原位检测。优选的修饰抗体(或其功能性活性片段)的应用方法是把标记过的修饰抗体覆盖到生物学样品上。如果抗体与之结合的分子位于细胞质中，例如通过使细胞膜可通透的方法将修饰抗体导入到细胞内是合乎要求的。通过应用上述方法，有可能不仅确定存在特异的分子而且确定其在所检查的组织中的分布。利用本发明，一般的技术人员可容易地看到为了获得上述原位检测结果，可对多种组织学方法中的任一种做修饰以进行检测。(例如染色方法)。
对特异分子的免疫测定法典型地包括如下步骤，在可检测的标记过的修饰抗体的存在下与如生物体液、组织抽提物、新鲜分离的细胞或培养细胞的裂解液等样品温育，然后用本领域众所周知的许多技术的任一种检测所结合的抗体。
生物学样品可以接触并且固定在如硝酸纤维素的固相支持物或载体上，或在能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的其他固相支持物上。然后用合适的一缓冲液冲洗该支持物，接着用可检测标记过的修饰抗体处理。然后用该缓冲液第二次冲洗该固相支持物，以移去未结合的抗体。然后用常规方法检测在固相支持物上的结合标记物的数量。
至少“固相支持物或载体”指的是任何能结合抗原或抗体的支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰过的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩粉、磁铁矿粉。就本发明的目的而言载体的特点可以是可溶的或某种程度上不可溶的。支持物材料事实上可以拥有任何可能的结构构型，只要所耦联的分子能与抗原或抗体结合。因此，支持物的构型可以是球形如珠形。或圆柱形，如在试管的内表面或柱的外表面。另外，该表面可以是平面的如薄片、测定带等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域的技术人员会知道许多其他合适的结合抗体或抗原的载体，或能应用日常的实验方法确定相同的载体。
给定的修饰抗体的结合活性可根据众所周知的方法确定。本领域的技术人员可依据应用常规实验方法对每个测定确定可操作和最适的测定条件。
可检测标记的修饰抗体的方法中的一种方法是把同样的分子与酶连接，然后用在酶免疫测定(EIA)中(Voller，A“酶联免疫吸收测定法(ELISA)”，1978，诊断水平2：1-7微生物协会季度出版物，Walkersville，MD)；Voller等，1978，临床病理学杂志31：507-520：Butler，1981，酶学方法73：482-523；Maggio，E(编著)，1980，酶免疫测定法，CRC出版社，Boca Raton，FL；Ishikawa等(编著)，1981，酶免疫测定法，Kgaku Shoin，(东京)。与修饰抗体结合的酶与合适的底物发生反应，优选生色底物，用上述的方式产生的反应可通过如分光光度法，荧光光度法或可视方法能检测化学组分。用于检测性标记修饰抗体的酶类包括但不局限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5类固醇异构酶、酵母酒精脱氢酶、α-甘油磷酸酶、脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。使用与该酶反应的生色底物反应后，比色法完成检测。也可通过比较底物酶反应的程度与相似制备的标准物的程度肉眼比较完成检测。
也可使用各种其他免疫测定法的任一种完成检测。例如，依靠放射活性标记的合成抗体或片段，有可能检测通过使用放射免疫测定法(RIA)检测抗体所要结合的蛋白(例如见，Weintraub，1986，放射免疫测定原理，放射配基测定技术第七次培训班，内分泌协会)。由上述方法使用γ-计数器或液闪计数器或放射自显影法检测该放射性同位素。
也有可能用荧光化合物标记该修饰抗体。当荧光性标记的抗体与暴露于合适波长的光下时、由于存在荧光那么就能检测到其存在。最常用的荧光标记化合物中是异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、异藻青蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
应用荧光发射金属如152Eu或其他镧系系列，也可检测用标记该修饰抗体。这些金属用如二乙烯三胺苯五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团连接到该抗体上。
将修饰抗体耦联到化学发光化合物上，也能检测用该修饰抗体。然后，通过检测化学反应过程中产生的化学发光的存在，确定化学发光标记的抗体存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、趋热性吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样地，也可用生物发光化合物标记本发明的合成修饰抗体。生物发光是一种在生物系统中发现的化学发光的类型，其中一种催化蛋白可增强化学发光反应的效率。通过检测化学发光存在的确定生物发光蛋白存在的。用于标记的重要发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母蛋白。
5．6治疗用途的证明
在用于人类之前，优选的方法是对本发明的治疗药物体外然后体内，检测其所需的治疗或预防活性。例如，用于确定是施用特异的治疗药物否有效的体外测定方法包括体外细胞培养测定方法，在该方法中，来自细胞系或来自患有特异疾病或失调的病人的培养细胞的合适细胞与治疗药物接触或反之施用治疗药物，然后观察治疗药物对细胞的影响。
如果该治疗药物是一种识别癌或肿瘤抗原的修饰免疫球蛋白，通过把治疗药物与培养细胞(要么来自病人或培养的细胞系)接触，然后用本领域熟知的任何方法测定细胞的成活或生长情况，就可测定该修饰免疫球蛋白的潜在效能，例如，细胞增殖可通过测定3H-胸腺嘧啶的掺入、直接细胞计数、检测诸如原癌基因(如fos、myc)或细胞周期标记物等已知基因的转录活性变化测定；细胞成活率用台盼蓝染色评价，根据形态变化的肉眼评价分化等方法。
如果该治疗药物是一种识别传染病病原的抗原或针对传染病病原的细胞受体的修饰抗体，通过把该治疗药物与用传染病病原感染过的培养细胞(要么来自病人或培养细胞系)接触，然后测定这些细胞降低传染病病原或传染病病原感染的生理学指征的降低，可测定该抗体的潜在效能。或者，通过把治疗药物与易受传染病病原感染但未被传染病病原感染的细胞(来自病人后培养或培养细胞系)接触，然后让所述的细胞与传染病病原接触，然后确定接触过治疗药物的细胞感染率是否比未与治疗药物接触过的细胞的感染率更低。传染病病原对细胞的感染可用本领域已知的任何方法测定。
如果该治疗药物是一种对特异受体或配体特异的修饰免疫球蛋白，通过把治疗药物与表达结合对受体成员的培养细胞(来自病人或培养的细胞系)接触，然后确定该治疗药物是否阻止配体与受体的结合和／或受体信号传导，或者是否该治疗药物刺激受体信号传导的方法，可测定该修饰免疫球蛋白的潜在效能。用本领域测定配体-受体结合和受体信号传递(如在第6节举例的方法)的已知的任何方法，能测定这些指征。
治疗药物的效能也可在合适的动物模型，临床试验和人类中测定。可用本领域中的任何方法确定治疗药物的效能。例如，给动物模型或给人类受试者施用治疗药物后，评价动物或人类受试者中任何该治疗药物打算治疗的疾病或失调的指征。例如，在治疗前、治疗期间或治疗后适当的时间间隔、测定在动物模型或人类受试者中该修饰抗体直接作用的分子数量水平，可评价该治疗药物的效能。能鉴定该分子数量的任何变化或缺乏变化，并确定治疗对受试者的影响。所述的分子数量水平的变化与否，可通过本领域熟知的任何方法确定，例如，在上面5．5节中或下面5．7节描述的免疫测定方法的任何一种方法。
在其它方面，通过监测受试者从特异疾病或病情的改善或恢复情况，可测定该修饰抗体的效能，所述的疾病或病情与合成修饰抗体直接作用的分子有关。当该修饰抗体直接作用肿瘤或癌抗原时，特异的肿瘤或癌症的好转可用任一种熟知的监测癌症或肿瘤的诊断或筛选方法，来追踪检测。例如，但不是限制方法，通过测定受试者血清中或注射标记的特异针对该抗原的抗体后，特异癌症或肿瘤抗原的水平(或另一种和特异的癌症或肿瘤相关的抗原)，可监测癌症或肿瘤的好转。此外，其它影像技术，如计算机断层扫描术(CT)或声波图或任何其他影像方法，可用于监测癌症或肿瘤的进展。活检也可应用。上述试验在人类中进行之前，可在特异癌或肿瘤的动物模型中进行修饰免疫球蛋白的效能试验。
如果该治疗药物特异作用于传染病病原的抗原或传染病病原的细胞受体，通过把该修饰抗体给受试者(人类受试者或患病的动物模型)，然后监测特异传染病病原的水平或特异传染病的症状，可测定该修饰抗体的效能。传染病病原的水平可通过本领域熟知的任一种方法确定，如在病毒的情况下测病毒滴度，或细菌水平(例如，用培养来自病人的样品)，等等。也可测定该修饰免疫球蛋白直接作用的抗原水平，确定传染病病原的水平。传染病病原水平的降低或传染病症状的改善表明该修饰抗体有效。
如果治疗药物被施用作疫苗，通过用疫苗免疫后监测试验动物的抗独特型应答，可确定含有本发明的修饰抗体的疫苗制剂的免疫力。出现的体液应答可视为总的免疫应答的象征，其它的应答成分，尤其是细胞介导的免疫性，可能对预防疾病是重要的。试验动物可包括小鼠、兔子、黑猩猩，最后为人类受试者。本发明制得的疫苗能进行实验性感染黑猩猩。然而，由于黑猩猩是受保护的物种，对本发明疫苗的抗体应答可先用许多较小，廉价的动物中研究，目的是找到1或2种用于黑猩猩效能研究的最佳候选免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的最佳结合。
受试动物的免疫应答可通过各种方法分析。如得到的免疫血清与抗体的反应性，可通过已知的技术测定，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹、放射性免疫沉淀等；或者预防感染和／或缓解被免疫宿主的疾病症状。
在兔子中测定本发明的疫苗组合物诱导对该修饰免疫球蛋白分子的抗独特型应答的能力可作为一个合适的动物试验的实例。例如，可用无特异病原(SPF)的雄性年轻成年新西兰大白兔作测试。试验组的每一只兔子接受有效剂量的疫苗。对照组兔子接受用1mM Tris-HCl，pH9．0含有天然产生抗体的疫苗注射。每1或2周抽取兔子血样，用如放射免疫测定法(Abbott联合实验室)分析血清中对该修饰免疫球蛋白分子的抗独特型抗体和对修饰抗体直接作用的抗原特异的抗抗独特型抗体。也可用ELISA法测定抗独特型抗体的存在。由于兔子的远交的特点，可能产生应答的变化，在小鼠中测定疫苗的应答很有帮助。
5．7．修饰免疫球蛋白的测定法
构建拥有1或多个含针对特定分子的结合位点的CDRs的免疫球蛋白后，本领域熟知的任何结合测定法都可用于评价所得到的修饰抗体和特异分子的结合情况。这些测定法也可用于挑选表现为对特异抗原有更高亲和力或特异性的抗体。
例如，但不是限制测定方法，该修饰抗体与特异分子的结合情况能用本领域熟知的各种免疫测定法测定，这些方法包括但不局限于用诸如放射免疫测定法等技术的竞争或和非竞争性测定系统、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫放射性测量法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(例如，用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白印迹、沉淀反应、凝集反应测定法(如凝胶凝集反应测定法、血凝素反应测定法)、补体固定测定法、免疫荧光测定法、蛋白A测定法和免疫电泳测定法等。在一实施方案中，通过检测初级抗体的标记检测抗体结合情况。在另一实施方案中，通过检测结合于初级抗体上的次级抗体或试剂来检测初级抗体。在进一步的实施方案中，标记次级抗体。检测结合情况的免疫测定法中许多方法在本领域熟知，并属于本发明的范围之中。
下面描述一种有用的体外测定系统，该系统用于评价修饰抗体与靶分子的结合情况。简言之，该修饰抗体和检测样品的混合反应液在有关条件下温育，作用一定时间以使两种组分相互充分作用，如相互结合，这样形成一种复合体，它代表一种暂时性复合体，在反应混合液中可被移去和／或被检测到。这些测定能用各种方法进行。例如，一种进行上述测定的方法包括把该修饰抗体或待检物质锚定在固相物上，反应结束后检测锚定在固相上的抗体／分子复合体。在上述方法的一个实施方案中，可直接或间接标记修饰抗体，并且在固相表面锚定检测样品。实际操作时，微量滴定板可方便地用作固相物。所锚定的组分可通过非共价或共价连接固定。简单地用检测样品的溶液包被在固相表面然后干燥，可完成非共价的连接。
非固定的组分可加入到含有锚定组分的包被过的表面进行测定。反应完成后，在有关条件下移去未反应的组分(例如，清洗法)，这样任何所形成的复合体仍保留固定在固相表面。锚定在固相表面的复合体可用许多方法检测。如果非固定的组分是预先标记的，固定在表面的标记物的检测就表明形成了复合体。如果非固定的组分不是预先标记的，那么间接标记物可用于检测锚定在表面的复合体。
另外，反应能在液相中进行，从未反应的组分中分离反应产物，然后检测复合体。
5．8转基因动物
本发明也提供针对本发明的修饰免疫球蛋白(或其功能性片段)的转基因(即含有编码核酸)的动物。任何物种的动物，包括但不局限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、绵羊、猪、微型猪、山羊和如狒狒、猴子和黑猩猩等非人灵长类，可用于产生本发明的转基因动物。
因此，在具体的实施方案中，本发明提供重组非人类动物，该动物含有一种重组核酸，该重组核酸含有一种编码本发明修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，尤其是重组非人类转基因动物含编码修饰抗体的核酸，该修饰抗体与癌或肿瘤抗原免疫特异地结合；或含编码如下修饰抗体的核酸的重组非人类转基因动物，该修饰抗体与传染病病原的抗原或传染病病原的细胞受体免疫特异地结合。
本领域已知的任何技术可用于把抗体转基因导入到动物中，以产生转基因动物的原种系。上述技术包括但不局限于原核显微注射(Hoppe和Wagner，1989，美国专利号4，873，191)；逆转录病毒介导的基因转移入胚细胞系(Van der Putten等，1985，美国国家科学院院报82：6148-6152)；胚胎干细胞的基因打靶(Thonpson等，1989，细胞56：313-321)；胚胎的电穿孔(Lo，1983，分子细胞生物学3：1803-1814)；和精子介导的基因转入(Lavitrano等，1989，细胞57：717-723)；等技术。有关上述技术的综述，见Gordon，1989，转基因动物，国际细胞学综述115：171-229，在此作为整体引入仅供参考。
本发明提供转基动物细胞全部携带编码修饰抗体的核苷酸序的转基因动物，以及某些细胞而不是所有细胞中均携带转基因转基因动物，即镶嵌动物。转基因可整合成单一转基因或以多联体的形式，如头对头排列或头对尾串联排列。用下列方法例如Lasko等(Lasko等，1992，美国国家科学院院报89：6232-6236)介绍的方法，转基因可选择性地导入到特异细胞类型中并在该细胞中活化。上述细胞类型特异活化的所需要调节序列与特定的靶细胞类型有关，并且这些对本领域的技术人员来说显而易见。当需要编码合成抗体转基因的核苷酸整合到内源性免疫球蛋白的染色体位点时，优选基因打靶法。简言之，当应用上述的技术，为实现整合须设计含有与内源免疫球蛋白同源的某些核苷酸序列的载体，经与染色体序列的同源重组，将载体整合到内源免疫球蛋白基因的核苷酸序列中并破坏该基因的功能。按照如Gu等(Gu等，1994，科学265：103-106)介绍的方法，可把转基因选择性导入到特定的细胞类型中，结果内源免疫球蛋白仅在该细胞类型中失活。上述细胞类型特异失活的需要调节序列与特异的靶细胞类型有关，并且对本领域的技术人员是显而易见的。
产生具有整合选择位点单拷贝的转基因动物的方法，对本领域的技术人员来说也众所周知(如见，Bronson等，1996，美国国家科学院院报93：9067-9072)。
一旦产生转基因动物，可用标准技术测定重组抗体基因的表达。通过Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织以测定转基因的整合是否发生，可完成初绐筛选。用下列技术，也可判断转基因动物的组织中转基因mRNA表达的水平，这些技术包括但不局限于从动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR。用抗体转基因产物特异的抗体，也可对表达基因组织的样品用免疫细胞化学方法评价。
6．实施例：含有缓激肽的合成修饰抗体
本实施例描述免疫特异地与缓激肽受体(BR)结合的合成修饰抗体的构建。该缓激肽受体与称为缓激肽的天然配体结合。BR-缓激肽的相互作用是可用在本发明方法结合对的一个实例，当缓激肽中称为结合位点的氨基酸与缓激肽受体接触时，BR与缓激肽的相互作用。本实施例的合成修饰抗体含有来自缓激肽结合位点的氨基酸序列。因此，这些合成修饰抗体模拟缓激肽配体，并可预期结合到缓激肽受体上(BR)。按下列所述的方法构建了含有缓激肽序列的6个合成修饰抗体，并证明与BR结合。
产生含有缓激肽结合序列的合成修饰抗体的策略概括如下：
1)用寡核苷酸，通过基因工程手段处理可变区基因，使其含有一个具有缓激肽结合序列的CDR；
2)然后将通过基因工程手段处理过的可变区基因插入到含有合适恒定区的哺乳动物表达载体中；
3)用含有轻链和重链的一个载体转染哺乳动物细胞，并且表达该合成修饰抗体；以及
4)测定合成修饰抗体对BR的结合情况。
6．1含有缓激肽结合位点的可变区基因的构建
为了构建编码一个含有缓激肽结合位点的CDR的可变区基因，进行下列的策略。
首先，单链寡核苷酸退火以产生粘性双链DNA片段(如图5，第1步的图解；也见，Kufemeier等，1994生物技术17：242)。具体而言，用GenoSys Biotech Inc的自动技术，合成长度为80个碱基的相应于目的序列寡核苷酸，具有20个碱基的重叠区。这些寡核苷酸的特异序列在图6A和B表示(分别构建轻链和重链可变区)。图6A列出了用于工程构建含有一段缓激肽结合序列的轻链可变区基因的寡核苷酸序列。图6B列出了用于工程构建含有一段缓激肽结合序列的重链可变区基因的寡核苷酸序列。用于工程构建6个缓激肽CDRs(BKCDR1、BKCDR2、BKCDR3、BKCDR4、BKCDR5、BKCDR6)的寡核苷酸组合和2个共有区(ConVL1和ConVH1)在表5列出。
表5用于工程构建具有缓激肽序列的合成修饰抗体的寡核苷酸名称Oligo1     Oligo2    Oligo3     Oligo4     Oligo5   Oligo6    Oligo7     Oligo8    Oligo9    Oligo10    Oligo11  Oligo12ConV1       L1       BKLC1      BKLC2      BKLC3    BKLC4     BKLC5      BKLC6     BKLC7     BKLC8      BKLC9    BKLC10  L2BKCDR1      L1       BKLC1      BKCDR12    BKLC3    BKLC4     BKLC5      BKLC6     BKLC7     BKLC8      BKLCDR19 BKLC10  L2BKCDR2      L1       BKLC1      BKLC2      BKLCDR23 BKLC4     BKLC5      BKLC6     BKLC7     BKLCDR28   BKLC9    BKLC10  L2BKCDR3      L1       BKLC1      BKLC2      BKLC3    BKLC4     BKLCDR35   BKLCDR36  BKLC7     BKLC8      BKLC9    BKLC10  L2ConVH1    BKHC1      BKHC2      BKHC3      BKHC4    BKHC5     BKHC6      BKHC7     BKHC8     BKHC9      BKHC10BKCDR4    BKHC1      BKHDR42    BKHDR43    BKHC4    BKHC5     BKHC6      BKHC7     BKHC8     BKHDR49    BKHC10BKCDR5    BKHC1      BKHC2      BKHDR53    BKHC4    BKHC5     BKHC6      BKHC7     BKHDR58   BKHC9      BKHC10BKCDR6    BKHC1      BKHC2      BKHC3      BKHC4    BKHC5     BKHC6      BKHC7     BKHC8     BKHC9      BKHC10
为了把这些寡核苷酸组合成所需要的基因，用10或12种寡核苷酸组按下列描述的方法构建可变区基因。按下列方法把每种寡核苷酸的5＇端磷酸化：25μl的每种寡核苷酸在存在T4多核苷酸激酶和50mMATP，37℃下温育1小时。然后70℃加热5分钟终止反应，用乙醇沉淀。一旦完成磷酸化，按图5所示的互补寡核苷酸(寡核苷酸1+寡核苷酸10、寡核苷酸2+寡核苷酸9、寡核苷酸3+寡核苷酸8、寡核苷酸4+寡核苷酸7、寡核苷酸5+寡核苷酸6)的无菌的微量离心管中混合，然后65℃水浴5分钟，接着室温下冷却30分钟而退火。退火得到具有粘性末端的短双链DNA片段。
下一步，粘性双链DNA片段连接成较长的双链(图5，步骤2-4)，直到组装成工程构建的可变区基因。具体而言，在存在T4 DNA连接酶和10mM ATP的条件下，粘性双链DNA片段在恒温16℃的水浴中连接2个小时。退火的寡核苷酸1／10和退火的寡核苷酸2／9混合，并且退火的寡核苷酸3／8和退火的寡核苷酸4／7混合。得到的寡核苷酸标示为寡核苷酸1／10／2／9和寡核苷酸3／8／4／7。下一步，寡核苷酸3／8／4／7与寡核苷酸5／6连接。然后产生的寡核苷酸3／8／4／7／5／6连接到寡核苷酸1／10／2／9上，得到一条全长的可变区基因。
另外，当用12种寡核苷酸为一组时，添加的顺序为寡核苷酸数1+12=1／12，2+11=2／11，3+10=3／10，4+9=4／9，5+8=5／8，6+7=6／7，1／12+2／11=1／12／２／11，3／10+4／9=3／10／4／9，5／8+6／7=5／8／6／7，1／12／2／11+3／10／4／9=1／12／2／11／3／10／4／9，1／12／2／11／3／10／4／9+5／8／6／7=全长的可变区基因。用本方法构建了8种可变区基因，其中4种基因是轻链可变区而4种基因是重链可变区。工程构建的轻链基因包括ConVL1，一种没有缓激肽序列的共有轻链可变区，BKCDR1，一种在CDR1中含有缓激肽序列的轻链可变区；BKCDR2，一种在CDR2中含有缓激肽序列的轻链可变区；和BKCDR3，一种在CDR3中含有缓激肽序列的轻链可变区。工程构建的重链可变区基因包括ConVH1，一种没有缓激肽序列的重链可变区；BKCDR4，一种在CDR4中含有缓激肽序列的重链可变区；BKCDR5，一种在CDR5中含有缓激肽序列的重链可变区；和BKCDR6，一种在CDR6中含有缓激肽序列的重链可变区。8种工程构建的可变区基因的序列在图4A至4F中显示。
通过组合寡核苷酸制得的每一种工程基因按下列方法处理：
用凝胶电泳可纯化得到工程可变区基因。为去除过量的未连接寡核苷酸和其它不完整的DNA片段，连接产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上，恒定110V电泳2小时。切下含有全长DNA产物的主带并放在无菌的1．5ml离心管中。为使DNA从琼脂糖释放该凝胶切片用f3琼脂糖酶40℃消化3小时。用0．3M NaOAc和异丙醇-20℃沉淀1小时，接着12，000rpm离心15分钟回收该DNA。纯化的DNA沉淀重新悬浮在pH8．0的50ul TE缓冲液中。然后经PCR扩增该工程可变区基因。具体而言，100ng的工程可变区基因与25mM dNTPs、200ng引物和5U的高度忠实性热稳定Pfu DNA聚合酶，在缓冲液中混合。进行28个循环扩增DNA。得到的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析。
接着把相应于工程可变区基因的每种纯化的DNA插入到pUC19细菌载体中，pUC19是有2686个碱基对，高拷贝数的大肠杆菌质粒载体，该载体含有一个位于lacZ基因中的54个碱基对多克隆连接位点和一个Amp选择性标记。为了制备插入工程可变区基因的载体，10μgpUC19用HincII(50U)在37℃线性化处理3小时，结果得到具有钝端序列5＇GTC的载体。为防止载体自身的重新连接，线性载体DNA用25U的小牛小肠碱性磷酸酸(CIP)在37℃去磷酸化1小时。为了把工程可变区基因插入到pUC19载体中，大约0．5μg去磷酸化线状载体DNA在T4 DNA连接酶(1000U)存在下，与3μg磷酸化的可变区基因混合，16℃温育12小时。
然后，用含有工程可变区基因的细菌载体转化细菌细胞。具体来说，新鲜制备的感受态DH5α细胞50μl和1μg的含有工程可变区基因的pUC19混合，然后转移到电穿孔小杯中(0．2cm间隙；Bio-Rad)。在电穿孔仪中(Bio-Rad基因脉冲仪)，每个小杯在2．5kV／2000hm／25μF下施加脉冲。之后马上往每个小杯中加入1ml SOC培养基，并让细胞在离心管中37℃下恢复1小时。移取来自每个转化的细胞等份，以1∶100稀释，然后100μl铺板到含有氨苄青霉素(Amp40μg／ml)的LB平板上。该平板在37℃下培养过夜由于Amp标记的存在，仅含有pUC19载体的转化体在LB／Amp平板上生长。
挑取单一转化体集落，在3ml LB／Amp无菌玻璃管中不断摇动37℃下生长过夜。质粒DNA用Easy Prep柱(Pharmacia Biotech)分离，然后悬浮在pH7．5的100μl TE缓冲液中。为证实在pUC19中存在基因插入，来自每个集落的25μl质粒DNA用Hinc II限制酶内核酸酶在37℃下消化1小时，然后在1％琼脂糖凝胶上分析。通过该方法，含有插入基因的质粒DNA，由于丧失限制性位点(5＇．．GTCGAC．．3＇)，对酶切有抗性迁移率与闭环(CC)DNA形式迁移率拉近而没有插入的那些质粒可被切割，在凝胶上与线形(L)双链DNA片段迁移率模似。
为了证实工程可变区基因的正确基因序列并消除构建操作过程中产生非所需突变的可能性，在自动ABI 377 DNA测序仪上进行DNA测序，测序用针对克隆的M13／pUC反向引物(5＇AAC AGC TATGACCATG3＇)以及PCR基因产物5＇末端20个碱基的引物(5＇GAATTCATGGCTTGGGTGTG3＇)。所有克隆被证实含有正确的序列。
用本实施例的方法，构建6个含有缓激肽序列的工程可变区基因。在表6显示的是合成修饰抗体的名称和在可变区基因内相应缓激肽结合序列的定位。例如，称为hAb BKCDR1的合成抗体在轻链可变区基因(VL)的CDR1中含有缓激肽结合序列(BK)。该合成抗体在重链可变区基因(VH)中拥有一个共有序列(Con)。
表6．含有缓激肽的合成修饰抗体
合成修饰抗体的名称  VL         VHhAbBKCDR1             BKCDR1         ConVH1hAbBKCDR2             BKCDR2         ConVH1hAbBKCDR3             BKCDR3         ConVH1hAbBKCDR4             ConVL1         BKCDR4hAbBKCDR5             ConVL1         BKCDR5hAbBKCDR6             ConVL1         BKCDR6
本实施例6个合成修饰抗体的每一个可变区的相应氨基酸序列在表7列出。CDRs用黑体标出。缓激肽结合位点的氨基酸为：Arg ProPro Gly Phe Ser Pro Phe Arg，并用下划线在CDRs中标出。表5也说明人κ轻链VL亚组Ⅰ和人重链VH亚组Ⅰ基因的共有序列。在共有CDR太短以致不能包括完整缓激肽结合位点序列的情况下，删除来自缓激肽结合位点的氨基末端残基，因为已知羧基末端残基在受体结合中更重要(Stewart和Vavrek，肽B2缓激肽拮抗剂的化学，5196页，Burch R．M．编著，缓激肽拮抗剂，基础和临床研究，纽约；MancalDekker，1991，在此引入仅供参考)。
表7．工程可变区基因的氨基酸序列
人Κ轻链VL亚组(Kabat等，1991)氨基酸    区域    共有序列    BKCDR1    BKCDR2   BKCDR31         FR1      Asp         Asp       Asp      Asp2                              Ile       Ile      Ile3                  Gln         Gln       Gln      Gln4                  Met         Met       Met      Met5                  Thr         Thr       Thr      Thr6                  Gln         Gln       Gln      Gln7                  Ser         Ser       Ser      Ser8                  Pro         Pro       Pro      Pro9                  Ser         Ser       Ser      Ser10                 Ser         Ser       Ser      Ser11                 Leu         Leu       Leu      Leu12                 Ser         Ser       Ser      Ser13                 Ala         Ala       Ala      Ala14                 Ser         Ser       Ser      Ser15                 Val         Val       Val      Val16                 Gly         Gly       Gly      Gly17                 Asp         Asp       Asp      Asp18                 Arg         Arg       Arg      Arg19                 Val         Val       Val      Val20                 Thr         Thr       Thr      Thr21                 Ile         Ile       Ile      Ile22                 Thr         Thr       Thr      Thr23                 Cys         Cys       Cys      Cys24        CDR1     Arg         Arg       Arg      Arg25                 Ala         Pro       Ala      Ala26                 Ser         Pro       Ser      Ser27       (A-F)     Gln         Gln       Gln      Gln28                 Ser         Phe       Ser      Ser29                 Ile         Ser       Ile      Ile氨基酸    区域    共有序列    BKCDR1    BKCDR2    BKCDR330                   Ser        Pro       Ser       Ser31                   Asn        Phe       Asn       Asn32                   Tyr        Arg       Tyr       Tyr33                   Leu        Leu       Leu       Leu34                   Ala        Ala       Ala       Ala35         FR2       Trp        Trp       Trp       Trp36                   Tyr        Tyr       Tyr       Tyr37                   Gln        Gln       Gln       Gln38                   Gln        Gln       Gln       Gln39                   Lys        Lys       Lys       Lys40                   Pro        Pro       Pro       Pro41                   Gly        Gly       Gly       Gly42                   Lys        Lys       Lys       Lys43                   Ala        Ala       Ala       Ala44                   Pro        Pro       Pro       Pro45                   Lys        Lys       Lys       Lys46                   Leu        Leu       Leu       Leu47                   Leu        Leu       Leu       Leu48                   Ile        Ile       Ile       Ile49                   Tyr        Tyr       Tyr       Tyr50         CDR2      Ala        Ala       Pro       Ala51                   Ala        Ala       Gly       Ala52                   Ser        Ser       Phe       Ser53                   Ser        Ser       Ser       Ser54                   Leu        Leu       Pro       Leu55                   Glu        Glu       Phe       Glu56                   Ser        Ser       Arg       Ser57         FR3       Gly        Gly       Gly       Gly58                   Val        Val       Val       Val59                   Pro        Pro       Pro       Pro60                   Ser        Ser       Ser       Ser61                   Arg        Arg       Arg       Arg62                   Phe        Phe       Phe       Phe63                   Ser        Ser       Ser       Ser64                   Gly        Gly       Gly       Gly65                   Ser        Ser       Ser       Ser66                   Gly        Gly       Gly       Gly67                   Ser        Ser       Ser       Ser68                   Gly        Gly       Gly       Gly69                   Thr        Thr       Thr       Thr70                   Arg        Arg       Arg       Arg71                   Phe        phe       Phe       Phe72                   Thr        Thr       Thr       Thr73                   Leu        Leu       Leu       Leu74                   Thr        Thr       Thr       Thr氨基酸    区域    共有序列    BKCDR1    BKCDR2    BKCDR375                   Ile        Ile       Ile       Ile76                   Ser        Ser       Ser       Ser77                   Ser        Ser       Ser       Ser78                   Leu        Leu       Leu       Leu79                   Gln        Gln       Gln       Gln80                   Pro        Pro       Pro       Pro81                   Glu        Glu       Glu       Glu82                   Asp        Asp       Asp       Asp83                   Phe        Phe       Phe       Phe84                   Ala        Ala       Ala       Ala85                   Thr        Thr       Thr       Thr86                   Tyr        Tyr       Tyr       Tyr87                   Tyr        Tyr       Tyr       Tyr88                   Cys        Cys       Cys       Cys89         CDR3      Gln        Gln       Gln       Arg90                   Gln        Gln       Gln       Pro91                   Tyr        Tyr       Tyr       Pro92                   Asn        Asn       Asn       Gly93                   Ser        Ser       Ser       Phe94                   Leu        Leu       Leu       Ser95        (A-F)      Pro        Pro       Pro       Pro96                   Trp        Trp       Trp       Phe97                   Thr        Thr       Thr       Arg98        FR4        Phe        Phe       Phe       Phe99                   Gly        Gly       Gly       Gly100                  Gin        Gin       Gin       Gin101                  Gly        Gly       Gly       Gly102                  Thr        Thr       Thr       Thr103                  Lys        Lys       Lys       Lys104                  Val        Val       Val       Val105                  Glu        Glu       Glu       Glu106                  Ile        Ile       Ile       Ile107                  Lys        Lys       Lys       Lys108                  Arg        Arg       Arg       Arg109                  Thr        Thr       Thr       Thr人重链VH亚组Ⅰ(Kabat等，1991)氨基酸    区域    共有序列     BKCDR4    BKCDR5    BKCDR61       FR1       Gln        Gln       Gln       Gln2                 Val        Val       Val       Val3                 Gln        Gln       Gln       Gln4                 Leu        Leu       Leu       Leu5                 Val        Val       Val       Val氨基酸    区域    共有序列    BKCDR4    BKCDR5    BKCDR66                    Gln        Gln       Gln       Gln7                    Ser        Ser       Ser       Ser8                    G1y        Gly       Gly       Gly9                    Ala        Ala       Ala       Ala10                   Glu        Glu       Glu       Glu11                   Val        Val       Val       Val12                   Lys        Lys       Lys       Lys13                   Lys        Lys       Lys       Lys14                   Pro        Pro       Pro       Pro15                   Gly        Gly       Gly       Gly16                   Ala        Ala       Ala       Ala17                   Ser        Ser       Ser       Ser18                   Val        Val       Val       Val19                   Lys        Lys       Lys       Lys20                   Val        Val       Val       Val21                   Ser        Ser       Ser       Ser22                   Cys        Cys       Cys       Cys23                   Lys        Lys       Lys       Lys24                   Ala        Ala       Ala       Ala25                   Ser        Ser       Ser       Ser26                   Gly        Gly       Gly       Gly27                   Tyr        Tyr       Tyr       Tyr28                   Thr        Thr       Thr       Thr29                   Phe        Phe       Phe       Phe30                   Thr        Thr       Thr       Thr31        CDR4       Ser        Pro       Ser       Ser32                   Tyr        Gly       Tyr       Tyr33                   Ala        Phe       Ala       Ala34                   Ile        Ser       Ile       Ile35        (A-B)      Ser        Pro       Ser       Ser
      35A        Trp        Phe       Trp       Trp
      35B        Asn        Arg       Asn       Asn36        FR2        Trp        Trp       Trp       Trp37                   Val        Val       Val       Val38                   Arg        Arg       Arg       Arg39                   Gln        Gln       Gln       Gln40                   Ala        Ala       Ala       Ala41                   pro        Pro       Pro       Pro42                   Gly        Gly       Gly       Gly43                   Gln        Gln       Gln       Gln44                   Gly        Gly       Gly       Gly45                   Leu        Leu       Leu       Leu46                   Glu        Glu       Glu       Glu47                   Trp        Trp       Trp       Trp48                   Met        Met       Met       Met氨基酸    区域    共有序列    BKCDR4   BKCDR5   BKCDR649                   Gly        Gly      Gly      Gly50        CDR5       Trp        Trp      Trp      Trp51                   Ile        Ile      Ile      Ile52        (A-C)      Asn        Asn      Asn      Asn53                   Gly        Gly      Gly      Gly54                   Asn        Asn      Asn      Asn39                   Lys        Lys      Lys      Lys40                   Pro        Pro      Pro      Pro41                   Gly        Gly      Gly      Gly42                   Lys        Lys      Lys      Lys43                   Ala        Ala      Ala      Ala44                   Pro        Pro      Pro      Pro45                   Lys        Lys      Lys      Lys46                   Leu        Leu      Leu      Leu47                   Leu        Leu      Leu      Leu48                   Ile        Ile      Ile      Ile49                   Tyr        Tyr      Tyr      Tyr50        CDR2       Ala        Ala      Pro      Ala51                   Ala        Ala      Gly      Ala52                   Ser        Ser      Phe      Ser53                   Ser        Ser      Ser      Ser54                   Leu        Leu      Pro      Leu55                   Glu        Glu      Phe      Glu56                   Ser        Ser      Arg      Ser57        FR3        Gly        Gly      Gly      Gly58                   Val        Val      Val      Val59                   Pro        Pro      Pro      Pro60                   Ser        Ser      Ser      Ser61                   Arg        Arg      Arg      Arg62                   Phe        Phe      Phe      Phe63                   Ser        Ser      Ser      Ser64                   Gly        Gly      Gly      Gly65                   Ser        Ser      Ser      Ser66                   Gly        Gly      Gly      Gly67                   Ser        Ser      Ser      Ser68                   Gly        Gly      Gly      Gly69                   Thr        Thr      Thr      Thr70                   Arg        Arg      Arg      Arg71                   Phe        Phe      Phe      Phe72                   Thr        Thr      Thr      Thr73                   Leu        Leu      Leu      Leu74                   Thr        Thr      Thr      Thr75                   Ile        Ile      Ile      Ile76                   Ser        Ser      Ser      Ser77                   Ser        Ser      Ser      Ser氨基酸    区域    共有序列    BKCDR4    BKCDR5    BKCDR678                  Leu         Leu       Leu       Leu79                  Gln         Gln       Gln       Gln80                  pro         Pro       Pro       Pro81                  Glu         Glu       Glu       Glu82                  Asp         Asp       Asp       Asp83                  Phe         Phe       Phe       Phe84                  Ala         Ala       Ala       Ala85                  Thr         Thr       Thr       Thr86                  Tyr         Tyr       Tyr       Tyr87                  Tyr         Tyr       Tyr       Tyr88                  Cys         Cys       Cys       Cys89        CDR3      Gln         Gln       Gln       Arg90                  Gln         Gln       Gln       Pro55                  Gly         Gly       Pro       Gly56                  Asp         Asp       Pro       Asp57                  Thr         Thr       Gly       Thr58                  Asn         Asn       Phe       Asn59                  Tyr         Tyr       Ser       Tyr60                  Ala         Ala       Pro       Ala61                  Gln         Gln       Phe       Gln62                  Lys         Lys       Are       Lys63                  Phe         Phe       Phe       Phe64                  Gln         Gln       Gln       Gln65                  Gly         Gly       Gly       Gly66        FR3       Arg         Arg       Arg       Arg67                  Val         Val       Val       Val68                  Thr         Thr       Thr       Thr69                  Ile         Ile       Ile       Ile70                  Thr         Thr       Thr       Thr71                  Ala         Ala       Ala       Ala72                  Asp         Asp       Asp       Asp73                  Thr         Thr       Thr       Thr74                  Ser         Ser       Ser       Ser75                  Thr         Thr       Thr       Thr76                  Ser         Ser       Ser       Ser77                  Thr         Thr       Thr       Thr78                  Ala         Ala       Ala       Ala79                  Tyr         Tyr       Tyr       Tyr80                  Met         Met       Met       Met81                  Glu         Glu       Glu       Glu82        (A-C)     Leu         Leu       Leu       Leu
      82A       Ser         Ser       Ser       Ser
      82B       Ser         Ser       Ser       Ser
      82C       Leu         Leu       Leu       Leu氨基酸    区域    共有序列    BKCDR4    BKCDR5    BKCDR683                  Arg         Arg       Arg      Arg84                  Ser         Ser       Ser      Ser85                  Glu         Glu       Glu      Glu86                  Asp         Asp       Asp      Asp87                  Thr         Thr       Thr      Thr88                  Ala         Ala       Ala      Ala89                  Val         Val       Val      Val90                  Tyr         Tyr       Tyr      Tyr91                  Tyr         Tyr       Tyr      Tyr92                  Cys         Cys       Cys      Cys93                  Ala         Ala       Ala      Ala94                  Arg         Arg       Arg      Arg95        CDR6      Ala         Ala       Ala      Ala96                  Pro         Pro       Pro      Pro97                  Gly         Gly       Gly      Gly98                  Tyr         Tyr       Tyr      Phe99                  Gly         Gly       Gly      Ser100       (A-K)     Ser         Ser       Ser      Pro101                 Asp         Asp       Asp      Phe102                 Tyr         Tyr       Tyr      Arg103       FR4       Trp         Trp       Trp      Trp91                  Tyr         Tyr       Pro      Pro92                  Asn         Asn       Asn      Gly93                  Ser         Ser       Ser      Phe94                  Leu         Leu       Leu      Ser95        (A-F)     Pro         Pro       Pro      Pro96                  Trp         Trp       Trp      Phe97                  Thr         Thr       Thr      Arg98         FR4      Phe         Phe       Phe      Phe99                  Gly         Gly       Gly      Gly100                 Gln         Gln       Gln      Gln101                 Gly         Gly       Gly      Gly102                 Thr         Thr       Thr      Thr103                 Lys         Lys       Lys      Lys104                 Val         Val       Val      Val105                 Glu         Glu       Glu      Glu106                 Ile         Ile       Ile      Ile107                 Lys         Lys       Lys      Lys108                 Arg         Arg       Arg      Arg109                 Thr         Thr       Thr      Thr104                 Gly         Gly       Gly      Gly105                 Gln         Gln       Gln      Gln106                 Gly         Gly       Gly      Gly107                 Thr         Thr       Thr      Thr108                 Leu         Leu       Leu      Leu氯基酸    区域    共有序列    BKCDR4    BKCDR5    BKCDR6109                  Val        Val       Val       Val110                  Thr        Thr       Thr       Thr111                  Val        Val       Val       Val112                  Ser        Ser       Ser       Ser113                  Ser        Ser       Ser       Ser
6．2．工程可变区基因插入到哺乳动物表达载体中
一条完整的抗体轻链拥有一个可变区和一个稳定区。一条完整的抗体重链含有一个可变区、一个恒定区和一个绞链区。为了构建完整的轻链和重链，上述工程构建的修饰可变区基因可随后插入到含有合适恒定区的载体中。缓激肽序列插入轻链CDR的工程可变区基因，可克隆到pMRRO10．1载体(图3A)中，该载体含有人K轻链恒定区。工程轻链可变区插入到该载体中得到一条完整的轻链序列。另外，缓激肽序列插入到重链CDR中的工程可变区基因，被插入到pGAMMA1载体(图3B)中，该载体含有人IgG1恒定区和绞链区序列。工程重链可变区基因插入到该载体中获得一条完整的重链序列。
为了构建编码完整抗体的哺乳动物载体，完整重链序列和轻链序列被插入到单一哺乳动物表达载体中(Bebbington，C．R．1991，在方法一书中：酶学方法的配套方法，第2卷，136-145页)。所产生的载体编码抗体的轻链和重链，并被命名为pNEPuDGV(图3C)。
6．3．合成修饰抗体在哺乳动物细胞中的表达
为检查组装抗体的产生，用pNEPuDGV转染COS细胞。COS细胞(一种非洲绿猴肾细胞系，CV-1，用缺乏原点的SV40病毒转化得到)，被用于合成抗体的短时瞬间表达，因为它们能把含SV40复制起点的环状质粒复制到非常高的拷贝数。用钙沉淀法(Sullian等，FEBS Lett，285：120-123，1991)把抗体表达载体转染到COS7细胞中(从美国典型培养物保藏中心获得该细胞)。转化细胞在Dulbecco＇s改良Eagle＇s培养基中培养72小时，之后收集上清，缓激肽的抗体。用ELISA法测定来自转染COS细胞的上清液中组装的IgG。ELISA方法包括用抗人IgG Fc包被的96孔板上捕获样品和标准物。用连接到辣根过氧化酶(HRP)的抗人K链和底物四甲基二苯胺(TMB)，检测结合的组装IgG。显色程度与于样品中组装抗体的数量成正比。
6．4．含有缓激肽的合成修饰抗体模拟缓激肽配体并结合到缓激肽受体上
工程构建含有缓激肽结合序列的合成修饰抗体预期能模拟缓激肽配体并结合到缓激肽受体(BR)上。为了证实这些合成修饰抗体结合BR，用缓激肽受体结合测定法测定合成抗体。用下列方法测定合成抗体与BR的结合。SV-T2细胞是一种转化的成纤维细胞，每个细胞表达大约3，000个缓激肽受体(BR)。刺激在SV-72细胞上的受体导致PGE2合成的迅速增高，合成量的增高与缓激肽的结合水平成正比。因此，释放到培养基中的PGE2是受体结合的指标。
如图7A所示，加入1nM缓激肽(配体)刺激PGE2合成大约提高4倍。PGE2合成定量方法是ELISA在图7A中对受体拮抗剂HOE-140也作为检测。单独加入HOE-140和缓激肽不引起PGE2合成。
而且，如图7B所示，表达的修饰抗体其结用于测定合和刺激缓激肽受体的能力。用来自被抗体表达载体pNEPuDGV1转染的COS细胞的培养基刺激SV-T2细胞，观察其上的缓激肽受体的表达，表达载体pNEPuDGV1编码hABBKCDR3、hABBKCDR4、hABBKCDR5、或共有序列。具有可变链区BKCDR3和BKCDR5的合成抗体，以剂量依赖方式刺激PGE2合成。BKCDR4、ConVH、单独培养基、HOE-140不刺激PGE2合成(图7B)细胞与BKCDR4接触，PGE2合成有可能归因于如下事实，CDR4共有序列太短不能容纳适应整个缓激肽结合序列。表6比较了共有CDR氨基酸序列和BKCDR序列。结果表明合成修饰抗体BKCDR3和BKCDR5能与天然配体竞争性结合缓激肽受体。结合。如图7C所示、加入缓激肽刺激PGE2合成4倍(向左起第二条框1)。BKCDR3或BKCDR5加入到预先用天然缓激肽刺激过的细胞中可抑制缓激肽刺激的PGE2的合成。
表8共有CDR3：Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp ThrBKCDR3：Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg共有CDR4：Ser Tyr Ala Ile Ser Trp AsnBKCDR4：Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg共有CDR5：Trp Ile Asn Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln GlyBKCDR5：Trp Ile Asn Gly Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Phe Gln Gly
总之，这些结果表明含有缓激肽结合位点的修饰抗体能与缓激肽受体结合。
本发明的范围并不受限制于这里所描述的特定方案。事实上，除了本文描述的那些方案外，对本领域的技术人员来说，根据前面的描述和所附的图例，显而易见地会出现各种改良方案。上述修改方案应当包含在本发明所附的权利要求的范围之内。
在此引用了各种参考文献，这些公开内容作为整体引入仅供参考。

Claims (122)

1．一种与结合对的第一成员免疫特异地结合的修饰免疫球蛋白，该结合对由所述的一个第一成员和一个第二成员组成，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该结构域至少拥有一个含有所述第二成员的一部分的CDR，所述部分含有第一成员的一个结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种癌抗原。
2．权利要求1的修饰免疫球蛋白，它是一种抗体。
3．权利要求1的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种肿瘤抗原。
4．权利要求3的修饰免疫球蛋白，其中所述的肿瘤抗原是多形表皮粘蛋白抗原。
5．权利要求3的修饰免疫球蛋白，其中所述的肿瘤抗原是人结肠癌相关蛋白抗原。
6．权利要求5的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分具有选自以下各组的一种氨基酸序列：Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala，Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr，Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr，phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn，Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly，and Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr．
7．权利要求3的修饰免疫球蛋白，其中所述的肿瘤抗原是一种人结肠癌相关的糖抗原。
8．权利要求3的修饰免疫球蛋白，其中所述的肿瘤抗原是一种人乳脂小球抗原。
9．权利要求8的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分拥有选自下列各组的氨基酸序列：Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu，Glu-Ile-Leu-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly，Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr，Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala，Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser，andGln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr．
10．权利要求8的修饰免疫球蛋白，它进一步包含一种含有第二成员一部分的第二个CDR，第二成员具有选自下列各组的氨基酸序列：Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu，Glu-Ile-Leu-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Ple-Lys-Gly，Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr，Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala，Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-Ser，and Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-
11．权利要求3的修饰免疫球蛋白，其中所述的肿瘤抗原是乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤、胰腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肠道肿瘤、B淋巴细胞肿瘤或T淋巴细胞肿瘤的抗原。
12．权利要求1的修饰免疫球蛋白。其中所述的癌抗原选自下列各组，它们是KS1／4汽癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺酸磷酸、前列腺特异抗原、黑色素瘤相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原、前列腺特异膜抗原、癌胚抗原、多形表皮粘蛋白抗原、人乳脂肪小球抗原、结直肠肿瘤相关抗原TAG-72、CO17-1A、GICA19-9、CTA-1、LEA、Burkitt＇s淋巴瘤抗原38．13、CD19、人B淋巴瘤抗原CD20、CD33、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3、肿瘤特异移植型细胞表面抗原、癌胚抗原-α-胎蛋白L6、人肺癌抗原L20、人白血病T细胞抗原-GP37、新糖蛋白、鞘脂类、EGFR、HER2抗原、多形表皮粘蛋白、人恶性淋巴细胞抗原-Apo-1、I类抗原M18、M39、SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85、C14、F3、AH6、Y半抗原、LeY、TL5、FC10．2、胃腺癌抗原、CP-514、NS-10、CO-43、MH2、在结肠癌中找到的19．9、胃癌粘蛋白、T5A7、R24、4．2、GD3、D1．1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1：22：25：8、SSEA-3、SSEA-4和一种T细胞受体衍生肽。
13．一种与结合对的第一成员免疫特异结合的修饰免疫球蛋白，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该结构域至少拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有针对所述第一成员的一个结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种传染病病原的抗原。
14．权利要求13的修饰免疫球蛋白，它是一种抗体。
15．权利要求13的修饰免疫球蛋白，其中所述的传染病病原是一种细菌。
16．权利要求13的修饰免疫球蛋白、其中所述的传染病病原是一种病毒。
17．权利要求13的修饰免疫球蛋白、其中所述的传染病病原是一种寄生虫。
18．权利要求13的修饰免疫球蛋白、其中所述的传染病病原的抗原选自下列各组，它们是Brambell受体、HSV-2的抗原、淋球菌的抗原、梅毒螺旋体的抗原、沙眼衣原体的抗原或人乳头瘤病毒的抗原。
19．权利要求13的修饰免疫球蛋白，其中传染病病原的抗原选自下列各组，它们是流感病毒血凝素、人呼吸道合胞体病毒G糖蛋白、登革病毒的核心蛋白、登革病毒的基质蛋白、麻疹病毒血凝素、II型单纯疱疹病毒糖蛋白gB、脊髓灰质炎病毒I VP1、HIV1的被膜糖蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、白喉毒素、链球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、假性狂犬病毒g50、假性狂犬病毒糖蛋白H、假性狂犬病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒糖蛋白38、猪细小病毒衣壳蛋白、猪痢疾小蛇菌保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新城病病毒血凝素神经氨酸酶、猪流感血凝素、猪流感神经氨酸酶、传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白Ⅰ、La Crosse病毒的糖蛋白、新生小牛腹泻病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、马流感病毒A型／阿拉斯加91神经氨酸酶、马流感病毒A型／迈阿密63神经氨酸酶、马流感病毒A型／肯塔基81神经氨酸酶、Ⅰ型马疱疹病毒糖蛋白B、I型马疱疹病毒糖蛋白D、牛呼吸性合胞体病毒附着蛋白、牛呼吸性合胞体病毒糖蛋白D、牛呼吸性合胞体病毒核衣壳蛋白、牛类流感病毒3型融合蛋白、牛类流感病毒3型血凝素神经氨酸酶、牛病毒性腹泻病毒糖蛋白48、牛腹泻病毒糖蛋白53。
20．权利要求15的修饰免疫球蛋白，其中传染病病原选自下列各组，它们是分支杆菌、立克次氏体、支原体、奈瑟菌类、志贺菌类、军团菌属、霍乱弧菌、链球菌属、白喉棒状杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌、嗜血杆菌类、衣原体类和大肠杆菌。
21．权利要求16的修饰免疫球蛋白，其中传染病病原选自下列各组，它们是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒、Ⅱ型单纯疱疹病毒、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸性合胞体病毒、乳多空病毒、细小病毒、巨细胞病毒、束形病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、Ⅰ型人免疫缺陷病毒、Ⅱ型人免疫缺陷病毒、细小核糖核酸病毒、肠道病毒、嵌杯状病毒、诺沃克组病毒、披膜病毒、甲病毒、黄热病病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、沙粒病毒、呼吸道肠道病毒、轮形病毒、眶病毒、Ⅰ型人T细胞白血病病毒、Ⅱ型人T细胞白血病病毒、类人猿免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、细小病毒、Epstein-Barr病毒、人疱疹病毒-6、Ⅰ型猕猴疱疹病毒和痘病毒。
22．权利要求17的修饰免疫球蛋白，其中传染病病原选自疟原虫属、艾美球虫属、利什曼原虫属、可可齐地虫属(kokzidioa)和锥虫属以及真菌。
23．一种与结合对第一成员免疫特异结合的修饰免疫球蛋白，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该结构域至少拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点，该结合位点不含有序列Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种针对传染病病原的细胞受体。
24．权利要求23的修饰免疫球蛋白，它是一种抗体。
25．权利要求23的修饰免疫球蛋白，其中，所述的传染病病原是一种细菌。
26．权利要求23的修饰免疫球蛋白，其中，所述的传染病病原是一种病毒。
27．权利要求23的修饰免疫球蛋白，其中，所述的传染病病原是一种寄生虫。
28．权利要求23的修饰免疫球蛋白，其中细胞受体选自下列各组的蛋白，它们是LPV受体、腺苷环化酶、BDV表面糖蛋白、N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸受体、CD4-、高度硫酸化型硫酸肝素、p65、含Gal-αl-4-Gal的异受体、CD16b、整联蛋白VLA-2受体、EV受体、CD14、糖偶联物受体、α／βT细胞受体、衰减加速因子受体、细胞外被膜糖蛋白受体、免疫球蛋白FC受体痘病毒M-T7、GALV受体、CD14受体、路易士(b)血型抗原受体、T细胞受体、硫酸肝素糖受聚糖受体、成纤维细胞生长因子受体、CD11a、CD2、G-蛋白耦联受体、CD4、硫酸肝素蛋白聚糖、膜联蛋白Ⅱ、CD13(氨肽酶N)、人氨肽酶N受体、血凝素受体、CR3受体、蛋白激酶受体、半乳糖N-乙酰半乳糖胺可抑制性凝集素受体、趋化因子受体、膜联蛋白Ⅰ、actA蛋白、CD46受体、脑膜炎双球菌毒力相关opa受体、CD46受体、癌胚抗原家族受体、癌胚抗原家族Bg1a受体、γ干扰素受体、糖蛋白gp70、rmc-1受体、人整联蛋白受体ανβ3、硫酸肝素蛋白聚糖受体、CD66受体、整联蛋白受体、膜辅因子蛋白、CD46、GM1、GM2、GM3、CD3、神经酰胺、血凝素-神经氨酸酶蛋白、红细胞P抗原受体、CD36受体、血型糖蛋白A受体、γ干扰素受体、KDEL受体、粘膜定向α4β7受体、表皮生长因子受体、α5β1整联蛋白、非糖苷化J774受体、CXCR1-4受体、CCR1-5受体、CXCR3受体、CCR5受体、gp46表面糖蛋白、TNFRp55受体、TNFp75受体、可溶性白介素-1β受体。
29．一种与配体-受体结合对的第一成员免疫特异结合的修饰免疫球蛋白，该结合对由所述的第一成员和第二成员所组成，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该结构域至少拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR、所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点，并且在天然CDR中未有发现。
30．权利要求29的修饰免疫球蛋白，它是一种抗体。
31．权利要求29的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种受体。
32．权利要求29的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种配体。
33．权利要求29的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种受体激动剂。
34．权利要求29的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种受体拮抗剂。
35．权利要求29的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员是一种缓激肽受体。
36．权利要求35的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分由氨基酸序列Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg组成。
37．权利要求31的修饰免疫球蛋白，其中所述的受体选自下列一组，它们是阿片样受体、葡萄糖转运蛋白、谷氨酸受体、狐独素受体、红细胞生成素受体、胰岛素受体、酪氨酸激酶受体、KIT干细胞因子受体、神经生长因子受体、胰岛素样生长因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、促生长素受体、来源于胶质细胞的神经营养因子受体、gp39受体、G蛋白受体类和β2-肾上腺素能受体。
38．权利要求30的修饰免疫球蛋白，其中所述的配体选自下列一组，它们是缩胆囊肽、galanin、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、趋化因子、瘦素、蛋白酶、神经肽Y、神经激肽-1、神经激肽-2、神经激肽-3、铃蟾肽、胃泌素、促肾上腺皮质素释放激素、内皮素、褪黑激素、促生长素抑制素、血管活性肠肽、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、多巴胺和内皮素。
39．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的抗体选自IgG、IgE、IgM、IgD和IgA的一种类型。
40．一种权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白的片段，其中所述的片段能与所述的第一成员免疫特异地结合。
41．权利要求40的片段，其中所述的片段选自Fab、(Fab＇)2、重链二聚体、轻链二聚体和Fv片段。
42．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分插入在所述的CDR之内。
43．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分取代一个或多个CDR的氨基酸。
44．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是一种胚系CDR。
45．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是一种非胚系CDR。
46．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分至少为4个氨基酸。
47．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的部分为10-20个氨基酸的范围。
48．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR含有不多于25个氨基酸。
49．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是重链可变区的第一个CDR。
50．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是重链可变区的第二个CDR。
51．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是重链可变区的第三个CDR。
52．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是轻链可变区的第一个CDR。
53．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是轻链可变区的第二个CDR。
54．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中含有所述部分的CDR是轻链可变区的第三个CDR。
55．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中不止一个CDR含有所述的结合位点的一部分。
56．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中第二个CDR含有针对所述第一成员之外其它分子的第二结合点。
57．权利要求56的修饰免疫球蛋白，其中所述的第一成员之外的其它分子而是一种位于免疫细胞表面的分子。
58．权利要求57的修饰免疫球蛋白，其中所述的免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞、TIL细胞或嗜中性粒细胞。
59．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，该修饰免疫球蛋白对所述第一成员的特异性比天然产生的与所述第一成员免疫特异结合的抗体更高。
60．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，该免疫球蛋白与所述的第一成员的亲和性比天然产生的抗体与所述的第一成员免疫特异地结合的亲和力更高。
61．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，它表现为对所述的第一成员的结合常数至少为2×107M。
62．权利要求2、14、24或30的修饰免疫球蛋白，其中所述的抗体拥有对所述的第一成员的亲和常数至少为2×107M。
63．权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的可变区中形成二硫键的一个或多个半胱氨酸残基被一个或多个不含巯基的氨基酸残基所替换。
64．权利要求63的修饰免疫球蛋白，其中所述的一个或多个半胱氨酸残基中至少一个在轻链可变区的23或88位。
65．权利要求63的修饰免疫球蛋白，其中所述的一个或多个半胱氨酸残基中至少一个在重链可变区的23或92位。
66．权利要求63的修饰免疫球蛋白，其中所述的至少一个不含有巯基氨基酸残基是丙氨酸。
67．一种分子，包括与结合对的第一成员免疫特异地结合的可变区，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的可变区拥有至少一个含所述第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有针对所述第一成员的一个结合位点，并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种癌抗原。
68．一种分子，包括与结合对的第一成员免疫特异地结合的可变区，该结合对由所述的第一成员和第二成员所组成，所述的可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，并且在天然CDR中未有发现，所述的部分含有针对第一成员的一个结合位点，所述的第一成员是一种传染病病原的抗原。
69．一种分子，包括与结合对的第一成员免疫特异地结合的可变区，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述第一成员的结合位点，该结合位点不拥有序列Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种针对传染病病原的细胞受体。
70．一种分子，包括与配体-受体结合对的第一成员免疫特异地结合的可变区，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的可变区拥有至少一个含有所述第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有针对所述第一成员的一个结合位点并且在天然CDR中未有发现。
71．权利要求67、68、69或70的分子，其中所述的分子是一种单链抗体。
72．权利要求67、68、69或70的分子，它进一步包含一个恒定区。
73．权利要求72的分子，其中除了含有所述部分的CDR外，该可变区来自小鼠抗体，而恒定区来自人抗体。
74．权利要求72的分子，其中除了含所述部分的CDR外，可变区拥有来自人抗体的构架区和来自小鼠抗体的CDRs，并且其中恒定区来自人抗体。
75．权利要求74的分子，其中就天然产生的构架区而论，所述的可变区拥有有至少一个氨基酸变化的至少一个构架区。
76．权利要求67、68、69或70的分子，它经共价键被融合到免疫刺激或生长增强因子或其功能性片段上。
77．权利要求76的分子，其中免疫刺激因子选自下列各组，它们是白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-10、白介素-12、白介素-15、G-集落刺激因子、肿瘤坏死因子、穿孔素、γ-干扰素和NK细胞抗原。
78．一种分离的核酸，它包含编码权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白的核苷酸序列。
79．一种分离的核酸，它包含编码权利要求67、68、69或70的分子的核苷酸序列。
80．权利要求78的分离的核酸，其中所述的核酸是一种载体。
81．权利要求79的分离的核酸，其中所述的核酸是一种载体。
82．一种含有权利要求78的核酸的细胞，该核酸是重组的。
83．一种含有权利要求79的核酸的细胞，该核酸是重组的。
84．一种重组的非人类动物，该动物含有权利要求78的核酸。
85．一种重组的非人类动物，该动物含有权利要求79的核酸。
86．一种药物组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白和一种药学上可接受的载体。
87．一种药物组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求67、68、69或70的分子和一种药学上可接受的载体。
88．一种药用组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求78的核酸和一种药学上可接受的载体。
89．一种药用组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求79的核酸和一种药学上可接受的载体。
90．一种药用组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求82的重组细胞和一种药学上可接受的载体。
91．一种药用组合物，它包含一种治疗或预防有效量的权利要求83的重组细胞和一种药学上可接受的载体。
92．一种疫苗组合物，它包含足够量诱导免疫应答的权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白和一种药学可接受的载体。
93．一种疫苗组合物，它包含足够量诱导免疫应答的权利要求67、68、69或70的分子和一种药学可接受的载体。
94．一种疫苗组合物，它包含足够量诱导抗独特型应答的权利要求63的修饰免疫球蛋白和一种药学上可接受的载体。
95．一种在待测定的样品中鉴别或测定或检测癌抗原的方法，该癌抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对中的第一成员，所述的方法包含如下步骤：
(a)用能免疫特异地与所述癌抗原结合的修饰免疫球蛋白与待测定的样品在有关条件下接触，所述的修饰免疫球蛋白包含一可变区，该可变区至少拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对癌抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现，结果能发生所述的修饰免疫球蛋白与样品中任何所述的癌抗原免疫特异的结合；然后
(b)检测所述修饰免疫球蛋白与所述癌抗原的任何结合；
其中，检测到所述的修饰免疫球蛋白与所述的癌抗原的结合，表示在所述的样本中存在所述的癌抗原。
96．一种在待测定的样品中鉴别或测定或检测传染病病原的抗原的方法，该抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包含如下步骤：
(a)用能免疫特异地与所述抗原结合的修饰免疫球蛋白在有关条件下与待测定的样品接触，所述的修饰免疫球蛋白包含一可变区，该可变区至少拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，该部分含有一个针对所述抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现，结果能发生所述的修饰免疫球蛋白与样品中任何抗原免疫特异结合；然后
(b)检测所述修饰免疫球蛋白与所述抗原的任何的发生；
其中，检测到所述修饰免疫球蛋白与所述抗原的结合表示在所述的样本中存在所述的抗原。
97．一种在待测定的样品中鉴别或测定或检测配体的方法，该配体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包含如下步骤：
(a)用能免疫特异地与所述配体结合的修饰免疫球蛋白与待测定的样品在有关条件下接触，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，该部分含有一个针对所述配体的结合位点并且在天然CDR中未有发现，结果能发生所述的修饰免疫球蛋白与样品中任何配体的免疫特异结合；然后
(b)检测所述修饰免疫球蛋白与所述配体的任何结合的发生；
其中，检测到所述修饰免疫球蛋白与所述配体的结合表示在所述的样本中存在所述的配体。
98．一种在待测定的样品中鉴别或测定或检测受体的方法，该受体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包含如下步骤：
(a)用能免疫特异地与所述受体结合的修饰免疫球蛋白与待测定的样品在有关条件下接触，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，该部分含有一个针对所述的受体的结合位点并且在天然CDR中未有发现，结果能发生所述的修饰免疫球蛋白与样品中任何受体的免疫特异结合；然后
(b)检测所述修饰免疫球蛋白与所述受体的任何结合的发生；
其中，检测到所述修饰免疫球蛋白与所述受体的结合表示在样本中存在所述的受体。
99．一种检测癌抗原的试剂盒，该癌抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的试剂盒在一容器中包含：
(a)一种能免疫特异地与所述癌抗原免疫特异结合的修饰免疫球蛋白，所述的免疫球蛋白包含一可变区，该可变区拥有至少一个含有所述第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述的癌抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现；以及
(b)一种检测所述的癌抗原与所述的免疫球蛋白结合的方法。
100．一种检测传染病病原的抗原的试剂盒，该抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的试剂盒在一容器中包含：
(a)一种能免疫特异地与所述抗原结合的修饰免疫球蛋白，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述抗原的结合位点并在天然CDR中未有发现；以及
(b)一种检测所述的抗原与所述免疫球蛋白结合的方法。
101．一种检测针对传染病病原的细胞受体的试剂盒，该细胞受体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述试剂盒在一容器中包含：
(a)一种能免疫特异地与所述的细胞受体结合的修饰免疫球蛋白，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有针对所述的细胞受体的一个结合位点，该结合位点不拥有Asn-Lae-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并且在天然CDR中未有发现；以及
(b)一种检测所述的细胞受体与所述免疫球蛋白结合的方法。
102．一种检测配体的试剂盒，它是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的试剂盒在一容器中包含；
(a)一种能免疫特异地与所述的配体结合的修饰免疫球蛋白，所述的球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有针对配体的一个结合位点并且在天然CDR中未有发现；以及
(b)一种检测所述的配体与所述的免疫球蛋白结合的方法。
103．一种检测受体的试剂盒，它是由所述的第一成员和第二成员的结合对的第一成员，所述的试剂盒在一容器中包含：
(a)一种能免疫特异地与所述受体结合的修饰免疫球蛋白，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述受体的结合位点并在天然CDR中未有发现；以及
(b)一种检测所述的受体与所述的免疫球蛋白结合的方法。
104．一种诊断或筛选癌症存在或癌症发展趋向的方法，该癌症的特征是癌抗原增加，它是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包含测定在受试者中修饰免疫球蛋白与来自受试者的样品免疫特异结合的水平、其中所述的修饰免疫球蛋白免疫特异地与所述的癌抗原结合而所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该结构域拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述癌抗原的结合位点并在天然CDR中未有发现，其中相对于来自未患癌症或没有癌症发展趋向的受试者的类似样品中所述的免疫特异结合的水平，该免疫特异结合水平的增加表明存在癌症或有癌症发展趋向。
105．一种诊断或筛选存在传染病病原的方法，其特征是存在所述的传染病病原的抗原，该抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的方法包含测定在受试者中修饰免疫球蛋白与来自受试者的样品免疫特异结合的水平，其中所述的修饰免疫球蛋白免疫特异地与所述抗原结合并且该修饰免疫球蛋白包含一可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述抗原的结合位点并在天然CDR中未有发现，其中相对于来自未含有传染病病原的受试者的类似样品中的免疫特异结合的水平，所述免疫特异结合的水平增加表明存在传染病病原。
106．一种治疗或预防癌症的方法，该癌症以存在癌抗原为特征，该受试者需要上述治疗或预防，所述的癌抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，该癌抗原被修饰免疫球蛋白免疫特异地结合，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述癌抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现，上述方法包括给受试者施用一种治疗或预防有效量的所述修饰免疫球蛋白。
107．一种治疗或预防传染病的方法，该传染病以存在传染病病原为特征，该受试者需要上述的治疗或预防，所述的抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，并且该抗原被修饰免疫球蛋白免疫特异地结合，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述抗原的结合位点并在天然CDR中未有发现，该方法包括给受试者施用治疗或预防有效量的所述修饰免疫球蛋白。
108．一种治疗或预防疾病的方法，该疾病由传染病病原与细胞受体的结合引起，该受试者需要上述的治疗或预防，所述的细胞受体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，并且该细胞受体被修饰免疫球蛋白免疫特异地结合，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述细胞受体的结合位点，该结合位点不拥有序列Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并在天然CDR中未有发现，所述的方法包括给受试者施用治疗或预防有效量的所述修饰免疫球蛋白。
109．一种调节结合对第一成员的活性的方法，该结合对由第一和第二成员组成，所述的方法包括施用权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白。
110．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该免疫球蛋白免疫特异地与癌抗原结合，该癌抗原由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述癌抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的方法包含培养一种含有一种核酸的重组细胞，该核酸包含一种编码该修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白，然后回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
111．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白免疫特异地与传染病病原的抗原结合，该抗原是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一种针对所述抗原的结合位点并且在天然CDR中未有发现，该方法包括培养一种含有一种核酸的重组细胞，该核酸包含一种编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白，然后回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
112．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与针对传染病的细胞受体免疫特异地结合，该细胞受体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一种针对所述细胞受体的结合位点，该结合位点不含有序列Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并且在天然CDR中未有发现，该方法包括培养一种含有一种核酸的重组细胞，该核酸包含一种编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白，然后回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
113．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与配体免疫特异地结合、该配体是由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述配体的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的方法包括培养一种含一种核酸的重组细胞，该核酸包含一种编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白，然后回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
114．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与受体免疫特异地结合、该受体是由一种由所述的第一成员和第二成员组成的结合对的第一成员，所述的修饰免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，该部分含有一个针对所述受体的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的方法包括培养一种含有一种核酸的重组细胞，该核酸包含一种编码修饰免疫球蛋白的核苷酸序列，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白，然后回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
115．一种生产核酸的方法，该核酸编码权利要求1、13、23或29的修饰免疫球蛋白，该方法包括：
(a)合成一套寡核苷酸，所述的整套寡核苷酸包括含有编码该修饰免疫球蛋白的部分核苷酸序列的寡核苷酸，和含有编码该修饰免疫球蛋白的核苷酸序列互补的部分核苷酸序列的寡核苷酸，并且除了那些含有编码修饰免疫球蛋白的N-末端和C-末端部分的核苷酸序列的寡核苷酸之外，每种所述的寡核苷酸拥有和该套另一种寡核苷酸重叠的末端序列；
(b)让寡核苷酸相互杂交；以及
(c)连接杂交过的寡核苷酸，结果产生了含有编码该修饰免疫球蛋白的核苷酸序列的核酸。
116．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与结合对的第一成员免疫特异地结合，所述的免疫球蛋白包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种癌抗原，所述的方法包括：
(a)培养一种含有由权利要求115的方法产生的核酸的重组细胞，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白；以及
(b)回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
117．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与结合对的第一成员免疫特异地结合、该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的抗体包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种传染病病原的抗原，所述的方法包括：
(a)培养一种含有由权利要求115的方法产生的核酸的重组细胞，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白；以及
(b)回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
118．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与结合对的第一成员免疫特异地结合，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的抗体包含一个可变区，该结构域拥有至少一个CDR的含有所述的第二成员的一部分，所述的部分含有一个针对第一成员的结合位点，该结合位点不含有序列Asn-Ala-Asn-Pro或Asn-Val-Asp-Pro并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种针对传染病病原的细胞受体，所述的方法包括：
(a)培养一种含有由权利要求115产生的核酸的重组细胞，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白。
(b)回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
119．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与结合对的第一成员免疫特异地结合，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的抗体包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有第二成员的一部分的CDR，所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种配体，所述的方法包括：
(a)培养一种含有由权利要求115的方法产生的核酸的重组细胞，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白；以及
(b)回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
120．一种生产修饰免疫球蛋白的方法，该修饰免疫球蛋白与结合对的第一成员免疫特异地结合，该结合对由所述的第一成员和第二成员组成，所述的抗体包含一个可变区，该可变区拥有至少一个含有所述的第二成员的一部分的CDR可变区，所述的部分含有一个针对所述的第一成员的结合位点并且在天然CDR中未有发现，所述的第一成员是一种受体，所述的方法包括：
(a)培养一种含有由权利要求115的方法产生的核酸的重组细胞，结果由该细胞表达编码的修饰免疫球蛋白；以及
(b)回收获得所表达的修饰免疫球蛋白。
121．一种分离的核酸，它由权利要求115的方法产生。
122．权利要求121的分离核酸，它是一种载体。
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